JP2012523417A

JP2012523417A - Ｄｋｋ−１抗体

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Publication number: JP2012523417A
Application number: JP2012504760A
Authority: JP
Inventors: マルシオ・シェディド; ライアン・ジェイムズ・ダーリン; レーチェル・ジャネット・ガルビン; バーバラ・アン・スワンソン
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-10-04
Anticipated expiration: 2030-04-06
Also published as: HUE034625T2; CA2758252C; LT2930184T; ZA201107256B; EA021401B1; SI3514173T1; AU2010234611B2; PL2417158T3; RS56505B1; PL3514173T3; KR20140033523A; ME02798B; AR075989A1; BRPI1014157B1; IL214845A0; HUE043904T2; KR101461362B1; LT3514173T; NZ595011A; EP2417158A1

Abstract

本発明は、ＤＫＫ−１による媒介が原因となる疾患の治療に有効な、ヒトＤＫＫ−１に結合しかつヒトＤＫＫ−１の活性を阻害するヒト遺伝子操作抗体、その抗原結合フラグメントを提供する。

Description

本発明は、ＤＫＫ−１に対するヒト遺伝子操作抗体、および、ＤＫＫ−１による媒介が原因となる疾患の治療における当該抗体の使用に関する。

Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）は、標準的なＷｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子であると示されているタンパク質のｄｉｃｋｋｏｐｆファミリーのメンバーである。この経路は、骨の発達および形成における主要な役割を担う。Ｄｋｋ−１は、ＷｎｔコレセプターＬＲＰ５またはＬＲＰ６およびｋｒｅｍｅｎタンパク質とＤｋｋ−１との相互作用を通じてＷｎｔシグナル伝達を阻害する。Ｄｋｋ−１は、Ｗｎｔ経路のメンバーをＬＲＰ５またはＬＲＰ６のいずれかとの相互作用から防ぐので、Ｗｎｔ媒介シグナル変換を防いでいる。Ｄｋｋ−１はまた、多発性骨髄腫、乳癌、腎癌および非小細胞肺癌を含む骨転移癌に関与していると示されている。

Ｄｋｋ−１に結合する抗体が記載されている（例えば、特許文献１を参照）。しかしながら、未だ、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６とのＤｋｋ−１の相互作用を阻害するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体の治療的な必要性が存在する。加えて、骨の形成の調節におけるＤｋｋ−１の関与を考慮すると、骨の治癒に用いるためのヒト遺伝子操作抗Ｄｋｋ−１抗体の治療的な必要性が存在する。加えて、癌におけるＤｋｋ−１の関与を考えると、多発性骨髄腫、乳癌および非小細胞肺癌を含む癌を治療するためのヒト遺伝子操作抗Ｄｋｋ−１抗体の必要性が存在する。

国際公開第２００６０１５３７３号

本発明の抗体は、多数の所望の特性を有する治療的に有用なＤＫＫ−１アンタゴニストである。本発明のヒト遺伝子操作抗体は、ヒトＤＫＫ−１、カニクイザルＤＫＫ−１、ラットＤＫＫ−１、マウスＤＫＫ−１、およびウサギＤＫＫ−１に対して高い親和性（Ｋｄ）を示す。本発明の抗体は、骨芽細胞活性のマーカーであるアルカリホスファターゼのＤＫＫ−１媒介阻害をブロックする。更に、本発明の抗体は、インビボモデルの皮質欠損における前部皮質および後部皮質の両方にて骨密度の増加を示し、インビボにおいて非小細胞肺異種移植片の有意な増殖阻害を示す。

本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について５．０×１０^−１１Ｍ未満の３７°ＣにおけるＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその結合フラグメントを提供する。ここで、ＬＣＤＲ１は配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は配列番号４７のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は配列番号４９のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして、ＨＣＤＲ３は配列番号４４のアミノ酸配列を有する。

本発明はまた、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント、および、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明は、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含む骨を治癒する方法を提供する。本発明はまた、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含む癌を治療する方法を提供する。ここで、癌は、多発性骨髄腫、乳癌および非小細胞肺癌からなる群より選択される。

本発明は、本願明細書に記載されるように、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）について１．５×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。より好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）について１．０×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。更に好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）について５．０×１０^−１２未満のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。より好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）について０．５×１０^−１２Ｍと１．５×１０^−１１Ｍとの間のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。更に好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）について１．０×１０^−１２Ｍと１．０×１０^−１１との間のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。Ｋｄ値は、実施例２に記載されるように、３７^ｏＣにおける結合平衡により確定される。

本発明はまた、本願明細書に記載されるように、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、５．０×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。より好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、３．０×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。更に好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、およびマウスＤＫＫ−１（配列番号３３）について、２．０×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。より好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、１．０×１０^−１１Ｍと５．０×１０^−１１Ｍとの間のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。更に好ましくは、本発明は、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、およびマウスＤＫＫ−１（配列番号３３）について、１．５×１０^−１１Ｍと３．０×１０^−１１Ｍとの間のＫｄを有するヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。Ｋｄ値は、実施例２に記載されるように、３７^ｏＣにおける結合平衡により確定される。

より好ましくは、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲおよび配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、当該ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、３．０×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有する。更に好ましくは、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲおよび配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、当該ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、２．５×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有する。より好ましくは、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲおよび配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、当該ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、２．０×１０^−１１未満のＫｄを有する。更に好ましくは、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲおよび配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、当該ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、０．５×１０^−１２Ｍと３．０×１０^−１１Ｍとの間のＫｄを有する。より好ましくは、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲおよび配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、当該ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、１．０×１０^−１２Ｍと２．５×１０^−１１との間のＫｄを有する。Ｋｄ値は、実施例２に記載されるように、３７^ｏＣにおける結合平衡により確定される。

本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその結合フラグメントを提供する。ここで、ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）である、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＣＤＲである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。ここで、ＬＣＤＲ１は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、そして、ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。

本発明は、ＬＣＤＲ１が配列番号４６のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号４８のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号５０のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号４３のアミノ酸配列を有し、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号４５のアミノ酸配列を有する、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその結合フラグメントを提供する。

本発明は、好ましくは、ＬＣＤＲ１が配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号４７のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号４９のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号４４のアミノ酸配列を有する、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその結合フラグメントを提供する。

本発明は、ＬＣＤＲ１が配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が配列番号６、配列番号８、および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が配列番号７および配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその結合フラグメントを提供する。

