KR20120022811A - 혈액 종양 치료를 목적으로 하는 항ＩＬ－３Ｒα 항체 - Google Patents

혈액 종양 치료를 목적으로 하는 항ＩＬ－３Ｒα 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은, IL-3 시그널을 저해하지 않으며 인간 IL-3Rα쇄의 B 도메인에 결합하고, C 도메인에는 결합하지 않는, 인간 IL-3Rα쇄에 대한 항체, 인간 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 피검체에 있어서, 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα가 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양을 예방 또는 치료하기 위한 조성물, 인간 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로 하는 조성물을 피검체에 대하여 투여하는 것을 포함하는 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα가 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양의 치료 방법을 제공한다.

Description

혈액 종양 치료를 목적으로 하는 항ＩＬ－３Ｒα 항체{ANTI-IL-3Rα ANTIBODY FOR USE IN TREATMENT OF BLOOD TUMOR}
본 발명은, 인간 IL-3Rα 단백질(별칭 : 인간 CD123)에 대한 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 인간 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로 하는, 골수성 악성 종양, 특히 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 치료약 및 진단약의 발명에 관한 것이다.
악성 종양에 관해
악성 종양(암)은, 일본에서의 사망 원인의 제1위를 차지하고, 또한 환자수는 해마다 증가하고 있어, 유효성 및 안정성이 높은 약제나 치료법의 개발이 강하게 요구되고 있다. 악성 종양을 형성하는 원인으로서, 방사선, 자외선이나 각종 발암성 물질에 의한 DNA의 변이가 있다. 악성 종양에 관한 연구는, 이러한 유전적인 변화를 분자 생물학적으로 동정하는 것에 주력되어 왔다. 그 결과, 다수의 변이의 축적 등에 의해 종양화가 야기된다고 생각되고 있다. 몇가지 결정적인 변이에 관해서는 세포주의 모델 등에 의해 종양화로 직결되는 것이 나타나고 있다. 본 발명의 대상 질환의 하나인 백혈병에 있어서는, 염색체 이상이 많이 확인되어, 분류되어 있다. 그 대부분이 염색체 전좌이며, 주요 염색체 전좌에 관해서는 이미 전좌 관련 유전자가 동정되어 있다. 전좌 관련 유전자의 기능 해석에 의해, 그 유전자가 백혈병의 발증에 관여하는 예가 알려져 있다.
암 줄기 세포에 관해
한편, 세포 생물학적 견지에서, 정상 조직과 마찬가지로 줄기 세포가 악성 종양의 기원이라고 하는, 소위 암 줄기 세포 가설이 오래전부터 제창되고 있다. 줄기 세포는, 자기 복제능과 다분화능을 갖는 세포라고 정의되며, 일반적으로 전능성 줄기 세포와 조직 줄기 세포로 크게 나뉜다. 조직 줄기 세포는, 혈액계, 간장, 신경계 등 특정한 조직ㆍ장기의 기원이며, 매우 낮은 빈도로 존재한다. 그 중에서도 조혈 줄기 세포는 가장 연구가 진행되어 있다. 치사량의 방사선 조사에 의해 조혈계를 파괴한 마우스에 대하여, 1개의 조혈 줄기 세포를 이식함으로써 장기간에 걸쳐 조혈계를 재건할 수 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 암 줄기 세포는 정상 줄기 세포와 달리, 오랫동안 그 실체를 파악할 수 없어, 연구가 지연되고 있다. 그러나, 1997년에 Dick 등에 의해, 급성 골수성 백혈병에 있어서 처음으로 암 줄기 세포가 동정되었다. 이후, 여러가지 악성 종양에 있어서 암 줄기 세포의 존재가 보고되고 있다. 종합하면, 종양 전체의 수% 이하의 빈도로 존재하며, 정상 줄기 세포와 마찬가지로 희소 세포이다. 종양을 형성하는 나머지 세포는 증폭 능력이 제한된 종양 전구 세포 또는 종양 세포라고 생각된다.
이러한 보고에 의해, 종양에 있어서도 정상 조직과 마찬가지로 피라미드 계층이 존재하며, 그 정점(기원)에 있는 암 줄기 세포가 강한 종양 형성능을 갖는다는 것이 나타났다.
암 줄기 세포의 특성과 치료상의 문제
많은 보고를 종합하면, 암 줄기 세포는 정상 줄기 세포가 갖는 여러가지 특성을 유지하고 있다고 생각된다. 예를 들어, 희소 세포인 것, 미소 환경(niche)에 존재하는 것, 다제 내성 유전자를 발현하는 것, 세포 주기가 멈춰 있는 것 등에 관한 유사성을 들 수 있다.
그 중에서도, 정상 줄기 세포와 마찬가지로 다제 내성 유전자군을 발현하는 것과, 세포 주기의 휴지기에 존재한다고 하는 특성은 치료상의 큰 문제점이 될 수 있다. 다제 내성 유전자 BCRP는 여러가지 항암제를 세포밖으로 배출함으로써 약효를 감약시키는 펌프이며, 그 활성을 이용한 줄기 세포의 채취법이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 또, 세포 주기의 휴지기에 존재하여 「동면」상태에 있는 것(비특허문헌 3)은, 암의 빠른 세포 증식에 착안한 많은 항암제나 방사선에 대한 감수성의 저하를 초래하고 있다(비특허문헌 4 및 5).
이상의 이러한 특성에 의해, 치료에 저항성을 나타내는 암 줄기 세포가 종양재발의 원인이라고 생각되고 있다.
분자 표적약에 관해
악성 종양의 치료는, 항암제 요법, 방사선 요법, 절제의 3가지가 주요 방침이 된다. 혈액 종양에서는, 항암제 요법과 방사선 요법으로 한정되며, 암 줄기 세포가 이러한 치료에 대한 저항성을 가질 수 있는 것은 전술한 대로이다. 또 하나의 문제는, 이 2개의 치료는 영향이 전신에 미치기 때문에, 부작용이 크다는 것이다. 이 문제에 대한 해결 수단으로 기대되는 것이 분자 표적 의약이다. 표적 분자가 발현되어 있는 세포에만 약효를 발휘함으로써, 부작용이 경감할 수 있을 가능성을 갖는다.
분자 표적 의약의 혈액 질환 영역에서의 대표적인 약제로서, 이마티닙과 리툭시맵을 들 수 있다. 이마티닙은, CML 환자의 95%에서 관찰되는 염색체 이상(필라델피아 염색체)에 의해 생성되는, Bcr-Abl이라는 백혈병화 인자를 표적으로 하는 것이다. Bcr-Abl의 기능을 저해함으로써, 백혈병 세포의 자살을 유도하는 저분자 의약품이다. 리툭시맵은, B 세포 상의 표면 분자인 CD20을 인식하는 항체 의약품으로, B 세포의 악성 종양(비호지킨 림프종 등)에 대하여 항종양 효과를 갖는다. 한편, AML에 대한 분자 표적약은 적어, AML 세포 표면 항원으로서 알려져 있는 CD33에 대한 모노클로날 항체에 항생 물질 칼리키아마이신을 결합시킨 약제 겜투주맵ㆍ오조가마이신(Mylotarg)뿐이다. 그러나 Mylotarg는, 칼리키아마이신에서 유래한다고 생각되는 독성이 강하여, 승인 범위가 좁은 것과 더불어 이용이 제한되고 있는 것이 현상이다. 이상의 것부터, 새로운 표적 유전자의 발견과 그것에 대한 치료약의 개발은, 치료의 가능성과 선택지의 확대로 직결되는 중요한 발명이라고 할 수 있다.
분자 표적약의 형태로서, 항체 의약품, 저분자 의약품을 비롯하여, 펩티드 의약품, 사이토카인 등 생체내 단백질 제제, siRNA, 앱타머 등 여러가지 것이 연구ㆍ개발되고 있다. 치료약으로서의 항체의 사용은, 그 특이성 때문에, 질환 세포가 특이적 항원을 발현하는 병태의 치료에 유용하다. 항체는, 세포 표면에 발현되는 단백질을 항원으로서 결합하여, 결합한 세포에 유효하게 작용한다. 항체는, 혈중 반감기가 길고, 항원에 대한 특이성이 높다고 하는 특징을 가지며, 항종양제로서도 매우 유용하다. 예를 들어, 종양 특이적인 항원을 표적으로 한 항체라면, 투여한 항체는 종양에 집적되어, 보체 의존성 세포 상해 활성(CDC)이나 항체 의존적 세포성 세포 상해 활성(ADCC)을 통한 종양 세포에 대한 공격을 기대할 수 있다. 또, 항체에 방사성 물질이나 세포 독성 물질 등을 결합시킴으로써, 약제를 효율적으로 종양 부위에 송달하여 작용시키는 것이 가능해진다. 동시에, 비특이적인 타조직으로의 약제 도달량을 감소시킬 수 있어, 부작용의 경감도 기대할 수 있다. 종양 특이적 항원이 세포사를 유도하는 활성을 갖는 경우는, 아고니스틱 활성을 갖는 항체를 투여함으로써, 또 종양 특이적 항원이 세포의 증식 및 생존에 관여하는 경우는 중화 활성을 갖는 항체를 투여함으로써, 종양의 증식 정지 또는 퇴축을 기대할 수 있다. 항체는, 상기 그 특징 때문에 항종양제로서 이용하기에 적합하다고 생각된다.
항체 의약품에 관해
당초의 항체 제작은, 면역 대상 동물로서 마우스가 사용되었다. 그러나, 여러가지 이유 때문에 마우스 항체의 의약품으로서의 사용은 제한된다. 인간 체내에서 외래물이라고 인식될 수 있는 마우스 항체는, 소위 「인간 항마우스 항체」, 즉 「HAMA」 응답을 야기시킬 수 있다(비특허문헌 6). 또한, 마우스 항체의 Fc 부분은, 인간 보체 또는 세포 상해 활성을 통한 질환 세포의 공격에 유효하지 않다.
이러한 문제를 회피하기 위한 접근의 하나로서 키메라 항체가 개발되었다(특허문헌 1 및 2). 키메라 항체는, 2개 또는 그 이상의 종에서 유래하는 항체의 일부(마우스 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 정상 영역 등)를 포함한다. 이러한 키메라 항체의 이점은 마우스 항체의 특징은 유지하지만, 인간 Fc를 가지므로 인간 보체 또는 세포 상해 활성을 자극할 수 있다. 그러나, 이러한 키메라 항체도 여전히 「인간 항키메라 항체」, 즉 「HACA」 응답을 야기하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 7).
또한, 치환된 항체의 일부만이 상보성 결정 영역(「CDR」)인 재조합 항체가 개발되었다(특허문헌 3 및 4). CDR 이식 기술을 사용하여, 마우스 CDR, 인간가변부 프레임워크 및 정상 영역을 포함하는 항체, 소위 「인간화 항체」를 제작할 수 있게 되었다(비특허문헌 8). 또한, 인간 항체 생성 마우스의 사용, 또는 인간 항체 라이브러리를 이용한 스크리닝에 의해, 완전 인간 항체의 제작에 관해서도, 범용성이 있는 기술이 제공되어 있다(비특허문헌 9 및 10).
IL-3Rα에 관해
IL3Rα는 IL-3 수용체의 α쇄이고, 사이토카인 수용체 패밀리에 속하며, 리간드인 IL-3과 약한 결합성을 나타낸다. β쇄(CD131, 이후, IL-3Rβ로도 표현함)와 헤테로 수용체를 형성함으로써 강한 결합을 갖는 IL-3 수용체가 되어, β쇄의 세포내 부위를 통하여 증식ㆍ분화 등의 시그널을 세포내에 전달한다. β쇄는, IL-5 수용체 α쇄, GM-CSF 수용체 α쇄와 공유하고 있다.
IL-3Rα는 1회 막관통의 I형 막단백질이며, 막외 영역에는, IL-3 결합 부위, 피브로넥틴 타입 III 부위가 존재하는 것이 서열 상에서 알려져 있다. 막내 영역에는 시그널을 전달할 수 있는 구조는 없는 것이 알려져 있다. IL-3Rα의 입체 구조는 해독되어 있지 않지만, 사이토카인 수용체는 패밀리 사이에서, 구조상 중요한 S-S 결합을 형성하는 시스테인 잔기의 위치는 대부분은 보존되어 있어, 구조는 유사하다고 추정할 수 있다. 동일한 사이토카인 수용체 중에서는, IL-13 수용체 α쇄, IL-4 수용체 α쇄, GM-CSF 수용체 α쇄의 결정 구조가 해석되어 있다. 이들 사이토카인 수용체 패밀리의 정보로부터, IL-3Rα의 막외 영역은 크게 3 도메인(A-B-C 도메인)으로 나뉘어져 있는 것을 추정할 수 있다. 인간 IL-3Rα의 A 도메인을 인식하는 항체 7G3은 IL-3 시그널을 블록하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 11). 또한, A 도메인을 결손한 IL-3Rα 분자가 발현하고 있는 것이 보고되어 있어(비특허문헌 12), 당연히 A 도메인을 인식하는 항체는 A 도메인 결손형 IL-3Rα를 인식할 수는 없다. 또, C 도메인은, IL-3Rα 분자의 근원이며, IL-3Rβ와 IL-3Rα의 회합을 입체적으로 저해할 가능성이 높다고 생각된다.
IL-3Rα의 리간드로서 유일하게 알려져 있는 것은 IL-3이다. IL-3은, 이하의 콜로니 형성을 촉진하는 것이 알려져 있는 조혈 인자이다: 적혈구, 거핵구, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단구계 세포. IL-3은, 다분화능을 갖는 전구 세포를 자극하는 것도 알려져 있지만, 어느 쪽이냐고 한다면, 자기 복제능을 갖는 미숙한 줄기 세포가 아니라, 분화 방향이 정해진(Commiting한) 전구 세포의 분화를 촉진한다고 한다.
IL-3Rα는, β쇄와 헤테로다이머를 형성하여 IL-3 시그널을 세린/트레오닌 인산화 경로를 통해 세포내에 전달하여, 골수계 세포의 증식ㆍ분화에 관여하고 있는 것이 알려져 있다. IL-3Rα의 발현은, 조혈 전구 세포 중에서도 Granulocyte-Macrophage Progenitor(GMP) 또는 Common Myeloid Progenitor(CMP)에 발현하고 있는 것이 알려져 있고, IL-3 시그널을 통하여 호중구, 마크로파지계에 대한 증식ㆍ분화를 유도한다. 한편, CMP의 하류에 있는 Megakaryocyte Erythroid Progenitor(MEP)는, 마찬가지로 CMP의 하류에 있는 GMP와는 달리, IL-3Rα의 발현이 없는 것이 보고되어 있다.
AML 줄기 세포에 관해서는, Bonnet과 Dick은 AML 줄기 세포가 CD34 양성 CD38 음성의 획분에 존재하는 것을 보고하였다(비특허문헌 13). 또한, Jordan 등은, 정상 줄기 세포의 동일한 획분(CD34 양성 CD38 음성)과 비교함으로써, IL-3Rα가 AML 줄기 세포에 고발현하고 있는 것을 발견했다(비특허문헌 14). 이후의 복수의 논문에서도, AML 줄기 세포 뿐만 아니라, 백혈병 줄기 세포의 마커로서의 IL-3Rα의 높은 포텐셜이 보고되어 있다(비특허문헌 15 및 16). 백혈병을 포함하는 암치료에서는, 정상 세포를 가능한 한 손상시키지 않고, 암세포만을 제거하는 것이 중요하고, 이 IL-3Rα의 정상 줄기 세포와 백혈병 줄기 세포의 발현의 차이는, 백혈병 줄기 세포를 타게팅하는 치료에 유용하다고 생각한다.
IL-3Rα와 헤테로다이머를 형성하는 IL-3Rβ에 관해서는, 백혈병 줄기 세포에서 고발현하고 있는 보고는 존재하지 않고, 실제로 백혈병 줄기 세포와 정상 줄기 세포의 mRNA 발현을 비교한 마이크로어레이에서도, 백혈병 줄기 세포에서 발현이 항진하고 있는 분자로서 동정되지 않았다(비특허문헌 17).
IL-3Rα와 헤테로다이머를 형성하는 IL-3Rβ에 관해서는, 백혈병 줄기 세포에서 고발현하고 있는 보고는 존재하지 않고, 실제로 백혈병 줄기 세포와 정상 줄기 세포의 mRNA 발현을 비교한 마이크로어레이에서도, 백혈병 줄기 세포에서 발현이 항진하고 있는 분자로서 동정되지 않았다(비특허문헌 18).
IL-3에 의존하는 백혈병 세포의 존재는 오래전부터 알려져 있지만, 오래전 연구에서는 백혈병 세포의 대부분을 차지하는 아구(芽球)에 착안한 연구이다. 오늘날 백혈병 줄기 세포의 연구에서는, 백혈병 줄기 세포는 증식을 최대한 억제함으로써 항암제 내성을 획득한다고 한다. 또, IL-3 반응성의 아구는 증식성이 높다고 생각되어, 이들 세포는 통상의 항암제 치료가 유효하다고 추측된다.
