KR20120088555A - 환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경적 영향인자를 사용한 대사적 장애의 진단 방법 - Google Patents

환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경적 영향인자를 사용한 대사적 장애의 진단 방법 Download PDF

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KR20120088555A
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니벤 라진 나라인
존 패트릭 맥쿡
랑가프라사드 사랑가라잔
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버그 바이오시스템즈, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경적 영향인자를 사용한 대사적 장애를 진단하는 방법에 관한 것이다. 환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경적 영향인자를 사용한 사람에서 대사적 장애를 진단하기 위한 방법 및 제형이 기재된다.

Description

환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경적 영향인자를 사용한 대사적 장애의 진단 방법{METHODS FOR THE DIAGNOSIS OF METABOLIC DISORDERS USING EPIMETABOLIC SHIFTERS, MULTIDIMENSIONAL INTRACELLULAR MOLECULES, OR ENVIRONMENTAL INFLUENCERS}
본 출원은 “환경대사적 전환인자(조효소 Q10)을 사용하여 종양학적 장애를 치료하는 방법(Attorney docket no.: 117732-00601)”이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,241호, “환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 종양학적 장애를 치료하는 방법(Attorney docket no.: 117732-00701)”이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,243호, “환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 종양학적 장애를 진단하는 방법(Attorney docket no.: 117732-00801)”이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,244호, “환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 대사적 장애를 치료하기 위한 방법(Attorney docket no.: 117732-00901)”이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,245호 및 “환경대사적 전환인자, 다차원 세포내 분자 또는 환경 영향인자를 사용하여 대사적 장애를 진단하기 위한 방법(Attorney docket no.: 117732-01001)”이란 명칭으로 2009년 5월 11일자에 출원된 미국 가출원 일련번호 제61/177,246호에 대하여 우선권을 주장한다. 상기 출원 각각의 모든 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 당뇨병 및 비만과 같은 대사적 장애의 진단에 관한 것이다.
혈당 수준이 식후 상승함으로써, 인슐린이 분비되고 말초 조직(골격근 및 지방)의 세포가 에너지원으로서 혈액으로부터 글루코스를 능동적으로 흡수하도록 자극한다. 조절불능의 인슐린 분비 또는 활성의 결과로서 글루코스 항상성의 상실은 전형적으로 당뇨병과 같은 대사적 장애를 유발하고 이는 비만에 의해 동시유발되거나 추가로 악화될 수 있다. 이들 병태는 흔히 치명적이기 때문에 혈류로부터 적당한 글루코스 제거를 복원하기 위한 전략이 필요하다.
당뇨병은 췌장에 강한 손상을 유발하는 임의의 병태(예를 들어, 췌장염, 종양, 코르티코스테로이드 또는 펩타미딘과 같은 특정 약물의 투여, 철 과중(예를 들어, 혈색소침착증), 후천성 또는 유전학적 내분비병증 및 수술 절제)에 부수적으로 발병할 수 있고, 가장 일반적인 형태의 당뇨병은 전형적으로 인슐린 시그날 전달계의 주요 장애로부터 발병한다. 2개의 주요 유형의 당뇨병, 즉 1형 당뇨병(또한 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)으로서 공지됨) 및 2형 당뇨병(또한 인슐린 비의존성 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)으로서 공지됨)이 있고 이들은 이들의 상이한 병리학적 기작에도 불구하고 공통된 장기 합병증을 공유한다.
1형 당뇨병은 주요 당뇨병에 대한 모든 사례의 대략 10%를 차지하고 기관 특이적 자가면역 질환이고 췌장의 인슐린 생성 베타 세포가 강하게 파괴됨을 특징으로 한다. 결과적으로 인슐린 생성의 감소는 불가피하게 글루코스 대사의 조절 불능을 유도한다. 인슐린 투여가 상기 병태를 앓는 환자에게 상당한 이득을 제공하지만 인슐린의 짧은 혈청 반감기가 정상혈당을 유지하는데 주요 장애가 된다. 또 다른 치료법은 섬세포 이식이지만 상기 전략은 이의 성과가 제한적이다.
집단의 보다 큰 비율에 영향을 주는 2형 당뇨병은 인슐린 분비의 조절 불능 및/또는 말초 조직의 인슐린에 대한 감소된 반응, 즉 인슐린 내성을 특징으로 한다. 2형 당뇨병의 병리학적 과정이 아직 명확하지 않지만 역학적 연구는 상기 형태의 당뇨병이 다중 유전학적 결함 또는 다형성(이들 각각은 자신이 위험을 가져다주는데 기여하고 환경적 인자(과체중, 다이어트, 비활동성, 약물 및 과다 알콜 소비를 포함함)에 의해 변형된다)으로부터 비롯됨을 시사한다. 다양한 치료학적 치료가 2형 당뇨병의 관리를 위해 가용하지만 이들은 쇠약하게 하는 다양한 부작용과 연관되어 있다. 따라서, 2형 당뇨병을 갖거나 이의 위험에 처한 것으로 진단된 환자는 흔히 체중 감량, 다이어트 변화, 운동 및 적당한 알콜 섭취를 포함하는, 보다 건강한 생활방식을 채택하도록 권유된다. 그러나 상기 생활방식의 변화는 당뇨병에 의해 유발된 혈관 및 기관 손상을 역전시키기에는 충분하지 않다.
여기에서 CoQ10, Q10, 유비퀴논 또는 유비데카레논이라고도 칭해지는 조효소 Q10은 인기 있는 영양보조제이고, CoQ10의 환원형인 유비퀴놀의 항산화 특성을 통해 면역 체계를 보호하도록 도와주는 비타민 유사 보조식품으로 영양제품 전문점, 건강식품점, 약국 및 유사 상점에서 캡슐 형태로 찾을 수 있다. CoQ10은 잘 알려진 물질이고 여기에서 참고문헌으로 포함된 것의 전체 공개내용은 국제 공개번호 WO2005/069916에서 좀 더 자세하게 설명되었다.
CoQ10은 인체 대부분 조직과 기타 포유류의 조직에서 발견된다. 인체에서 CoQ10의 조직분포와 산화환원상태는 Bhagavan 와 Chopra 등이 작성한 리뷰 아티클인 2006, Free Radical Research 40(5), 445-453 에서 검토되었다. 저자들은 “일반적으로 심장, 신장, 간, 근육 등 고에너지를 요하거나 대사활동이 있는 조직은 상대적으로 고농도의 CoQ10을 함유한다”라고 발표했다. 또한 저자들은 “[a]뇌와 폐를 제외하고는 조직에서 CoQ10이 환원형인 하이드로퀴논 또는 유비퀴놀로 대부분 존재하”고 “이것은 뇌와 폐 조직에서 증가된 산화 스트레스가 반영되었음을 알수 있다.”고 발표했다. 특히, Bhagavan et al.은 심장, 신장, 간, 근육, 소장 및 혈액(혈장)에서 각각 75%, 95%, 65%, 95%, 96%의 CoQ10이 환원형이라고 발표했다. 이와 유사하게 Ruiz-Jiminez, 2007 J. Chroma A 1175, 242-248은 인간 혈장의 Q10과 Q10 환원형(Q10H2)를 분석했을 때 분자의 대부분(90%)이 환원형이었다고 발표했다.
CoQ10은 상당히 지용성이고 보통 물에 녹지 않는다. 물에서의 불용해성과 지질에서의 제한된 용해성 그리고 상대적으로 큰 분자량 때문에 CoQ10의 경구 투여 흡수율은 낮다. Bhagavan와 Chopra 는 “쥐에서 한 어떠한 실험에서, 경구 투여된 CoQ10의 2-3%만이 흡수되었다”고 보고하였다. Bhagavan와 Chopra는 또한 “쥐 실험에서의 데이터가 Co10이 소장에서 흡수 중 또는 그 후 유비퀴놀로 환원됨을 보여준다”고 보고하였다.
당뇨병 관리를 위해 현재 가용한 전략은 최적 수준에 이르지 못하였고 보다 효과적이고 쇠약하게 하는 부작용과 관련되지 않은 치료법이 강하게 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로 내인성 조효소 Q10(또한 본원에서 CoQ10 또는 Q10으로 언급됨)의 적용이 아폽토시스 잠재력을 회복시킨다는 발견을 토대로 한다. 아폽토시스 반응은 우선적으로 암 세포에서 유도된다. 미토콘드리아 Q10 수준의 시간 및 용량 반응은 48시간 후에 세포 미토콘드리아 Q10의 수준이 6배 증가하는 것으로 관찰된다. 본 발명은 추가로 Q10이 공급 산화된 형태(프로-산화제)로 유지되고 임의의 상당한 양으로 환원된(항산화제) 형태의 Q10H2로 전환되지 않는 다는 놀랍고 예상치 않은 발견을 토대로 한다. 본 발명은 상당한 수의 단백질 및 mRNA 수준이 Q10으로 처리된 세포에서 조절된다는 추가의 발현을 토대로 한다. 이들 조절된 단백질은 아폽토시스, 암 생물학 및 세포 정상, 해당과정 및 대사, 분자 수송 및 세포 시그날 전달을 포함하는 여러 세포 경로로 응집되어 있는 것으로 밝혀졌다.
본원에 기재된 출원 데이타는 Q10의 작용 기작으로 통찰력을 제공하였다. 특히, 이론에 국한되지 않고 출원의 발견은 Q10이 세포 미세환경으로의 대사적 전환을 유도함을 지적한다. 많은 질환들은 변화된 대사적 상태와 관련된 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 차등 대사는 암 세포에서 발생하는 것으로 공지되어 있고(바루그 효과(Warurg effect)), 이에 의해 대부분의 암 세포는 미토콘드리아에서 산화성 인산화(피루베이트의 산화)에 의해 보다는 해당과정에 이은 락트산 발효에 의해 에너지를 주로 생산한다. 또 다른 예에서, 대사적 장애, 예를 들어, 당뇨병 및 비만은 변화된 글루코스 대사와 관련되어 있다.
따라서, 특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다); 및 (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계(여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 앓고 있다는 징후이다)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, (1) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 마커의 발현이 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화 쪽으로 세포 대사 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 환부 세포에서 변화된다); 및 (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계 (여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있다는 징후이다)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다); 및 (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하는 단계(여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있다는 징후이다)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, (1) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 마커의 발현이 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화 쪽으로 세포 대사 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 환부 세포에서 변화된다); 및 (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하는 단계 (여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있다는 징후이다)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 치료 계획의 적어도 일부를 피검체에게 적용하기 전에 상기 피검체로부터 수득한 제1 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준(여기서, 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다)을 (2) 치료 계획중 적어도 일부를 적용한 후 제2 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교함을 포함하고, 이때, 제1 샘플과 대비하여 제2 샘플중에 마커의 발현 수준의 변화는 치료가 상기 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 징후이다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 치료 계획의 적어도 일부를 피검체에게 적용하기 전에 상기 피검체로부터 수득한 제1 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준(여기서, 마커의 발현은 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포 대사 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 환부 세포에서 변화된다)을 (2) 치료 계획중 적어도 일부를 적용한 후 제2 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교함을 포함하고, 이때, 제1 샘플과 대비하여 제2 샘플중에 마커의 발현 수준의 변화는 치료가 상기 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 징후이다.
특정 측면에서, 본 발명은 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 생물학적 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되고 마커는 양성 배수 변화 및/또는 음성 배수 변화를 갖는, 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다); (2) 피검체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않는다); 및 (3) 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플중의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않는 생물학적 샘플중에서 하나 이상의 마커 발현 수준을 비교하여 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 단계(여기서,제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플중에 존재하는 음성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준의 감소는 환경적 영향인자 화합물이 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 징후이고 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플중에 존재하는 양성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준의 증가는 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 징후이다)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 생물학적 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되고 마커의 발현은 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포 대사적 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 장애의 환부 세포에서 상향 또는 하향 조절된다); (2) 피검체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않는다); 및 (3) 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플중의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않은 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 비교하여 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 단계(여기서, 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여, 하나 이상의 하향 조절된 마커의 발현 수준에서 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플에서의 감소는 환경적 영향인자 화합물이 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 징후이고, 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여, 하나 이상의 상향조절된 마커의 발현 수준에서 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플에서의 증가는 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 징후이다)를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (2) 생물학적 샘플을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; (3) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(이때 상기 마커는 양성 배수 변화 및/또는 음성 배수 변화를 갖는, 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다); (4) 생물학적 샘플중에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 시험 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 (5) 생물학적 샘플중에 존재하는 음성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 감소시키고/시키거나 생물학적 샘플중에 존재하는 양성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 선별하여 피검체중에 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 단계를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (2) 생물학적 샘플을 시험 화합물과 접촉시키는 단계; (3) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(이때 상기 마커의 발현은 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포 대사적 에너지 잔환이 일어나도록 유도된 대사적 장애의 환부 세포에서 상향 또는 하향 조절된다); (4) 생물학적 샘플중에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 시험 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 (5) 생물학적 샘플에서 하나 이상의 하향 조절된 마커의 발현 수준을 감소시키고/시키거나 생물학적 샘플에서 하나 이상의 상향 조절된 마커의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 선별하여 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 대사적 장애는 당뇨병, 비만, 전당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환, 대사적 증후군 및 대사적 장애의 임의의 주요 요소들로 구성된 군으로부터 선택되는 장애이다.
몇몇 양태에서, 상기 마커는 피검체의 환부 세포에서 정상화된 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포성 대사 에너지 전환을 선택적으로 유발한다.
몇몇 양태에서, 상기 샘플은 피검체로부터 수득한 유체, 예를 들어, 혈류, 구토물, 침액, 림프액, 낭포액, 뇨, 기관지 폐포에 의해 수거된 유체, 복강 세정에 의해 수거된 유체 및 부인과적 유체로부터 선택된 유체를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 샘플은 혈액 샘플 또는 이의 성분이다. 몇몇 양태에서, 상기 샘플은 피검체로부터 수득한 조직 또는 이의 성분, 예를 들어, 골, 연결 조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장 및 피부로부터 선택된 조직을 포함한다.
몇몇 양태에서, 피검체는 사람이다.
몇몇 양태에서, 생물학적 샘플중의 마커의 발현 수준은 샘플중에 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석함에 의해 측정한다. 몇몇 양태에서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석은 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킴을 포함한다. 몇몇 양태에서, 피검체 샘플중의 마커의 발현 수준은 샘플중에 단백질 또는 이의 일부를 분석함에 의해 측정한다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 시약, 예를 들어, 표지된 시약(이는 마커와 특이적으로 결합한다)을 사용하여 분석한다. 시약은 예를 들어, 항체 및 항원 결합 항체 단편을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 샘플중의 마커의 발현 수준은 상기 샘플에 대한, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 단일가닥 확인 다형태 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 이종이중나선 분석, 서던 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 동일계 하이브리드화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열분석, 제한 단편 길이 다형태 분석 및 이의 조합 또는 준조합으로 구성된 군으로부터 선택된 기술을 사용하여 측정한다. 몇몇 양태에서, 샘플중의 마커의 발현 수준은 면역조직화학, 면역세포화학, 유동세포측정기, ELISA 및 질량 분광측정기를 사용하여 측정한다.
몇몇 양태에서, 상기 마커는 HNF4-알파, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, 트랜스알돌라제 1, COQ1, COQ3, COQ6, 프레닐트랜스퍼라제, 4-하이드로벤조에이트, 호중구 사이토졸 인자 2, 산화질소 신타제 2A, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2, VDAC, Bax 채널, ANT, 시토크롬 c, 복합체 1, 복합체 II, 복합체 III, 복합체 IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, Cpt1C 및 Cam 키나제 II로 구성된 군으로부터 선택된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 아폽토시스와 관련된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 산화성 스트레스와 관련된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 열 쇼크와 관련된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 혈관형성과 관련된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 당뇨병과 관련된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 고혈압과 관련된 마커이다. 몇몇 양태에서, 상기 마커는 심혈관 질환과 관련된 마커이다.
몇몇 양태에서, 다수의 마커의 발현 수준을 측정한다.
몇몇 양태에서, 상기 피검체는 환경적 영향인자 화합물, 설포닐우레아 화합물, 메글리티니드 화합물, 프란딘, 나테글리니드 화합물, 비구아니드 화합물, 티아졸리딘디온 화합물, 프레코스, 시믈린, 비에타, DPP-IV 억제제, 그리고 인슐린으로부터 선택된 치료제로 치료된다. 몇몇 양태에서, 상기 치료제는 환경적 영향인자 화합물을 포함한다. 환경적 영향인자 화합물은 예를 들어, 다차원적 세포내 분자(MIM) 또는 환경대사적 전환인자(epi-전환인자)일 수 있다. 몇몇 양태에서, 환경적 영향인자는 CoQ-10이다. 몇몇 양태에서, 환경적 영향인자는 비타민 D3이다. 몇몇 양태에서, 환경적 영향인자 화합물은 아세틸 Co-A, 팔미틸, L-카르니틴, 티로신, 페닐알라닌, 시스테인 및 소분자로부터 선택된 화합물이다. 몇몇 양태에서, 환경적 영향인자 화합물은 피브로넥틴, TNF-알파, IL-5, IL-12, IL-23, 혈관형성 인자 및 아폽토시스 인자로부터 선택되는 화합물이다. 몇몇 양태에서, 상기 치료법은 추가로 설포닐우레아 화합물을 사용한 치료, 메글리티니드 화합물을 사용한 차료, 프란딘을 사용한 치료, 나테글리니드 화합물을 사용한 치료, 비구아니드 화합물을 사용한 치료, 티아졸리딘디온 화합물을 사용한 치료, 프레코스를 사용한 치료, 시믈린을 사용한 치료, 비에타를 사용한 치료, DPP-IV 억제제를 사용한 치료 및 인슐린을 사용한 치료로부터 선택되는 치료 요법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 상기 피검체가 대사적 장애를 앓고있는지의 여부를 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 예측하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 상기 키트는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 상기 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 대사적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 상기 키트는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 대사적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 대사적 장애를 갖는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 상기 키트는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 대사적 장애를 갖는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 키트는 추가로 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하기 위한 수단을 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 키트는 대조군 샘플을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 환경적 영향인자 화합물을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 키트는 다수의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약을 포함한다.
몇몇 양태에서, 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 수단은 샘플에서 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석하기 위한 수단을 포함한다. 몇몇 양태에서, 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 수단은 샘플에서 단백질 또는 이의 일부를 분석하기 위한 수단을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 피검체가 CoQ10 반응성 상태를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 그룹으로부터 선택된다) 및 (2) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 피검체가 CoQ10 반응성 상태를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계(여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여, 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 CoQ10 반응성 상태를 앓고 있다는 징후이다)를 포함한다. 몇몇 양태에서, CoQ10 반응성 상태는 대사적 장애이다.
도 1: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 SK-MEL-28의 민감도.
도 2: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 SKBR3의 민감도.
도 3: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 PaCa2의 민감도.
도 4: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 PC-3의 민감도.
도 5: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 HepG2의 민감도.
도 6: 초기 및 후기 사멸세포의 양에 의해 측정되는 Q10 처리후 24시간째에서의 MCF-7의 민감도.
도 7: 아포스트랜드 ELISA 방법에 의해 측정되는, Q10으로 24시간 처리한 후, 사멸세포의 측정.
도 8: 2-D 겔 전기영동로의 예시적 겔 분석. 검출용 스팟은 표시되어있음.
도 9: SK-MEL-28 세포에서, Q10에 의해 조절됨으로써 2-D 겔 전기영동에 의해 검출된 단백질 사이의 상호결합 네트워크.
도 10: Verhoeven et al. (Am. J. Hum. Genet. 2001 68(5):1086-1092)로부터 적용되는 펜토오즈 포스페이트 경로.
도 11: SK-MEL-28 세포의 미토콘드리아 풍부 물질의 2-D 겔. 질량분석기(mass spectrometry) 특성에 의해 표시되고 검출된 스팟은 표시되어 있음.
도 12: 100 μM의 Q10을 배양액에 외생적으로 첨가함에 따른, SK-MEL-28 세포 미토콘드리아에 존재하는 Q10의 상대적 양의 비교 그래프.
도 13: 알려진 과정을 맵핑한 세포사멸 경로.
도 14: Bcl-티의 웨스턴 블랏 분석.
도 15: 비멘틴 항체로 증명되는 SK-MEL-28 샘플 세트의 웨스턴 블랏 분석.
도 16: 산화적 인산화 복합체(oxidative phosphorylation complexes (MitoSciences #MS601))를 표적화하는 다섯 개 항체로 평가되는, 다수 세포주로부터 세포 용해의 웨스턴 블랏 분석.
도 17: F1-알파 수준의 웨스턴 블랏 비교.
도 18: C-III-Core 2와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 19: C-II-30와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 20: C-IV-COX II 와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 21: C-I-20 (ND6)와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 22: 다섯 개 미토콘드리아 단백질에 대항하는 다양한 세포형의 웨스턴 블랏 분석.
도 23: 복합체 V 단백질 C-V-α와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 24: C-III-Core 1과 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 25: 포린(Porin, VDAC1)과 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 26: 사이클로필린 D와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 27: 사이토크롬 C와 Q10 반응의 웨스턴 블랏 비교.
도 28: 힐릭스(Helix) 10 열린 형태에서 HNF4알파 (1M7W.pdb)의 지질 결합 채널로 삽입되는 Q10(구)의 이론적 모델.
도 29: 정상산소 및 산소결핍 상태에서 다양한 글루코스 상태에 있어서의 HDFa 세포의 OCR.
도 30: 정상산소 및 산소결핍 상태에서 다양한 글루코스 상태에 있어서의 HASMC 세포의 OCR.
도 31: CoQ10 및 스트레스인자의 부존재 및 존재하에서의 MCF-7 유방암 세포의 OCR 값.
도 32: CoQ10 및 스트레스인자의 부존재 및 존재하에서의 PaCa-2 췌장암 세포의 OCR 값.
정의
여기 사용된 바와 같이, 하기 각 용어는 이번 부분에서 이와 관련된 의미를 갖는다.
여기에서 "a" "an"은 하나 또는 하나 이상의 (즉, 최소 1개)를 나타내는 문법적 목적을 갖는 용어이다. 예컨대 "구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 이상의 구성요소를 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 여기에서 "제한되지 않으나, 포함되는"이라는 의미이며, 이와 상호변경가능하게 사용된다.
용어 "또는"은 만약 문맥에서 명백히 다르게 지적하지 않는 한 "및/또는"을 의미하며 이와 상호변경가능하게 사용된다.
용어 "예컨대"는 "제한되지 않으나, 예컨대"의 의미이며, 이와 상호변경가능하게 사용된다.
본 발명의 방법에 의해 치료되기 위한 "환자" 또는 "피검체"는 인간 또는 비-인간 동물을 의미할 수 있고, 바람직하게는 포유류이다. 본원에 사용된 바와 같이, "피검체" 또는 "환자"는 제한없이 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니아피그, 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 어류 및 조류를 포함하는 임의의 동물(예를 들어, 사람)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "생존"은 대사적 장애에 대해 치료받는 피검자의 지속적인 생명을 언급한다. 하나의 양태에서, 생존은 대사적 장애가 재발하지 않는 것을 언급한다.
"예방하는" 또는 "예방"은 질환 또는 장애가 발병할 위험을 감소시킴(즉, 질환의 임상적 증상증 하나 이상이 질환에 노출되거나 경향이 있을 수 있는 환자에서 발병하지 않도록 하는)을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "양"은 (a) 단위 부피 또는 세포 당 몰 또는 중량으로, 분자에서 측정된 바와 같은 절대량 또는 (b) 예를 들어, 0 내지 5의 수치 등급에 의해 지정된 상대적 양을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대조군 양"은 대사적 장애를 앓지 않는 피검자에서 유래된 세포 또는 샘플에서의 마커의 양을 언급한다. 대조군 양은 예를 들어, 마커를 발현하는, 예를 들어, 고수준, 중간 수준 또는 낮은 수준으로 상기 단백질을 발현하는 것으로 공지된 세포 또는 조직에 존재하는 평균 마커의 양을 계산함에 의해 측정할 수 있다.
"치료적 유효량"은 질환 치료를 위해 환자에 투여하였을 때 질환에 대한 치료 효과가 충분한 화합물의 양을 의미한다. 질환을 예방하기 위해 투여하였을 때, 질환의 발생을 늦추거나 피하는데 충분한 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 화합물, 투여되는 개체의 질환 및 그 심각도 및 나이, 중량 등에 따라 달라질 것이다.
"예방하는" 또는 "예방"은 질환 또는 장애 (즉, 질환에 노출되거나 질환의 성향을 갖게 될 수 있으나 질환을 아직 경험하지 않았거나 질환의 증후를 나타내지 않는 환자에게 있어 질환이 발달하지 않도록 질환의 최소 하나의 임상 증후를 야기하는)가 일어나는 위험성을 감소시키는 것을 말한다.
"예방하는(prophylactic)" 또는 "치료적(therapeutic)" 처치라는 용어는 하나 또는 그 이상의 본 발명 조성물을 개체에 투여하는 것을 말한다. 만약 원치않는 상태의 임상적 증후에 앞서 투여되었다면 (예컨대 숙주동물의 질환 또는 기타 원치않는 상태), 그 처치는 예방적일 것이고, 즉 그것은 숙주에게 원치않는 상태로 발달하는 것을 막을 것이고, 반면 만약 원치않는 상태의 증후가 나타난 후 투여된다면, 그 처치는 치료적일 것이다(즉, 존재하는 원치않는 상태 또는 그로부터의 부작용을 감소, 완화 또는 유지시키는 것을 의도한다).
용어 "치료 효과"는 약학적으로 활성있는 물질에 의해 야기되는 동물, 특히 포유류 및 더욱 특이적으로는 인간에서의 국소 또는 전신 효과를 말한다. 상기 용어는 따라서 질환의 진단, 치유(cure), 완화, 치료 또는 예방에 사용되거나 동물 또는 바람직한 인간의 신체적 또는 정신적 발달 및 상태의 증진에 사용되는 것을 의도하는 임의의 물질을 의미한다. "치료적-유효량"이라는 용어는 임의의 처치에 사용되는 적정 이익/위험 비율에서 임의의 바람직한 국소 또는 전신 효과를 나타내는 물질의 양을 의미한다. 어떤 실시양태에서, 화합물의 치료적-유효량은 치료지수, 용해도 및 기타 등에 의존할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 발견된 어떤 화합물은 이러한 처치에 사용되는 적정 이익/위험 비율을 낳기 위하여 충분한 양으로 투여될 수 있다.
용어 "발현"은 DNA로부터 폴리펩티드를 얻는 과정을 의미하는 것으로 여기에서 사용된다. 상기 과정은 유전자로부터 mRNA로의 전사 및 이 mRNA로부터 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 문맥에 따라, "발현"은 RNA, 단백질 또는 둘 다의 생성을 말할 수 있다.
용어 "세포내 유전자의 발현 수준" 또는 "유전자 발현 수준"은 pre-mRNA 초기 전사, 전사 프로세싱 중간체, 성숙 mRNA 및 분해산물 뿐만 아니라 mRNA의 수준, 또는 세포에서 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 수준을 말한다.
용어 "조절(modulation)"은 반응의 상향조절(즉, 활성 또는 촉진), 하향조절(즉, 저해 또는 억제) 또는 이들의 조합 또는 각각을 말한다. "조절제"는 조절하는 화합물 또는 분자이며, 예컨대 작용제, 길항제, 활성화제, 촉진제, 억제제, 또는 저해제일 수 있다.
"고수준의 발현", "고수준의 활성", "증가된 수준의 발현" 또는 "증가된 수준의 활성"은 발현 및/또는 활성을 평가하기 위해 사용되는 분석의 표준 오차 보다 큰 시험 샘플에서 발현 수준 및/또는 활성을 언급하고 바람직하게는 대조군 샘플(예를 들어, 종양학적 장애를 앓지 않는 건강한 피검자 기원의 샘플)에서 마커의 발현 수준 및/또는 활성 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서 마커의 평균 발현 수준 및/또는 활성의 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상이다.
"저수준의 발현", "저수준의 활성", "감소된 수준의 발현" 또는 "감소된 수준의 활성"은 발현 및/또는 활성을 평가하기 위해 사용되는 분석의 표준 오차보다 큰, 시험 샘플에서 발현 수준 및/또는 활성 수준을 언급하고 바람직하게 대조군 샘플(예를 들어, 마커의 예후 능력에 대한 확실한 표준물로서 작용하는 후속 정보와 함께 종양학적 장애의 패널에 대해 직간접적으로 계산된 샘플)에서 마커의 발현 수준 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서 마커의 평균 발현 수준 및/또는 활성 보다 2배 이상 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상 적다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체"는 예를 들어, 천연 형태의 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 단일쇄 항체와 같은 재조합 항체, 키메라 및 사람화된 항체 및 다중특이적 항체, 그리고 이전의 모든 것에 대한 단편 및 유도체를 포함하고, 상기 단편 및 유도체는 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학적 잔기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "공지된 표준물" 또는 "대조군"은 본 발명으 마커와 대사적 장애의 존재 또는 부재와의 양 및/또는 수학적 관계중 하나 이상을 언급한다. 공지된 표준물을 합성하기 위한 시약은 제한없이 대사적 장애가 없는 환자 기원의 세포 및 임의로 표지된 항체를 포함한다. 공지된 표준물은 또한 마커 단백질을 발현하는 조직 배양 세포주(특이적 마커 단백질을 발현하거나 특이적 마커 단배질을 발현하지 않도록 조작된 세포주 또는 일정한 양의 마커 단백질을 항상성으로 함유하거나 조작될 수 있는 (예를 들어, 변화된 환경(여기서, 상기 변화된 환경은 성장 인자, 호르몬, 스테로이드, 사이토킨, 항체, 다양한 약물 및 항-대사물 및 세포외 매트릭스를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다)에 노출시킴에 의해) 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는)를 포함할 수 있다. 상기 세포주는 직접적으로 분석으 위해 유리 슬라이드상에 탑재되어, 고정되고 직접적으로 펠렛으로서 파라핀중에 매립될 수 있거나 아가로스와 같은 매트릭스내에 현탁되고 이어서 고정되고 파라핀에 매립되고 조직 샘플로서 분할되고 가공될 수 있다. 상기 표준물은 직간접적으로 마커 단백질의 예측능에 대한 입증 표준물로서 작용하는 후속 정보와 함께 환자 샘플의 패널에 대하여 계산되어야만 한다.
본원에 사용된 바와 같은 1차 치료는 대사적 장애를 앓는 피검체의 초기 치료를 언급한다. 1차 치료는 제한없이 설포닐우레아 화합물, 메글리티니드 화합물, 프란딘, 나테글리니드 화합물, 비구아니드 화합물, 티아졸리딘디온 화합물, 프레코스, 시믈린, 비에타, DPP-IV 억제제 또는 인슐린을 사용한 치료를 포함한다.
대사적 장애는 대사적 장애의 하나 이상의 증상이 경감되거나 종결되거나 서행되거나 예방되는 것으로 예상되는 경우 "치료된다". 본원에 사용된 바와 같이, 대사적 장애는 또한 대사적 장애의 재발 또는 진행이 감소되거나 서행되거나 지연되거나 예방되는 경우 "치료된다".
키트는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어, 프로브를 포함하는 임의의 제품(예를 들어, 팩키지 또는 컨테이너)이고 상기 제품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트로서 판촉되거나 분배되거나 시판된다.
"대사 경로"는 한 화합물이 다른 것으로 변형되어 세포 기능을 위한 중간체를 제공하고 에너지를 내는 효소-매개 반응의 과정을 말한다. 대사 경로는 선형 또는 사이클일 수 있다.
"대사 상태(metabolic state)"는 그들이 건강 또는 질병의 상태와 관련된 다양한 화학 및 생물 학적 지표에 의한 측정되는, 주어진 시간 지점에서의 특정 세포성, 다중세포성 또는 조직 환경의 분자적 내용을 말한다.
"마이크로어레이"라는 용어는 기질, 예컨대 종이, 나일론 또는 기타 타입의 멤브레인, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 임의의 다른 적절한 고체 지지체상에서 합성되는 구분되는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드(예컨대 항체) 또는 펩티드에 대한 어레이를 말한다.
용어 "장애" 및 "질환"은 신체의 임의의 부분, 기관 또는 시스템(또는 이들의 임의의 조합)의 정상 구조 또는 기능으로부터의 임의의 일탈을 말하며 이들을 포함하는 의미로 사용된다. 특정 질환은 생물학적, 화학적 및 물리적 변화를 포함하여 특징적 증상 및 증후에 의해 표명되며, 이로 제한되지는 않으나 인구, 환경, 고용, 유전 및 의학적 히스토리와 같은 요인들을 포함하는 보통 다양한 다른 인자들과 연관된다. 임의의 특징적 증후, 증상 및 관련 요인들은 중요한 진단 정보를 얻기 위하여 다양한 방법을 통해 정량될 수 있다.
어떤 실시양태에서, 본 발명은 그들을 필요로 하는 피검체에서 조효소 Q10 반응성 상태를 진단 또는 예측하기 위한 방법을 제공한다. "조효소 Q10 반응성 상태" 또는 "CoQ10 반응성 상태"는 조효소 Q10의 투여로 인해 치료, 예방 또는 완화될 수 있는 질환, 장애, 상태(state) 및/또는 상태(condition)을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속될 필요 없이, 여기에 기재된 바와 같이 CoQ10은 최소한 부분적으로, 세포 미소환경에서 대사적 쉬프트를 유도함으로써, 예컨대 정상 상태 세포에서 산화적 인산화의 형태 및/또는 수준을 향해 쉬프트됨으로써 기능한다고 여겨진다. 따라서, 어떤 실시양태에서, CoQ10 반응성 상태는 세포 미소환경의 변화된 대사로부터 일어나는 상태이다. 조효소 Q10 반응성 상태는 예를 들면, 종양학적 장애, 예를 들면 해당과정 및 락테이트 생합성 과정을 향해 편향될 수 있는 것을 포함한다. 어떤 실시양태에서, CoQ10 반응성 종양학적 장애는 다른 것들 중 간암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 간암 또는 뼈암, 편평상피세포암, 기저세포암, 흑색종(melanomas) 및 광선각화증(actinic keratosis)을 포함한다. 조효소 Q10 반응성 상태는 또한 예를 들면 대사장애도 포함하는데, 예컨대 비만, 당뇨, 전-당뇨, 대사적 장애 증후군, 포만감(satiety) 및 내분비성 장애를 포함한다. 조효소 Q10 반응성 상태는 여기 기재된 바와 같은 기타 대사적 장애를 또한 포함한다.
어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물, 여기 기재된 예컨대 MIM 또는 epi-전환인자는 조효소 Q10과 공통된 활성을 공유한다. 여기 기재된 바와 같이, "조효소 Q10과 공통된 활성을 공유한다"는 문장은 조효소 Q10과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 최소한의 부분이 나타내는 화합물의 활성을 말한다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10 활성의 25% 또는 그 이상의 활성을 나타낸다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10 활성의 약 130%를 포함하고, 그 보다 높은 활성을 나타낸다. 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10활성의 약 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, 116%, 117%, 118%, 119%, 120%, 121%, 122%, 123%, 124%, 125%, 126%, 127%, 128%, 129%, 또는 130%의 활성을 나타낸다. 상기 문단에 나열된 각 값들은 용어 "약"에 의해 조정될 수 있을 것으로 이해된다. 또한, 상기 문단에 나열된 임의의 두 값에 의해 정의되는 임의의 범위가 본 발명에 포함되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 어떤 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 조효소 Q10 활성의 약 50% 및 약 100% 사이의 활성을 나타낸다. 어떤 실시양태에서, 조효소 Q10 및 본 발명의 화합물에 의해 공유되는 활성은 세포 대사에서 쉬프트를 유도하기 위한 활성이다. 어떤 실시양태에서, CoQ10 및 본 발명의 화합물에 의해 공유되는 활성은 OCR(Oxygen Consumption Rate) 및/또는 ECAR (ExtraCellular Acidification Rate)에 의해 측정된다.
키트는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어, 프로브를 포함하는 임의의 제품(예를 들어, 팩키지 또는 컨테이너)이고 상기 제품은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트로서 판촉되거나 분배되거나 시판된다.
본원에 사용된 바와 같은 "조효소 생합성 경로"는 티로신 및 아세틸-CoA의 유비퀴논으로의 화학적/생물학적 전환 사이에 형성되는 화합물을 특징으로 한다. 조효소 생합성 경로의 중간체는 3-헥사프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 3-헥사프레닐-4,5-디하이드록시벤조에이트, 3-헥사프레닐-4-하이드록시-5-메콕시벤조에이트, 2-헥사프레닐-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-헥사프레닐-3-메틸-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-헥사프레닐-3-메틸-5-하이드록시-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 3-옥타프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 2-옥타프레닐페놀, 2-옥타프레닐-6-메톨시페놀, 2-옥타프레닐-3-메틸-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-옥타프레닐-3-메틸-5-하이드록시-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-3-메틸-5-하이드록시-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-3-메틸-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-6-메톡시-1,4-벤조퀴논, 2-데카프레닐-6-메톡시페놀, 3-데카프레닐-4-하이드록시-5-메톡시벤조에이트, 3-데카프레닐-4,5-디하이드록시벤조에이트, 3-데카프레닐-4-하이드록시벤조에이트, 4-하이드록시 페닐피루베이트, 4-하이드록시페닐락테이트, 4-하이드로기-벤조에이트, 4-하이드록시신나메이트 및 헥사프레닐디포스페이트를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "글루코스의 혐기적 사용" 또는 "혐기적 해당과정"은 시토졸내에서 해당과정에 이어서 락트산 발효에 의한 세포의 에너지 생산을 언급한다. 예를 들어, 많은 암 세포는 혐기적 해당과정에 의해 에너지를 생산한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "호기성 해당과정" 또는 "미토콘드리아 산화성 인산화"는 해당과정에 이어서 미토콘드리아에서의 피루베이트의 산화에 의한 세포의 에너지 생산을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이, "글루코스의 혐기적 사용을 차단하고 미토콘드리아 산화성 인산화를 증강시킬 수 있는"은 혐기적 해당과정으로부터 호기성 해당과정 또는 미토콘드리아 산화성 인산화로의 세포의 대사적 상태의 전환 또는 변화를 유도하는 환경적 영향인자(예를 들어, 환경대사적 전환인자)의 능력을 언급한다.
I. 대사적 장애
본 발명은 대사적 장애를 진단하거나 예측하기 위한 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "대사적 장애"는 환자 대사의 변화로부터 비롯되는 임의의 병리학적 증상을 언급한다. 상기 장애는 비정상적 전신 글루코스, 지질 및/또는 단백질 대사 이로부터 발생하는 병리학적 결과와 관련된 것들을 포함한다. 대사적 장애는 예를 들어, 고혈당증을 유발하는 글루코스 항상성에서의 변화로부터 비롯되는 것들을 포함한다. 본 발명에 따라 글루코스 수준의 변화는 전형적으로 글루코스 수준이 건강한 개체에서의 수준과 비교하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 또는 100%까지 증가하는 것이다. 대사적 장애는 세포 증식, 성장, 분화 또는 이동, 항상성, 세포간- 또는 세포내 소통의 세포 조절과 같은 세포 기능, 간 기능, 근육 기능 또는 지방세포 기능과 같은 조직 기능; 호르몬 반응(예를 들어, 인슐린 반응)과 같은 유기체내 전신 반응에 해로운 영향을 줄 수 있다. 대사적 장애는 비만, 당뇨병(또한 본원에서 진성 당뇨병으로 언급됨)(예를 들어, I형 당뇨병, II형 당뇨병, MODY 및 임신 당뇨병), 전당뇨병, 대사적 증후군, 포만감 및 노령화에 따른 내분비 이상증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대사적 장애의 추가의 예는 과식증, 소식증, 트리글리세라이드 저장 질환, 바르데트-비들 증후군, 로렌스-문 증후군, 프라더-라브하르트-윌리 증후군, 케아른스-사이레 증후군, 식욕부진, 중간쇄 아실-CoA 데하이드로게나제 결핍증 및 악액질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 몇몇 양태에서, 대사적 장애는 조효소 Q10 반응성 상태이다.
"대사적 장애를 치료하거나, 감소시키거나 예방하는'이란 이것이 발생하기 전후 상기 병태를 경감시키는 것을 의미한다. 균등의 비처리된 대조군과 비교되는 바와 같이 감소 또는 예방 정도는 임의의 표준 기술에 의한 측정시 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95% 이상, 또는 100%이다
진성당뇨병은 혈액에서 글루코스의 만성적 상응을 유발하는 이종 그룹의 대사적 질환(고혈당증)이다. 당뇨병은 췌장섬 파괴 또는 기능부전으로 글루코스 조절이 상실된 것을 특징으로 한다. 2개의 주요 유형의 진성당뇨병은 "인슐린-의존성 당뇨병("IDDM) 또는 "청소년 개시 당뇨병"으로서 공지된 I형 및 "비인슐린 의존성("NIDDM") 또는 "성인-개시 당뇨병"으로서 공지된 II형이다.
"I형 당뇨병"은 인슐린 생산이 상실되어 고혈당증을 유발하는, 췌장 세포의 자가면역 매개 파괴로부터 비롯되는 병태를 언급한다. I형 당뇨병은 생존을 보장하기 위해서는 인슐린 대용 치료법을 요구한다. 주사가능한 인슐린 및 경구 저혈당제와 같은 약물이 당뇨병자가 보다 오랫동안 생존하도록 하지만 당뇨병은 심장 질환 또는 암에 이어서 3번째 주요 킬러인채로 남아있다. 그러나, 이들 약물은 높거나 낮은 혈당 수준 사이에서의 전환을 예방하기에 충분한 혈당 수준을 조절하지 않고 신장, 눈 및 혈관을 손상시킨다. 당뇨병 조절 및 합병증 시험으로부터의 데이타는 혈액 글루코스의 집중 조절이 하루당 1회 또는 2회 인슐린 주사로 이루어진 통상적인 치료법과 비교하여, 망막증, 신증 및 신경병증과 같은 당뇨병의 합병증을 상당히 지연시킴을 보여준다. DCCT에서 집중 치료는 하루에 3회 이상의 인슐린의 수회 주사 또는 외부 펌프에 의한 연속적 피하 인슐린 주사(CSII)를 포함했다. 인슐린 펌프는 인슐린의 생리학적 대용에 근접하기 위한 피하 다중 하루 주사(MDI)에 대한 다양한 또 다른 방법중 하나이다.
"2형 당뇨병"은 125 mg/dl (6.94 mmol/L) 초과의 혈당 또는 혈청 글루코스 농도를 갖는다. II형 당뇨병은 정상 수준보다 높은 수준의 혈장 인슐린의 존재(고인슐린혈증)하에서의 고혈당증을 특징으로 하고 40세 이상의 가체중 성인에서 흔하게 나타나고 모든 사례의 90%초과를 나타낸다. II형 당뇨병의 진행은 글루코스 유도된 인슐린 분비 속도에서 상대적 감소와 커플링된 혈액 글루코스의 증가하는 농도와 연관되어 있다. II형 당뇨병에서, 탄수화물 대사를 조절하는 조직 프로세싱이 인슐린에 대한 감소된 민감성을 갖고 따라서 인슐린 생성 부재하에 발생하는 것이 아니라 혈액내 증가된 글루코스 수준에 대해 감소된 민감성을 갖는 것으로 사료되고 혈액에서 증가된 글루코스 수준에 대한 감소된 민감성 및 인슐린 생산에 응답하지 못하는 무능력을 갖는 것으로 사료된다. 대안적으로, 당뇨병은 인슐린의 이의 표적 세포에 대한 작용을 매개하는 분자 기구의 다양한 결함으로부터 비롯될 수 있고 이들의 세포 표면상의 인슐린 수용체의 부재일 수 있다. 따라서, II형 당뇨병의 치료는 흔히 인슐린의 투여를 필요로하지 않지만 예를 들어, 설포닐 우레아와 같은 경구 저혈당제를 사용한 치료에 의해 증강되는, 다이어트 및 생활방식의 변화를 기초로 할 수 있다.
"전당뇨병"은 환자가 2형 당뇨병의 발병인 것으로 예비 진단된 병태를 언급한다. 전당뇨병은 높은 정상 범위 gtoreq.100 mg/dL (Meigs et al., Diabetes 2003 52:1475-1484)내의 공복 혈액 글루코스 및 공복 고인슐린혈증(상승된 혈장 인슐린 농도)을 갖는 개체를 포함하도록 손상된 글루코스 내성의 정의를 연장시킨다.
"비만"은 환자가 30 kg/m.sup.2 이상의 BMI를 갖는 병태를 언급한다. "내장 비만"은 남성 환자에서 대퇴부에 대한 가슴의 비율이 1.0이고 여성 환자에서는 0.8인 것을 언급한다. 또 다른 측면에서, 내장 비만은 인슐린 내성의 위험 및 전당뇨병의 발병을 정의한다.
"과체중"은 25 kg/m.sup.2 이상 및 30 kg/m.sup.2 미만의 BMI를 갖는 환자를 언급한다. "체중 획득"은 행동 습관 또는 중독, 예를 들어 과식 또는 폭식, 금연과 관련된 체중 증가 또는 생물학적 (생활) 변화, 예를 들어, 남성에서는 나이가 듦에 따른 체중 획득 및 여성에서는 폐경기에 따른 체중 획득과 관련된 체중 증가를 언급한다.
증후군 X로서도 언급되는 "대사적 증후군(MS)는 체내 다른 경로 및 시스템에 영향을 주는 대사적 장애를 언급한다. 본래에 대사적 증후군은 심혈관 질환을 강화시키도록 상승작용하는 대사적 장애(비만, 인슐린 내성, 고혈압 및 이상지질혈증, 주로 고트리글리세라이드증의 클러스터로서 정의되었다. 보다 최근에 (2001), 미국 범 콜레스테롤 교육 프로그램(NCEP)은 대사적 증후군을 하기의 5개 기준중 3개를 충족하는 경우로서 분류하였다: 110 mg/dl 이상의 공복 글루코스 수준, 150 mg/dl이상의 혈장 트리글리세라이드 수준(고트리글리세라이드증), 남성에서 40 mg/dl 미만 또는 여성에서 50 mg/dl 미만의 HDL 콜레스테롤, 130/85 mm Hg 이상의 혈압(고혈압), 그리고 중앙 비만(중앙 비만은 남성의 경우 복부 가슴 둘레가 40인치 초과이고 여성의 경우에는 35인치 초과인 것으로서 정의된다). 현재, 다음과 같이 국제적으로 인정받는 3개 기구는 다른 정의를 하고있다: 1) 세계 보건 기구, 2) 미국 심장 연합회/국가 심장, 폐 및 혈액 기관(AHA/NHLBI) 및 3) 국제 당뇨병 협회(International Diabetes Federation) (IDF). The definitions of Metabolic Syndrome by the WHO, AHA/NHLBI 및 IDF에 의한 대사적 증후군의 정의는 NECP의 정의와 매우 유사하고 모두 증후군을 정의하기 위한 동일한 대사적 파라미터를 사용하지만 WHO는 또한 인슐린 공복 인슐린 수준에 대한 평가를 포함한다(Moebus S et al, Cardiovascular Diabetology, 6: 1-10, 2007; Athyros V G et al, Int. J. Cardiology, 117: 204-210, 2007). 이들 상이한 정의중에서 증후군을 갖는 것으로서 분류되어야 하는 이들 대사적 파라미터에 대한 민감한 차이는 특정 피검체가 이들 상이한 정의에 따라 증후군을 갖거나 갖지 않는 것으로서 상이하게 분류될 수 있다. 또한, MS를 갖는 만연된 심혈관 질환은 사용되는 정의에 따라 다양하다(Moebus S et al, Cardiovascular Diabetology, 6: 1-10, 2007; Athyros V G et al, Int. J. Cardiology, 117: 204-210, 2007). 미국 당뇨병 협회(The American Diabetes Association)는 5명의 과체중 환자에서 1명은 대사적 증후군을 앓고 있는 것으로 추정한다.
다른 측면에서, 대사적 증후군은 증후군 X, 인슐린 내성 증후군, 인슐린 내성 고혈압, 대사적 고혈압 증후군, 대사기능이상 증후군을 포함하지만 이에 제한되지 않는 승인된 동의어에 의해 기재된다. 대사적 증후군의 성분은 글루코스 내성, 손상된 글루코스 내성, 손상된 공복 혈청 글루코스, 손상된 공복 혈액 글루코스, 고인슐린혈증, 전당뇨병, 비만, 내장 비만, 고트리글리세라이드혈증, 유리된 지방산의 상승된 혈청 농도, C-반응성 단백질의 상승된 혈청 농도, 지질단백질의 상승된 혈청 농도, 호모시스테인의 상승된 혈청 농도, 작은 밀집성 저밀도 지질단백질(LDL)-콜레스테롤의 상응된 혈청 농도, 지질단백질 관련 포스포리파제(A2)의 상승된 혈청 농도, 고밀도 지질단백질(HDL)-콜레스테롤의 감소된 혈청 농도, HDL(2b)-콜레스테롤의 감소된 혈청 농도, 아디포넥틴의 감소된 혈청 농도, 그리고 알부민뇨증)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.(참조: Pershadsingh HA Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma: therapeutic target for diseases beyond diabetes: quo vadis Expert Opin Investig Drugs. (2004) 13:215-28, and references cited therein).
이전의 대사적 장애의 "주요 요소"는 손상된 공복 글루코스 또는 손상된 글루코스 내성, 증가된 가슴 둘레, 증가된 내장 지방 함량, 증가된 공복 혈장 글루코스, 증가된 공복 혈장 트리글리세라이드, 감소된 공복 고밀도 지질단백질 수준, 증가된 혈압, 인슐린 내성, 고인슐린혈증, 심혈관 질환 (또는 이의 구성분, 예를 들어, 죽상동맥경화증, 관상 동맥 질환, 말초 혈관 질환, 또는 뇌혈관질환), 울혈성 심부전증, 상승된 혈장 노르에피네프린, 상승된 심혈관 관련 염증 인자, 내장 내피 기능부전을 강화시키는 상승된 혈장 인자, 고지질단백질혈증, 죽상동맥경화증 또는 아테롬성경화증, 식욕항진증, 고혈당증, 고지질혈증, 그리고 고혈압 또는 높은 혈액 압력, 증가된 혈장 식후 트리글리세라이드 또는 유리 지방산 수준, 증가된 세포 산화 스트레스 또는 이의 혈장 지표, 증가된 순환 고응집 상태, 간 지방증, 간 지방증, 신부전증 및 신장 기능결핍을 포함하는 신장 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"인슐린 내성"은 글루코스 로드에 대한 정상 반응을 초과하는 순환계 인슐린 수준이 유글리세미아 상태를 유지하기 위해 요구되는 병태를 언급한다(Ford et al., JAMA. 2002, 287:356-9). 인슐린 내성 및 치료에 대한 인슐린 내성을 갖는 환자의 반응은 인슐린 내성에 대한 신임할 수 있는 지표인 인슐린 내성에 대한 항상성 모델 평가(HOMA-IR) 스코어를 평가함에 의해 정량될 수 있다(Katsuki et al., Diabetes Care 2001, 24:362-5). 항상성 평가 모델 (HOMA)-IR 스코어에 의한 인슐린 내성의 평가는 문헌[참조: Galvin et al., Diabet Med 1992, 9:921-8에 기재된 식(여기서, HOMA-IR=[공복 혈청 인슐린(.mu.U/mL)].시간.[공복 혈장 글루코스(mmol/L)/22.5])에 의해 계산할 수 있다.
"고인슐린혈증"은 피검체가 유글리세미아 존재 또는 부재하의 인슐린 내성을 갖고, 여기서, 공복 또는 식후 혈청 또는 혈장 인슐린 농도는 인슐린 내성 없이 대퇴부에 대한 가슴의 비율이 1.0미만(남성에 대해) 또는 0.8 미만(여성에 대해)인 정상의 마른 개체의 농도 이상으로 상승된 병태로서 정의된다.
용어 "손상된 글루코스 내성" (IGT)은 글루코스 내성 시험을 받은 경우 정상 내지 고혈당 사이에 있는 혈중 글루코스 수준을 갖는 개체를 기술하기 위해 사용된다. 상기 개체는 당뇨병을 갖는 것으로 고려되지는 않지만 당뇨병을 발병할 위험성이 높다. 예를 들어, 손상된 글루코스 내성은 환자가 110 mg/dl 초과 및 126 mg/dl (7.00 mmol/L) 미만의 공복 혈액 글루코스 농도 또는 공복 혈청 글루코스 농도, 또는 140 mg/dl (7.78 mmol/L)초과 및 200 mg/dl (11.11 mmol/L) 미만의 식후 2시간 혈당 글루코스 또는 혈청 글루코스 농도를 갖는 병태를 언급한다.