本発明は、好ましくは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。（ｉ）ＬＣＤＲ１が配列番号５であり、ＬＣＤＲ２が配列番号６であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号３である；（ｉｉ）ＬＣＤＲ１が配列番号５であり、ＬＣＤＲ２が配列番号８であり、ＬＣＤＲ３が配列番号７であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号４である；（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ１が配列番号５であり、ＬＣＤＲ２が配列番号６であり、ＬＣＤＲ３が配列番号９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号３である；（ｉｖ）ＬＣＤＲ１が配列番号５であり、ＬＣＤＲ２が配列番号１０であり、ＬＣＤＲ３が配列番号９であり、ＨＣＤＲ１が配列番号１であり、ＨＣＤＲ２が配列番号２であり、そして、ＨＣＤＲ３が配列番号３である。

本発明は、ＬＣＶＲが配列番号５２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、好ましくは、ＬＣＶＲが配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、好ましくは、ＨＣＶＲが配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、好ましくは、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲが以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。（ｉ）ＬＣＶＲが配列番号１３のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲが配列番号１１のアミノ酸配列を含む；（ｉｉ）ＬＣＶＲが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲが配列番号１２のアミノ酸配列を含む；（ｉｉｉ）ＬＣＶＲが配列番号１５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲが配列番号１１のアミノ酸配列を含む；（ｉｖ）ＬＣＶＲが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲが配列番号１１のアミノ酸配列を含む。

本発明は、好ましくは、ＬＣＶＲが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＶＲが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明は、好ましくは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。

より好ましくは、本発明は、重鎖および軽鎖が以下の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。（ｉ）重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号１９のアミノ酸配列を含む；（ｉｉ）重鎖が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２０のアミノ酸配列を含む；（ｉｉｉ）重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２１のアミノ酸配列を含む；（ｉｖ）重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、軽鎖が配列番号２２のアミノ酸配列を含む。

本発明は、好ましくは、各軽鎖が配列番号１９のアミノ酸配列を含む２本の軽鎖、および、各重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含む２本の重鎖、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、各軽鎖が配列番号２１のアミノ酸配列を含む２本の軽鎖、および、各重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含む２本の重鎖、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、各軽鎖が配列番号２２のアミノ酸配列を含む２本の軽鎖、および、各重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含む２本の重鎖、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。

本発明は、好ましくは、各軽鎖が配列番号２０のアミノ酸配列を含む２本の軽鎖、および、各重鎖が配列番号１８のアミノ酸配列を含む２本の重鎖、を含むヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体を提供する。

本発明はまた、抗体競合アッセイにより決定されるように、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）に対して結合するための本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

本発明はまた、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント、および、医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。

更に、本発明は、医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤および任意の他の治療成分とともに、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。

更なる態様において、本発明は、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含む、骨を治癒する方法を提供する。

更なる態様において、本発明は、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを投与する工程を含む、癌を治療する方法を提供する。ここで、癌は、好ましくは、多発性骨髄腫、乳癌、および非小細胞肺癌からなる群より選択される。

更に、本発明は、治療に用いるための、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。好ましくは、本発明は、骨の治癒の治療または癌の治療に用いるための、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ここで、癌は、好ましくは、多発性骨髄腫、乳癌および非小細胞肺癌からなる群より選択される。

更に、本発明はまた、骨の治癒または癌の治療のための医薬の製造における、本発明のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。ここで、癌は、好ましくは、多発性骨髄腫、乳癌および非小細胞肺癌からなる群より選択される。

定義
天然に存在しているような完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続されている２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、可変領域に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原認識に主に関与する約１００〜１１０個のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を規定する。

ＣＤＲは、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、十分に保存されている領域に散在する。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の各々は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列されている。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称され、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称される。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する大部分の残基を含む。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、周知のＫａｂａｔ番号付け法に従う。

軽鎖はカッパまたはラムダと分類され、当該技術分野において公知の特定の定常領域によって特徴付けられる。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンと分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧ抗体はさらに、サブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられ得る。各重鎖のタイプは、当該技術分野において周知の配列を有する特定の定常領域によって特徴付けられる。

本願明細書に使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）とは、例えば、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む、単一のコピーまたはクローンに由来する抗体を意味し、産生される方法を意味するのはでない。本発明のＭａｂは、好ましくは、均一または実質的に均一の集団に存在する。完全なＭａｂは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。このようなモノクローナル抗体の「抗原結合フラグメント」としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、および一本鎖Ｆｖフラグメントが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、例えばＣＤＲ移植、またはこのような技術の組み合わせ、あるいは当該技術分野において公知の他の技術により産生され得る。例えば、マウスは、ヒトＤＫＫ−１またはそのフラグメントで免疫化され得、得られた抗体は回収され、精製され得、それらが、本願明細書に開示される抗体化合物と類似または同様の結合特性および機能特性を有するかどうかの決定が、以下の実施例に開示される方法によって評価され得る。抗原結合フラグメントはまた、従来の方法によって調製され得る。抗体および抗原結合フラグメントを産生し、精製するための方法は当該技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，第５〜８章、および１５章、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２に見出され得る。

用語「キメラ抗体」とは、異なる種（通常２種）由来のドメインを含有する抗体を意味する。抗体Ｖは、軽鎖および重鎖の可変ドメインがマウス抗体由来の残基を含有し、一方、定常領域の軽鎖ドメインがラットのカッパ軽鎖を含む残基を含有し、定常領域の重鎖ドメインがラットのＩｇＧ１抗体を含む残基を含有する、キメラ抗体である。抗体Ｖはマウス／ラットキメラであり、長期の前臨床モデルにおいて免疫反応の可能性を減少させるための研究に使用されている。

用語「ヒト遺伝子操作抗体」とは、本発明に従う結合特性および機能特性を有し、さらに、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ周囲の実質的にヒトまたは完全にヒトであるフレームワーク領域を有する、モノクローナル抗体を意味する。このようなヒト遺伝子操作抗体の「抗原結合フラグメント」としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、および一本鎖Ｆｖフラグメントが挙げられる。「フレームワーク領域」または「フレームワーク配列」とは、フレームワーク領域１〜４のいずれか１つを意味する。本発明に包含されるヒト遺伝子操作抗体およびその抗原結合フラグメントには、フレームワーク領域１〜４のいずれか１つ以上が、実質的にまたは完全にヒトである（すなわち、個々の実質的または完全なヒトフレームワーク領域１〜４の可能な組み合わせのいずれかが存在する）分子が含まれる。例えば、これには、フレームワーク領域１とフレームワーク領域２、フレームワーク領域１とフレームワーク領域３、フレームワーク領域１、２と３などが実質的または完全にヒトである分子が含まれる。実質的にヒトフレームワークは、公知のヒト生殖細胞フレームワーク配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するものである。好ましくは、実質的なヒトフレームワークは、公知のヒト生殖細胞フレームワーク配列に対して少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の配列同一性を有する。