IL-3R 수용체를 타겟으로 한 약제의 후보로는, 오래 전에는 IL-3 그 자체가 조혈 부전의 환자에게 투여되었지만, 결과적으로 의약품이 되지 않았다. IL-3에 디프테리아 독소를 부가한 융합 단백질이, 백혈병을 대상 질환으로 하여 임상 시험 실시중이다. IL-3 및 디프테리아 독소 부가 IL-3에 관해서는, IL-3의 성질 때문에, IL-3Rα 단독 단백질에 대해서가 아니라, IL-3Rα와 β의 헤테로 단백질에 강하게 결합하기 때문에, IL-3Rα가 특이적으로 발현 상승하고 있는 세포를 타겟으로 하고 있는 약제로는 적합하지 않다. 한편, IL-3Rα를 타겟으로 하는 약제 후보로는, IL-3Rα의 인간 마우스 키메라 항체 7G3이 제1 상(相)인 결과가 보고되어 있다(비특허문헌 19). 7G3 키메라 항체는, IL-3 시그널을 블록하는 것을 AML 치료의 메커니즘으로 하고 있고, IL-3Rα 양성 세포의 제거를 목적으로 하는 약제가 아니다. 또, 그 밖에도 IL-3Rα 항체는 몇가지 알려져 있지만(9F5(Becton Dickinson사), 6H6(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY사), AC145(Miltenyi-Biotec사)), IL-3Rα 고발현 세포의 제거능을 갖지 않는다.
[특허문헌]
특허문헌 1 : 유럽 특허 출원 공개 제120694호
특허문헌 2 : 유럽 특허 출원 공개 제125023호
특허문헌 3 : 영국 특허 출원 공개 제GB2188638A호
특허문헌 4 : 미국 특허 제5585089호
[비특허문헌]
비특허문헌 1 : Osawa M 등, Science. 273 : 242-5 (1996)
비특허문헌 2 : Goodell MA 등, J Exp Med. 183 : 1797-806 (1996)
비특허문헌 3 : Yamazaki S 등, EMBO J. 25 : 3515-23(2006)
비특허문헌 4 : Ishikawa F 등, Nat Biotechnol. 25 : 1315-21.(2007)
비특허문헌 5 : Bao S 등, Nature. 444 : 756-60 (2006)
비특허문헌 6 : Schiff 등, Canc. Res., 45, 879-885 (1985)
비특허문헌 7 : Bruggemann 등, J. Exp. Med., 170 : 2153-2157 (1989)
비특허문헌 8 : Riechmann 등, Nature, 332 : 323-327 (1988)
비특허문헌 9 : Ishida I 등, Cloning Stem Cells. 4 : 91-102 (2002)
비특허문헌 10 : Wu 등, JMol Biol. 19 : 151-62 (1999)
비특허문헌 11 : Sun 등, Blood, 87 : 83 (1996)
비특허문헌 12 : Chen 등, JBiol Chem, 284 : 5763 (2009)
비특허문헌 13 : Bonnet 등, NatMed, 1997; 3 : 730
비특허문헌 14 : Jordan 등, Leukemia, 2000; 14 : 1777
비특허문헌 15 : Haematologica, 2001; 86 : 1261
비특허문헌 16 : LeukLymphoma, 2006; 47 : 207
비특허문헌 17 : Majeti 등, Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106 : 3396
비특허문헌 18 : Majeti 등, Proc Natl Acad Sci USA. 106 : 3396 (2009)
비특허문헌 19 : Blood, 2008112(11) : Abstract2956
본 발명의 목적은, 백혈병 줄기 세포만을 제거하는 것이 가능하고, 정상 세포에 악영향을 잘 미치지 않는(부작용이 적은) 치료약을 제공하는 것이다. 구체적으로는 IL-3 시그널을 저해하지 않으며 인간 IL-3Rα쇄의 B 도메인에 결합하고, C 도메인에는 결합하지 않는, 인간 IL-3Rα쇄에 대한 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물, 상기 항체를 이용한 치료 방법, 또는 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이하의 (1)?(9)에 관한 것이다.
(1) IL-3 시그널을 저해하지 않으며 인간 IL-3Rα쇄의 B 도메인에 결합하고, C 도메인에는 결합하지 않는, 인간 IL-3Rα쇄에 대한 항체.
(2) 또한 높은 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)을 갖는 상기 (1)에 기재된 항체.
(3) 높은 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)이, IL-2로 배양한 PBMC를 이용한 Colon-26/hCD123 ADCC 측정법에 있어서, 항체 농도가 0.01 ㎍/㎖ 이하이고 특이적 용해율 10%가 되는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 항체.
(4) 이하의 (a)?(e)로 이루어진 군에서 선택된 중쇄의 CDR과 경쇄의 CDR의 아미노산 서열을 갖는 상기 (1)?(3) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(a) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 113?115로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 131?133으로 표시되는 아미노산 서열
(b) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 116?118로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 134?136으로 표시되는 아미노산 서열
(c) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 119?121로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 137?139로 표시되는 아미노산 서열
(d) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 122?124로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 140?142로 표시되는 아미노산 서열
(e) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 125?127로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 143?145로 표시되는 아미노산 서열
(5) 이하의 (a)?(f)로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 상기 (1)?(4) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(a) 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 발린(V)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(b) 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 발린(V)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(c) 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(d) 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(e) 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 138번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
(f) (a)?(e)로 표시되는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 1?3개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역.
(6) (1)?(5) 중 어느 하나에 기재된 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 피검체에 있어서, 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα가 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
(7) (1)?(5) 중 어느 하나에 기재된 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로 하는 조성물을 피검체에 대하여 투여하는 것을 포함하는 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα가 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양의 치료 방법.
(8) (1)?(5) 중 어느 하나에 기재된 IL-3Rα 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피험체로부터의 생물학적 검체에 있어서, 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양을 검출하기 위한 조성물.
(9) 상기 혈액 종양이 급성 골수성 백혈병(AML)인, (1)?(5) 중 어느 하나에 기재된 조성물 또는 방법.
본 발명에 의해, IL-3 시그널을 저해하지 않으며 인간 IL-3Rα쇄의 B 도메인에 결합하고, C 도메인에는 결합하지 않는, 인간 IL-3Rα쇄에 대한 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물, 상기 항체를 이용한 치료 방법, 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1 및 도 2는, 라벨화 항IL-3Rα 항체를 이용한 IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 플로우 사이토메트리 해석의 결과이다.
도 3은, 라벨화 항IL-3Rα 항체를 이용한 IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 플로우 사이토메트리 해석의 결과이다.
도 4는, 인간 IL-3Rα 분자의 A 및 B 도메인의 핵산 및 아미노산 서열 중, 분자의 외측에 배치된 영역 1?7을 GM-CSFRα 서열로 치환한 영역 부분을 점선으로 나타낸 도면이다.
도 5는, IL-3 시그널의 블로킹능을 검토한 세포주 증식 시험의 결과이다. 종축에 세포 증식 저해율(%), 횡축에 각종 IL-3Rα 항체명을 나타낸다.
도 6은, IL-3 시그널의 블로킹능을 검토한 콜로니 분석 시험의 결과이다. GM은 Granulocyte/Macrophage계, E는 Erythroid계 콜로니, GEMM은 혼합 콜로니에 의한 결과를 나타낸다.
도 7은, 담암 모델에서의 각종 인간 항체의 항종양 효과를 검토한 결과이다. 종축은 MOLM13 세포수, 횡축에 각종 항IL-3Rα 항체명을 각각 나타내고 있다.
도 8 및 도 9는, 항IL-3Rα 항체에 의한 IL-3Rα 발현 세포주에 대한 ADCC 시험의 결과이다. 도 8은 IL-2로 배양하지 않는 PBMC를, 도 9는 IL-2로 배양한 PBMC를 사용했다.
도 10은, 항IL-3Rα 항체를 PE 표지 항인간 IgG 이차 항체로 검출한 게잡이 원숭이 IL-3Rα 강제 발현 세포의 플로우 사이토메트리 해석의 결과이다. 상단은 게잡이 원숭이 IL-3Rα 발현 세포를, 하단은 인간 IL-3Rα의 발현 세포를 각각 나타낸다.
(특정한 바람직한 실시형태의 상세한 설명)
본 명세서에 이용되는 섹션의 발견은, 조직화의 목적만을 위한 것이며, 기재되는 주제에 한정된다고 해석되어서는 안된다. 본 출원에 인용되는 모든 인용문헌은, 임의의 목적을 위해 본 명세서에 관해 참조로서 명백하게 원용된다.
(개요)
본 발명은, IL-3 시그널을 저해하지 않으며 인간 IL-3 수용체 α쇄(이하, IL-3Rα로 약기함)의 B 도메인에 결합하고, C 도메인에는 결합하지 않는, 인간 IL-3Rα쇄에 대한 항체에 관한 것이다.
백혈병 줄기 세포의 세포 표면에는 IL-3 수용체(이하, IL-3R로 약기함), 특히 IL-3Rα가 발현하고 있다. 통상, IL-3 시그널을 세포내에 전달하여 증식ㆍ분화를 유도하는 것은 IL-3 수용체 β쇄(이하, IL-3Rβ로 약기함)이다.
따라서, IL-3 시그널을 저해하는 것은, 정상 줄기 세포에 의한 정상적인 조혈을 저해할 수 있는 등의 부작용의 우려가 있다. 따라서, 백혈병 줄기 세포를 타겟으로 하는 새로운 치료법으로는, IL-3Rα를 타겟으로 하고, 또한 IL-3 시그널을 저해하지 않는 것이 바람직하다.
(IL-3Rα)
IL-3Rα 유전자는 사이토카인 수용체 패밀리에 속하는 I형 막관통 단백질이다. IL-3Rα 분자는, 정상 세포에서는, 조혈 전구 세포의 일부, 호염기구, 수상 세포의 일부 등에 발현하고 있다. 종양에서는, 조혈계 종양ㆍ백혈병에서의 발현이 주로 알려져 있다. IL-3Rα를 발현하고 있는 종양의 예로는, AML이나 급성 전화한 CML의 아구, 백혈병 줄기 세포라고 여겨지는 분화 마커 음성 CD34 양성 CD38 음성의 획분에서는, AML, CML, MDS, ALL, SM에서 발현하고 있는 것이 알려져 있다. IL-3Rα의 기지의 리간드인 IL-3은, 혈액 중에서는 활성화 T 세포, 자연 살해 세포, 비만 세포, 거핵구계의 일부의 세포가 발현하고 있다. 또, IL-3Rα는 CD123으로도 불린다. IL-3Rα에는, 포유류(예를 들어, 영장류, 인간)형 IL-3Rα이 포함된다. 인간 IL-3Rα 등의 IL-3Rα 서열에는, 다형 변이체가 포함된다. 전길이 인간 IL-3Rα의 구체예로는, 이하의 아미노산 서열을 들 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
인간 IL-3Rα 세포외 도메인의 구체예로는, 이하의 아미노산 서열을 들 수 있다.
Figure pct00003
또, IL-3Rα의 세포외 도메인은, A?C의 3개의 도메인으로 나누어진다.
A 도메인으로는, 서열번호 2의 아미노산의 18번째 글루타민(Q)부터 100번째 세린(S)까지, B 도메인으로는, 서열번호 2의 아미노산의 101번째 글리신(G)부터 203번째 세린(S)까지, C 도메인으로는, 서열번호 2의 아미노산의 204번째 글루타민(Q)부터 308번째 류신(L)까지의 영역을 갖는다.
또한, A 및 B 도메인 중, 분자의 외측에 배치되는 영역으로는, 이하의 7 영역을 들 수 있다.
영역 1로는, 서열번호 2의 아미노산의 55번째 아스파라긴산(D)부터 61번째 프롤린(P)까지, 영역 2로는, 서열번호 2의 아미노산의 63번째 발린(V)부터 70번째 페닐알라닌(F)까지, 영역 3으로는, 서열번호 2의 아미노산의 91번째 세린(S)부터 98번째 글루타민산(E)까지, 영역 4로는, 서열번호 2의 아미노산의 97번째 프롤린(P)부터 104번째 트립토판(W)까지, 영역 5로는, 서열번호 2의 아미노산의 122번째 시스테인(C)부터 128번째 프롤린(P)까지, 영역 6으로는, 서열번호 2의 아미노산의 182번째 이소류신(I)부터 188번째 세린(S)까지, 영역 7로는, 서열번호 2의 아미노산의 192번째 글리신(G)부터 198번째 리신(K)을 들 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체로는, IL-3Rα의 세포외 도메인인, 서열번호 2에 기재된 아미노산에서, 101?203번째 아미노산 서열에 결합하고, 204?308번째 아미노산 서열에는 결합하지 않는 항체, 나아가 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에서의 182?188번째 및 192?198번째 아미노산 서열에 결합하는 항체를 들 수 있다.
본 발명의 항체는, IL-3Rα의 세포외 도메인의 전술한 특정한 영역에 결합하고, IL-3 시그널을 저해하지 않는다.
본 발명에서 「IL-3 시그널을 저해하지 않으며」란, IL-3에 의한 IL-3R을 통한 세포내 시그널을 저해하지 않는 것을 말하고, IL-3과 IL-3R의 회합을 저해하지 않는 경우 및 IL-3Rα쇄와 β쇄의 결합을 저해하지 않는 것이 포함된다. 구체적으로는, 실시예 8에서의 해석에서, 도 5에 나타내는 세포 증식 저해율이 항체의 농도를 10 ㎍/㎖로 했을 때에 있어서, 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상인 것을 말한다. 본 명세서에서, 「IL-3 시그널의 블로킹」과 「IL-3 시그널의 저해」는 동일한 의미로 이용되며, 구별되지 않고, IL-3 시그널의 블로킹능이란, IL-3 시그널을 저해하는 능력을 말한다.
또, 본 발명의 항체는, 전술한 성질에 더하여, 높은 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)을 갖는다.
ADCC 활성을 갖는 IL-3Rα 항체는, IL-3Rα를 발현하는 세포에 결합하고, NK 세포 등의 세포 상해 활성을 갖는 이펙터 세포를 통해 IL-3Rα 발현 세포를 살상할 수 있는 항체를 말한다.
높은 ADCC 활성이란, 구체적으로는 실시예 11에 기재된, IL-2 배양한 PBMC를 이용한 Colon-26/hCD123 ADCC 측정법으로 측정했을 때, 항체 농도가 0.01 ㎍/㎖ 이하이고 특이적 용해율이 10% 이상인 것을 말한다.
특이적 용해율이란, 항체에 의한 타겟 세포의 용해도를 측정한 값이며, 구체적으로는 후술하는 실시예 11에 의해 산출된다.
IL-3Rα를 발현되는 세포로는, 혈액 종양 세포(acute myeloid leukemia(AML) 세포, chronic myeloid leukemia(CML) 세포, myelo dysplastic syndromes(MDS) 세포, acute lymphoid leukemia(ALL) 세포, chronic lymphoid leukemia(CLL) 세포, 다발성 골수종(multiple myeloma : MM) 세포, systemic mastocytoma(SM) 세포 등), 제어성 T 세포(예를 들어, CD4 양성 CD25 양성 세포), 항원 제시 세포(예를 들어, 수상 세포, 단구ㆍ마크로파지 및 그것과 유사한 세포(간성상세포, 파골 세포, 마이크로글리아 세포, 표피내 대식 세포, 진애 세포(폐포 대식 세포) 등)), 호염기구 등을 들 수 있다.
또, AML 세포, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, SM 세포, MM 세포, 각종 림프종 세포에는 각각의 종양 줄기 세포를 포함한다.
종양 줄기 세포란, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML)에서 Lineage(-)CD34(+)CD38(-) 골수 세포로 대표되는, 종양을 구성하는 세포군의 하나이다.
따라서, 본 발명의 항체는, 높은 ADCC 활성을 갖기 때문에, IL-3Rα가 발현하고 있는 세포의 저감 또는 제거를 유도한다.
또 본 발명의 IL-3Rα 항체에는, 이하의 (a)?(e)로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄의 CDR 및 경쇄의 CDR을 갖는 IL-3Rα 항체가 포함된다.
(a) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 113?115로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 131?133으로 표시되는 아미노산 서열
(b) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 116?118로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 134?136으로 표시되는 아미노산 서열
(c) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 119?121로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 137?139로 표시되는 아미노산 서열
(d) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 122?124로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 140?142로 표시되는 아미노산 서열
(e) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 125?127로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 143?145로 표시되는 아미노산 서열
또한, 본 발명의 항체에는, 이하의 (a)?(f)로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 IL-3Rα 항체(괄호내에, 각 가변 영역 서열이 유래하는 후술하는 실시예의 항체의 명칭을 나타낸다).
(a) 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 발린(V)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. (항체의 명칭 : Old4)
(b) 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 발린(V)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. (항체의 명칭 : Old5)
(c) 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. (항체의 명칭 : Old17)
(d) 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. (항체의 명칭 : Old19)
(e) 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 138번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역. (항체의 명칭 : New102)
(f) (a)?(e)로 표시되는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 1?3개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역.
(항체)
항체란, 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 이들의 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편도 포함한다.
항체는, 성숙 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 또, 항체는, 성숙 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열에 관한, 항체 정상 영역, 상보성 결정 영역(CDR) 또는 프레임워크(FR) 영역 내부 또는 외부에서의 치환물 등의 수식 형태 및 변이 형태도 포함한다. 특정한 양태에서는, 치환에는 보존적 아미노산 치환이 포함된다.
또, 항체는, 성숙 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열의 부분 서열도 포함한다. 특정한 양태에서는, 부분 서열은, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 단쇄 Fv(scFv),디술피드 결합 Fv(sdFv) 및 VL 또는 VH에서 선택된다.
또, 항체는 이종 도메인도 포함한다. 특정한 양태에서는, 이종 도메인에는 태그, 검출 가능한 표지 또는 세포 상해성 약제가 포함된다.
항체에는, 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체, 이들 모두의 이소타입 또는 서브클래스가 포함된다. 특정한 양태에서는, 상기 항체는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), IgA, IgM, IgE 또는 IgD 아이소타입이다. 「모노클로날」항체란, 진핵 생물 클론, 원핵 생물 클론 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론에 기초하여, 진핵 생물 클론, 원핵 생물 클론 또는 파지 클론을 포함하는 단일클론으로부터 얻어지거나, 또는 진핵 생물 클론, 원핵 생물 클론 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유도되는 항체를 가리킨다. 고로, 「모노클로날」항체는, 구조적으로 정의되는 것이며, 그것이 생성되는 방법이 아니다.