"고혈당증"(고혈당)의 병태는 혈액 글루코스 수준이 너무 높은 병태이다. 전형적으로, 고혈당증은 혈액 글루코스 수준이 180 mg/dl 초과로 상승하는 경우 발생한다. 고혈당증의 증상은 빈번한 소변, 과다 갈증 및 장기간에 걸친 체중 감소를 포함한다.
"저혈당증"(낮은 혈당)의 병태는 혈액 글루코스 수준이 매우 낮은 병태이다. 전형적으로, 저혈당증은 혈액 글루코스 수준이 70 mg/dl 미만으로 저하된 경우 발생한다. 저혈당증의 증상은 사지(특히 손 및 팔에서)의 저림, 착란, 동요 또는 어지럼증을 포함한다. 상기 병태는 가용한 글루코스 양에 대해 과량의 인슐린이 존재하는 경우 발생하기 때문에 이것은 때때로 인슐린 반응으로서 언급된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 당뇨병과 같은 대사적 장애를 갖거나 이의 위험에 처한 것으로 진단된 임의의 환자를 치료하기 위해 유용하다. 대사적 장애(예를 들어, 당뇨병 또는 비만)의 발병이 예방되는 환자는 상기 진단을 받거나 받지 않을 수 있다. 당업자는 본 발명의 환자가 표준 시험에 적용되거나 하나 이상의 위험 인자의 존재로 인해 고위험에 처한자로서 조사 없이 동정될 수 있음을 이해한다.
대사적 장애의 진단은 본원에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 임의의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 당뇨병을 진단하기 위한 방법은 예를 들어, 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제6,537,806호에 기재되어 있다. 당뇨병은 예를 들어, 글루코스 및 케톤 수준(지방 분해 생성물)을 측정하는 뇨 시험(뇨 분석); 혈중 글루코스 수준을 측정하는 시험; 글루코스 내성 시험 및 포유동물로부터 수거된 생물학적 샘플(혈액, 혈청 또는 뇨)중에서 대사적 장애에 특징적인 분자 마커를 검출하는 분석(예를 들어, 당뇨병의 경우에 헤모글로빈 Alc(HbAlc) 수준의 측정)을 사용하여 진단되고 모니터링될 수 있다.
대사적 장애에 대해 치료되는 환자는 의학 전문가가 상기 병태를 갖는 것으로서 진단한 자이다. 진단은 본원에 기재된 것들과 같은 임의의 적합한 수단에 의해 수행할 수 있다. 당뇨병 또는 비만의 발병이 예방되는 환자는 상기 진단을 받거나 받지않을 수 있다. 당업자는 본 발명의 환자가 표준 시험에 적용되거나 가계 병력, 비만, 특정 인종(예를 들어, 아프리카계 미국인 및 스페인계 미국인), 임신 당뇨병 또는 9파운드 이상의 체중의 아기 출산, 고혈압, 비반 또는 당뇨병 경향이 있는 병리학적 병태를 가짐, 높은 혈액 수준의 트리글리세라이드, 높은 혈액 수준의 콜레스테롤, 분자 마커의 존재(예를 들어, 자가항체의 존재) 및 나이(45세 이상)와 같은 하나 이상의 위험 인자의 존재로 인해 고위험에 처한자로서 조사 없이 동정될 수 있음을 이해한다. 개체는 이들의 체중이 이들의 키에 비해 요망될 수 있는 최대 체중을 20%(여성에서는 25%)를 초과하는 경우 비만인 것으로 간주된다. 100파운드 이상의 과체중인 성인은 병적인 비만인 것으로 간주된다. 비만은 또한 30 kg/m.sup.2 이상의 체지방 지수(BMI)로서 정의된다.
환자는 무작위 혈장 글루코스 시험(하루의 임의의 시점에 채혈)이 200 mg/dL 이상의 값을 지적하는 경우, 공복 혈장 글루코스 시험이 126 mg/dL 이상(8시간 후)의 값을 지적하는 경우 또는 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)이 사람이 물에 용해된 75g의 글루코스를 함유하는 음료를 소비한지 2시간 후에 채혈한 혈액 샘플중에 200 mg/dL 이상의 혈장 글루코스 값을 지적하는 경우 당뇨병을 갖는 것으로서 또는 이의 위험에 처한 것으로서 진단될 수 있다. OGTT는 3시간 동안 일정 간격으로 혈장 글루코스를 측정한다. 바람직하게, 본 발명에 따라 치료된 당뇨병 환자에서 혈장 글루코스의 수준은 160 내지 60 mg/dL의 범위, 150 내지 70 mg/dL의 범위, 140 내지 70 mg/dL의 범위, 135 내지 80 mg/dL 범위, 그리고 바람직하게는 120 내지 80mg/dL의 범위이다.
임의로, 이전의 2개월 및 3개월 동안에 평균 혈액 글루코스 수준을 평가하는 헤모글로빈 Alc(HbAlc) 시험이 사용될 수 있다. 당뇨병이 없는 사람은 전형적으로 4% 내지 6% 범위의 HbAlc 값을 갖는다. HbAlc의 1% 증가마다 혈액 글루코스 수준은 대략 30mg/dL으로 증가하고 합병증의 위험이 증가한다. 바람직하게, 본 발명에 따라 치료되는 환자의 HbAlc 값은 9% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 그리고 가장 바람직하겐느 약 5%로 감소한다. 따라서, 치료되는 환자의 HbAlc 수준은 바람직하게 치료 이전의 수준에 상대적으로 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 저하된다.
임신 당뇨병은 전형적으로 OGTT 동안에 측정되는 혈장 글루코스 값을 기준으로 진단된다. 글루코스 수준은 통상적으로 임신동안에 저하되기때문에 임신중 당뇨병의 진단을 위한 역치 값은 임신전 동일한 사람에서보다 낮다. 여성이 하기의 수치중 어느 하나를 충족하거나 초과하는 2개의 혈장 글로코스 판독을 갖는 경우, 상기 여성은 임신 당뇨병을 가진 것이다: 95 mg/dL의 공복 혈장 글루코스 수준, 180 mg/dL의 1시간 수준, 155 mg/dL의 2시간 수준, 또는 140 mg/dL의 3시간 수준.
케톤 시험을 또한 사용하여 I형 당뇨병을 진단할 수 있다. 케톤은 충분한 인슐린이 없는 경우 혈액에서 증가하기 때문에 이들은 궁극적으로 뇨에 축적된다. 고수준의 혈액 케톤은 케톤산증으로 불리우는 심각한 병태를 유발할 수 있다.
미국 당뇨병 협회의 지침에 따르면, 2형 당뇨병으로 진단되기 위해서는 개체가 126 mg/dl 이상의 공복 혈장 글루코스 수준 또는 200 mg/dl 이상의 2시간 경구 글루코스 내성 시험(OGTT) 혈장 글루코스 값을 가져야만 한다(Diabetes Care, 26:S5-S20, 2003).
전당뇨병으로 불리우는 관련 병태는 100 mg/dl 초과이지만 126 mg/dl 미만인 공복 글루코스 수준 또는 140 mg/dl 초과이지만 200 mg/dl 미만인 2시간 OGTT 혈장 글루코스 수준을 갖는 것으로서 정의된다. 산적된 증거는 전당뇨병 병태가 심혈관 질환을 발병할 위험 인자일 수 있음을 시사한다(Diabetes Care 26:2910-2914, 2003). 또한 손상된 글루코스 내성 또는 손상된 공복 글루코스로서 언급되는 전당뇨병은 2형 진성당뇨병, 심혈관 질환을 발병시키고 사망을 유발하는 주요 위험 인자이다. 전당뇨병을 효과적으로 치료함에 의해 2형 당뇨병의 발병을 예방하는 치료학적 중재를 개발하는데 집중되고 있다(Pharmacotherapy, 24:362-71, 2004).
비만(통상적으로 대략 >30 kg/m.sup.2의 체지방지수로서 정의됨)은 흔히 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 당뇨병, 고혈압 및 이상지질혈증과 같은 다양한 병리학적 병태와 관련된다. 상기 병태의 각각은 심혈관 질환의 위험에 기여한다.
인슐린 내성, 고혈압 및 이상지질혈증과 함께 비만은 심혈관 질환을 강화시키는데 함께 상승작용하는 대사적 증후군(또한 증후군 X로서 공지됨)인 것으로 고려된다. 보다 최근에, 미국 범 콜레스테롤 교육 프로그램은 하기의 5개의 기준중 3개를 충족하는 것으로서 대사적 증후군을 분류하였다: 110 mg/dl 이상의 공복 글루코스 수준, 150 mg/dl 이상의 혈장 트리글리세라이드 수준(고트리글리세라이드혈증), 남성에서 40 mg/dl 미만의 HDL 콜레스테롤 또는 여성에서 50 mg/dl미만의 HDL 콜레스테롤, 130/85 mm Hg 이상의 혈압 (고혈압), 그리고 중앙 비만(중앙 비만은 남성에 대해서는 40인치 초과의 복부 가슴 둘레 및 여성에 대해서는 35인치 초과의 복부 가슴 둘레로서 정의된다).
당업자는 당업계에 공지된 상기 시험중 어느 하나 또는 어느 다른 시험의 사용을 사용하여 본 발명의 치료학적 치료 효능을 모니터링할 수 있음을 인지할 것이다. 헤모글로빈 Alc(HbAlc) 수준의 측정이 이전의 2개월 내지 3개월동안에 평균 혈액 글루코스의 지표이기 대문에 상기 시험을 사용하여 당뇨병 치료에 대한 환자의 반응을 모니터링할 수 있다.
발명의 치료학적 방법은 환자에서 글루코스 수준 또는 지질 수준을 감소시키는데 효과적이다. "글루코스 수준을 감소시키는"은 비처리된 대조군에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 글루코스 수준이 감소함을 의미한다. 바람직하게, 글루코스 수준은 정상혈당 수준, 즉 150 내지 60 mg/dL, 140 내지 70 mg/dL, 130 내지 70 mg/dL, 125 내지 80 mg/dL, 그리고 바람직하게는 120 내지 80 mg/dL으로 감소한다. 글루코스 수준의 감소는 혈액으로부터 글루코스의 제거와 관련된 생물학적 활성중 허느 하나를 증가시킴에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 글루코스 수준을 감소시키는 능력을 갖는 제제는 인슐린 생산, 분비 또는 작용을 증가시킬 수 있다. 인슐린 작용은 예를 들어, 말초 조직에 의한 글루코스 흡수를 증가시키고/시키거나 간 글루코스 생산을 감소시킴에 의해 증가될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제제는 장으로부터 탄수화물의 흡수를 감소시킬 수 있거나 글루코스 수숑체 활성을 변화시키거나(예를 들어, GLUT4 발현, 고유 활성 또는 이동을 증가시킴에 의해) 인슐린 민감성 조직의 양을 증가시키거나(예를 들어, 근육 세포 또는 지방세포 분화를 증가시킴에 의해) 지방세포 또는 근육 세포에서 유전자 전사를 변화시킬 수 있다(예를 들어, 대사적 경로 유전자의 지방세포 발현으로부터 인자의 변화된 분비). 바람직하게, 본 발명의 제제는 글루코스의 제거와 관련된 활성중 하나 이상을 증가시킨다. "지질 수준을 감소시키는"이란 비처리된 대조군에 비해 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 이상 지질의 수준이 감소함을 의미한다.
"글루코스 수준이 감소되도록 인슐린 시그날 전달 경로를 변화시키는"이란 전체 결과가 혈장으로부터 글루코스의 제거에 있어서 증가이도록 인슐린 시그날 전달에 관여하는 활성중 어느 하나를 변화(증가시키거나 감소시킴에 의해)시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 발명의 env-영향인자는 인슐린 생산, 분비 또는 작용을 증가시키거나 말초 조직에 의한 글루코스 섭취를 증가시키거나 간 글루코스 생산을 감소시키거나 장으로부터 탄수화물의 흡수를 감소시키는 인슈린 시그날 전달 경로를 변화시킨다.
환경적 영향인자, 예를 들어, 환경-전환인자가 글루코스 수준을 감소시키고 대사적 장애를 치료하는 능력은 당업계에 공지된 표준 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 글루코스 흡수를 증가시키는 제제를 동정하는 세포 기반 스크리닝 분석이 사용될 수 있다. 특히, 세포 배양중 분화된 지방세포를 사용하여 인슐린 자극시 방사능표지된 글루코스에 의해 검출되는 바와 같이 글루코스 흡수를 증가시키는 환경-전환인자의 능력을 평가할 수 있다. 또 다른 예시적인 분석에서, 비-당뇨병 피검체로부터 유래된 세포의 조건적 고정화에 의해 수득된 사람 근원세포를 사용하여, 양성 대조군으로서 인슐린을 사용하는 글리코겐 합성에 대한 제제의 효과를 스크리닝할 수 있다. 치료 전에, 세포를 혈청 고갈시킴에 이어서 방사능 표지된 글루코스를 함유하는 무혈청 배지에서 2시간 동안 환경 전환인자 또는 대조군과 항온처리하고 이후 글리코켄 합성을 측정한다. 예시적인 분석은 실시예에서 추가로 기재한다.
II. 환경 영향인자
본 발명은 환경 영향인자의 투여로 대사적 장애를 치료하는 방법을 제공한다. "환경 영향인자"(env-영향인자)는 인간의 질병 환경에 유익한 방향으로 영향을 주거나 조절하는 분자로서 인간의 질병 환경을 정상 또는 건강한 환경으로 전환, 원래대로 재확립 또는 유지하여 정상 상태를 유도한다. env-영향인자는 하기 정의된 바와 같은 다차원 세포내 분자(Multidimensional Intracellular Molecules, MIMs) 및 환경대사적 전환인자(Epimetabolic shifters, Epi-전환인자)를 포함한다.
1. 다차원 세포내 분자(MIM)
용어 "다차원 세포내 분자(MIM)"은 인간의 최소 하나의 세포에 존재하고/거나 신체에 의해 자연적으로 생성되는 내생 분자의 분리된 형태 또는 합성을 통해 생산된 형태이다. MIM은 하나 또는 그 이상의, 둘 또는 그 이상의, 셋 또는 그 이상의, 또는 하기 기능 모두에 의해 특징지워진다. MIM은 세포로 들어갈 수 있고, 분자의 생물학적으로 활성이 있는 부분이 모두 세포로 들어가는 한, 세포로의 도입은 세포내로의 완전한 또는 부분적 도입을 포함한다. MIM은 세포내에서 신호 전달 및/또는 유전자 발현 메커니즘을 유도할 수 있다. MIM은 분자가 치료적 및 담체, 예컨대 약물 전달, 효과 모두를 갖는 점에서 다차원적이다. MIM은 또한 분자가 질병 상태에서 한 방향으로 작용하고, 정상 상태에서 상이한 방향으로 작용하는 면에서 다차원적이다. 예를 들면, CoQ10의 경우, VEGF 존재하에 CoQ10을 흑색종 세포에 투여하면 Bcl2의 수준이 감소하게 되며, 결국 흑색종 세포에 대해서 종양발생의 잠재력이 감소하게 된다. 반대로, 정상 섬유아세포에서, CoQ10 및 VEGF를 공동 투여하면 Bcl2 수준에 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, MIM은 질병 상태의 세포에 선택적으로 작용하고, 정상 상태의 (매칭) 세포에 실질적으로 영향을 주지 않는다. 바람직하게는, MIM은 표현형, 대사 상태, 유전형, mRNA/단백질 발현 수준 등에 있어서 질병 상태의 세포기 (매칭) 정상 상태 세포에 근접하게 만든다.
일 실시양태에서, MIM은 epi-전환인자일 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, MIM은 epi-전환인자가 아니다. 기술자는 본 발명의 MIM이 두 개 또는 그 이상의 내싱 분자의 혼합물을 포함하는 것을 의도한다는 점을 또한 이해할 것이며, 여기에서 혼합물은 하나 또는 그 이상의 앞서 언급한 기능에 의해 특징지워진다. 혼합물 중의 내생 분자는 혼합물이 MIM으로서 기능하는 비율로 존재한다.
MIM은 지질 기반 또는 비-지질 기반 분자일 수 있다. MIM의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, CoQ10, 아세틸 Co-A, 팔미틸 Co-A, L-카르니틴, 아미노산, 예컨대 티로신, 페닐알라닌 및 시스테인을 포함한다. 일 실시양태에서, MIM은 소분자이다. 본 발명의 일 실시양태에서, MIM은 CoQ10이 아니다. MIM은 이 기술분야의 기술자가 여기에 상세히 기재된 임의의 분석방법을 사용하여 루틴하게 확인할 수 있다.
어떤 실시양태에서, MIM은 비타민 B 패밀리의 화합물, 또는 비타민 B 패밀리의 화합물을 포함하는 뉴클레오사이드, 모노뉴클레오티드 또는 디뉴클레오티드를 포함한다. 비타민 B 패밀리의 화합물은, 예를 들면 티아민(비타민 B1), 니아신(티코틴 산 또는 비타민 B3로도 알려진), 또는 피리독신(비타민 B6) 뿐만 아니라 프로비타민 예컨대 판테놀(프로비타민 B5)를 포함한다. 어떤 실시양태에서, MIM은 티아민, 니아신 및 피리독신으로부터 선택된다. 비타민 B 패밀리의 화합물을 포함하는 뉴클레오사이드, 모노뉴클레오티드 또는 디뉴크렐오티드는 예를 들면, 아데닌 또는 니아신(니코틴산) 분자를 포함하는 뉴클레오사이드, 모노뉴클레오티드 또는 디뉴클레오티드를 포함한다. 어떤 실시양태에서, MIM은 아데노신, 아데노신 디포스페이트(ADP), 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드(FAD, 비타민 B2 및 ADP의 부분을 포함하는) 및 니코틴산 디뉴클레오티드로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, MIM은 아미노산을 포함한다. 아미노산의 예로는, 예컨대 티로신(예컨대 L-티로신), 시스테인, 페닐알라닌(예컨대 L-페닐알라닌) 및 알라닌을 포함한다. 어떤 실시양태에서, 아미노산은 페닐알라닌 또는 알라닌이다. 어떤 실시양태에서, MIM은 아미노산 유도체 예컨대 4-히드록시페닐피루베이트 또는 아세틸글리신을 포함한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 글루코스 아날로그이며, 예컨대 글루코스 분자에서 한 -OH 또는 -CH2OH 치환체가 -COOH, -COO- 또는 -NH2 치환체로 대체된 글루코스 분자이다. 글루코스 아날로그의 예로는 글루코사민, 글루큐론산, 글루큐로니드 및 글루큐로네이트를 포함한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 화학식 (I)의 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00001
(I)
여기에서
n은 0 또는 1의 정수이고;
R1, R2, R3 및 R4은 만약 존재한다면, 각각 독립적으로 수소 및 히드록실로부터 선택되거나, R1 및 R2는 이들이 부착된 탄소와 함께 카르보닐 (C=O)기를 형성하며;
W는 -COOH 또는 -N(CH3)3 +이고;
X는 수소이며, 음전하 또는 알칼리 금속 양이온, 예컨대 Na+ 또는 이다.
n이 0일 때, CHR3기는 W 치환기에 결합되는 것으로 이해된다.
어떤 실시양태에서, W는 -N(CH3)3 +이다. 어떤 실시양태에서, MIM은 카르니틴, 예컨대 L-카르니틴이다.
어떤 실시양태에서, MIM은 디카르복실산이다. 어떤 실시양태에서 W는 -COOH이다. 어떤 실시양태에서 R3은 수소이다. 어떤 실시양태에서 n은 0이다. 어떤 실시양태에서 R1 및 R2은 각각 독립적으로 수소이다. 어떤 실시양태에서, W는 -COOH이고, R3는 수소이며, n은 0이고, R1 및 R2은 각각 독립적으로 수소이다. 어떤 실시양태에서 n은 1이다. 어떤 실시양태에서 R1 및 R2은 그것들이 부착된 탄소와 함께 카르보닐(C=O)기를 형성한다. 어떤 실시양태에서, R4는 수소이다. 어떤 실시양태에서, R4는 히드록실이다. 어떤 실시양태에서, W는 -COOH이고, R3는 수소이며, n은 1이고, R1 및 R2는 그것들이 부착된 탄소와 함께 카르보닐(C=O)기를 형성한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 크렙 사이클의 중간체이고, 과량은 크렙 사이클이 생산적인 산화적 인산화로 가도록 한다. MIM인 예시적 크렙 사이클 중간체로는 숙신산 또는 숙시네이트, 말산 또는 말레이트 및 α-케토글루타르산 또는 α-케토글루타레이트를 포함한다.
어떤 실시양태에서, MIM은 CoQ10의 빌딩 블록(building block)이며, 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00002
.
따라서, CoQ10의 빌딩 블록은 이로 제한되는 것은 아니나, 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트, 3-메톡시-4-히드록시만델레이트, 바닐산, 4-히드록시벤조에이트, 메발론산, 파네실, 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논, 뿐만 아니라 이들의 상응하는 산 또는 이온을 포함한다. 어떤 구체예에서, MIM은 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트 및 4-히드록시벤조에이트로부터 선택된다.
(i) MIM을 감별하는 방법
본 발명은 MIM을 확인하기 위한 방법을 제공한다. MIM을 확인하기 위한 방법은 일반적으로 내생 분자의 세포로 외생적 첨가 및 세포에서, 내생 분자가 제공하는, 예컨대 세포 미소환경 프로파일에서의 효과의 평가를 포함한다. 세포 미소환경 프로파일에서의 변화를 확인하기 위하여 세포에서의 효과가 하나 또는 그 이상의 세포성, mRNA, 단백질, 지질, 그리고/또는 대사체 수준에서 평가된다. 일 실시양태에서, 세포는 배양된 세포, 예컨대 시험관내이다. 일 실시양태에서, 세포는 기관에 존재한다. 내생 분자는 단일 농도로 세포에 첨가될 수 있거나 농도 범위 이상으로 세포에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 미처리된 세포, 대조군의 내생 분자 수준과 비교하였을 때 내생 분자는 세포에 첨가되어 세포에서 내생 분자의 수준이 (예컨대 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 또는 그 이상까지) 증가한다.
예컨대 임의의 하나 또는 그 이상의 형태적, 생리적, 그리고/또는 조성물 (예컨대 mRNA, 단백질, 지질, 대사체)의 변화에 의해 검출되는 세포에서 변화를 유도하는 분자는 만약 세포 미소환경 프로파일에 대해 유도된 변화가 질병이 있는 세포 상태 및 정상 세포 상태에서 상이한지를 결정하기 위하여 또한 평가될 수 있다. 다양한 조직 기원의 세포(예컨대 세포 배양 주), 세포 형태 또는 질병이 있는 상태는 비교 평가로 평가될 수 있다. 예를 들면, 암 세포의 세포 미소환경 프로파일에서 유도된 변화는 비-암화 또는 정상 세포에서 유도된 변화와 비교될 수 있다. 정상 세포와 비교하였을 때, 세포의 미소환경 프로파일에 있어서 변화를 유도하는 것 및/또는 질병이 있는 세포의 미소환경 프로파일에 있어 별도로 (예컨대, 우선적으로) 변화를 유도하는 것으로 관찰되는 내생 분자 (예컨대 세포의 형태적, 생리적 및/또는 조성물, 예컨대 mRNA, 단백질, 지질 또는 대사체의 변화를 유도하는 것)은 MIM으로 구분된다.
본 발명의 MIM은 지질 기반 MIM 또는 비-지질 기반 MIM일 수 있다. 지질 기반 MIM을 확인하기 위한 방법으로 상기-기재된 세포 기반 방법을 포함하며, 지질 기반 내생 분자가 세포로 외생적으로 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 지질 기반 내생 분자는 지질 기반 내생 분자가 세포에서 상승하는 수준으로 세포에 첨가된다. 일 실시양태에서, 지질 기반 내생 분자의 수준은 미처치 대조군 세포에서의 수준에 비하여 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 또는 그 이상까지 증가된다. 지질 기반 분자의 세포로의 제형화 및 전달은 각 테스트 분자의 특성에 달려있으나, 이 기술분야에 많은 방법이 알려져 있다. 지질 기반 분자의 제형화 및 전달 모드의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, 공동-용매(co-solvent), 담체 분자, 리포좀, 분산제제, 현탁화제, 나노입자 분산제제, 에멀젼, 예컨대 수중유형 또는 유중수형 에멀젼, 다중상 에멀젼, 예컨대 유중수중유형 에멀젼, 폴리머 포착 및 캡슐화에 의한 가용화를 포함한다. 지질 기반 MIM의 세포로의 전달은 세포 지질의 추출 및 이 기술분야에 알려진 루틴한 방법, 예컨대 질량 분석기로 MIM을 정량함으로써 확인될 수 있다.
비-지질 기반 MIM을 확인하기 위한 방법은 상기-기재된 세포 기반 방법을 포함하며, 비-지질 기반 내생 분자는 세포로 외생적으로 첨가된다. 바람직한 실시양태에서, 비-지질 기반 내생 분자는 비-지질 기반 내생 분자 수준이 세포에서 상승되는 수준으로 세포에 첨가된다. 일 실시양태에서 비-지질 기반 내생 분자의 수준은 미처리 대조군 세포에서의 수준에 비하여 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 3.0배, 4.0배, 5.0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 또는 그 이상까지 상승한다. 비-지질 기반 분자의 세포로의 제형화 및 전달은 각 테스트 분자의 특성에 달려있으나, 이 기술분야에 많은 방법이 알려져 있다. 비-지질 기반 분자의 제형화 및 전달 모드의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나, 공동-용매(co-solvent), 담체 분자, 능동수송, 폴리머 포착 또는 흡착, 폴리머 이식, 리포조말 캡슐화로 로 가용화하는 것 및 표적화된 전달 시스템과 함께 제형화하는 것을 포함한다. 비-지질 기반 MIM의 세포로의 전달은 세포 내용물의 추출 및 이 기술분야에 알려진 루틴한 방법, 예컨대 질량 분석기로 MIM을 정량함으로써 확인될 수 있다.
2. 환경대사적 전환인자(Epimetabolic Shifters, epi-전환인자)
여기 사용된 바와 같은 "환경대사적 전환인자"(epi-전환인자)는 건강(또는 정상) 상태로부터 질병이 있는 상태로의 대사 변환 및 그 반대를 조절하는 (내생적 또는 외생적) 분자이며, 그럼으로써 인간의 세포성, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주 건강을 유지 또는 재확립할 수 있다. epi-전환인자는 조직 미소환경의 정상화를 유발할 수 있다. 예를 들면, epi-전환인자는 세포에 첨가되거나 세포로부터 고갈될 때, 세포의 미소환경(예컨대 대사 상태)에 영향을 줄 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 기술자는 본 발명의 epi-전환인자가 두 개 또는 그 이상의 분자의 혼합물을 포함하는 것을 또한 의도한다는 점을 이해할 것이며, 여기에서 혼합물은 앞서 언급한 하나 또는 그 이상의 기능에 의해 특징지워진다. 혼합물에 있어서 분자는 혼합물이 epi-전환인자로 기능하는 비율로 존재한다. epi-전환인자의 예로는, 이로 제한되는 것은 아니나 CoQ10; 비타민 D3; ECM 구성요소 예컨대 피브로넥틴; 면역조절자, 예컨대 TNFα 또는 임의의 인터루킨, 예컨대 IL-5, IL-12, IL-23; 신생혈관생성 인자(angiogenic factors); 및 세포사멸 인자를 포함한다.
어떤 실시양태에서, epi-전환인자는 예컨대 크렙 사이클에서 하나 또는 그 이상의 반응을 촉매하는데 직접적으로 참여하거나 과량인 경우 크렙 사이클로 가도록 만드는 크렙 사이클 대사체를 생성하는 효소와 같은 효소이다. 어떤 실시양태에서, 효소는 펜토오즈 포스페이트 경로, 예컨대 트랜스알돌라아제, 또는 트랜스케톨라아제의 비-산화 상(non-oxidative phase)의 효소이다. 다른 실시양태에서, 효소는 크렙 사이클을 촉진하는 구성성분 효소 또는 효소 복합체이며, 예컨대 합성효소 또는 리가아제이다. 예시적 효소로는 숙시닐 CoA 합성효소 (크렙 사이클 효소) 또는 피루베이트 카르복실라아제 (피루베이트의 가역적 카르복실화를 촉매하여 올살로아세테이트(OAA), 크렙 사이클의 대사체를 형성하는 리가아제)를 포함한다.
어떤 실시양태에서, epi-전환인자는 CoQ10의 빌딩 블록이다. CoQ10의 빌딩 블록은, 이로 제한되는 것은 아니나, 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트, 3-메톡시-4-히드록시 만엘레이트, 바닐산, 4-히드록시벤조에이트, 메발론산, 파네실, 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논, 뿐만 아니라 이들의 상응하는 산 또는 이온을 포함한다. 어떤 실시양태에서, epi-전환인자는 페닐알라닌, 티로신, 4-히드록시페닐피루베이트, 페닐아세테이트 및 4-히드록시벤조에이트로부터 선택된다.
어떤 실시양태에서, epi-전환인자는 비타민 B 패밀리의 화합물이다. 비타민 B 패밀리의 화합물로는, 예를 들면 리보플라빈(비타민 B2), 또는 이들의 아날로그를 포함한다. epi-전환인자는 또한 임의의 아날로그 또는 프로-드럭을 포함하는데, 이들은 생체내에서 여기 기재된 것과 같은 임의의 내생적 MIM으로 대사될 수 있다.
일 실시양태에서, epi-전환인자는 또한 MIM이다. 일 실시양태에서, epi-전환인자는 CoQ10이 아니다. epi-전환인자는 이 기술분야의 기술자에 의해 여기 상세히 기재된 임의의 분석방법을 사용하여 루틴하게 확인될 수 있다.
(i) epi-전환인자를 확인하는 방법
환경대사적 전환인자(epi-전환인자)는 세포의 대사 상태를 조절할 수 있는 분자이며, 예컨대 건강(또는 정상) 상태로부터 질병이 있는 상태로의 대사 변환 및 그 반대를 유도하며, 그럼으로써 인간의 세포성, 조직, 기관, 시스템 및/또는 숙주 건강을 유지 또는 재확립할 수 있다. 본 발명의 epi-전환인자는 따라서 질병이 있는 상태의 진단학적 평가에 있어 유용성을 갖는다. 본 발명의 epi-전환인자는 또한 치료적 적용에 있어 유용성을 갖는데, 여기에서 epi-전환인자의 적용 또는 투여 (또는 다른 치료적 분자에 의한 epi-전환인자의 조정)는 조직의 미소환경 및 질병이 있는 상태의 정상화에 영향을 준다.
환경대사적 전환인자의 확인은 일반적으로 차별적인 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 예컨대 대사체, 지질, 단백질 또는 RNA (개개의 프로파일로서 또는 배합으로서)의 분자 프로파일의 확립을 포함한다. 수준의 변화 (예컨대, 증가되거나 감소된 수준)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 분자가 잠재적 epi-전환인자로 구분된다.
일 실시양태에서, epi-전환인자는 또한 MIM이다. 잠재적 epi-전환인자는 이 기술분야에 알려진 임의의 다수의 루틴한 기술을 사용함으로써, 그리고 여기에 기재된 임의의 방법을 사용함으로써, 세포로 외생적으로 첨가하여 세포로 들어가는 능력을 평가할 수 있다. 예를 들면, 잠재적 epi-전환인자의 세포로의 도입은 세포 내용물의 추출 및 이 기술분야에 알려진 루틴한 방법, 예컨대 질량 분석기에 의한 잠재적 epi-전환인자의 정량에 의해 확인될 수도 있다. 세포로 들어갈 수 있는 잠재적 epi-전환인자는 그럼으로써 MIM으로서 확인된다.
epi-전환인자를 확인하기 위하여, 잠재적 epi-전환인자는 그 다음으로 세포의 대사 상태를 변환시키는 능력에 대해 평가된다. 잠재적 epi-전환인자의 세포 미소환경의 대사 상태를 변환시키는 능력은 잠재적 epi-전환인자를 세포로 도입함으로써(예컨대 외생적으로 첨가) 및 하나 또는 그 이상의 유전자 발현에 있어서의 변화(예ㅋ너대 mRNA 또는 단백질 발현상의 변화), 지질 또는 대사체 수준에 있어서의 농도 변화, 그리고/또는 미토콘드리아 기능 또는 개수에 있어서의 변화를 모니터링함으로써 평가된다. 세포 미소환경의 대사 상태를 변환시킬 수 있는 잠재적 epi-전환인자는 여기 상세히 기재된 임의의 분석방법을 사용하여 이 기술분야의 기술자에 의해 루틴하게 확인될 수 있다. 잠재적 epi-전환인자는 또한 정상 건강 상태쪽으로 (또는 역으로, 질병이 있는 상태쪽으로 정상 세포의 대사 상태가 변환되는 능력에 대하여) 질병이 있는 세포의 대사 상태가 변환되는 능력이 측정된다. 정상 건강 상태쪽으로 질병이 있는 세포의 대사 상태가 변환될 수 있는 (또는 질병이 있는 상태쪽으로 건강한 정상 세포의 대사 상태가 변환될 수 있는) 잠재적 epi-전환인자는 따라서 epi-전환인자로 확인된다. 바람직한 실시양태에서, epi-전환인자는 정상 세포의 건강 및/또는 성장에 부정적으로 영향을 주지 않는다.
본 발명의 환경대사적 전환인자는, 이로 제한되는 것은 아니나, 소분자 대사체, 지질-기반 분자 및 단백질 및 RNA를 포함한다. 소분자내생 대사체 클래스에서 환경대사적 전환인자를 확인하기 위하여, 차별적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 대사체 프로파일이 확립된다. 각 세포 또는 조직에 대한 대사체 프로파일은 세포 또는 조직으로부터 대사체를 추출하고, 그 후 예를 들면 질량분석기와 결합된 액상-크로마토그라피 또는 질량분석방법과 결합된 가스-크로마토그라피를 포함하는, 기술자에게 알려진 루틴한 방법을 사용하여 대사체를 확인하고 정량함으로써 결정된다. 수준의 변화(예컨대 증가되거나 감소된 수준)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 대사체가 잠재적 epi-전환인자로 구분된다.
내생 지질-기반 분자 클래스에서 환경대사적 전환인자를 확인하기 위하여, 차별적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 지질 프로파일이 확립된다. 각 세포 또는 조직에 대한 지질 프로파일은 지질 추출 방법, 그 후 기술자에게 알려진 루틴한 방법, 예를 들면 질량분석기와 결합된 액상-크로마토그라피 또는 질량분석 방법과 결합된 가스-크로마토그라피를 사용하여 지질을 확인 및 정량함으로써 결정된다. 수준의 변화(예컨대, 벌크 또는 트레이스 수준에 있어서의 증가 또는 감소)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 지질이 잠재적 epi-전환인자로 구분된다.
단백질 및 RNA 클래스에서 환경대사적 전환인자를 확인하기 위하여, 차별적 질환 상태, 진행 또는 공격성을 나타내는 세포 또는 조직의 패널에 대한 유전자 발현 프로파일이 확립된다. 각 세포 또는 조직에 대한 발현 프로파일은 표준 프로테오믹스, mRNA 어레이, 또는 유전적 어레이 방법, 예컨대 여기 상세히 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 mRNA 및/또는 단백질 수준에서 결정된다. 발현의 변화(예컨대, mRNA 또는 단백질 수준에 있어서의 발현의 증가 또는 감소)가 질환 상태, 진행 또는 공격성과 관련되어 있는 유전자가 잠재적 epi-전환인자로 구분된다.
일단 (예컨대 용해되는 대사체, 지질-기반 분자, 단백질, RNA 또는 기타 조성물의 생물학적 클래스에 대해) 상기 기재된 분자 프로파일이 확립되면 세포 환경에서 확인된 잠재적 epi-전환인자 사이의 알려진 관련성을 설명하기 위하여 세포성 및 생화학적 경로 분석이 수행된다. 이러한 세포성 및/또는 생화학적 경로 분석을 통해 수득된 정보는 경로 및 잠재적 epi-전환인자를 카테고리화하기 위하여 사용될 수 있다.
질환 상태를 조절하기 위한 epi-전환인자의 사용은 여기 상세히 기재되거나 이 기술분야에 알려진 임의의 많은 수의 분석방법을 사용하여 이 기술분야의 기술자에 의해 더욱 평가되고 확인될 수 있다. 질환 상태를 조절하기 위한 epi-전환인자의 사용은 epi-전환인자를 세포 또는 기관으로 직접적으로 외생적으로 전달함으로써 평가될 수 있다. 질환 상태를 조절하기 위한 epi-전환인자의 사용은 epi-전환인자(예컨대 epi-전환인자의 수준 또는 활성)를 직접 조절하는 분자의 발달로써 선택적으로 평가될 수 있다. 질환 상태를 조절하기 위한 epi-전환인자의 사용은 다른 분자들, 예컨대 epi-전환인자와 동일한 경로에 위치하는 유전자(예컨대 RNA 또는 단백질 수준에서 조절되는)와 같은 다른 분자를 조절함으로써 epi-전환인자(예컨대 epi-전환인자의 수준 또는 활성)를 간접적으로 조절하는 분자의 발달에 의해 측정될 수도 있다.
여기 기재된 환경대사적(Epimetabolomic)적 접근은 세포 미소환경에 존재하는 내생 분자의 확인을 촉진하며, 그 수준은 유전적, mRNA 또는 단백질-기반 메커니즘을 통해 감지되고 컨트롤된다. 본 발명의 epi-전환인자에 의해 촉발되는 정상 세포에서 발견되는 조절 반응 경로는 불완전 조절(misregulated) 또는 질병에 걸린 세포 환경에서 치료적 값을 제공할 것이다. 또한, 여기 기재된 환경대사적 접근은 임상 환자 선택, 질환 진단 키트에 사용되기 위한 진단적 지표 또는 예후 지표로서 제공될 수 있는 epi-전환인자를 확인한다.
III. MIM/Epi-전환인자를 확인하기에 유용한 시험법
관심있는 분자 및 화합물을 분리하고 확인하기 위해 사용된 본 발명의 기술과 방법은 액체 크로마토그래피(LC), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 분석법(MS), 가스 크로마토그래피(GC), 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC-MS), 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC-MS), 핵자기 공명법(NMR), 자기공명 이미지(MRI), 푸리에 트랜스폼 적외선법(FT-IR) 및 유도 결합 플라즈마 분석기(ICP-MS)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 질량 분석 기술은 자기 섹터 및 이중 초점 기기, 4중 극자 투과 기기, 4중 극자 이온-트랩 기기, 비행-시간 기기(TOF), 푸리에 트랜스폼 이온 사이클로트론 공명 기기(FT-MS) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행-시간 질량 분석기(MALDI-TOF MS)의 사용을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
생체에너지 분자 수준의 정량화
환경 영향 인자(예를 들면, MIMs 또는 Epi-전환인자)는 후보 epi-전환인자가 적용되었을 때, 세포의 세포내 생체에너지 분자(예를 들면, ATP, 피루베이트, ADP, NADH, NAD, NADPH, NADP, 아세틸CoA, FADH2)의 수준 변화에 의해 확인될 수 있다. 생체에너지 분자 수준의 예시화된 시험법으로 발색, 형광 및/또는 생체인광(bioluminescent)에 기반한 방법을 사용한다. 그러한 시험법의 예는 하기에 제공된다.
세포내 ATP의 수준은 다양한 시험법 및 공지의 시스템에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 시스템에서 용해된 세포로부터 나오는 세포질 ATP은 루시페린과 효소 루시퍼라제와 반응하여 빛을 생산한다. 이러한 생체 인광은 생체인광분석기에 의해 측정되며, 용해된 세포의 세포내 ATP 농도는 계산될 수 있다 (EnzyLightTM ATP Assay Kit (EATP-100), BioAssay Systems, Hayward, CA). 또 다른 시스템에서, 예를 들어, ATP와 이의 탈인산화된 형태인 ADP 모두는 생체 인광법에 의해 계산될 수 있는데; ATP 수준이 계산된 후에, ADP는 ATP로 변환되고 이후 검출되며 동일한 루시퍼라제 시스템(ApoSENSORTM ADP/ATP Ratio Assay Kit, BioVision Inc., Mountain View, CA)을 사용하여 계산된다.
피루베이트는 세포내 대사 경로에서 중요한 중간체이다. 피루베이트는 글루코스신생합성(glucogenesis)을 거쳐 탄수화물로 변환될 수 있으며, 세포내 대사 상태에 의존하여, 지질산으로 변환되거나 아세틸 CoA를 거쳐 대사되거나 또는 알라닌 또는 에탄올로 변환된다. 따라서, 피루베이트 수준의 검출은 세포 표본의 대사 활성과 상태 측정에 제공된다. 피루베이트를 검출하는 하나의 시험법은, 예를 들면, 발색 및 형광 모두를 사용하여 다른 범위 내의 피루베이트 농도를 검출하는 것(EnzyChromTM 피루베이트 분석 키트 (Cat# EPYR-100), BioAssay Systems, Hayward, CA)이다.
환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 세포내 미토콘드리아에 의해 수행되는, 세포내 생체에너지 분자의 생성 및 유지와 관련된 산화적 인산화 과정에 영향을 줄 수 있다. 세포 배양물 및 표본에서 직접적으로 세포 에너지의 변화를 검출하는 시험법(이하 기술)에 더하여, 세포내 미토콘드리아 복합체와 효소에 별개로 미치는 화합물의 영향을 검출하고 정량화하는 시험법이 존재한다. 예를 들어, MT-OXC MitoToxTM완전 OXPHOS 활성 시험법 (MitoSciences Inc., Eugene, OR) 은 미토콘드리아로부터 추출된 복합체 I 내지 V에 직접적으로 적용된 화합물의 영향을 검출하고 정량화할 수 있다. NADH 데하이드로게나제(복합체 I), 시토크롬 c 산화효소(복합체 IV) 및 ATP 합성효소(복합체 V)와 같은 개별적인 미토콘드리아 복합체에 미치는 영향의 검출 및 정량화를 위한 시험법이 또한 활용될 수 있다 (MitoSciences Inc., Eugene, OR).
세포 에너지의 측정
환경 전환인자(예를 들면, MIM 또는 epi-전환인자)는 또한 세포 에너지의 변화에 의해 확인될 수 있다. 세포 에너지 측정의 한 예는 분자성 산소의 소비 및/또는 세포 배양 배지의 pH 변화를 실시간으로 측정하는 것이다. 예를 들어, 잠재적인 epi-전환인자가 세포의 대사 상태를 조절하는 능력은 예를 들면, XF24 분석기(Seahorse, Inc.)을 사용하여 분석될 수 있다. 이러한 기술은 세포 미소환경의 생체 에너지를 평가하기 위하여, 세포 단일층 내 산소 및 pH 변화의 실시간 검출을 허용한다. XF24 분석기는 세포 에너지에 있어 주요 지시자에 해당하는, 호기성 대사의 측정값인 산소 소비율(OCR)과 당분해의 측정값인 세포외 산성화(ECAR) 모두를 측정하고 비교한다.
산화적 인산화와 미토콘드리아 기능의 측정
산화적 인산화는 미토콘드리아 막 내 묻혀진 단백질 복합체를 거쳐 진핵 세포내에서 수행되는 영양 화합물의 산화를 거쳐 ATP가 생성되는 과정이다. 대부분의 유기체의 세포내에서 ATP의 주요 원천으로서, 산화적 인산화 활성의 변화는 강력하게 세포내 대사 및 에너지 균형을 변화시킬 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 산화적 인산화에 대한 이들의 영향에 의해 검출되고/되거나 확인될 수 있다. 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 이에 제한되는 것은 아니나, 전자 전달 사슬 및 ATP 합성을 포함하는 산화적 인산화의 구체적인 측면에 대한 이들의 영향을 검출되거/되거나 확인될 수 있다.
산화적 인산화와 관련된 과정을 수행하는 미토콘드리아의 막 내 단백질 복합체는 특별한 작업을 수행하고, 이는 I, II, III 및 IV로 번호 붙여진다. 이들 복합체는 트래스-내부 막 ATP 합성효소(복합체 V로 알려짐)를 따르는, 산화적 인산화 과정과 관련된 주요 대상(entity)이다. 일반적으로 미토콘드리아 기능, 특히 산화적 인산화 과정에 미치는 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)의 효과를 조사할 수 있는 시험법에 추가하여, 다른 복합체로부터 분리되어 개별적인 복합체에 epi-전환인자가 미치는 영향을 조사하는데 사용될 수 있는 시험법이 활용될 수 있다.
NADH-조효소 Q 옥시도리덕타제 또는 NDAH 데하이드로게나제로서 알려진 복합체 I은 전자 전달 사슬 내에서의 첫번째 단백질이다. 일부 구체예에서, 복합체 I에 의한 NAD+ 생산에 있어 epi-전환인자가 미치는 영향의 검출 및 정량화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 복합체는 96-웰 플레이트에서 표본으로부터 면역포획될 수 있고; NADH에서 NAD+로의 산화는 450 nM에서의 증가된 흡수를 나타내는 염색 분자의 환원과 함께 동시에 일어난다(복합체 I 효소 활성 마이크로플레이트 시험 키트, MitoSciences Inc., Eugene, OR).
시토크롬 c 산화효소(COX)로 알려진 복합체 IV는 전자 전달 사슬에서 마지막 단백질이다. 일부 구체예에서, 복합체 IV에 의한 시토크롬 c의 산화와 산소에서 물로의 환원에 미치는 epi-전환인자의 효과 검출 및 정량화가 수행될 수 있다. 예를 들어, COX는 마이크로웰 플레이트에서 면역포획되어 COX의 산화는 발색 시험법으로 측정된다 (복합체 IV 효소 활성 마이크로플레이트 시험 키트, MitoSciences Inc., Eugene, OR).
산화적 인산화 과정에서의 첫번째 효소는 ATP 합성효소(복합체 V)로, 다른 복합체에 의해 생성된 양성자 구배를 사용하여 ATP를 ADP로 합성하는 동력으로 한다. 일부 구체예에서, ATP 합성효소의 활성에 미치는 epi-전환인자의 효과 검출 및 정량화가 수행될 수 있다. 예를 들어, 표본 내 ATP 합성 효소의 활성과 ATP 합성 효소의 양은 마이크로웰 플레이트의 웰 내 면역포획된 ATP 합성 효소에 의해 측정될 수 있다. 효소는 또한 어떤 특정 조건에서 ATP아제로서 기능할 수도 있으며, 따라서 ATP 합성효소 활성에 대한 시험법에서, ATP를 ADP로 환원하는 비율은 NADH를 NAD+로 산화하는 것을 동시에 검출함으로써 측정된다. ATP의 함량은 ATP아제 에 표식화된 항체를 사용하여 계산된다(ATP 합성효소 Duplexing (Activity + Quantity) Microplate Assay Kit, MitoSciences Inc., Eugene, OR). 산화적 인산화를 위한 추가적인 시험법은 복합체 II 및 III의 활성에 미치는 영향을 시험하는 시험법을 포함한다. 예를 들면, MT-OXC MitoToxTM Complete OXPHOS System (MitoSciences Inc., Eugene, OR) 은 복합체 I, IV 및 V 뿐만 아니라 복합체 II 및 III에 화합물이 미치는 영향을 평가하는데 사용될 수 있고, 전체적인 산화적 인산화 시스템에 화합물이 미치는 영향에 대한 데이터를 제공한다.
상기 기술한 바와 같이, 온전한 세포 표본의 실시간 관찰은 세포 배양 배지 내 산소 소비 및 pH의 변화에 대한 탐침기를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 세포 에너지의 시험법은 미토콘드리아 기능 및 잠재적인 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)가 표본 세포내 미토콘드리아 활성에 미치는 영향에 대한 광범위한 개요를 제공한다.
환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 또한 미토콘드리아 투과성 전이(MPT), 즉, 미토콘드리아 투과 전이 공극(MPTP)의 형성에 의해 미토콘드리아 막의 투과성이 향상되는 현상에 영향을 미칠 수 있다. 미토콘드리아 투과성의 향상은 미토콘드리아가 부풀어 오르게 하며(swelling), 산화적 인산화 및 ATP 재생을 어렵게 하고 결국 세포사로 이끈다. MPT는 세포 사멸 유도와 관련될 수 있다 (참조, 예를 들어 본원에서 전체가 참조로서 도입되는 Halestrap, A.P., Biochem. Soc. Trans. 34:232-237 (2006) 및 Lena, A. et al. Journal of Translational Med. 7:13-26 (2009))
일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)가 MPT 및 MPTP의 형성, 중단 및/또는 효과에 미치는 영향의 검출 및 정량화가 측정될 수 있다. 예를 들어, 시험법은 미토콘드리아 내부 막과 다른 시토졸 구획(compartment)을 구분시키는 구체적인 염료 분자(칼세인)의 사용을 통해 MPT를 측정할 수 있다. 또 다른 분자, CoCl2의 적용은 시토졸 내 칼세인 염료의 형광을 억누르는(squelch) 역할을 한다. 그러나 CoCl2는, 미토콘드리아의 내부에 접속하지는 못하므로 따라서, 미토콘드리아 내 칼세인 형광은 MPT가 일어나고 CoCl2가 MPTP를 거쳐 미토콘드리아 내부로 접속하지 않는 한, 억눌러지지 않는다. 미토콘드리아-특정 형광의 손실은 MPT가 일어날 때, 표시된다. 유동세포 분석법(Flow cytometry)이 세포 및 세포 기관 형광을 평가하는데 사용될 수 있다((MitoProbeTM Transition Pore Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, OR). 실험적인 결과를 평가하기 위하여, 추가적인 시험법은 형광 현미경을 사용한다(Image-iTTM LIVE Mitochondrial Transition Pore Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, OR).
세포 증식 및 염증 측정
본 발명의 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 세포 증식 및/또는 염증과 관련된 분자의 생산 또는 활성에 미치는 효과에 의해 확인되고 평가된다. 이들 분자는 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 세포 외 매트릭스 성분, 케포카인, 뉴로펩타이드, 뉴로트랜스미터, 뉴로트로핀 및 신호 전달과 관련되는 것들과 같은 세포내 분자 뿐만 아니라 세포 신호와 관련되는 기타 분자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
혈관내피 성장인자(VEGF)는 잠재적인 혈관신생, 혈관형성(vasculogenic) 및 분열촉진(mitogenic) 특성을 갖는 성장 인자이다. VEGF는 내피 투과성 및 스웰링을 자극하며 VEGF 활성은 류마티스 관절염, 전이성 암, 노인 황반변성 및 당뇨망막병증을 포함하는 다양한 질병 및 장애와 연루된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 그것이 VEGF의 생산에 미치는 영향에 의해 확인되고 특징지어진다. 예를 들어, 혈중 산소 감소 조건 또는 산성증 유사 조건 하에서 유지되는 세포는 증가된 VEGF 생산을 나타낼 것이다. 배지로 유출되는 VEGF는 활용가능한 항-VEGF 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하는 ELISA 또는 다른 항체-기반 시험법에 의해 시험될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, Epi-전환인자는 그것이 VEGF에 대한 세포 반응성에 미치는 영향에 기반하고/하거나, VEGF 수용체의 발현 또는 활성에 미치는 영향에 기반하여 확인되고/되거나 특징지어진다.
자가 면역 질환 뿐만 아니라 건강한 면역 시스템 기능 둘 다에 연루되어, 종양 괴사 인자(TNF)는 염증과 면역 시스템 활성의 주요 매개체이다. 본 발명의 일부 구체예에서, Epi-전환인자는 그것이 TNF의 생산 또는 활성에 미치는 영향에 의해 확인되고 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포에 의해 생산되고 배지로 유출되는 TNF는 ELISA 또는 당업계에 알려진 다른 항체-기반 시험법을 거쳐 정량화될 수 있다. 또한 일부 구체예에서, 환경 영향 인자는 그것이 TNF에 대한 수용체 발현에 미치는 영향에 의해 확인되고 특징지어 질 수 있다 (Human TNF RI Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN).
세포외 매트릭스 성분(ECM)은 세포와 조직의 구조 및 신호 전달 과정 모두에 있어 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 잠복성 형질 전환 성장 인자 베타 결합 단백질은 ECM 성분으로, 이는 ECM과 함께 형질 전환 성장 인자 베타(TGFβ)의 저장소를 생성한다. 매트릭스-결합된 TGFβ는 이후에 매트릭스 리모델링 과정 동안 방출될 수 있고, 근처의 세포에 성장 인자 효과를 발휘할 수 있다 (Dallas, S. Methods in Mol. Biol. 139:231-243 (2000)).