完全なヒトフレームワークは、公知のヒト生殖細胞フレームワーク配列と同一のものである。ヒトフレームワーク生殖細胞配列は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを介してＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から得られ得るか、またはＭａｒｉｅ−ＰａｕｌｅＬｅｆｒａｎｃおよびＧｅｒａｒｄＬｅｆｒａｎｃによるＴｈｅＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＦａｃｔｓＢｏｏｋ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，２００１，ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得られ得る。例えば、生殖細胞の軽鎖フレームワークは、Ａｌ１、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２０、Ａ２７、Ａ３０、ＬＩ、Ｌ１Ｉ、Ｌ１２、Ｌ２、Ｌ５、Ｌ１５、Ｌ６、Ｌ８、Ｏ１２、Ｏ２、およびＯ８からなる群より選択され得る。また、生殖細胞の重鎖フレームワーク領域は、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−７２、ＶＨＩ−４６、ＶＨ３−９、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７４、ＶＨ４−３１、ＶＨＩ−１８、ＶＨＩ−６９、ＶＩ−１３−７、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５Ｉからなる群より選択され得る。

本発明による類似の機能特性を示す、本願明細書に開示されるものに加えてヒト遺伝子操作抗体は、いくつかの異なる方法を用いて生成され得る。本願明細書に開示される特定の抗体化合物は、さらなる抗体化合物を調製するために鋳型または親抗体化合物として使用され得る。１つのアプローチにおいて、親抗体化合物のＣＤＲは、親抗体化合物のフレームワークと高い配列同一性を有するヒトフレームワークに移植される。新しいフレームワークの配列同一性は、通常、親抗体化合物における対応するフレームワークの配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一である。この移植により、親抗体のものと比べて結合親和性の減少が生じ得る。この場合、フレームワークは、Ｑｕｅｅｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９に開示されている特定の基準に基づいて特定の位置にて親フレームワークに復帰突然変異され得る。ヒト化マウス抗体に有用な方法を記載しているさらなる参考文献としては、米国特許第４，８１６，３９７号；同第５，２２５，５３９号、および同第５，６９３，７６１号；Ｌｅｖｉｔｔ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６８：５９５−６２０に記載されているコンピュータプログラムＡＢＭＯＤおよびＥＮＣＡＤ；ならびにＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２７；ならびにＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４−１５３６が挙げられる。

復帰突然変異とみなされる残基の同定は以下のように実施され得る：
アミノ酸が以下のカテゴリーの範囲内にある場合、使用されるヒト生殖細胞配列のフレームワークアミノ酸（「アクセプターフレームワーク」）は、親抗体化合物のフレームワーク（「ドナーフレームワーク」）由来のフレームワークアミノ酸に置換される：
（ａ）アクセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークには稀であるが、ドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的である；
（ｂ）アミノ酸の位置はＣＤＲの１つに直接隣接している；または
（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５〜６オングストローム（中心〜中心）内である。

アクセプターフレームワークのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸およびドナーフレームワークにおける対応するアミノ酸の各々が、通常、その位置におけるヒトフレームワークに稀である場合、かかるアミノ酸は、その位置におけるヒトフレームワークに典型的であるアミノ酸に置換され得る。この復帰突然変異の基準により、親抗体化合物の活性を回復できる。

本願明細書に開示される抗体化合物と類似の機能特性を示すヒト遺伝子操作抗体を生成するための別のアプローチは、フレームワークを変化させずに移植されたＣＤＲ内のアミノ酸をランダムに突然変異し、親抗体化合物のものと同程度か、またはより良い結合親和性および他の機能特性について、得られた分子をスクリーニングすることに関する。かかる突然変異はまた、各ＣＤＲ内の各アミノ酸位置に導入され得、続いて、結合親和性および他の機能特性に対するかかる突然変異の効果を評価する。改良された特性を生じる単一突然変異が組み合わされて、互いに組み合わせたそれらの効果を評価してもよい。

さらに、前述のアプローチの両方の組み合わせが可能である。ＣＤＲ移植後、ＣＤＲにおけるアミノ酸変化を導入することに加えて、特定のフレームワーク領域を復帰突然変異してもよい。この方法論は、Ｗｕら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２に記載されている。

本発明の教示を適用することで、当業者は、一般的な技術、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、本願明細書に開示されているＣＤＲおよびフレームワーク配列内のアミノ酸を置換でき、それによって、本発明の配列に由来するさらなる可変領域アミノ酸配列を生成する。全ての代替の天然に存在するアミノ酸が特定の置換部位に導入されてもよい。本願明細書に開示される方法は、次いで、これらのさらなる可変領域アミノ酸配列をスクリーニングするために使用されて、示されるインビボでの機能を有する配列を同定できる。このように、本発明によるヒト遺伝子操作抗体およびその抗原結合部分を調製するのに適切なさらなる配列が同定され得る。好ましくは、フレームワーク内のアミノ酸置換は、本願明細書に開示される４本の軽鎖および／または重鎖のフレームワーク領域のうちのいずれか１つ以上の中の１つ、２つまたは３つの位置に制限される。好ましくは、ＣＤＲ内のアミノ酸置換は、３本の軽鎖および／または重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上の中の１つ、２つまたは３つの位置に制限される。上記のこれらのフレームワーク領域およびＣＤＲ内の種々の変更の組み合わせもまた、可能である。最も好ましくは、これらの技術は、配列番号１２および配列番号１４にそれぞれ記載している、可変重鎖アミノ酸配列および可変軽鎖アミノ酸配列を使用してさらなる可変領域アミノ酸配列を生成するために使用される。