IL-3Rα 항체, 항IL-3Rα 및 항IL-3Rα 항체란, IL-3Rα와 특이적으로 결합하는 항체를 가리킨다. 특이적 결합이란, IL-3Rα 중에 존재하는 에피토프에 대하여 선택적이라는 것이다. 특이적 결합은, 당기술분야에서 공지된 분석(예를 들어, 면역 침강, ELISA, 플로우 사이토메트리, 웨스턴 블로팅)을 이용하여 비특이적 결합과 구별할 수 있다.
IL-3Rα 항체가 특이적으로 결합하는 항원 에피토프의 전부 또는 일부가 상이한 단백질에 존재하는 경우에, 이 항체는 상이한 단백질과 결합할 가능성이 있다. 그 때문에, IL-3Rα 항체는, IL-3Rα 에피토프의 서열 또는 구조적 상동성의 정도에 따라서, 그 IL-3Rα 에피토프에 대하여 높은 서열 또는 구조적 상동성을 갖는 별도의 단백질과 특이적으로 결합 가능성이 있다. 따라서, IL-3Rα 항체는, 상이한 단백질에, 충분한 서열 또는 구조적 상동성을 갖는 에피토프가 존재하는 경우에, 상이한 단백질과 결합할 가능성이 있다.
IL-3Rα 항체에는, 단리 및 정제 항체가 포함된다. 단리 또는 정제 IL-3Rα 항체를 포함하는 본 발명의 항체는, 인간을 포함한다.
조성물의 수식어로서 이용되는 용어 「단리(된)」란, 그 조성물이 사람의 손으로 만들어진다는 것, 또는 천연적으로 존재하는 in vivo 환경에 있는 1종 이상의 다른 성분으로부터, 일반적으로, 1 이상의 조작 스텝 또는 프로세스에 의해 분리된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 그와 같이 분리된 조성물은, 그와 같은 조성물이 통상 자연스럽게 결합하는 1종 이상의 재료, 예를 들어, 1종 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막을 실질적으로 포함하지 않는다. 그 때문에, 단리 조성물은, 그 조성물이 자연스럽게 발생하는 생물의 세포 중의 다른 생체 성분으로부터, 또는 그 조성물이(예를 들어, 합성에 의해 또는 세포 배양에 의해) 생성되는 인공 배지로부터 분리되어 있다. 예를 들어, 단리 IL-3Rα 항체는, 그 항체가 생성되는 동물(예를 들어, 비트랜스제닉 포유류 또는 트랜스제닉 포유류(설치류(마우스) 또는 유제류(소) 동물 등의))로부터 얻을 수 있고, 다른 폴리펩티드 및 핵산으로부터 분리되어 있다. 따라서, 그 동물로부터 얻어지는 항체를 함유하는 혈청은 단리되어 있다고 생각된다. 용어 「단리(된)」는, 별도의 물리적 형상을 배제하는 것은 아니고, 예를 들어, 단리 항체에는, 항체 부분 서열, 키메라, 멀티머 또는 유도체화된 형태가 포함될 수 있다.
조성물의 수식어로서 이용되는 용어 「정제(된)」란, 그 조성물이 일반적으로 자연스럽게 결합하는 재료의 대부분 또는 실질적으로 모두를 포함하지 않는 조성물을 가리킨다. 정제 항체는, 일반적으로, 항체 환경에 통상 존재하는 성분으로부터 취출되고 있다. 그 때문에, 항체 생성 하이브리도마 세포 배양물로부터 분리된 항체 상청은 정제되어 있다고 생각된다. 따라서, 정제(된)는, 절대 순도를 요구하는 것은 아니고, 관계상의 비(context specific)이다. 또한, 「정제(된)」 조성물은, 1종 이상의 다른 분자와 조합할 수 있다. 그 때문에, 용어 「정제(된)」는, 조성물의 조합을 배제하는 것은 아니다. 순도는, 예를 들어, UV 분광법, 크로마토그래피(예를 들어, HPLC, 기상), 겔전기 영동(예를 들어, 은 또는 쿠마시 염색) 및 서열 해석(펩티드 및 핵산) 등의 임의의 적절한 방법으로 결정할 수 있다.
「정제(된)」단백질 및 핵산에는, 표준적인 정제법에 의해 얻어지는 단백질 및 핵산이 포함된다. 또, 이 용어에는, 숙주 세포에서의 재조합 발현이나 화학 합성에 의해 얻어지는 단백질 및 핵산도 포함된다. 또, 「정제(된)」는, 혼입 물질의 레벨이, 인간 또는 비인간 동물에 대한 투여에 관한 감독관청, 예를 들어, 식품 의약품국(the Food and Drug Administration)(FDA)에 승인되는 레벨보다 낮은 조성물을 가리키는 경우도 있다.
IL-3Rα 항체에는, IL-3Rα와 결합하여, in vivo에서 또는 in vitro에서(예를 들어 피험체에서) IL-3Rα 기능 또는 활성을 모듈레이트하는 항체가 포함된다. 본 명세서에서, IL-3Rα의 활성 또는 기능에 관해 이용되는 경우의 용어 「모듈레이트한다」 및 그 문법상의 변형은, IL-3Rα의 활성 또는 기능을 검출할 수 있도록 영향, 개변 또는 변경을 받지만, IL-3 시그널을 저해하는 것은 포함되지 않는 것을 의미한다. 따라서, IL-3Rα의 활성 또는 기능을 모듈레이트하는 IL-3Rα 항체는, IL-3R 시그널은 저해하지 않고 1종 이상의 IL-3Rα 활성 또는 기능을 검출할 수 있도록 영향, 개변 또는 변경을 부여하는 항체이며, 그와 같은 IL-3Rα의 활성 또는 기능에는, 예를 들어, IL-3Rα 리간드(예를 들어 IL-3)와의 IL-3Rα의 결합, IL-3Rα 매개 시그널 전달 또는 IL-3Rα 매개 세포 응답 또는 IL-3Rα에 의해 모듈레이션 가능한 세포 응답, 또는 본 명세서에 기재되어 있거나, 그렇지 않으면 공지이거나 또는 알 수 있는 별도의 IL-3Rα 활성 또는 기능을 포함할 수 있다.
모듈레이트할 수 있는 비한정적인 여러가지 IL-3Rα 활성 및 기능에는, 예를 들어, IL-3Rα 매개 시그널 전달 또는 IL-3Rα 매개 세포 응답 또는 IL-3Rα에 의해 모듈레이션 가능한 세포 응답, 세포 증식 또는 증가(예를 들어, AML 세포, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, MM 세포, SM 세포, 각종 림프종 세포, 단구, 마크로파지, 비만 세포, 호염기구, 헬퍼 T 세포, 제어성 T 세포, 자연 살해 세포, 골수구계 전구 세포, 림프구계 전구 세포 등), 세포 생존 또는 아포토시스(예를 들어, AML 세포, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, MM 세포, SM 세포, 각종 림프종 세포, 단구, 마크로파지, 비만 세포, 호염기구, 헬퍼 T 세포, 제어성 T 세포, 자연 살해 세포, 골수구계 전구 세포, 림프구계 전구 세포 등), 사이토카인(예를 들어, Th1, Th2 및 비Th1/Th2 사이토카인) 및 인터페론의 발현 또는 생성, 항아포토시스 단백질 또는 프로아포토시스 단백질의 발현 또는 생성 및 이들의 장해, 질환, 생리학적 상태, 병상 및 증상의 처치, 억제 또는 개선이 포함된다. 모듈레이트되는 특정한 사이토카인으로는, 한정되는 것이 아니지만, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, TNF-α, 인터페론 γ(in vivo 또는 in vitro)를 들 수 있다. 특정한 항아포토시스 단백질 또는 프로아포토시스 단백질 발현으로는, 한정되는 것은 아니지만, Bcl-xL, Bcl-2, Bad, Bim 및 Mcl-1을 들 수 있다.
따라서, 본 명세서에 기재된 예시적인 IL-3Rα 항체에는, 1종 이상의 IL-3Rα 매개 시그널 전달 또는 IL-3Rα 매개 세포 응답 또는 IL-3Rα에 의해 유도되는 세포 응답, 세포 증식(예를 들어, AML 세포, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, MM 세포, SM 세포, 각종 림프종 세포, 단구, 마크로파지, 비만 세포, 호염기구, 헬퍼 T 세포, 제어성 T 세포, 자연 살해 세포, 골수구계 전구 세포, 림프구계 전구 세포 등), 세포 생존 또는 아포토시스(예를 들어, AML 세포, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, MM 세포, SM 세포, 각종 림프종 세포, 단구, 마크로파지, 비만 세포, 호염기구, 헬퍼 T 세포, 제어성 T 세포, 자연 살해 세포, 골수구계 전구 세포, 림프구계 전구 세포 등), 사이토카인(예를 들어, Th1, Th2 및 다른 비Th1/Th2 사이토카인, 예를 들어, IL-17, IL-23 및 IL-26) 및 인터페론의 발현 또는 생성(Th1, Th2, 비Th1/Th2, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, TNF-α, 인터페론 γ 및 GM-CSF(in vivo 또는 in vitro) 등), 항아포토시스 단백질 또는 프로아포토시스 단백질의 발현(예를 들어, Bcl-xL, Bcl-2, Bad, Bim 또는 Mcl-1) 및 이들의 장해, 질환, 병상 및 증상의 처치, 억제 또는 개선을 모듈레이트하는 항체가 포함된다. 특정한 양태에서는, 본 발명의 IL-3Rα 항체는, AML 세포의 증식 또는 생존을 모듈레이트하고, 다른 혈액 종양 세포(예를 들어, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, MM 세포, SM 세포 또는 각종 림프종 세포)의 수를 모듈레이트하고, 단구, 마크로파지, 비만 세포, 호염기구, 헬퍼 T 세포, 제어성 T 세포, 자연 살해 세포, 골수구계 전구 세포, 림프구계 전구 세포 등 비혈액 종양 세포의 증식 또는 생존을 모듈레이트하거나, 또는 AML 세포, CML 세포, ALL 세포, CLL 세포, MDS 세포, MM 세포, SM 세포, 또는 각종 림프종 세포를 감소, 소실 또는 고갈시킨다.
IL-3Rα 항체에는, 「변이체」라고도 불리는 치환물(예를 들어, 아미노산 치환물), 부가물 및 결실물(예를 들어, 부분 서열 또는 프래그먼트) 등의 개변형태가 포함된다. 그와 같은 개변 항체 형태 및 변이체는, 본 발명에서 표시되는 IL-3Rα 항체의 적어도 일부의 기능 또는 활성, 예를 들어 IL-3Rα와 결합하는 것, 또는 IL-3Rα의 활성 또는 기능(예를 들어, IL-3Rα 시그널 전달)을 모듈레이트하는 것을 유지한다. 따라서, 개변 IL-3Rα 항체는, 예를 들어, 적어도 일부의 IL-3Rα 결합 또는 1종 이상의 IL-3Rα 기능 또는 활성(예를 들어, 시그널 전달, 세포 응답 등)을 모듈레이트할 능력을 유지할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 「개변한다」(「수식한다」) 및 그 문법상의 변형은, 조성물이 참조 조성물로부터 벗어나 있다는 것을 의미한다. 개변된 단백질, 핵산 및 다른 조성물은, 비개변의 참조 단백질, 핵산 또는 다른 조성물보다 높은 또는 낮은 활성을 가지며, 또는 비개변의 참조 단백질, 핵산 또는 다른 조성물과는 상이한 기능을 가질 수 있다.
아미노산 치환을 포함하는 그와 같은 항체는, 핵산에 의해 코드될 수 있다. 그렇기 때문에, 아미노산 치환을 포함하는 항체를 코드하는 핵산 서열도 제공된다.
용어 「동일성」 또는 「동일한」이란, 2개 이상의 참조되는 실체가 동일하다는 것을 의미한다. 따라서, 2개의 단백질 서열(예를 들어, IL-3Rα 항체)가 동일한 경우, 이들은 적어도 참조되는 영역 또는 부분 내에서 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 「동일성 영역」이란, 2개 이상의 참조되는 실체의 동일한 부분을 가리킨다. 따라서, 2개의 단백질 서열이 하나 이상의 서열 영역에서 동일한 경우, 이들은 그 영역 내에서 동일성을 공유한다. 「실질적 동일성」이란, 분자가, 1종 이상의 참조 분자 기능 또는 활성의 적어도 일부의 기능 또는 활성, 또는 그 분자가 동일성을 공유하는 참조 분자의 관련/대응 영역 또는 부분을 갖거나 또는 갖는다고 예측되도록, 구조적으로 또는 기능적으로 보존되어 있다는 것을 의미한다. 따라서, 실질적 동일성을 갖는 폴리펩티드(예를 들어, IL-3Rα 항체)는, 참조 폴리펩티드(예를 들어, IL-3Rα 항체)로서의 적어도 일부의 활성 또는 기능을 갖거나 또는 갖는다고 예측된다. 예를 들어, 특정한 일실시형태에서는, 비개변 IL-3Rα 항체의 적어도 일부의 활성 또는 기능을 유지하는 1종 이상의 개변(예를 들어, 1?3개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 또는 삽입)을 갖는 IL-3Rα 항체는, 참조 IL-3Rα 항체에 대하여 실질적 동일성을 갖는다고 생각된다.
구조적으로 관련된 단백질과 기능적으로 관련된 단백질의 차이 때문에, 기능 또는 활성을 유지하기 위해 필요한 서열 동일성의 양은, 단백질, 영역 및 그 영역의 기능 또는 활성에 따라 상이하다. 단백질에서는 불과 30% 아미노산 서열 동일성이 존재하는 것만으로, 어떤 활성 또는 기능을 유지할 수 있지만, 일반적으로는 참조 서열에 대하여 보다 높은, 예를 들어, 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 98%의 동일성이 존재한다. 2 서열간의 동일성의 정도는, 당기술분야에서 공지의 컴퓨터 프로그램이나 수학 알고리즘을 이용하여 확인할 수 있다. 서열 동일성의 비율(상동성)을 계산하는 그와 같은 알고리즘에서는, 일반적으로, 비교 영역에 걸친 서열 갭과 미스매치를 계상한다. 예를 들어, BLAST(예를 들어, BLAST2.0) 검색 알고리즘(예를 들어, Altschul 등, J. Mol. Biol. 215 : 403 (1990) 참조, NCBI를 통하여 공적으로 입수 가능)는, 이하와 같은 예시적 검색 파라미터를 갖는다: 미스매치-2; 갭 개시 5; 갭 신장 2. 폴리펩티드 서열 비교에서는, BLASTP 알고리즘을, 일반적으로 PAM100, PAM250, BLOSUM62 또는 BLOSUM50. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 등의 스코어 행렬과 조합하여 이용하고, SSEARCH 서열 비교 프로그램도 동일성의 정도를 정량하기 위해 이용된다(Pearson 등, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85 : 2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132 : 185 (2000); 및 Smith 등, J. Mol. Biol. 147 : 195 (1981)). Delaunay에 기초하는 위상 맵핑을 이용하여 단백질 구조적 유사성을 정량하기 위한 프로그램도 개발되었다(Bostick 등, Biochem Biophys Res Commun. 304 : 320 (2003)).
「보존적 치환」은, 생물학적으로, 화학적으로 또는 구조적으로 유사한 잔기에 의한 1개의 아미노산의 치환이다. 생물학적으로 유사하다는 것은, 치환에 의해 생물 활성, 예를 들어, IL-3Rα 결합 활성이 파괴되지 않는다는 것을 의미한다. 구조적으로 유사하다는 것은, 아미노산이 동일한 정도의 길이의 측쇄를 갖는(예를 들어, 알라닌, 글리신 및 세린)다는 것, 또는 동일한 정도의 사이즈라는 것을 의미한다. 화학적 유사성이란, 잔기가 동일한 전하를 갖는다는 것 또는 친수성 또는 소수성이라고 하는 것을 의미한다. 특정한 예로는, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌 등의 일소수성 잔기의 별도의 것과의 치환, 또는 일극성 잔기의 별도의 것과의 치환, 예를 들어, 아르기닌의 리신과의 치환, 글루타민산의 아스파라긴산과의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴과의 치환, 세린의 트레오닌과의 치환 등을 들 수 있다.
또, 개변 항체에는, L-아미노산(및 이들의 혼합물)과 치환된 1종 이상의 D-아미노산, 구조적 및 기능적 유사체, 예를 들어, 합성 또는 비천연 아미노산 또는 아미노산 유사체를 갖는 펩티드 미메틱스 및 유도체화된 형태도 포함된다. 개변에는, 환상 구조, 예를 들어 아미노 말단 및 카르복시 말단의 분자간의 말단간 아미드 결합 또는 분자내 또는 분자간 디술피드 결합이 포함된다.
아미노산 개변의 비한정적인 또 다른 특정한 예로는, IL-3Rα의 부분 서열(subsequence) 및 프래그먼트를 들 수 있다. 예시적인 IL-3Rα의 부분 서열 및 프래그먼트는, 본 발명의 예시적 IL-3Rα 항체가 결합하는 IL-3Rα 서열의 일부를 포함한다. 또, 예시적인 IL-3Rα의 부분 서열 및 프래그먼트는, 면역원성 부분, 예를 들어, 본 발명의 예시적 IL-3Rα 항체가 결합하는 서열을 포함하는 IL-3Rα의 일부도 포함한다.