일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 그것이 배양 세포에 의한 ECM 생성에 미치는 영향에 의해 확인되거나 특징지어진다. 연구자들은 지속적으로 기술을 개발하여, ECM의 조성 뿐만 아니라 세포에 의한 ECM 생성을 연구하고 정량화할 수 있었다. 예를 들어, 세포에 의한 ECM 합성은 배양 전에 하이드로겔 내에 세포를 묻음(embed)으로서 평가될 수 있다. 생화학 분석 및 기타 분석은 세포 수확 및 하이드로겔 소화 이후에 세포에 의해 생성되는 ECM에 대해 수행될 수 있다 (Strehin, I. and Elisseeff, J. Methods in Mol. Bio. 522:349-362 (2009)).
일부 구체예에서, 환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 epi-환경 인자)가 유기체 내 ECM의 생산, 상태 또는 부족, 또는 그것의 성분 중 하나에 미치는 영향을 확인하거나 특징지을 수 있다. 조건부 넉-아웃(knock-out(KO))된 쥐가 개발되어 왔는데, 그 개발의 특정 단계 또는 별개의 세포 형태 내에서 단지 특히, ECM 유전자를 넉-아웃하는 것이 허용되었다 (Brancaccio, M. et al. Methods in Mol Bio. 522:15-50 (2009)). 특정 조직 내 특정 ECM 성분의 부재시 또는 개발의 특정 단계에서의 활성에 대하여 epi-전환인자 또는 잠재적인 epi-전환인자를 적용 또는 투여한 효과가 따라서 평가되었다.
형질막 보존과 세포사의 측정
환경 영향 인자(예를 들어, MIM 또는 Epi-전환인자)는 세포 표본의 형질막 보존 변화 및/또는 세포 사멸, 괴사 또는 증가되거나 감소되는 세포사와 유사한 세포적 변화를 겪는 세포의 수 또는 백분율 변화에 의해 확인될 수 있다.
락테이트 데하이드로게나제(LDH)에 대한 시험법은 세포 상태 및 손상 수준의 측정을 제공한다. LDH는 안정적이고 상대적으로 풍부한 세포질 효소이다. 형질막이 물리적 보존을 잃었을 때, LDH는 외부 구획으로 달아난다. 더 높은 LDH의 농도는 더 높은 형질막 손상 및 세포사의 수준과 연관성을 갖는다. LDH 시험법의 예는 표본 내 LDH의 수준을 검출하고 정량화하는 발색 시스템을 사용하는 시험법을 포함하며, 여기서 테트라졸리움 염의 산화 형태는 LDH 효소의 활성을 거쳐 생산된다 (QuantiChromTM Lactate Dehydrogenase Kit (DLDH-100), BioAssay Systems, Hayward, CA; LDH Cytotoxicity Detection Kit, Clontech, Mountain View, CA).
세포 사멸은 다양하게 다른 개시 이벤트를 갖는 프로그램화된 세포사 과정이다. 다양한 시험법으로 세포 사멸을 겪는 세포의 수와 비율 변화를 측정할 수 있다. 세포 사멸을 검출하고 정량화하는데 사용되는 시험법의 한 형태는 카스파아제 시험법이다. 카스파아제는 세포 사멸 동안 단백질 가수 분해성 절단을 거쳐 활성화되는 아스파르트산-특정 시스테인 프로테아제이다. 활성화된 카스파아제를 검출하는 시험법의 예는 PhiPhiLux®(OncoImmunin, Inc., Gaithersburg, MD) 및 카스파아제-Glo®3/7 Assay Systems (Promega Corp., Madison, WI)을 포함한다. 세포 사멸 및 비교 표본 내 세포 사멸을 겪는 세포 백분율 또는 수 변화를 검출할 수 있는 추가적인 시험법은 TUNEL/DNA 절편 시험법을 포함한다. 이 시험법은 세포 사멸의 실행 시기 동안 뉴클라아제에 의해 생성되는 180 내지 200 염기쌍 DNA 절편을 검출한다. 예시적인 TUNEL/DNA 절편 시험법은 In Situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 및 the DeadEndTMColorimetric and Fluorometric TUNEL Systems (Promega Corp., Madison, WI)을 포함한다.
일부 세포 사명 시험법은 세포 사멸성 및/또는 비-세포 사멸성 상태와 관련된 단백질을 검출하고 정량화한다. 예를 들어, MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay (Promega Corp., Madison, WI)은 단일 기질, 형광 검출 시스템을 사용하여, 살아있는 세포와 사멸한 세포에 특징적인 프로테아제를 검출하고 정량화하며, 그로 인해 세포 또는 조직 표본 내 세포 사멸을 겪는 세포에 대한 살아있는 세포의 비율을 제공한다.
세포 사멸을 검출하고 정량화하는 데 활용될 수 있는 추가적인 시험법은 세포 투과율을 검출하는 시험법(예를 들어, APOPercentageTM APOPTOSIS Assay, Biocolor, UK) 및 아넥신 V용 시험법(예를 들어, Annexin V-Biotin Apoptosis Detection Kit, BioVision Inc., Mountain View, CA)을 포함한다.
IV. 발명의 용도
본 발명은 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 분석하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 대사적 장애 및/또는 이에 대해 치료되는 피검자의 생존을 예측하기 위해 당업자에 의해 사용되는 임의의 다른 방법과 연계하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 피검자로부터 수득한 샘플의 형태학적 또는 세포학적 분석과 연계하여 수행될 수 있다. 세포학적 방법은 그 자체 또는 다른 마커와 연계하고/하거나 Shc 마커와 연계함에 의한 임의의 다른 분자 마커의 면역조직화학적 또는 면역형광 검출(및 적절한 경우 정량)을 포함한다. 다른 방법은 동일계 PCR에 의해, 또는 조직을 추출하고 실시간 PCR에 의해 다른 마커를 정량함에 의해 다른 마커의 검출을 포함한다. PCR은 폴리머라제 연쇄 반응으로서 정의된다.
피검자에서 대사적 장애를 치료하기 위한 치료 요법의 효능을 평가하기 위한 방법이 또한 제공된다. 이들 방법에서, 한쌍의 샘플(제1 샘플은 치료 요법에 적용되지 않는 것이고 제2 샘플은 치료 요법중 적어도 일부에 적용된다)에서 마커의 양이 평가된다.
본원에 기재된 방법을 사용하여, 특히 세포막을 통과할 수 있기에 충분히 작은 분자를 포함하는 다양한 분자가 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절, 예를 들어, 증가시키는 분자를 동정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 상기 동정된 화합물은 피검체에서 대사적 장애를 억제하기 위해 또는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 피검체에 제공될 수 있다.
V. 발명의 마커
본 발명은 표 2 내지 4 및 6 내지 29에 열거된 마커(이후 "생물마커", "마커" 또는 "본 발명의 마커")에 관한 것이다. 본 발명은 마커에 의해 암호화된 핵산 및 단백질 또는 이에 상응하는 핵산 및 단백질(이후부터 각각 "마커 핵산 및 "마커 단백질")을 제공한다. 이들 마커는 특히 대사적 장애의 존재에 대해 스크리닝하고 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지를 예측하고 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하고 대사적 장애를 치료하기 위한 치료제 또는 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는데 유용하다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 하나 이상의 생물마커가 본 발명의 방법과 연계하여 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 하나 이상의 생물마커는 기재된 생물마커 목록중에 하나 이상의 마커가 분석되고 다양한 양태에서 상기 목록에 제시된 하나 이상의 생물마커가 분석될 수 있고, 예를 들어, 상기 목록중에 2개, 3개, 4개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개 이상 또는 모든 생물마커가 분석될 수 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
"마커"는 정상 또는 건강한 조직 또는 세포에서의 발현 수준과 조직 또는 세포에서의 변화된 발현 수준이 대사적 장애와 같은 질환 상태와 관련된 유전자이다. "마커 핵산"은 본 발명의 마커에 의해 암호화되거나 이에 상응하는 핵산(예를 들어, mRNA, cDNA)이다. 상기 마커 핵산은 서열번호(nts)의 전체 또는 일부 서열 또는 상기 서열의 상보체를 포함하는 DNA(예를 들어, cDNA)를 포함한다. 상기 마커 핵산은 임의의 서열번호의 전체 또는 일부 서열 또는 상기 서열의 상보체를 포함하는 RNA를 포함하고, 여기서, 모든 티미딘 잔기는 우리딘 잔기로 대체된다. "마커 단백질"은 본 발명의 마커에 의해 암호화되거나 이에 상응하는 단백질이다. 마커 단백질은 임의의 서열번호(AA)의 전체 또는 일부 서열을 포함한다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용된다.
아폽토시스와 관련된 마커는 아폽토시스 경로에 관여하는 마커이다. 예를 들어, 아폽토시스와 관련된 마커는 표 6A, 6B, 7-9, 25 및 28에 열거된 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 아폽토시스와 관련된 마커는 Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, 그리고 cMyc를 포함한다.
"산화성 스트레스와 관련된 마커"는 산화성 스트레스 경로에 관여된 마커이다. 예를 들어, 산화성 스트레스와 관련된 마커는 표 10 내지 12에 열거된 마커들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 산화성 스트레스와 관련된 마커는 호중구 사이토졸 인자 2, 산화질소 신타제 2A 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(미토콘드리아)를 포함한다.
열 쇼크와 관련된 마커는 열 쇼크에 관여하는 마커이다. 예를 들어, 열 쇼크와 관련된 마커는 표 13에 열거된 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"혈관형성과 관련된 마커"는 혈관 형성에 관여하는 마커이다. 예를 들어, 혈관형성과 관련된 마커는 표 24 및 27에 열거된 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"당뇨병과 관련된 마커"는 당뇨병에 관여하는 마커이다. 예를 들어, 당뇨병과 관련된 마커는 표 14 내지 17, 23 및 26에 열거된 마커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"대사적 장애 관련된" 체액은 환자의 몸에서의 경우 대사적 세포를 통해 또는 대사적 세포로부터 분출된 세포 또는 단백질이 상기 세포 통과할 수 있는 대사적 세포를 통해 접촉하거나 통과하는 유체이다. 예시적인 대사적 장애 관련 체액은 혈액 유체(예를 들어, 전혈, 혈청, 혈소판 제거된 혈액)을 포함하고 하기에서 보다 상세하게 설명된다. 많은 대사적 장애 관련 체액은 특히 세포가 전이하는 경우 여기에 대사적 세포를 가질 수 있다. 대사적 세포를 함유할 수 있는 세포 함유 유체는 전혈, 혈소판이 제거된 혈액, 림프액 및 뇨를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
마커 발현의 "정상" 수준은 대사적 장애를 앓고 있지 않은 사람 피검체 또는 환자의 세포에서 마커의 발현 수준이다.
"마커의 과발현 또는 고수준의 발현"은 시험 샘플에서 발현을 평가하기 위해 사용되는 분석의 표준 오차를 초과하고 바람직하게는 대조군 샘플(예를 들어, 마커 관련 질환, 즉 대사적 장애를 갖지 않는 건강한 피검체 기원의 샘플이다)에서 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서 마커의 평균 발현 수준 보다 2배 이상 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7베, 8배, 9배 또는 10배 큰 시험 샘플에서의 발현 수준을 언급한다.
마커의 "저수준의 발현"은 대조군 샘플(예를 들어, 마커 관련 질환 즉 대사적 장애를 갖지 않는 피검체 기원의 샘플)에서 마커의 발현 수준 및 바람직하게는 여러 대조군 샘플에서 마커의 평균 발현 수준보다 2배 이상 및 보다 바람직하게는 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 낮은 발현 수준인 시험 샘플에서의 발현 수준을 언급한다.
"전사된 폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 전사체"는 본 발명의 마커의 전사 및 정상적인 전사 후 프로세싱(예를 들어, 스플라이싱), 경우에 따라 RNA 전사체, 그리고 RNA 전사체의 역전사에 의해 제조된 성숙한 mRNA의 모두 또는 일부와 상동성이거나 상보적인 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA, hnRNA, cDNA 또는 상기 RNA 또는 cDNA의 유사체)이다.
"상보적인"은 2개의 핵산 가닥의 영역들사이에 또는 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 사이의 서열 상보성에 대한 광범위한 개념을 언급한다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티밑 또는 우라실인 경우 제1 영역에 역평행한 제2 핵산 영역의 잔기와 특이적 수소 결합("염기쌍 형성")을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 잔기 구아닌인 경우 제1 가닥과 역평행하는 제2 핵산 가닥 단지와 염기쌍을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 핵산의 제1 영역은 2개의 영역이 역평행 방식으로 정렬되는 경우 제1 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있는 경우 동일하거나 상이한 핵산의 제2 영역에 상보적이다. 바람직하게, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하여 제1 및 제2 부분이 역평행 방식으로 정렬되는 경우 제1 부분의 뉴클레오타이드 잔기의 약 50% 이상 및 바람직하게는 약 75% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상이 제2 부분에서 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다. 보다 바람직하게, 제1 부분의 모든 뉴클레오타이드 잔기들은 제2 부분에서 뉴클레오타이드 잔기와 염기쌍을 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성"은 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역 또는 2개의 상이한 핵산 가닥의 영역 사이에 뉴클레오타이드 서열 유사성을 언급한다. 양쪽 영역에서 뉴클레오타이드 잔기 위치가 동일한 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점령되는 경우 상기 영역은 상기 위치에서 상동성이다. 제1 영역은 각 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드 잔기 위치가 동일한 잔기에 의해 점령되는 경우 제2 영역에 상동성이다. 2개 영역 사이의 상동성은 동일한 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점령되는 2개 영역의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 비율 측면에서 표현된다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 5'-ATTGCC-3'을 갖는 영역 및 뉴클레오타이드 서열 5'-TATGGC-3'을 갖는 영역은 50% 상동성을 공유한다. 바람직하게, 제1 영역은 제1 부분을 포함하고 제2 영역은 제2 부분을 포함하여 각각의 부분의 뉴클레오타이드 잔기 위치의 약 50% 이상 및 바람직하게는 약 75% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상은 동일한 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점령된다. 보다 바람직하게, 각각의 부분들의 모든 뉴클레오타이드 잔기 위치 위치는 동일한 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점령된다.
"본 발명의 단백질"은 마커 단백질 및 이들의 단편; 변이 마커 단백질 및 이들의 단편; 마커 또는 변이체 마커 단백질의 15개 이상의 아미노산 절편을 포함하는 펩타이드 및 폴리펩타이드; 및 마커 또는 변이 마커 단백질을 포함하는 융합 단백질, 또는 마커 또는 변이 마커 단백질의 15개 이상의 아미노산 절편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 마커 단백질 및 본 발명의 마커 단백질의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 유도체 및 항체 단편을 제공한다. 본원에서 달리 특정되지 않는 경우, 상기 용어 "항체" 및 "항체들"은 광범위하게 천연 형태의 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgE) 및 단일쇄 항체와 같은 재조합 항체, 키메라 항체 및 사람화된 항체 및 다중 특이적 항체, 및 이전의 모든 단편 및 유도체를 포함하고, 상기 단편 및 유도체는 하나 이상의 항원 결합 부위를 갖는다. 항체 유도체는 항체에 접합된 단백질 또는 화학적 잔기를 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 생물마커는 인슐린 수용체 경로의 조절인자이다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 인슐린 수용체에 결합한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 당뇨병 관련 유전자이다. 당뇨병 관련 유전자는 예를 들어, 표 23에 열거된 유전자를 포함한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 산화성 스트레스에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 카스파제 조절인자, 예를 들어, 카스파제 활성화인자 또는 카스파제 억제인자이다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 세포 성장에 관여한다. 다른 양태에서, 생물마커는 세포 주기 조절 및 DNA 합성에 관여한다. 여전히 또 다른 양태에서, 생물마커는 해당과정 및 대사, 예를 들어, 펜토스 포스페이트 경로 및 미토콘드리아 산화성 대사에 관여한다. 추가의 양태에서, 생물마커는 분자 수송에 관여한다. 몇몇 양태에서, 세포 시그날 전달에 관여한다. 다른 양태에서, 생물마커는 당뇨병 및 산화성 스트레스, 예를 들어, 당분해 경로 및 인슐린 프로세싱에 관여한다. 여전히 다른 양태에서, 생물마커는 14-3-3 매개된 시그날 전달에 관여한다. 추가의 양태에서, 생물마커는 세라미드 시그날 전달에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 미토콘드리아 단백질 수송에 관여한다. 다른 양태에서, 생물마커는 지방세포 분화에 관여한다. 여전히 다른 양태에서, 생물마커는 지질 및 콜레스테롤 대사에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 막 유동성에 관여한다. 다른 양태에서, 생물마커는 면역조절에 관여한다. 여전히 다른 양태에서, 생물마커는 게놈 안정성에 관여한다. 추가의 양태에서, 생물마커는 세포외 매트릭스 단백질 통합성에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 막 수송에 관여한다. 다른 양태에서, 생물마커는 산화성 조절에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 펜토스 포스페이트 경로에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 종 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 아라키돈산 대사에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 상기 지적된 경로중 2개 이상에 관여한다. 몇몇 양태에서, 생물마커는 상기 지적된 경로의 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 등에 관여한다. 몇몇 양태에서, 하나 이상의 생물마커는 본 발명과 연계하여 사용된다. 이들 양태에서, 생물마커는 각각 개별적으로 상기 지적된 경로의 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 등에 관여할 수 있다.
특정 양태에서, 특정 열거된 유전자가 잠재적인 환경적 영향인자(예를 들어, CoQ10)의 상이한 농도에 의한 치료후 상이한 시기에서 하나 이상의 치료 조건과 관련되는 경우 상기 특정 유전자에 대한 배수 변화는 가장 긴 기록된 치료 시간을 언급한다. 다른 양태에서, 특정 유전자에 대한 배수 변화는 가장 짧게 기록된 치료 시간을 언급한다. 다른 양태에서, 특정 유전자에 대한 배수 변화는 최고 농도의 env-영향인자(예를 들어, CoQ10)에 의한 치료를 언급한다. 다른 양태에서, 특정 유전자에 대한 배수 변화는 최저 농도의 env-환경인자(예를 들어, CoQ10)에 의한 치료를 언급한다. 여전히 다른 양태에서, 특정 유전자에 대한 배수 변화는 env-환경인자의 치료학적 효과와 일치하는 방식으로의 조절(예를 들어, 상향 또는 하향 조절)을 언급한다.
특정 양태에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69중 어느 하나에 열거된 임의의 유전자의 변화를 언급한다. 특정 양태에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표중 하나를 제외하고(예를 들어, 표 1을 제외하고, 표 5를 제외하고 등) 표 2 내지 4 및 6 내지 29중 어느 하나에 열거된 임의의 유전자의 변화를 언급한다. 특정 양태에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표 중 2임의의 2개를 제외하고(예를 들어, 표 1 및 5를 제외하고, 표 2 및 16을 제외하고 등) 표 2 내지 4 및 6 내지 29중 어느 하나에 열거된 임의의 유전자의 변화를 언급한다. 특정 양태에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표중 임의의 3개를 제외하거나 표중 임의의 4개를 제외하거나 표중 임의의 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상을 제외하고 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69중 어느 하나에 열거된 임의의 유전자의 변화를 언급한다. 특정 양태에서, 양성 또는 음성 배수 변화는 표 1, 5, 9, 12 및 59를 제외하고, 표 2 내지 4 및 6 내지 29 중 어느 하나에 열거된 임의의 유전자의 변화를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이 "양성 배수 변화"는 관련 표에 열거된 유전자의 "상향 조절 또는 증가(발현의)를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이, 음성 배수 변화는 관련 표에 열거된 유전자의 하향 조절 또는 감소(발현의)를 언급한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기의 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다.
1. 분리된 핵산 분자
본 발명의 하나의 측면은 마커 단백질 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 분리된 핵산은 또한 마커 핵산 분자 및 마커 핵산 분자의 단편, 예를 들어, 마커 핵산 분자의 증폭 및 돌연변이를 위한 PCR 프라이머로서 사용하기에 적합한 것들을 동정하기 위한 하이브리드화 프로브로서 사용하기에 충분한 핵산 분자를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자(예를 들어, mRNA), 그리고 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 합성된 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만 바람직하게는 이중 가닥의 DNA이다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산 분자의 천연 공급에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 분자이다. 하나의 양태에서, "분리된" 핵산 분자는 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 핵산을 천연적으로 플랭킹하는 서열(바람직하게는 단백질 암호화 서열)(즉 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없다. 예를 들어, 다양한 양태에서, 분리된 핵산 분자는 핵산이 유래된 세포의 게놈 DNA에서 핵산 분자를 천연적으로 플랭킹하는 약 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0.5 kB 또는 0.1 kB 미만의 뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 또 다른 양태에서, "분리된" 핵산 분자, 예를 들어, cDNA 분자에는 재조합 기술에 의해 제조되는 경우 실질적으로 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 부재일 수 있거나 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 도는 다른 화학물질이 부재일 수 있다. 실질적으로 세포성 물질이 부재인 핵산 분자는 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만의 이종성 핵산(또한 본원에서 "오염 핵산"으로서 언급됨)을 갖는 제제를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술 및 본원에 기재된 데이타베이스 기록에서 서열 정보를 사용하여 분리될 수 있다. 상기 핵산 서열 모두 또는 일부를 사용하여, 본 발명의 핵산 분자는 표준 하이브리드화 및 클로닝 기술을 사용하여 분리될 수 있다(예를 들어, 문헌(참조: Sambrook et al., ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989))에 기재됨).
본 발명의 핵산 분자는 표준 PCR 증폭 기술에 따라 주형으로서 및 적당한 프라이머로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 상기 증폭된 핵산은 적당한 벡터에 클로닝될 수 있고 DNA 서열 분석을 특징으로 한다. 추가로, 본 발명의 핵산 분자의 전부 또는 일부에 상응하는 뉴클레오타이드는 예를 들어, 자동화 DNA 합성기를 사용하여 표준 합성 기술에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 마커 핵산의 뉴클레오타이드 서열 또는 마커 단백질을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다. 소정의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 핵산 분자는 소정의 뉴클레오타이드 서열에 충분히 상보적이어서 소정의 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하여 적합한 이중가닥을 형성할 수 있는 분자이다.
더욱이, 본 발명의 핵산 분자는 핵산 서열의 단지 일부를 포함할 수 있고, 이때, 전장 핵산 서열은 마커 단백질을 암호화하는 마커 핵산을 포함한다. 상기 핵산은 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로브/프라이머는 전형적으로 하나 이상의 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오타이드로서 사용된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 엄중 조건하에서 본 발명의 핵산의 약 7개 이상, 바람직하게, 약 15개, 보다 바람직하게는 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400개 이상의 연속 뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 뉴클레오타이드 서열 영역을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자 서열을 기초로 하는 프로브를 사용하여 본 발명의 하나 이상의 마커에 상응하는 전사체 또는 게놈 서열을 검출할 수 있다. 상기 프로브는 여기에 부착된 표지 그룹, 예를 들어, 방사능동위원소, 형광성 화합물, 효소, 효소 조인자를 포함한다. 상기 프로브는 예를 들어, 피검체 기원의 세포의 샘플에서 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 수준을 측정함에 의해 예를 들어, mRNA 수준을 검출하거나 단백질을 암호화하는 유전자가 돌연변이되었거나 결실되었는지의 여부를 검출함에 의해 단백질을 잘못 발현하는 세포 또는 조직을 동정하기 위한 진단 시험 키트의 일부로서 사용될 수 잇다.
본 발명은 추가로 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 마커 단백질(예를 들어, 서열번호 (AAs)의 서열을 갖는 단백질)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과는 상이하지만 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
아미노산 서열에 변화를 유도하는 DNA 서열 다형태가 집단(예를 들어, 사람 집단)내에 존재할 수 있음은 당업자에게 인지될 것이다. 상기 유전학적 다형태는 천연 대립유전자 변이로 인해 잡단내 개체중에 존재할 수 있다. 대립유전자는 소정의 유전자 좌에서 다르게 존재하는 유전자 그룹중 하나이다. 추가로, RNA 발현 수준에 영향을 미치는 DNA 다형태가 또한 상기 유전자의 전체 발현 수준에 영향을 미칠 수 있도록(예를 들어, 조절 또는 분해에 영향을 미침에 의해) 존재할 수 있음이 인지될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "대립유전자 변이체"는 소저의 유전자 좌에 존재하는 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 본 발명의 마커에 상응하는 폴리펩타이드를 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 언급한다. 상기 천연 대립유전자 변이는 전형적으로 소정의 유전자의 뉴클레오타이드 서열중 1 내지 5%의 변이를 유도할 수 있다. 또 다른 대립유전자는 다수의 상이한 개체에서 목적하는 유전자의 서열을 분석함에 의해 동정할 수 있다. 이것은 다양한 개체에서 동일한 유전자 좌를 동정하기 위한 하이브리드화 프로브를 사용함에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 임의의 및 모든 상기 뉴클레오타이드 변화 및 수득한 아미노산 다형태 도는 변화는 천연 대립형질 변화의 결과이고 기능정 활성을 변화시키지 않으며 본 발명의 범위내에 있는 것으로 의도된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 길이가 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3500, 4000, 4500개 이상인 뉴클레오타이드이고 엄중 조건하에서 마커 핵산 또는 마커 단백질을 암호화하는 핵산에 하이브리드화한다. 본원에 사용된 바와 같이, "엄중 조건하에서 하이브리드화하는"은 서로 60% 이상 (65%, 70%, 바람직하게는 75%) 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열이 전형적으로 서로 하이브리드화된 채로 존재하는 하이브리드화 및 세척 조건을 기재하는 것으로 의도된다. 상기 엄중 조건은 당업자에게 공지되어 있고 문헌[참조: sections 6.3.1-6.3.6 of Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)]에 기재되어 있다. 엄중 하이브리드화 조건의 바람직한 비제한적인 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/나트류 시트레이트(SSC)중에서의 하이브리드화에 이어서 50 내지 65℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS에서의 하이브리드화이다.
집단내 존재할 수 있는 본 발명의 핵산 분자의 천연의 대립형질 변이체에 추가로, 당업자는 추가로 서열 변화가 암호화된 단백질의 생물학적 활성을 변화시키는 거 없이 암호화된 단백질의 아미노산 서열내 변화를 유도하는 돌연변이에 의해 도입될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, "비-필수 아미노산 잔기에서 아미노산 대체를 유도하는 뉴클레오타이드 치환을 수행할 수 있다. "비-필수" 아미노산은 생물학적 활성을 변화시키는 것 없이 야생형 서열로부터 변화될 수 있는 잔기이고, "필수" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 위해 요구된다. 예를 들어, 다양한 종의 동족체중에서 보존되지 않거나 단지 반-보존적인 아미노산 잔기는 활성을 위해 비-필수일 수 있고 따라서 변화를 위한 가능한 표적이다. 대안적으로, 다양한 종(예를 들어, 쥐 및 사람)의 동족체중에서 보존된 아미노산 잔기는 활성을 위해 필수 일 수 있고 변화를 위해 가능 표적이 아닐 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 활성을 위해 필수적이지 않은 아미노산 잔기내 변화를 함유하는 변이체 마커 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 변이체 마커 단백질은 천연 마커 단백질과 아미노산 서열에서는 차이가 있지만 여전히 생물학적 활성을 보유한다. 하나의 양태에서, 상기 변이체 마커 단백질은 마커 단백질의 아미노산 서열과 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
변이체 마커 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결실을 마커 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 도입함에 의해 하나 이상의 아미노산 잔기 치환, 부가 또는 결실이 암호화된 단백질에 도입된다. 돌연변이는 표준 기술, 예를 들어, 부위 지시된 돌연변이 유발 및 PCR 매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 바람직하게, 연속 아미노산 치환은 하나 이상의 예측된 비-필수 아미노산 잔기에서 수행된다. "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 계열은 당업계에서 보고되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 대안적으로 돌연변이는 예를 들어, 포화 돌연변이유발에 의한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있고 수득한 돌연변이는 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위한 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이유발 후, 암호화된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있고 단백질의 활성이 측정될 수 있다.
본 발명은 안티센스 핵산 분자, 즉 본 발명의 센스 핵산에 상보적인 분자, 예를 들어, 이중가닥 마커 cDNA 분자중 암호화 가닥에 상보적인 분자 또는 마커 mRNA 서열에 상보적인 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 안티센스 핵산은 본 발명의 센스 핵산에 수소결합(즉 어닐링)할 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 암호화 가닥에 상보적일 수 있거나 이의 일부, 예를 들어, 단백질 암호화 영역(예를 들어, 개방 판독 프레임)의 전부 또는 일부에 상보적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 마커 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 암호화 가닥의 비암호화 영역의 전부 또는 일부에 대한 안티센스일 수 있다. 비암호화 영역(5' 및 3' 비해독 영역")은 암호화 영역을 플랭킹하고 아미노산으로 해독되지 않는 5' 및 3' 서열이다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 이상인 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 과정을 사용하는 효소적 연결 반응 및 화학적 합성을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 천연 뉴클레오타이드 또는 분자의 생물학적 활성을 증가시키거나 안티센스 및 센스 핵산 사이에 형형성된 이중가닥의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오타이드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있고, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오타이드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 제조하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드의 예는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오드우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실, (acp3)w, 그리고 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 대안적으로, 안티센스 핵산은 핵산이 안티센스 배향(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 하기의 서브섹션에서 추가로 기재된, 목적하는 표적 핵산에 대해 안티센스 배향을 가질 것이다)으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조될 수 있다
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 전형적으로 피검체에 투여되거나 이들이 마커 단백질을 암호화하는 세포성 mRNA 및 또는 게놈 DNA와 하이브리드화하거나 이에 결합하여 마커의 발현이 억제, 예를 들어, 전사 및/또는 해독이 억제도록 하는 방식으로 동일계에서 합성된다. 상기 하이브리드화는 안정한 이중가닥을 형성하기 위한 통상적인 뉴클레오타이드에 의해 또는 예를 들어, DNA 이중가닥에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에, 이중 나선의 메이져 그루브에서 특이적 상호작용을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예는 조직 부위에 직접적인 주사 또는 안티센스 핵산의 대사적 장애 관련 체액으로의 주입을 포함한다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 선택된 세포를 표적화하고 전신 투여되도록 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 전신 투여를 위해, 안티센스 분자는 이들이 특이적으로 선택된 세포 표면상에 발현된 수용체 또는 항원에 특이적으로 결합하도록, 예를 들어, 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 펩타이드 또는 항체에 연결시킴에 의해 변형시킬 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 또한 본원에 기재된 벡터를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 안티센스 분자의 충분한 세포내 농도를 성취하기 위해, 안티센스 핵산 분자가 강한 pol II 또는 pol III 프로부터하에 놓여진 벡터 작제물이 바람직하다.
본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자이다. α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 함께 특정 이중-가닥 하이브리드를 형성하며, 보통의 α-단위와 반대로, 상기 스트랜드는 서로 평행하게 진행한다 (Gaultier et al. (1987) Nucleic acids. Res. 15:6625-6641). 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 (Inoue et al. (1987) Nucleic acids Res. 15:6131- 6148) 또는 키메라 RNA-DNA 아날로그(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 리보자임을 포함한다. 리보자임은 mRNA와 같은 단일 가닥 핵산을 절단할 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매성 RNA 분자이고 여에 이들은 상보적 영역을 갖는다. 따라서, 리보자임(예를 들어, 문헌[참조: Haselhoff and Gerlach, 1988, Nature 334:585-591]에 기재된 바와 같은 해머헤드 리보자임)을 사용하여 촉매적으로 mRNA 전사체를 절단함에 의해 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 해독을 억제할 수 있다. 마커 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 대해 특이성을 갖는 리보자임은 마커에 상응하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 디자인할 수 있다. 예를 들어, 활성 부위의 뉴클레오타이드 서열이 절단된 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 문헌[Tetrahymena L-19 IVS RNA]유도체가 작제될 수 있다(문헌참조: Cech et al. U.S. Patent No. 4,987,071; 그리고 Cech et al . U.S. Patent No. 5,116,742). 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA를 사용하여 RNA 분자의 풀로부터 특이적 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매 RNA를 선택할 수 있다(문헌참조: Bartel and Szostak, 1993, Science 261:1411-1418).
본 발명은 또한, 삼중 나선 구조를 형성하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 마커의 발현은 마커 핵산 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 조절 영역(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 표적화시켜 표적 세포에서 유전자의 전사를 방해하는 삼중 나선 구조를 형성함에 의해 억제될 수 있다[문헌참조: generally Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene (1992) Ann . N.Y. Acad . Sci . 660:27-36; 그리고 Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15]
다양한 양태에서, 본 발명의 핵산은 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 골격에서 변형시켜 예를 들어, 분자의 안정성, 하이브리드화 또는 가용성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산의 데옥시리보스 포스페이트 골격을 변형시켜 펩타이드 핵산을 생성시킬 수 있다(문헌참조: Hyrup et al., 1996, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩타이드 핵산" 또는 "PNA"는 핵산 모사체, 예를 들어, DNA 모사체를 언급하고, 여기서, 데옥시리보스 포스페이트 골격은 슈도펩타이드 골격에 의해 대체되고 단지 4개의 중성 뉴클레오염기가 보유된다. PNA의 중성 골격은 낮은 이온 강도의 조건하에 DNA 및 RNA에 대한 특이적 하이브리드화를 가능하게 하는 것으로 나타났다. PNA 올리고머의 합성은 문헌[참조: Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675]에 기재된 바와 같이 표준 고형상 펩타이드 합성 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다.
PNA는 치료학적 및 진단학적 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, PNA를 예를 들어, 전사 또는 해독 정지를 유도하거나 복제를 억제함에 의해 유전자 발현의 서열 특이적 조절을 위한 안티센스 또는 항유전자 제제로서 사용될 수 있다. PNA는 또한 예를 들어, 다른 효소, 예를 들어, S1 뉴클레아제(Hyrup (1996)와 조합하여 사용되는 경우 인공 제한 효소로서 또는 DNA 서열 및 하이브리드화(Hyrup, 1996, supra; Perry-O'Keefe et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675)를 위한 프로브 또는 프라이머로서 예를 들어, PNA 지시된 PCR 클램핑에 의해 유전자에서 단일 염기쌍 돌연변이의 합성에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, PNA는 예를 들어, 지질성 또는 다른 헬퍼 그룹을 PNA로 부착시킴에 의해, PNA-DNA 키메라의 형성에 의해 또는 리포좀 또는 당업계에 공지된 약물 전달 다른 기술을 사용함에 의해 이들의 안정성 또는 세포 흡수를 증진시키기 위해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, PNA 및 DNA의 유리한 성질을 조합시킬 수 있는 PNA-DNA 키메라를 생성시킬 수 있다. 상기 키메라는 DNA 제한 효소, 예를 들어, RNase H 및 DNA 폴리머라제가 DNA 부분에 상호작용하도록 할 수 있고 PNA 부분은 높은 결합 친화성 및 특이성을 제공한다. PNA-DNA 키메라는 염기 스택킹, 뉴클레오염기간의 결합 수 및 배향 측면에서 선택된 적당한 길이의 링커를 사용하여 연결할 수 있다(문헌참조: Hyrup, 1996, supra). PNA-DNA 키메라의 합성은 문헌[참조: Hyrup (1996), supra , 그리고 Finn et al . (1996) Nucleic Acids Res . 24(17):3357-63]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, DNA 쇄는 표준 포스포르아미디트 커플링 화학 및 변형된 뉴클레오사이드 유사체를 사용하는 고형 지지체상에서 합성할 수 있다. 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포르아미디트와 같은 화합물은 PNA와 DNA 5' 말단간의 연결체로서 사용될 수 있다(문헌참조: Mag et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:5973-88). 이어서 PNA 단량체는 단계적 방식으로 5' PNA 분절 및 3' DNA 분절과 함께 키메라 분자를 생성시키기 위해 커플링될 수 있다 (문헌참조: Finn et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 대안적으로, 키메라 분자는 5' DNA 분절 및 3' PNA 분절과 함께 합성될 수 있다(Peterser et al., 1975, Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).
다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드와 같은 다른 첨부된 그룹(예를 들어, 생체내 숙주 세포 수용체를 표적화하기 위해), 또는 세포막(문헌참조: Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT Publication No. WO 88/09810) 또는 혈뇌 장벽(참조문헌: PCT Publication No. WO 89/10134)을 통과하는 수송을 촉진시키는 제제를 포함한다. 추가로, 올리고뉴클레오타이드는 하이드리드화 유발 절단 제제(문헌참조: Krol et al., 1988, Bio/Techniques 6:958-976) 또는 인터컬레이팅 제제(see, e.g., Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549)를 사용하여 변형시킬 수 있다. 이를 위해, 상기 올리고뉴클레오타이드는 또 다른 분자, 예를 들어, 펩타이드, 하이드리드화 유발된 가교결합제, 수송 제제, 하이브리드화 유발 절단 제제 등에 접합될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산과 상보적인 하나 이상의 영역을 갖는 분자 비콘 핵산을 포함하고 분자 비콘은 샘플에서 발명의 핵산의 존재를 정량하기 위해 유용하다. "분자 비콘" 핵산은 한 쌍의 상보적 영역을 포함하고 형광단 및 이와 연합된 형광 켄처를 갖는 핵산이다. 상기 형광단 및 켄처는 상보적 영역이 서로 어닐링하는 경우 형광단의 형광이 켄처에 의해 켄칭되도록 하는 배향으로 핵산의 상이한 부분과 연합된다. 핵산의 상보적 영역이 서로 어닐링하지 않는 경우 형광단의 형광은 보다 드문 정도로 켄칭된다. 분자 비콘 핵산은 예를 들어, 미국 특허 제5,876,930호에 기재되어 있다.
2. 분리된 단백질 및 항체
본 발명의 한가지 측면은 마커 단백질 또는 이의 단편에 대하여 지시된 항체를 생성하는 면역원으로서 사용하기 위한 폴리펩타이드 단편 뿐만 아니라 분리된 마커 단백질 및 이의 생물학적 활성 부분에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 천연 마커 단백질은 표준 단백질 정제 기술을 사용한 적당한 정제 계획에 의해 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 또 다른 양태에서, 마커 단백질의 전체 또는 이의 분절을 포함하는 단백질 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 재조합 발현에 대안적으로 상기 단백질 또는 펩타이드는 표준 펩타이드 합성 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
"분리된" 또는 "정제된" 단배질 또는 이의 생물학적 활성 부분은 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원 기원의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 부재이거나 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 부재이다. 상기 용어 "세포성 물질이 실질적으로 부재인"은 단백질이 분리되거나 재조합적으로 제조된 세포의 세포 성분으로부터 단백질이 분리된 단백질 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 부재인 단백질은 이종성 단백질(또한 본원에서 "오염 단백질"로서 언급됨)이 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (무수 중량을 기준으로) 미만인 단백질 제제를 포함한다. 단백질 또는 이의 생물학적 활성 부분이 재조합적으로 제조되는 경우, 이것은 또한 바람직하게 배양 배지가 실질적으로 부재이고 즉, 배양 배지는 단백질 제제 용적의 약 20%, 10%, 또는 5% 미만을 나타낸다. 단백질이 화학적 합성에 의해 제조되는 경우, 이것은 바람직하게 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 부재이고 즉, 이것은 단백질 합성에 관여한 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있다. 따라서, 상기 단백질 제제는 목적하는 폴리펩타이드 이외의 화학적 전구체 또는 화합물이 약 30%, 20%, 10%, 5% (무수 중량을 기준으로)미만 이다.
마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 전장 단백질 보다 소수의 아미노산을 포함하고 상응하는 전장 단백질의 하나 이상의 활성을 나타내는 마커 단백질의 아미노산 서열과 충분히 동일하거나 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 상응하는 전장 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명의 마커 단백질의 생물학적 활성 부분은 예를 들어 길이가 10, 25, 50, 100개 이상의 아미노산인 폴리펩타이드일 수 있다. 더욱이, 마커 단백질의 다른 영역이 결실된 다른 생물학적 활성 부분은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고 천연 형태의 마커 단백질의 기능적 활성중 하나 이상에 대해 평가될 수 있다.
바람직한 마커 단백질은 임의의 서열번호(nts)의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 다른 유용한 단백질은 이들 서열중 하나와 실질적으로 동일하고(예를 들어, 40% 이상, 바람직하게 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 천연 대립유전자 변이 또는 돌연변이 유발로 인해 아미노산 서열에서는 여전히 상이하지만 상응하는 천연 마커 단백질의 기능적 활성을 보유한다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 % 동일성을 측정하기 위해, 상기 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 서열 또는 핵산 서열내에 갭이 도입될 수 있다). 이어서 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 의해 점령되는 경우 분자는 그 위치에서 동일하다. 바람직하게, 2개의 서열간의 % 동일성은 글로벌 정렬을 사용하여 계산한다. 대안적으로, 2개 서열간의 % 정렬은 국소 정렬을 사용하여 계산한다. 2개의 서열간의 % 동일성은 서열에 의해 나누어진 동일한 위치 수의 함수이다(즉, % 동일성 = # 동일한 위치 수/# 총 위치 수(예를 들어, 중첩 위치) x 100). 하나의 양태에서, 2개의 서열은 동일한 길이이다. 또 다른 양태에서, 2개의 서열은 동일한 길이가 아니다
2개의 서열간의 % 동일성의 결정은 수학적 알고리듬을 사용하여 성취할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 바람직한 비제한적인 예는 카를린 및 알츠슐의 알고리듬이다[문헌참조: Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]. 상기 알고리듬은 문헌[참조: Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410의 BLASTN 및 BLASTX에 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 조사는 BLASTN 프로그램, 스코어 =100, 워드길이 = 12를 사용하여 수행하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득하였다. BLAST 단백질 조사는 BLASTP 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3을 사용하여 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위해 갭 형성된 정렬을 수득하기 위해, 갭 형성 BLAST로 불리우는 보다 새로운 버젼의 BLAST 알고리듬이 문헌[참조: Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용하여 프로그램 BLASTN, BLASTP 및 BLASTX에 대한 갭 형성된 국소 정렬을 수행할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자간의 원거리 관계를 검출하는 반복적인 조사를 수행할 수 있다. BLAST, 갭 형성된 BLAST, 그리고 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, BLASTX 및 BLASTN)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov). 서열 비교용으로 사용되는 수학적 알고리듬의 비제한적인 예는 문헌[참조: Myers and Miller, (1988) CABIOS 4:11-17]의 알고리듬이다. 상기 알고리듬은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)으로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위한 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 패널티를 사용할 수 있다. 국소 서열 유사성의 영역에 대해 또 다른 유용한 알고리듬 및 정렬은 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448]에 기재된 바와 같은 FASTA 알고리듬이다. 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위해 FASTA 알고리듬을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표는 예를 들어, 2의 k-투플 값과 함께 사용될 수 있다.
2개의 서열간의 % 동일성은 상기된 것들과 유사한 기술을 사용하여 갭을 허용하거나 허용하는 것 없이 측정할 수 있다. % 동일성을 계산하는데 있어서, 단지 정확한 매치가 계수된다.
본 발명은 또한 마커 단백질 또는 이의 분절을 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 이종성 폴리펩타이드(즉, 마커 단백질 이외의 폴리펩타이드)에 작동적으로 연결된 마커 단백질의 전부 또는 일부(바람직하게 생물학적 활성 부분). 융합 단백질내에서, 상기 용어 "작동적으로 연결된"은 마커 단백질 또는 이의 분절 및 이종성 폴리펩타이드가 서로 프레임내 융합된 것을 지적하는 것으로 의도된다. 이종성 폴리펩타이드는 마커 단백질 또는 분절의 아미노 말단 또는 카복실 말단에 융합될 수 있다.
하나의 유용한 융합 단백질은 마커 단백질 또는 분절이 GST 서열의 카복실 말단에 융합된 GST 융합 단백질이다. 상기 융합 단백질은 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 정제를 촉진시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 융합 단백질은 이의 아미노 말단에 이종성 시그날 서열을 함유한다. 예를 들어, 마커 단백질의 천연 시그날 서열은 제거될 수 있고 또 다른 단백질 기원의 시그날 서열로 대체될 수 있다. 예를 들어, 바쿨로바이러스 외피 단백질의 gp67 분비 서열은 이종성 시그날 서열로서 사용될 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1992). 진핵 이종성 시그날 서열의 다른 예는 멜리틴 및 사람 태반 알칼린 포스파타제의 분비 서열을 포함한다(Stratagene; La Jolla, California). 또 다른 예에서, 유용한 원핵 이종성 시그날 서열은 phoA 분비 시그날 (Sambrook et al., supra) 및 단백질 A 분비 시그날(Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 융합 단백질은 마커 단백질의 전부 또는 일부가 면역글로불린 단백질 계열의 구성원으로부터 유래된 서열에 융합된 면역글로불린 융합 단백질이다. 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질은 약제학적 조성물에 도입될 수 있고 피검체에 투여되어 세포의 표면상의 리간드(가용성 또는 막 결합된)와 단백질(수용체)간의 상호작용을 억제하여 생체내 시그날 전달을 억제할 수 있다. 면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 마커 단백질의 동족 리간드의 생물유용성에 영향을 미칠 수 있다. 리간드/수용체 상호작용의 억제는 증식성 및 분화성 장애 및 세포 생존 조절(예를 들어, 촉진 또는 억제) 둘 모두에 대해 치료학적으로 유용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 면역글로불린 융합 단백질을 면역원으로서 사용하여 피검체내 마커 단백질에 대해 지시된 항체를 제조하고 리간드를 정제하고 스크리닝 분석에서 마커 단백질과 리간드의 상호작용을 억제하는 분자를 동정할 수 있다.
본 발명의 키메라 및 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다. 또 다른 양태에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링될 수 있고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 합성할 수 있는 2개의 연속 유전자 단편간의 상보적 오버행을 유발하는 앵커 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., supra). 더욱이, 이미 융합 잔기(예를 들어, GST 폴리펩타이드)를 암호화하는 발현 벡터가 시판되고 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 상기 발현 벡터에 클로닝시켜 융합 잔기가 본 발명의 폴리펩타이드에 프레임내 연결되도록 할 수 있다.
시그날 서열은 마커 단백질의 분비 및 분리를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 시그날 서열은 전형적으로 하나 이상의 절단 연쇄 반응에서 분비 동안에 성숙한 단백질로부터 일반적으로 절단되는 소수성 아미노산 코어를 특징으로 한다. 상기 시그날 펩타이드는 이들이 분비 경로를 통해 통과함으로써 성숙한 단백질 기원의 시그날 서열의 절단을 허용하는 프로세싱 부위를 함유한다. 따라서, 본 발명은 시그날 서열이 단백질분해적으로 절단된 상기 단백질(즉, 절단 생성물) 뿐만 아니라 시그날 서열을 갖는 마커 단백질, 융합 단백질 또는 이의 분절에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 시그날 서열을 암호화하는 핵산 서열은 발현 벡터에서 목적하는 단백질, 예를 들어, 마커 단백질 또는 이의 분절에 작동적으로 연결될 수 있다. 상기 시그날 서열은 예를 들어, 발현 벡터로 형질전환된 진핵 숙주 세포로부터 단백질의 분비를 지시하고 상기 시그날 서열은 후속적으로 또는 동시에 절단된다. 이어서 상기 단백질은 당업계 인지된 방법에 의해 세포외 매질로부터 정제될 수 있다. 대안적으로, 상기 시그날 서열은 예를 들어, GST 도메인과 함께 정제를 촉진시키는 서열을 사용하여, 목적하는 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 마커 단백질의 변이체에 관한 것이다. 상기 변이체는 효능제(모사체) 또는 길항제로서 기능할 수 있는 변화된 아미노산 서열을 갖는다. 상기 변이체는 돌연변이 유발, 예를 들어, 명백한 점 돌연변이 또는 절단에 의해 생성될 수 있다. 효능제는 실질적으로 천연 형태의 단백질과 동일하거나 서브세트의 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 단백질의 길항제는 예를 들어, 목적하는 단백질을 포함하는 세포 시그날 연속 반응의 다운스트림 또는 업스트림 구성원에 경쟁적으로 결합함에 의해 천연 형태의 단백질의 활성중 하나 이상을 억제할 수 있다. 따라서, 특이적 생물학적 효과는 제한된 기능의 변이체를 사용한 치료에 의해 유발될 수 있다. 천연 형태의 단백질의 생물학적 활성의 서브세트를 갖는 변이체를 사용한 피검체의 치료는 천연 형태의 단백질을 사용한 치료와 대비하여 피검체에서 보다 적은 부작용을 가질 수 있다.
효능제(모사체) 또는 길항제로서 기능하는 마커 단백질의 변이체는 효능제 또는 길항제 활성에 대한 본 발명의 단백질의 돌연변이체, 예를 들어, 절단 돌연변이체의 라이브러리 조합을 스크리닝함에 의해 동정할 수 있다. 하나의 양태에서, 다양한 변이체 라이브러리는 핵산 수준에서 조합적 돌연변이 유발에 의해 제조되고 다양한 유전자 라이브러리에 의해 암호화된다. 다양한 라이브러리의 변이체는 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 유전자 서열에 효소적으로 연결시켜 축퇴성 세트의 잠재적인 단백질 서열이 개별 폴리펩타이드 또는 대안적으로 한 세트의 대형 융합 단백질(예를 들어, 파아지 디스플레이를 위해)로서 발현가능하도록 제조될 수 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 마커 단백질의 잠재적인 변이체의 라이브러리를 제조하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 축퇴성 올리고뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌참조: Narang, 1983, Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984, Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984, Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477).
추가로, 마커 단백질 절편의 라이브러리를 사용하여 변이체 마커 단백질 또는 이의 분절의 스크리닝 및 후속적 선별을 위한 다양한 집단의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 암호화 서열 단편의 라이브러리는 목적하는 암호화 서열의 이중가닥의 PCR 단편을, 닉킹(nicking)이 분자당 단지 하나 존재하는 조건하에서 뉴클레아제로 처리하고, 이중 가닥의 DNA를 변성시키고 DNA를 상이한 닉 형성된 생성물로부터 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥의 DNA를 형성하도록 DNA를 재형성시키고 S1 뉴클레아제를 사용한 처리에 의해 재형성된 이중가닥으로부터 단일가닥 부분을 제거하고 수득한 단편 라이브러리를 발현 벡터에 연결시킴에 의해 제조될 수 있다. 상기 방법으로 목적하는 단백질의 다양한 크기의 아미노 말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 유래될 수 있다.
점 돌연변이 또는 절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고 선택된 성질을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 여러 기술이 당업계에 공지되어 있다. 대형 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 고처리량 분석에 순응할 수 있는 가장 광범위하게 사용되는 기술은 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터에 클로닝하고 적당한 세포를 수득한 라이브러리의 벡터로 형질전환시키고 목적하는 활성의 검출이 생성물이 검출된 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 촉진시킨다는 조건하에서 조합 유전자를 발현시킴을 포함한다. 라이브러리에서 기능성 돌연변이체의 빈도수를 증진시키는 기술인 재귀 앙상블 돌연변이 유발은 스크리닝 분석과 조합적으로 사용하여 본 발명의 단백질의 변이체를 동정할 수 있다(문헌참조: Arkin and Yourvan, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3):327- 331).
발명의 또 다른 측면은 본 발명의 단백질에 대해 지시된 항체에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 상기 항체는 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 본원에 상호교환적으로 사용되는 용어 "항체" 및 "항체들"은 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분을 포함하는 단편 및 유도체 뿐만 아니라 면역글로불린 분자를 언급한다(즉, 상기 부분은 마커 단백질과 같은 항원, 예를 들어, 마커 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유한다). 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 단백질에 결합하지만, 샘플중에, 예를 들어, 천연적으로 단백질을 함유하는 생물학적 샘플중에 다른 분자에는 실질적으로 결합하지 않는 항체이다. 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분의 예는 단일쇄 항체(scAb), F(ab) 및 F(ab')2 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 분리된 단백질 또는 이의 단편은 항체를 제조하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 전장 단백질이 사용될 수 있거나 대안적으로 본 발명은 면역원으로서 사용하기 위한 항원성 펩타이드 단편을 제공한다. 본 발명의 단백질의 항원성 펩타이드는 본 발명의 단백질 중 하나의 아미노산 서열의 8개 이상(바람직하게 10, 15, 20, 또는 30개 이상)의 아미노산 잔기를 포함하고 펩타이드에 대해 생성된 항체가 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성하도록 하나 이상의 단백질의 에피토프를 포함한다. 항원성 펩타이드에 의해 포함된 바람직한 에피토프는 단백질 표면상에 위치한 영역, 예를 들어, 친수성 영역이다. 소수성 서열 분석, 친수성 서열 분석 또는 유사한 분석을 사용하여 친수성 영역을 동정할 수 있다. 바람직한 양태에서, 분리된 마커 단백질 또는 이의 단편은 면역원으로서 사용된다.