本願明細書に開示される分子と「競合する」ヒト遺伝子操作抗体またはその抗原結合フラグメントは、本発明の分子が結合する部位と同一であるか、または重なる部位においてヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）に結合するものである。ヒト遺伝子操作抗体またはその抗原結合フラグメントの競合は、例えば、抗体競合アッセイによって同定され得る。例えば、精製または部分的に精製されたヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）のサンプルは、固体支持体に結合される。次いで、試験または本発明の抗体のいずれかが標識されている、本願明細書に開示される抗体および試験モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが加えられる。標識された抗体および標識されていない抗体が、ＤＫＫ−１上の離れた部位または別個の部位に結合する場合、標識された抗体は、擬似競合抗体が存在するか否かに関わらず、同じレベルまで結合する。しかしながら、相互作用部位が同一または重なる場合、標識されていない抗体が競合し、抗原に結合した標識された抗体の量は低下する。標識されていない抗体が過剰に存在する場合、標識された抗体は結合しない。本発明の目的のために、ヒト遺伝子操作抗体またはその抗原結合フラグメントの競合は、ＤＫＫ−１に対する本発明の抗体の結合を、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％減少させるものである。このような競合アッセイを実施するための手順の詳細は当該技術分野において周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，５６７−５６９ページ、ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２に見出され得る。このようなアッセイは、精製された抗体を用いることによって定量的になされてもよい。標準曲線を、抗体自体の標識した型に対して１つの抗体を滴定することによって確立する。標識した分子のプレートに対する結合を阻害する、標識されていない競合モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を滴定する。結果をプロットし、結合阻害の所望の度合いを達成するのに必要な濃度を比較する。このような競合アッセイにおいて、本発明のヒト遺伝子操作抗体またはその抗原結合フラグメントと競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが同じまたは類似の機能特性を有するか否かに関わらず、本発明のヒト遺伝子操作抗体は本願明細書の実施例に開示される方法によって決定され得る。

用語「阻害する」とは、ＤＫＫ−１の生物学的効果を実質的に拮抗、妨げ、防止、抑制、遅延、中断、除去、停止、減少または反転する能力を意味する。

用語「治療している」（または「治療する」もしくは「治療」）とは、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を遅延、遮断、阻害、抑制、停止、減少、または反転することに関するプロセスを意味するが、ＤＫＫ−１活性に付随する全ての疾患関連の症状、状態、または障害の全ての除去に関与する必要はない。

用語「予防している」（または「予防する」もしくは「予防」）とは、症状、障害、状態または疾患の罹患または発生の妨げ、抑制、または阻害を意味する。急性事象および慢性状態が治療および防止され得る。急性事象において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、症状、障害、状態、または疾患の発症時に投与され、急性事象が終わると停止される。対照的に、慢性症状、障害、状態、または疾患は、十分に長い時間枠にわたって治療される。

用語「有効量」とは、患者に対する単回または複数回投与時に、所望の治療または予防を与える、本発明の抗体化合物の量または投与量を意味する。本発明の抗体化合物の治療有効量は、単回投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの範囲の量を含み得る。いずれかの個々の患者についての治療有効量は、バイオマーカーに対する抗体化合物の効果を管理することによって医療管理者によって決定され得る。

用語「骨の治癒」とは、ＤＫＫ−１を遮断することによる損傷部位における骨形成の刺激を意味する。骨の治癒指標の例としては、限定されないが、骨折治癒、インプラント固定／保持、および歯科インプラント固定／保持が挙げられる。

本発明のヒト遺伝子操作抗体は、様々な経路によって投与される、ヒト医療における医薬として使用され得る。最も好ましくは、このような組成物は非経口投与用である。このような医薬組成物は、当該技術分野において周知の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，第１９版（１９９５），Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．を参照のこと）によって調製されることができ、本願明細書に開示されるヒト遺伝子操作抗体、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。

以下のアッセイの結果は、本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントがＤＫＫ−１阻害剤として有用であることを実証する。本発明の抗体は多くの所望の特性を有する。例えば、本発明の抗体ＩＩは、高い化学的および物理的安定性、ならびに溶解性を有する。促進された研究が、異なるバッファー条件（ｐＨおよびＮａＣｌバリエーション）下で本発明の抗体をインキュベートすること、ならびに４週間、４℃、２５℃、および４０℃でインキュベートすることによって抗体の化学的安定性を評価するために実施される。本発明の抗体の化学修飾は、荷電した変異体を分離するためのカチオン交換（「ＣＥＸ」）クロマトグラフィー（例えば、アスパラギンのアスパラギン酸へのアミド分解）、および分解の特異的部位を識別するためのＬＣ−ＭＳ分析によって検出される。抗体ＩＩは、ＣＥＸによって検出される最小量の分解を有し、この結果は、ＬＣ−ＭＳデータによってさらに確認され、ＣＤＲにおける全ての３つのアスパラギン残基が、ｐＨ８のバッファー中で４０℃での４週間のインキュベーション後に、本願明細書に記載される他の抗体と比べて最小量のアミド分解を有することを示す。ｐＨ６＋１５０ｍＭＮａＣｌで調製される場合、抗体ＩＩについての溶解度は、抗体Ｉと比べてより有益である。さらに、４℃で保存される場合、抗体ＩＩは１０５ｍｇ／ｍＬより高い溶解度を維持したが、交代Ｉについての溶解度は、４８ｍｇ／ｍＬのみであり、これらの同じ条件下で沈殿する。本願明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」とは、薬剤について起こり得る５０％の最大応答を生じるその薬剤の濃度を意味する。「Ｋｄ」とは、式：ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ＝Ｋｄによって計算され得る平衡解離定数を意味する。

実施例１：抗体の産生
抗体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは以下のように生成し、精製できる。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡまたはＣＨＯなどの適切な宿主細胞を、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比を用いて抗体をスクリーニングするための発現系、または配列番号２３、もしくは配列番号２４などのＨＣ、および配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、もしくは配列番号２８などのＬＣの両方をコードする単一のベクター系で一過性または安定にトランスフェクトする。清澄培地（その中に抗体が分泌される）を、多くの一般に使用される技術のいずれかを用いて精製する。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性バッファーで平衡化されているプロテインＡまたはＧセファロースＦＦカラムに簡便に適用することができる。カラムを洗浄して非特異的結合成分を除去する。結合した抗体を、例えばｐＨ勾配（例えば０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８から０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ３．０）によって溶出する。抗体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどにより検出し、次いでプールする。意図する使用に応じて、さらなる精製を任意にする。抗体を一般的な技術を用いて濃縮および／または濾過滅菌し得る。可溶性会合体および多量体を、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効果的に除去し得る。これらのクロマトグラフィー工程の後の抗体の純度は９９％より高い。産生物は−７０℃ですぐに凍結してもよいか、または凍結乾燥してもよい。これらの抗体についてのアミノ酸配列を以下に提供する。