본 발명에 의하면, IL-3Rα 항체 및 비개변 또는 참조 IL-3Rα 항체의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 유지하는 IL-3Rα 항체 부분 서열 또는 프래그먼트를 코드하는 핵산이 제공된다. 본 명세서에서, 용어 「부분 서열」 또는 「프래그먼트」란, 전길이 분자의 일부분을 의미한다. IL-3Rα 항체를 코드하는 IL-3Rα 항체의 부분 서열은, 전길이 IL-3Rα보다 1개 이상 적은 아미노산(예를 들어, 아미노 또는 카르복시 말단 중 어느 하나로부터의 1개 이상의 내부 또는 말단 아미노산의 결실)을 갖는다. IL-3Rα 항체의 부분 서열은, 전길이 IL-3Rα 항체보다 1개 이상 적은 아미노산을 갖는다. 핵산 부분 서열은, 전길이 비교 핵산 서열보다 1개 이상 적은 뉴클레오티드를 갖는다. 따라서, 부분 서열은, 전길이 천연 IL-3Rα까지의 임의의 길이일 수 있다.
IL-3Rα 항체 부분 서열 및 프래그먼트는, 전길이 항체로서의 결합 친화성, 전길이 항체로서의 결합 특이성, 또는 전길이 항체로서의 1종 이상의 활성 또는 기능, 예를 들어, IL-3Rα 안타고니스트 또는 아고니스트 항체의 기능 또는 활성을 가질 수 있다. 항체에 관한 경우의 용어 「기능적 부분 서열」 및 「기능적 프래그먼트」란, 전길이 참조 항체로서의 1종 이상의 기능 또는 활성, 예를 들어, IL-3Rα 항체의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 유지하는 항체 부분을 의미한다. 예를 들어, IL-3Rα 또는 IL-3Rα의 단편과 결합하는 항체 부분 서열 또는 프래그먼트는 기능적 부분 서열이라고 생각된다.
항체 부분 서열 및 프래그먼트는 조합할 수 있다. 예를 들어, VL 또는 VH 부분 서열은, 링커 서열에 의해 연결할 수 있고, 그것에 의해 VL-VH 키메라를 형성할 수 있다. 단쇄 Fv(scFv) 부분 서열의 조합은, 링커 서열에 의해 연결할 수 있고, 그것에 의해 scFv-scFv 키메라를 형성할 수 있다. IL-3Rα 항체 부분 서열 및 프래그먼트는, 단쇄 항체 또는 가변 영역을 단독으로 또는 다른 IL-3Rα 항체 부분 서열의 전부 또는 일부와 조합하여 포함한다.
항체 부분 서열 및 프래그먼트는, 항체의 단백질 분해에 의한 가수분해, 예를 들어, 모든 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 조제할 수 있다. 펩신에서의 효소적 절단에 의해 부여된 항체 부분 서열 및 프래그먼트는, F(ab')2로서 표시되는 5S 프래그먼트를 부여한다. 이 프래그먼트는, 티올 환원제를 이용하여 더 절단할 수 있어, 3.5SFab' 1가 프래그먼트를 만들어 낼 수 있다. 또는, 펩신을 이용한 효소적 절단에서는, 2개의 1가 Fab' 프래그먼트와 Fc 프래그먼트가 직접 부여된다(예를 들어, 미국 특허 제4,036,945호 및 미국 특허 제4,331,647호; 및 Edelman 등, Methods Enymol. 1 : 422 (1967) 참조). 다른 항체 절단 방법, 예를 들어 1가 경쇄-중쇄 프래그먼트를 형성하기 위한 중쇄의 분리, 프래그먼트의 또 다른 절단, 또는 다른 효소적 또는 화학적인 방법도 사용해도 좋다.
단백질 및 항체, 그리고 이들의 부분 서열 및 프래그먼트는, 유전학적 방법으로 만들어 낼 수 있다. 기술은, 단백질 또는 항체를 코드하는 유전자의 전부 또는 일부를, Cos 세포 또는 대장균(E.coli) 등의 숙주 세포 중에서 발현시키는 것을 포함한다. 재조합 숙주 세포는, 전길이 또는 부분 서열, 예를 들어, scFv를 합성한다(예를 들어, Whitlow 등, In : Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2 : 97 (1991), Bird 등, Science 242 : 423 (1988); 및 미국 특허 제4,946,778호 참조). 단쇄 Fv 및 항체는, 미국 특허 제4,946,778호 및 미국 특허 제5,258,498호; Huston 등, Methods Enzymol 203 : 46 (1991); Shu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 7995 (1993); 및 Skerra 등, Science 240 : 1038 (1988)에 기재된 대로의 순서로 제작할 수 있다.
수식 형태에는, 유도체화된 서열, 예를 들어, 유리 아미노기가 아민염산염, p-톨루엔술포닐기, 카르보벤족시기를 형성하고 있고; 유리 카르복시기가 염, 메틸 및 에틸에스테르를 형성하고 있고; 유리 히드록실기(free hydroxl groups)가 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성하고 있는 아미노산, 및 천연에 존재하는 아미노산 유도체, 예를 들어, 4-히드록시프롤린(프롤린의 유도체), 5-히드록시리신(리신의 유도체), 호모세린(세린의 유도체), 오르니틴(리신의 유도체) 등이 포함된다. 수식은, 당기술분야에서 공지의 방법(예를 들어, PCR에 기초하는 부위 특이적, 결실 및 삽입 돌연변이 유발, 화학 수식 및 돌연변이 유발, 가교 등)을 이용하여 행할 수 있다.
단백질(예를 들어, 항체), 핵산 및 다른 조성물의 수식 형태에는, 부가물 및 삽입물이 포함된다. 예를 들어, 부가는, 모든 종류의 분자의, 단백질(예를 들어, 항체), 핵산 또는 다른 조성물과의 공유 또는 비공유 결합일 수 있다. 일반적으로, 부가 및 삽입은 상이한 기능 또는 활성을 부여한다.
부가물 및 삽입물에는, 융합(키메라) 폴리펩티드 또는 핵산 서열이 포함되며, 이들은 상기 서열과 공유 결합한 참조 천연(야생형) 서열 중에는 통상 존재하지 않는 1종 이상의 분자를 갖는 서열이다. 특정한 예는, 다기능 단백질(예를 들어, 다중 특이성 항체)을 만들어내기 위한 별도의 단백질(예를 들어, 항체)의 아미노산 서열이다.
또, 본 발명의 항체에는, 상이한 또는 보조 기능 또는 활성을 부여하기 위해, 1개 이상의 추가 도메인이 공유 결합하고 있는 키메라 또는 융합물도 포함된다. 항체에는, 2개 이상의 아미노산 서열이 서로 결합되어 있는, 자연계에서는 원래 존재하지 않는 키메라 또는 융합물이 포함된다.
본 발명에 의하면, 이종 도메인을 포함하는 IL-3Rα 항체 및 IL-3Rα 항체를 코드하는 핵산이 제공된다. 이종 도메인은, 아미노산 부가물 또는 삽입물일 수 있지만, 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 따라서, 이종 도메인은, 여러가지 상이한 종류의 소형 또는 대형 기능적 부분 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 그와 같은 부분에는, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소형 유기 화합물, 예를 들어 약물, 금속(금, 은) 등이 포함된다.
이종 도메인의 비한정적인 특정예로는, 예를 들어, 태그, 검출 가능한 표지 및 세포 상해성 약제를 들 수 있다. 태그 및 검출 가능한 표지의 특정한 예로는, T7-, His-, myc-, HA- 및 FLAG-태그; 효소(서양 와사비 퍼옥시다아제, 우레아제, 카탈라아제, 알카리성 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 트랜스페라아제); 효소 기질; 리간드(예를 들어, 비오틴); 수용체(아비딘); 방사성 핵종(예를 들어, C14, S35, P32, P33, H3, I125 및 I131); 전자 밀도 시약; 에너지 전달 분자; 상자성 표지; 플루오로포어(플루오레세인, 로다민, 피코에리트린); 발색단; 화학 발광제(이미다졸, 루시페라아제); 및 생물 발광제를 들 수 있다. 세포 상해성 약제의 특정한 예로는, 디프테리아 독소(diptheria, toxin), 콜레라 독소 및 리신을 들 수 있다.
단백질(예를 들어, 항체), 핵산 또는 다른 조성물과 부가물 또는 삽입물(예를 들어, 이종 도메인)과의 사이에, 2개의 실체가 상이한 기능 또는 활성을 적어도 일부 유지하도록, 링커 서열을 삽입해도 좋다. 링커 서열은, 어느 한쪽의 도메인을 촉진할 수 있거나 또는 어느 한쪽의 도메인과 상호작용할 수 있는 1종 이상의 특성을 갖고 있어도 좋고, 그와 같은 특성에는, 플렉시블 구조, 질서 이차 구조가 형성 불가능한 것, 또는 소수성 또는 하전성이 포함된다. 플렉시블 단백질 영역에서 일반적으로 보이는 아미노산에는, 글리신, 아스파라긴 및 세린이 포함된다. 다른 중성에 가까운 아미노산, 예를 들어 트레오닌 및 알라닌도 또한, 링커 서열에 이용해도 좋다. 링커 서열의 길이는 변동할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,087,329호 참조). 링커에는, 화학 가교제 및 결합제(conjugating agents), 예를 들어 술포-숙신이미딜 유도체(술포-SMCC, 술포-SMPB), 수베르산디숙신이미딜(DSS), 글루타르산디숙신이미딜(DSG) 및 타르타르산디숙신이미딜(DST)이 더 포함된다.
부가의 또 다른 예로는, 글리코실화, 지방산, 지질, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 포르밀화, 유비키틴화 및 보호 또는 차단기에 의한 유도체화, 그리고 수많은 화학 수식 중 어느 하나를 들 수 있다. 다른 치환 및 가능성에 관해서는 당업자라면 용이하게 알 수 있어, 본 발명의 범위 내라고 생각된다.
그와 같은 수식 서열은, 세포 발현 또는 in vitro 번역을 통한 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다. 폴리펩티드 및 핵산 서열은, 당기술분야에서 공지의 방법, 예를 들어, 자동 펩티드 합성 장치(예를 들어, Applied Biosystems, Foster City, CA 참조)를 이용한 화학 합성에 의해서도 만들어 낼 수 있다.
치환물, 부분 서열 및 부가물 등의 수식 및 변이 항체는, IL-3Rα 항체의 검출 가능한 활성을 유지할 수 있는 것이다. 일실시형태에서는, 수식 항체는, IL-3Rα 분자에 대한 결합 활성을 가지며, 이펙터 세포를 중심으로 한 면역 시스템에 의한 IL-3Rα 발현 세포의 저감 또는 제거를 유도한다. IL-3Rα 발현 세포의 기능 제어에 관여하여, 세포의 생존, 증식, 휴지, 세포사 등을 유도한다. 세포사에는, 아포토시스, 네크로시스, 오토파지 등을 포함한다.
(IL-3Rα의 스크리닝 방법)
본 발명에 의하면, IL-3Rα를 스크리닝하고, 검출하여, 동정하는 무세포 방법(예를 들어, 용액 중에서 고상으로) 및 세포에 기초한 방법(예를 들어, in vitro 또는 in vivo)이 또한 제공된다. 이들 방법은, 용액 중에서, in vitro에서 생체 재료 또는 샘플을 이용하여, 및 in vivo에서, 예를 들어, 동물 유래의 세포(예를 들어, 림프구)의 샘플에서 실시할 수 있다. 일실시형태에서는, 방법은, 생체 재료 또는 샘플을, IL-3Rα와의 항체의 결합을 가능하게 하는 조건하에서 IL-3Rα와 결합하는 항체와 접촉시키는 것과; IL-3Rα와의 항체의 결합에 관해 분석하는 것을 포함한다. 항체를 IL-3Rα와 결합시킴으로써 IL-3Rα의 존재가 검출된다. 일양태에서는, IL-3Rα는 세포 또는 조직에 존재한다. 별도의 양태에서는, 상기 생체 재료 또는 샘플은 포유류 피험체로부터 얻어진다.
조성물, 예를 들어 단백질(예를 들어, IL-3Rα 항체), 재료, 샘플, 또는 처치에 관해 이용되는 경우의 용어 「접촉시키는 것」이란, 그 조성물(예를 들어, IL-3Rα 항체)과 다른 참조되는 실체와의 직접 또는 간접 상호작용을 의미한다. 직접 상호작용의 특정한 예는 결합이다. 간접 상호작용의 특정한 예는, 조성물이 중간 분자에 작용하고, 이 중간 분자가 다음에 참조되는 실체에 작용한다고 하는 경우이다. 따라서, 예를 들어, 세포(예를 들어, 림프구)를 IL-3Rα 항체와 접촉시키는 것에는, 그 항체를(예를 들어, IL-3Rα와의 결합을 통하여) 그 세포와 결합시키는 것, 또는 그 항체를 중간물에 작용시키고, 이 중간물이 다음에 그 세포에 작용하는 것이 포함된다.
용어 「분석하는 것」 및 「측정하는 것」, 그리고 그 문법상의 변형은, 본 명세서에서 동일한 의미로 이용되며, 정성적 측정 또는 정량적 측정 중 어느 하나, 또는 정성적 측정 및 정량적 측정 모두를 가리킨다. 이들 용어가 결합에 관해 이용되는 경우, 본 명세서에 기재되어 있고, 당기술분야에서 공지의 여러가지 방법을 포함하는, 상대량, 결합의 친화성 또는 특이성을 평가하는 모든 수단이 의도된다. 예를 들어, IL-3Rα와의 IL-3Rα 항체의 결합은, 플로우 사이토메트리 분석에 의해 분석 또는 측정할 수 있다.
(항체의 조제)
본 발명은, IL-3Rα 양성 세포 상해 활성을 갖는 인간 IL-3Rα 항체를 제작하기 위한 방법도 제공한다. 일실시형태에서는, 방법은, 인간 Fc 재조합 단백질과 콘쥬게이트된 인간 IL-3Rα 세포외 도메인 또는 IL-3Rα 유전자 도입 세포를, 인간 면역글로불린을 발현할 수 있는 동물(예를 들어, 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스제닉 소)에 투여하는 것; 상기 동물을 인간 IL-3Rα 항체의 발현에 관해 스크리닝하는 것; 인간 IL-3Rα 항체를 생성하는 동물을 선택하는 것; 선택된 동물로부터 항체를 단리하는 것을 포함한다.
항체 제작에 적합한 IL-3Rα 단백질은, 여러가지 표준 단백질 정제 또는 재조합 발현 기술 중 어느 하나에 의해 만들어 낼 수 있다. 예를 들어, IL-3Rα 서열은, 표준적인 펩티드 합성 기술, 예를 들어 고상 합성에 의해 만들어 낼 수 있다. 단백질의 일부분에는, 발현 또는 합성된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, FLAG 태그, T7 태그 또는 폴리히스티딘 서열 등의 아미노산 서열을 포함해도 좋다. 그 단백질은 세포 중에서 발현되어, 정제될 수 있다. 그 단백질은, 재조합법에 의해 보다 큰 단백질(예를 들어, 융합물 또는 키메라)의 일부로서 발현될 수 있다. 면역 응답을 일으키기에 적합한 IL-3Rα의 형태에는, IL-3Rα 부분 서열, 예를 들어 면역원성 프래그먼트가 포함된다. 또 다른 형태의 IL-3Rα로는, IL-3Rα 발현 세포, IL-3Rα 함유 조제물 또는 세포 추출물 또는 획분, 부분 정제 IL-3Rα를 들 수 있다.
폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 제작하는 방법은, 당기술분야에서 공지이다. 예를 들어, IL-3Rα 또는 그 면역원성 프래그먼트는, 원한다면, 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 오브알부민(예를 들어, BSA) 등의 담체와 콘쥬게이트되거나, 또는 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬반트 등의 아쥬반트와 혼합되어, 동물을 면역하기 위해 사용된다. 하이브리도마 기술을 이용하여, IL-3Rα에 응답하는 면역 동물 유래의 비세포를 단리하여, 골수종 세포와 융합할 수 있다. 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체는, IL-3Rα 또는 그 면역원성 프래그먼트와의 반응성에 관해 스크리닝할 수 있다.
면역할 수 있는 동물에게는, 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 소 또는 몰모트가 포함된다. 초회 및 임의 선택의 추가 면역은, 정맥내 경로, 복강내 경로, 근육내 경로 또는 피하 경로에 의한 것이어도 좋다. 또한, 면역 응답을 높이기 위해, 항원을, 오브알부민 또는 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH), 티로글로불린 및 파상풍 톡소이드 등의 별도의 단백질과 결합할 수 있거나, 또는 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬반트 등의 아쥬반트와 혼합할 수 있다. 초회 및 임의 선택의 추가 면역은, 복강내 경로, 근육내 경로, 안구내 경로 또는 피하 경로에 의한 것이어도 좋다. 추가 면역은, 동일한 농도 또는 상이한 농도의 IL-3Rα 조제물이어도 좋고, 규칙 또는 불규칙한 간격이어도 좋다.
동물에는, 인간 유전자좌를 포함하도록 유전자 수식된 것이 포함되며, 그것을 이용하여 인간 항체를 만들어 낼 수 있다. 1종 이상의 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 트랜스제닉 동물에 관해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,939,598호, WO02/43478 및 WO 02/092812에 기재되어 있다. 종래의 하이브리도마 기술을 이용하여, 항원에 대하여 고응답물인 면역 마우스 유래의 비세포를 단리하여, 골수종 세포와 융합할 수 있다. IL-3Rα와 결합하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
인간 폴리클로날 항체 및 인간 모노클로날 항체를 제작하기 위한 또 다른 방법이 기재되어 있다(예를 들어, Kuroiwa 등, Nat. Biotechnol. 20 : 889 (2002); WO98/24893; WO92/01047; WO96/34096; WO96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 미국 특허 제5,625,126호; 미국 특허 제5,633,425호; 미국 특허 제5,569,825호; 미국 특허 제5,661,016호; 미국 특허 제5,545,806호; 미국 특허 제5,814,318호; 미국 특허 제5,885,793호; 미국 특허 제5,916,771호; 및 미국 특허 제5,939,598호 참조).