면역원은 전형적으로 토끼, 염소, 마우스 또는 기타 포유동물 또는 척추동물과 같은 적합한(즉, 면역적격한) 피검체를 면역화시킴에 의해 항체를 제조하기 위해 사용된다. 적당한 면역원성 제제는 예를 들어, 재조합적으로 발현되거나 화학적으로 합성된 단백질 또는 펩타이드를 함유할 수 있다. 상기 제제는 프룬트 완전 또는 불완전 제제 또는 유사한 면역자극 제제와 같은 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 면역원 조성물은 어떠한 다른 사람 단백질을 함유하지 않는 조성물이고, 예를 들어, 면역원 조성물은 본 발명의 단백질의 재조합 발현을 위한 비-사람 숙주 세포를 사용하여 제조된다. 상기 방식으로 수득한 항체 조성물은 본 발명의 단백질 이외의 다른 사람 단백질과는 감소된 결합을 갖거나 어떠한 결합도 갖지 않는다.
본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 상기 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 단지 1종의 항원 결합 부위를 함유하는 항체 분자 집단을 언급한다. 바람직한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 조성물은 본 발명의 단백질에 지시된 항체에 대해 선택된 것이다. 특히 바람직한 폴리클로날 및 모노클로날 항체 제제는 마커 단백질 또는 이의 단편에 지시된 항체만을 함유하는 것이다.
폴리클로날 항체는 적합한 피검체를 면역원으로서 본 발명의 단백질로 면역화시킴에 의해 제조될 수 있다. 면역화된 피검체에서 항체 역가는 예를 들어, 면역화된 폴리펩타이드를 사용하는 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 사용한 표준 기술에 의해 기간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 면역화 후 적당한 시점에서, 예를 들어, 특이적 항체 역가가 최고인 경우 항체 생산 세포는 피검체로부터 수득되고 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]에 의해 본래 기재된 하이브리도마 기술, 사람 B 세포 하이브리도마 기술(문헌참조: Kozbor et al., 1983, Immunol. Today 4:72), EBV-하이브리도마 기술(문헌참조: Cole et al., pp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 1985) 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 의해 모노클로날 항체(mAb)를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다[문헌참조: Current Protocols in Immunology, Coligan et al. ed., John Wiley & Sons, New York, 1994]. 본 발명의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포는 예를 들어, 표준 ELISA 분석을 사용하여 목적하는 폴리펩타이드에 결합하는 항체에 대한 하이브리도마 배양 상등액을 스크리닝함에 의해 검출한다.
모노클로날 항체 분비 하이브리도마를 제조하기 위한 대안으로, 본 발명의 단백질에 대해 시지된 모노클로날 항체는 목적하는 폴리펩타이드를 사용하여 재조합의 조합적 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파아지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝함에 의해 동정되고 분리될 수 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위한 키트는 시판되고 있다[문헌참조: the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 그리고 the Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612]. 추가로, 항체 디스플레이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는데 사용하기에 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들어, 문헌[참조: 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공개번호 WO 92/18619; PCT 공개번호 WO 91/17271; PCT 공개번호 WO 92/20791; PCT 공개번호 WO 92/15679; PCT 공개번호 WO 93/01288; PCT 공개번호 WO 92/01047; PCT 공개번호 WO 92/09690; PCT 공개번호 WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734]에서 찾을 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 재조합 항체는 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합한다. 재조합 항체는 사람 및 비사람 부분의 단일쇄 항체 및 다중 특이적 항체 둘 모두를 포함하는, 키메라 및 사람화된 모노클로날 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종, 예를 들어, 쥐 mAb 및 사람 면역글로불린 불변 영역으로부터 기원하는 가변 영역을 갖는 것들과 같은 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자이다(문헌참조: Cabilly et al., 미국 특허 제4,816,567호; 및 Boss et al., 미국 특허 제4,816,397호; 이들의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다). 단일쇄 항체는 항원 결합 부위를 갖고 단일 폴리펩타이드로 이루어진다. 이들은 당업계에 공지된 기술에 의해, 예를 들어, 문헌[참조: Ladner et. al 미국 특허 제4,946,778호 (이는 전반적인 내용이 본원에 인용된다); Bird et al., (1988) Science 242:423-426; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:1-9; Whitlow et al., (1991) Methods in Enzymology 2:97-105; 그리고 Huston et al., (1991) Methods in Enzymology Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 다중 특이적 항체는 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 항체 분자이다. 상기 분자는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어, 문헌[참조: Segal, 미국 특허 제4,676,980호(이의 기재내용은 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다); Holliger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Whitlow et al., (1994) Protein Eng. 7:1017-1026 및 미국 특허 제6,121,424호]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
사람화된 항체는 비-사람 종 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자 기원의 골격 영역을 갖는 비-사람 종 기원의 항체 분자이다(문헌참조: Queen, U.S. Patent No. 5,585,089, 이의 내용은 전반적으로 본원에 인용된다). 사람화된 모노클로날 항체는 예를 들어, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어, 문헌[참조: PCT 공개 번호 WO 87/02671; 유럽 특허 출원 번호 제184,187호; 유럽 특허원 제171,496호; 유럽 특허원 제173,494호; PCT 공개번호 WO 86/01533; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허원 제125,023호; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521- 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 그리고 Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; 미국 특허 제5,225,539호; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; 그리고 Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
보다 특히, 사람화된 항체는 예를 들어, 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 사람 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 유전자전이 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 유전자전이 마우스는 선택된 항원, 예를 들어, 본 발명의 마커에 상응하는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 사용한 정상적인 양상으로 면역화시킨다. 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체는 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 유전자전이 마우스에 의해 함유된 사람 면역글로불린 전이유전자는 B 세포 분화동안에 재배열하고 후속적으로 부류 스위칭 및 체세포 돌연변이를 진행한다. 따라서, 상기 기술을 사용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA 및 IgE 항체를 제조할 수 있다. 사람 항체를 제조하기 위한 상기 기술의 검토를 위해, 문헌[Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93)]을 참조한다. 사람 항체 및 사람 모노클로날 항체에 대한 기술 및 상기 항체를 제조하기 위한 프로토콜의 상세한 논의를 위해 문헌[미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,661,016호; 및 미국 특허 제5,545,806호]을 참조한다. 추가로, 제조원[Abgenix, Inc. (Freemont, CA)]은 상기된 것과 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대해 지시된 사람 항체를 제공하도록 고용될 수 있다.
선택된 에피토프를 인지하는 사람 항체는 완전하게 "가이드 선별"로 언급되는 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 방법에서, 선택된 비-사람 모노클로날 항체, 예를 들어, 쥐 항체는 동일한 에피토프를 인지하는 완전한 사람 항체의 선별을 지도하기 위해 사용된다(문헌참조: Jespers et al., 1994, Bio/technology 12:899-903).
본 발명의 항체는 제조 후(예를 들어, 피검체의 혈액 또는 혈청으로부터) 또는 합성 후 분리할 수 있고 널리 공지된 기술에 의해 추가로 정제할 수 있다. 예를 들어, IgG 항체는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 본 발명의 단백질에 특이적인 항체는 친화성 크로마토그래피에 의해 선별되거나(예를 들어, 부분적으로 정제된) 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합적으로 발현되고 정제된(또는 부분적으로 정제된) 단백질은 본원에 기재된 바와 같이 제조되고 공유적으로 또는 비공유적으로 예를 들어 크로마토그래피 칼럼에 커플링될 수 있다. 이어서 상기 칼럼은 다수의 상이한 에피토프에 대해 지시된 항체를 함유하는 샘플로부터 본 발명의 단백질에 특이적인 항체를 친화성 정제하여 실질적으로 정제된 항체 조성물, 즉 실질적으로 오염 항체가 부재인 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 실질적으로 정제된 항체 조성물이란 본원에서 항체 샘플이 본 발명의 목적하는 단백질과는 다른 에피토프에 대해 지시된 오염 항체를 단지 최고 30%(무수 중량)로 함유하고 바람직하게 최고 20%, 보다 바림직하게 10% 미만 및 가장 바람직하게 최고 5%(무수 중량)가 오염 항체이다. 정제된 항체 조성물은 항체의 99% 이상이 본 발명의 수득된 단백질에 대해 지시됨을 의미한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체는 본 발명의 단백질의 분비된 서열, 세포외 도메인, 막관통 또는 세포질 도메인 또는 세포질 막에 특이적으로 결합할 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열의 분비된 서열 또는 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직한 양태에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체는 마커 단백질의 아미노산 서열의 분비된 서열 또는 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 단배질에 대해 지시된 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기술에 의해 단백질을 분리할 수 있다. 더욱이, 상기 항체를 사용하여 마커 단백질 또는 이의 단편(예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 상등액중에서)을 검출함으로써 마커의 발현 수준 및 발현 패턴을 평가할 수 있다. 상기 항체는 또한 진단학적으로 사용하여 임상적 시험 과정의 일부로서 조직 또는 체액내 (예를 들어, 대사적 장애 관련 체액중에서) 단백질 수준을 모니터링하여 예를 들어, 소정의 치료 계획의 효능을 측정할 수 있다. 검출은, 검출가능한 물질에 커플링된 본 발명의 항체를 포함하는 항체 유도체의 사용에 의해 촉진될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보족 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보족 그룹 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐라민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고; 적합한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H을 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 대사적 장애를 치료하는데 있어서 치료학적 제제로서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 사람 항체는 완전하게 대사적 장애를 앓는 사람 환자, 특히 당뇨병 또는 비만을 갖는 환자들의 치료를 위해 사용된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 치료를 위해 사용된다. 추가로, 상기 치료학적 항체는 세포 독소, 치료제 또는 방사능 물질 이온과 같은 치료학적 잔기에 접합된 항체를 포함하는 항체 유도체 또는 면역독소일 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 해로운 임의의 제제를 포함한다. 이의 예는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 그리고 푸로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 치료제는 항대사물(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 그리고 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 다크티노마이신(이전에는 액티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 그리고 안트라마이신 (AMC)), 그리고 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
본 발명의 접합된 항체는 약물 잔기는 통상적인 화학적 치료제에 제한되는 것으로 해서되지 말아야 하기 대문에 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 약물 잔기는 목적하는 생물학적 활성을 소유하는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들어, 리보솜 억제 단백질(문헌참조: Better et al., 미국 특허 제6,146,631호, 이의 기재내용은 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다), 아브린, 리신 A 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화인자와 같은 단백질; 또는 예를 들어, 림포킨, 인터류킨-1("IL-1"), 인터류킨-2("IL-2"), 인터류킨-6("IL-6"), 과립구 마크로파아지 콜로니 자극 인자("GM-CSF") 또는 기타 성장 인자와 같은 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF")를 포함할 수 있다.
상기 치료학적 잔기를 항체에 접합시키기 위한 기술은 널리 공지되어 있다[문헌참조: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)].
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 실질적으로 정제된 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고 이 모두는 본 발명의 단백질 및 바람직하게 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 다양한 측면에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 사람, 비-사람, 키메라 및/또는 사람화된 항체일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 비-사람 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 이 모두는 본 발명의 단백질 및 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 상기 비-사람 항체는 염소, 마우스, 양, 말, 닭, 토끼 또는 래트 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 비-사람 항체는 키메라 및/또는 사람화된 항체일 수 있다. 추가로, 본 발명의 비-사람 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 모노클로날 항체, 항체 단편 및 유도체를 제공하고, 이 모두는 본 발명의 단백질 및 바람직하게는 마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 모노클로날 항체는 사람, 사람화된, 키메라 및/또는 비-사람 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 검출가능한 물질에 접합된 본 발명의 항체 및 사용 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
3. 예측 가능한 의약
본 발명은, 진단학적 분석, 예후적 분석, 약역학 및 모니터링 임상 시험이 개체를 예방학적으로 치료하기 위한 예후(예측) 목적을 위해 사용되는 예측 가능한 의약 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 하나의 측면은 대사적 장애를 나타낼 위험에 개체가 처해있는지의 여부를 결정하기 위해 하나 이상의 마커 단백질 또는 핵산의 발현 수준을 측정하기 위한 진단학적 분석에 관한 것이다. 상기 분석은 예후적 또는 예측적 목적으로 장애 발병 전에 개체를 예방학적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 임상적 시험에서 본 발명의 마커의 발현 또는 활성에 대한 제제의 영향을 모니터링하는 것에 관한 것이고, 예를 들어, 약물 또는 기타 화합물은 대사적 장애를 억제하거나 임의의 다른 장애를 치료하거나 예방하기 위해 투여된다(즉, 상기 치료가 가질 수 있는 임의의 발암 효과를 이해하기 위해). 이들 및 다른 제제는 하기의 섹션에서 추가로 상세하게 기재한다.
A. 진단학적 분석
생물학적 샘플에서 마커 단백질 또는 핵산의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 예시적 방법은 시험 피검체로부터 생물학적 샘플(예를 들어, 대사적 장애 관련 체액)을 수득하고, 상기 생물학적 샘플을 폴리펩타이드 또는 핵산을 검출할 수 있는 화합물 또는 제제(예를 들어, mRNA, 게놈 DNA 또는 cDNA)와 접촉시킴을 포함한다. 따라서 본 발명의 검출 방법을 사용하여 예를 들어, 시험관내 및 생체내 생물학적 샘플에서 mRNA, 단백질, cDNA, 또는 게놈 DNA를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA를 검출하기 위한 시험관내 기술은 노던 하이브리드화 및 동일계 하이브리드화를 포함한다. 마커 단백질의 검출을 위한 시험관내 기술은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기술은 서던 하이브리드화를 포함한다. mRNA의 검출을 위한 생체내 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 노던 하이브리드화 및 동일계 하이브리드화를 포함한다. 추가로, 마커 단백질의 검출을 위한 생체내 기술은 피검체에 단백질 또는 이의 단편에 대해 지시된 표지된 항체를 도입함을 포함한다. 예를 들어, 상기 항체는 피검체내 존재 및 위치가 표준 이미지화 기술에 의해 검출될 수 있는 방사능 활성 마커로 표지될 수 있다.
상기 진단학적 및 예측적 분석의 일반적인 원리는 적절한 조건하에서 및 마커와 프로브가 상호작용하여 결합하도록 하여 반응 혼합물중에서 제거될 수 있고/있거나 검출될 수 있는 복합체를 형성하도록 하기에 충분한 시간동안 마커 및 프로브를 함유할 수 있는 샘플 또는 반응 혼합물을 제조함을 포함한다. 이들 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 분석을 수행하기 위한 한가지 방법은 마커 또는 프로브를 기질로서도 언급되는 고형상 지지체상에 부착시키고 반응 말기에 고형상에 부착된 표적 마커/프로브 복합체를 검출함을 포함한다. 상기 방법중 하나의 양태에서, 마커의 존재 및/또는 농도에 대해 분석되어야만 하는 피검체 기원의 샘플은 캐리어 또는 고형상 지지체상으로 부착시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 역 상황이 가능하고 이때 상기 프로브는 고형상에 부착시킬 수 있고 피검체 기원의 샘플은 분석의 부착되지 않은 성분으로서 반응하도록 허용될 수 있다.
분석 성분을 고형상으로 부착시키기 위한 많은 확립된 방법이 있다. 이들은 제한 없이 비오틴 및 스트렙타비딘의 접합을 통해 고정화된 마커 또는 프로브 분자를 포함한다. 상기 비오티닐화된 분석 성분은 당업계에 공지된 기술(예를 들어, 비오티닐화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, IL)을 사용하는 방법을 사용하여 비오틴-NHS(N-하이드록시-숙시니미드)로부터 제조될 수 있고 스트렙타비딘 피복된 96웰 플레이트 (Pierce Chemical)의 웰에 고정화된다. 특정 양태에서, 고정화된 분석 성분을 갖는 표면은 미리 제조하고 저장될 수 있다.
상기 분석을 위한 다른 적합한 캐리어 또는 고형상 지지체는 마커 또는 프로브가 속하는 분자 부류에 결합할 수 있는 임의의 물질을 포함한다. 널리 공지된 지지체 또는 캐리어는 유리, 폴리스티렌, 나일론, 폴리프로필렌, 덱스트란, 아밀라제, 중성 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 가브로스 및 마그네티트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 언급된 방법을 사용한 분석을 수행하기 위해, 비-고정화된 성분은 고형상에 첨가하고 이 즉시 제2 성분이 부착된다. 반응이 완료된 후, 복합체를 형성하지 않은 성분은 형성된 임의의 복합체가 고형상에 고정화된 상태로 유지되도록 하는 조건하에서 제거될 수 있다(예를 들어, 세척에 의해). 고형상에 부착된 마커/프로브 복합체의 검출은 본원에 명시된 다수의 방법으로 수행할 수 있다.
바람직한 양태에서, 프로가 부착되지 않은 분석 성분인 경우 프로브는 직간접적으로 검출 목적 및 분석 판독을 위해 본원에서 논의되고 당업자에게 널리 공지된 검출가능한 표지로 표지시킬 수 있다.
또한, 성분(마커 또는 프로브)의 추가의 조작 또는 표지 없이 예를 들어, 형광 에너지 전달 기술을 사용함에 의해 마커/프로브 형성을 직접적으로 검출할 수 있다(문헌참조: Lakowicz et al., U.S. Patent No. 5,631,169; Stavrianopoulos, et al., U.S. Patent No. 4,868,103). 제1 공여체 분자상의 형광단 표지는 적당한 파장의 입사광으로 여기시 이의 방출된 형광 에너지가 제2 수용체 분자상의 형광 표지에 의해 흡수되어 제2 수용체 분자가 흡수된 에너지로 인해 형광성을 나타낼 수 있도록 선택된다. 대안적으로, 공여체 단백질 분자는 단순히 트립토판 잔기의 천연 형광성 에너지를 사용할 수 있다. '수용체' 분자 표지가 '공여체'의 표지와는 구분될 수 있도록 상이한 파장의 빛을 방출하는 표지가 선택된다. 표지간의 에너지 전달의 효능은 분자를 분리하는 거리와 관련되기 대문에 분자간의 공간 관계를 평가할 수 있다. 분자간에 결합되는 상황에서 상기 분석에서 '수용체' 분자 표지의 형광 방출은 최대이어야만 한다. FET 결합 반응은 당업계에 널리 공지된 표준 형광 검출 수단(예를 들어, 형광측정기를 사용하여)을 통해 간편하게 측정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 마커를 인지하는 프로브의 능력에 대한 측정은 실시간 생분자 상호작용 분석(BIA)과 같은 기술을 사용함에 의해 분석 성분(프로브 또는 마커)를 표지시키는 것 없이 성취할 수 있다(문헌참조: Sjolander, S. and Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). 본원에 사용된 바와 같은 "BIA: 또는 "표면 플라스몬 공명"은 상호작용물의 어떠한 것도 표지시키는 것 없이 생물특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다(예를 들어, BIAcore). 결합 표면에서 질량 변화(결합 반응을 지적함)는 표면 근처의 빛의 굴절지수를 변화시키고(표면 플라스몬 공명(SPR)의 광학적 현상) 이는 검출가능한 신호를 유도하여 이는 생물학적 분자간의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있다.
대안적으로, 또 다른 양태에서, 유사한 진단학적 및 예측적 분석은 액체상중에 용질로서 마커 및 프로브를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분석에서, 복합체화된 마커 및 프로브는 차등 원심분리, 크로마토그래피, 전기영동 및 면역침전을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 표준 기술 중 어느 하나에 의해 복합체를 형성하지 않은 성분으로부터 분리된다. 차등 원심분리에서 마커/프로브 복합체는 일련의 원심분리 단계를 통해 이들의 상이한 크기 및 밀도를 기준으로 하는 복합체의 상이한 침강 평평으로 인해 복합체를 형성하지 않은 분석 성분으로부터 분리될 수 있다(문헌참조: Rivas, G., and Minton, A.P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8):284-7). 표준 크로마토그래피 기술은 또한 복합체화되지 않은 것으로부터 복합체화된 분자를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 크기별로 분자를 분리하고 칼럼 포맷에서 적당한 겔 여과 수지의 사용을 통해, 비교적 큰 복합체가 비교적 작은 복합체를 형성하지 않은 성분으로부터 분리될 수 있다. 유사하게, 복합체를 형성하지 않은 성분과 비교하여 마커/프로브 복합체의 비교적 상이한 하전 성질을 이용하여 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 수지의 사용을 통해 복합체화되지 않은 성분과 복합체화된 성분을 구분할 수 있다. 상기 수지 및 크로마토그래피 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다(문헌참조: Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8; Hage, D.S., and Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10;699(1-2):499-525). 겔 전기영동을 또한 사용하여 비결합된 성분으로부터 복합체화된 분석 성분을 분리할 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999). 상기 기술에서, 단백질 또는 핵산 복합체는 예를 들어, 크기 또는 하전을 기준으로 분리된다. 전기영동 과정 동안에 결합 상호작용을 유지하기 위해, 비-변성 겔 매트릭스 물질 및 환원제가 부재인 조건이 전형적으로 바람직하다. 특정 분석 및 이의 성분에 대해 적당한 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
특정 양태에서, 마커 mRNA의 수준은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 원위치 및 시험관내 포맷 둘 모두에 의해 측정할 수 있다. 상기 용어 "생물학적 샘플"은 피검체내 존재하는 조직, 세포 및 유체 뿐만 아니라 피검체로부터 분리된 조직, 세포, 생물학적 유체 및 이의 분리물을 포함하는 것으로 의도된다. 많은 발현 검출 방법은 분리된 RNA를 사용한다. 시험관내 방법을 위해, mRNA의 분리에 대해 선별하지 않는 임의의 RNA 분리 기술이 대사적 장애 세포로부터 RNA의 정제를 위해 사용될 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999). 추가로, 다수의 조직 샘플은 당업자에게 널리 공지된 기술, 예를 들어, 문헌[Chomczynski (1989, 미국 특허 제4,843,155호)]의 단일 단계 RNA 분리 공정을 사용하여 가공될 수 있다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 정렬을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위해 하나의 바람직한 진단학적 방법은 검출되는 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 분리된 mRNA를 접촉시킴을 포함한다. 상기 핵산 프로브는 예를 들어, 전장 cDNA 또는 이의 일부, 예를 들어, 엄중 조건하에서 본 발명의 마커를 암호화하는 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 하이브드리드화기에 충분한, 길이가 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 이상인 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 진단학적 분석에 사용하기 위한 다른 적합한 프로브는 본원에 기재되어 있다. mRNA와 프로브의 하이브리드화는 의문의 마커가 발현됨을 지적한다.
하나의 포맷에서, mRNA은 고체 표면상에 고정화되고 예를 들어, 아가로스 겔상에서 분리된 mRNA를 전개하고 mRNA를 겔로부터 막, 예를 들어, 니트로스셀룰로스로 전달시킴에 의해 프로브와 접촉된다. 또 다른 포맷에서, 상기 프로브는 고체 표면에 고정화되고 mRNA는 프로브와 예를 들어, 어피메트릭스 유전자 칩 어레이에서 접촉된다. 당업자는 본 발명의 마커에 의해 암호화된 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위한 공지된 mRNA 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플에서 mRNA 마커 수준을 측정하기 위한 또 다른 방법은 핵산 증폭 과정, 예를 들어, RT-PCR에 의한 증폭 과정(문헌(참조: Mullis, 1987, U.S. Patent No. 4,683,202)에 제시된 실험적 양태), 리가제 연쇄 반응 (문헌참조: Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), 자가 지지된 서열 복제(문헌참조: Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(문헌참조: Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제(문헌참조: Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(문헌참조: Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 계획은 특히 상기 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출을 위해 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 영역(각각 플러스 및 마이너스 가닥 또는 이와 반대로)에 어닐링할 수 있고 이 사이에 짧은 영역을 함유할 수 있는 한쌍의 핵산 분자로서 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 길이가 10 내지 30개인 뉴클레오타이드이고 길이가 50개 내지 200개 뉴클레오타이드인 영역을 플랭킹한다. 적당한 조건하에서 및 적당한 시약을 사용하여 상기 프라이머는 프라이머에 의해 플랭킹된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 증폭을 허용한다.
원위치 방법을 위해, mRNA는 검출 전에 세포로부터 분리될 필요가 없다. 상기 방법에서, 세포 또는 조직 샘플은 공지된 조직학적 방법을 사용하여 제조되고/가공된다. 상기 샘플은 이어서 지지체, 전형적을 유리 슬라이드상에 고정화시키고 이어서 마커를 암호화하는 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 프로브와 접촉시킨다.
마커의 절대 발현 수준을 기준으로 하는 측정을 수행하기 위한 대안으로서, 측정은 마커의 정상화된 발현 수준을 기준으로 할 수 있다. 발현 수준은 발현을 마커가 아닌, 예를 들어, 항상성으로 발현되는 하우스키핑 유전자의 발현과 비교함에 의해 마커의 절대 발현 수준을 보정함에 의해 표준화시킨다. 표준화를 위해 적합한 유전자는 액틴 유전자 또는 상피 세포 특이적 유전자와 같은 하우스키핑 유전자를 포함한다. 상기 표준화는 하나의 샘플, 예를 들어, 환자의 샘플에서의 발현 수준과 또 다른 샘플, 예를 들어, 비-대사적 장애 샘플의 대조 또는 상이한 공급원의 샘플간의 대조를 가능하게 한다.
대안적으로, 상기 발현 수준은 상대적 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대적 발현 수준을 측정하기 위해, 미지의 샘플에 대한 발현 수준의 측정 전에 마커의 발현 수준은 10개 이상의 정상 대 대사적 장애 분리물의 샘플. 바람직하게는 50개 이상의 샘플에 대해 측정된다. 다수의 샘플중에서 분석된 유전자 각각의 평균 발현 수준이 측정되고 이것은 마커에 대한 기본 발현 수준으로서 사용된다. 시험 샘플에 대해 측정된 마커의 발현 수준(절대 수준의 발현)을 이어서 상기 마커에 대해 수득된 평균 발현 값으로 나눈다. 이것은 상대적 발현 수준을 제공한다.
바람직하게, 기본 측정에 사용되는 샘플은 대사적 장애와 관련된 조직 기원일 것이다. 세포 공급원의 선택은 상대적 발현 수준의 사용에 의존한다. 평균 발현 스코어로서 정상 조직에서 발견되는 발현의 사용은 분석된 마커가 정상 세포에 비해 대사적 장애에 특이적인지에 대한 확인을 도와준다. 추가로, 보다 많은 데이타가 축적됨에 따라서, 평균 발현 값은 보정될 수 있고 이는 축적된 데이타를 기준으로 개선된 상대적 발현 값을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 마커 단백질이 검출된다. 본 발명의 마커 단백질을 검출하기 위한 바람직한 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게 검출가능한 수준을 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날 또는 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 온전한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체(예를 들어, Fab 또는 F(ab')2가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체와 관련된 용어 "표지된"은 직접적으로 표지된 또 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적 표지 뿐만 아니라 검출가능한 물질을 프로브 또는 항체에 커플링시킴(즉 물리적으로 연결하고)에 의한 프로브 또는 항체의 직접적인 표지화를 포함하는 것으로 의도된다. 간접적인 표지화의 예는 형광 표지된 2차 항체 및 이것이 형광적으로 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴을 사용한 DNA 프로브의 말단 표지화를 사용하는 1차 항체의 검출을 포함한다.
세포로부터의 단백질은 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 사용되는 단백질 분리 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)]에 기재된 것들과 같은 것일 수 있다.
다양한 포맷을 사용하여 샘플이 소정의 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지를 측정할 수 있다. 상기 포맷의 예는 효소 면역분석 (EIA), 방사능면역분석(RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 세포가 본 발명의 마커를 발현하는지를 측정하는데 사용하기 위한 공지된 단백질/항체 검출 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
하나의 포맷에서, 항체 또는 항체 단편 또는 유도체는 발현된 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 또는 면역형광 기술과 같은 방법에 사용될 수 있다. 상기 용도에서, 일반적으로 고형 지지체상에 항체 또는 단백질을 고정화시키는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 고형상 지지체 또는 캐리어는 항원 또는 항체와 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 널리 공지된 지지체 또는 캐리어는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 중성 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 가브로스 및 마그네티트를 포함한다.
당업자는 항체 또는 항원을 결합시키기 위한 많은 다른 적합한 캐리어를 알고 본 발명에 사용하기 위한 지지체를 채택할 수 있다. 예를 들어, 대사적 장애 세포로부터 분리된 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 전개할 수 있고 니트로셀룰로스와 같은 고형상 지지체상으로 고정화시킬 수 있다. 상기 지지체는 이어서 적합한 완충제로 세척함에 이어서 검출가능하게 표지된 항체로 처리할 수 있다. 고형상 지지체는 이어서 비결합된 항체를 제거하기 위해 2회 완충액으로 세척할 수 있다. 고형 지지체상에 결합된 표지의 양은 이어서 통상적인 수단에 의해 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플중에서 마커 단백질 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 상기 키트를 사용하여 지지체가 당뇨병 또는 비만과 같은 대사적 장애를 앓고 있거나 이를 나타낼 증가된 위험에 처해 있는지를 측정할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 마커 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 제제 및 샘플중에 단백질 또는 mRNA의 양을 측정하기 위한 수단을 포함할 수 있다(예를 들어, 단백질 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오타이드 프로브). 키트는 또한 키트를 사용하여 수득된 결과를 해석하기 위한 지침서를 포함한다.
항체 기본 키트에 대해, 상기 키트는 예를 들어: (1) 마커 단백질에 결합하는 제1 항체(예를 들어, 고형 지지체에 부착된) 및 임의로 (2) 단백질 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 접합된 제2의 다른 항체를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 기본 키트를 위해, 상기 키트는 예를 들어, (1) 마커 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오타이드 또는 (2) 마커 핵산 분자를 증폭시키기위해 유용한 한쌍의 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 예를 들어, 완충제, 방부제 또는 단백질 안정화제를 포함할 수 있다. 상기 키트는 추가로 검출가능한 표지(예를 들어, 효소 또는 기질)를 검출하기 위해 필요한 성분을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 분석될 수 있고 시험 샘플과 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 일련의 대조군 샘플을 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 개별 용기내에 포함될 수 있고 다양한 용기 모두는 키트를 사용하여 수행된 분석 결과를 해석하기 위한 지침서와 함께 단일 팩키지내에 있을 수 있다.
B. 약제게놈
본 발명의 마커는 또한 약제게놈 마커로서 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제게놈 마커"는 이의 발현 수준이 환자에서 특정 임상적 약물 반응 또는 민감성과 관련되는 객관적인 생화학적 마커이다(문헌참조: McLeod et al. (1999) Eur. J. Cancer 35(12): 1650-1652). 약제게놈 마커 발현의 존재 또는 양은 환자의 예측된 반응과 관련되고 보다 특히 특정 약물 또는 약물 부류와 함께 치료에 대한 환자의 대사적 장애와 관련된다. 환자에서 하나 이상의 약제게놈 마커의 발현의 존재 또는 양을 분석함에 의해, 환자에게 가장 적당하거나 보다 큰 정도의 성공율을 가질 것으로 예측되는 약물 치료가 선택될 수 있다. 예를 들어, 환자에서 특정 마커에 의해 암호화된 RNA 또는 단백질의 존재 또는 양을 기준으로, 환자에서 존재할 가능성이 있는 특이적 대사적 장애의 치료를 위해 최적화된 약물 또는 치료 과정이 선택될 수 있다. 따라서 약제게놈 마커의 사용은 상이한 약물 또는 계획을 시도할 필요 없이 각각의 대사적 장애에 대해 가장 적당한 치료를 선택하거나 디자인할 수 있도록 한다.
약제게놈의 또 다른 측면은 신체가 약물에 대해 작용하는 방식을 변화시키는 유전학적 조건을 고려한다. 이들 약제유전학적 조건은 드문 결함 또는 다형태로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 (G6PD) 결핍은 주요 임상적 합병증이 산화제 약물(항-말라리아, 설폰아미드, 진통제, 니트로푸란스)의 주입 후 용혈 및 파바빈의 소모인 공통된 유전된 효소병이다.
예시적인 양태로서, 약물 대사 효소의 활성은 약물 작용의 강도 및 지속기간 둘 모두의 주요 결정인자이다. 약물 대사 효소(예를 들어, N-아세틸트랜스퍼라제 2(NAT 2) 및 시토크롬 P450 효소 CYP2D6 및 CYP2C19)의 유전학적 다형태의 발견은 몇몇 환자가 표준 및 안정한 용량의 약물이 투여된 후 예상된 약물 효과를 얻지 못하거나 악화된 약물 반응 및 심각한 독성을 나타내는지에 대한 이유를 설명한다. 이들 다형태는 집단에서 2개의 표현형, 광범위한 대사 진행(EM) 및 불량한 대사 진행(PM)으로 나타난다. PM 만연은 집단마다 상이하다. 예를 들어, CYP2D6을 암호화하는 유전자는 다형태일 가능성이 높고 몇몇 돌연변이가 PM에서 동정되었고 이 모두는 기능성 CYP2D6의 부재를 유도한다. CYP2D6 및 CYP2C19의 불량한 대사 진행은 이들이 표준 용량으로 투여되는 경우 매우 흔히 악화된 약물 반응 및 부작용을 나타낸다. 대사물이 활성 치료학적 잔기인 경우, PM은 어떠한 치료학적 반응을 보여주지 않고 이는 이의 CYP2D6 형성된 대사물 모르핀에 의해 매개된 코데인의 진통 효과에 대해 입증된 바와 같다. 다른 극한 상황은 표준 용량에 응답하지 않는 초급속 대사 진행자이다. 최근에 초과속 대사의 분자적 기반이 CYP2D6 유전자 증폭으로 인해 동정되었다.
따라서, 개체에서 본 발명의 마커의 발현 수준은 개체의 치료학적 또는 예방학적 치료를 위해 적당한 제제를 선택하기 위해 측정될 수 있다. 추가로, 약제유전학적 연구를 사용하여 개체의 약물 반응성 표현형의 확인을 위해 약물 대사 효소를 암호화하는 다형태 대립형질의 유전자분류를 적용할 수 있다. 용량 또는 약물 선택에 적용되는 경우 상기 지식은 부작용 또는 치료학적 실패를 회피할 수 있고 따라서 본 발명의 마커의 발현의 조절인자로 피검체를 치료하는 경우 치료학적 또는 예방학적 효능을 증진시킬 수 있다.
C. 임상적 시험의 모니터링
본 발명의 마커의 발현 수준에 대한 제제(예를 들어, 약물 화합물)의 영향에 대한 모니터링은 기본 약물 스크리닝에서 뿐만 아니라 임상적 시험에서 적용될 수 있다. 예를 들어, 마커 발현에 영향을 주는 제제의 효과는 대사적 장애에 대해 치료 받은 피검체의 임상적 시험에서 모니터링될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 제제(예를 들어, 효능제, 길항제, 펩타이드모사체, 단백질, 펩타이드, 핵산, 소분자, 또는 기타 약물 후보물을 사용한 피검체의 치료 효과를 모니터링하는 방법을 제공하고, (i) 제제의 투여 전에 피검체로부터 투여전 샘플을 수득하는 단계; (ii) 투여전 샘플에서 본 발명의 하나 이상의 선택된 마커의 발현 수준을 검출하는 단계; (iii) 피검체로부터 하나 이상의 투여 후 샘플을 수득하는 단계; (iv) 투여 후 샘플에서 마커의 발현 수준을 검출하는 단계; (v) 투여전 샘플에서 마커의 발현 수준을 투여 후 샘플 또는 샘플들중에서의 마커의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (vi) 이에 따라 피검체에 제제의 투여를 변경하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 치료 과정 동안에 증가된 마커 유전자의 발현은 비효과적인 용량 및 용량을 증가시킬 필요가 있는 요구량을 지적할 수 있다. 역으로, 감소된 수준의 마커 유전자는 효능적인 치료를 지적할 수 있고 용량을 변화시킬 필요가 없다는 것을 지적할 수 있다.
D. 어레이
본 발명은 또한 본 발명의 마커를 포함하는 어레이를 포함한다. 상기 어레이를 사용하여 어레이내 하나 이상의 유전자의 발현을 분석할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 어레이를 사용하여 조직에서 유전자 발현을 분석함으로써 어레이내 유전자의 조직 특이성을 확인할 수 있다. 상기 방식으로 약 7600개 까지의 유전자가 발현을 위해 동시에 분석될 수 있다. 이것은 하나 이상의 조직에서 특이적으로 발현되는 일련의 유전자들을 보여주는 프로필이 개발될 수 있게 한다.
상기 정량적 측정 뿐만 아니라, 본 발명은 유전자 발현의 정량을 가능하게 한다. 따라서, 조직 특이성 뿐만 아니라 조직내 일련의 유전자의 발현 수준이 확인될 수 있다. 따라서, 유전자는 이들의 조직 발현 자체 및 상기 조직에서 발현 수준을 기초로 분류될 수 있다. 이것은 예를 들어, 조직간에 또는 조직중에 유전자 발현의 관계를 확인하는데 유용하다. 따라서, 하나의 조직은 교란될 수 있고 제2 조직에서 유전자 발현에 대한 효과를 측정할 수 있다. 본원에서, 생물학적 자극에 응답하는 또 다른 세포 유형에 대한 하나의 세포 유형의 효과를 측정할 수 있다. 상기 측정은 예를 들어, 유전자 발현 수준에서 세포-세포 상호작용 효과를 알기 위해 유용하다. 제제가 하나의 세포 유형을 치료하기 위해 치료학적으로 투여되지만 또 다른 세포 유형에 대해서는 부작용을 나타내지 않는 경우, 본 발명은 바람직하지 못한 효과의 분자적 기반을 결정하기 위한 분석을 제공하고 역작용제를 동시투여하거나 목적하지 않은 효과를 치료할 기회를 제공한다. 유사하게, 심지어 단일 세포 유형내에서도 목적하지 않은 생물학적 효과는 분자 수준에서 측정할 수 있다. 따라서, 표적 유전자 이외의 다른 유전자의 발현에 대한 제제의 효과는 확인될 수 있고 대응될 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 어레이를 사용하여 어레이내 하나 이상의 유전자의 발현 시간 과정을 모니터링할 수 있다. 이것은 본원에 기재된 바와 같이 다양한 생물학적 분야와 관련하여 예를 들어, 대사적 장애의 발병, 대사적 장애의 진행 및 대사적 장애와 관련된 세포 형질전환과 같은 과정에서 존재할 수 있다.
상기 어레이는 또한 동일한 세포 또는 상이한 세포에서 다른 유전자의 발현에 대한 유전자의 발현의 효과를 확인하는데 유용하다. 이것은 예를 들어, 궁극적 또는 다운스트림 표적이 조절될 수 없는 경우 치료학적 중재를 위한 또 다른 분자 표적의 선별을 위해 제공된다.
상기 어레이는 또한 정상 및 비정상 세포에서 하나 이상의 유전자의 차등적 발현 패턴을 확인하기 위해 유용하다. 이것은 진단 또는 치료학적 중재를 위한 분자 표적으로서 작용할 수 있는 일련의 유전자를 제공한다.
VI. 샘플을 수득하기 위한 방법
본 발명의 방법에 유용한 샘플은 본 발명의 마커를 발현하는 임의의 조직, 세포, 생검 또는 체액을 포함한다. 하나의 양태에서, 샘플은 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 협측 부스럼, 침액, 뇌척수액, 뇨, 대변 또는 기관지폐포 세척액일 수 있다. 바람직한 양태에서, 조직 샘플은 혈액 또는 뇨 샘플을 포함하는 대사적 장애 샘플이다.
신체 샘플은 생검을 사용하거나 특정 지역을 긁어내거나 면봉채취하거나 또는 체액을 흡입하기 위해 바늘을 사용함을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 피검체로부터 수득할 수 있다. 다양한 신체 샘플을 수거하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 마커를 검출하고 정량하기 위해 적합한 조직 샘플은 당업자에게 공지된 방법에 따라 새롭게 얻거나 동결시키거나 고정시킬 수 있다. 적합한 조직 샘플을 바람직하게 분할하고 추가의 분석을 위해 현미경 슬라이드상에 놓는다. 대안적으로 고체 샘플, 즉 조직 샘플은 가용화시키고/시키거나 균질화시키고 이어서 가용성 추출물로서 분석할 수 있다.
하나의 양태에서, 새롭게 수득한 조직 샘플은 예를 들어, 액체 질소 또는 디플루오로디클로로메탄을 사용하여 동결시킨다. 동결된 샘플은 예를 들어, OCT를 사용하여 분할하기 위해 탑재하고 연속으로 저온저장기에 분할하여 놓는다. 연속 분할물을 유리 현미경 슬라이드상에 수거한다. 면역조직화학적 염색을 위해 슬라이드는 예를 들어, 크롬-알룸, 겔화 또는 폴리-L-라이신으로 피복하여 상기 분할물이 슬라이드에 확실히 고정되도록 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 샘플은 분할전에 고정화시키고 매립한다. 예를 들어, 조직 샘플은 예를 들어, 포르말린중에 고정화시키고 예를 들어 파라핀중에서 연속으로 탈수시키고 매립할 수 있다.
샘플이 수득되면, 본 발명의 마커의 검출 및 정량을 위해 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법을 핵산 또는 단백질 수준에서 사용할 수 있다. 상기 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 웨스턴 블롯, 노던 블롯, 서던 블롯, 면역조직화학, ELISA, 예를 들어, 증폭된 ELISA, 면역침전, 면역형광, 유동세포측정기, 면역세포화학, 질량분광측정기 분석, 예를 들어, MALDI-TOF 및 SELDI-TOF, 핵산 하이브리드화 기술, 핵산 역전사 방법 및 핵산 증폭 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 본 발명의 마커의 발현은 예를 들어, 이들 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 단백질 수준에 대해 검출한다.
샘플은 본 발명의 마커가 항체 결합에 근접가능하게 하기 위해 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 면역세포조직 또는 면역조직화학 방법의 특정 측면에서, 슬라이드는 전처리 완충액에 전달될 수 있고 임의로 항원 접근성을 증가시키기 위해 가열될 수 있다. 전처리 완충액 중 샘플의 가열은 세포의 지질 이중층을 신속하게 파괴하고 항원(새로운 표면에서의 경우일 수 있지만 전형적으로 고정된 표본에 존재하는 것이 아님)이 항체 결합에 보다 근접가능하게 한다. 상기 용어 "전처리 완충액" 및 "제조 완충액"은 본원에서 면역염색을 위해, 특히 본 발명의 마커의 항체 결합을 위한 근접성을 증가시킴에 의해 세포학 또는 조직학 샘플을 제조하기 위해 사용되는 완충액을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 전처리 완충액은 pH 특이적 염 용액, 중합체, 세제 또는 비이온성 또는 음이온성 계면활성제, 예를 들어, 에톡실화된 음이온 또는 비이온성 게면활성제, 알카노에이트 또는 알콕실레이트 또는 이들 계면활성제의 블렌드 또는 담즙염의 사용을 포함할 수 있다. 전처리 완충액은 예를 들어, 데옥시콜산, 나트륨 염 또는 나트륨 라우레쓰-13-카복실레이트(예를 들어, 산도판 LS) 또는 및 에톡실화된 음이온 복합체 0.1% 내지 1% 용액일 수 있다. 몇몇 양태에서, 전처리 완충액은 또한 슬라이드 저장 완충액으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 마커 단백질이 항체 결합에 보다 근접하게 하기 위한 임의의 방법은 본 발명의 실시에 사용될 수 있고 당업계에 공지된 항원 검색 방법을 포함한다[ 문헌참조: Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다].
마커 단백질 근접성을 증가시키기 위한 전처리 후, 샘플은 적당한 차단제, 예를 들어, 퍼옥시다제 차단제, 예를 들어, 과산화수소를 사용하여 차단할 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 샘플은 단백질 차단제를 사용하여 차단하여 항체의 비특이적 결합을 방지할 수 있다. 상기 단백질 차단제는 예를 들어, 정제된 카제인을 포함할 수 있다. 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 모노클로날 또는 폴리클로날 항체는 이어서 샘플과 항온처리한다. 당업자는 보다 정확한 예측 또는 진단이 몇몇 경우에 환자 샘플에서 본 발명의 마커 단백질에 대한 다중 에피토프를 검출함에 의해 수득할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 본 발명의 마커의 상이한 에피토프에 대해 지시된 2개 이상의 항체가 사용된다. 하나 이상의 항체가 사용되는 경우, 이들 항체는 개별 항체 시약으로서 연속으로 또는 항체 칵테일로서 동시에 단일 샘플에 첨가할 수 있다. 대안적으로 각각의 개별 항체는 동일한 환자 기원의 별도의 샘플에 첨가할 수 있고 수득한 데이타를 모은다.
항체 결하을 검출하기 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 발명의 마커에 결합하는 항체는 항체 결합 수준에 상응하고 따라서 마커 단백질 발현 수준에 상응하는 검출가능한 시그날을 생성시키는 화학적 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 면역조직화학 또는 면역세포화학 방법 중 하나에서, 항체 결합은 표지된 중합체에 접합된 2차 항체의 사용을 통해 검출한다. 표지된 중합체의 예는 중합체 효소 접합체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 복합체에서 효소는 전형적으로 항원-항체 결합 부위에 크로모겐의 침적을 촉매하기 위해 사용되고 이에 의해 목적하는 생물마커의 발현 수준에 상응하는 세포 염색이 유도된다. 특정 목적하는 효소는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 및 알칼린 포스파타제(AP)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 특정 면역조직화학 또는 면역세포조직화학 방법에서, 본 발명의 마커에 결합하는 항체는 2차 항체에 접합된 HRP 표지된 중합체의 사용을 통해 검출한다. 항체 결합은 또한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 결합하는 종 특이적 프로브 시약 및 종 특이적 프로브 시약에 결합하는 HRP에 접합된 중합체의 사용을 통해 검출할 수 있다. 슬라이드는 임의의 크로마겐, 예를 들어, 크로마겐 3,3-디아미노벤지딘(DAB)을 사용하는 항체 결합에 대해 염색시키고 이어서 헤마톡실린 및 임의로 수산화암모늄 또는 TBS/트윈-20과 같은 블루잉 제제로 대비염색시킨다. 다른 적합한 크로마겐은 예를 들어, 3-아미노-9-에틸카바졸(AEC)을 포함한다. 본 발명의 몇몇 측면에서, 슬라이드는 세포 염색, 예를 들어, 형광 염색(즉 마커 발현)을 평가하기 위해 세포기술자 및/또는 병리학적가 현미경적으로 검토한다. 대안적으로, 샘플은 자동화 현미경을 통해 또는 양성 염색 세포의 동정을 촉진시키는 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 요원에 의해 검토될 수 있다.
항체 결합 검출은 항-마커 항체를 검출가능한 물질에 커플링시켜 촉진시킬 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보족 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사능 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고 적합한 보족 그룹 복합체의 예는 스트렙타비디딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린 및 아에쿠오린을 포함하고, 적합한 방사능 물질의 예는 125I, 131I, 35S, 14C, 또는 3H을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 동결된 샘플은 상기된 바와 같이 제조하고 후속적으로 예를 들어, 트리스 완충 식염수(TBS)를 사용하여 적당한 농도로 희석된 본 발명의 마커에 대해 항체로 염색시킨다. 1차 항체는 슬라이드를 비오티닐화된 항-면역글로불린중에서 항온처리함에 의해 검출할 수 있다. 상기 시그날은 항원의 디아미노벤지딘 침전을 사용하여 임의로 증폭되고 가시화될 수 있다. 추가로, 슬라이드는 임의로 예를 들어, 헤마톡실린으로 대비염색시켜 세포를 가시화시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 고정되고 매립된 샘플은 본 발명의 마커에 대해 항체로 염색시키고 동결된 부분에 대해 상기된 바와 같이 대비염색시킨다. 추가로, 샘플은 임의로 항체 염색을 가시화하기 위해 시그날을 증폭시키기 위한 제제로 처리할 수 있다. 예를 들어, 퍼옥시다제 접합된 스트렙타비딘(Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, DAKO, Carpinteria, CA)과 반응하는 비오티닐-티라미드의 퍼옥시다제 촉매된 침적을 사용할 수 있다.
조직 기본 분석(즉, 면역조직화학)은 본 발명의 마커를 검출하고 정량하기 위한 바람직한 방법이다. 하나의 양태에서, 본 발명의 마커의 존재 또는 부재는 면역조직화학에 의해 결정할 수 있다. 하나의 양태에서, 면역조직화학 분석은 마커가 부재인 세포가 염색되지 않도록 저농도의 항-마커 항체를 사용한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 마커의 존재 또는 부재는 마커 단백질이 부재인 세포가 과중되게 염색되도록 고농도의 항-마커 항체를 사용하는 면역조직화학적 방법을 사용하여 결정한다. 염색하지 않는 세포는 돌연변이된 마커를 함유하고 항원적으로 인지가능한 마커 단백질을 생성하지 못하거나 마커 수준을 조절하는 경로가 조절불능된 세포이고 무시할만한 마커 단백질을 안정된 상태로 발현한다.
당업자는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용되는 특정 항체의 농도는 결 시간, 본 발명의 마커에 대한 항체의 특이성의 수준 및 샘플 제조 방법과 같은 상기 인자에 의존하여 다양하다. 더욱이, 다중 항체가 사용되는 경우, 요구되는 농도는 항체가 샘플에 적용되는 정도, 예를 들어, 칵테일로서 동시에 적용되거나 개별 항체 시약으로서 연속으로 적용되는 정도에 의해 영향받을 수 있다. 추가로, 본 발명의 마커에 결합하는 항체를 가시화하기 위해 사용되는 검출 화학은 또한 목적하는 시그날 대 노이즈 비율을 생성하기 위해 최적되어야만 한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 프로테오믹 방법, 예를 들어, 질량 분광측정기는 본 발명의 마커 단백질을 검출하고 정량하기 위해 사용된다. 예를 들어, 혈청과 같은 생물학적 샘플의 단백질 결합 칩으로의 적용을 포함하는 매트릭스 연합된 레이져 탈착/이온화 타임 오브 플라이트 질량 분광측정기(MALDI-TOF MS)(Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029)를 사용하여 PY-Shc 및/또는 p66-Shc 단백질을 검출하고 정량할 수 있다. 질량 분광측정 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,622,824호, 제5,605,798호 및 제5,547,835호에 기재되어 있고 이의 각각의 내용은 본원에 참조로서 인용된다.
다른 양태에서, 본 발명의 마커의 발현은 핵산 수준에 대한 것이다. 발현을 평가하기 위한 핵산 기준 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 피검체기원의 샘플에서 마커 mRNA의 수준을 측정한다. 많은 발현 검출 방법은 분리된 RNA를 사용한다. mRNA의 분리에 대해 선별하지 않는 임의의 RNA 분리 기술은 본 발명의 마커를 발현하는 세포로부터 RNA의 정제를 위해 사용될 수 있다(문헌참조: Ausubel et al., ed., (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York). 추가로, 다수의 조직 샘플은 당업자에게 널리 공지된 기술, 예를 들어, 문헌(참조: Chomczynski (1989, 미국 특허 제4,843,155호)의 단일 단계 RNA 분리 과정을 사용하여 용이하게 가공될 수 있다.
용어 "프로브"는 선택적으로 본 발명의 마커, 예를 들어, 뉴클레오타이드 전사체 및/또는 단백질에 결합할 수 있는 임의의 분자를 언급한다. 프로브는 당업자에 의해 합성될 수 있거나 적당한 생물학적 제제로부터 유래할 수 있다. 프로브는 특이적으로 표지되도록 디자인될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라제 연쇄 반응 분석 및 프로브 정렬을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위해 하나의 바람직한 진단학적 방법은 검출되는 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 분리된 mRNA를 접촉시킴을 포함한다. 상기 핵산 프로브는 예를 들어, 전장 cDNA 또는 이의 일부, 예를 들어, 엄중 조건하에서 본 발명의 마커를 암호화하는 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 하이브드리드화기에 충분한, 길이가 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개 이상인 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 진단학적 분석에 사용하기 위한 다른 적합한 프로브는 본원에 기재되어 있다. mRNA와 프로브의 하이브리드화는 의문의 마커가 발현됨을 지적한다.