実施例２：ＤＫＫ−１抗体についての親和性（Ｋｄ）測定
結合平衡を確立するために、定濃度の抗体を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）またはバッファーのみにおける種々の濃度のＨｉｓ標識化ＤＫＫ−１（配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３）（１ｎＭ〜１ｐＭ範囲）と混合し、３７℃で数日間インキュベートする。２セットの結合反応物（１セットは低濃度の抗体（３ｐＭ）および１セットは高濃度の抗体（３０または５０ｐＭ））を設定する。

平衡を確立した後、ＫｉｎＥｘＡ３０００機器（ＳａｐｉｄｙｎｅＩｎｓｔ．Ｉｎｃ．）を使用して、「遊離」（非結合）抗体の画分をプローブする。つまり、Ｈｉｓ標識化ＤＫＫ−１を、小さいカラムを付与するためにその機器に詰められている、ＮＨＳ−活性化セファロース４高速流ビーズ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合する。抗体＋Ｈｉｓ標識化ＤＫＫ−１の予め平衡化された混合物をビーズに通して、遊離抗体のみを捕捉する。捕捉した遊離抗体の量は、平衡化されたサンプルの遊離濃度に比例し、蛍光標識された二次抗体の注入により検出される。低濃度および高濃度の抗体からのデータセットを、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアにおけるｎ曲線分析を用いて全体にフィットする。このフィッティングはＫｄ値および９５％信頼区間を回帰する。

実施例３：Ｃ２Ｃ１２アルカリホスファターゼアッセイにおけるＤｋｋ−１抗体の効果
標準的なＷｎｔシグナル伝達は骨芽細胞分化および活性に重要である。ＢＭＰ−４と混合したＷｎｔ−３ａＣＭ（馴化培地）は、多能性マウスＣ２Ｃ１２細胞を誘導して、アルカリホスファターゼ（「ＡＰ」）、骨芽細胞活性のマーカーの測定可能なエンドポイントを有する骨芽細胞に分化する。ＤＫＫ−１、標準的なＷｎｔシグナル伝達の阻害剤は、ＡＰの分化および産生を阻害する。ＤＫＫ−１抗体を中和することにより、ＡＰのＤＫＫ−１媒介性阻害が防止される。ＤＫＫ−１阻害活性を遮断する抗体はＡＰ活性の損失を防止する。

Ｃ２Ｃ１２細胞は、組織培養フラスコにおいて増殖培地（Ｌ−グルタミン、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）、１×抗生物質／抗真菌薬、１×ピルビン酸ナトリウムを含有するダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」））中で６０％〜８０％コンフルエンスまで増殖する。Ｃ２Ｃ１２細胞を、増殖培地中に３０，０００細胞／ｍＬの濃度まで再懸濁し、１００μＬ／ウェルを９６ウェル組織培養プレートに添加し、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートする。増殖培地を、５０μＬのアッセイ培地（Ｌ−グルタミン、５％の熱不活性化ＦＢＳ、１×抗生物質／抗真菌薬、１×ピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ）と置き換える。分化（およびそれによるＡＰ産生の誘導）を刺激するために、１００μＬのアッセイ培地および１．５×Ｗｎｔ−３ａＣＭ＋ＢＭＰ−４（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓカタログ＃３１４−ＢＰ）を加える。これにより、１×Ｗｎｔ−３ａＣＭおよび２５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−４の最終濃度を得る。陰性コントロールはＬ細胞ＣＭのみを含む（Ｗｎｔ−３ａまたはＢＭＰ−４を含まない）。細胞を、７２時間、３７℃、９５％湿度、５％ＣＯ_２にてインキュベートする。培地を除去し、細胞を、２００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で洗浄し、ＰＢＳを除去する。細胞を、３回凍結融解する。１００μＬのワンステップｐＮＰＰ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ＃３７６２１）をウェルごとに加え、プレートを室温でインキュベートする。吸光度を４０５ｎｍで読み取る。分化を阻害するのに必要とされるＤＫＫ−１の濃度を決定するために、様々な種由来のＤｋｋ−１分子を滴定して、ＡＰ誘導を完全に阻害するのに必要な最小濃度を同定する。

ＡＰ誘導を完全に阻害する各々の種由来のＤＫＫ−１の最小濃度は以下の通りである：ヒトＤＫＫ−１＝３８ｎＭ、カニクイザルＤＫＫ−１＝１１．４ｎＭ、ラットＤＫＫ−１＝５．８ｎＭ、およびウサギＤＫＫ−１＝２５．０ｎＭ。

ＡＰ誘導を完全に阻害するＤＫＫ−１の濃度を決定することで、高濃度の抗ＤＫＫ−１抗体を、室温で３０分間、阻害濃度のＤｋｋ−１を含むアッセイ培地に予めインキュベートする。ＡＰ誘導を上記のように決定する。結果をＥＣ５０（ｎＭ±標準誤差）として報告する。

抗体ＩＩは、Ｃ２Ｃ１２ＡＰのＤｋｋ−１媒介性阻害を遮断する。様々な種のＤＫＫ−１について、ＥＣ５０（ｎＭ±標準誤差として与える）は以下の通りである：ヒト＝９．８±０．４１、カニクイザル＝６．４±０．２５、ラット＝２．９±０．２５、およびウサギ＝６．０±０．３２。

実施例４：インビボアッセイにおける皮質欠損（ＣＤ）
６ヶ月齢の雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを卵巣切除し、２ヶ月間骨を損傷させる。２ｍｍ直径の欠損を、２ｍｍの歯科用ビットを備える電気ドリルを用いて左および右の大腿骨に導入する。この穴は前部皮質および後部皮質の両方に広がる。骨の治癒を、外科手術後３５日間、定量的コンピュータ断層撮影（「ｑＣＴ」）を使用して骨量密度（「ＢＭＤ」）を評価することによって長期的にモニターする。実験の終わりに、動物を屠殺し、大腿骨全体を、骨幹全体の生化学的強度を確認するために欠損までの負荷（ｌｏａｄｅｄ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）の測定に供する。抗体を示した用量および間隔で皮下に投与する。

抗体ＩＩは以下の用量である：外科出術後１日に開始して２週間ごとに１回、５ｍｇ／ｋｇ（１群）、外科手術後９日に開始して２週間ごとに１回、１ｍｇ／ｋｇ（２群）、５ｍｇ／ｋｇ（３群）、または１５ｍｇ／ｋｇ（４群）を投与する。ＢＭＤを３５日にｑＣＴにより評価する。１群は、前部皮質および後部皮質の両方において統計的に有意なＢＭＤの増加を示した。４群は、皮質の両方において統計的に有意なＢＭＤの増加を示したが、２群および３群は、有意でないＢＭＤの増加を示した。