항체에 관해 이용되는 경우의 용어 「인간」이란, 항체의 아미노산 서열이 완전히 인간 아미노산 서열, 즉 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역 및 인간 정상 영역이라고 하는 것을 의미한다. 따라서, 모든 아미노산은, 인간 아미노산이거나 또는 인간 항체 중에 존재하는 것이다. 비인간 항체인 항체는, 비인간 아미노산 잔기를 인간 항체 중에 존재하는 아미노산 잔기와 치환함으로써 완전 인간 항체로 할 수 있다. 인간 항체 중에 존재하는 아미노산 잔기, CDR 영역 맵 및 인간 항체 콘센서스 잔기에 관해서는, 당기술분야에서 공지이다(예를 들어, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제4판 US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987); Chothia 및 Lesk (1987) 참조. 22의 기지 인간 VHIII 서열을 대상으로 한 조사에 기초한 인간 VH 서브 그룹 III의 콘센서스 서열 및 30의 기지 인간 κ I 서열을 대상으로 한 조사에 기초한 인간 VL κ쇄 서브 그룹 I의 콘센서스 서열에 관해서는, Padlan Mol. Immunol. 31 : 169 (1994); 및 Padlan Mol. Immunol. 28 : 489 (1991)에 기재되어 있다. 따라서, 인간 항체에는, 1개 이상의 아미노산 잔기가 임의의 다른 인간 항체 중에 존재하는 1개 이상의 아미노산과 치환되어 있는 항체가 포함된다.
IL-3Rα 항체에는, 예를 들어, CDR 그래프팅(CDR-grafting) (EP 239,400; WO91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 미국 특허 제5,530,101호; 및 미국 특허 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing) (EP592,106; EP519,596; Padlan, Molecular Immunol. 28 : 489 (1991); Studnicka 등, Protein Engineering 7 : 805 (1994); Roguska. 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91 : 969 (1994)) 및 체인 셔플링(chain shuffling) (미국 특허 제5,565,332호) 등의 당기술분야에서 공지의 기술을 이용하여 만들어 낼 수 있는 인간화 항체가 포함된다. 인간화 항체를 만들어 내기 위해서는, 지금까지 인간 콘센서스 서열(Padlan, Mol. Immunol. 31 : 169 (1994); 및 Padlan, Mol. Immunol. 28 : 489 (1991))이 이용되어 왔다(Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 4285 (1992); 및 Presta 등, J. Immunol. 151 : 2623 (1993)).
항체에 관해 이용되는 경우의 용어 「인간화」란, 항체의 아미노산 서열이 억셉터-인간 면역글로불린 분자 중에 원하는 항원과 특이적으로 결합하는 1 이상의 상보성 결정 영역(CDR)의 비인간 아미노산 잔기(예를 들어, 마우스, 래트, 염소, 토끼 등)와, Fv 프레임워크 영역(FR) 중에 1 이상의 인간 아미노산 잔기(CDR에 플랭킹하는 아미노산 잔기임)를 갖는다는 것을 의미한다. 「영장류화」라고 불리는 항체는, 억셉터-인간 면역글로불린 분자 및 프레임워크 영역의 아미노산 잔기가 임의의 인간 잔기에 더하여, 임의의 영장류 아미노산 잔기(예를 들어, 원숭이, 긴팔원숭이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 마카크 원숭이)일 수 있다는 것을 제외하면, 「인간화」의 의미의 범위내이다. 면역글로불린의 인간 FR 잔기는, 대응하는 비인간 잔기와 치환할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항원 친화성 또는 특이성을 개변하는, 일반적으로는 높이기 위해, CDR 또는 인간 프레임워크 영역 중의 잔기를, 비인간 CDR 또는 프레임워크 영역 도너 항체 유래의 대응하는 잔기와 치환할 수 있다. 인간화 항체는, 인간 항체에도 도너 CDR 또는 프레임워크 서열에도 보이지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 또는 도너 비인간 항체에는 보이지 않는 특정 위치에서의 FR 치환은, 그 위치에서 결합 친화성 또는 특이성 인간 항체를 개선한다고 예측될 수 있다. 분자 모델링에 기초하는 항체 프레임워크 및 CDR 치환은, 당기술분야에서는 주지이며, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 동정하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링이나 특정 위치에서의 이상 프레임워크 잔기를 동정하기 위한 서열 비교에 의한 것이다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 및 Riechmann 등, Nature 332 : 323 (1988) 참조).
IL-3Rα 항체에는 키메라 항체가 포함된다. 본 명세서에서, 항체에 관해 이용되는 경우의 용어 「키메라」 및 그 문법상의 변형은, 항체의 아미노산 서열이, 2개 이상의 상이한 종에 유래하는, 2개 이상의 상이한 종으로부터 얻어지거나 또는 단리되거나, 또는 2개 이상의 상이한 종에 기초하는 1 이상의 부분을 함유한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체의 일부분은 인간(예를 들어, 정상 영역)일 수 있고, 항체의 별도의 부분은 비인간(예를 들어, 쥐 중쇄 또는 쥐 경쇄 가변 영역)일 수 있다. 따라서, 키메라 항체의 예는, 항체의 상이한 부분이 상이한 종에서 기원하는 항체이다. 키메라 항체는, 인간화 또는 영장류화 항체와는 달리, 항체의 임의의 영역에 상이한 종의 서열을 가질 수 있다.
키메라 항체를 제작하기 위한 방법은 당기술분야에서 공지이다(예를 들어, Morrison, Science 229 : 1202 (1985); Oi 등, Bio Techniques 4 : 214 (1986); Gillies 등, J. Immunol. Methods 125 : 191 (1989); 및 미국 특허 제5,807,715호; 미국 특허 제4,816,567호; 및 미국 특허 제4,816,397호). 예를 들어, Munro, Nature 312 : 597 (1984); Neuberger 등, Nature 312 : 604 (1984); Sharon 등, Nature 309 : 364 (1984); Morrison 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81 : 6851 (1984); Boulianne 등, Nature 312 : 643 (1984); Capon 등, Nature 337 : 525 (1989); 및 Traunecker 등, Nature 339 : 68 (1989)에서는, 어떤 종의 항체 유래의 가변 영역이 별도의 종의 가변 영역과 치환되어 있는 키메라 항체가 기재되어 있다.
또, IL-3Rα 항체는, 하이브리도마 기술, 재조합 기술 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 이용하더라도 제작할 수 있다(미국 특허 제4,902,614호, 미국 특허 제4,543,439호 및 미국 특허 제4,411,993호 참조; Monoclonal Antibodies. Hybridomas : A New Dimensionin Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn 및 Bechtol (편), 1980년 및 Harlow 등, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제2판 1988년도 참조한 것).
본 발명의 인간 항인간 IL-3Rα 항체는, 여러가지 형태의 가용화형 재조합 인간 IL-3Rα 단백질 또는 IL-3Rα를 발현하는 세포주에서 면역한 염색체 도입 마우스(KM mice(상표))를 이용하여 생산되었다(WO02/43478, WO 02/092812 및 Ishida, 등, IBC's 11th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000)). 인간 항인간 항체는, 비형질전환 친(親)세포계가 아니라, 인간 IL-3Rα 안정 트랜스펙트 세포계, 예를 들어 Jurkat-IL-3Rα 세포 및 L929-IL-3Rα 세포를 검출할 수 있도록 염색하여, 그 항체가 인간 IL-3Rα와 특이적으로 결합하는 것을 나타냈다.
본 발명의 항체는, κ경쇄 서열 또는 λ경쇄 서열, 천연에 존재하는 항체에 있는, 어느 한쪽의 전길이, 이들의 혼합물(즉 κ쇄 서열과 λ쇄 서열의 융합물) 및 이들의 부분 서열/프래그먼트를 가질 수 있다. 천연에 존재하는 항체 분자에는, 2개의 κ경쇄 또는 2개의 λ경쇄가 포함되어 있다.
본 발명에 의하면, IL-3Rα와 특이적으로 결합하는 항체를 제작하는 방법이 또한 제공된다. 일실시형태에서는, IL-3Rα 항체를 제작하기 위한 방법은, 원한다면, 인간 Fc 재조합 단백질과 콘쥬게이트된, 인간 IL-3Rα, 부분 서열 또는 프래그먼트(예를 들어, IL-3Rα 세포외 도메인)를, 인간 면역글로불린을 발현할 수 있는 동물(예를 들어, 트랜스제닉 마우스 또는 트랜스제닉 소)에 투여하는 것, 그 동물을 인간 IL-3Rα 항체의 발현에 관해 스크리닝하는 것, 인간 IL-3Rα 항체를 생성하는 동물을 선택하는 것, 및 선택된 동물로부터 항체를 단리하는 것을 포함한다. 일양태에서는, 이 방법에 의해 인간 IL-3Rα 항체가 IL-3Rα 안타고니스트 또는 아고니스트 활성을 갖는지의 여부가 판정된다.
이펙터 활성이란, 항체의 Fc 영역을 통해 야기되는 항체 의존성의 활성을 말하며, 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC 활성), 보체 의존성 상해 활성(CDC 활성)이나, 마크로파지나 수상 세포 등의 식세포에 의한 항체 의존성 파고사이토시스(Antibody dependent phagocytosis, ADP 활성) 등이 알려져 있다.
본 발명의 항IL-3Rα 모노클로날 항체의 이펙터 활성을 제어하는 방법으로는, 항체의 Fc 영역의 297번째 아스파라긴(Asn)에 결합하는 N 결합 복합형 당쇄의 환원 말단에 존재하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 α-1,6 결합하는 푸코스(코어푸코스라고도 함)의 양을 제어하는 방법(WO2005/035586, WO2002/31140, WO00/61739)이나, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 제어하는 방법 등이 알려져 있다. 본 발명의 항IL-3Rα 모노클로날 항체에는 어떤 방법을 이용하더라도, 이펙터 활성을 제어할 수 있다.
항체의 Fc의 N 결합 복합형 당쇄의 코어푸코스의 함량을 제어함으로써, 항체의 이펙터 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 항체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 저하시키는 방법으로는, 디푸코스화(defucosylated or non-fucosylated)를 들 수 있다. 디푸코스화란, α1,6-푸코스 전이 효소 유전자가 결손된 CHO 세포를 이용하여 항체를 발현하는 것으로, 푸코스가 결합하지 않은 항체를 취득할 수 있다. 푸코스가 결합하지 않은 항체는 높은 ADCC 활성을 갖는다. 한편, 항체의 Fc에 결합하고 있는 N 결합 복합형 당쇄에 결합하는 푸코스의 함량을 증가시키는 방법으로는, α1,6-푸코스 전이 효소 유전자를 도입한 숙주 세포를 이용하여 항체를 발현시킴으로써, 푸코스가 결합하고 있는 항체를 취득할 수 있다. 푸코스가 결합하고 있는 항체는, 푸코스가 결합하지 않은 항체보다 낮은 ADCC 활성을 갖는다.
또, 항체의 Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 ADCC 활성이나 CDC 활성을 증가 또는 저하시킬 수 있다. 예를 들어, US2007/0148165에 기재된 Fc 영역의 아미노산 서열을 이용함으로써, 항체의 CDC 활성을 증가시킬 수 있다. 또, US6,737,056, US7,297,775나 US7,317,091에 기재된 아미노산 개변을 행함으로써, ADCC 활성 또는 CDC 활성을, 증가시킬 수도 있고 저하시킬 수도 있다. 또한, 전술한 방법을 조합하여 하나의 항체에 사용함으로써, 항체의 이펙터 활성이 제어된 항체를 취득할 수 있다.
본 발명에 의하면, 벡터 등의 본 발명의 핵산 서열이 또한 제공된다. 일실시형태에서는, 벡터에는, IL-3Rα 항체, 그 부분 서열 또는 프래그먼트를 코드하는 핵산 서열이 포함된다.
핵산은, 다양한 길이일 수 있다. 본 발명 IL-3Rα 항체 또는 그 부분 서열을 코드하는 핵산의 길이는, 일반적으로, 약 100개 뉴클레오티드?600개 뉴클레오티드, 또는 그와 같은 길이의 범위 이내에서의 임의의 수치 또는 수치 영역, 100?150개, 150?200개, 200?250개, 250?300개, 300?350개, 350?400개, 400?450개, 450?500개, 500?550개, 또는 약 550?600개 뉴클레오티드 길이, 또는 그와 같은 길이의 범위 이내에서의 임의의 수치 또는 수치 영역 또는 값(any numerical value or range or value)에 미친다. 본 발명 IL-3Rα 항체 또는 그 부분 서열을 코드하는 핵산과 특이적으로 하이브리다이즈하는 핵산의 길이는, 일반적으로, 약 10?20개, 20?30개, 30?50개, 50?100개, 100?150개, 150?200개, 200?250개, 250?300개, 300?400개, 400?500개, 500?600개 뉴클레오티드, 또는 그와 같은 길이의 범위 이내에서의 임의의 수치 또는 수치 영역에 미친다.
용어 「핵산」 및 「폴리뉴클레오티드」란, 인산에스테르 결합 또는 동등물에 의해 결합된 적어도 2개 이상의 리보 또는 디옥시-리보핵산 염기쌍(뉴클레오티드)을 가리킨다. 핵산에는, 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오시드가 포함된다. 핵산에는, 단일 분자, 이중 분자 또는 삼중 분자, 환상 분자 또는 선형 분자가 포함된다. 예시적인 핵산으로는, 한정되는 것은 아니지만 : RNA, DNA, cDNA, 게놈 핵산, 천연에 존재하는 핵산 및 비천연 핵산, 예를 들어, 합성 핵산을 들 수 있다. 짧은 핵산 및 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 10?20개, 20?30개, 30?50개, 50?100개 뉴클레오티드)는, 일반적으로 「올리고뉴클레오티드」또는 단일쇄 또는 이중쇄 DNA의 「프로브」라고 불린다.
핵산은, 여러가지 표준적인 클로닝 기술 및 화학 합성 기술을 이용하여 만들어낼 수 있다. 기술로는, 한정되는 것은 아니지만, 항체 코드 서열과 어닐링 가능한 프라이머(예를 들어, 축중 프라이머 혼합물)를 이용한 게놈 DNA 또는 cDNA 표적의 핵산 증폭, 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 들 수 있다. 또, 핵산은, 화학 합성(예를 들어, 고상 포스포아미다이트 합성) 또는 유전자로부터의 전사에 의해서도 만들어낼 수 있다. 만들어진 서열은, 그 후, in vitro에서 번역하거나, 또는 플라스미드에 클로닝하여, 증식시킨 후, 세포(예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어 효모 또는 세균, 진핵 생물(동물 또는 포유류 세포 또는 식물 등))에서 발현시킬 수 있다.
벡터는, 핵산의 삽입 또는 흡수에 의해 조작할 수 있는 매개물이다. 벡터로는, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 원핵 생물(세균) 벡터 및 진핵 생물(식물, 균류, 포유류) 벡터를 들 수 있다. 벡터는, in vitro에서 또는 in vivo에서의 핵산의 발현을 위해 이용할 수 있다. 그와 같은 벡터는, 「발현 벡터」라고 불리며, IL-3Rα 항체, 그 부분 서열 및 프래그먼트를 코드하는 핵산을 비롯한 핵산의 도입이나, 코드되는 단백질의 in vitro에서(예를 들어, 용액 중에서 또는 고상에서), 세포에서 또는 in vivo에서 피험체에서의 발현에 유용하다.
또, 벡터는, 핵산의 조작에도 이용할 수 있다. 유전자 조작에서는, 「클로닝 벡터」를 사용하여, in vitro에서(예를 들어, 용액 중에서 또는 고상에서), 세포에서 또는 in vivo에서 피험체에 있어서, 삽입된 핵산을 전사 또는 번역할 수 있다.
벡터는, 일반적으로, in vitro에서 또는 in vivo에서의 세포에서의 증식을 위한 복제 기점을 포함한다. 벡터 내에 존재하는 발현 제어 엘리멘트 등의 제어 엘리멘트는, 필요에 따라, 전사 및 번역을 용이하게 하기 위해 포함시킬 수 있다.
벡터는 선택 마커를 포함하는 경우가 있다. 「선택 마커」는, 유전자를 함유하는 세포의 선택을 가능하게 하는 유전자이다. 「양의 선택」이란, 양의 선택이 발생하여, 선택 마커를 함유하는 세포를 선택하는 프로세스를 가리킨다. 약제 내성이 양의 선택 마커의 일례이며, 마커를 함유하는 세포는 약제 함유 배양 배지 중에서 생존하고, 마커가 없는 세포는 사멸한다. 선택 마커로는, G418 내성을 부여하는 neo; 하이그로마이신 내성을 부여하는 hygr; 및 퓨로마이신 내성을 부여하는 puro 등의 약제 내성 유전자를 들 수 있다. 다른 양의 선택 마커 유전자에는, 마커를 함유하는 세포의 동정 또는 스크리닝을 가능하게 하는 유전자가 포함된다. 이러한 유전자로는, 특히, 형광 단백질(GFP 및 GFP 유사 발색단, 루시페라아제) 유전자, lacZ 유전자, 알카리성 포스파타아제 유전자 및 CD8 등의 표면 마커를 들 수 있다. 「음의 선택」이란, 적절한 음의 선택 약제에 폭로하여, 음의 선택 마커를 함유하는 세포를 사멸시키는 프로세스를 가리킨다. 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘키나아제(HSV-tk) 유전자를 함유하는 세포(Wigler 등, Cell 11 : 223 (1977))는 약제 간시클로비르(GANC)에 대하여 감수성이다. 마찬가지로, gpt 유전자는 세포를 6-티옥산틴 감수성으로 한다.