하나의 양태에서, mRNA은 고체 표면상에 고정화되고 예를 들어, 아가로스 겔상에서 분리된 mRNA를 전개하고 mRNA를 겔로부터 막, 예를 들어, 니트로스셀룰로스로 전달시킴에 의해 프로브와 접촉된다. 또 다른 포맷에서, 상기 프로브는 고체 표면에 고정화되고 mRNA는 프로브와 예를 들어, 어피메트릭스 유전자 칩 어레이에서 접촉된다. 당업자는 본 발명의 마커에 의해 암호화된 mRNA의 수준을 검출하는데 사용하기 위한 공지된 mRNA 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플에서 mRNA 마커 수준을 측정하기 위한 또 다른 방법은 핵산 증폭 과정, 예를 들어, RT-PCR에 의한 증폭 과정(문헌(참조: Mullis, 1987, U.S. Patent No. 4,683,202)에 제시된 실험적 양태), 리가제 연쇄 반응 (문헌참조: Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193), 자가 지지된 서열 복제(문헌참조: Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(문헌참조: Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제(문헌참조: Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 롤링 서클 복제(문헌참조: Lizardi et al., U.S. Patent No. 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용한 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 계획은 특히 상기 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출을 위해 유용하다. 본 발명의 특정 측면에서, 마커 발현은 정량적 형광성 RT-PCR (즉, the TaqManTM System)에 의해 평가한다. 상기 방법은 전형적으로 본 발명의 마커에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용한다. 공지된 서열에 대해 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 디자인하기 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 마커의 발현 수준은 막 블롯(노던, 서던, 도트 등과 같은 하이브리드화 분석에 사용되는 바와 같이) 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체)를 사용하여 모니터링할 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호, 이는 본원에 참조로서 인용된다]. 마커 발현의 검출은 또한 용액중 핵산 프로브를 사용함을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 마이크로어레이는 본 발명의 마커의 발현을 검출하기 위해 사용된다. 마이크로어레이는 특히 상이한 실험간의 재현성때문에 상기 목적을 위해 적합하다. DNA 마이크로어레이는 다수의 유전자의 발현 수준의 동시 측정을 위한 한가지 방법을 제공한다. 각각의 어레이는 고형 지지체에 부착된 캡쳐 프로브의 재현성 패턴으로 이루어진다. 표지된 RNA 또는 DNA는 어레이상에 상보적인 프로브에 하이브리드화하고 이어서 레어져 스캐닝에 의해 검출된다. 어레이상의 각각의 프로브에 대한 하이브리드화 강도를 측정하고 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 정량적 값으로 전환시킨다[문헌참조 미국 특허 제6,040,138호, 제5,800,992호 및 제6,020,135호, 제6,033,860호, 그리고 제6,344,316호, 이는 본원에 참조로서 인용된다]. 고밀도 올리고뉴클레오타이드 분석은 특히 샘플에서 다수의 RNA에 대한 유전자 발현 프로필을 측정하기 위해 유용하다.
인산화된 마커의 양 및/또는 본 발명의 마커의 양의 수학적 관계를 사용하여 대사적 장애에 대해 치료되는 피검체의 생존, 대사적 장애를 치료하기 위한 치료 요법의 효능 등을 계산하고 당업자에게 공지된 회귀 분석 방법을 포함할 수 있는 본 발명의 방법을 사용한다. 예를 들어, 적합한 회귀 모델은 CART(예를 들어, Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications StatSoft, Tulsa, OK), Cox (예를 들어. www.evidence-based-medicine.co.uk), 대수적 정상 및 로그 정상(예를 들어, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 로지스틱(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression 또는 http://faculty.chass.ncsu.edu/garson/PA765/logistic.htm), 파라미터, 비-파라미터, 반-파라미터(예를 들어, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형 (예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression 또는 http://www.curvefit.com/linear_regression.htm), 또는 부가적(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model 또는 http://support.sas.com/rnd/app/da/new/dagam.html)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 회귀 분석은 인산화된 마커의 양을 포함한다. 또 다른 양태에서, 회귀 분석은 마커 수학적 관계를 포함한다. 여전히 또 다른 양태에서, 인산화된 마커의 양 및/또는 마커 수학적 관계의 회귀 분석은 부가적인 임상적 및/또는 분자 공동 변수를 포함할 수 있다. 상기 임상적 공동 변수는 치료 계획, 임상적 결과(예를 들어, 질환 특이적 생존, 치료 실패) 및/또는 진단 후 시간, 치료 개시 후 시간 및/또는 치료 완료 후 시간의 함수로서 임상적 결과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
인산화된 마커의 양 및/또는 본 발명의 마커의 양의 수학적 관계를 사용하여 대사적 장애에 대해 치료되는 피검체의 생존, 대사적 장애를 치료하기 위한 치료 요법의 효능 등을 계산하고 당업자에게 공지된 회귀 분석 방법을 포함할 수 있는 본 발명의 방법을 사용한다. 예를 들어, 적합한 회귀 모델은 CART(예를 들어, Hill, T, and Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications StatSoft, Tulsa, OK), Cox (예를 들어. www.evidence-based-medicine.co.uk), 대수적 정상 및 로그 정상(예를 들어, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), 로지스틱(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression 또는 http://faculty.chass.ncsu.edu/garson/PA765/logistic.htm), 파라미터, 비-파라미터, 반-파라미터(예를 들어, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), 선형 (예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression 또는 http://www.curvefit.com/linear_regression.htm), 또는 부가적(예를 들어, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model 또는 http://support.sas.com/rnd/app/da/new/dagam.html)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 양태에서, 회귀 분석은 인산화된 마커의 양을 포함한다. 또 다른 양태에서, 회귀 분석은 마커 수학적 관계를 포함한다. 여전히 또 다른 양태에서, 인산화된 마커의 양 및/또는 마커 수학적 관계의 회귀 분석은 부가적인 임상적 및/또는 분자 공동 변수를 포함할 수 있다. 상기 임상적 공동 변수는 치료 계획, 임상적 결과(예를 들어, 질환 특이적 생존, 치료 실패) 및/또는 진단 후 시간, 치료 개시 후 시간 및/또는 치료 완료 후 시간의 함수로서 임상적 결과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
VII. 키트
본 발명은 또한 대사적 장애에 대해 치료되는 피검체의 대사적 장애 또는 생존을 예측하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 이들 키트는 하기중 하나 이상을 포함한다: 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 검출가능한 항체, 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 검출가능한 항체, 염색용 피검체 조직 샘플을 수득하고/하거나 제조하기 위한 시약 및 사용 지침서.
본 발명의 키트는 임의로 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유용한 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 상보적 핵산을 어닐링하기 위해 또는 이것이 특이적으로 결합하는 단백질과 항체의 결합을 위해 적합한 유체(예를 들어 SSC 완충액), 하나 이상의 샘플 격막, 본 발명의 방법의 수행능을 기재하는 지침서 및 조직 특이적 대조군/표준물을 포함할 수 있다.
VIII. 스크리닝 시험법
본 발명은 또한 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 대사적 장애를 조절하는 조절인자, 즉 후보 또는 시험 화합물 또는 제제(예를 들면, 단백질, 펩타이트, 펩티도미메틱, 펩토이드, 작은 분자 또는 다른 약물)를 확인하기 위한 방법("스크리닝 시험법"으로서 본원에서 또한 지칭됨)을 제공한다. 그러한 시험법은 일반적으로 본 발명의 마커와 하나 이상의 시험법 성분 사이의 반응을 포함한다. 다른 성분은 시험 화합물 그 자체이거나 시험 화합물과 본 발명에 따른 마커의 자연적 결합 파트너의 조합이다. 본원에 기재된 것과 같은 시험법을 거쳐 확인된 화합물은 예를 들면, 대사적 장애를 조절하는데, 예를 들면, 억제, 경감, 치료 또는 예방하는데 유용하다.
본 발명의 스크리닝 시험법에서 사용되는 시험 화합물은 천연 및/또는 합성 화합물의 체계적인 라이브러리를 포함하는 어떤 활용 가능한 원천으로부터 획득될 수 있다. 시험 화합물은 또한 생물학적 라이브러리; 펩토이드 라이브러리(효소적 분해에 저항성이 있지만 그럼에도 불구하고 생활성으로 남아있는, 신규한 비-펩타이드성 골격이나 펩타이드 기능성을 갖는 분자의 라이브러리; 예를 들면, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85 참조); 공간적으로 다루어질 수 있는 병렬 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 요구하는 합성 라이브러리 방법; '하나의 비드 하나의-화합물' 라이브러리법; 및 친화 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리법을 포함하는 공지의 조합 라이브러리 법에 따라 수많은 접근법에 의해 획득될 수 있다. 생물학적 라이브러리 및 페토이드 라이브러리 접근법은 펩타이드 라이브러리로 제한되지만, 다른 4가지 접근법은 펩타이드, 비-펩타이드 올리고머 또는 화합물의 작은 분자 라이브러리에 적용가능하다(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
분자 라이브러리의 합성을 위한 방법의 예는 당업계, 예를 들면 DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; 및 Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233에서 발견된다.
화합물의 라이브러리는 용액 내 (예를 들면, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421) , 또는 비드 위 (Lam, 1991, Nature 354:82-84), 칩(Fodor, 1993, Nature 364:555-556), 박테리아 및/또는 공극 (Ladner, USP 5,223,409), 플라스미드 (Cull et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) 또는 파지(Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, supra.) 위에 존재할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 피검체로부터의 생물학적 샘플과 시험 화합물을 접촉시키고, 샘플 내 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성을 조절하기 위한 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 마커의 발현 및/또는 활성은 본원에서 기술한 바에 따라 결정될 수 있다.
하나의 구체예로, 본 발명은 본 발명의 마커 또는 이의 생물학적 활성 부분의 기질인, 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 시험법을 제공한다. 아직 또 다른 구체예로, 본 발명은 본 발명의 마커 또는 이의 생물학적 활성 부분에 결합하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 시험법을 제공한다. 시험 화합물이 마커에 직접적으로 결합하는 능력을 결정하는 것은 예를 들면, 화합물을 방사성 동위 원소 또는 효소적 라벨로 커플링함으로써 달성되며, 그러한 화합물의 마커에 대한 결합은 복합체 내 라벨링된 마커 화합물을 검출하는 것에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 화합물(예로서, 마커 기질)은 131I, 125I, 35S, 14C, 또는 3H, 그리고 직접적인 전파 방출의 계산 혹은 신틸레이션 계산에 의해 검출되는 방사성 동위원소로 직접적 혹은 간접적으로 라벨링될 수 있다. 대안적으로, 시험법 성분은 효소적으로, 예를 들면 겨자무과산화요소, 알카리 포스파타아제 또는 루시퍼라제, 그리고 적절한 기질의 제품으로의 변환을 결정함으로써 검출되는 효소적 라벨에 의해 라벨링될 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 스크리닝 시험법에 의해 확인된 신규한 제제로 더욱 적용된다. 따라서, 본원에서 기술된 대로 확인된 제제를 적절한 동물 모델에서 더욱 사용하는 것은 본 발명의 범위 내이다. 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같이 확인된 본 발명에 따르는 마커의 발현 및/또는 활성을 조절하도록 하는 제제는, 효능, 독성, 또는 그러한 제제로 치료하였을 때의 부작용을 결정하기 위해 동물 모델 내에서 사용될 수 있다. 다르게는, 본원에 기술된 바와 같이 확인된 제제는 그러한 제제의 행동 기전을 결정하기 위하여, 동물 모델 내에서 사용될 수 있다. 더욱이 본 발명은 앞서 기술된 치료를 위해, 상기 기술된 스크리닝 시험법에 의해 확인되는 신규한 제제의 용도에 적용된다.
본 발명은 추가로 제한으로서 해석되지 말아야 하는 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 문헌 및 공개된 특허 및 특허원의 내용물은 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 예시
본 발명은 현재, 일반적으로 기재되어 있고, 당업자는 기타 분석, 세포 유형, 제제, 작제물 또는 데이타 분석 방법이 모드 제한 없이 청구된 바와 같은 발명의 범위로부터 벗어나는 것 없이 사용될 수 있다는 상기 교시 및 하기의 실시예로부터 인지할 것이기때문에 단순히 본 발명의특정 측면 및 양태의 설명을 목적으로 포함되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 하기 실시예를 참조로 용이하게 이해될 것이다.
본원에 전반에 걸쳐 인용된 임의의 특허, 특허원, 특허 공보 또는 과학적 문헌은 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다.
본 발명의 실시는 적절한 경우 및 달리 지시되지 않는 경우, 세포 생물학, 세포 배양물, 분자 생물학, 유전자전이 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 및 면역학을 사용하고 이들은 당업자 기술 범위내에 있다. 상기 기술은 문헌에 기재되어 있다[문헌참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook and Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Using Antibodies, Second Edition by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Current Protocols in Cell Biology, ed. by Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, and Yamada, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999; 그리고 PCR Protocols, ed. by Bartlett et al., Humana Press, 2003].
실시예 1: MIM으로서의 CoQ10의 구분
CoQ10의 MIM으로의 가능성에 대해 평가하기 위해, 암 세포주와 정상 대조 세포주를 둘 다 포함한 세포주의 집합에 산화형 CoQ10이 외부로부터 추가되었고, 각 세포주의 세포 미세환경 속성에 유도된 변화가 평가되었다. 세포 형태/생리, mRNA와 단백질 수준을 둘 다 포함한 세포 조성에 대한 변화가 분석되었고 정상 세포와 질병 세포에서 그러한 변화가 비교되었다. 이러한 실험의 결과로부터 CoQ10과 특히 MIM으로서 CoQ10의 산화형을 확인했다. 실험의 첫 세트에서 CoQ10에 대한 민감도와 세포의 세포사멸 반응을 측정함으로써 세포 형태/생리 변화를 분석하였다. 대조 세포주 (각질세포와 멜라닌세포의 일차배양)와 여러 피부암 세포주(SK-MEL-28, 비 전이성 피부암; SK-MEL-2, 전이성 피부암; 또는 SCC, 편평세포암; PaCa2, 췌장암 세포주; 또는 HEP-G2, 간암 세포주)를 포함한 피부 세포주군이 다양한 양의 조효소 Q10으로 처리되었다. 이러한 실험의 결과는 암세포에서만 세포사멸과 세포 죽음을 유도함과 대조 세포주와 비교 시 암 세포주의 농도 의존적 반응이 변화되었음을 입증했다. 본보기 실험은 아래 실시예 3에 상세하게 설명되어 있다.
다음으로 CoQ10 처리에 따른 세포 조성의 변화를 평가하기 위한 분석을 하였다. mRNA 수준에서 유전자 발현의 변화는 실시간 PCR 분석방법을 이용하여 분석되었다. 본보기 실험이 아래 실시예 6과 9-13에 상세하게 설명되어 있다. 보완실험에서 단백질 수준에서 유전자 발현의 변화가 항체 마이크로어레이법, 2차원 겔 정기영동 실험을 이용하여 분석되었고, 그 후 질량 분석을 이용해 단백질을 확인한 후 웨스턴 블롯 분석되었다. 본보기 실험이 아래 실시예 4, 7, 8에 각각 상세히 설명되어 있다. 이러한 분석에서의 결과로 mRNA와 단백질 수준에서 모두 산화형 CoQ10의 추가에 의해 시험된 세포주에서 상당한 유전자 발현의 변화가 유도되었음을 증명하였다. CoQ10 처리에 의해 조절된 유전자는 세포사멸, 암 생물학, 해당작용과 대사, 분자 수송, 세포 신호전달을 포함한 여러 세포 경로 내에서 무리를 이루어 발견된다.
세포내로의 CoQ10 침투를 확인하고 세포에 있는 CoQ10 수준과 형태를 밝히기 위해 실험이 수행되었다. 특히, 미토콘드리아에 조효소 Q10의 수준뿐만 아니라 CoQ10의 형태 (예, 산화형 또는 환원형)가 CoQ10 처리된 세포에서 미토콘드리아 농축 샘플(preparations)을 분석함으로서 밝혀졌다. 외부에서 Q10을 추가하면 미토콘드리아 내 존재하는 조효소 Q10 수준이 시간과 농도 의존적으로 증가됨을 확인하였다. 놀랍고 예상치 못하게, CoQ10은 미토콘드리아에서 주로 산화형으로 존재함이 확인되었다. 추가적으로, 미토콘드리아 농축 샘플의 단백질 수준의 변화가 2D 겔 전기영동과 질량 분석법을 통한 단백질 식별을 이용해 분석되었다. 이러한 실험의 결과로 대사와 세포사멸 경로와 연관된 특정 단백질에 대한 mRNA와 단백질 수준 조절에 의해 증명된 것 시간에 따라 실시된 미토콘드리아 내 CoQ10 산화형의 수준이 세포 변화의 다양함과 연관성이 있음을 확인했다. 본보기 실험이 아래 실시예 5에 상세히 설명되어 있다.
본 출원에 설명된 결과로 내인성 분자 CoQ10과 특히 산화형 CoQ10이 MIM으로 확인되었다. 예를 들어, CoQ10이 mRNA와 단백질 수준 모두에서 유전자 발현 변화를 유도하는 것이 관찰되었기 때문에 이러한 결과를 통해 CoQ10을 MIM으로 확인했다. 또한 CoQ10이 정상 상태(예, 비 암종)와 비교하였을 때 질병 상태(예, 암)에서 세포 형태/생리와 세포 조성(예, mRNA와 단백질 수준에서 모두 유전자 발현의 변화)에 각기 다른 변화를 유도하였기 때문에 이러한 결과를 통해 CoQ10이 다양한 특징을 가진다고 확인했다. 게다가, 이 실험결과를 통해 CoQ10이 세포를 통과할 수 있고 그에 따라 치료효과와 운반효과를 모두 보였다는 점에서 CoQ10이 다양한 특징을 가짐을 확인하였다.
실시예 2: 질병 관련 과정과 대사적 장애에 대한 바이오마커를 확인하는 방법
관심있는 물질로 처리된 세포주에서 이루어진 세포기반 분석에서, 처리되고 처리되지 않은 세포의 차이가 mRNA 어레이, 단백질 항체 어레이, 2D 겔 전기영동을 통해 분석되었다. 비교샘플 분석에서 MIM 또는 epi-전환인자에 의해 조절된다고 확인된 단백질은 Systems Biology perspective with pathway analysis (Ingenuity IPA software)와 알려진 문헌의 검토를 통해 분석되었다. 치료적인 또는 바이오 마커 표적 가능성이 있다고 확인된 단백질에 대해 웨스턴 블랏 분석, siRNA 넉-다운 또는 재조합 유전자 생성 또는 특성분석 방법과 같은 확증시험을 하였다.
실시예 3-8에 대한 물질과 방법
조효소 Q10 모액
500 μM 조효소 Q10 (5% 이소프로파놀 세포성장 배지)가 다음과 같이 준비되었다. 500 μM 조효소 Q10 10mL 모액은 항상 새롭게 제조되었다. 분자량:863.34 (0.0005 mol/L)(0.010 L)(863.34 g/mol) = 0.004317 g
500 μM 모액 10mL를 제조하기 위해, 조효소 Q10 4.32mg을 측량하여 15mL 팔콘튜브에 넣고 500μL의 이소프로파놀을 추가하였다. 용액은 약 50-60℃ 수조에서 데워졌고 완전히 용해되도록 저었다. 본 용액에 9.5mL 배지(세포성장 배지와 동일)가 추가되었다.
세포배양
세포들은 American Type Culture Collection 또는 Gibco에서 입수하였다. 세포는 5% 소태아혈청(FBS), 0.25 μg/mL 암포테리신, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U mL-1 페니실린이 보강된 DMEM/F-12 배지에서 성장시켰다. 세포들은 37℃에서 95%공기와 5% 이산화탄소가 있는 공기에서 유지되었다.
조효소 Q10치료와 단백질 분리
세포들은 Q10에 노출되기 전에 85% 포화상태(confluency)까지 성장되었다. 보강배지는 Q10으로 농도 50 μM, 100 μM까지 조정되었다. 플라스크는 대조군인 50 μM Q10, 100 μM Q10으로 3회 처리되었다. 단백질은 4, 8, 12, 24시간 후 처리된 플라스크와 대조 플라스크로부터 분리되었다. 단백질 분리를 위해, 세포들은 pH 7.4의 차가운 PBS 5mL로 3회 세척되었다. 그런 후 세포를 3mL PBS에서 긁어 모으고, 원심분리기로 응집시키고, pH 7.4의 용해완충액(80mM TRIS-HCl, 1% SDS, 프로테아제와 포스포타제 저해제와 함께)에서 재부유 시켰다. 단백질 농도는 BCA법을 이용하여 정량화되었다.
세포주
아래 나열된 세포주들은 증식되었고 각 세포주에 대한 세포은행(cell bank)이 설립되었다. 다양한 분석을 위한 세포의 대규모 생산이 수행되었고 분석을 위해 물질이 채취되었다. 일반적으로, 세포주 유지를 위해 세포 특이적 배지가 요구되지 않을 때, 세포배양을 위해 사용된 배지는 5% 혈청이 있는 DMEMF-12였다. 세포들은 분열, 세포분석에의 이용, 다음의 표준 실습법 이전에 보통 75-80% 포화상태(confluence, clear spacing)까지 배양되었다. 다음의 세포주들이 실험을 위해 설정되었다:
SK-MEL-28 (비-전이성 피부 흑색종)
SK-MEL-2 (전이성 피부암)
HEKa (각질세포, 피부조절)
HEMa (멜라닌 세포, 피부조절)
nFIB (신생 섬유아세포)
HEP-G2 (간암) [SBH 세포주]
SkBr-3 (유방암, Her2 과발현)
MCF-7 (유방암, p53 돌연변이)
PC-3 (전립선암) [SBH 세포주]
SkBr-3 (인간 유방 선암)
NCI-ES-0808
SCC (편평세포암)
PaCa-2
NIH-3T3
세포 배양:
세포들은 American Type Culture Collection 또는 Gibco에서 입수하였다. 소태아혈청(FBS), 0.25 μg/mL 암포테리신, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U mL-1 페니실린이 보강된 DMEM/F-12 배지에서 성장시켰다. 세포들은 37℃에서 95%공기와 5% 이산화탄소가 있는 공기에서 유지되었다.
피부 악성 흑색종 SK-MEL28 세포들은 5% FBS, 암포테리신, 페니실린/스트렙토마이신이 보강된 글루타맥스가 있는 DMEM/F12에서 배양되었고 유지되었다. 세포들은 37℃에서 5% CO2에서 성장하였다. 추가 세포주와 성장 조건에 대한 세부사항은 아래 표에 있다.
Figure pct00003
SKMEL28 세포의 Q10 치료:
SK-MEL 28 세포들은 100 μM Q10 또는 대조 매개체로 처리되었다. Q10의 제조법은 다음과 같다. 15mL 캡튜브안에 Q10 4.32mg (Cytotech사 공급)가 옮겨지고 그 후 이소프로파놀 500 μL를 추가함으로 용해되었다. 그 결과용액은 65℃ 수조에서 데워졌고 빠른 속도로 보텍스 처리되었다. Q10/이소프로파놀 용액은 평형화된 세포배양배지를 추가하여 10mL 부피로 만들어졌다. 모액은 Q10의 최고 용해도에 도달하기 위해 보텍스 처리되었다. 모액은 최종농도 100 μM Q10을 만들기 위해 희석되었다(모액 2mL에 배지 8mL). 대조매개체는 이소프로파놀 500 μL가 9.5mL 배지에 추가되었다. 대조모액은 8mL 배지로 추가 희석되었다(2mL 모액). 세포는 처리시작 후 6, 16, 24, 48 또는 72시간에 채취되었다.
SCC 세포의 Q10처리:
SCC 세포는 100 μM Q10(상기 명시된 것처럼 준비된)으로 6시간 또는 24시간 동안 처리되었다. 대조세포는 처리되지 않은 세포였다. 세포는 처리 후 다른 시간에 수거하여 덩어리화시켰고 응집체는 RNA가 아래 설명된 것처럼 XTAL에서 분리될 때까지 급송 냉동하여 영하 80℃에서 보관되었다.
RNA 분리:
세포는 RNA를 분리하기 위해 제조업체의 설명에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen사, Valencia CA)키트를 이용하여 각각 다른 처리 시간에 분해되었다. RNA는 260nm에서 광학밀도를 측정하여 정량화되었다.
첫번째 가닥 합성:
첫번째 cDNA가닥은 제조업체의 설명에 따라 RT2 First Strnad Synthesis kit (SABiosciences., Frederick MD)을 사용하여 총 RNA 1㎍에서 합성되었다.
실시간 PCR:
첫 번째 가닥 합성에서의 결과물은 물에서 희석되고, SYBR green master mix (SABiosciences., Frederick MD)와 섞이고 PCR 어레이 위에 로딩되었다. 실시간 PCR가 Biorad CFX96 PCR 어레이(세포사멸 어레이, 당뇨 어레이, 산화 스트레스와 항산화 방어 어레이와 열충격 단백질 어레이) 위에서 수행되었다. (SABiosciences, Frederick MD).
아폽토시스에 대한 Nexin 분석에 의해 조효소 Q10에 대한 세포주 민감도 파악:
초기와 후기 세포사멸 시 세포의 비율은 조효소 Q10 처리 24시간 후에 측정되었다. 초기와 후기 세포사멸은 조효소 Q10에 대한 다양한 암 세포주의 민감도의 차이를 이해하기 위한 마커로 이용되었다. 시험된 세포주들은 PaCa2, HepG2, PC-3, SKBr3, MCF-7, SK-MEL28였다. 세포는 96 웰 플레이트에 붙도록 밤새 두었다. 이러한 세포는 대조매개체, 50 μM Q10 또는 100 μM 조효소 Q10으로 처리되었다. 24시간 후에, 세포사멸 세포의 존재가 PCA96 유세포 분석기(Guava Technologies, Hayward, CA)에서 측정되었다. 추가로, 일부 세포들은 세포사멸을 위한 양성 대조군으로 4 μM 스타우로스포린으로 2시간 동안 처리되었다. 세포는 처음 PBS로 세척되었고 실온에서 Accumax (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) 50 μL로 분리되었다. 분리는 1% Pluronic F-68 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)을 포함한 배양배지를 추가함으로써 중단되었다. 그런 후 각 웰에 Nexin 시약 (Guava Technologies, Hayward, CA) 100 μL를 첨가하였다. 어두운 곳에서 20분 배양 후, 세포가 기질에 재부착하는 것을 최소화하기 위하여 저결합 플레이트(low binding plate)에서 분석이 수행되었다. Nexin 시약은 두 가지 염료를 함유한다. 세포표면의 포스파티딜 세린을 감지하는 Annexin-V-PE; 초기 세포사멸 세포의 특성. 두번째 염료, 7-AAD는 살아있고(건강한) 초기 세포사멸 세포에서는 배척되는 반면에 초기 세포사멸 세포에만 침투한다. 세포의 네 시기의 비율; 건강세포, 초기 자가사멸, 후기 자가사멸과 잔해가 Cytosoft 2.5.7 소프트웨어 (Guava Technologies, Hayward, CA)를 이용하여 측정되었다.
면역블롯팅
샘플당 약 50 μg의 단백질이 면역블롯팅을 통해 분석되었다. 모든 처리는 대조군과 함께 3회 수행되었다. 단백질은 12% TRIS-HCl겔에서 분리되었고, 전기영동법을 통해 니트로섬유소막으로 옮겨졌고 일차 항체와 함께 배양되기 전에 5% 우유와 TBST 용액을 이용하여 저지되었다. 일차 항체는 4℃, 5% BSA와 TBST 용액에서 밤새 배양되었다. 이차 항체는 4℃에서 한 시간 동안 배양되었다. 모든 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입되었다. 1:5000 비율로 이용된 β액틴을 제외하고, 항체는 1:1000의 비율로 이용되었다. 점이 발생되었고, 결과는 NIH 자바 기반의 광학농도계 분석 소프트웨어 이미지 J를 이용하여 정량화되었다. 모든 점은 각 β액틴 발현을 위해 탐지되었고 β액틴 발현에 대해 보정되었다.
2차원 전기영동
등전위점 초점화(IEF)전, 40mM 트리스, 7M 요소, 2M 티오요소, 1% C7 양쪽성이온 세제에 샘플이 용해되었고, 트리부틸포스핀으로 환원되었고 실온에서 90분간 10mM 아크릴아미드에 알킬화되었다. 샘플의 전도도를 환원시키기 위해 7M 요소, 2M 티오요소, 2% CHAPS으로 구성된 최소 3 볼륨의 재부유 완충액과 함께 샘플이 10-kDA 컷오프 Amicon Ultra 장치를 통해 시험된 후. 단백질 100 마이크로그램이 pH 3에서 10, pH 4에서 7 또는 6에서 11로 pH 기울기가 고정된 11cm 길이의 스트립(GE, Amersham, USA)에서 100,000 볼트 시간까지 IEF 되었다. IEF 후, pH 기울기가 고정된 스트립은 6 M 요소, 2% SDS, 50 mM 트리스-아세테이트 완충액, pH 7.0, 0.01% 브롬페놀 블루에서 평형화되었고 8-16% 트리스-염산 Precast 겔, 1mm (Invitrogen, USA)에서 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동되었다. 겔은 두 번 시험되었다. 겔은 고정되고 SYPRO Ruby, 80ml/겔, 1mm (Invitrogen, USA)로 염색되었고 후지 FLA-5100 레이저 스캐너에서 이미지화되거나 PVDF 막으로 이동되었다.
dPC(Protein Forest Inc.) 선택적 pI 분류를 이용하는 방법을 통해 단백질 감별의 유용성을 시험하기 위해 대조샘플에 대한 추가 정보를 얻었고, 트립신 가수분해. 단백질의 큰 하부단위를 확인하는데 유용성을 입증한 대조 샘플과 함께 dPC 분석이 수행되었다. 본 시험 동안 생산된 물질들은 향후 필요할 경우 사용할 수 있도록 보관되었다.
2D 겔 이미지 분석:
모든 겔 이미지 분석이 Progenesis Discovery와 Pro Nonlinear Dynamics Inc., Newcastle upon Tyne, UK)를 이용하여 수행되었다. 반점 발견, 정합, 배경 제거, 보정, 여과 후 SYPRO Ruby 겔 이미지에 대한 자료가 도출되었다. 발현이 유의하게 바뀐(p>0.05) 반점을 확인하기 위해 스튜던트 t 시험(Student's t test)( Progenesis Discovery)을 이용하여 그룹간 쌍별 비교가 수행되었다.
항체 어레이:
Q10 처리 세포(SK-MEL-28, SCC)에서의 단백질 농도 수치의 변화를 가늠하기 위해 700개 이상의 단백질 항체를 스크린 하는데 항체 마이크로어레이(Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)가 사용되었다. 슬라이드 위의 상응하는 항체 반점에 의해 단백질이 결합될 때 세포 추출물에서의 단백질 발현이 감지되었다. 결합 전에 단백질은 형광 시각화와 정량분석에 이용되는 형광염료로 직접 표지되었다. 서로 다른 CyDye(Cy3 또는 Cy5)로 각각 표지 된 두 샘플(시험샘플과 대조샘플)의 단백질 발현 프로파일을 비교하는데 어레이가 이용되었고 두 샘플은 자동적으로 어레이의 동일한 단백질 농도에 자동적으로 적용되었다. 각 샘플에 대한 형광 신호 강도는 샘플과 대조군의 염료 표지에 해당하는 파장에서 각각 기록되었다.
고용량의 조효소 Q10은 배양된 SKMEL-28 세포의 세포사멸, 당뇨, 산화 스트레스 경로에 연관된 유전자 발현을 조절한다.
실험 세부내용: SKMEL-28 세포 (ATCC Catalog # HTB-72)는 전이성이 없고, 5% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신, 암포테리신이 보강된 Glutamax (Invitrogen Cat# 10565-042)를 포함하는 DMEM-F12에서 배양된 피부 흑색종 세포는 각기 다른 시간동안 매개체 또는 100 μM 조효소 Q10으로 처리되었다. 조효소 Q10 처리의 결과인 유전자 발현에서 어떠한 변화는 실시간 PCR 분석(Apoptosis Cat #PAHS-12, Diabetes Cat #PAHS-023 및 Oxidative Stress Cat #PAHS-065)을 이용하여 정량화되었다. (SABiosciences, Frederick, MD).
조효소 Q10 500μM 모액이 4.32mg을 배지를 이소프로파놀 500ul에 용해하여 준비한 후 배지를 추가하여 10ml로 희석되었다. 조효소 Q10을 번갈아가며 보텍스하고 65도씨로 가열하여서 녹였다. 모액 2ml는 세포처리에 이용된 배지를 포함한 100μM Q10을 얻기 위하여 배지로 10ml로 희석되었다. 동시에 조효소 Q10이 추가되지 않았다는 것을 제외하고는 유사한 프로토콜로 매개체가 준비되었다.
SKMEL-28 세포는 6-웰 플레이트가 1x105 세포/well의 밀도로 심어졌다. 24시간 뒤, 세포가 부착되고 50% 포화상태에 도달했을 때, 매개체 또는 100μM Q10이 첨가되었다. 매개체 처리 세포는 24시간 뒤 채취된 반면, 세포는 Q10 처리 6, 12, 24, 48 또는 72시간에 채취되었다. 세포는 각기 다른 처리 시간에 스핀 컬럼과 온 컬럼 DNase 처리를 이용하여 제조업체의 설명에 따라 RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc., Valencia CA Cat #74104) 을 이용하여 RNA 분리를 위해 녹여졌다. RNA는 260nm에서 흡광도를 측정함으로써 정량화되었다.
총 RNA 0.4-1μg을 이용한 첫번째 가닥 cDNA 합성에 의해 실시간 PCR이 선행되었다. 첫번째 가닥 합성의 결과물은 물로 희석되었고 SYBR green master mix(SABiosciences., Frederick MD Cat#PA-010-12)와 섞이고 일반 경로, 보정에 이용되는 5개의 하우스키핑 유전자, 역전사, PCR 컨트롤과 관련된 각기 다른 84개 유전자에 대한 프라이머 분석을 포함하는 PCR 어레이에 로딩되었다. 실시간 PCR은 Biorad Cfx96위에서 진행되었다. 증폭반응은 효소를 활성화시키기 위해 높은 온도에서 시작됐고, 그 후 (95℃ 15초 이차 변성단계와 60℃ 1분 결합 및 연장단계)를 각각 40번을 했고, 융해곡선 프로그램이 그 뒤를 이었다. 모든 처리군에 대한 PCR 증폭기의 결과인 Ct 값은 엑셀 스프레드시트에 정리되었고, http://www.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php에 있는 비교분석 소프트웨어에 로딩되었다.
미토콘드리아 농축 샘플의 정제:
실험 상세내용: t=0에서 모은 세포와 함께 24시간 또는 48시간 동안 100 μM Q10 처리된 SKMEL-28, NCI-ES0808, NIH-3T3 세포는 세척하고 T160 플라스크에서 긁어내어 수거되었다. 세포는 원심분리, 응집, 냉각처리 후 미토콘드리아가 분리될 때까지 영하 80℃에서 보관되었다. 세포 응집체는 해동되고, 재부유시킨 후 Dounce homogenizer에서 파열시켰다. 균질 현탁액은 원심분리되고 미토콘드리아는 시액과 배양세포를 위한 Mitochondria Isolation kit(MitoSciences, Eugene OR, Cat # MS852)에 권고된 프로토콜을 이용하여 분리되었다. 미토콘드리아 분획은 분취되어 영하 80℃에 보관되었다.
조효소 Q10과 유비퀴놀-10 정량법:
조효소 Q10(Q10)과 환원형인 유비퀴놀-10(Q10H2)의 동시 분석법은 최근 게재된, 양이온 모드에서 LC-MS(액체크로마토그래프 질량분석법)/전자분무 이온화 질량분석법을 통한 방법(Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chromatogr. A, 1175, 242-248)에 기초하여 시행되었다. 위 방법은 기타 선택된 지방의 감별과 동시에 Q10과 Q10H2 모두를 매우 선택적으로 확인하고 민감하게 정량화 시킬 수 있다. 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28의 미토콘드리아 농축 샘플 부분표본은 단백질 침전(1-프로파놀 300 μl 에서 초음파처리된 압축세포 100 μl ), 액체-액체 추출(상청액에 물 100 μl 첨가하고 n-헥산 200 μl로 X3추출), 95:5 혼합 헥산 추출물의 건조상태까지 증발과 메탄올/헥산(부피/부피) 50 μl에서 복원에 기반한 일반적인 전처리되었다. 프리즘 RP 1 X 100 mm, 5 μm 입자크기 칼럼(Keystone Scientific)이 있는 Waters Quattro II 삼단계 사중극자형 질량분석기에서 LC-MS/MS 분석이 이루어졌다. 유속 50 μl/min 에서 20% 이소프로필 알코올 80% 메탄올에 있는 4mM 포름산 암모늄으로 등용매를 분리하였다. 샘플 10μl가 주입되었다. MRM 분석이 콘전압 40과 충돌에너지 30에서의 m/z 882.7>197.00 (Q10H2)과 m/z 880.80>197.00 (Q10) 전이를 이용하여 수행되었다.
실시예 3. CoQ10에 대한 세포주의 민감도
여러 세포주들이 Q10 적용 24시간 후 7AAD와 Annexin-V-PE 두 염료를 함유하는 시약 (Nexin 시약)을 이용하여 Q10에 대한 민감도가 테스트되었다. 7AAD 염료는 투과하기 쉬운 세포막이 있는, 주로 후기 세포사멸 시기에 있는, 세포에 들어간다. Annexin-V-PE는 초기 세포사멸 세포의 원형질막 겉표면에 노출된 포스파티딜 세린에 결합하는 염료이다. 그러므로 Nexin 시약은 유세포 분석기(flow cytometer)에서 세포사멸 세포들의 각기 다른 시기를 구분하는 데 사용 가능하다.
PaCa2 세포는 50 μM Q10와 100 μM Q10 적용 24시간 후 초기와 말기 자기사멸 세포(개폐(gating) 세포의 5-10% 사이) 모두에서 증가됨을 보였다. PC-3세포 또한 PaCa2 세포에 비해 증가 폭은 작았지만 50 μM와 100 μM Q10에서 증가하였다. MCF-7과 SK-MEL28 세포들은 50 μM와 100 μM Q10에서 초기 자기사멸 단계에서만 증가함을 보였다. HepG2 세포 역시 50 μM Q10 처리에 민감했다. SKBr3는 50 μM 또는 100 μM Q10 처리에도 초기와 말기 자기사멸 세포에서 어떠한 유의한 증가를 보이지 않은 시험된 유일한 세포주였다. 결과들은 도면 1-6에 묘사되어있다.
Q10 처리가 HepG2 간암 세포에서 세포사멸 반응을 유발한다는 것을 추가 확인하기 위해서, 단일가닥 DNA를 측정하는 ApoStrnad™ ELISA 방법을 이용하여 두 번째 세포사멸 분석이 이루어졌다. ApoStrnad™ ELISA는 포름아미드 변성에 대한 세포사멸 세포 DNA의 민감도와 단일가닥 DNA(ssDNA)에 대한 단일클론 항체로 변성 DNA 감지를 기반으로 한다. 50과 100 μM Q10으로 간암 세포주 HepG2 처리는 각각 17%, 32% 용량반응을 보였고(도면 7) 탐지 가능한 세포사멸을 유발했다. 이러한 결과는 다른 조직(예, SCC, SKMEL-28, MCF-7, PC-3)에서의 기타암 세포주에서 Q10이 유발한 세포사멸의 관찰과 일관된다.
실시예 4: Q10 처리된 세포의 단백질체학 분석
Q10 처리된 샘플의 세포 응집체는 proteomic 방법을 이용하여 분석되었다. 세포 응집체는 2-D 겔과 웨스턴 블롯 분석법으로 분해되고 처리되었다. 세 종류의 세포(SKMEL-28, SCC, nFib)는 Q10으로 처리되었고 2D 겔 전기 영동법으로 단백질체 특징분석되었다.
Q10 처리된 SKMEL-28세포의 단백질체 분석
웨스턴 블롯과 2D 겔 전기영동에 의해 진행되고 평가된 첫 실험 세트는 피부암 세포주 SKMEL-28이었다. 실험 세트는 0, 50 또는 100 μM Q10으로 3, 6, 12, 24시간에 처리된 SK-MEL-28 세포를 포함했다.
Q10 처리된 SK-MEL-28 샘플 세트는 2D 겔 전기영동(도 8)되었고 대조 샘플 대비 단백질 수치에 차이가 있는지 확인되었다. 대조 샘플을 모든 처리된 샘플과 비교하여 총 24개 겔에 있는 943개 점을 비교분석 하였다. 분석에서 시간에 따른 증가, 감소 또는 번역 후 변이에 의한 점 변화를 확인하였다.
분석을 통해 통계적으로 유의한 점(spot)의 변화 32개를 확인했다. 이것을 통해, 20개의 비중복 지점은 트립신 가수분해(digestion)와 질량분석 특성을 통한 단백질 분석을 위해 절단하고 수득하였다. 특징 있는 펩타이드는 단백질을 확인하기 위해 Mascot과 MSRAT 소프트웨어 분석이 있는 단백질 데이터베이스에서 찾아졌다(표 2).
Figure pct00004
본 실험에서의 중요한 발견은 트랜스알돌라아제 1의 감소이고 이러한 사실은 Q10이 암세포에서 대사상태를 변화시킨다는 전제를 뒷받침한다. 트랜스알돌라아제 1은 5탄당 인산경로(육탄당 일인산 회로라고도 알려진)에 있는 효소이다. 트랜스알돌라아제(EC:2.2.1.2) 세도헵툴로오즈 7-인산에서 글리세르알데하이드-3-인산으로 에리트로오즈-4-인산과 프룩토오즈 6-인산을 만들기 위한 탄소 세 개 케톨단위의 가역적 운반을 촉매한다. 트랜스케톨라아제와 함께 이 효소는 해당경로와 5탄당 인산경로를 연결한다. 이것은 생합성반응과 환원환경 유지를 위해 환원 당량 생성을 촉진하기 위한 뉴클레오티드와 NADPH 합성과 관련 있다.
최근 논문(Basta, P., et.al. Aμgust 2008, Cancer Detect Prevention, 32, 200-208)은 트랜스알돌라아제의 유전적 다형성의 증거를 제시했고 두경부의 편평세포암과 연관 있다. 또 다른 최근의 논문(Qian, Y., et.al. May 2008, Biochem J, 415, 123-134)에서는 미토콘드리아 항상성, 칼슘 유동, 세포사멸의 조절인자로서 트랜스알돌라아제 결핍을 확인했다.
이러한 초기 결과로부터, 2D 겔 전기영동으로 Q10에 의해 조절된다고 확인된 기타 단백질이 알려진 관계(도면9)에 대해 분석되었다. 이러한 단백질의 기능분석으로 다양한 과정[세포주기; 5탄당 인산 경로(TALDO1); 세라마이드 신호법(CTSD);아미노아실-tRNA 생합성(GARS), 미토콘드리아 단백질 수송(TOM22)]에 연관된 개개의 단백질과 함께 14-3-3-매개 신호(PDCP6IP, YWHAZ, VIM)에 연관된 그룹이 있다는 것이 밝혀졌다.
Q10 처리된 SCC 세포의 단백질체 분석
이전 SK-MEL-28분석의 후속 실험으로 또 다른 피부암 세포주, 편평세포암(SCC)이 준비되었고 2D 전기영동법으로 분석되었다. SCC 세포는 채취 전 6시간 또는 24시간 동안 100 μM Q10으로 처리되었다. 처리되지 않은 세포도 대조군으로 채취되었다. 세포 응집체는 녹여졌고 샘플은 2D 전기영동(2회)되었다. 6시간과 24시간 처리에 대한 대조 샘플과 비교하여 600개 이상의 단백질 반점 분석이 비교실험에서 수행되었다.
상위 24개의 유의한 반점 변화가 2D 전기영동 겔의 비교분석에서 평가되었다. 이를 통해, 12개 반점은 삭제되었고 트립신 가수분해와 질량분석 특성(아래 표3에 결과요약)을 통해 확인되었다.
Figure pct00005
트랜스알돌라아제 1: Q10 처리된 SKMEL-28 세포에서 이전에 관찰된 바와 같이, 트랜스알돌라아제 1 효소는 수치가 감소되었다. 이것을 통해 Q10과 트랜스알돌라아제(및 그에 따른 세포의 대사상태)의 변화간 사전에 관찰된 연관성 독자적으로 확인된다.
트랜스알돌라아제는 5탄당 인산 경로(도면10)의 비산화 상태에 있는 효소이다. 5탄당 인산 경로는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(환원된 NADH) 생성, 환원적 생합성, ATP, DNA, RNA의 필수 요소인 리보오즈 형성을 위한 세포의 대사 상태에 필수적이다. 또한 트랜스알돌라아제는 해당과정과 5탄당 인산경로를 연결한다. 해당과정은 산화적 인산화의 미토콘드리아 과정이 이용되지 않음에 따라 암세포가 세포 생존에 필요한 에너지를 얻는 대사경로이다. Q10은 산화적 인산화와 미토콘드리아 ATP 생성에 요구되는 필수 조효소 요소이다.
BSCv: 반점 23은 BSCv라 명명된 크로모좀 20 기원의 새로운 인간 단백질이었다. BSCv 단백질은 아디포사이트 원형질막 결합 단백질(유전자명: APMAP 또는 C20orf3)로도 알려져 있고 단백질의 스트릭토시딘 합성효소(strictosidine synthase)계와 유사한 서열의 단일 관통막 타입 2 막단백질로 예상된다. Q10 처리는 이 단백질 수치의 감소를 야기했다. 이 단백질은 잘 특성화되지 않았고, 스트릭토시딘 합성효소와 상동관계도 확인되지 않았다. 재미있게도, 이 단백질은 아디포사이트 분화(Albrektsen et al., 2001)와 관련 있다. 인간 대망 지방조직에 대한 최근의 단백질체 연구는 BSCv가 병리학적으로 비만인 여성의 다낭성 난소 증후군(PCOS)에 대해 각각 다르게 발현하는 9개의 단백질 중 하나임을 확인하였다(Corton, 2008 Hum. Reprod. 23: 651-661). Q10에 반응하는 세포 표면 단백질과 같이 BSCx에 대한 항체는 바이오마커로 활용될 수 있다. 통용되는 결과와 가능한 문헌을 근거로, BSCv는 암과 당뇨에서 잠재적인 역할을 할 수 있다.
NM23A: 비전이성 세포 1, 단백질 (NME1로도 알려진 NM233A)은 전이 억제제로 예상된다. 이 유전자(NME1)는 상당히 전이적인 세포에서 감소된 mRNA 전사수준을 보였기 때문에 발견되었다. 이 단백질은 이인산 뉴클레오사이드 카이네이즈(NDK)로도 활성이 있고 'A'(이 유전자에 의해 암호화된)와 'B'(NME에 의해 암호화된) 아형으로 구성된 6합체로 존재한다. 이 유전자의 돌연변이는 공격적인 신경세포 종양에서 확인되었다. NDK 활동은 예를 들어 구연산(크렙스) 회로에서 GTP가 ATP로 변하는 때와 같이 서로 다른 삼인산 뉴클레오사이드 간의 평형을 유지한다. NDK 복합체는 STRAP과의 상호작용을 통해 p53와 관련이 있다. STRAP이 HNF4A와 연관 있다는 것은 주목할만하다. 그러므로, NM23A는 세포 조절과 질병 치료에 중요한 회로에 포함될 가능성이 있는 단백질이다.
Rho GDP 해리 억제자(GDI) 알파: GDI는 Rho 단백질로부터 GDP 해리와 그에 따른 Rho 단백질로의 GTP 결합을 저해함으로써 Rho 단백질의GDP/GTP 교환반응을 조절한다. 이 단백질은 암세포에서 상향조절 되어있다.
실시예 5: 미토콘드리아 농축 분석
여러 근거가 미토콘드리아 단백질과 암 생물학과 Q10 반응의 역할에 대한 정밀한 평가가 이루어졌다고 시사한다. 첫째로, 정상세포에서 에너지 생산을 위한 미토콘드리아 산화적 인산화 과정에서 Q10의 역할이 필수적이다. 그러나, 암세포에서 일어나는 대사의 변화는 Q10을 요구하지 않는 해당과정의 대체 경로를 통해 에너지를 생산한다. 둘째로 세포의 세포사멸 반응이 일어나기 위해서는 미토콘드리아 단백질 요구된다. Q10은 암세포(Bcl-2-단백질 그룹, 사이토크롬 c)에서 세포사멸을 촉진한다고 밝혀졌다. 마지막으로, 미토콘드리아 수송 수용체 단백질 TOM22(이하 설명된 실험 참고)이 단백질 수치를 통해 조절되는 것처럼 새로운 미토콘드리아 단백질이 Q10처리에 의해 조절됨이 확인되었다.
미토콘드리아 농축 샘플 생산:
피부암 SKMEL-28 세포가 100 μM Q10 또는 가짜 매개체로 6, 19 또는 48시간 동안 처리되었다. 세포는 세척하고 T-160 플라스크 (각 시간에 4)에서 긁어서 채취하였다. 세포는 원심분리를 통해 모아졌고 응집체는 냉각 후 영하 80도씨에 보관하였다. 세포 응집체는 재부유되고 2mL Dounce 균질화기를 이용해 파열되었다. 시약과 방법은 Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells (MitoSciences, Cat# MS852)에서 구했다. 그 결과로 생긴 미토콘드리아 샘플은 75μL 분취액(한 샘플당 4-5 분취액)으로 나눠지고 영하 80도에 보관되었다.
Q10 처리된 SK-MEL-28 세포로부터 분리된 미토콘드리아 농축 샘플의 단백질체 분석
6, 19, 48 시간 동안 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28 미토콘드리아 농축 샘플(상응하는 가짜 매개체 대조군과 함께)의 두 분취액에 용해되어있는 단백질에서 2D 겔 전기영동이 수행되었다. 샘플은 두 번 2D 전기영동되었다. 대조군 샘플을 다른 시간대 샘플과 비교하는 비교시험에서 525 단백질 반점분석이 수행되었다(도면 11).
2D 전기영동 겔 비교분석에서 9개의 통계적으로 유의한 반점 변화가 선택되었다. 이를 통해 9개 반점을 트립신 가수분해와 질량분석 특성화에 의한 확인을 위해 제출되었다.
Figure pct00006
아실 CoA 티오에스터라제 7: 아실-CoA 티오에스터라제7(ACOT7)은 지방산 아실 CoA를 유리지방산과 CoA로 가수분해하는 반응에 촉매작용을 하는 효소 그룹의 일원이다. 그러므로 이 효소는 지방 대사와 세포 신호전달의 조절에 중요한 역할을 한다. ACOT7은 지방산 사슬의 탄소수가 8-16개(C8-C16)가 있는 고급 아실-CoA 기질을 선호한다. ACOT7의 정확한 세포에서의 기능은 온전히 이해되지 않았다. 스테롤 조절인자-결합 단백질 2에 의해 이 유전자 전사는 활성화되고 이는 콜레스테롤 대사에서의 기능을 시사한다.
본 사례에서의 결과는 ACOT7가 Q10 대사에 직접적 또는 간접적으로 연관되어있을 가능성이 있음을 시사한다. 그러므로, ACOT7을 표적으로 삼는 것은 Q10의 세포간 수치 조절을 촉진할 수 있고 따라서 세포에서 Q10 효과에 영향을 미친다.
피루브산 키나제: 피루브산 키나제는 해당작용의 후기단계에 관련된 효소이다. 이것은 포스포에놀피루브산(PEP)로부터 ADP로의 인산기 이동하여 피루브산 한 분자와 ATP 한 분자를 산출하는 반응을 촉매한다.
Figure pct00007

이 단백질은 미토콘드리아 농축 SK-MEL-28 샘플에서 확인된 타입 2 아형인 PKM2의 단백질로 추정된다. 이 아형은 암세포 형성과 조절과 연관이 있다고 잘 알려져 있다.
미토콘드리아에서 Q10 수치 정량화
최근 발표된 방법(Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248)을 기반으로 양이온 모드에서 전자분무 이온화법(ESI)으로 LC-MS-MS를 통해 조효소 Q10(Q10)과 환원형 유비퀴놀-10(Q10H2)의 동시분석이 수행되었다. 이 방법을 통해 기타 선택된 지방의 감별과 동시에 Q10과 Q10H2 모두를 매우 선택적으로 감별하고 민감하게 정량하는 것이 가능하다. 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28의 미토콘드리아 농축 샘플 분취액이 단백질 침전, 액체-액체 추출, 건조상태로의 증발, 95:5 메탄올/헥산(부피/부피) 복원에 기반하여 일반적인 전처리되었다.
이 분석에서 Q10, Q10H2, Q9가 정량화되었다(표 5). 관련 분자인 Q9의 수치가 낮았고 거의 탐지가능 수준이었다. 처리되지 않은 샘플의 수치는 상대적으로 일관적이었고, 6시간 Q10 처리된 샘플과 같은 수준이었다. 전체 물질에서 샘플편차를 조절하기 위해서, 샘플 사이즈 에러에 의해 편차가 생기지 않았음을 확인하기 위해 콜레스테롤 수치도 측정되었다. Q10 수치가 같은 미토콘드리아 조제물의 다른 분취액의 단백질 추출물에서 얻어진 총 단백질 값에 대해 보정되었을 때, 상대적 비율이 비교되었다. 그 결과 Q10수치는 19시간(~3배)에 유의적으로 증가하였고, 48시간에는 훨씬 많이 증가되었다(~6배)(도면 12).