実施例５：インビボにおける癌の効果アッセイ
マウス（雌のＣ．Ｂ−１７マウス、ＦｏｘＣｈａｓｅ重症複合免疫不全モデル＃ＣＢ１７ＳＣ−Ｍ）を、実験開始前に動物施設において１週間順化する。順化後、マウスを処置あたり１０の群に無作為化する。培養したヒトＡ５４９非小細胞肺癌細胞を、マウスのひ腹に皮下移植し、腫瘍を平均腫瘍体積約１００ｍｍ３に到達させる。抗体ＩＩ（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）、コントロールＩｇＧ抗体（１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）、または賦形剤（０．０２％のＴｗｅｅｎ８０を補足したクエン酸緩衝生理食塩水）を皮下注射により投与する。動物に７日間隔で２回処置を与える。

腫瘍を電気キャリパーにより１週間ごとに２回測定して、増殖曲線をプロットする。動物をまた、体重変動および毒性兆候に関して１週間に２回モニターする。表３に示す腫瘍体積測定を２９日目に得る。

表２に示すように、抗体ＩＩを受容した処置群は、インビボにおいてヒトＡ５４９非小細胞肺異種移植片の有意な増殖阻害を示した。

実施例６：インビボ異種移植片アッセイにおける血管形成の再正常化
抗腫瘍効果の機構を理解するために、ハイコンテントイメージング分析を、抗体ＩＩまたはＩｇＧコントロールで処置したＡ５４９腫瘍で実施する。数個の表現型に基づいたマーカーを、定量的および定性的の両方で分析して、血管形成（ＣＤ３１および平滑筋アクチン、ＳＭＡ）、低酸素症誘発（グルコース輸送体１、ＧＬＵＴ１）、細胞増殖（Ｋｉ６７）、およびアポトーシス（ＴｅｒｍｉｎａｌＵＤＰＮｉｃｋ−ＥｎｄＬａｂｅｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ）の癌関連生物学的プロセスを評価する。

雌のＣ．Ｂ−１７（ＦｏｘＣｈａｓｅＳＣＩＤ）モデル＃ＣＢ１７ＳＣ−Ｍマウス（７〜８週齢）を１週間順化させ、通常の低脂肪（４．５％）の食餌を自由に与え、それを研究期間の間、継続する。

ＡＴＣＣ起源からのＡ５４９細胞を増殖させ、１０％ＦＢＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ＃０、ならびにピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸およびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１１３６０、＃１１１４０および＃１５１４０）の１００倍希釈）を補足したＦ−１２Ｋａｉｇｈｎ’ｓ培地（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ＃２１１２７）に分ける。それらを分離し、９５％生存率で１９回の継代にてＰＢＳ中の５０×１０^６個の細胞／ｍｌの最終濃度に調製する。

５×１０^６個のＡ５４９ヒト肺癌細胞を、ＰＢＳとマトリゲル（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の１：１の混合物中で対象マウスの横腹に皮下注射する。腫瘍および体重測定を週に２回実施する。処置前に、マウスを、ランダム化アルゴリズムを用いて腫瘍サイズに基づいて無作為化する。

腫瘍が２００ｍｍ^３に到達してから開始し、無作為化したマウスを、１０匹の動物の２つの群に分け、５ｍｇ／ｋｇの抗体ＩＩまたはＩｇＧ４コントロールのいずれかを１日目および再度８日目に皮下投与する。この研究は、抗体の最初の用量投与後、１０日で終了する。

抗体ＩＩをクエン酸緩衝生理食塩水（ＣＢＳ）（１０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ６、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．２％のポリソルベート）中に調製する。ＩｇＧ４コントロールをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に６．０ｍｇ／ｍｌにて与える。

異種移植片腫瘍を、投与の１７日後にマウスから摘出し、亜鉛−トリス固定剤（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に入れる。固定した腫瘍を処理し、パラフィンで遮断し、標準顕微鏡スライド上に３μＭのスライスとして薄片にする。スライドを、６０°Ｆにて１時間、焼き固め、次いでキシレン中で脱パラフィンする（４回の処置、１０分ごと）。スライドを、トリス緩衝生理食塩水／Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）での最終洗浄を用いて連続したエタノール／水浸漬により再水和する。次いでスライドを、３０分間、プロテインブロック（ＰｒｏｔｅｉｎＢｌｏｃｋ）（ＤＡＫＯ）で遮断する。腫瘍状態パネル（ＴｕｍｏｒＨｅａｌｔｈＰａｎｅｌ）に関して、スライドを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラット抗ヒトＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）／抗ラットＡｌｅｘａ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ウサギ抗Ｋｉ６７（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）／抗ウサギＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＴＵＮＥＬ−ＴＭＲレッド（ＴＵＮＥＬ希釈バッファー中で１：５に希釈；Ｒｏｃｈｅ）の組み合わせで染色する。血管形成パネルに関して、スライドを、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラット抗ヒトＣＤ３１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）／抗ラットＡｌｅｘａ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ウサギ抗ＧＬＵＴ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）／抗ウサギＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびマウス抗平滑筋アクチン／Ｃｙ３（Ｓｉｇｍａ）の組み合わせで染色する。スライドを、ｉＣｙｓレーザー走査型サイトメトリー（ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ）およびＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ倒立蛍光顕微鏡で構成されるＭａｒｉａｎａｓＤｉｇｉｔａｌＩｍａｇｉｎｇＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔＩｍａｇｉｎｇＩｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）を用いて画像化する。処置群の定量的データ比較を、ＪＭＰ統計ソフトウェア（ＳＡＳ）においてダネット分析を用いて実施する。

表３に示すように、コントロールＩｇＧ処置した動物由来のＡ５４９異種移植片は適度に血管が新生し、適度なレベルの筋線維芽細胞および低酸素の多くの局部的領域を有する。コントロールＩｇＧ処置した腫瘍は、新血管形成血管発芽および周皮細胞にほとんど覆われていない成熟血管の両方からなる血管の拡大ネットワークを有する。コントロールＩｇＧ処置した腫瘍は、潅流血管から少し離れた明確に画定された領域および血管からさらに離れた壊死部分である低酸素領域（ＧＬＵＴ１によってマークした）を有する。抗体ＩＩでの処置により、減少した血管領域、減少した周皮細胞領域、および減少した血管の周皮細胞範囲を生じる。しかしながら、この処置は、腫瘍低酸素の有意差を生じない。定性的に、抗体ＩＩで処置した腫瘍血管系は、より小さな、ほとんどネットワーク化されていない血管からなり、コントロールＩｇＧ処置した群と比べて周皮細胞範囲をほとんど有さないように見える。