바이러스 벡터에는, 레트로바이러스(retroviral)(분열 세포뿐만 아니라 비분열 세포에도 감염시키기 위한 렌티바이러스), 포말형 바이러스(미국 특허 제5,624,820호, 미국 특허 제5,693,508호, 미국 특허 제5,665,577호, 미국 특허 제6,013,516호 및 미국 특허 제5,674,703호; WO92/05266 및 WO92/14829), 아데노바이러스(미국 특허 제5,700,470호, 미국 특허 제5,731,172호 및 미국 특허 제5,928,944호), 아데노 수반 바이러스(AAV)(미국 특허 제5,604,090호), 단순 헤르페스 바이러스 벡터(미국 특허 제5,501,979호), 사이토메갈로바이러스(CMV)계 벡터(미국 특허 제5,561,063호), 레오바이러스, 로터바이러스 게놈, 시미안 바이러스40(SV40) 또는 유두종 바이러스(Cone 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 6349 (1984); Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman 편, 1982년; Sarver 등, Mol. Cell. Biol. 1 : 486 (1981); 미국 특허 제5,719,054호)에 기초하는 것이 포함된다. 아데노바이러스는 천천히 복제 및/또는 최종 분화한 세포에 효율적으로 감염하며, 이 아데노바이러스를 이용하여 천천히 복제하는 세포 및/또는 최종 분화한 세포를 표적으로 할 수 있다. 발현에 유용한 또 다른 바이러스 벡터로는, 파르보바이러스, 노워크바이러스, 코로나바이러스, 파라믹소바이러스 및 라브도바이러스, 토가바이러스(예를 들어, 신드비스바이러스 및 셈리키삼림바이러스) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 들 수 있다.
핵산을 포함하는 벡터는, 그 핵산이 발현 제어 엘리멘트에 기능할 수 있는 형태로 연결되어 있는 경우에 발현될 수 있다. 용어 「기능할 수 있는 형태로 연결된」(operably linked)이란, 그것에 관한 엘리멘트간의 물리적 또는 기능적 관계에 의해 이들의 엘리멘트가 의도된 것처럼 기능하는 것이 가능해진다는 것을 가리킨다. 따라서, 발현 제어 엘리멘트에 「기능할 수 있는 형태로 연결된」핵산이란, 제어 엘리멘트가 핵산 전사, 필요에 따라, 그 전사물의 번역을 모듈레이트한다는 것을 의미한다.
「발현 제어 엘리멘트」 또는 「발현 제어 서열」은, 기능할 수 있는 형태로 연결된 핵산의 발현에 영향을 미치는 폴리뉴클레오티드이다. 프로모터 및 인핸서는, 발현 제어 엘리멘트 및 서열의 비한정적인 특정예이다. 「프로모터」는, 하류(3' 방향) 핵산 서열의 전사를 개시 가능한 시스 작용 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열에는, 전사 개시를 촉진하는 뉴클레오티드가 포함된다. 인핸서도 핵산 발현을 조절하지만, 그것이 기능할 수 있는 형태로 연결되어 있는 핵산의 전사 개시 부위로부터 떨어져 작용한다. 인핸서는, 핵산의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나에 존재하는 경우, 또한 핵산 내(예를 들어, 인트론 또는 코드 서열)에 존재하는 경우에도 작용한다. 또 다른 발현 제어 엘리멘트로는, 리더 서열 및 융합 파트너 서열, 다중 유전자를 만들어내기 위한 내재성 리보솜 결합 부위(IRES) 엘리멘트, 또는 폴리시스트론성 메시지, 인트론의 스플라이싱 시그널, mRNA의 인프레임 번역을 가능하게 하기 위한 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지, 목적으로 하는 전사물의 적절한 폴리아데닐화를 가져오는 폴리아데닐화 시그널 및 정지 코돈을 들 수 있다.
발현 제어 엘리멘트에는, 기능할 수 있는 형태로 연결된 핵산의 전사가 시그널 또는 자극 부재로 발생하는 「구성적」 엘리멘트가 포함된다. 시그널 또는 자극에 응답하여 발현을 부여하여, 기능할 수 있는 형태로 연결된 핵산의 발현을 증감하는 발현 제어 엘리멘트는 「조절 가능하다」. 시그널 또는 자극에 응답하여 기능할 수 있는 형태로 연결된 핵산의 발현을 증가하는 조절 가능한 엘리멘트는, 「유도 엘리멘트」라고 불리고 있다. 시그널 또는 자극에 응답하여 기능할 수 있는 형태로 연결된 핵산의 발현을 감소하는 조절 가능한 엘리멘트는, 「억제 엘리멘트」(즉, 시그널은 발현을 감소시키고; 그 시그널이 제거되거나 또는 존재하지 않는 경우에, 발현이 증가한다)라고 불리고 있다.
세균의 발현에서는, 구성적 프로모터에는, T7, 그리고 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등의 유도 프로모터가 포함된다. 곤충 세포계에서는, 구성적 또는 유도 프로모터(예를 들어, 에크디손)가 이용될 수 있다. 효모에서는, 구성적 프로모터에는, 예를 들어, ADH 또는 LEU2 및 GAL 등의 유도 프로모터가 포함된다(예를 들어, Ausubel 등, In : Current Protocols in Molecular Biology, 제2권, 제13장, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience 편, 1988년; Grant 등, In : Methods in Enzymology, 153 : 516-544 (1987), Wu & Grossman 편, 1987년, Acad. Press, N. Y.; Glover, DNA Cloning, 제II권, 제3장, IRL Press, Wash., D. C., 1986년; Bitter, In : Methods in Enzymology, 152 : 673-684 (1987), Berger & Kimmel 편, Acad. Press, N.Y.; 및 Strathern 등, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces Cold Spring Harbor Press편, 제I권 및 제II권 (1982) 참조).
포유류의 발현에서는, 바이러스 또는 다른 기원의 구성적 프로모터가 이용될 수 있다. 예를 들어, CMV, SV40 또는 바이러스의 긴 말단 반복 서열(LTR) 등, 또는 포유류 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 II A 프로모터; 열쇼크 프로모터, 스테로이드/갑상선 호르몬/레티노인산 응답 엘리멘트) 또는 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 마우스 유방암 바이러스 LTR) 유래의 유도 프로모터가 이용된다.
발현 제어 엘리멘트에는, 특정한 조직 또는 세포종에서 활성인 엘리멘트가 포함되며, 이러한 엘리멘트는 「조직 특이적 발현 제어 엘리멘트」라고 불리고 있다. 조직 특이적 발현 제어 엘리멘트는, 일반적으로, 특정한 세포 또는 조직종에서 보다 활성이 높지만, 이것은 이 조직 특이적 발현 제어 엘리멘트가, 다른 세포 또는 조직종에 비해, 그 특정한 세포 또는 조직종에서 활성인 전사 활성화 단백질, 또는 다른 전사 조절 인자에 의해 인식되기 때문이다. 그와 같은 발현 제어 엘리멘트의 비한정적인 특정예는, 헥소키나아제 II, COX-2, α-페토프로테인, 암태아성 항원, DE3/MUC1, 전립선 특이적 항원, C-erB2/neu, 글루코스 의존성 인슐린 분비 자극 폴리펩티드(GIP), 텔로머라아제 역전사 효소 및 저산소증-응답성 프로모터 등의 프로모터이다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 IL-3Rα 핵산 또는 벡터로 형질전환 또는 트랜스펙트된 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포로는, 한정되는 것은 아니지만, 원핵 세포 및 진핵 세포, 예를 들어 세균, 진핵(효모), 식물, 곤충 및 동물(예를 들어, 영장류 및 인간 등의 포유류)의 세포를 들 수 있다. 형질전환 세포의 비한정적인 예로는, 재조합 박테리오파지 핵산, 플라스미드 핵산 또는 코스미드 핵산 발현 벡터로 형질전환된 세균; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 컬리플라워모자이크바이러스, CaMV; 담배모자이크바이러스, TMV)에 감염시킨 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큐로바이러스)에 감염시킨 곤충 세포; 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아바이러스)에 감염시킨 동물 세포, 또는 안정적인 발현을 위해 조작된 형질전환 동물 세포를 들 수 있다. IL-3Rα 항체, 그 부분 서열 및 프래그먼트를 발현하는 포유류 숙주 세포의 비한정적인 예에는 CHO 세포가 있다. 숙주 세포는, 초대 세포 분리주, 단리된 이차 세포 또는 게대 배양 세포, 또는 주화 세포 또는 불사화 세포 배양물 유래의 복수의 세포 또는 세포 집단이어도 좋다.
세포(예를 들어, 숙주 세포) 또는 생물에 관해 이용되는 경우의 용어 「형질전환된」 또는 「트랜스펙트된」이란, 외인성 분자, 예를 들어, 단백질 또는 핵산(예를 들어, 트랜스진)의 세포에 대한 흡수후의 세포에서의 유전자 변화를 의미한다. 따라서, 「트랜스펙트된」 또는 「형질전환된」세포는, 외인성 분자가 사람의 손으로, 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 도입되어 있는 세포, 또는 그 후대이다.
핵산 또는 단백질은, 세포 및 그 후대에서 안정적으로 또는 일시적으로 트랜스펙트 또는 형질전환(발현)할 수 있다. 세포를 증식시켜, 도입한 단백질을 발현시킬 수 있거나, 또는 핵산을 전사할 수 있다. 복제 중에 발생하는 돌연변이가 존재할 가능성이 있기 때문에, 트랜스펙트 또는 형질전환 세포의 후대는, 친세포와 동일하지 않은 경우가 있다.
일반적으로, 세포 트랜스펙션 또는 형질전환에서는 벡터를 사용한다. 벡터는, 바이러스 입자 또는 소포 내에 포함시킬 수 있고, 원한다면, 표적 세포 리간드 또는 수용체와 결합하는 그 입자 또는 소포 표면에 단백질을 포함시킴으로써 특정한 세포종으로 향하게 할 수 있다. 따라서, 바이러스 입자 또는 소포 자체, 또는 바이러스 표면의 단백질을 만들어, in vitro에서, ex vivo에서 또는 in vivo에서의 트랜스펙션 또는 형질전환을 목적으로 하여 세포를 표적으로 할 수 있다. 따라서, in vitro에서, in vivo에서 및 ex vivo에서의 세포, 조직 또는 기관으로의 바이러스 및 비바이러스 벡터 송달 방법이 포함된다.
또, 표적 세포(예를 들어, 숙주 세포)에 대한 핵산의 도입은, 침투압 충격(예를 들어, 인산칼슘), 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 세포 융합 등과 같은 당기술분야에서 공지인 방법으로도 행할 수 있다. in vitro에서, ex vivo에서 및 in vivo에서의 핵산 및 폴리펩티드의 도입은, 다른 기술을 이용하더라도 행할 수 있다. 예를 들어, 폴리에스테르, 폴리아민산, 히드로겔, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌-아세트산비닐, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 황산프로타민, 또는 락티드/글리콜리드 코폴리머, 폴리락티드/글리콜리드 코폴리머, 또는 에틸렌아세트산비닐 코폴리머 등의 폴리머 물질. 핵산은, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해, 예를 들어, 각각, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로 캡슐, 또는 폴리(메틸메타크롤레이트)(poly(methylmethacrolate)) 마이크로 캡슐을 이용하여 조제한 마이크로 캡슐 중에, 또는 콜로이드계 중에 봉입할 수 있다. 콜로이드 분산계에는, 고분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 지질에 기초하는 계(수중유형 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜 등)가 포함된다.
여러가지 조성물을 세포에 도입하기 위한 리포솜은, 당기술분야에서 공지이며, 예를 들어, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 리포펙틴 및 DOTAP이 포함된다(예를 들어, 미국 특허 제4,844,904호, 미국 특허 제5,000,959호, 미국 특허 제4,863,740호 및 미국 특허 제4,975,282호; 그리고 GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md). 유전자 요법에 유용한 피페라진에 기초하는 암필릭 양이온성 지질(piperazine based amphilic cationic lipids)도 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,861,397호 참조). 양이온성 지질계도 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,459,127호 참조). 본 명세서에서, 폴리머 물질, 마이크로 캡슐 및 콜로이드 분산계(리포솜 등)를 통합하여 「소포」라고 부른다.
또한 항체 제조 방법에서 사용할 수 있는 바람직한 기술에는, IL-3Rα에 기초하는 아피니티 정제, 비변성 겔 정제, HPLC 또는 RP-HPLC, 사이즈 배제, 프로테인 A 컬럼에서의 정제, 또는 이들 기술의 임의의 조합이 포함된다. IL-3Rα 항체 이소타입은, ELISA 분석을 이용하여 결정할 수 있고, 예를 들어, 마우스 Ig 흡수 항인간 Ig를 이용하여 인간 Ig을 동정할 수 있다.
결합 친화성은, 결합(Ka) 및 해리(Kd)속도에 의해 결정할 수 있다. 평형 친화성 정수, KD는 Ka/Kd비이다. 결합(Ka) 및 해리(Kd) 속도는, 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 측정할 수 있다(Rich 및 Myszka, Curr. Opin. Biotechnol 11 : 54 (2000); Englebienne, Analyst. 123 : 1599 (1998)). 결합 속도의 실시간 검출 및 모니터링에 관한 계장 및 방법은 공지이며, 시판되고 있다(BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Sweden; 및 Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27 : 335 (1999)). KD값은, IL-3Rα에서의 결합 부위의 절반(50%)을 포화시키는 데 필요한 IL-3Rα 항체 농도로서 정의할 수 있다.
(영장류에서의 교차성)
현재, 500에 미치는 항체 의약이 세계에서 개발되어 있고, 인간 항체는 면역원성의 문제를 회피할 수 있을 가능성이 높다고 여겨지고 있다. 그러나, 한편 인간 항체는 설치류에서는 약효가 전혀 보이지 않는 경우가 많다. 그 경우, 독성 시험에는 영장류를 이용할 수 밖에 없는 경우가 많아, 침팬지에서만 반응성이 보인다고 하는 경우도 적지 않다. 침팬지에서만 약리 반응이 보이는 경우에는, 독성 시험의 제약은 더욱 커진다. 원래 침팬지 시험을 실시할 수 있는 시설이 매우 한정되고, 개체가 HIV에 감염되어 있는 경우도 많아, 시험 종사자의 노동 위생의 문제도 존재한다. 또, 침팬지에 관해서는, 최종 투약후의 해부 시험은 행할 수 없고, 생식 독성 시험의 실시도 불가능한 등, 큰 제약이 있다. 따라서, 원숭이(게잡이 원숭이 및/또는 붉은털 원숭이)에서 약효를 확인할 수 있는 것은, 의약품 개발을 위해 필수적인 독성 시험 등을 진행시키는 관점에서도 유용하다.
원숭이 교차성을 확인하는 방법으로는, 면역 화학 조직 염색법, 고상 효소 면역 측정법(이하, 「ELISA」) 및 플로우 사이토메트리(FCM) 등, 공지의 방법으로 확인할 수 있다.
(의약 조성물)
항체는 의약 조성물에 포함시킬 수 있다. 일실시형태에서는, 항체는 제약상 허용되는 담체, 안정제 또는 부형제를 포함하고 있고, 수용액의 형태 또는 동결 건조 제제로서 조제된다. 전형적으로는, 제약적으로 허용 가능한 적당량의 염이 제제의 등장화를 위해 이용된다. 허용할 수 있는 담체, 안정화제 또는 부형제는, 예를 들어, 인산, 시트르산 및 다른 유기산 등의 완충액; 저분자량(잔기수 10개 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린 등의 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨 등의 당류, 나트륨 등의 염형성 쌍이온; 메티오닌 및 아스코르빈산을 포함하는 항산화제; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 방부제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질암모늄클로라이드; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 알킬파라벤류, 예를 들어 메틸 또는 프로필파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥산올; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비이온성 계면활성제를 포함한다.
(IL-3Rα 발현 세포를 표적으로 한 항종양 물질의 치료적 사용)
치료적 사용이 검토되는 질환으로는, IL-3Rα를 발현되는 혈액 종양 세포(AML 세포, CML 세포, MDS 세포, ALL 세포, CLL 세포, 다발성 골수종 세포 등), 비만 세포, 호염기구, 헬퍼 T 세포(예를 들어, Th1 세포, Th17 세포), 제어성 T 세포(예를 들어, CD4 양성 CD25 양성 세포) 항원 제시 세포(예를 들어, 수상 세포, 단구ㆍ마크로파지 및 그것과 유사한 세포(간성상 세포, 파골 세포, 마이크로글리아 세포, 표피내 마크로파지, 진애 세포(폐포 대식 세포) 등))에 결합 또는 표적으로 함으로써 치료가 가능한 질환이 생각되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
치료적 사용이 검토되는 질환으로는, 골수 또는 말초혈 중에 IL-3Rα의 발현이 보이는 혈액 질환을 들 수 있다. 구체적으로는 급성 골수성 백혈병(AML)을 생각할 수 있다. 급성 골수성 백혈병은, 조혈 줄기 세포로부터 여러가지 혈구로 분화해 가는 도중의 세포에서, 이들의 어느 단계의 세포가 종양화했는지에 따른 FAB 분류 (French-American-British criteria)에 기초하여 M0(미분화형 골수성 백혈병), M1(미분화형 골수 아구성 백혈병), M2(분화형 골수 아구성 백혈병), M3(전골수 구성 백혈병), M4(골수 단구성 백혈병), M5(단구성 백혈병), M6(적백혈병) 및 M7(거핵구성 백혈병)의 병형 및 이들의 아형으로 분류된다. 또 다른 질환으로는, 예를 들어, 급성 림프성 백혈병, 비정형적 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 성인 T 세포성 백혈병, NK/T 세포 림프종, 과립 림프구 증다증(LGL 백혈병), 진성 적혈구 증다증, 본태성 혈소판 혈증, 호산구 증다 증후군, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 비만성 대세포형 B 세포 림프종, Burkitt 림프종, 림프 아구성 림프종 및 Catsleman병이 포함된다.