Figure pct00008
본 실험에서의 놀라운 결과는 Q10이 세포에 산화형으로 공급되었다는 것이다. 48시간 샘플에서, 환원형 Q10H2도 측정되었고 매우 낮은 양이 존재한다는 것이 확인되었다(CoQ10 샘플의 46.63ng에 비해 CoQ10H2 샘플 0.28ng). Q10 48시간 처리 샘플에서의 Q10H2 수치가 완화하게 증가(3배)했지만, 그 수치는 분석에서의 추정 검출한계에 가까웠다. 재미있게도, 산화형(Q10)은 생물학적 체계 내에서 산화 촉진제의 역할을 할 수 있었다. 문헌에 따르면, 인간 혈장에서 Q10과 Q10H2를 분석해 봤을 때, 분자의 대다수(90%)는 항산화제 역할을 할 수 있는 Q10H2의 환원형이었다(Ruiz-Jimenez, 2007, J. Chroma A, 1175, 242-248).
그러므로, 이러한 결과로부터 외부로부터 Q10이 배지에 추가 유입됨에 따라 미토콘드리아에서 Q10의 수치가 증가함을 확인했다. 놀랍고 예측하지 못한 발견은 Q10이 공급된 산화형(산화촉진제)에서 유지되었고 Q10H2의 환원형(항산화제)로 어떠한 유의한 양만큼 변환되지 않았다는 점이다.
실시예 6. 실시간 PCR 분석
실험 1: 세포사멸 어레이
위에 실시예 3에서 논의된 바와 같이, 암세포의 Q10 노출은 세포사멸 과정에 의해 암세포들이 사멸하는 비율을 높인다. Q10 반응에 연관된 단백질을 확인하기 위해, 세포사멸에 대한 표적 회로 어레이에 연관된 유전자/단백질에 대한 mRNA 수치의 변화를 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)법이 이루어졌다.
PCR 어레이를 스크리닝 도구로 사용하면서, 세포내 Q10의 생물학적 활동방식에 대한 이해를 도와줄 수 있는 분자 표적의 범위가 평가되었다. 80개 경로 특정 표적을 포함하는 사전에 선택된 서브세트의 mRNA 수치를 측정하기 위해 mRNA 수치의 변화는 실시간 PCR 정량법을 통해 분석되었다.
mRNA 결과를 해석하기 위해, mRNA 전사가 두 배 변화한 유전자를 확인하고 평가하였다. mRNA를 생산하기 위한 유전자 전사 수치를 통해서는 발현된 단백질 수치의 가능한 변화에 대한 대략적인 추정만이 가능하다. 노련한 사람은 각 mRNA가 분해된 정도가 다르거나 비효율적으로 번역이 되어서, 단백질 양이 다른 결과를 얻었음에 감사할 것이다.
24시간 동안 50μM Q10 처리된 SkBr-3 세포
총 84개의 세포사멸 경로 관련 단백질에 대해서 mRNA 수치 변화를 측정하기 위해 RT-PCR 분석법이 이용되었다. Q10처리(24시간)된 SkBr3에 대한 실시간 PCR 세포사멸 분석 실험을 통해 다음의 mRNA가 영향을 받음을 확인하였다: Bcl2, Bcl2L1, Bcl2L11, Birc6, Bax, Xiap, Hprt1, Apaf1, Abl1, Braf. 이러한 결과는 암세포에 Q10 처리 시 세포사멸 반응이 일어난다는 증거를 또 다시 지지한다.
[표 6A]
Figure pct00009
SK-MEL-28 세포에서 이루어진 3개의 개별시험에서의 일관된 결과는 아래 표 6B에 요약되어있다. 100 μM Q10 처리된 SCC 세포에서도 여러 유전자가 조절되었다. SCC 세포에서 조절되는 것으로 보이는 세포사멸 어레이에서의 유전자들이 표 7에 설명되어 있다. SK-MEL-28 세포와 SCC 세포에 있는 많은 유전자가 6시간에 조절되었음을 확인했다. 24시간쯤에는 조절이 감소되었다. SK-MEL-28 세포와 SCC 세포에서 모두 조절되는 유전자는 표 8에 설명되어 있다.
[표 6B]
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
재미있게도, 변화된 mRNA 수치는 세포사멸 단백질들의 상당한 상향조절을 보여주었고, 그 중 Bcl-xl에서의 변화가 가장 컸다. SK-MEL-28 세포에서의 단백질 어레이 실험에서도 이러한 결과를 확인할 수 있었다.
Bcl-xl은 미토콘드리아의 막횡단 분자이다(Bcl-xl은 "엄청 큰 기저 세포 종양"을 뜻한다). 이것은 FAS-L의 신호변환 경로에 연관되고 단백질 Bcl-2 그룹의 멤버인 여러 세포사멸 단백질 중 하나이다. Bcl-xl은 암세포 생존에 연루되었음이 시사되어왔다. 그러나, 인간 Bcl-x mRNA의 선택적 재조합으로 최소 두 개의 별개 Bcl-x mRNA 종, Bcl-xL과 Bcl-xS가 생긴다고 알려져 있다. 우세한 단백질 산물(233 아미노산)은 큰 Bcl-xL mRNA, Bcl-xL이고 이것은 성장인자 철수에 따른 세포 죽음을 저해한다(Boise et al., 1993 . Cell 74, 597-608). 반면에 Bcl-xS는 세포 죽음을 저해하는 Bcl-2 기능을 저해하고 세포를 세포사멸 세포의 죽음에 좀 더 민감하게 만든다. 이용된 분석법은 Bcl-x의 어떤 아형이 상향조절 되는지 구별하지 않았다. 이러한 실험에서 CoQ10에 의해 상향 조절된 Bcl-x 아형은 2개의 mRNA 재조합 아형(Bcl-xL 대 Bcl-sL)의 비율을 분석하기 위해 RT-PCR 법을 사용하는 것과 같이 일반에 알려진 일반적인 방법을 통해 밝혀질 수 있다.
세포사멸 관련 단백질 조사로부터, 여러 세포사멸 촉진인자와 항 세포사멸 인자는 BCL-2 패밀리 또는 내에 있거나 발현 정도를 조절하였다(BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). 이러한 단백질들은 미토콘드리아 외막 침투를 관장한다.
세포사멸 반응에 대한 초기 마커는 카스파아제 3/7 단백질에 의한 세포사멸을 사전에 관찰한 것과 일관되게 카스파아제-9(16시간)의 조절과 함께 관찰된다. 스트레스 신호전달 경로의 유도는 미토콘드리아에서 사이토크롬c의 분비와 apaf-1(apoptosome)의 활성화를 야기하고, 이것은 결국 카스파아제 9의 효소 전구체를 활성화 형으로 쪼갠다. 일단 시작되면 카스파아제 9는 다른 세포사멸 경로를 촉진하기 위해 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-7로 쪼개진다.
조절되는 단백질의 종양괴사인자 수용체 군에 대해서 일관적인 연관성이 있다.
암단백질 p73의 강한 하향조절 또한 주목되었다. 유방암 자궁암을 포함한 인간에서 통상적으로 발견되는 여러 암 분석은 상응하는 부위의 정상 조직과 비교했을 때 p73이 과발현됨을 보여주었다. 세포주기 조절과 포유류 세포의 DNS 합성(예, E2F-1)에 연관된 인체 내 전사 요소의 조절되지 않는 과발현이 p73 발현을 유도한다는 것이 최근의 연구 결과에서 시사되었다. 그 결과에서 P73이 종양단백질일 수 있지만 p53 단백질이 연관된 기전와 다른 기전을 가질 것이라고 제시되었다. 세포사멸 경로의 도식도가 도면 13에 나타나있다.
SKMEL-28 세포
세포사멸 관련 단백질 조사로부터, 여러 세포사멸 촉진인자와 항 세포사멸 인자는 BCL-2 패밀리 또는 내에 있거나 발현 정도를 조절하였다(BCL2L11, BNIP2, BAG1, HRK, BAK1, BCL2, BCL2L1). 이러한 단백질들은 미토콘드리아 외막 침투를 관장한다.
세포사멸 반응에 대한 초기 마커는 카스파아제 3/7 단백질에 의한 세포사멸을 사전에 관찰한 것과 일관되게 카스파아제-9(16시간)의 조절과 함께 관찰된다. 스트레스 신호전달 경로의 유도는 미토콘드리아에서 사이토크롬c의 분비와 apaf-1(apoptosome)의 활성화를 야기하고, 이것은 결국 카스파아제 9의 효소 전구체를 활성화 형으로 쪼갠다. 일단 시작되면 카스파아제 9는 다른 세포사멸 경로를 촉진하기 위해 프로카스파아제-3과 프로카스파아제-7로 쪼개진다.
Figure pct00014
Figure pct00015
조절되는 단백질의 종양괴사인자 수용체 군에 대해서 일관적인 연관성이 있다.
암단백질 p73의 강한 하향조절 또한 주목되었다. 유방암 자궁암을 포함한 인간에서 통상적으로 발견되는 여러 암 분석은 상응하는 부위의 정상 조직과 비교했을 때 p73이 과발현됨을 보여주었다. 세포주기 조절과 포유류 세포의 DNS 합성(예, E2F-1)에 연관된 인체 내 전사 요소의 조절되지 않는 과발현이 p73 발현을 유도한다는 것이 최근의 연구 결과에서 시사되었다. 그 결과에서 P73이 종양단백질일 수 있지만 p53 단백질이 연관된 기전과 다른 기전을 가질 것이라고 제시되었다.
실험예 2: 산화 스트레스와 항산화 방어 어레이를 이용한 실시간 PCR 어레이
Q10 반응에 연관된 단백질을 확인하기 위해, 산화 스트레스와 항산화 방어에 대한 표적 회로 어레이에 연관된 유전자/단백질에 대한 mRNA 수치 변화를 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)법이 이루어졌다.
아래 표 10에는 100 μM Q10 처리된 SK-MEL-28 세포에서 조절되는 유전자가 나열되어있다. 두 별개 시험에서 조절된 유전자에 대해서만 결과가 있다. 6시간에서 상당한 양의 유전자가 조절되었지만, RNA에서 가장 큰 변화는 48시간에서 볼 수 있었다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
호중구 기질 인자 2(NCF2, 65kDa, 만성육아종, 상염색체 2)는 가장 처음 유도된 mRNA 중 하나이다(6시간 때 관찰). 그 후 16시간대와 그 뒤로, 호중구 기질 인자 1(NCF1)(만성육아종, 상염색체 1)이 최초 유도기 후 매우 높은 수준으로 유도되었다.
호중구 기질 인자 2는 호중구에서 쉽게 발견되는 NADPH라고 알려진 복합 단백질 구조물의 기질이다. 이 산화효소는 호중구 식체의 루멘으로 운반되는 많은 양의 초과산화물을 생산한다.
NADPH 산화효소 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산-산화효소)는 막결합 효소 복합체이다. 이것은 원형질막과 식체의 막에서 발견할 수 있다. 이것은 6개의 하위단위로 구성되어 있다. 하위단위는 다음과 같다:
Rho 구아노신 트리포스파타제 (GTPase), 일반적으로 Rac1 또는 Rac2 (Rac은 Rho-연관 C3 보툴리눔 독소 기질을 의미한다)
5개 "phox" 단위 (Phox는 포식세포 항산화제를 의미한다)
P91-PHOX (헴 포함)
p22phox
p40phox
p47phox (NCF1)
p67phox (NCF2)
또 다른 NADPH 산화효소 수치는 변하지 않음이 관찰되었다. 그 효소는 새로운 NADPH 산화효소로 초과산화물을 생성하고 Ca(2+)-의존적 방법에서 H+ 채널로서 기능을 하는 NOX5이다.
또한 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존적 RAC 교환체 1(PREX1) 역시 상향조절되었다. 이 단백질은 작은 GTP-결합 단백질(RACs)의 RHO군에서 구아닌 뉴클레오티드 교환인자로서의 역할을 한다. 이 단백질은 RAC1에 결합하고 결합 GDP를 유리 GTP로 교환함으로써 RAC1을 활성화시킨다. 주로 세포질에서 찾을 수 있는 이 암호화된 단백질은 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트와 헤테로트라이머릭 G 단백질의 베타-감마 하위단위에 의해 활성화된다.
초기에 유도된 단백질 중 두 번째 많은 것은 산화질소 합성효소 2A(유도효소, 간세포)(NOS2A). 산화질소는 신경전달과 항균, 항암 작용을 포함한 여러 과정에서 생물학적 매개체로 작용하는 활성 자유기이다. 이 유전자는 간에서 발현되는 산화질소 합성효소를 암호화하고 특정 사이토카인과 지질다당류의 복합체에 의해 유도 가능하다.
과산화물 제거효소 2, 미토콘드리아 (SOD2)는 철/망간 과산화물 제거효소군에 속한다. 이것은 호모테트라머를 형성하고 서브유니트당 망간이온 하나를 결합시키는 미토콘드리아 단백질을 암호화한다. 이 단백질은 산화적 인산화의 초과산화 부산물에 결합하고 그것을 과산화 수소와 이원자 산소로 변화시킨다. 이 유전자에 있는 돌연변이는 특발성 심근증(IDC), 조로, 산발적 운동신경 질병, 암에 연관되어 있다.
하향 조절된 단백질의 한 예가 포크헤드 박스 M1(FOXM1)이고, 이것은 내인성 FOXM1 발현이 S와 G2/M기에서 최고조일 때 세포주기에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 최근의 연구에서 FOXM1이 Plk1, 사이클린 B2, Nek2, CENPF와 같은 G2/M 특이 유전자의 다양한 집합체의 발현을 조절하고 염색체 분리와 게놈의 안정성 유지에 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다. FOXM1 유전자는 현재 인간의 암유전자 전구체로 알려져 있다. FOXM1의 이상 상향조절은 기저세포 종양(BCC)의 악성종양형성과 연관이 있다. 따라서 간, 유방, 폐, 전립선, 자궁경부, 직장, 췌장, 뇌를 포함한 인간 고형암의 대부분에서 FOXM1이 상향조절 되어있음이 발견된다.
SKMEL-28 세포
SKMEL-28 세포를 이용하여 추가 실험이 행해졌다. 100 μM Q10 처리된 SKKMEL-28 세포에 있는 mRNA 수치는 처리되지 않은 세포에서의 수치와 다양한 시간대에서 실시간 PCR 법(RT-PCR)을 이용하여 비교되었다. PCR 어레이 (SABiosciences) 적절한 RNA 품질관리 뿐만 아니라 최적화된 실시간 PCR 프라이머 분석. PCR 어레이 분석에는 실시간 PCR의 민감도와 마이크로 어레이의 여러 유전자 프로파일링 능력이 있고, 유전자 발현 분석을 수행한다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
호중구 기질 인자 2(NCF2, 65kDa, 만성육아종, 상염색체 2)는 가장 처음 유도된 mRNA 중 하나이다(6시간 때 관찰). 그 후 16시간대와 그 뒤로, 호중구 기질 인자 1(NCF1)(만성육아종, 상염색체 1)이 최초 유도기 후 매우 높은 수준으로 유도되었다.
호중구 기질 인자 2는 호중구에서 쉽게 발견되는 NADPH라고 알려진 복합 단백질 구조물의 기질이다. 이 산화효소는 호중구 식체의 루멘으로 운반되는 많은 양의 초과산화물을 생산한다. NADPH 산화효소 (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산-산화효소)는 막결합 효소 복합체이다. 이것은 원형질막과 식체의 막에서 발견할 수 있다. 이것은 6개의 하위단위로 구성되어 있다. 하위단위는 다음과 같다:
Rho 구아노신 트리포스파타제 (GTPase), 일반적으로 Rac1 또는 Rac2 (Rac은 Rho-연관 C3 보툴리눔 독소 기질을 의미한다)
5개 "phox" 단위 (Phox는 포식세포 항산화제를 의미한다)
P91-PHOX (헴 포함)
p22phox
p40phox
p47phox (NCF1)
p67phox (NCF2)
또 다른 NADPH 산화효소 수치는 변하지 않음이 관찰되었다. 그 효소는 새로운 NADPH 산화효소로 초과산화물을 생성하고 Ca(2+)-의존적 방법에서 H+ 채널로서 기능을 하는 NOX5이다.
또한 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트-의존적 RAC 교환체 1(PREX1) 역시 상향조절되었다. 이 단백질은 작은 GTP-결합 단백질(RACs)의 RHO군에서 구아닌 뉴클레오티드 교환인자로서의 역할을 한다. 이 단백질은 RAC1에 결합하고 결합 GDP를 유리 GTP로 교환함으로써 RAC1을 활성화시킨다. 주로 세포질에서 찾을 수 있는 이 암호화된 단백질은 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트와 헤테로트라이머릭 G 단백질의 베타-감마 하위단위에 의해 활성화된다.
초기에 유도된 단백질 중 두 번째 많은 것은 산화질소 합성효소 2A(유도효소, 간세포)(NOS2A). 산화질소는 신경전달과 항균, 항암 작용을 포함한 여러 과정에서 생물학적 매개체로 작용하는 활성 자유기이다. 이 유전자는 간에서 발현되는 산화질소 합성효소를 암호화하고 특정 사이토카인과 지질다당류의 복합체에 의해 유도 가능하다.
하향 조절된 단백질의 한 예가 포크헤드 박스 M1(FOXM1)이고, 이것은 내인성 FOXM1 발현이 S와 G2/M기에서 최고조일 때 세포주기에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 최근의 연구에서 FOXM1이 Plk1, 사이클린 B2, Nek2, CENPF와 같은 G2/M 특이 유전자의 다양한 집합체의 발현을 조절하고 염색체 분리와 게놈의 안정성 유지에 중요한 역할을 한다고 밝혀졌다. FOXM1 유전자는 현재 인간의 암유전자 전구체로 알려져 있다. FOXM1의 이상 상향조절은 기저세포 종양(BCC)의 악성종양형성과 연관이 있다. 따라서 간, 유방, 폐, 전립선, 자궁경부, 직장, 췌장, 뇌를 포함한 인간 고형암의 대부분에서 FOXM1이 상향조절 되어있음이 발견된다.
실험예 3: 열충격 어레이를 이용한 실시간 PCR
SCC 세포가 열충격 어레이되었고 조절된 유전자에 대한 데이터는 아래 표 13에 요약되어있다.
Figure pct00023
실험 4: 당뇨병 어레이를 사용한 실시간 PCR 어레이
Q10이 다양한 유전자에 영향을 주고 세포의 대사상태를 변화시킬 수 있다는 전체적인 가설을 시험하기 위해 본 사례에서 설명된 실험들을 진행하였다. Q10을 100 μM 처리한 SK-MEL-28 세포의 mRNA를 당뇨병과 그 기전에 관련된 표적 단백질로 구성된 패널을 사용하여 RT-PCR방법을 통해 평가하였다. 본 시험 결과, 당분해 작용기전과 인슐린 진행과정에 관련된 몇몇 단백질의 mRNA 발현 수준이 변화된 것을 발견하였다. (표 14에 요약하였음)
Figure pct00024
본 초기 시험결과는 인슐린과 관련된 다양한 단백질의 mRNA 발현수준이 양방향으로 조절되었음을 보여주고 있다. 본 결과는 Q10이 당뇨병 치료 및 평가에 영향을 줄 수 있음을 나타내고 있다.
Q10을 처리한 SK-MEL-28 세포에서 얻은 결과를 확인하기 위해 추가적인 시험을 진행하였다. Q10을 처리한 이후 6시간에 SK-MEL-28 세포의 많은 유전자의 발현이 조절되었다. 하지만 16시간째와 24시간째에는 초기 조절이 덜 명확하게 바뀌었다. 약 48시간째에는 당뇨병과 관련된 많은 유전자의 발현이 강하게 조절되는 것을 발견하였다. 2개 이상의 독립적인 시험들로부터 얻은 일관된 결과를 표 15에 정리하였다. Q10을 처리한 SCC 세포도 처리 후 6시간째와 24시간째에 어떤 유전자의 발현이 조절되는 것을 보여주는 것 같았다. SCC 세포에 대한 결과는 표 16에 정리하였으며, SK-MEL-28 세포와 SCC 세포 모두에서 발현이 조절된 유전자에 대한 결과는 표17에 정리하였다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
다양한 인슐린 관련 단백질의 mRNA 발현 수준은 양방향으로 조절되었다. Q10은 세포의 대사조절에 영향을 주며, 따라서 당뇨병과 같이 대사가 조절되지 못하는 질병에 영향을 준다.
키나제 14 (MAPK14)는 MAP 키나제 군에 속한다. MAP 키나제는 다양한 생화학적 신호를 통합하는 역할을 하며 분화, 분열, 전사 조절 및 발생과 같은 매우 넓은 범위의 세포적 진행과정에 관련한다. 본 시험을 통해 MAPK 14가 유의적으로 감소하는 것을 관찰하였다.
간세포 핵 인자(Hepatocyte nuclear factor) 4, 알파 (HNF4A): HNF4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4)는 간, 소화관, 신장 및 간 발생에 중요한 췌장 베타 세포에 주로 발현되는 핵 수용체 단백질이다. 인간에서는 NHF4는 2개의 이형질체가 있는데, HNF4A는 알파 이형질체를, HNF4G는 감마 이형질체를 각각 암호화하고 있다 (예를 들면 Chartier FL, Bossu JP, Laudet V, Fruchart JC, Laine B (1994). "Cloning and sequencing of cDNAs encoding the human hepatocyte nuclear factor 4 indicate the presence of two isoforms in human liver". Gene 147 (2): 269-72 참조).
HNF4는 원래 희귀 수용체로 분류되었었다. 하지만 이후에 HNF4가 다양한 지방산에 지속적으로 붙어있는 것 때문에 지속적으로 활성화 된다고 밝혀졌다 (예를 들면 Sladek F (2002). "Desperately seeking...something". Mol Cell 10 (2): 219-221 and Jump DB, Botolin D, Wang Y, Xu J, Christian B, Demeure O (2005). "Fatty acid regulation of hepatic gene trnascription". J Nutr 135 (11) 참조). 다른 핵 수용체와 같이 HNF4의 리간드 결합역은 기본적인 알파 나선형의 샌드위치 폴드를 가지고 있으며 (예를 들면 Wisely GB, Miller AB, Davis RG, Thornquest AD Jr, Johnson R, Spitzer T, Sefler A, Shearer B, Moore JT, Miller AB, Willson TM, Williams SP (2002). "Hepatocyte nuclear factor 4 is a trnascription factor that constitutively binds fatty acids". Structure 10 (9): 1225-34, 그리고 Dhe-Paganon S, Duda K, Iwamoto M, Chi YI, Shoelson SE (2002). "Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand". J Biol Chem 277 (41): 37973-6 참조), 공활성단백질과 상호작용을 한다 (예를 들면 Duda K, Chi YI, Shoelson SE (2004). "Structural basis for HNF-4alpha activation by ligand and coactivator binding". J Biol Chem 279 (22): 23311-6 참조).
HNF4 알파 유전자의 변이는 소아성인형당뇨병 (MODY)과 관련되어 있다 (예를 들면 Fajans SS, Bell GI, Polonsky KS (2001). "Molecular mechanisms and clinical pathophysiology of maturity-onset diabetes of the young". N Engl J Med 345 (13): 971-80 참조)
HNF4 (Hepatocyte nuclear factor 4)는 간세포와 췌장세포에서 발현되는 많은 유전자를 조절하는 것으로 알려진 조직 특이적인 전사 인자 (trnascription factor)이다. 비록 HNF4가 신장의 일부분에서 매우 많이 발현되지만 신장에서의 역할이나 신장세포에서 발현되는 HNF4의 조절을 받는 유전자에 대해서는 많이 알려진 바가 없다. 신장암 (RCC)에서는 HNF4의 존재량과 활성이 자주 감소되고 이는 신장세포에서 HNF4가 발암 억제 기능을 하는 것을 의미한다. 흥미롭게도 HNF4의 조절을 받는 많은 유전자들은 신장암 마이크로어레이(microarray) 연구에서 규제해지(deregulation)되는 것으로 알려졌다. 이러한 유전자들 (ACY1, WT1, SELENBP1, COBL, EFHD1, AGXT2L1, ALDH5A1, THEM2, ABCB1, FLJ14146, CSPG2, TRIM9 및 HEY1)은 신장암에서 HNF4의 감소에 따라 활성이 변화되는 유전자 후보들이다.
HNF4알파(1M7W.pdb; Dhe-Paganon (2002) JBC, 277, 37973)의 리간드 결합 도메인의 구조에서 작은 지질이 관찰되었고 대장균(E. coli) 생산으로부터 함께 정제되었다. 결정체(crystal)는 단백질의 2가지 형태를 포함하고 있는데, 가늘고 긴 나선형10 (helix 10)과 짧은 나선형12 (helix 12)가 형태를 변화시킨다. 지질이 결합하는 부위를 살펴보면 흥미롭게도 2개의 출구지역(exits region)이 있는 것을 관찰할 수 있다. 하나의 출구지역은 작은 지질의 머리 그룹을 붙잡고 있으며 여러 개의 포켓지역(pocket region)들이 함께 위치하고 있음을 알 수 있다. Q10이 전사인자에 명확하게(specifically) 결합한다고 가정할 수 있다. 본 모델에서 Q10이 지질결합터널 (lipid binding tunnel)에 들어가면 Q10의 링부위가 표면의 포켓에 정확히 맞아 들어간다. (도면 28). 기존에 알려진 기능상실변이(loss-of-function) (E276Q)는 이러한 표면의 포켓의 안쪽 아미노산을 결정할 가능성이 있고 따라서 추측되는 Q10결합에 부정적인 영향을 미친다.
더불어, Q10결합 모델에서 소수성(hydrophobic) 꼬리부분은 내부 구멍에서 뻗어나와 가늘고 긴 나선형10과 상호작용한다. 따라서, 이러한 상호작용이 나선형10과 나선형12간의 형태변화를 일으킬 가능성도 있다. 이러한 현상은 전사인자의 활성의 활성/비활성 평형상태를 바꿀 수도 있다.
실시예 7: 항체 마이크로어레이 분석
Q10이 존재함에 따른 단백질 농도의 분석은 항체 마이크로어레이 (microarray) 방법을 사용하여 평가하였다. 마이크로어레이는 다양한 단백질 종류와 가능한 작용기전 표지물(marker)로 구성된 700개 이상의 단백질에 대한 항체를 포함한다.
첫번째 시험은 Q10을 처리한 세포에서 단백질 농도의 변화를 측정하기 위해 항체 마이크로어레이 (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)와 Q10을 처리한지 6시간 혹은 24시간된 SK-MEL-28 세포를 이용하여 수행하였다. 세포를 거둬들인 후 수용성 단백질 상청액(supernatant)을 추출하여 얻었다. 각 샘플(1 mg/mL)로부터 얻은 단백질(약 총 1mg)은 두개로 나뉘어 각각 Cy3과 Cy5 형광염료(fluorescent dye)로 표시하였다. 과도한 염료는 단백질과 마이크로어레이 시험진행(incubation)에 사용된 물질로부터 제거시켰다. 두 개의 시간포인트에서 샘플을 비교하기 위해 서로 다른 표지가 된 샘플로부터 동일한 양의 단백질을 섞었다. (예: Cy3으로 표지된 3시간째 샘플을 Cy5로 표지된 24시간째 샘플과 섞었다.). 마이크로어레이 칩과 시험진행(incubation)한 후에 (제조사 추천 프로토콜에 따라), 칩을 씻고 말렸다. 형광 레이져 스캐너(scanner)를 사용하여 마이크로어레이를 스캔하여 Cy3과 Cy5 표지의 상대적인 형광 강도를 측정하였다.
Figure pct00029
Figure pct00030
사전에 관찰된 세포사멸 단백질을 확인함과 동시에 더 많은 수의 세포사멸을 촉진하는 단백질과 세포사멸을 억제하는 단백질을 알아보기 위하여 잠재적으로 관련될 수 있는 넓은 범위의 단백질군을 검진할 수 있는 2가지 분석방법을 선택하였다.
첫번째로, 항체 마이크로어레이 (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)를 이용하여 50μM Q10을 24시간 동안 처리한 SK-MEL-28 세포에서 단백질 농도 수준이 변화하는 것을 평가하기 위해 700개가 넘는 단백질 항체를 검진하였다.
Q10을 24시간 처리한 SK-MEL-28 세포에 대한 항체어레이 시험으로부터 발현수준이 변경된 단백질을 다음과 같이 찾아내었다: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Connexin 32, PumA bbc3, BID, Par4, cCbl. 금번 초기 시험을 통해 예상된 세포사멸을 촉진하는 단백질이 변경된다는 중요한 사실을 알 수 있었다.
SK-MEL-28 세포에 대한 항체 마이크로어레이
항체 마이크로어레이 (Panorama XP725 Antibody Array, Sigma)를 이용하여 50μM Q10을 24시간 동안 처리한 SK-MEL-28 세포에서 단백질 농도 수준이 변화하는 것을 평가하기 위해 700개가 넘는 단백질 항체를 검진하였다.
Figure pct00031
Q10을 24시간 처리한 SK-MEL-28 세포에 대한 항체어레이 시험으로부터 발현수준이 변경된 단백질을 다음과 같이 찾아내었다: Bcl-xl, Bmf, BTK, BLK, cJun (pSer63), Connexin 32, PumA bbc3, BID, Par4, cCbl. 외부에서 Q10을 추가하여 증가된 수준에서 세포사멸을 촉진하는 단백질의 수준이 변경된 것을 확인하였다.
Bcl-xl ("Basal cell lymphoma-extra large")는 미토콘드리아의 막을 통과하는 분자이다. FAS-L의 신호전달 기전에 관련되어 있으며 Bcl-2단백질군 중 세포사멸을 억제하는 여러 단백질 중 하나이다. 이것은 암세포의 생존에 관련된 것으로 알려져 있다. 하지만 인간 Bcl-x mRNA의 선택적 이어맞추기(alternative splicing) 과정에 의해 최소 2개의 서로 다른 Bcl-x mRNA 종류 (Bcl-xL과 Bcl-xS)로 나타나는 것으로 알려져 있다. 주된 단백질 (233개 아미노산)은 성장인자가 없어짐에 따라 세포가 사멸하는 것을 억제하는 더 큰 Bcl-x mRNA에서 생성된 Bcl-xL 단백질이다(Boise et al., 1993 . Cell 74, 597-608). 반면에 Bcl-xS는 세포사멸을 억제하는 Bcl-2의 역할을 억제하고 세포가 보다 세포사멸을 허용할 수 있도록 만들어 준다.
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 8: 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석
첫번째 실험은 피부 암세포주 SKMEL-28을 이용하여 웨스턴 블롯과 2-D 겔 전기영동을 수행하였다. 50μM 혹은 100μM Q10을 각 3, 6, 12 및 24시간째 SK-MEL-28 세포에 처리하였다.
Bcl-xL에 대한 항체(도면 14), Vementin에 대한 항체(도면 15), 미토콘드리아 산화성 인산화반응 기능에 대한 다양한 항체들 (도면 16-21) 및 미토콘드리아 막의 온전함(integrity)에 대한 다양한 항체들 (도면 22-27)을 사용하여 다양한 세포 종류에 대해 평가하였다. 본 실험 결과 Q10처리에 따라 여러 단백질들의 수준이 증가되거나 감소되었다.
실시예 9: 100μM Q10을 처리한 췌장암 세포(PaCa2)에서 mRNA 수준이 조절되는 당뇨병 관련 유전자 발견
100μM Q10을 처리한 후 다양한 시간대별로 준비한 샘플을 당뇨병 어레이를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 기본적으로 위에서 언급된 방법으로 수행되었다. Q10처리에 따라 조절되는 다양한 유전자를 아래 표 23에 정리하였다. 그 결과 ABCC8, ACLY, ADRB3, CCL5, CEACAM1, CEBRA, FOXG1, FOXP3, G6PD, GLP1R, GPD1, HNF4A, ICAM1, IGFBP5, INPPL1, IRS2, MAPK14, ME1, NFKB1, PARP1, PIK3C2B, PIK3CD, PPARGC1B, PRKAG2, PTPN1, PYGL, SLC2A4, SNAP25, HNF1B, TNRFSF1A, TRIB3, VAPA, VEGFA, IL4R 및 IL6 과 같은 유전자들이 Q10처리에 따라 조절되었다.
Figure pct00034
실시예 10: 100μM Q10을 처리한 췌장암 세포(PaCa2)에서 mRNA 수준이 조절되는 신생혈관생성 관련 유전자 발견
100μM Q10을 처리한 후 다양한 시간대별로 준비한 샘플을 신생혈관생성 어레이를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 기본적으로 위에서 언급된 방법으로 수행되었다. Q10처리에 따라 조절되는 다양한 유전자를 아래 표 24에 정리하였다. 그 결과 AKT1, ANGPTL4, ANGPEP, CCL2, CDH4, CXCL1, EDG1, EFNA3, EFNB2, EGF, FGF1, ID3, IL1B, IL8, KDR, NRP1, PECAM1, PROK2, SERPINF1, SPHK1, STAB1, TGFB1, VEGFA 및 VEGFB 과 같은 유전자들이 Q10처리에 따라 조절되었다.
Figure pct00035
실시예 11: 100μM Q10을 처리한 췌장암 세포(PaCa2)에서 mRNA 수준이 조절되는 세포사멸 관련 유전자 발견
100μM Q10을 처리한 후 다양한 시간대별로 준비한 샘플을 세포사멸 어레이를 사용하여 실험을 수행하였다. 실험은 기본적으로 위에서 언급된 방법으로 수행되었다. Q10처리에 따라 조절되는 다양한 유전자를 아래 표 25에 정리하였다. 그 결과 ABL1, AKT1, Bcl2L1, BclAF1, CASP1, CASP2, CASP6, CIDEA, FADD, LTA, TNF, TNFSF10A 및 TNFSF10 과 같은 유전자들이 Q10처리에 따라 조절되었다.
Figure pct00036
실시예 12: 간세포(HEPG2)에 대한 PCR 당뇨병 어레이
HepG2(간암세포)세포에 비히클(vehicle)를 24시간 처리하거나 혹은 100μM Q10을 각기 다른 시간동안 처리하였다. 각 웰(well)당 처음에는 1x105의 세포를 처리하였고 이후에 PaCa2세포에 사용하였던 절차를 따랐다. (상기 실시예 9-11). 하지만 예상보다 이 샘플에서 추출한 RNA의 총 양은 적었다. 전체 RNA의 1μg을 사용하여 역전사 시험(reverse trnascription)을 수행하였다 (260nm에서 측정하여 정량함). 역전사시험에 사용한 최대 용량은 8ul이다. RNA 농도가 낮기 때문에 매개체를 이용하거나 Q10을 처리하고 16시간과 48시간이 지난 샘플을 이용한 RT-PCR 어레이는 0.44μg의 RNA를 이용하여 수행하였다. 아래 표 26에 정리된 것과 같이, Q10 100μM을 처리하였을 때 HepG2세포 유전자의 조절에 대한 트렌드와 패턴에 대한 초기 분석결과를 어레이를 통해 얻었다. 결과에 따르면, PPARGC1A, PRKAA1 및 SNAP25 유전자가 처리후 16시간째 발현이 감소되었다 (대조군 대비, 각각 약 20배, 6배 및 5배 감소). 처리후 48시간째에는 PPARGC1A 와 PRKAA1 유전자는 발현이 정상으로 돌아오거나 혹은 약간 증가되었으나 SNAP25 유전자는 약 2배 정도 발현이 감소되었다.
Figure pct00037
실시예 13: 간세포에 대한 PCR 신생혈관형성 어레이
HepG2(간암세포)세포에 비히클(vehicle)를 24시간 처리하거나 혹은 100μM Q10을 각기 다른 시간동안 처리하였다. 각 웰(well)당 처음에는 1x105의 세포를 처리하였고 이후에 PaCa2세포에 사용하였던 절차를 따랐다. (상기 실시예 9-11). 하지만 예상보다 이 샘플에서 추출한 RNA의 총 양은 적었다. 전체 RNA의 1μg을 사용하여 역전사 시험(reverse trnascription)을 수행하였다 (260nm에서 측정하여 정량함). 역전사시험에 사용한 최대 용량은 8μl이다. RNA 농도가 낮기 때문에 매개체를 이용하거나 Q10을 처리하고 16시간과 48시간이 지난 샘플을 이용한 RT-PCR 어레이는 0.44μg의 RNA를 이용하여 수행하였다. 아래 표 27에 정리된 것과 같이, Q10 100μM을 처리하였을 때 HepG2세포 유전자의 조절에 대한 트렌드와 패턴에 대한 초기 분석결과를 어레이를 통해 얻었다. Q10처리에 따른 다양한 유전자가 조절되는 결과를 표 27에 정리하였다. 결과에 따르면, ANGPTL3, ANGPTL4, CXCL1, CXCL3, CXCL5, ENG, MMP2 및 TIMP3 유전자가 처리후 16시간째 발현이 증가되었다 (대조군 대비, 각각 약 5.5배, 3배, 3배, 3.2배, 3배, 3배, 1배 및 6.5배, 6배 및 5배 증가). ID3유전자는 Q10 처리후 16시간째 대조군 대비 약 5배 정도 발현이 감소되었다. 처리후 48시간째에는 ANGPTL3, CXCL1, CXCL3, ENG 및 TIMP3 유전자는 여전히 발현이 증가된 반면 (대조군 대비, 각각 약 3.5배, 1.5배, 3.175배, 2배 및 3배), ANGPTL4, CXCL5, ID3 및 MMP2 유전자는 대조군 대비 각각 약 1배, 1배, 2배 및 18배 발현이 감소되었다.
Figure pct00038
RT-PCR어레이는 신생혈관형성 과정에 관련된 것으로 알려진 단백질로 구성되어 있다. 신생혈관형성은 암세포가 악성으로 변화하는 과정에서 매우 중요한 것이다. 이 중 몇몇 단백질은 당뇨병에도 관련되어 있다.
ANGPTL3 및 ANGPTL4: 관련 논문에 따르면, ANGPTL3단백질은 지질대사 조절에 관련되어 있다고 알려져 있다. 특히 한 논문(Li, C. Curr Opin Lipidol. 2006 Apr;17(2):152-6)은 신생혈관형성 촉진 성장인자(angiopoietins)와 유사 신생혈관형성 촉진 성장인자(angiopoietins-like)가 유사한 도메인 구조를 가지고 있다고 밝히고 있다. ANGPTL3과 4는 지방단백질(lipoprotein)을 활성을 억제하는 상과(上科, superfamily)에 속하는 유일한 두 개의 단백질이다. 하지만, ANGPTL3과 4는 각기 다른 수준에서 조절되며 생체 내에서 각기 다른 역할(non-redundant function)을 하는 것으로 알려져 있다. ANGPTL3과 4는 단백분해되어 2개로 분해되고 핵 수용체에 의해 각기 다르게 조절된다. ANGPTL4을 과발현시킨 트랜스제닉(trnasgenic) 모델과 ANGPTL3과 4를 녹아웃(knock-out) 시킨 모델에서 이 두 개의 단백질이 지방단백질 대사에 필수적인 역할을 하는 것을 밝혔다. 간세포 유래 ANGPTL3은 음식물을 먹은 상태에서의 지방단백질 지방가수분해효소(리파아제, lipase)의 활성을 주로 억제하는 반면에, ANGPTL4는 음식물을 먹은 상태와 먹지않은 상태 모두에서 중요한 역할을 한다. 추가적으로, ANGPTL4는 지방단백질 유래 지방산의 조직특이적인 이동을 조절한다. 따라서 ANGPTL4는 발현되는 장소에 따라 지방단백질 지방가수분해효소를 내분비적(endocrine)이나 자가분비적(autocrine)/근거리분비적(paracrine)으로 억제한다.
지방단백질 지방가수분해효소는 킬로미크론(chylomicrons)과 저밀도지단백(low-density lipoprotein, VLDL)에서 발견되는데, 지방단백질의 지질을 3개의 유리지방산(free fatty acide)과 1개의 글리세롤(glycerol) 분자로 가수분해하는 효소이다. 해당 조직에서 지방단백질 지방가수분해효소의 활성은 트리글리세리드(triglyceride)유래 지방산을 흡수하는데 반응속도를 제어하는 요소이다. 지방산의 분배의 불균형은 중요한 물질대사의 결과를 초래한다. 고지방 음식섭취는 조직특이적인 인슐린저항성과 이에 따른 제2형 당뇨병 발달에 연루된 조직특이적인 LPL의 과발현을 일으킨다.
본 실시예의 결과들은 Q10이 지질 대사에 관련된 단백질을 조절하며 ANGPTL3/ANGPTL4 유전자와 이와 관련된 기전에 대해 추가적인 연구가 필요함을 의미한다. 예를 들어, ANGPTL3/ANGPTL4는 Akt, 콜레스테롤, 지방산, HDL-콜레스테롤, HNF1A, ITGA5, ITGA5, ITGAV, ITG83, L-트릴아이오도티노닌(trilodothynonine), LIPG, LPL, Mapk, Nrth, NR1H3, PPARD, PTK2, RXRA, 트리아실글리세롤 및 9-시스-레티노산 같은 경로에 관련되어 있다고 알려져 있다.
실시예 14: 간세포(HEPG2)에 대한 PCR 세포사멸 어레이
상기 기술된 것처럼 100μM Q10을 처리하고 16시간과 48시간이 지난 샘플을 이용하여 세포사멸 어레이를 수행하였다. 하지만 48시간을 위한 어레이는 형광단(fluorophore)을 SYBR대신 FAM을 사용하였다. FAM과 SYBR은 동일한 파장에서 형광 빛을 낸다.
Q10처리에 따른 다양한 유전자가 조절되는 결과를 표 28에 정리하였다. Q10처리 후 16시간째 CASP9유전자는 대조군 대비 약 61배 정도 발현이 증가되었으며, BAG1과 TNFRSF1A는 처리 후 16시간째 대조군 대비 각각 약 6배와 4배 정도 발현이 감소되었다. 처리 후 48시간째에는 CASP9, BAG1 및 TNFRSF1A는 대조군 대비 각각 약 55배, 1배 및 1배씩 발현이 증가되었다.
Figure pct00039
실시예 15: 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적(Epi)-전환인자의 능력 평가
선택된 Epi-전환인자, 예를 들어, CoQ10이 대사적 장애, 예를 들어, 당뇨병을 치료할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 시험관내 인슐린 자극된 글루코스 흡수의 증가를 모니터링하는 세포 기반 분석을 사용한다. 특히, 분화된 마우스 지방세포를 사용하여 방사능표지된 글루코스의 섬광 계수에 의해 측정된 바와 같이 인슐린 자극시 글루코스 흡수를 증가시키는 능력을 갖는 제제를 동정한다(예를 들어, 퍼킨 엘머 1450 마이크로베타 JET 판독기를 사용하여). 이들 분석은 다음과 같이 수행한다.
재료 및 방법:
프레스 배지(Prees Media)
"프레스" 배지로 또한 언급된 완전 배지를 다음과 같이 제조한다. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에 L-글루타민, 페니실린-G 및 스트렙토마이신(pen/strep) 및 열-불활성화된 태아 소 혈청(FBS)(65℃에서 30분동안 열 불활성화된)을 보충한다. 혈청은 세포의 성장, 부착 및 분화에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 임의의 새로운 많은 혈청을 먼저 사용전에 시험하였다. 배지는 지시 염료의 적색/오렌지색에 의해 지적되는 바와 같이 pH가 적당한 범위(약 7)내에 있을 때까지 배양기(5% CO2)에서 평형화시켰다. 배지가 분홍색(고 pH를 지적함)이 되는 경우 기본 조건이 세포에 영향을 주어 분화 배지-1(DM1) 및 분화 배지-2(DM2)에 사용되는 인슐린 변성시킬 수 있기 때문에 배지를 버렸다.
분화 배지
분화 배지-1 (DM1)은 DMEM에 10% FBS, L-글루타민, pen/strep, IBMX(375. mu.M), 인슐린 (120nM) 및 덱사메타손(188nM)을 보충하여 제조하였다. 분화 배지-2 (DM2)는 DMEM에 10% FBS, L-글루타민, pen/strep 및 인슐린(120nM)을 보충하여 제조하였다.
겔라틴화된 플레이트의 제조
세포 배양 플레이트는 다음과 같이 겔라틴화한다. 겔라틴(증류수중 1% w/v)을 오토클레이빙하고 실온에 저장하였다. 각각의 세포 배양 바닥을 겔라틴 용액으로 균일하게 포장하여 어떠한 기포가 형성되지 않도록 한다. 상기 용액을 겔라틴 필름만이 잔류하도록 제거하였다. 이들 플레이트드를 조직 배양 후드하에 건조되도록 방치한다. 이어서 플레이트를 PBS로 세척하고 이후 0.5% 글루타릭 디알데하이드 용액(증류수중 글루타르알데하이드)를 세포 배양 웰에 첨가하였다. 10분 후, 웰은 pen-strep을 함유하는 DMEM으로 2회 세척한다. 각각의 세척 단계는 대략 5분동안 지속해야만 한다.
세포 배양물
3T3-L1 예비지방세포를 대략 2-일마다 또는 대략 60% 컨플루언스에 도달하는 즉시 분할하였다. 과(over)컨플루언스는 이들 세포가 지방세포로 분화하는 능력에 영향을 미칠 수 있다.
다른 시약
D-(+)-글루코스("냉" 글루코스, 방사능표지되지 않음)는 DPBS 혼합물에 첨가하여 최종 농도가 10mM이 되도록 하였다.
염기(예를 들어, 최종 농도가 0.5N인 수산화나트륨) 및 세제(예를 들어, 최종 농도가 0.1%w/v가 되도록 희석된 나트륨 도데실 설페이트의 혼합물인 용해 완충액을 매번 새롭게 제조하였다(사용 1시간 내지 2시간내에). 사용전에, 용해 완충액은 대략 30분의 기간동안 실온을 초과하는 온도로 가온시켜 완충액의 침전을 회피하였다.
글루코스 흡수의 측정
예비지방세포 3T3-L1 세포는 대략 웰(블랙 NUNC 96웰 플레이트)당 5000개 세포 밀도로 분주한다. 이들 세포는 2개의 별도의 단계에서 지방세포로 분화한다. 처음에, 세포는 2 내지 3일동안 분화 배지-1(DM1)(2 내지 3일동안)에서 배양한다. DM1은 증식을 차단하고 지방세포 특이적 유전자의 발현을 유도한다. 이어서 세포는 분화 배지-2(DM2)에서 3 내지 4일동안 배양하고 이후에 배양 배지는 신선한 DM2로 대체한다. 글루코스 흡수 분석은 분화 9일 내지 15일에 수행한다.
실험 2일전에(분화 7일 내지 13일에), DM2를 제거하고 신선한 프레스 배지로 대체하였다. 후보 화합물을 이 시점에서 첨가하고 대략 48시간동안 항온처리한다. 실험 날에, 세포(현재 분화 9일 내지 15일)는 약 pH 7에서 DPBS, 황산마그네슘(0.8mM) 및 헤페스(10mM)중에서 3시간동안 혈청 고갈시킨다. 이러한 항온처리 기간 후에, 신선한 인슐린 함유 DPBS(10 nM)를 지방세포에 첨가한다. 임의의 인슐린 부재의 신선한 DPBS는 음성 대조군으로서 작용하는 세포상에 위치시킨다. 37℃에서 25분동안 항온처리한 후, 방사능 글루코스(각각의 웰중 최종 농도 0.04mM의 sup.14C, 약 0.26 .mu.Ci .sup.14C-글루코스로 표지된)를 실온에서 15분동안 배지에 첨가한다. 이어서 배지를 제거하고 세포를 완전히 세척하고 용해시킨다. 용해 즉시, 세포는 웰 기저로부터 탈착된 작은 혼탁한 매쓰를 형성한다. 10% 빙초산을 각각의 웰에 첨가하여 용해 반응물을 중성화시킨다. 이어서 섬광 유체를 웰에 첨가하고 글루코스를 혼입하여 MicroBeta 플레이트 판독기를 사용하는 각각의 웰내에 방사능의 양을 측정함에 의해 결정한다.
이전의 실험 프로토콜을 사용하여, 환경적-전환인자는 환경적 전환인자가 시험관내에서 세포내 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 증진시키거나 증가시키거나 증강시키는 경우 대사적 장애, 예를 들어, 당뇨병을 치료할 수 있는 것으로서 동정된다.
실시예 16: 대사적 장애와 관련된 MIM의 식별
가능한 MIM으로서 후보물질 (예를 들어 환경적 영향인자)을 평가하기 위하여 질병 세포주 (암세포)와 정상 세포주를 포함하는 세포주 패널(panel)에 선택된 후보 MIM을 외적으로 첨가하였고, 각 패널의 각 세포주에 대한 세포성 미세환경적 프로파일을 유도하는 변화를 평가하였다. 세포의 형태학적, 생리학적 및 mRNA와 단백질 수준과 같은 세포 구성물에 대한 변화를 측정하였고 정상 세포주와 질병 세포주를 비교하였다.
후보 MIM에 대한 세포의 민감도(sensitivity)와 세포사멸적 반응을 측정함으로써 세포의 형태학적 및 생리학적 변화를 평가하였다. 본 시험은 예 3에서 기술된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 최소 1개의 대조군 세포주와 최소 1개의 암세포 세포주로 구성된 세포주 패널에 후보 MIM을 다양한 농도로 처리하였다. 가능한 MIM에 대한 세포주의 민감도는 여러 농도 범위에 걸쳐 여러 시간대별로 세포의 생존을 관찰하여 측정하였다. 가능한 MIM에 대한 세포주의 세포사멸 반응은 예를 들어 Nexin물질과 유세포분석기 (flow cytometry) 방법을 결합한 방법을 사용하여 측정하였다. Nexin물질은 2개의 염색제와 7AAD 및 Annexin-V-PE로 구성되어 있으며 세포사멸의 초기와 말기에서 세포의 수를 정량할 수 있다. 또다른 세포사멸 측정방법은 APOSTRNADTM ELISA 방법을 통해 단일가닥(single-strnaded) DNA를 측정하는 방법도 있다. 질병 세포주와 대조군 세포주의 민감도와 세포사멸성 반응도를 측정하고 비교하였다. 정상 세포에 비교해 질병 세포에서 차별된 세포독성이나 세포사멸적 반응을 유도하는 물질은 MIM으로 식별하였다.
후보 MIM을 처리한 후에 세포의 구성물질에 변화를 측정하였다. 실시간 PCR 어레이 방법을 통해 mRNA 수준의 유전자 발현 변화를 분석하였다. 이 실험은 상기 예 6과 예 9-13에서 설명된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 후보 MIM을 정상 대조군 세포주와 질병 세포주의 한 개 이상의 세포에 외적으로 추가하였고 처리 후 다양한 시간 대에서 mRNA를 세포로부터 추출하였다. 특정 기전에 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준은 세포사멸, 산화적 스트레스, 항산화 방어, 신생혈관생성, 열충격(heat shock) 혹은 당뇨병에 대한 어레이등을 포함하는 표적기전 (targeted pathway) 어레이를 이용하여 평가되었다. mRNA 전사수준이 2배 이상 변화된 유전자를 선별하여 분석하였다. 세포내 mRNA 수준의 변화를 유도하거나 정상 세포에 비해 질병 세포에서 한 개 이상의 mRNA 수준의 차별적 변화를 유도하는 물질을 MIM으로 식별하였다.