表３に示すように、ＩｇＧ処置した腫瘍は、全体にわたって均一に分布している増殖腫瘍細胞を有するが、また、血管のない１つ以上の広範囲の壊死も頻繁に示す。抗体ＩＩでの処置は、アポトーシスの変化を生じず、全増殖領域のわずかな有意でない減少のみである。しかしながら、抗体ＩＩで処置した腫瘍において高度に集中するＫｉ６７細胞の領域の割合が大きく減少し、Ｇ２細胞周期において細胞の減少した量を示し得る。

実施例７：インビボにおける骨の効果アッセイ
インプラント周辺の骨形成を促進し、骨組織を再生する抗体Ｖ（軽鎖配列番号３４および重鎖配列番号３５）の能力を評価するために、体重約４２５ｇの４か月齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙＩｎｃ）を利用する。ラットに、チタンネジ（２ｍｍ×４ｍｍ）を脛骨−腓骨連結部上の両下肢の右外側の中膜に外科的に埋め込む。次いで、ラットを体重によって無作為に２つの群に分け、１０ｍｇ／ｋｇの抗体Ｖまたは１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧコントロールのいずれかを、２１日間、外科手術の同じ日に開始して１週間に１回皮下注射を与える。定量的コンピュータ断層撮影（ＡｌｏｋａＬａＴｈｅｔａＬＴＣ−１００モデルＣＴスキャナー）を、生体外で走査するために使用し、６０μｍのボクセルサイズの新しく形成された骨を定量する。目的の体積（ＶＯＩ）を、以前のインプラント部位にわたって０．１ｍｍ間隔で２８スライスと定義する。群の相違を、ＪＭＰバージョン５．１．ソフトウェア（Ｃａｒｙ，ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ）を用いて評価し、ｐ＜０．０５の有意なレベルでダネット法を使用してＩｇＧコントロールと比較する。生体外でのファキシトロン（ｆａｘｉｔｒｏｎ）ｘ線画像による定性的評価により、抗体Ｖで処置したラットが多くの新しい骨またはインプラント周辺に仮骨を有することが示される。定量的ＣＴ分析により、ＩｇＧコントロールと比べて抗体Ｖで処置したラットにおいて、皮質インプラント周辺の骨塩量（１４％）、新しい骨領域（１６％）、皮質厚（７％）ならびに骨髄海綿状インプラント周辺の新しい骨塩量（１８％）および骨領域（１６％）の統計的に有意な増加が明らかにされる。このデータにより、抗体Ｖが、チタンを埋め込んだラットにおいて新しい骨形成を刺激し、骨組織再生を促進することが実証される。

配列表

重鎖 CDRs

配列番号:1 GFTFSSYTMS
配列番号:2 TISGGGFGTYYPDSVKG
配列番号:3 PGYHNYYFDI
配列番号:4 PGYNNYYFDI

軽鎖 CDRs

配列番号:5 HASDSISNSLH
配列番号:6 YGRQSIQ
配列番号:7 QQSESWPLH
配列番号:8 YARQSIQ
配列番号:9 QQSASWPLH
配列番号:10 YARQSEQ

重鎖可変領域

配列番号:11
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYHNYYFDIWGQGTTVTVSS

配列番号:12
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYNNYYFDIWGQGTTVTVSS

軽鎖可変領域

配列番号:13
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIK

配列番号:14
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIK

配列番号:15
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIK

配列番号:16
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSEQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIK

完全な重鎖

配列番号:17
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYHNYYFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

配列番号:18
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYNNYYFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

完全な軽鎖

配列番号:19
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号:20
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSESWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号:21
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYGRQSIQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号:22
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYARQSEQGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSASWPLHFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ヌクレオチド配列 - 重鎖可変領域

配列番号:23
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGGTGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATCACAACTACTACTTTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

配列番号:24
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATACCATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATTTCCGGTGGTGGTTTCGGCACATACTATCCCGACAGTGTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACCTGGATATAATAACTACTACTTTGACATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT

ヌクレオチド配列 - 軽鎖可変領域

配列番号:25
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

配列番号:26
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGAGAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

配列番号:27
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGGCAGACAGTCCATCCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

配列番号:28
GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCCACGCCAGCGACAGTATTAGCAACAGCCTACACTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATTATGCTAGACAGTCCGAGCAGGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAACAGAGTGCCAGCTGGCCGCTCCACTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC

ヒト DKK-1

配列番号:29
TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH

カニクイザルDKK-1

配列番号:30
TLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNNFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHSKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQR

ラット DKK-1

配列番号:31
TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQPYPCAEDEECGTDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICMPSDHSHLPRGEIEEGIIENLGNDHGAGDGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLACRIQKDHHQTSNSSRLHTCQRHAFIDYKDDDDKHV

ウサギ DKK-1

配列番号:32
TLNSVLVNSNAIKNLPPPLGGANGHPGSAVSATPGILYEGGNKYLPLDNYQPYPCTEDEECGTDEYCASPARGGGAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICMPSDHNHFHRGEIEETIVESFGNDHSTSDGYSRRTTLSSKMYHAKGQEGSVCLRSSDCATGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGDGLSCRLQNDQHEASNSSRLHTCQR

マウス DKK-1

配列番号:33
TLNSVLINSNAIKNLPPPLGGAGGQPGSAVSVAPGVLYEGGNKYQTLDNYQPYPCAEDEECGSDEYCSSPSRGAAGVGGVQICLACRKRRKRCMTHAMCCPGNYCKNGICMPSDHSHFPRGEIEESIIENLGNDHNAAAGDGYPRRTTLTSKIYHTKGQEGSVCLRSSDCAAGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHKRKGSHGLEIFQRCYCGEGLACRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH

抗体 V - 完全な軽鎖

配列番号:34
DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLSKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC

抗体 V - 完全な重鎖

配列番号:35
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRNCGGDCKPCICTGSEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISQDDPEVHFSWFVDDVEVHTAQTRPPEEQFNSTFRSVSELPILHQDWLNGRTFRCKVTSAAFPSPIEKTISKPEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQPQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKEKWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

抗体 V - 軽鎖可変領域

配列番号:36
DILLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASDSISGSLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLNFGAGTKLELK

抗体 V - 重鎖可変領域

配列番号:37
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISGGGGNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLSSLRSEDTALYYCARPGYNNYYFDYWGQGTTLTVSS

抗体 V - 重鎖CDRs

配列番号:38 TISGGGGNTYYPDSVKG
配列番号:39 PGYNNYYFDY

抗体 V - 軽鎖 CDRs

配列番号:40 RASDSISGSLH
配列番号:41 YASQSIS
配列番号:42 QQSNSWPLN

コンセンサス重鎖 CDRs

配列番号:43 TISGGGX₁X₂TYYPDSVKG
X₁ は F, Gである
X₂ は G, Nである

配列番号:44 PGYX₃NYYFDI
X₃ は H, Nである

配列番号:45 PGYX₄NYYFDX₅
X₄ は H, Nである
X₅ は I, Yである

コンセンサス軽鎖 CDRs

配列番号:46 X₆ASDSISX₇SLH
X₆ は H, Rである
X₇ は N, Gである

配列番号:47 YX₈RQSX₉Q
X₈ は G, Aである
X₉ は I, Eである

配列番号:48 YX₁₀X₁₁QSX₁₂X₁₃
X₁₀ は G, Aである
X₁₁ は R, Sである
X₁₂ は I, Eである
X₁₃ は Q, Sである

配列番号:49 QQSX₁₄SWPLH
X₁₄ は E, Aである

配列番号:50 QQSX₁₅SWPLX₁₆
X₁₅ は E, A, Nである
X₁₆ は H, Nである

コンセンサス重鎖可変領域
配列番号:51
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGFGTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPGYX₁₇NYYFDI WGQGTTVTVSS
X₁₇ は H, Nである

コンセンサス軽鎖可変領域
配列番号:52
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASDSISNSLHWYQQKPGQAPRLLIYYX₁₈RQS X₁₉QGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC QQSX₂₀SWPLHFGGGTKVEIK
X₁₈ は G, Aである
X₁₉ は I, Eである
X₂₀ は E, Aである

Claims

ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）、カニクイザルＤＫＫ−１（配列番号３０）、ラットＤｋｋ−１（配列番号３１）、マウスＤＫＫ−１（配列番号３３）、およびウサギＤＫＫ−１（配列番号３２）について、５．０×１０^−１１Ｍ未満のＫｄを有する、ヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
該Ｋｄは、ＫｉｎＥｘＡ３０００機器を用いて３７°Ｃにて決定される、請求項１に記載のヒト遺伝子操作抗体またはその抗原結合フラグメント。
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、該ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）である、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、該ＨＣＶが、ＣＤＲである、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、該ＬＣＤＲ１が配列番号５のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
該ＬＣＤＲ１が配列番号５のアミノ酸配列を有し、該ＬＣＤＲ２が配列番号４７のアミノ酸配列を有し、該ＬＣＤＲ３が配列番号４９のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ１が配列番号１のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ２が配列番号２のアミノ酸配列を有し、該ＨＣＤＲ３が配列番号４４のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
該ＬＣＤＲ１、該ＬＣＤＲ２、該ＬＣＤＲ３、該ＨＣＤＲ１、該ＨＣＤＲ２、および該ＨＣＤＲ３が、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）該ＬＣＤＲ１は配列番号５であり、該ＬＣＤＲ２は配列番号６であり、該ＬＣＤＲ３は配列番号７であり、該ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、該ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、該ＨＣＤＲ３は配列番号３である、
（ｉｉ）該ＬＣＤＲ１は配列番号５であり、該ＬＣＤＲ２は配列番号８であり、該ＬＣＤＲ３は配列番号７であり、該ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、該ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、該ＨＣＤＲ３は配列番号４である、
（ｉｉｉ）該ＬＣＤＲ１は配列番号５であり、該ＬＣＤＲ２は配列番号６であり、該ＬＣＤＲ３は配列番号９であり、該ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、該ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、該ＨＣＤＲ３は配列番号３である、
（ｉｖ）該ＬＣＤＲ１は配列番号５であり、該ＬＣＤＲ２は配列番号１０であり、該ＬＣＤＲ３は配列番号９であり、該ＨＣＤＲ１は配列番号１であり、該ＨＣＤＲ２は配列番号２であり、該ＨＣＤＲ３は配列番号３である、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３または４に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
該ＬＣＶＲが配列番号５２のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＶＲが配列番号５１のアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
該ＬＣＶＲが配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３から６のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
該ＨＣＶＲが配列番号１１および配列番号１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３から７のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
該ＬＣＶＲおよび該ＨＣＶＲが、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）該ＬＣＶＲが配列番号１３のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＶＲが配列番号１１のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）該ＬＣＶＲが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＶＲが配列番号１２のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）該ＬＣＶＲが配列番号１５のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＶＲが配列番号１１のアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）該ＬＣＶＲが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＶＲが配列番号１１のアミノ酸配列を含む；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３から８のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
該ＬＣＶＲが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、該ＨＣＶＲが配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、を含む、請求項３から９のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖、を含む、請求項３から９のいずれか１項、または、請求項１１に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
以下の（ａ）〜（ｄ）：
（ａ）該重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、該軽鎖が配列番号１９のアミノ酸配列を含む、
（ｂ）該重鎖が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、該軽鎖が配列番号２０のアミノ酸配列を含む、
（ｃ）該重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、該軽鎖が配列番号２１のアミノ酸配列を含む、および
（ｄ）該重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、該軽鎖が配列番号２２のアミノ酸配列を含む、
からなる群より選択される該重鎖および該軽鎖のアミノ酸配列を含む請求項３から９、または、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
各軽鎖が配列番号２０のアミノ酸配列を含む２本の軽鎖、および、各重鎖が配列番号１８のアミノ酸配列を含む２本の重鎖、を含む請求項３から１３のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体。
抗体競合アッセイにより決定されるように、ヒトＤＫＫ−１（配列番号２９）に対して結合するための請求項３から１４のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント、および、医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、医薬組成物。
医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤および任意の他の治療成分とともに、請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
治療に用いるための、請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
骨の治癒の治療に用いるための、請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
骨の治癒のための医薬の製造における、請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
癌の治療に用いるための、請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
該癌は、多発性骨髄腫、乳癌、および非小細胞肺癌からなる群より選択される、癌の治療に用いるための請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１から１５のいずれか１項に記載のヒト遺伝子操作ＤＫＫ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
該癌は、多発性骨髄腫、乳癌、および非小細胞肺癌からなる群より選択される請求項２３に記載の使用。