IL-3Rα 항체 또는 IL-3Rα 발현 세포를 표적으로 한 항종양 물질의 투여 또는 송달을 포함하는 본 발명의 방법은, 임의의 허용되는 방법(any acdceptable method)으로 실시할 수 있다. 특정한 실시형태에서는, 이들은 피험체에 국소적으로, 국부적으로 또는 전신적으로 투여된다.
또, 상기 질환을 치료하기 위해 IL-3Rα 항체 또는 IL-3Rα 발현 세포를 표적으로 한 항종양 물질은, 동일한 질환에 바람직한 다른 치료제(전형적으로는 화학 요법제)와 조합 또는 방사선 요법과의 병용도 고려할 수 있다. 바람직한 다른 치료제로는, 시타라빈(Ara-C), 안트라사이클린계의 항종양제(전형적으로는, 다우노루비신(DNR), 이달비신(IDA)) 등의 화학 요법제, all-trans retinoic acid(ATRA), 아비산이나 Am80(타미바로텐) 등의 분화 유도 요법제, 겜투주맵ㆍ오조가마이신(오조가마이신 콘쥬게이트 항CD33 항체), 토포테칸, 플루다라빈, 시클로스포린, 미톡산트론(MIT), 인터페론 및 이마티닙을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 임상상 유효해지는 치료법과의 조합도 포함된다.
본 발명에 의해 치료 가능한 피험체에는, 포유류(예를 들어, 인간)가 포함된다. 특정한 실시형태에서는, 혈액 종양의 의심이 있는 피험체이거나 또는 혈액 종양의 치료를 받은 피험체; IL-3Rα 매개 세포 응답의 의심이 있는 피험체이거나 또는 IL-3Rα 매개 세포 응답의 치료를 받은 피험체; 골수성 악성 종양의 의심이 있는 피험체이거나 또는 골수성 악성 종양의 치료를 받은 피검체; 급성 골수성 백혈병의 의심이 있는 피험체이거나 또는 급성 골수성 백혈병의 치료를 받은 피검체.
본 명세서에서, 용어 「치료한다」,「치료(하는 것)」,「처치」 및 그 문법상의 변형은, 환자에 있어서 생리학적 효과 또는 병이 진행된 결과를 얻는 것이 바람직한 각 피험체 또는 환자에 있어서 행해지는 프로토콜, 계획, 과정 또는 개선법을 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법에는, 특히, 특정한 피험체의 장해, 질환, 생리학적 상태, 병상 또는 증상에 있어서 측정 가능한 개선 또는 유익한 효과를 가져오는 처치 및 치료법이 포함된다. 측정 가능한 개선 또는 유익한 효과는, 장해, 질환, 생리학적 상태, 병상 또는 증상에서의 모든 타각적 또는 자각적, 과도적, 일시적 또는 장기적 개선, 또는 그 장해, 질환, 생리학적 상태, 병상 또는 상태에 관련 또는 기인하는 유해한 증상의 발증, 중증도, 기간 또는 빈도의 경감이다. 본 발명 방법에서는 바로 효과가 나타나지는 않고, 조금 지연되고, 시간의 경과에 따라 최종적인 개선 또는 유익한 효과가 보일 가능성이 있어, 특정한 피험체에 있어서 안정화 또는 개선이 발생한다.
특별히 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는, 본 발명이 관련된 기술분야의 업자에게는 일반적으로 분명한 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 또는 시험에, 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료를 사용할 수 있지만, 본 명세서에 기재하고 있는 것이 바람직한 방법 및 재료이다.
[실시예]
실시예 1 인간ㆍ게잡이 원숭이ㆍ붉은털 원숭이 IL-3Rα 발현 세포의 제작
(IL-3Rα cDNA의 분자 클로닝 및 발현 벡터의 제작)
인간 IL-3Rα cDNA는 혈액 세포 유래 cDNA(CLONTECH Human MTC Panel)로부터 ExTaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 장치는 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드바이오시스템즈, 이하, 본 명세서에서 PCR 장치는 동일)을 이용했다. PCR 반응은 94℃ 5분간의 변성 단계에 이어서, 94℃ 30초-55℃ 30초-72℃ 2분의 3스텝 반응을 40 사이클 행한 후, 99℃ 30초의 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다;
Figure pct00004
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 JetSorb(Genomed사)를 이용하여 추출했다. 추출한 DNA를 MfeI 및 NotI에서 절단하고, EcoRI 및 NotI에서 절단한 pEGFP-N1 vector(Clontech사) 또는 pEF6/Myc-His vector와 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(카나마이신 함유)에 뿌렸다. pEGFP-N1 vector의 인서트 체크는, LATaq(Takara사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 94℃ 5분간의 변성 단계에 이어서, 94℃ 30초-55℃ 30초-72℃ 2분의 3스텝 반응을 40 사이클 행한 후, 99℃ 30초의 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 IL-3Rα_Fw 및 IL-3Rα_Re를 이용했다.
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니를 대상으로, 다이렉트 시퀀싱법으로 염기 서열을 결정했다. 시퀀스 샘플의 반응은 BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(어플라이드바이오시스템즈)와 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드바이오시스템즈)을 이용했다(본 명세서에서의 모든 DNA 서열 해석에서 이들을 사용). 프라이머는 IL-3Rα_Fw, IL-3Rα_Re 및 다음 프라이머를 이용했다:
Figure pct00005
시퀀스 해석 장치는 ABI3700XL DNA analyzer(어플라이드바이오시스템즈)를 이용했다. GenBank accession number NP_002174.1의 코딩 리젼과 동일한 서열을 갖는 클론을 선정하고, 미니프렙법으로 플라스미드 DNA를 추출했다. 벡터명은 각각, pEGFR-N1/hCD123, pEF6/Myc-His/hCD123으로 한다.
인서트(MfeI부터 NotI까지)의 서열은 이하와 같다:
Figure pct00006
게잡이 원숭이 및 붉은털 원숭이 IL-3Rα cDNA는, 게잡이 원숭이 골수 유래 cDNA 또는 붉은털 원숭이 골수 유래 cDNA로부터 LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 장치는 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드바이오시스템즈)을 이용했다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 70초의 3스텝 반응을 40 사이클 행한 후, 72℃ 2분의 반응을 행했다. hIL-3RAcDNA 서열을 기초로, 공공의 붉은털 원숭이 게놈 데이터베이스(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast.hgsc)에 대한 BLAST 검색에 의해 부분 서열을 취득하여, 프라이머를 설계했다. 이용한 프라이머 서열은 이하와 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 Gel Extraction Kit(QIAGEN사)를 이용하여 추출했다. 추출한 DNA를 pGEM-T Easy vector(Promega사)와 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(암피실린 함유)에 뿌렸다. pGEM-TEasy vector의 인서트 체크는, LATaq(Takara사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 1분의 3스텝 반응을 35 사이클 행한 후, 72℃ 2분의 반응을 행했다. 프라이머는 이하를 이용했다:
Figure pct00009
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니를 대상으로, 다이렉트 시퀀싱법으로 염기 서열을 결정했다. PCR 프라이머는 T7 및 SP6을 이용했다. PCR에 의한 변이가 보이지 않는 클론을 선정하여, 미니프렙법으로 플라스미드 DNA를 추출했다. 얻어진 DNA를 MfeI 및 NotI에서 절단하고, EcoRI 및 NotI에서 개열한 pEGFP-N1 vector(Clontech사)와 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(카나마이신 함유)에 뿌렸다.
pEGFP-N1 vector의 인서트 체크는, LATaq(Takara사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 94℃ 5분간의 변성 단계에 이어서, 94℃ 30초-55℃ 30초-72℃ 2분의 3스텝 반응을 40 사이클 행한 후, 99℃ 30초의 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 Rhe123Fw1 및 Rhe123Rv1을 이용했다.
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니를 대상으로, 다이렉트 시퀀싱법으로 염기 서열을 결정했다. 시퀀스 샘플의 반응은 Big Dye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(어플라이드바이오시스템즈)와 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드바이오시스템즈)을 이용했다(본 명세서에서의 모든 DNA 서열 해석에서 이들을 사용). 프라이머는 Rhe123Fw1 및 Rhe123Rv1을 이용했다. 벡터명은 각각, pEGFR-N1/cyCD123, pEGFR-N1/rhCD123으로 한다.
게잡이 원숭이 IL-3Rα의 인서트(MfeI부터 NotI까지)의 서열은 이하와 같다:
Figure pct00010
붉은털 원숭이 IL-3Rα의 인서트(MfeI부터 NotI까지)의 서열은 이하와 같다:
Figure pct00011
(IL-3Rα 강제 발현 세포주의 제작)
L929 세포(ATCC 제조) 및 Colon-26 세포(ATCC 제조)에, pEGFP-N1 vector/hCD123 또는 pEF6/Myc-His vector/hCD123을 일렉트로포레이션(BTX)을 이용하여 감염시켰다. 구체적으로는, 10-20 ㎍의 DNA를 10만 세포와 혼합하여, 300 V, 950 μF로 반응시켰다. 세포는, pEGFP-N1/hCD123에서는 네오마이신(Calbiochem사), pEF6/Myc-His/hCD123에서는 블라스트사이진(invitrogen사)을 이용하여 약제 내성 세포를 선발했다. 선발한 세포는, 또한 플로우 사이토메트리(FACS Vantage, FACS Aria 등, BD Biosciences사)에 의해 GFP 양성 세포 또는 IL-3Rα(CD123)의 고발현의 세포를 소팅에 의해 선발하여, L929/hCD123 및 Colon-26/hCD123으로 명명했다.
게잡이 원숭이 IL-3Rα 및 붉은털 원숭이 IL-3Rα 강제 발현 세포의 제작에 관해서도, 인간 IL-3Rα 강제 발현 세포주와 마찬가지로 L929 및 Colon-26을 이용하여 제작하여, L929/cyCD123, Colon-26/cyCD123, L929/rhCD123, Colon-26/rhCD123으로 명명했다.
실시예 2 가용화형 세포외 IL-3Rα 단백질의 제작
(가용화형 세포막외 인간 IL-3Rα 단백질 발현 벡터의 조제)
인간 IL-3Rα의 세포외 영역을 코드하는 cDNA를 PCR법으로 증폭시키고, 하류에 FLAG 태그를 연결했다. 구체적으로는, 인간 IL-3Rα의 세포외 영역을 코드하는 cDNA는 pEF6/Myc-His/hCD123 플라스미드 DNA를 주형으로 하고 Platinum Pfu polymerase(invitrogen사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 96℃ 2분간의 변성 단계에 이어서, 96℃ 20초-55℃ 30초-68℃ 65초의 3스텝 반응을 30 사이클 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 IL-3Rα_Fw 및 이하의 프라이머를 이용했다:
Figure pct00012
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. DNA를 JetSorb(Genomed사)를 이용하여 추출했다. 정제된 DNA를 MfeI와 NotI에서 소화하고, 다시 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. 1.0 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 JetSorb(Genomed사)를 이용하여 추출했다. 정제된 DNA와 동일 효소에 의해 개열되어 있던 pTracer-CMV/Bsd 벡터를 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(암피실린 함유)에 뿌렸다. 인서트 체크는, LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 40초의 3스텝 반응을 35 사이클 행한 후, 72℃ 2분간의 신장 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 IL-3Rα_Fw 및 IL-3Rαsol-FLAG-NotI.
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.0 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니로부터 미니프렙법으로 플라스미드 DNA를 추출했다. 정제한 plasmid DNA는 DNA 서열 해석에 의해 GenBank accession number NP_002174.1의 상기 영역과 동일한 서열을 갖는 것을 확인했다.
인서트(MfeI부터 NotI까지)의 서열은 이하와 같다:
Figure pct00013
(가용화형 인간 IL-3Rα 단백질의 조제)
가용화 IL-3Rα 서열을 포함하는 pTracerCMV 발현 벡터의 플라스미드 DNA를 QIAGEN Plasmid Maxi Kit에 의해 정제했다. 발현을 위한 숙주 세포에는, CHOras1 세포를 이용했다. CHOras1 세포는 SFM II 배지(인비트로젠사)를 이용하여 진탕 배양했다(37℃, 5% CO2).
유전자 도입에는 PEI법을 이용했다. Polyethylenimine, Linear, MW25,000(Polysciences사)를 칭량하고, HCl로 pH 7.0 부근으로 조정하면서 PBS 중에 용해시켰다(1 g/L). 1시간 교반후, 구멍 직경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(미리포어사)로 여과 멸균했다. 정제한 플라스미드 DNA 1 ㎎과 Opti-Pro SFM(invitrogen사) 20 ㎖를 혼합하여, 용액 A로 했다. PEI 용액(1 g/L) 2.5 ㎖와 Opti-ProSFM(invitrogen사) 20 ㎖를 혼합하여, 용액 B로 했다. 용액 A와 용액 B를 혼합하여 10분간 정치한 후, CHOras1 세포 (1 ㎖ 당 세포 1000000개)에 첨가했다. 6일후, 세포 상청을 회수하여, 단백질 정제에 이용했다.
배양 상청으로부터의 가용화형 IL-3Rα 단백질의 정제는 이하의 방법으로 행했다. 가용화형 IL-3Rα 단백질을 포함하는 배양 상청을 유전자 도입으로부터 6일후에 원심 분리에 의해 회수하여, 필터를 통과시켰다. 트리스 완충 생리식염수(TBS)로 5배 희석하고, Anti-FLAG M2 Agarose Affinity Gel(시그마사)를 이용하여 제작하고 Anti-FLAG 컬럼에 HiLoad Pump P-50(파마시아바이오테크사)를 이용하여 어플라이했다. 용출은 FLAG 펩티드(시그마사)를 이용하고, 메뉴얼에 따랐다. 용출액을 프랙션으로 획분하고, 각 프랙션을 환원 조건화에 SDS-PAGE(멀티겔 II 미니 10/20% 그래디언트겔; 코스모바이오사)후, 은염색 및 웨스턴 블로팅을 행했다. 은염색은 은염색 시약 「제1」(제1화학사)을 이용했다. 웨스턴 블로팅에는, 항FLAG M2 항체(시그마사)와 알칼리포스파타아제 표지 토끼 항마우스 이뮤노글로불린 항체를 이용했다. 목적으로 하는 단백질이 보인 프랙션을 아미콘울트라-4 10K (미리포어사)를 이용하여 농축하고, Superdex 200 gp (GE 헬스케어사)를 이용하여 겔여과 크로마토그래피를 행했다. 분획하여, 각 프랙션을 환원 조건화에 SDS-PAGE(멀티겔 II 미니 10/20% 그래디언트겔; 코스모바이오사)후, 은염색 및 웨스턴 블로팅을 행했다. 은염색은 은염색 시약 「제1」(제1화학사)을 이용했다. 웨스턴 블로팅에는, 항FLAG M2 항체(시그마사)와 알칼리포스파타아제 표지 토끼 항마우스 이뮤노글로불린 항체를 이용했다. 목적으로 하는 단백질이 보인 프랙션을 아미콘울트라-4 10K (미리포어사)를 이용하여 농축하고, PBS로 세정했다. 구멍 직경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(미리포어사)로 여과 멸균하여, 가용화형 인간 IL-3Rα 단백질을 얻었다. 리물루스 ES-II 키트와코(와꼬준야쿠사)를 이용한 리물루스 테스트의 결과, 엔도톡신은 검출되지 않았다. 가용화형 IL-3Rα 단백질의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여, 1 ㎎/㎖를 1.4 OD로서 산출했다.
실시예 3 인간 항체 생성 마우스를 이용한 항인간 IL-3Rα 인간 항체의 제작
(인간 항체 생성 마우스)
면역에 이용한 마우스는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 관해 호모 접합체의 유전적 배경을 갖고 있고, 또한 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 14번 염색체 단편(SC20) 및 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 동시에 유지한다. 이 마우스는 인간 Ig 중쇄 유전자좌를 갖는 계통 A의 마우스와, 인간 Igκ쇄 트랜스진을 갖는 계통 B의 마우스와의 교배에 의해 제작되었다. 계통 A는, 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 관해 호모 접합체이며, 자손 전달 가능한 14번 염색체 단편(SC20)을 유지하는 마우스 계통이고, 예를 들어 토미즈카 등의 보고[Tomizuka. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2000 Vol97 : 722]에 기재되어 있다. 또, 계통 B는 내인성 Ig 중쇄 및 κ경쇄 파괴의 양자에 관해 호모 접합체이며, 인간 Igκ쇄 트랜스 유전자(KCo5)를 유지하는 마우스 계통(트랜스제닉 마우스)이고, 예를 들어 Fishwild 등의 보고[Nat Biotechnol, (1996), 114 : 845]에 기재되어 있다.
계통 A의 수컷 마우스와 계통 B의 암컷 마우스, 또는 계통 A의 암컷 마우스와 계통 B의 수컷 마우스의 교배에 의해 얻어진, 혈청 중에 인간 Ig 중쇄 및 κ경쇄가 동시에 검출되는 개체[Ishida & Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering, Abstract 2000]를, 이하의 면역 실험에 이용했다. 상기 인간 항체 생성 마우스(KM 마우스로 칭함)는, 계약을 체결함으로써, 교와발효기린 주식회사로부터 입수 가능하다.