보완적 실험에서, 항체 마이크로어레이 방법과 2-D 겔 전기영동법을 사용하여 단백질 수준의 유전자 발현 변화를 분석하였고 질량분석법을 이용한 단백질 식별과 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 이러한 실험들은 예 7, 4 및 8에서 각기 설명된 방법처럼 수행되었다. 간략히 설명하면, 후보 MIM을 정상 대조군 세포주와 질병 세포주의 한 개 이상의 세포에 외적으로 추가하였고 처리 후 6시간째 혹은 24시간째와 같이 다양한 시간 대에서 용해성 단백질을 세포로부터 추출하였다. 다양한 범위의 단백질 종류와 가능한 기전 마커와 같은 700여개 이상의 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 항체어레이를 사용하여 후보 MIM에 의한 단백질의 수준변화를 평가하였다. 더 나아가 상호보완적인 단백질체학(proteomic) 분석을 2-D 겔 전기영동과 질량분석법을 이용하여 수행하였다. 후보 MIM을 정상 대조군 세포주와 질병 세포주의 한 개 이상의 세포에 외적으로 추가하였고 세포 덩어리를 용해하여 2-D 겔 전기영동에 사용하였다. 처리되지 않은 샘플인 대조군에 비해 처리받은 샘플에서 단백질 수준변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 증가 혹은 감소된 수준 혹은 단백질번역 후 번역(post-trnaslational modification)에 따른 처리시간에 따른 점의 변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 통계적으로 유의한 변화를 보이는 점을 절제하여 트립신을 사용해 분해하고 질량분석법을 통해 단백질을 식별하였다. 식별된 펩타이드를 단백질을 찾는 Mascot와 MSRAT 소프트웨어 분석과 같은 단백질 데이터베이스를 통해 검색하였다. 앞선 2-D 겔 전기영동과 항체 마이크로어레이 실험에 추가해서 후보 MIM에 의해 유도된 특정 단백질의 변화를 웨스턴 블롯을 통해 평가하였다. 이러한 모든 단백질체학 실험에서 다양한 세포주에서 발현이 증가되거나 감소되는 단백질을 식별하고 평가하였다. 세포내 단백질 수준의 변화를 유도하거나 정상 세포에 비해 질병 세포에서 한 개 이상의 단백질 수준의 차별적 변화를 유도하는 물질을 MIM으로 식별하였다.
앞선 실험에서 후보 MIM 처리에 의해 조절되는 유전자를 세포적 그리고 생화학적 기전을 통해 분석하였고 이들은 세포사멸, 암, 세포성장, 해당과정 및 대사, 분자적 이동 그리고 세포신호 등과 같은 다양한 세포적 기전으로 분류되었다.
후보 MIM이 세포내로 들어가는 것을 확인하고 세포내에서 국소적으로 위치하는지를 밝히고 세포내에 존재하는 수준과 형태를 밝히기 위해 실험을 수행하였다. 본 실험은 실시예 5에서 기술된 방법으로 진행하였다. 예를 들어, 미토콘드리아 내에 존재하는 후보 MIM의 수준과 형태를 밝히기 위해 후보 MIM을 처리한 세포로부터 분리한 미토콘드리아 농축 샘플(preparations)을 분석하였다. 외적으로 후보 MIM을 추가함에 따라 미토콘드리아 내 후보 MIM의 수준이 시간의존적이고 농도의존적으로 증가하는 것을 확인했다. 추가적으로 총 세포 단백질 샘플에 대해 기술된 것과 같이 2-D 겔 전기영동을 이용해 미토콘드리아 농축 샘플에서의 단백질 수준 변화를 분석하였고 질량분석법을 이용해 단백질 식별을 분석하였다. 세포내에 들어가 존재하고 미토콘드리아에 증가된 수준으로 존재하는 후보 MIM을 MIM으로 식별하였다. 평가하는 시간 동안에 세포에서 또는 예를 들면, 미토콘드리아에서의 후보 MIM의 수준은 예를 들면, 특정 단백질에 대한 mRNA와 단백질 수준의 조절과 같이 관찰된 세포적 변화와 밀접한 연관성이 있다.
mRNA 혹은 단백질 수준에서 유전자 발현과 같이 세포의 구성물의 변화를 유도하는 것으로 관찰된 후보 MIM을 MIM으로 식별하였다. 정상적인 상태와 비교하여 질병상태 (예를 들면, 당뇨병 또는 비만)에서 세포 형태, 생리 및 구성물 (mRNA 혹은 단백질 수준에서 유전자 발현의 차별된 변화)에서의 차별적 변화를 유도하는 것으로 관찰된 후보 MIM을 특히 다양한 특징을 가지고 있는 MIM으로 식별하였다. 후보 MIM이 치료적 효과뿐만 아니라 매개체 효과를 보여주기 때문에 세포 안으로 들어갈 수 있는 후보 MIM을 특히 다양한 특징을 가지고 있는 MIM으로 식별하였다.
실시예 17: 대사적 장애에 관련된 epi-전환인자로서의 CoQ10의 발견
대조군 세포주 (각질세포(keratinocyte)와 멜라닌세포(melanocyte)의 초대배양(primary culture))와 여러 피부암 세포주 (SK-MEL-28, 비전이성 피부 흑색종, SK-MEL-2, 전이성 피부 흑색종, SCC, 편평상피암(squamous cell carcinoma), PaCa2, 췌장암 세포주, HEP-G2, 간암 세포주)로 구성된 피부 세포주의 패널에 조효소 Q10을 처리하였다. 암세포주는 대조군 세포주와 비교하여 변화된 농도 의존적인 반응을 보였고 암세포에서만 세포사멸이 발생하였다. 예시적인 실험의 자세한 내용은 실시예 3에서 제시되었다.
어레이는 CoQ10을 상기 명시된 세포에 처리한 후에 mRNA와 단백질 수준이 변화하는 것을 측정하기 위해 사용되었다. mRNA 발현의 변화는 각 세포사멸, 산화적 스트레스와 산화방지제, 혈관생성 및 당뇨병에 특정화된 실시간 PCR 마이크로어레이 분석을 이용하여 분석하였다. 단백질 발현의 변화는 항체 마이크로어레이 분석과 웨스턴 블럿 (Western Blot) 분석을 이용하여 분석하였다. 이러한 분석 결과를 통해 조효소Q10에 의해 세포주에서 mRNA수준과 단백질 수준에서 유전자 발현에 유의한 변화가 발생하는 것을 보여주었다. 세포 대사과정에 관련된 것으로 알려진 많은 유전자가 CoQ10처리 결과 발현이 조절되는 것을 관찰하였다. 예를 들어, 핵수용체 단백질 HNF4A의 발현은 Q10처리 이후에 증가되었다. 트랜스알도라제1(TAL)의 발현도 역시 Q10처리 이후에 조절되었다. TAL은 NADPH와 반응적인 산소 중간체의 균형을 맞춤으로써 ATP합성과 세포의 생존에 매우 중요한 체크 포인트인 미토콘드리아 막안팎(trnas-membrnaed)의 전기적 포텐셜을 조절한다. 대사적 장애와 특별히 관련된 것으로서 당뇨병에 관련된 것으로 알려진 많은 유전자들이 Q10에 의해 조절되고 있음이 밝혀졌다. 예시적인 실험의 자세한 내용은 실시예 4, 6, 7, 8 및 9에서 제시되었다.
Q10은 에너지 생산을 위한 미토콘드리아 안에서의 산화성인산화반응 (oxidative phosphorylation) 프로세스에 필수적인 보조인자이다. 미토콘드리아 내부에 존재하는 조효소Q10의 형태와 수준은 CoQ10을 처리한 세포로부터 분리한 미토콘드리아 농축 샘플(preparations)을 분석하여 밝혔다. 외부에서 Q10을 추가함에 따라 미토콘드리아 내 조효소Q10의 수준이 시간의존적이고 농도의존적으로 증가하는 것을 확인했다. 대사적 그리고 세포사멸적 기전과 관련된 특정 단백질에 대한 mRNA 및 단백질 수준의 조절에서 관찰된 바와 같은 매우 다양한 세포적 변화들은 시간 진행과 밀접한 연관성이 있었다. 예시적인 실험의 자세한 내용은 실시예 5에서 제시되었다.
여기에 기술된 결과를 통해 내재적인 CoQ10을 epi-전환인자로 식별하였다. 특히 CoQ10이 세포내 대사적 상태를 이동시키고 부분적으로 미토콘드리아 기능을 복원시켰다. 여기에 기술된 데이터의 해석과 현재 알려진 내용을 바탕으로 위와 같이 결론내릴 수 있다.
Q10은 합성되어 미토콘드리아 내막 안으로 이동되고, 축적되며 사용되는 것으로 알려져 있다. Q10은 또한 미토콘드리아 내에서 에너지 생산을 하는 산화적 인산화반응에 필수적인 보조인자로 알려져 있다. 하지만, 정상세포의 미토콘드리아에서 피루브산(pyruvate)을 산화시킴으로써 에너지를 생산하는 것과는 달리 대부분의 암세포에서는 세포기질(cytosol) 내 젖산(lactic acid)의 발효에 따른 해당과정을 통해 대부분 에너지를 생산한다. 산화적 인산화반응은 전자전달체와 시토크롬C (cytochrome C)과 관련된다. 세포사멸은 세포사멸을 촉진하는 인자에 의한 미토콘드리아 막이 투과될 수 있도록 바뀌면서 미토콘드리아가 파열되는 것과 관련된다. 상이한 대사적 에너지 합성 기전을 이용함으로써 암세포는 세포의 이상에 대한 정상적인 세포사멸 반응을 완화시킬 수 있다. 이론에 얽매이지 않기 위하여, Applicants는 Q10이 산화적 인산화반응 기전 단백질의 발현을 증가시킴으로써 암을 유발하는 결함을 인지하고 세포사멸을 유발하는 상태로 미토콘드리아의 기능을 바꿔주는 기능을 한다고 제안한다. 따라서, Q10은 세포의 대사적 상태를 바꿈으로써 epi-전환인자로서의 역할을 한다
실시예 18: 대사적 장애에 관련된 epi-전환인자의 발견
대조군 세포주 (각질세포(keratinocyte)와 멜라닌세포(melanocyte)의 초대배양(primary culture))와 암세포주 (SK-MEL-28, 비전이성 피부 흑색종, SK-MEL-2, 전이성 피부 흑색종, SCC, 편평상피암(squamous cell carcinoma), PaCa2, 췌장암 세포주, HEP-G2, 간암 세포주)로 구성된 피부 세포주의 패널에 후보 epi-전환인자를 처리하였다. 후보 epi-전환인자에 대한 세포의 민감도(sensitivity)와 세포사멸적 반응을 측정함으로써 세포의 형태학적 및 생리학적 변화를 평가하였다. 본 시험은 예 3에서 기술된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 가능한 MIM에 대한 세포주의 민감도는 여러 농도 범위에 걸쳐 여러 시간대별로 세포의 생존을 관찰하여 측정하였다. 가능한 epi-전환인자에 대한 세포주의 세포사멸 반응은 예를 들어 Nexin물질과 유세포분석기 (flow cytometry) 방법을 결합한 방법을 사용하여 측정하였다. Nexin물질은 2개의 염색제와 7AAD 및 Annexin-V-PE로 구성되어 있으며 세포사멸의 초기와 말기에서 세포의 수를 정량할 수 있다. 또 다른 세포사멸 측정방법은 APOSTRNADTM ELISA 방법을 통해 단일가닥(single-strnaded) DNA를 측정하는 방법도 있다. 질병 세포주와 대조군 세포주의 민감도와 세포사멸성 반응도를 측정하고 비교하였다. 정상적인 혹은 대조군 세포와 비교해 암세포에서 후보 epi-전환인자가 우선적으로 혹은 선택적으로 세포의 성장을 억제하는 능력을 가졌는지 평가하였다. 추가적으로 정상적인 혹은 대조군 세포와 비교해 암세포에서 후보 epi-전환인자가 우선적으로 혹은 선택적으로 세포사멸을 유도하는 능력을 가졌는지 평가하였다.
후보 epi-전환인자를 처리한 후에 상기 식별된 세포의 mRNA와 단백질 수준에 변화가 있는지 알아보기 위해 분석하였다. 실시간 PCR 마이크로어레이 방법을 통해 mRNA 수준의 유전자 발현 변화를 분석하였다. 이 실험은 상기 예 6과 예 9-13에서 설명된 방법으로 수행되었다. 간략히 설명하면, 처리 후 다양한 시간 대에서 mRNA를 세포로부터 추출하였다. 특정 기전에 관련된 유전자의 mRNA 발현 수준은 세포사멸, 산화적 스트레스, 항산화 방어, 신생혈관생성, 열충격(heat shock) 혹은 당뇨병에 대한 어레이등을 포함하는 표적기전 (targeted pathway) 어레이를 이용하여 평가되었다. mRNA 전사수준이 2배 이상 변화된 유전자를 선별하여 분석하였다.
항체 마이크로어레이 방법과 질량분석법과 연결된 2-D 겔 전기영동법 및 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현의 변화를 분석하였다. 이러한 실험들은 실시예 7, 4 및 8에서 각기 설명된 방법처럼 수행되었다. 간략히 설명하면, 후보 epi-전환인자 처리 후 6시간째 혹은 24시간째와 같이 다양한 시간 대에서 용해성 단백질을 세포로부터 추출하였다. 다양한 범위의 단백질 종류와 가능한 기전 마커와 같은 700여개 이상의 단백질에 대한 항체를 포함하고 있는 항체 어레이를 사용하여 후보 epi-전환인자에 의한 단백질의 수준변화를 평가하였다. 더 나아가 상호보완적인 단백질체학(proteomic) 분석을 2-D 겔 전기영동과 질량분석법을 이용하여 수행하였다. 후보 epi-전환인자를 세포주에 외적으로 추가하였고 세포 덩어리를 용해하여 2-D 겔 전기영동에 사용하였다. 처리되지 않은 샘플인 대조군에 비해 처리받은 샘플에서 단백질 수준변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 증가 혹은 감소된 수준 혹은 단백질번역 후 번역(post-trnaslational modification)에 따른 처리시간에 따른 점의 변화를 식별하기 위해 겔을 분석하였다. 통계적으로 유의한 변화를 보이는 점을 절제하여 트립신을 사용해 분해하고 질량분석법을 통해 단백질을 식별하였다. 식별된 펩타이드를 단백질을 찾는 Mascot와 MSRAT 소프트웨어 분석과 같은 단백질 데이터베이스를 통해 검색하였다. 앞선 2-D 겔 전기영동과 항체 마이크로어레이 실험에 추가해서 후보 MIM 에 의해 유도된 특정 단백질의 변화를 웨스턴 블롯을 통해 평가하였다. 이러한 모든 단백질체학 실험에서 다양한 세포주에서 발현이 증가되거나 감소되는 단백질을 식별하고 평가하였다.
후보 epi-전환인자를 추가함에 따라 세포주에서 mRNA 및 단백질 수준에서 유전자 발현에 변화에 근거하여 후보 epi-전환인자를 평가한다. 특히 후보 epi-전환인자가 세포적 대사과정에 관련된 것으로 알려진 유전자를 조절하는 능력이 있는지 평가한다. 대사적 장애와 특별히 관련된 것으로서 후보 epi-전환인자가, 예를 들면, 당뇨병 또는 비만에 관련된 것으로 알려진 유전자를 조절하는 능력이 있는지 평가하였다.
세포내 혹은 특정 세포내 위치에 후보 epi-전환인자의 수준과 형태를 알아보기 위해 기술자에게 알려진 방법을 이용하였다. 예를 들어, 여러 시간과 다양한 농도에 있어 미토콘리드아에서 후보 epi-전환인자의 수준을 알아보기 위해 후보 epi-전환인자를 처리한 세포로부터 미토콘드리아 농축 샘플을 준비하여 분석하였다. 여러 시간대의 후보 epi-전환인자의 수준을 대사적 그리고 세포사멸적 기전에 관계된 특정 단백질에 대한 mRNA와 단백질 수준의 조절과 같이 관찰된 다른 세포적 변화와 비교하고 상관성이 있을 수 있다.
선행 실험에서 얻은 결과에 근거하여 세포의 대사적 상태를 변화시키는 것으로 관찰된 후보 epi-전환인자를 epi-전환인자로 식별하였다. 예를 들어, 세포에서 인슐린-자극 글루코스 흡수를 증진, 증가 또는 증강시키는 후보 epi-전환인자를 epi-전환인자로 식별하였다.
실시예 19: epi-전환인자로서의 비타민 D3의 발견
비타민 D3 혹은 1α, 25-디히드록시비타민 D3 (혹은 칼리스티올로도 알려짐)는 2단계 효소적 과정에 의해 비타민D로부터 합성되는 비타민D의 대사체이다. 비타민 D3는 어디에나 존재하는 핵 비타민D 수용체 (VDR)과 상호작용하여 칼슘과 인산염의 항상성(homeostasis) 및 세포의 분열과 분화에 관련된 다양한 유전자의 전사를 조절한다. 비타민 D3는 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 전린선암종(prostate adenocarcinoma), 난소암, 유방암 및 폐암 등과 같은 다양한 모델 시스템에서 항암성 효과가 있다고 알려져 있다 (reviewed in Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700).
비타민 D3의 항암효과는 세포주기의 G1단계에서 성장중단, 세포사멸, 종양세포의 분화, 성장인자을 통한 세포의 생존신호의 파괴 및 신생혈관생성과 세포부착의 억제 등과 같은 다양한 메커니즘에 관련되어 있다고 보고되었다 (reviewed in Deeb et al. 2007 Nature Reviews Cancer 7:684-700). 예를 들어, 세포사멸에 대하여 비타민 D3는 항-세포사멸 단백질 BCL2와 생존촉진 단백질 BCL-XL의 발현을 억제하거나 세포사멸을 촉진하는 단백질 (예를 들면, BAX, BAK 및 BAD)의 발현을 유도하는 것과 같이 세포사멸의 중요 매개체를 조절함으로써 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Deeb et al. 2007). 추가적인 예로는, 신생혈관생성에 대하여 비타민 D3는 어떠한 종양유래 내피세포의 증식을 억제하고 종양의 신생혈관생성을 유도하는 혈관내피세포성장인자 (VEGF)의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다 (reviewed in Masuda and Jones, 2006 Mol. Cancer Ther. 5(4): 797-8070). 또 다른 예로는, 세포주기의 중단에 대하여 비타민 D3는 G1단계에서의 중단을 유도하는데 중요하다고 알려진 사이클린 의존적 키나제 억제제 (cyclin-dependent kinase inhibitor) p21WAFI/CIPI의 유전자 전사를 유도하고 사이클린 의존적 키나제 억제제 (cyclin-dependent kinase inhibitor) p21WAFI/CIPI 단백질을 합성이나 안정화를 유도하는 것으로 알려져 있다 (Deeb et al. 2007).
선행 관찰에 근거하여 세포의 대사적 상태를 바꿀 수 있는 능력을 가진 비타민 D3를 epi-전환인자로 식별하였다. 비타민 D3는 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 능력이 있으며 특히 세포의 성장을 차별적으로 억제할 수 있으며 정상 세포에 비교해 질병(암) 세포에서 세포사멸적 반응을 유도할 수 있는 능력에 비추어 epi-전환인자로 식별하였다. (즉 정상세포에 비교해 암세포에서 세포사멸에 관련된 BCL-2, BCL-XL, 그리고 BAX 등과 같은 단백질의 발현을 차별적으로 조절함)
실시예 20: 주요 단백질의 요약
이전의 실시예에 기재된 실험 결과를 기준으로 Q10에 의해 조절된 주요 단백질은 하기 표에 요약한다.
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실시예 21: 조효소 Q10으로 처리한 세포의 웨스턴 분석
지난 50년이 넘는 기간 동안 내인성/외인성 인자가 악성세포로 전환의 근본적 원인과 같은 특정 과정에 영향을 준다고 암시하는 방대한 양의 정보가 만들어졌다. 임상과 기초 논문에서 암을 유전적 질병으로 정의하면서, DNA 구조와 기능의 변화가 암 발생과 진행에 중요한 역할을 한다는 증거를 제공했다(Wooster, 2010; Haiman, 2010). 1920년대 초기에 암 생성 병인에서의 근본적이 변화를 특성화 분석하는 작업에 관련된 Otto Warburg와 다른 연구자들은 두 개의 주요 관찰결과를 설명했다. (a) 산소 존재 하에 에너지 발생을 위한 ATP생성 과정에서 당을 운반하고 이용하는 세포의 능력- 바르버그 효과(Warburg Effect)로도 알려진 (b) 미토콘드리아 구조와 기능의 변화 - 미토콘드리아 ATP 생성 감소를 일으키는 전자 전달에서의 변화를 포함. 암을 대사적 장애로 보는 것과 같이 지난 몇 년간 암 병인에서 세포 생물에너지학의 중심역할에 대한 연구가 부활되었다.
역사상, 유전자에서 돌연변이로 인해 세포 발현이 변화된다고 생각되어왔지만, 후성적 과정이 암 발생에서의 유전자 발현에 큰 영향을 주는 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침하는 문헌이 점점 쌓여가고 있다. 이것은 대부분 유전자에서 돌연변이 비율이 낮고 암세포에서 발생되는 많은(광범위한) 돌연변이를 일으킬 수 없다는 관찰을 통해 입증되었다. 후성적 변화는 메틸화와 히스톤 테일의 변형에 의해 조절되고, 두 가지 변화 모두 히스톤 아세틸화(ref)에 아세틸 CoA가 요구되는 것과 같이 보조인자를 필요로 하기 때문에 세포의 에너지(영양) 상태와 선천적으로 관련이 있다. 아세틸 CoA의 생합성은 세포내 에너지 상태를 유전자 발현과 활성의 조절에 직접 연결하면서 해당과정과 크렙 사이클에 의존한다.
정상 세포에서, 미토콘드리아 산화적 인산화는 정상 생리활성과 세포 생존을 유지하는데 요구되는 에너지를 충족시키기 위해 충분한 ATP를 생성한다. 미토콘드리아 에너지 생성의 결과로 미토콘드리아에 손상을 주는 정상적이지 않은 생성, 활성 산소종(ROS)이 발생된다(refs). 미토콘드리아에 의한 만성 ROS 발생이 유전자 돌연변이를 누적증가를 일으킨다는 사실이 잘 정립되어 있고 이러한 현상은 암 발생의 병인으로 암시되어왔다. 암세포가 ROS 발생을 최소화하기 위해 미토콘드리아 호흡을 감소시키고 에너지 생성을 지속하기 위해 미토콘드리아 호흡을 해당과정으로 바꾼다고 암시되어 왔다. 그러므로, 산화적 인산화로부터 해당과정으로 에너지 발생을 점차 변화시키는 것은 세포에서 에너지 발생과 생리적 기능을 유지하는데 본질적이고 정상세포 표현형으로부터 암세포 표현형으로의 진행에 연관될 수 있다. 세포 에너지(생물 에너지학) 프로파일과 미토콘드리아 유전자 구성에서 축적된 변이(돌연변이)의 점진적 변화는 세포 대사체를 바꾼다. 미토콘드리아 인산화의 해당작용으로 전이의 결과와 같은 전체 세포 대사체 프로파일에서의 변화는 비정상적 생물 에너지에서 유도된 대사체 프로파일과 일치하고 암 발생을 뒷받침하는 근본적 원인이다. 비-암성 정상 미토콘드리아 산화적 인산화에 연관된 세포 생물 에너지학적 상태로 세포 대사체 변화를 이끌어내기 위해 내인성 분자를 이용한 표적 개입은 암 치료의 치료적 변수에 해당한다.
Epi-대사체 변화를 야기하는 MIM으로서의 조효소 Q10
여기에 있는 자료는 조효소 Q10으로의 정상세포와 암세포 치료가 해당작용-미토콘드리아 산화 스트레스 연속체 내에서 핵심 생화학적 말단을 조절하는 단백질 발현에서의 변화와 연관이 있음을 입증한다. 웨스턴 블롯을 통한 단백질 발현과 산소 소비율 평가를 설명하는 자료의 조합은 정상세포에서 조효소 Q10에 노출된 후에 정상 해당작용과 미토콘드리아 호흡률에 큰 변화가 없었다고 밝혔다. 따라서, HDFa(정상 인간 성체 섬유아세포), HASMC(정상 인간 대동맥 평활근 세포), nFib(정상 섬유아세포), HeKa (정상 인간 각질세포)와 같은 정상 세포주에서 단백질 발현과 미토콘드리아 호흡률 수치가 기저 생리상태를 대표한다고 생각될 수 있다. HepG2 (간암), PaCa-2 (췌장암), MCF7 (유방암), SK-MEL (흑색종), SCC-25 (편평세포암)과 같은 암세포 세포주에서 단백질 발현과 미토콘드리아 호흡률의 어떠한 일탈은 이 경우엔 암인 질병의 시작/진행에 따른 변화를 대표한다. 실험적 증거가 암세포로의 조효소 Q10 노출이 정상세포를 연상시키는 세포 병리생리학적 개편과 연관 있다는 가설을 뒷받침 한다. 세부적으로, 여기에서 제공된 자료는 암세포에서 조효소 Q10 노출이 정상 세포에서 관찰된 해당경로와 미토콘드리아 산화적 인산화에서의 변화와 연관 있음을 입증하고, 그러한 정상세포에서 관찰된 변화는 세포 구조의 전반적 개편을 유도한다.
정상세포에서, 해당과정 산물의 변수는 미토콘드리아 산화적 인산화(OXPHOS), 예. 미토콘드리아 OXPHOS를 통해 ATP를 생성하고 이에 필요한 환원 당량을 생성하기 위한 크렙스 회로(트리카복실산 회로, TCA, 또는 구연산 회로)에 들어가기 위해 해당경로를 통한 당에서의 피루브산 발생과 연결되어 있다. 그러므로, 정상세포에서 해당과정에 연관된 유전자 산물의 발현과 기능적 지향은 피루브산의 적절한 생성과 크렙스 회로로 피루브산의 유입에 대해 준비된다. 암세포에서의 해당작용과 크렙스 회로에 관여하는 중요 단백질의 잘 조절되지 않은 발현과 기능이 해당작용을 증가시키고 미토콘드리아 기능을 현저히 저하시킨다. 미토콘드리아 호흡사슬에 선택적으로 영향을 주는 내인성 분자인 조효소 Q10에 대한 암세포의 노출은 미토콘드리아에서 에너지 생산(즉, ATP 생성)을 회복시키는 것과 같은 생물 에너지학적 변화를 촉진시키기 위해 해당작용과 크렙스 회로의 단백질 발현을 변화시킨다(정상화시킨다).
실험방법
웨스턴 블롯 실험 1
실험에 사용된 세포는 HDFa와 MCF-7 이었고 조효소 Q10 두 농도, 50μM과 100μM 로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 후 채취되었다. 전체 세포 응집체는 C7 완충액 1mL에 차례로 재부유되었고, 라벨된 15mL 시험관으로 옮겨졌다. 샘플은 얼음이 있는 저온 실험실에서 14번 세팅의 6초음파 펄스를 이용하여 초음파처리되었다. 샘플은 초음파 후 짧은 시간 동안 2500g까지 회전시켜졌고 2ml 시험관에 옮겨 닮아졌다. 50mL 샘플 시험관에 남아있는 거품을 이용하여 각 샘플의 pH(pH는 9.0이 되어야 함)가 측정되었다.
1M 아크릴아미드 10 μl, 트리부틸포스펜 25 μl를 추가하고 90분 동안 간헐적으로 저으면서 항온처리하여 각 샘플의 알킬화와 환원이 수행되었다. 항온처리한 후, 1M DTT 10μl이 추가되고 시험관은 20도에서 10분 동안 20,000g로 회전시키고 상층액을 라벨된 Amicon Ultra 원심분리기 필터 단위 10 k 컷 오프 (Millipore catalog # UFC 801024)로 옮겼다. 샘플은 2500g에서 15분 동안 2 간격으로 회전시켰다. 전도도 측정기를 이용하여 샘플과 챕스에 대한 전도도를 측정하였다. 샘플의 전도도가 높으면, 완충액 교환을 위해 1ml 챕스(chaps)가 추가되었고 다시 2500g에서 부피가 250μl이 될 때까지 회전시켰다. 전도도가 200이거나 그 이하일 때는 샘플은 5분 간격으로 2500g에서 상층액의 부피가 150-100μl 사이가 될 때까지 회전시켜졌다. 샘플의 상층액은 에펜도르프 튜브에 옮겨졌고 BSA를 표준물질로 하여 Bradford 분석이 수행되었다.
샘플은 위에 명시된 표준 프로토콜 대로 처리되었고 각 샘플에 있는 단백질의 양이 Bradford 분석법을 이용하여 측정되었다. 단백질 10μg과 동일한 세포 부피가 아래 있는 것처럼 라멜리 로딩 염료 (LDS)와 함께 준비되었고 MilliQ water(MilliQ 수)가 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔 (Invitrogen, cat # NP0323Box)에 쓰였다.
겔은 200V에서 NOVEX Xcell Surelock 시스템과 1X MOPS 완충액을 이용하여 50분 동안 수행되었다. 그 후 겔은 한 시간 동안 NOVEX Xcell 슈어록 웨트(Surelock wet) 트랜스퍼 프로토콜을 이용하여 30V에서 이동되었다. 블롯은 인비트로젠으로부터의 심플리 블루 세이프테인(LC6065)으로 염색되었다.
HDFa와 MCF-7 샘플에서 IDH1과 ATP 시트르산 분해효소 수준
이동 후, 각 블롯을 2개의 와트만 필터 페이퍼 사이에 놓이도록 하고 15-20분간 건조시켰다. 건조 후 HB 연필을 사용하여 블롯에 날짜, 샘플 종류, 블롯1 또는 블롯2가 라벨되었다. 분자량 마커는 연필로 윤곽을 그렸고 파란색 마커는 한줄로 색깔있는 마커는 두줄로 표시하였다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었다. 4℃에서 밤새 흔들면서 항온처리함으로써 블롯 1은 5% BSA(1:1000 희석) TBST안에서 IDH1(Cell Signaling # 3997)에 대한 일차 항체로 탐침되었고 블롯 2는 1:1000 희석된 5% BSA(Cell Signaling #4332) 안에서 ATP 시트르산 분해효소에 대한 토끼 다클론 항체로 탐침되었다. 일차 항체와 함께 밤새 항온처리한 후, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한시간 뒤에, 블롯은 TBS-T( 각각 1X-15' ; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HDFa와 MCF-7 샘플에서의 액틴 수준
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양하고 TBS-T로 10분간 두번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척하여 박리되었다. 두 개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:5000으로 희석된 5% BSA(Sigma catalog # A5316, clone AC-74)에서 액틴에 대한 항체로 실온에서 흔들면서 한 시간 동안 탐침되었다. 액틴에 대한 일차 항체로 한 시간 동안 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 시한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 2
실험에 사용된 세포는 SKMEL28, SCC-25, nFib, Heka이었고 조효소 Q10 두 농도, 50 μM과 100 μM 로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 3, 6 및/또는 24시간 후 채취되었다. 샘플은 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔에서 위에서 설명된 것과 같이 처리되고 시험되었다. 겔은 위에서 설명된 것처럼 작동되고, 이동되고 염색되었다.
4개의 세포주에 대한 IDH1 수준
이동 후 블롯이 15-20분간 건조되었고, 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5' 로 3회 세척되었다. 그 후 4℃에서 밤새 흔들면서 항온처리함으로써 블롯은 5% BSA(1:1000 희석) TBST안에서 IDH1(Cell Signaling # 3997)에 대한 일차 항체로 탐침되었다. IDH1에 대한일차 항체와 함께 밤새 항온처리한 후, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
4개 세포주에서 ATP 시트르산 분해효소 수준
이소시트르산 데하이드로게나제 블롯은 메탄올로 30분간 배양하고 TBS-T로 10분간 두번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었으며 1:1000으로 희석된 5% BSA (Cell Signaling #4332)에서 ATP 시트르산 분해효소에 대한 항체로 4℃에서 흔들면서 한 시간 동안 탐침되었다. ATP 시트르산 분해효소에 대한 일차 항체로 한 시간 동안 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
4개의 각기 다른 세포주에서 액틴 수준
ATP 시트르산 용해요소 블롯은 메탄올로 30분간 배양하고 TBS-T로 10분간 두번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:5000으로 희석된 5% BSA (Sigma catalog # A5316, clone AC-74)에서 액틴에 대한 항체로 실온에서 흔들면서 한 시간 동안 탐침되었다. 액틴에 대한 일차 항체로 한 시간 동안 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 3
실험에 사용된 세포는 HepG2, HASMC, PACA2 이었고 조효소 Q10 두 농도(50μM과 100μM)로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 48시간 후 채취되었다. 본 실험(웨스턴 블롯 실험 3)과 이 예에서 아래 설명된 모든 실험(웨스턴 블롯 실험 4-9)에서, 세포는 5mM 당("5G") 또는 22mM 당("22G") 중 하나에 추가적으로 처리되었다. 세포에서 유래된 샘플은 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔에서 위에서 설명된 것과 같이 처리되고 시험되었다. 겔은 위에서 설명된 것처럼 작동되고, 이동되고 염색되었다.
HASMC 대 PACA2 와 HepG2에서 IDH1, ATP시트레이트 리아제, 액틴 수준
IDH1, ATP 시트르산 용해요소, 액틴 수준은 위에 설명된 것처럼 블롯을 IDH1, ATP 시트르산 용해요소, 액틴에 대한 일차 항체로 탐침함으로써 확인되었다.
웨스턴 블롯 실험 4
본 실험에 사용된 세포는 HepG2이고 조효소 Q10 두 농도, 50μM와 100μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 샘플은 4-12% Bis-Tris Novex NuPAGE 겔에서 위에서 설명된 것과 같이 처리되고 시험되었다. 겔은 위에서 설명된 것처럼 작동되고, 이동되고 염색되었다.
HepG2 세포에서 젖산 데하이드로게나제 수준
이동 후 블롯이 15-20분간 건조되었고, 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 그 후 4℃에서 밤새 흔들면서 항온처리함으로써 블롯은 5% BSA(1:1000 희석)에서 젖산 데하이드로게나제(abcam ab2101; 다클론)에 대한 일차 항체로 탐침되었다. 젖산 데하이드로게나제에 대한 일차 항체와 함께 밤새 항온처리한 후, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(토끼의 항염소; 1:10,000 희석)로 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HepG2 세포에서 피루베이트 키나제 근육형(PKM2) 수준
젖산 데하이드로게나제 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 2개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:500으로 희석된 5% BSA (NOVUS BIOLOGICALS catalog # H00005315-D01P)에서 피루브산 키나제 M2에 대한 토끼 다클론 항체로 4℃에서 흔들면서 탐침되었다. 피루브산 키나제 M2에 대한 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HepG2 세포에서 피루브산 데하이드로게나제 베타 수준
피루브산 키나제 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 2개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 항체의 박리와 ECF 시약이 효과가 있었음을 확인한 후, 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:500으로 희석된 5% BSA (ABNOVA catalog # H00005162-M03)에서 피루베이트 데하이드로게나제에 대한 토끼 항체로 4℃에서 흔들면서 밤새 탐침되었다. 피루브산 데하이드로게나제에 대한 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
HepG2 세포에서 액틴 수준
피루베이트 데하이드로게나제 블롯은 박리된 후 위에 설명된 것처럼 액틴으로 재탐침되었다.
웨스턴 블롯 실험 5
본 실험에 사용된 세포는 MIAPACA2 (PACA2) 이고 조효소 Q10 두 농도, 50 μM와 100μM 로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 PACA2 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
PaCa2 세포에서 락테이트 데하이드로게나제(LDH)와 피루베이트 데하이드로게나제(PDH) 수준
LDH와 PDH 수준은 위에 설명된 것과 같이 LDH와 PDH에 대한 일차 항체로 블롯을 성공적으로 탐침함으로써 측정되었다.
PaCa2 세포에서 카스파아제3 수준
블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 2개의 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었으며 1:200으로 희석된 5% BSA (Santacruz Biotechnology # sc7272)에서 카스파아제 3에 대한 항체로 4℃에서 흔들면서 밤새 탐침되었다. 카스파아제 3 대한 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 이차 항체(항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 한 시간 동안 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 6
본 웨스턴 블롯 실험에 사용된 세포는 PC-3, HepG2, MCF-7, HDFa, PACA2 이고 조효소 Q10 IV 제조법으로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
각기 다른 세포종류에서 카스파아제3과 액틴 수준
카스파아제3과 액틴의 수준은 위에 설명된 것과 같이 카스파아제3과 액틴에 대한 일차 항체로 블롯을 성공적으로 탐침함으로써 측정되었다.
웨스턴 블롯 실험 7
본 웨스턴 블롯 실험에 사용된 세포는 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)이고 조효소 Q10 두 농도, 50 μM 또는 100 μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 HASMC 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
액틴에 대한 시험 프로토콜:
액틴 수준은 위에 설명된 것처럼 블롯을 액틴에 대한 일차 항체로 탐침하여 측정하였다.
Hif 1 알파, 카스파아제3, PDHB에 대한 실험 프로토콜:
액틴 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:200으로 희석된 5% BSA 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리)에서 Hif 1 알파, 카스파아제 3 또는 PDHB 에 대한 항체로 탐침되었다. Hif 1알파(Abcam ab2185; 항토끼)에 대한 일차 항체는 5% BSA에 1:500으로 희석되어 있었다. 카스파아제 3(Santacruz sc7272; 항토끼)에 대한 일차 항체는 5% BSA에 1:200으로 희석되어 있었다. 피루베이트 데하이드로게나제 베타(PDHB)( Novus Biologicals H00005162-M03; 항마우스)에 대한 일차 항체는 5% BSA에 1:500으로 희석되어 있었다. 일차 항체로 밤새 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (PDHB 항마우스; Hif 1a과 카스파아제 3 항토끼:10,000 희석)로 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
PKM2, SDHB 및 SDHC에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5'로 3회 세척되었으며 1:200으로 희석된 5% BSA 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 PKM2, SDHB 또는 SDHC에 대한 항체로 탐침되었다. SDHC(ABNOVA H00006391-M02; 항마우스)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되어 있었다. SDHB에 대한 일차 항체는 Abcam ab4714-200; 항마우스; 1:1000 희석에서 얻었다. 피루브산 키나제 M2(PKM2)에 대한 일차 항체는 Novus Biologicals H00005315-D0IP; 항토끼; 1:500 희석에서 얻었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (PDHB 항마우스; Hif 1a과 카스파아제 3 항토끼:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 이차 항체로 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
LDH 및 Bik에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15' 2X5')로 3회 세척되었으며 TBS-T에 있는 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 LDH 또는 Bik에 대한 항체로 탐침되었다. LDH에 대한 일차 항체는 Abcam ab2101; 항염소; 1:1000 희석에서 얻었다. Bik에 대한 일차 항체는 Cell Signaling #9942; 항토끼; 1:1000 희석에서 얻었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (LDH 항염소; Jackson Laboratories) 와 Bik 항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
웨스턴 블롯 실험 9
사용된 세포는 HepG2이고 조효소 Q10 두 농도, 50 μM 또는 100 μM로 처리되거나 되지 않았으며, 처리 24시간 또는 48시간 후 채취되었다. 위에서 설명된 것과 같이 HepG2 샘플은 처리되었고 겔은 작동되고, 이동되고 염색되고 스캔되었다.
액틴에 대한 실험 프로토콜:
액틴 수준은 위에 설명된 것처럼 블롯을 액틴에 대한 일차 항체로 탐침하여 측정하였다.
카스파아제3과 MMP-6에 대한 실험 프로토콜:
액틴 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 카스파아제3 또는 MMP-6에 대한 항체로 탐침되었다. 카스파아제(Abcam ab44976-100; 항토끼)에 대한 일차 항체는 5% BSA에서 1:500으로 희석되었다. MMP-6(Santacruz scMM0029-ZB5; 항마우스)에 대한 일차 항체는 5% BSA에서 1:100으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (MMP-6 항마우스; 카스파아제 3 항토끼; 1:10,000희석)로 탐침되었다. 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
LDH에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA 또는 5% 우유에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 LDH에 대한 항체로 탐침되었다. LDH 080309b1 (Abcam ab2101; 항염소)에 대한 일차 항체는 5% 우유에서 1:1000으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (Jackson Immuno Research 항염소; 1:10,000 희석; 305-055-045)로 탐침되었다. 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
트랜스알돌라아제와 Hif1a에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 트랜스알돌라아제 또는 Hif1a에 대한 항체로 탐침되었다. 트랜스알돌라아제 (Abcam ab67467; 항마우스)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되었다. Hif1a (Abcam ab2185; 항토끼)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (항마우스 또는 항토끼; 1:10,000 희석)로 탐침되었다. 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
IGFBP3과 TP53에 대한 실험:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 IGFBP3 또는 TP53에 대한 항체로 탐침되었다. IGFBP3 (Abcam ab76001; 항토끼)에 대한 일차 항체는 1:100으로 희석되었다. TP53 (Sigma Aldrich AV02055; 항염소)에 대한 일차 항체는 1:100으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (항토끼; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
트랜스알돌라아제와 PDHB에 대한 실험 프로토콜:
상기 블롯은 메탄올로 30분간 배양되고 TBS-T로 10분간 두 번 세척되었고 50℃에서 스트리핑 완충액으로 30분간 항온처리하였으며 100ml 또는 그 이상의 TBS-T로 각각 30분간 2회 세척함으로써 박리되었다. 블롯은 레이저 스캐너에서 완전 스트리핑 되었는지 확인하기 위해 스캔되었다. 블롯은 5초간 메탄올로 활성화되었고, 물로 5분, TBST로 15분간 세척되었다. 블롯은 실온에서 TBS-T 내 5% 차단시약으로 한 시간 동안 차단되었고 그 후 실온에서 TBS-T(각각 1X-15'2X5'로 3회 세척되었으며 5% BSA에서 부드럽게 흔들며 밤새 4℃에서 항온처리함으로써 트랜스알돌라아제 또는 PDHB에 대한 항체로 탐침되었다. 트랜스알돌라아제 (Santacruz sc51440; 항염소)에 대한 일차 항체는 1:200으로 희석되었다. PDHB (Novus Biologicals H00005162-M03; 항마우스)에 대한 일차 항체는 1:500으로 희석되었다. 일차 항체로 배양된 후, 막은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 실온에서 1시간 동안 이차 항체 (항염소 또는 항마우스; 1:10,000 희석)로 진탕기(orbital tilting shaker)에서 탐침되었다. 항온처리한지 한 시간 뒤에, 블롯은 TBS-T(각각 1X-15'; 2X 5')로 3회 세척되었고 그 후 ECF 시액으로 5분간 배양되었으며 그 후 각 블롯은 25μM 해상도, 16비트, 그린 레이저, 400V와 500V에서 5100 후지 레이저 스캐너로 스캔되었다.
결론:
이소시트르산 데하이드로게나제-1 (IDH-1)
이소시트르산 데하이드로게나제는 미토콘드리아 기질 내에서 주로 일어나는 TCA 회로 포함된 효소 중 하나이다. 그러나 IDH1은 이소시트르산의 알파-케토글루타레이트로의 산화적 탈탄산 반응을 촉매하는 효소의 시토졸 형태이고 두단계 과정에서 이산화탄소를 발생한다. IDH1은 시토졸과 퍼옥시좀에 존재하는 NADP+ 의존적 형태이다. IDH1은 Ser113 인산화에의해 불활성화 되고 시트르산 회로가 없는 종들을 포함해서 많은 종에서 발현된다. IDH1은 정상적으로 종양 억제자 기능을 하고, IDH1이 불활성화 되면 HIF-1 회로(Bayley 2010; Reitman, 2010)의 활성화를 통해 암 발생에 부분적으로 기여한다. 최근의 연구에서 교모세포종의 병인에서 IDH1의 불활성화 돌연변이가 연루되었음을 보여주었다(Bleeker, 2009; Bleeker, 2010)
조효소 Q10으로의 처리는 MCF-7, SKMEL28, HepG2, PaCa-2 세포를 포함한 암세포주에서 IDH1의 발현을 증가시켰다. SCC25 세포주에서는 발현이 중간 정도로 증가하였다. 일차 인간유래 섬유아세포 HDFa, nFIB와 인간 대동맥 평활근 세포 HASMC의 대조배양에서 조효소 Q10에 대한 반응으로 IDH1의 발현 패턴이 유의하게 변화함을 입증하지 못했다. 알파-케토글루타레이트(알파-KG)는 TCA 회로의 중요한 중간체이고, 이소시트르산으로부터 생화학적으로 합성되며 최종적으로 숙시닐 CoA로 변환되며 약물이 될 가능성이 있는 MIM이고 epi-전환인자이다. 알파-KG는 세포에 의해 회로의 중간체를 보충하는 데 사용될 수 있고 따라서 산화적 인산화를 증가시키기 위한 환원당량을 생성시킬 수 있기 때문에 알파-KG의 발생은 TCA 회로에서 중대한 시점으로의 역할을 한다. 따라서, 조효소 Q10 매게된 IDH1 발현의 증가는 중간체 형성을 야기하고 이것은 미토콘드리아 TCA 회로에 암세포에서 산화적 인산화를 증가시키는데 사용될 수 있다. 실험의 결과는 아래 표 30-32에 요약되어 있다.
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
ATP 시트레이트 리아제(ACL)
ATP 시트레이트 리아제(ACL)는 호모테트라머(~126kd) 효소이고 시토졸에서 아세틸 CoA와 옥살아세테이트 형성을 촉매한다. 이 반응은 지방산, 콜레스테롤, 아세틸콜린 생합성과 당 생성작용에서 매우 중요한 첫 단계이다(Towle et al., 1997). 영양소와 호르몬이 이 중요 효소의 발현 수준과 인산화 상태를 조절한다. Akt와 PKA에 의한 ACL의 Ser454 인산화가 보고되었다(Berwick., DC MW et al., 2002; Pierce MW et al., 1982).
이 자료는 정상세포와 암세포에서 ATP 시트레이트 리아제에 대한 조효소 Q10의 효과가 있다고 설명한다. 이와 일관되게 암세포에서 용량의존적 ACL 효소 발현의 감소가 관찰되었다. 이와 대조적으로 정상세포에서 ACL 발현은 증가하는 경향을 보였다. 시토졸 ACL은 성장인자 자극과 분화 중에 세포에서 히스톤 아세틸화에 필수적이라고 밝혀졌다. ACL이 종양의 과정에서 중요한 과정인 시토졸 당에서 나온 시트르산을 히스톤 아세틸화에 필수적인 아세틸 CoA를 만들기 위해 이용한다는 사실은 조효소 Q10에 의해 유도된 ACL 발현이 암세포 기능에 영향을 미친다는 것을 설명한다. 시토졸 ACL에 의해 시트르산에서 생성된 아세틸 CoA는 세포 분열 중 새로운 지방과 콜레스테롤의 생합성을 위한 근원물질로서 작용한다. 따라서, 조효소 Q10이 유도한 ACL 발현의 변화는 아세틸 CoA가 정상세포 대 암세포에서 지방과 콜레스테롤 생합성하는 능력을 변화시킨다. 실험의 결과는 아래 표 33-36에 요약되어 있다.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
피루브산 키나제 M2 (PKM2)
피루브산 키나제는 해당경로에 연관된 효소이다. 이 효소는 ATP와 피루브산을 생성하기 위해 인산을 포스포이놀피루베이트(PEP)에서 이인산 아데노신 (ADP)로 운반하는 역할을 한다. PKM2는 해당 피루브산 키나제의 동위효소이고, 이 효소의 발현은 조직의 대사 가능에 의해 특성화된다. 예를 들어 M2 동위효소는 배아세포와 같이 고 에너지를 필요로 하면서 정상적으로 빠르게 증식하는 세포에서 발현되고 폐와 빠른 속도의 핵산 합성을 요하는 또한 췌장도세포와 같이 정상 분화되는 소수의 조직에서 발견된다. PKM2는 세포의 에너지 필요를 충족하기 위한 해당경로에의 의존에 의해 암세포에서 상당히 많이 발현된다. 배아에서는 제한되어있다고 생각되는 PKM2 이소폼은 암세포에서 재발현된다.PKM2를 발현하는 세포는 락트산 생성 증가와 산화적 인산화 감소를 보이면서 호기성 해당 형질(대사적 형질에서 변화를 보임)을 선호한다. 따라서, 암세포에서 PKM2 발현의 감소는 해당경로를 통한 에너지 생성을 변화시키거나 하향조절할 것이고, 이것은 암 치료에서 유용한 전략이다. 자료는 정상세포와 암세포에서 PKM2의 다양한 발현 패턴을 보여주었고, 암세포가 정상세포에 비교했을 때 발현 수준이 더 높았다. 조효소 Q10으로의 세포 처리는 정상세포와 암세포에서 PKM2 상한과 하한 밴드 발현 패턴을 변화시킨다. 시험된 암세포에서, PKM2 발현이 용량의존적으로 감소했고 정상세포에서는 중요한 변화가 관찰되지 않았다. 실험의 결과는 아래 표 37-39에 요약되어 있다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
락테이트 데하이드로게나제 (LDH)
LDH는 NADH와 NAD+를 상호변환하면서 피루브산과 락트산의 상호변환을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 미토콘드리아의 산화적 인산화로 낮은 세포의 산소분압에서 환원당량 생성과 ATP 발생을 위해 피루브산을 락트산으로 변화시키는 능력이 있다. 암세포는 ATP와 환원당량과 환원적 미토콘드리아 OXPHOS를 생성하기 위한 해당과정의 흐름을 유지하기 위해 통상적으로 LDH의 증가된 발현을 보여준다. 따라서, 암세포에서 LDH 발현을 감소시키는 것은 TCA 회로로의 피루브산의 진입을 촉진하기 위해 락트산 생성으로부터 대사를 변화시킬 것이다. 조효소 Q10 처리는 정상세포에는 최소의 영향을 주었고 암세포에서 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 발현을 감소시켰으며 이것은 조효소 Q10이 세포질 피루브산이 락트산으로 변화하는 것을 최소화함으로 해당작용에서의 ATP 발생을 미토콘드리아 OXPHOS로 근원물질로 변화시키기 위해 암세포 생물 에너지에서의 변화를 야기하는 역할을 한다는 것을 뒷받침한다. 실험의 결과는 아래 표 40-42에 요약되어 있다.
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
피루베이트 데하이드로게나제-B (PDH-E1)
피루베이트 데하이드로게나제 베타(PDH-E1)는 피루브산을 아세틸 CoA로 변환시키는 피루베이트 데하이드로게나제 복합체(PDC)의 일부인 첫번째 효소 요소이다. PDH-E1은 PDC 복합체에서 미토콘트리아에서 TCA 회로에 들어가기 위해 피루브산의 아세틸 CoA로의 변화에 본질적인 처음 두 개의 생화학 반응을 수행하는 활성을 나타내기 위해 티아민을 보조인자로 필요로한다. 따라서, 암세포에서의 PDH-E1 발현의 증가와 함께 PKM2와 LDH 발현의 동시 감소는 ATP 생성을 위한 미토콘드리아 OXPHOS를 증가시키는 방향으로 피루브산이 진입률을 증가시킬 것이다. 자료가 정상 세포와 암 세포주에서 PDH-E1 발현에 대해 암세포에서 본 효소의 기저 발현이 정상세포에 비해 감소했음을 보여준다. 조효소 Q10으로의 처리는 정상세포에는 변화를 거의 주지 않고 암세포에서 PDH-E1 단백질 발현의 점진적 증가와 연관있다. 실험의 결과는 아래 표 43-45에 요약되어 있다.
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
카스파아제 3
세포사멸 개시의 조절은 때때로 개시 카스파아제, 카스파아제-2,-9dhk -8/10의 수준에서 행해진다. 세포사멸의 외인성 경로에서, 카스파아제-8은, 활성이 있으면, 직접적으로 카스파아제-3과 같은 종결 카스파아제를 쪼개고 활성화시킨다. 이 활성있는 카스파아제-3은 다른 카스파아제(6, 7, 9) 뿐만 아니라 세포내 관련 표적을 쪼개고 활성화시킨다(예, PARP와 DFF). 이러한 실험에서 암 세포주와 정상 세포주에서 조효소 Q10 반응에 대한 작동 카스파아제-3 단백질 수준이 측정되었다. 세포사멸의 조절이 개시 카스파아제를 통해 이루어졌으나, 많은 신호전달 경로가 대신 작동 카스파아제를 직접 저해함으로써 세포사멸 신호전달을 방해하였다는 사실이 주목할 만 하다. 예를 들어 P38 MAPK는 카스파아제-3을 인산화시키고 이의 활성을 억제한다(Alvarado-Kristensson et al., 2004). 재미있게도, 동일 실험에서 단백질 인산염(PP2A)의 활성 또는 단백질 키나제 C 델타(PKC 델타) )(Voss et al., 2005)는 카스파아제-3 활성을 증가시키기 위해 p38 MAPK의 효과에 대응하고 세포사멸 신호 전달을 강화할 수 있다. 따라서, 활성화 또는 활성화 후 카스파아제-3 수준에서의 일이 어떤 경우에서 세포의 존망을 결정할 수 있다.
카스파아제-3은 세포사멸의 진행 과정에서 중요한 역할을 하는 시스테인-아스파트산 프로테아제이다. 암세포에서 카스파아제 3 수준은 조효소 Q10 처리로 증가되었다. 이와 반대로 정상세포에서 카스파아제-3의 발현은 완화하게 감소하였다. 실험의 결과는 아래 표 46-48에 요약되어 있다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
숙신산 데하이드로게나제 (SDH)
숙신산 조효소 Q 환원효소로도 알려진 숙신산 탈수수효소는 TCA와 전자전달반응 모두에 연관된 내부 미토콘드리아 막의 복합체이다. TCA에서, 이 복합체는 숙신산의 푸마르산으로의 산화와 동시에 유비퀴논의 유비퀴놀로의 환원을 촉매한다(Baysal et al., Science 2000; 그리고 Tomlinson et al., Nature Genetics 2002). SDH B, C, D 하위단위에서의 배선 돌연변이가 가족성 부신경절종 또는 자궁근종을 개시한다고 발견되었다(Baysal et al., Science 2000).
조효소 Q10 처리된 암세포의 미토콘드리아 분획에서 SDH 하위단위 B 발현의 특성화를 위해 웨스턴 블롯 분석법이 사용되었다. 그 결과는 조효소 Q10 처리가 세포의 미토콘트리아에서 SDH 단백질 수준을 높이는데 연관된다고 암시한다. 이러한 결과는 조효소 Q10의 기전 중 하나는 SDHB 같은 미토콘드리아 효소 수준을 증가시킴으로써 세포의 대사를 TCA 회로와 미토콘드리아로 변화시키는 것이다. 실험의 결과는 아래 표 49에 요약되어 있다.
Figure pct00060
저산소증 유도 인자 - 1
저산소증 유도 인자(Hif)는 알파와 베타 하위단위로 구성된 전사 인자이다. 산소 정상 상태에서, Hif1 알파 단백질 수준은 매우 낮다. Hif1 알파 단백질 수준은 단백질번역 후 일련의 사건들을 통한 계속적인 분해로 인해 매우 낮다. 해당작용과 산화적 인산화과정사이의 이동은 보통 피루브산의 이화작용적 운명을 결정하는 PDH와 LDH의 두 개의 효소의 상대적 활성에 의해 조절되는 것으로 간주된다. Hif는 LDH 수준을 유도하고 PDK를 자극함으로써 PDH를 억제하는 작용을 통해 중대한 비퓨게이션(bifurgation)을 조절한다. 피루브산 대사를 미토콘드리아에서 세포질로 전환시키는 능력 때문에, Hif는 암세포에서 생물에너지의 이동에 대한 중대한 매개체로 간주된다.
조효소Q10의 처리는 암세포의 미토콘드리아 분획에서 Hif1 알파 단백질 수준을 감소시킨다. 정상세포의 모든 세포 용해물에서, Hif1알파의 하단밴드가 관찰되고 역시 감소되는 것으로 보인다. 결과들은 아래 표 50-51에 정리되었다.
Figure pct00061
Figure pct00062
실시예 22: CoQ10을 처리한 정상세포와 암세포에서의 산소 소비 비율 (OCR)과 세포밖의 산성화 (ECAR)의 분석
본 예는 세포를 스트레서(즉, 고혈당증, 저산소증, 젖산)가 있거나 없는 상태에서 대표적인 MIM/CoQ10의 epi-전환인자로 처리하였을 때, 정상 생리적 조건에서 정상세포에서 측정되는 대표적인 값인 해당과정/젖산 생합성과 미토콘드리아의 산화성 인산화과정 (ECAR과OCR값으로 측정되는으로 이동하는 것을 보여준다.
출원은 이전 부분에서 암세포에 CoQ10을 처리하는 것은 미토콘드리아의 산화적 인산화과정을 촉진하는 특정 단백질의 발현의 변화와 관련이 있고 해당과정과 젖산 생합성의 수반되는 감소와 관련이 있다는 것을 보여주었다. 본 예는 시험관내 실험모델에서 용해된 산소와 세포밖의 pH수준을 측정하는 기계인 SeaHorse XF 분석기를 이용하여 세포주에서 산소 소비 비율 (OCR)을 측정함으로써 얻을 수 있는 미토콘드리아의 산화적 인산화과정의 직접적 수치를 보여준다 (SeaHorse Biosciences Inc, North Billerica, MA).
정상 조직을 둘러싸고 있는 세포내의 (세포질의) pH에 비교해 종양에서의 세포 밖의 미세환경의 pH는 상대적으로 산성이다. 종양의 이러한 특징은 세포외기질(ECM)을 침투할 수 있는 능력과, 나중에 아래 사항을 더 조절하는 신호전달 단계를 시작하는 종양의 전이에 대한 특징을 포함하는 다양한 목적을 제공한다:
종양 신생혈관생성
세포주기 회전을 조절하는 중단 매커니즘의 증가된 활성화
면역학적 감시에 대한 세포적 회피 시스템을 가능하게 하는 면역-조절적 메커니즘
당분해과정의 흐름과 젖산 사용에 대한 의존성을 증가시키는 대사적 조절 요소
발암성을 증가시는 Bcl-2, IAP, EndoG, AIF와 같은 중요 세포사멸적 유전자군의 기능장애
어느 특정한 이론에 얽매이지 않아도, 종양의 세포밖 미세환경의 산성pH는 변경된 해당과정 현상으로부터 증가된 젖산 생산에 따른 종양 세포에서 짜내진 수소 이온의 농도가 증가된 결과이다.
본 실험에서, 정상 세포주에서 OCR과 ECAR을 CoQ10이 있을 때와 없을 때 측정하여 기준치 값을 결정하였다. 정상적으로 영양분이 공급되는 환경에서 정상세포주의 OCR 비율은 다르고 체내에서 세포의 생리학적 역할을 기능을 하는 것으로 관찰되었다.
예를 들어, 한 실험은 사람 성인 피부 섬유아세포 세포주인 비-종양성 세포주 HDFa를 이용하여 수행하였다. 섬유아세포는 주로 세포외기질(ECM) 요소와 조직의 구조적 체계(스트로마 기질)를 형성하는 콜라겐을 합성하고 분비하는 세포이다. 더불어, 섬유아세포는 상처를 치료하고 국부적인 면역조절과 같은 다양한 기능의 조직의 대사로 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 정상적인 생리적 조건에서, 정상 섬유아세포의 에너지 필요는 해당과정과 산화적 인산화과정-EMC의 합성에 필요한 영양분을 공급하는 해당과정-의 결합을 통해 충족된다.
HDFa와는 반대로, HASMC(인간 대동맥 평활근 세포)는 동맥, 정맥, 림프관, 위장관, 호흡기계, 방광 및 기타 흥분수축결합을 하는 능력을 가진 조직들에서 발견된다. HASMC 세포와 같은 평활근이 수축할 수 있는 능력은 ATP로부터 에너지를 필요로 한다. 이러한 조직은 미토콘드리아로부터 ATP를 공급받는 낮은 에너지 모드로부터 ATP를 빠르게 생산하기 위한 해당작용으로의 전환에 이해 에너지가 공급되는 높은 에너지 모드 (운동/스트레스 동안)로 전환된다. 따라서 정상 평활근 세포는 정상적인 생리적 환경에서 필요한 에너지를 충족하기 위해 미토콘드리아 OXPHOS와 해당과정을 결합하여 사용한다.
그들의 각각의 생리적 역할의 다름 (즉, HDFa와 HASMC)는 SeaHorse XF 분석기를 이용하여 세포주에서 측정된 휴면하고 있는 OCR 값에서 관찰된다. 도면 29와 30은 생리적으로 정상적인 포도당 (약 4.6mM)과 고농도 포도당 (고혈당) 조건에서 자란 HDFa와HASMC 세포의 OCR을 설명하고 있다.
정상적으로 산소를 공급하고, 5.5mM 포도당이 있으면서, 어떠한 처리도 하지 않은 HDFa에 대한 기준치 OCR 값은 약 40 pmoles/분이다. (도면 29) 세포를 22mM 포도당에서 유지하면 이 값은 약간 상승한다. 반대로, 5.5mM 포도당이 있는 HASMC 세포의 OCR 값은 약 90 pmoles/분이며, 22mM 포도당에서 40 pmoles/분으로OCR 값은 감소한다. 따라서, 고혈당 조건에서, HDFa와 HASMC간에 다른 반응을 보이고, 더 나아가 그들 각각의 생리적 기질과 기능에 내재하는 차이를 보여주고 있다.
세포에 CoQ10을 처리하는 것은 정상 포도당 조건(5mM)에서 관찰되는 대표적 상태인 OCR의 변화와 관계가 있다. 생리적 반응의 복잡함은 낮은 산소분압에 있을 때 악화된다. 따라서 CoQ10을 처리하는 것은 특정 세포에 있어 원래 생리학적 상태로 돌아가려는 정상세포의 OCR 비율의 변화와 관련되어 있다.
표 52는 HDFa세포에서 CoQ10이 있을 때와 없을 때, 정상산소상태와 저산소상태일 때, 포도당이 5.5mM일 때와 22mM일 때 ECAR값 (mpH/분)을 보여준다. 정상세포에서 CoQ10을 처리하면 ECAR값에 최소한의 영향을 주지만 OCR에는 영향을 주는 것을 관찰할 수 있다. 높은 포도당과 저산소상태에서 CoQ10을 처리하면, 정상산소상태에서 처리하지 않았을 때 관찰되는 값보다 증가된 ECAR을 낮춰주는 것과 관련되어 있다.
Figure pct00063
표 53에서, HASMC세포에서 측정된 ECAR 기준치 값 (mpH/분)이 HDFa의 기준치 값보다 높은 것을 알 수 있다. 저산소상태로의 유도는 아마도 증가된 해당작용에 대한 이차적인 산성혈증을 유도하는 세포내 저산소증과 관련된 ECAR의 증가를 야기한다.
Figure pct00064
CoQ10처리는 정상산소상태의 정상 포도당 조건에서 관찰되는 값으로 향해가는 저산소상태의 고혈당 조건의 HASMC세포에서 ECAR비율의 하향적 경향과 관련되어 있다. 이러한 자료는 특정세포의 생리적 역할에 대해 내재된 생리적 변수의 존재와 CoQ10을 처리하였을 때 정상으로 향해서 움직이는 비정상 조건에서 (고혈당조건) 관찰되는 변화를 보여준다.
반대로, 암세포 (즉, MCF-7, PaCa-2)는 배양에서 유지하기 위한 해당과정 현상 때문에 내재적으로 정상세포에 비해 높은 수준의 포도당에서 배양될 수 있도록 준비되어 있다. CoQ10처리는 OCR 값에서 지속적인 감소를 유발한다. (도면 31과 도면 32)
MCF-7과 PaCa-2세포에서 OCR 값에 대한 CoQ10의 영향은 정상적인 HDFa와 HASMC세포에 대한 것과 유사하고, 그점에서 다양한 반응은 암세포의 각각의 대사적 프로파일에 근거한 치료적 반응을 연상시킨다.
Figure pct00065
표 54는 PaCa-2세포에서의 ECAR값을 나타낸다. 정상세포와는 달리, 암세포는 현상적으로 ATP 생성(증가된 해당작용)을 위해 많은 포도당을 사용하도록 준비되어 있고, 이것은 21 mpH/분 이라는 높은 ECAR로 나타난다 (표 54, 정상산소상태의 포도당 17mM의 치료하지 않은 그룹의 ECAR). CoQ10처리는 이러한 조건에서 ECAR비율의 유의한 감소를 만들어내고 아마도 젖산을 생산하는 해당과정의 감소와 연관이 있다. 이러한 세포에서의 OCR의 관련된 감소는 미토콘드리아의 OXPHOS의 증가된 효율과 관련되어 있다.
HAEC (정상 인간 대동맥 내피세포), MCF-7(유방암 세포), HepG2 (간암세포) 및 높은 전이성을 가진 PC-3(전립선암 세포) 세포주와 같은 다양한 정상세포와 암세포에서 OCR와 ECAR 값을 비교하였다. (자료를 보이지 않음). 실험한 모든 세포주에서 스트레서(고혈당, 저산소증, 젖산)가 있거나 없는 상태에서 CoQ10의 처리한 것은 정상 생리 조건에서 정상세포에서 관찰되는 대표적인 값인 OCR과 ECAR 값으로 이동하려는 것과 관련이 있다. 따라서, 세포사를 포함한 암세포에 CoQ10을 처리하는 전반적인 효과는 단백질적, 유전자적, 대사적 결과와 함께 해당과정부터 미토콘드리아 OXPHOS까지의 세포적 생물에너지학의 이동에 총체적으로 영향을 주는 후속효과이다.
실시예 23: CoQ10 생합성에 대한 빌딩블럭 분자
본 예에서는 벤조퀴논 고리의 생합성에 대한 전구물질, 이소프레노이드 반복의 생합성의 전구물질 및 벤조퀴논 고리의 부가물 등과 같은 ("빌딩블록 요소") CoQ10 생합성의 전구물질이 타겟세포에 각각 혹은 결합하여 들어가서 세포사멸 억제제 Bcl-2의 발현감소나 세포사멸 촉진제 카스파아제-3의 발현증가의 효과를 내는 것을 보여주고 있다. 어떠한 전구체나 그들의 결합은 세포의 증식을 억제하기도 한다. CoQ10 전구체는 CoQ10 투여에 따른 결과와 실질적으로 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
본 실험에 대한 일부 예시적 실험조건은 아래와 같다.
Skmel-28 흑색종 세포를 5% FBS와 1X 항생제를 넣은 DMEM/F12 배양액에서 키웠다. 세포를 85% 포화상태까지 키우고 빌딩블럭 요소를 3, 6, 12 및 24시간동안 처리하였다. 세포를 덩어리로 수거하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
실험에 사용한 빌딩블럭 요소로는 L-페닐알라닌, DL-페닐알라닌, D-페닐알라닌, L-티로신, DL-티로신, D-티로신, 4-하이드록시-페닐피루베이트, 페닐아세테이트, 3-메톡시-4-하이드록시만델레이트 (바닐릴만델레이트, VMA), 바닐린산, 4-하이드록시-벤조에이트, 피리독신, 판테놀, 메발론산, 아세틸글리신, 아세틸-CoA, 파네실 및 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논 등이다.
웨스턴 블롯 분석에서, 세포는 차가운 PBS에 덩어리로 수거되어 용해되고 BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질 수준을 정량하였다. 전체 세포 용해물을 4%로팅 12% 러닝 Tris-HCL겔에 로팅하였다. 단백질을 니트로셀루로오스 종이로 이동 시킨 후 5%의 우유 Tris버퍼 용액으로 한시간 가량 차단하였다. 단백질에 1차 항체 (Bcl-2와 카스파아제-3)에 밤새 노출시켰다. 니트로셀루로오스 종이를 피코 케미루미네센트에 5분간 노출시킨 다음 단백질 발현을 기록하였다. 노출 후, 같은 방법으로 액틴을 정량하였다. 이미지J를 이용하여 단백질 수준을 정량하였다. T-테스트를 이용하여 통계적 유의성을 분석하였다.
실험들의 실례적 결과는 아래 정리하였다.
L-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 퀴논 고리 구조에 대한 합성기전을 진행하기에 앞서 L-페닐알라닌은 티로신으로 전환된다. 흑색종 세포에서 세포사멸 단백질의 발현의 변화를 정량하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 시험에 사용한 농도는 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM 이다. L-페닐알라닌을 0.4M 페닐알라닌을 포함하고 있는 DMEM/F12 배양액에 추가하였다. 배양액에서의 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM의 L-페닐알라닌의 최종 농도는 각각 0.405 M, 0.425 M, 그리고 0.500 M이 되었다. 이러한 최종 농도를 Skmel-28 세포에 3, 6, 12 및 24시간 동안 항온처리하여 시험하였다. 세포를 80% 포화상태까지 키우고 처리배양액을 추가한 뒤, 위에 언급한 것과 같이 웨스턴 블롯 분석 절차에 따라 세포를 수거하였다. 100μM L-페닐알라닌을 3시간과 12시간 항온처리하는 경우, Bcl-2에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 5μM L-페닐알라닌에 대해서는, 6시간 항온처리하는 경우 Bcl-2에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 25μM L-페닐알라닌에 대해서는, 12시간 항온처리하는 경우 Bcl-2에서 통계적으로 유의한 감소가 그리고 카스파아제-3에서 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소는 세포사멸 가능성에 변화가 생긴 것을 의미하며, 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가는 세포가 세포사멸 과정을 겪고 있는 것을 의미한다. 샘플 크기와 표준편차 때문에 대조군과 비교했을 때 Bcl-2의 감소 트렌드는 항상 관찰되었고 이러한 시간대의 결과는 본 실험에서 통계적으로 유의하지 않았다.
D-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 생체에서 활성을 가진 L-페닐알라닌의 화학적 합성형태인 D-페닐알라닌을 L-페닐알라닌에 비교하여 시험하였다. 세개의 농도 (5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM D-페닐알라닌), 6시간 항온처리하는 경우 Bcl-2 발현에 유의한 감소가 관찰되었다. 5μM 과 25μM 에 대해서, 3시간 항온처리하는 경우 유의한 감소가 관찰되었다. 5μM 과 100μM 에 대해서, 6시간 항온처리하는 경우 카스파아제-3 발현에 유의한 증가가 관찰되었다.
DL-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: DL-페닐알라닌을 L-페닐알라닌에 비교하여 시험하였다. 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM 을 Skmel-28세포에 처리하였다. 항온처리 시간은 3, 6, 12 및 24시간이었다. 3시간 항온처리한 후에, 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 24시간 항온처리한 후에, Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 모든 다른 농도와 시간대에서 Bcl-2의 감소 경향과 카스파아μ제-3의 증가 경향이 관찰되었지만, 본 시험에서는 모두 통계적으로 유의하지 않았다.
L-티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신은 CoQ10의 퀴논 고리 구조를 합성하는데 사용되는 빌딩블럭 요소이다. L-티로신에 대한 초기 시험에서는 웨스턴 블롯 분석을 할 수 있는 충분한 단백질 농도를 나타내지 않았다. 본 실험에서 25 μM 이하의 농도를 웨스턴 블롯 분석에 시험하였다. L-티로신 디소디움 염 0.398467 M을 포함하는 DMEM/F12 배양액을 사용하였다. 초기 농도는 500 nM, 5 μM, 그리고 15 μM으로 증가되었다. 12시간 항온처리한 후에, 500nM에서 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 24시간 항온처리한 후에, 5μM에서 카스파아제-3의 통계적으로 유의한 증가와 Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 24시간 항온처리한 후에, 500μM과 5μM에서도 Bcl-2의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다.
D-티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신의 화학적 합성형태인 D-티로신을 흑색종 세포에서 세포사멸적 효과를 보이는 L-티로신과 비교하여 시험하였다. L-티로신에 대한 초기 시험에 근거하여, 25 μM 이하의 농도를 웨스턴 블롯 분석에 시험하였다. 시험농도는 1μM, 5μM 및 15μM이었다. 12시간과 24시간이 지났을 때, 5μM과 15μM에서 D-티로신은 Bcl-2 발현의 감소를 보여줬다. 카스파아제-3은 5μM에서 3, 12, 24시간이 지났을 때 유의하게 증가되었다. 카스파아제-3은 1μM에서 12시간과 24시간이 지났을 때 발현이 증가되었다. 추가로 카스파아제-3은 5μM에서 12시간이 지났을 때에도 발현이 증가되었다.
DL-티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신의 화학적 합성형태인 DL-티로신을 세포에서 세포사멸적 효과를 보이는 L-티로신과 비교하여 시험하였다. 12시간 항온처리 이후, 1μM과 15μM에서 Bcl-2의 발현이 통계적으로 감소되었고, 24시간 항온처리 이후 5μM에서 Bcl-2 발현이 통계적으로 감소되었다. 12시간 항온처리 이후 5μM과 15μM에서 카스파아제-3의 발현이 증가되는 것을 관찰하였다.
4-하이드록시-페닐피루베이트 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 4-하이드록시-페닐피루베이트는 타이로산과 페닐알라닌 아미노산으로부터 생성되며 링 구조 합성에 중요한 역할을 한다. Bcl-2와 카스파아제-3의 발현을 알아보기 위해 1μM, 5μM 및 15μM의 농도를 시험하였다. 24시간의 항온처리 이후 5μM과 15μM에서 Bcl-2 발현의 유의한 감소를 관찰하였고, 12시간의 항온처리 이후, 5μM과 15μM에서 카스파아제-3 발현의 유의한 증가를 관찰하였다.
페닐아세테이트 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 페닐아세테이트는 링 구조에 곁사슬을 붙이는 역할을 하는 4-하이드록시-벤조에이트로 전환될 수 있다. 시험 농도는 1μM, 5μM 및 15μM 을 사용하였다. 페닐아세테이트에 대해, 12시간과 24시간의 항온처리 이후 5μM과 15μM에서 Bcl-2 발현의 감소가 있었다. 12시간과 24시간의 항온처리 이후 5μM과 15μM에서 카스파아제-3 발현의 증가가 관찰되었다.
3-메톡시-4-하이드록시만델레이트 (바닐릴만델레이트, VMA)빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: VMA는 CoQ10의 링 구조를 합성하는 추가적인 요소이다. 시험 농도는 100nM, 250nM, 1μM, 25μM, 50μM 및 100μM 을 사용하였다. 본 실험에서는 통계적으로 유의한 세포사멸적 효과를 관찰할 수 없었지만, Bcl-2 발현이 감소하는 경향은 관찰하였다.
바닐린산 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 바닐린산은 퀴논 고리 합성에 필요한 전구체로 시험 농도는 550nM, 5μM및 15μM이었다. Bcl-2와 카스파아제-3 발현을 대해 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정하였다. 바닐린산은 24시간 항온처리한 후 500nM과 5μM에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다. 3시간 항온처리한 후 15μM에서 Bcl-2 발현의 감소가 있었다. 15μM에서 24시간 항온처리 시키면, 카스파아제-3 발현이 유의적으로 증가하였다.
4-하이드록시-벤조에이트 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 4-하이드록시-벤조에이트는 링 구조에 이소프레토이드 곁사슬을 붙이는 역할을 한다. 시험 농도는 500nM, 1μM및 50μM이었다. 24시간 항온처리한 후 15μM에서 Bcl-2 발현의 유의한 감소가 있었다.
4-피리독신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 피리독신은 CoQ10의 퀴논 고리 구조를 합성하는데 필요한 또다른 전구체 물질이다. 시험 농도는 5μM, 25μM및 100μM이었다. 세포에서 Bcl-2와 카스파아제-3의 수준을 측정하였다. 24시간 항온처리한 후 피리독신은 흑색종 세포에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다.
판테놀 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 판테놀은 CoQ10의 퀴논 고리 구조를 합성하는 역할을 한다. 시험 농도는 5μM, 25μM및 100μM이었다. 판테놀은 25μM에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다.
메발론산 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 메발론산은 CoQ10 합성에 주요 요소이다. 시험 농도는 500nM, 1μM, 25μM및 50μM이었다. 판테놀은 본 실험에서 Bcl-2 발현을 감소시키거나 카스파아제-3 발현을 증가시키지 않았다.
아세틸글리신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: CoQ10을 합성하는 또 다른 방법은 이소프레노이드(곁사슬) 합성이다. 아세틸글리신을 추가하면 조효소A를 아세틸-CoA로 전환하고, 아세틸-CoA는 이소프레노이드 합성을 위한 메발로산 기전으로 들어간다. 시험 농도는 5μM, 25μM및 100μM이었다. 아세틸글리신은 12시간 항온처리 이후 5μM과 25μM에서 Bcl-2 발현을 유의적으로 감소시켰다. 24시간 항온처리 이후 100μM에서도 Bcl-2 발현은 유의적으로 감소하였다.
아세틸-CoA 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 아세틸-CoA는 CoQ10을 합성하는 메발로산 기전에 대한 전구체이다. 시험 농도는 500nM, 1μM, 25μM 및 50μM이었다. 아세틸-CoA는 본 실험에서 유의적으로 Bcl-2 발현을 감소시키거나 카스파아제-3 발현을 증가시키지 않았다.
파네실과 병행한 L-티로신 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: L-티로신은 CoQ10의 퀴논 고리 구조의 합성에 필요한 전구체 중 한 요소이다. 이전 실험에서 L-페닐알라닌과 L-티로신이 들어있는 배양액에서 L-티로신의 반응을 실험하였다. 이 실험에서 L-페닐알라닌과 L-티로신을 추가하지 않은 배양액에 대한 L-티로신도 살펴보았다. 이 실험에서 사용된 L-티로신의 농도는 500 nM, 5 μM, 그리고 15 μM이었다. 파네실은 50μM에서 실험되었다. 3시간과 6시간 째에서 유의한 반응이 관찰되지 않았다.
파네실과 병행한 L-페닐알라닌 빌딩블럭 요소의 웨스턴 블롯 분석: 퀴논 고리 구조의 합성에 필요한 전구체인 L-페닐알라닌은 L-티로신과 L-페닐알라닌이 없는 배양액에 프라네실과 함께 처리하여 실험하였다. Bcl-2와 카스파아제-3의 발현을 분석하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 최종 L-페닐알라닌의 농도는 5 μM, 25 μM, 그리고 100 μM을 사용하였다. 파네실은 50μM을 사용하여 추가하였다. 본 실험에서 아래 표 55에 설명된 것과 같이 대부분의 농도와 병용한 실험에서 Bcl-1 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
Figure pct00066
4-하이드록시-벤조에이트와 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: 본 실험은 서로 다른 빌딩블록 분자를 병용하여 세포의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해 세포 증식 분석을 수행한 결과이다.
첫번째 실험은 4-하이드록시-벤조에이트와 벤조퀴논을 병용한 효과를 살펴보았다. 살아있는 세포에 대해 세포수를 계산한 후에 세포를 48시간 동안 항온처리하였다. 각 실험군은 대조군과 비교하였으며, 각 병용그룹은 벤조퀴논 처리 대조군과 비교하였다. 화합물은 벤조퀴논 추가에 대해 통계적으로 분석되었다. 다음 표에 세포 수 계산 결과를 요약하였으며 X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure pct00067
4-하이드록시-벤조익과 벤조퀴논을 병용한 세포에서 세포수의 유의한 감소가 일어났다. 4-하이드록시-벤조에이트 50μM과 벤조퀴논 70μM을 병용하면, 벤조퀴논 단독으로 처리한 것에 비해 유의한 세포수 감소가 있었다. 이것은 이러한 분자비에 대해 상승적인 효과를 의미한다.
추가적인 분자비에 대한 추가 시험을 수행하였다. 첫번째로 4-하이드록시-벤조익의 농도를 500 nM, 1 μM, 그리고 50 μM로 실험하였다. 이러한 농도는 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논(벤조)와 병용하여 시험되었다. 벤조의 농도는 25 μM, 50 μM, 그리고100 μM을 실험하였다. 흑색종 세포를 80% 포화상태로 키우고 6웰 플레이트에 웰당 40K 세포 수만큼 나누어 심었다. 세포에 CoQ10, 4-하이드록시벤조에이트, 벤조 그리고 4-하이드록시벤조에이트/벤조 병용을 처리하였다.
T-테스트를 p<0.05를 통계적 유의성으로 삼고 수행하였다. X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure pct00068
HB를 포함하는 배양액을 처리하면 세포의 증식이 유의하게 감소한다. 더구나 HB와 벤조퀴논을 병용처리하면 벤조퀴논만 단독으로 처리한 농도군과 비교하여 세포수가 유의하게 감소한다.
신생아 섬유아세포에 대해 세포 증식 분석을 수행하였다. 처리한 HB 농도는 500 nM, 5 μM, 그리고 25 μM이다. HB와 병용하여 벤조퀴논을 25 μM, 50 μM, 그리고 100 μM 농도로 처리하였다. 흑색종 세포를 웰당 40K 세포수로 심은 후에 24시간 동안 처리하였다. 세포에 트립신을 처리하고 콜터카운터로 세포수를 정량하였다.
섬유아세포에서는 통계분석결과 유의한 감소를 보여주지 않았다. 이것은 정상 세포에서 독성이 최소이거나 아예 없다는 것을 나타낸다.
페닐아세테이트와 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: 페닐아세테이트는 4-하이드록시-벤조익산(링 구조의 붙임을 촉진한다)의 합성을 위한 전구체이다. 페닐아세테이트를 CoQ10과 벤토퀴논과 함께 병용하여 항온처리하는 경우의 영향을 분석하기 위해 세포 증식 분석을 수행하였다.
Figure pct00069
페닐아세테이트와 벤조퀴논을 병용하였을 때 세포성 증식을 유의하게 감소시켰다. CoQ10과 벤조퀴논을 함께 항온처리 했을 때와 비교해 CoQ10과 페닐아세테이트를 병용하였을 때 유의하게 세포 수를 감소시켰다.
4-하이드록시-벤조에이트와 파네실의 병용에 대한 세포 증식 분석: 4-하이드록시-벤조에이트를 파네실과 병용하여 항온처리하였다. 결과는 아래 정리하였다. 4-하이드록시벤조에이트 그룹은 대조군과 하르네실 대조군 그룹과 비교하였다. X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure pct00070
L-페닐알라닌과 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: L-페닐알라닌과 벤조퀴논의 병용을 시험하기 위해 세포증식분석을 수행하였다. L-페닐알라닌을 대조군과 벤조퀴논 대조군과 비교한 결과를 아래 정리하였다. X 표시는 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure pct00071
L-페닐알라닌과 벤조퀴논을 병용한 것에 대한 유사한 상승적 역할을 관찰하였다.
L-페닐알라닌과 파네실의 병용에 대한 세포 증식 분석: L-페닐알라닌을 파네실과 함께 항온처리한 것에 대한 세포 증식에 대한 결과이다. L-페닐알라닌을 대조군과 파네실 대조군 그룹과 비교하였다. X 표시는 세포수가 통계적으로 감소한 것을 의미한다.
Figure pct00072
L-티로신과 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: 세포수를 센 뒤 L-티로신을 벤조퀴논과 함께 항온처리하였다. 대조군과 벤조퀴논 대조군 그룹과 비교하였다.
Figure pct00073
벤조퀴논의 추가는 L-티로신의 세포수에 대한 효과를 증폭시키지 않는다.
L-티로신과 벤조퀴논의 병용에 대한 세포 증식 분석: L-티로신과 파네실의 병용에 대해 점검하였다. 대조군과 파네실 대조군 그룹과 비교하였다.
Figure pct00074
L-티로신과 파네실의 병용은 본 실험에서 세포 수를 감소시키는 상승적인 효과를 보이지 않았다.
CoQ10의 합성은 2개의 주요 부분으로 나뉘는데, 링 구조를 합성하는 것과 곁사슬 구조를 합성하는 것이다. 여기서 종양학적 세포에 곁사슬 합성에 필요한 전구체들과 링 구조 요소를 함께 처리하였다. 본 결과는 링 구조 합성에 관여하는 3개의 주요 요소와 링 구조를 곁사슬 구조에 붙이는 역할을 하는 2개의 요소에 집중하였다. Bcl-2의 유의한 감소와 카스파아제-3의 유의한 증가를 보여주는 3가지 요소는 (1) L-페닐알라닌 (2) L-티로신 (3) 4-하이드록시페닐피루베이트이다. 곁가지를 링 구조에 붙이는데 관련된 2가지 요소는 (1) 4-하이드록시벤조에이트와 (2) 페닐아세테이트이다.
본 결과는 이러한 요소들을 2,3-디메톡시-5-메틸-p-벤조퀴논(벤조퀴논)과 함께 병용하여 외부에서 처리하였을 때 세포 증식을 유의하게 억제하는 것을 보여준다. 이것은 링 구조와 함께 벤조퀴논 링에 곁사슬을 붙이는 요소를 함께 보조하면 손상된 CoQ10 합성기전을 보충할 수 있는 것을 가르킨다. 이것은 또한 분자의 안정화를 원조하여 세포 과정에 의해 요구되는 기능성 성질을 유지시킨다. 페닐아세테이트는 4-하이드록시벤조에이트의합성을 위한 전구체이고 벤조퀴논과 조합된 외인성 전달은 종양성 세포에서 유사한 효과를 갖는다.
실시예 24: 당뇨병에 대한 세포 모델에서 조효소Q10에 의한 유전자 발현의 조절
조효소Q10은 직접적으로 산화적 인산화반응에 영향을 줌으로써 정상 미토콘드리아의 기능을 유지하는 역할을 하는 내재적인 물질이다. 당뇨병과 같은 대사적 질병의 중요한 지수로 역할을 하는 세포내 타켓을 조절할 수 있는 조효소Q10의 능력이 치료용 결과지표를 대표하는 방법등으로 제시되기도 한다.
당뇨병의 원인 혹은 치료와 관련된 유전자의 발현을 조효소Q10이 어떻게 조절하는지 이해하기 위해, 인간 신장에서 유래한 불멸의 1차 신장 근위관모양의 세포주 (HK-2)와 인간 대동맥의 평활근 세포의 1차배양 (HASMC)을 실험모델로 사용하였다. HK-2와 HASMC세포는 인간 혈액에서 정상으로 간주되는 범위에 해당하는 농도인 5.5mM 글루코오스 배양액에서 보통 유지된다. 하지만, 당뇨병 환경을 시뮬레이션하기위해, 두 개의 세포주는 만성 고혈당증에 관련된 인간 혈액에서 관찰되는 범위에 해당하는 농도인 22mM 글루코오스 배양액으로 옮겨졌다. 세포는 이후에 3계대를 번식하게되고 세포내 조절 프로세스가 기능적으로 당뇨병 상태를 흉내낼 수 있도록 적용되었다. 당뇨병의 생리적 영향이 신장의 기능이상에 대한 것인지 심혈관의 기능을 제대로 발휘 못하는 진행적인 병리생리학에 추가하여 말기신장병 (ESRD)의 진행에 대한 것인지에 따라 세포주를 선택하였다.
당뇨병 PCR 어레이를 사용하여 HK-2 세포에서 조효소Q10이 유전자 발현에 미치는 영향
당뇨병 PCR 어레이 (SABiosciences)는 84개의 유전자를 동시에 스크리닝할 수 있게 해준다. 본 시험에서 4개의 실험군을 시험하였다.
HK-2;
22 mM 글루코즈에서 유지된 HK-2 H;
HK2(H) + 50μM 조효소 Q10; 및
HK2(H) + 100μM 조효소 Q10
당뇨병 어레이(Cat # PAHS-023E, SABiosciences Frederick MD)에 대한 HK-2 샘플의 실시간 PCR 데이터에 대한 엄격한 분석은 처리하지 않은 HK-2정상 세포에 대해 최소 2배이상으로 유전자 조절이 되지 않는 모든 결과는 제외시켰다. (p값은 0.05이하). 만성 고혈당증 혹은 조효소Q10으로 인해 조절되는 것으로 관찰되는 유전자를 표 64에 정리하였고 그들의 기능과 세포내 위치 (Ingenuity Pathway Analysis에서 유래한)를 표 65에 정리하였다.
Figure pct00075
Figure pct00076
조절된 수준의 RNA 전사중에서, Carcino Embryonic Antigen Cell Adhesion Molecule 1 (CEACAM1) 유전자가 HK2(H) 세포에서 특히 100μM 조효소Q10을 처리하였을 때 발현이 매우 증가된 것으로 발견되었다. CEACAM-1은 (또한 CD66a와 BGP-I으로도 알려진) 115-200KD 타입 I 막관통 당단백질이며 CEA 상과의 막에 붙은 CEA 아과에 속한다. 세포의 표면에서, 이들은 비공유 호모- 혹은 헤테로다이머를 형성한다. 단백질의 세포밖 부분은 3개의 C2-타입 Ig유사 도메인과 한 개의 N-터미널 V-타입 Ig유사 도메인을 포함하고 있다. C-터미널 지역이 두번째 C2-타입 도메인 (320번째 아미노산 이후)에 관련된 다양한 유전자접합 변종이 존재한다. 쥐에서 CEACAM1 발현이 결여되면 당뇨병과 같은 대사적 증후군을 촉진시키는 것으로 나타난 반면에 CEACAM1의 발현의 증가는 인슐린 내재화의 증가와 관련이 있다. 인슐린 내재화의 증가는 인슐린 민감도와 포도당 활용이(즉, 혈액 내 포도당이 세포안으로 이동하는 것) 증가되는 것을 의미하며 따라서 제 2형 당뇨병의 대표적인 특징인 인슐린 저항성을 완화시키는 것을 의미한다.
표 55에서 보여지듯이, 인슐린 수용체 (INSR)의 발현도 조효소Q10을 처리한 당뇨병석 HK-2세포에서 변화되었다. 이론에 얽매이지 않더라도, 조효소Q10처리에 따른 INSR의 발현의 증가는 인슐린 민감도를 증가시키고 (단독으로 혹은 추가적으로 CEACAM1의 발현을 증가시키면서) 당뇨병과 관련된 중요한 생리학적/대사적 합병증을 뒤집을 가능성 보여준다.
미토콘드리아 어레이를 사용하여 HK-2 세포에서 조효소Q10이 유전자 발현에 미치는 영향
미토콘드리아 어레이(Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick MD)를 이용하여 당뇨병에 관련된 미토콘드리아 유전자의 차별화된 발현을 분석하였다. 만성 고혈당증 혹은 조효소Q10으로 인해 조절되는 것으로 관찰되는 유전자를 표 66에 정리하였고 그들의 기능과 세포내 위치를 표 67에 정리하였다.
Figure pct00077
Figure pct00078
이때까지 당뇨병에 있어서 조효소Q10을 처리한 당뇨병성 HK-2세포에서 발견된 4개의 미토콘드리아 유전자(표 3)의 역할이 규명되지 않았다.
연구 2: 당뇨병 PCR 어레이를 사용하여 HASMC 세포에서 조효소Q10이 유전자 발현에 미치는 영향
당뇨병 PCR 어레이 (SABiosciences)는 84개의 유전자를 동시에 스크리닝할 수 있게 해준다. 본 시험에서 4개의 실험군을 시험하였다.
Figure pct00079
당뇨병 어레이(Cat # PAHS-023E, SABiosciences Frederick MD)에 대한 HASMC 세포 샘플의 실시간 PCR 데이터에 대한 엄격한 분석은 처리하지 않은 HASMC 정상 세포에 대해 최소 2배이상으로 유전자 조절이 되지 않는 모든 결과는 제외시켰다. (p값은 0.05이하). 만성 고혈당증 혹은 조효소Q10으로 인해 조절되는 것으로 관찰되는 유전자를 표 68에 정리하였다.
Figure pct00080
HASMC세포에서 조효소Q10을 고혈당증 세포에 처리하면 심혈관의 기능 조절(AGT), 인슐린 민감도 (CEACAM1, INSR, SELL), 염증/면역 기능 (IL-6, TNF, CCL5)에 관여하는 유전자의 발현이 바뀌게 된다. 이론에 얽매이지 않더라도, INSR의 발현의 증가는 HASMC세포의 인슐린 민감도의 증가와 관련이 있고 이는 당뇨병을 치료하는데 이득이 되는 생리학적 특성이다. 반면에 면역조절 특징을 가진 IL-6는 골결근 세포, 지방세포, 간세포, 췌장 베타세포 및 신경내분비 세포에 작용함으로써 포도당 항상성과 대사에 직간접적으로 영향을 주는 것으로 제안되어 왔다. 활성화됨에 따라, 정상 T-세포가 RNATES와 케모카인 (chemokine, C-Cmotif) 리간드 (CCL5)를 발현하고 분비한다. CCL5는 지방세포가 발현하고 RNATES의 혈중 수준은 비만이나 제 2형 당뇨병에서 증가된다. 하지만, 표 68에서 보여진 것처럼, 조효소Q10을 HASMC세포에 처리하면 CCL5의 발현을 유의하게 감소시킨다. 앞선 자료에 근거하여, 조효소Q10의 투여는 당뇨병을 조절하는데 치료적인 이익이 있다.
미토콘드리아 어레이를 사용하여 HASMC 세포에서 조효소Q10이 유전자 발현에 미치는 영향
미토콘드리아 어레이(Cat# PAHS 087E, SABisociences Frederick MD)를 이용하여 당뇨병에 관련된 미토콘드리아 유전자의 차별화된 발현을 분석하였다. 만성 고혈당증 혹은 조효소Q10으로 인해 조절되는 것으로 관찰되는 유전자를 표 69에 정리하였다.
Figure pct00081
조효소Q10을 고혈당증의 HASMC 세포에 처리하면 예정세포사나 세포사멸 (BCL2L1, PMIAP1 또한 NOXA로도 알려짐), 운송단백질 (SLC25A1 [구연산염 운송체], SLC25A13 [아스파르트산염-글루타민산염 교환체], SLC25A19 [티아민 피로인산염 운송체]와 SLC25A22 [글루타민산염-수소 공동운송체] 및 미토콘드리아 매트릭스 운송 단백질 (MFN1, TIMM44 및 TOMM40)을 조절하는 유전자의 발현이 바뀌게 된다. 이러한 운송체들의 활성은 크랩사이클에 필요한 전구체를 조절하거나 미토콘드리아의 산화적 인산화반응을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 당뇨병의 HASMC 세포를 조효소Q10에 노출시키면 세포질과 미토콘드리아의 유전자 발현이 변화하는 것과 관련있다는 것을 보여주고 있다. 즉, 조효소Q10의 투여는 당뇨병을 조절하는데 치료적인 이익이 있다.
HASMC세포와 HK-2세포를 조효소Q10으로 처리하거나 혹은 고혈당증적 환경을 처리하여 얻은 결과를 비교한 결과 공통적으로 4개의 유전자가 조효소Q10에 의해 두 세포주에서 모두 조절되는 것을 알 수 있었다. (즉, 유전자 발현 어세이에서 PIK3C2B 와 SELL, 미토콘드리아 어레이 분석에서 TOMM40 과 TSPO). 당뇨병적 환경에서 조효소Q10을 세포에 저리하는 것은 당뇨병의 원인이나 치료에 관련된 것으로 알려진 유전자의 발현을 바뀌게 하는 것과 관련되어 있다.
등가 수준
당업자는 본원에 기재된 특정 양태 및 방법에 대한 많은 등가 수준을 과도한 실험 없이 확인할 수 있고 인지할 것이다. 상기 등가 수준은 하기의 청구항 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (55)

  1. (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다); 및
    (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계(여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 앓고 있다는 징후이다)를 포함하는, 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지를 평가하는 방법.
  2. (1) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 마커의 발현이 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화 쪽으로 세포 대사 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 장애의 환부 세포에서 변화된다); 및
    (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계 (여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있다는 징후이다)를 포함하는, 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지를 평가하는 방법.
  3. (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다); 및
    (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하는 단계(여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있다는 징후이다)
    를 포함하는, 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지를 예측하는 방법.
  4. (1) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 마커의 발현이 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화 쪽으로 세포 대사 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 장애의 환부 세포에서 변화된다); 및
    (2) 상기 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 상기 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하는 단계 (여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있다는 징후이다)
    를 포함하는, 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는를 예측하는 방법.
  5. (1) 치료 계획의 적어도 일부를 피검체에게 적용하기 전에 상기 피검체로부터 수득한 제1 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준(여기서, 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 29에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다)을
    (2) 치료 계획중 적어도 일부를 적용한 후 제2 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교함을 포함하고,
    이때, 제1 샘플과 대비하여 제2 샘플중에 마커의 발현 수준의 변화는 치료가 상기 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 지표인 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 치료 효능을 평가하는 방법.
  6. (1) 치료 요법의 적어도 일부를 피검체에게 적용하기 전에 상기 피검체로부터 수득한 제1 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준(여기서, 마커의 발현은 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포 대사 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 환부 세포에서 변화된다)을
    (2) 치료 계획중 적어도 일부를 적용한 후 제2 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교함을 포함하고,
    이때, 제1 샘플과 대비하여 제2 샘플중에 마커의 발현 수준의 변화는 치료가 상기 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 지표인, 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 치료 효능을 평가하는 방법.
  7. (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 생물학적 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되고 마커가 양성 배수 변화 및/또는 음성 배수 변화를 갖는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다);
    (2) 피검체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않는다); 및
    (3) 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플중의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않은 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 비교하여 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 단계를 포함하고,
    (4) 여기서, 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여, 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플에 존재하는 음성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현의 감소는 환경적 영향인자 화합물이 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 지표이고, 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여, 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플에 존재하는 양성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준의 증가는 환경적 영향인자 화합물이 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 지표인, 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합믈 효능을 평가하는 방법.
  8. (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 생물학적 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되고 마커의 발현은 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포 대사적 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 장애의 환부 세포에서 상향 또는 하향 조절된다);
    (2) 피검체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 샘플은 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않는다); 및
    (3) 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플중의 하나 이상의 마커의 발현 수준과 환경적 영향인자 화합물에 노출되지 않은 생물학적 샘플에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 비교하여 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 단계를 포함하고,
    (4) 여기서, 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여, 하나 이상의 하향 조절된 마커의 발현 수준에서 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플에서의 감소는 환경적 영향인자 화합물이 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효능적이라는 지표이고, 제2 샘플중에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준과 대비하여, 하나 이상의 상향조절된 마커의 발현 수준에서 환경적 영향인자 화합물에 노출된 생물학적 샘플에서의 증가는 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위해 효과적이라는 지표인, 이를 필요로 하는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합믈 효능을 평가하는 방법.
  9. (1) 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (2) 생물학적 샘플을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (3) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(이때 상기 마커는 양성 배수 변화 및/또는 음성 배수 변화를 갖는, 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된다);
    (4) 생물학적 샘플중에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 시험 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및
    (5) 생물학적 샘플중에 존재하는 음성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 감소시키고/시키거나 생물학적 샘플중에 존재하는 양성 배수 변화를 갖는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 선별하여 피검체중에 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 단계를 포함하는, 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법.
  10. (1) 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계;
    (2) 생물학적 샘플을 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (3) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플에 존재하는 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(이때 상기 마커의 발현은 정상의 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포 대사적 에너지 전환이 일어나도록 유도된 대사적 장애의 환부 세포에서 상향 또는 하향 조절된다);
    (4) 생물학적 샘플중에서 하나 이상의 마커의 발현 수준을 시험 화합물에 의해 접촉되지 않은 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및
    (5) 생물학적 샘플에서 하나 이상의 하향 조절된 마커의 발현 수준을 감소시키고/시키거나 생물학적 샘플에서 하나 이상의 상향 조절된 마커의 발현 수준을 증가시키는 시험 화합물을 선별하여 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 단계를 포함하는, 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 화합물을 동정하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대사적 장애가 당뇨병, 비만, 전당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환, 대사적 증후군 및 대사적 장애의 임의의 주요 요소들로 구성된 군으로부터 선택되는 장애인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마커가 피검체의 환부 세포에서 정상화된 미토콘드리아 산화성 인산화쪽으로 세포성 대사 에너지 전환을 선택적으로 유발하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 피검체로부터 수득한 유체를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 유체가 혈류, 구토물, 침액, 림프액, 그리고 뇨로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  15. 제14항에 있어서, 샘플이 혈액 샘플 또는 이의 성분인 방법.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 피검체로부터 수득한 조직 또는 이의 성분을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 조직이 골, 연결조직, 연골, 폐, 간, 신장, 근육 조직, 심장, 췌장 및 피부로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체가 사람인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플중에 마커의 발현 수준이 샘플중에 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석함에 의해 측정되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 전사된 폴리뉴클레오타이드의 분석이 전사된 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킴을 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 샘플중에 마커의 발현 수준이 샘플중에 단백질 또는 이의 일부를 분석함에 의해 측정되는 방법.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 마커에 특이적으로 결합하는 시약을 사용하여 분석되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 시약이 표지된 방법.
  24. 제22항에 있어서, 시약이 항체 및 항원 결합 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플중의 마커의 발현 수준이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭 반응, 역전사효소 PCR 분석, 단일가닥 확인 다형태 분석(SSCP), 미스매치 절단 검출, 이종이중나선 분석, 서던 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 동일계 하이브리드화, 어레이 분석, 데옥시리보핵산 서열분석, 제한 단편 길이 다형태 분석 및 이의 조합 또는 준조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정되는 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플중의 마커의 발현 수준이 면역조직화학, 면역세포화학, 유동세포측정기, ELISA 및 질량 분광측정기로 구성된 군으로부터 선택되는 기술을 사용하여 측정되는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 HNF4-알파, Bcl-xl, Bcl-xS, BNIP-2, Bcl-2, Birc6, Bcl-2-L11 (Bim), XIAP, BRAF, Bax, c-Jun, Bmf, PUMA, cMyc, 트랜스알돌라제 1, COQ1, COQ3, COQ6, 프레닐트랜스퍼라제, 4-하이드로벤조에이트, 호중구 사이토졸 인자 2, 산화질소 신타제 2A, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2, VDAC, Bax 채널, ANT, 시토크롬 c, 복합체 1, 복합체 II, 복합체 III, 복합체 IV, Foxo 3a, DJ-1, IDH-1, Cpt1C 및 Cam 키나제 II로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 아폽토시스와 연관된 마커인 방법.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 산화성 스트레스와 연관된 마커인 방법.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 열 쇼크와 연관된 마커인 방법.
  31. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 혈관형성과 연관된 마커인 방법.
  32. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 당뇨병과 연관된 마커인 방법.
  33. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 고혈압과 연관된 마커인 방법.
  34. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 심혈관 질환과 연관된 마커인 방법.
  35. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 마커의 발현 수준이 측정되는 방법.
  36. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체가 환경적 영향인자 화합물, 설포닐우레아 화합물, 메글리티니드 화합물, 프란딘, 나테글리니드 화합물, 비구아니드 화합물, 티아졸리딘디온 화합물, 프레코스, 시믈린, 비에타, DPP-IV 억제제, 그리고 인슐린으로 구성된 군으로부터 선택되는 치료제로 치료되는 방법.
  37. 제5항 또는 제6항에 있어서, 치료가 환경적 영향인자 화합물을 포함하는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 치료가 설포닐우레아 화합물을 사용한 치료, 메글리티니드 화합물을 사용한 차료, 프란딘을 사용한 치료, 나테글리니드 화합물을 사용한 치료, 비구아니드 화합물을 사용한 치료, 티아졸리딘디온 화합물을 사용한 치료, 프레코스를 사용한 치료, 시믈린을 사용한 치료, 비에타를 사용한 치료, DPP-IV 억제제를 사용한 치료 및 인슐린을 사용한 치료로부터 선택되는 치료 요법을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 환경적 영향인자 화합물이 다차원 세포내 분자(MIM) 또는 환경대사적 전환인자(epi-전환인자)인 방법.
  40. 제36항 또는 제37항에 있어서, 환경적 영향인자 화합물이 CoQ-10인 방법.
  41. 제36항 또는 제37항에 있어서, 환경적 영향인자 화합물이 비타민 D3인 방법.
  42. 제36항 또는 제37항에 있어서, 환경적 영향인자 화합물이 아세틸 Co-A, 팔미틸, L-카르니틴, 티로신, 페닐알라닌, 시스테인 및 소분자로부터 선택된 화합물인 방법.
  43. 제36항 또는 제37항에 있어서, 환경적 영향인자 화합물이 피브로넥틴, TNF-알파, IL-5, IL-12, IL-23, 혈관형성 인자 및 아폽토시스 인자로부터 선택되는 방법.
  44. 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 상기 피검체가 대사적 장애를 앓고있는지의 여부를 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함하는, 피검체가 대사적 장애를 앓고 있는지를 평가하는 키트.
  45. 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 상기 피검체가 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지의 여부를 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함하는, 대사적 장애를 나타낼 경향이 있는지를 예측하는 키트.
  46. 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 대사적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함하는, 대사적 장애를 치료하기 위한 치료법의 효능을 평가하는 키트.
  47. 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약 및 대사적 장애를 갖는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하기 위한 키트 사용 지침서를 포함하는, 대사적 장애를 갖는 피검체에서 대사적 장애를 치료하기 위한 환경적 영향인자 화합물의 효능을 평가하는 키트.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체로부터 생물학적 샘플을 수득하기 위한 수단을 추가로 포함하는 키트.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 샘플을 추가로 포함하는 키트.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 수단이 샘플중에 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부를 분석하기 위한 수단을 포함하는 키트.
  51. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 수단이 샘플중에 단백질 또는 이의 일부를 분석하기 위한 수단을 포함하는 키트.
  52. 제44항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 환경적 영향인자 화합물을 추가로 포함하는 키트.
  53. 제44항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  54. (1) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, 상기 마커는 표 2 내지 4 및 6 내지 29 및 64 내지 69에 열거된 마커로 구성된 군으로부터 그룹으로부터 선택된다) 및
    (2) 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준을 대조군 샘플중에 존재하는 마커의 발현 수준과 비교하여 피검체가 CoQ10 반응성 상태를 앓고 있는지의 여부를 평가하는 단계(여기서, 대조군 샘플중의 마커의 발현 수준과 대비하여, 피검체로부터 수득한 생물학적 샘플중에서 마커의 발현 수준의 변화는 피검체가 CoQ10 반응성 상태를 앓고 있다는 징후이다)를 포함하는, 피검체가 CoQ10 반응성 상태를 앓고 있는지를 평가하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, CoQ10 반응성 상태가 대사적 장애인 방법.
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