(인간 IL-3Rα에 대한 인간 모노클로날 항체의 제작)
본 실시예에서의 모노클로날 항체의 제작은, 단클론 항체 실험 조작 입문(안도타미에 등 저작, 코단샤 발행 1991) 등에 기재되는 바와 같은 일반적 방법에 따라서 조제했다. 면역원으로서의 IL-3Rα는, IL-3Rα 발현 L929 세포(CCL-1, ATCC), IL-3Rα 발현 Colon-26 세포(Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer Tohoku University) 또는 가용화형 인간 IL-3Rα 인간 Fc 융합 단백질을 이용했다. 피면역 동물로서 상기 KM 마우스를 이용했다.
인간 IL-3Rα에 대한 인간 모노클로날 항체의 조제를 목적으로, KM 마우스에게, 실시예 1에서 제작한 IL-3Rα 발현 L929 세포 또는 IL-3Rα 발현 Colon-26 세포를 복강내에 1주일?2주일 간격으로 1×107 세포/마리의 용량으로, 합계 4회 면역했다. 이하에 설명하는 비장 적출 3일전에, 가용화형 인간 IL-3Rα 단백질 20 ㎍/마우스 개체를 미정맥 투여했다.
면역된 마우스로부터 비장을 외과적으로 취득하여 PBS 중에 넣고, 메쉬(셀스트레이너 : Falcon사) 상에서 시린지의 피스톤을 이용하여 으깨었다. 메쉬를 통과한 세포 현탁액을 원심하여 세포를 침전시킨 후, Red Blood Cell Lysing Buffer(시그마사)로 재현탁했다. 실온에서 5분간의 인큐베이션후, 350 ㎎/㎖ 탄산수소나트륨, 50 단위/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 무혈청 DMEM 배지(인비트로젠사)(이하 「무혈청 DMEM 배지」라고 함)를 첨가하고, 세포를 침전시켰다. 다시 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 세포수를 측정했다.
한편, 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC No. CRL-1581)은 10% FCS(인비트로젠사), 50 단위/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지(인비트로젠사)(이하, 「혈청이 들어간 DMEM 배지」라고 함)에서, 37℃, 5% 탄산가스 존재하에 배양했다. SP2/0 세포를 마찬가지로 무혈청 DMEM 배지로 세정하고, 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 세포수를 측정했다. 회수한 비장 유래 세포의 현탁액과 마우스 미엘로마 현탁액을 세포수 5:1로 혼합하여 원심후, 상청을 완전히 제거했다. 이 펠릿에, 융합제로서 50%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 1500(베링거만하임사)을, 피펫의 끝에서 펠릿을 교반하면서 천천히 첨가한 후, 미리 37℃로 가온해 둔 무혈청 DMEM 배지를 천천히 첨가했다. 또한 적량의 무혈청 DMEM 배지를 천천히 첨가했다. 그 후, 37℃, 5% 탄산가스 존재하에 5분간 정치했다. 원심후, 상청을 제거하여 얻어진 융합 세포를, 10% FCS(인비트로젠사), 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(시그마사), IL-6(5 ng/㎖), 2-머캅토에탄올(인비트로젠사)을 포함하는 DMEM 배지(인비트로젠사)(이하, 「IL-6이 들어간 DMEM 배지」라고 함)에 현탁하여, 37℃, 5% 탄산가스 존재하에 배양했다. 다음날, 세포를 피펫팅에 의해 회수하고, 원심에 의해 침전한 세포 팰릿을 IL-6이 들어간 DMEM 배지에 재현탁했다. 현탁한 세포는, 96 웰 플레이트에 한계 희석하여, 7일?14일간 정도 배양했다. 그 배양 상청은 아래 실시예에 나타내는 하이브리도마 스크리닝에 이용했다.
(인간 IL-3Rα에 결합하는 인간 모노클로날 항체 생성 하이브리도마의 스크리닝)
상기 실시예에서 제작한 세포 상청을 이용하여 하이브리도마의 스크리닝을 행했다. 방법은, 간단하게는, 인간 IL-3Rα 안정 발현 세포주를 이용한 플로우 사이토메트리법으로 행했다.
구체적으로는, 인간 IL-3Rα 발현 L929 세포 및 친주 L929 세포의 조합, 또는 인간 IL3Rα 발현 Colon-26 세포 및 친주 Colon-26 세포의 조합으로, 각각 하이브리도마의 상청과 혼합하여, 4℃, 30분간 정치했다. 스테이닝 미듐(2% 소태아 혈청, 2 mM EDTA, 0.05% NaN3를 포함하는 Dulbecco's PBS)으로 2회 세정후, 이차 항체로서 Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-PE(서던바이오테크사)를 첨가하여, 4℃, 30분간 정치했다. 스테이닝 미듐으로 2회 세정후, FACSCalibur(BD Biosciences사)로 해석했다. 인간 IL-3Rα 발현 L929 세포만과 반응한 하이브리도마를 채취했다.
선발한 하이브리도마는, 한계 희석을 행하고, 그 배양 상청을 이용하여 스크리닝을 실시했다. 구체적으로는, 인간 IL-3Rα 발현 L929 세포 및 친주 L929 세포를, 각각 하이브리도마의 상청과 혼합하여, 4℃, 30분간 정치했다. 스테이닝 미듐으로 2회 세정후, 이차 항체로서 Goat F(ab')2 Anti-Human Kappa-PE(Dako사)를 첨가하여, 4℃, 30분간 정치했다. 스테이닝 미듐으로 2회 세정후, FACS Calibur(BD Biosciences사)로 해석했다. 인간 IL-3Rα 발현 L929 세포만과 반응한 하이브리도마를 채취했다.
실시예 4 재조합 항인간 IL-3Rα 인간 항체의 제작
(하이브리도마로부터의 항인간 IL-3Rα 항체 유전자의 취득 및 발현 벡터의 제작)
실시예 3에서 취득한 하이브리도마로부터, 클론명 Old4, Old5, Old17, Old19, New102 및 Old6을 10 ng/㎖ IL-6(R&D Systems사), 10% Fetal Bovine Serum(SIGMA사) 함유 eRDF 배지(쿄쿠도제약사)로 배양하여, 원심 분리에 의해 세포를 모은 후 TRIZOL(GIBCO사)를 첨가하고, 취급 설명서에 따라서 Total RNA를 추출했다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은, SMART RACE cDNA amplification Kit(클론테크사)를 이용하여, 첨부의 설명서에 따라서 행했다.
또 컨트롤로서 이용하는 항인간 IL-3Rα 마우스 항체 7G3을 생산하는 하이브리도마 ATCC, HB12009로부터, 가변 영역을 클로닝하고, 얻어진 cDNA와 인간 IgG1 정상 영역을 코드하는 DNA를 연결시켜, 키메라 항체 발현 벡터를 제작했다. 구체적으로는, 동결 보존된 하이브리도마를 원심 분리에 의해 세포를 모은 후 TRIZOL(GIBCO사)를 첨가하고, 취급 설명서에 따라서 Total RNA를 추출했다. 항체 cDNA의 가변 영역의 클로닝은, SMART RACE cDNA amplification Kit(클론테크사)에 첨가하고, 마우스 IgG 항체 특이적인 프라이머를 이용하여, 첨부의 설명서에 따라서 행했다.
5 ㎍의 total RNA를 주형으로서, 1st strand cDNA를 제작했다.
1) 1st strand cDNA의 합성
Total RNA 5 ㎍m/3 ㎕
5' CDS 1 ㎕
SMART oligo 1 ㎕
상기 조성의 반응액을 70℃에서 2분간 인큐베이트한 후,
5×Buffer 2 ㎕
DTT 1 ㎕
DNTP mix 1 ㎕
Superscript II 1 ㎕
를 첨가하여 42℃에서 1.5시간 인큐베이트했다.
또한, 100 ㎕의 Tricine Buffer를 첨가한 후, 72℃에서 7분간 인큐베이트하여, 1st strand cDNA를 취득했다.
2) PCR에 의한 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 증폭 및 재조합 항체 발현 벡터의 구축
cDNA의 증폭에는, Takara사의 Z-Taq를 이용했다.
cDNA 2 ㎕
10xZ-Taq Buffer 5 ㎕
dNTP mix 4 ㎕
Z-Taq 1 ㎕
프라이머 1
프라이머 2
상기 조성의 반응액을 재증류수로 최종 용량 50 ㎕로 하여, PCR에 이용했다.
중쇄의 증폭에는, UPM(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)와 hh-6 프라이머(5'-GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTT-3') (서열번호 15)를 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 30회 반복했다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하여, NUP(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)와 hh-3 프라이머(5'-GTGCACGCCGCT GGT CAGGGCGCCTG-3') (서열번호 16)를 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 20회 반복했다. 그 후, 증폭시킨 PCR 산물을 PCR purification kit(키아겐사)에 의해 정제하고, hh-4(5'-GGT GCC AGG GGG AAG ACC GAT GG-3') (서열번호 17)를 프라이머로 하여, 염기 서열의 결정을 행했다. 서열 정보를 기초로, 이하의 특이적 프라이머를 합성하고, 이 프라이머를 이용하여 반대 방향으로부터도 서열을 결정했다.
Old4 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTG T -3') (서열번호 18)
Old4 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC -3') (서열번호 19)
Old5 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTG T -3') (서열번호 20)
Old5 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC -3') (서열번호 21)
Old17 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTG T -3') (서열번호 22)
Old17 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACAAGGGTTCCC-3') (서열번호 23)
Old19 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGG TCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCT TTG T -3') (서열번호 24)
Old19 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC -3') (서열번호 25)
New102 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTG T -3') (서열번호 26)
New102 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAG GAGACGGTGACCAGGGTT -3') (서열번호 27)
Old6 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGGTCGACCCACCATGGAACTGGGGCTCCGCTG-3') (서열번호 28)
Old6 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTC-3') (서열번호 29)
마우스 항체 7G3의 중쇄의 증폭에는, UPM(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)과 mH_Rv1 프라이머(5'-ATTTTG TCG ACC KYG GTS YTG CTG GCY GGGTG-3') (서열번호 30)를 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 30회 반복했다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하여, NUP(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)와 mH_Rv2 프라이머(5'-GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3') (서열번호 31)를 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 20회 반복했다. 그 후, 증폭시킨 PCR 산물을 PCR purification kit(키아겐사)에 의해 정제하고, mH_Rv2 프라이머(서열번호 31)를 프라이머로 하여, 중쇄 가변 영역의 염기 서열의 결정을 행했다. 서열 정보를 기초로, 이하의 특이적 프라이머를 합성하고, 이 프라이머를 이용하여 반대 방향으로부터도 서열을 결정했다.
7G3 중쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGGTCGACCACCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTC-3') (서열번호 32)
7G3 중쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3') (서열번호 33)
상기 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고(98℃ 1초, 60℃ 30초, 72℃ 30초), 중쇄 증폭 cDNA 단편을 SalI, NheI에서 소화하고, 동일 효소에 의해 개열되어 있던 N5KG1-Val Lark 벡터(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1(US patent 6001358)의 개변 벡터)에 도입했다. 삽입된 서열이 direct sequence에 의해 결정된 것과 동일하다는 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인했다.
경쇄는, UPM(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)과 hk-2(5'-GTT GAAGCT CTT TGT GAC GGG CGA GC-3') (서열번호 34) 프라이머를 사용하고, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUP(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)와 hk-6(5'-TGGCGGGAAGATG AAG ACA GAT GGT G-3') (서열번호 35)를 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 20회 반복했다. 그 후, 증폭시킨 PCR 산물을 PCR purification kit(키아겐사)에 의해 정제하고, hk-6 프라이머를 이용하여 염기 서열을 결정했다. 서열 정보를 기초로, 이하의 특이적 프라이머를 합성하고, 반대 방향으로부터도 서열을 결정했다.
Old4 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC CCG CTC AGC -3') (서열번호 36)
Old4 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCC CCT G -3') (서열번호 37)
Old5 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGA GAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCG CTC AGC -3') (서열번호 38)
Old5 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCC CCT G -3') (서열번호 39)
Old17 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC TCG CTC AG -3') (서열번호 40)
Old17 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCC CCT G -3') (서열번호 41)
Old19 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC TCG CTC AG -3') (서열번호 42)
Old19 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC CTT GGC -3') (서열번호 43)
New102 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCC TCG CTC AG -3') (서열번호 44)
New102 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATCTC CAGCTTGG TCC CCT G -3') (서열번호 45)
Old6 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGC3') (서열번호 46)
Old6 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTCCCAGGGC-3') (서열번호 47)
마우스 항체 7G3의 경쇄는, UPM(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)와 mK_Rv1(5'-TT GAA GCT CTT GAC AAT GGG TGA AGT TGAT-3') (서열번호 48) 프라이머를 사용하고, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 30회 반복하여 증폭시켰다. 또한, 이 반응액 1 ㎕를 주형으로 하고, NUP(SMART RACE cDNA amplification Kit; 클론테크사)와 mK_Rv2(5'-GTAGGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAGT-3') (서열번호 49)를 이용하여, 98℃ 1초, 68℃ 30초의 사이클을 20회 반복했다. 그 후, 증폭시킨 PCR 산물을 PCR purification kit(키아겐사)에 의해 정제하고, mK_Rv2 프라이머를 이용하여 염기 서열을 결정했다. 서열 정보를 기초로, 이하의 특이적 프라이머를 합성하고, 반대 방향으로부터도 서열을 결정했다.
7G3 경쇄 특이적 프라이머 Fw (5'-AGAGAGAGAGAGATCTCACCATGGAATCACAGACTCAGGTCCTC-3') (서열번호 50)
7G3 경쇄 특이적 프라이머 Rv (5'-AGAGAGAGAGCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCC-3') (서열번호 51)
상기 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고(98℃ 1초, 60℃ 30초, 72℃ 30초), 경쇄 증폭 cDNA 단편을 BglII, BsiWI에서 소화하고, 동일 효소에 의해 개열되어 있던 N5KG1-Val Lark 벡터에 도입했다. 삽입된 서열이 direct sequence에 의해 결정된 것과 동일하다는 것을, 벡터를 주형으로 하여 서열을 결정함으로써 확인했다.
Old4의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<Old4 중쇄 가변 영역>
Figure pct00014
<Old4 중쇄 가변 영역>
Figure pct00015
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 52의 5' 말단으로부터 16번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 432번째 아데닌(A)와 433번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 53의 N 말단으로부터 139번째 세린(S) 잔기까지이며, 140번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 53의 N 말단으로부터 19번째 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 53의 20번째 글루타민(Q)인 것으로 생각된다.
<Old4 경쇄 가변 영역>
Figure pct00016
<Old4 경쇄 가변 영역>
Figure pct00017
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 54의 5' 말단으로부터 16번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 402번째 아데닌(A)와 403번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 55의 N 말단으로부터 129번째 리신(K) 잔기까지이며, 130번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 55의 N 말단으로부터 22번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 55의 23번째 발린(V)인 것으로 생각된다.
Old5의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<Old5 중쇄 가변 영역>
Figure pct00018
Figure pct00019
<Old5 중쇄 가변 영역>
Figure pct00020
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 56의 5' 말단으로부터 11번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 427번째 아데닌(A)와 428번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 57의 N 말단으로부터 139번째 세린(S) 잔기까지이며, 140번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 57의 N 말단으로부터 19번째 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 57의 20번째 글루타민(Q)인 것으로 생각된다.
<Old5 경쇄 가변 영역>
Figure pct00021
<Old5 경쇄 가변 영역>
Figure pct00022
Figure pct00023
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 58의 5' 말단으로부터 16번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 402번째 아데닌(A)와 403번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 59의 N 말단으로부터 129번째 리신(K) 잔기까지이며, 130번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 59의 N 말단으로부터 22번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 59의 23번째 발린(V)인 것으로 생각된다.
Old17의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<Old17 중쇄 가변 영역>
Figure pct00024
<Old17 중쇄 가변 영역>
Figure pct00025
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 60의 5' 말단으로부터 16번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 432번째 아데닌(A)와 433번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 61의 N 말단으로부터 139번째 세린(S) 잔기까지이며, 140번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 61의 N 말단으로부터 19번째 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 61의 20번째 글루타민(Q)인 것으로 생각된다.
<Old17 경쇄 가변 영역>
Figure pct00026
<Old17 경쇄 가변 영역>
Figure pct00027
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 62의 5' 말단으로부터 19번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 399번째 아데닌(A)와 400번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 63의 N 말단으로부터 129번째 리신(K) 잔기까지이며, 130번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 63의 N 말단으로부터 22번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 63의 23번째 아스파라긴산(D)인 것으로 생각된다.
Old19의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<Old19 중쇄 가변 영역>
Figure pct00028
<Old19 중쇄 가변 영역>
Figure pct00029
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 64의 5' 말단으로부터 9번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 425번째 아데닌(A)와 426번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 65의 N 말단으로부터 139번째 세린(S) 잔기까지이며, 140번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 65의 N 말단으로부터 19번째 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 65의 20번째 글루타민(Q)인 것으로 생각된다.
<Old19 경쇄 가변 영역>
Figure pct00030
Figure pct00031
<Old19 경쇄 가변 영역>
Figure pct00032
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 66의 5' 말단으로부터 13번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 399번째 아데닌(A)와 400번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 67의 N 말단으로부터 129번째 리신(K) 잔기까지이며, 130번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 67의 N 말단으로부터 22번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 67의 23번째 아스파라긴산(D)인 것으로 생각된다.
New102의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<New102 중쇄 가변 영역>
Figure pct00033
<New102 중쇄 가변 영역>
Figure pct00034
Figure pct00035
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 68의 5' 말단으로부터 9번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 423번째 아데닌(A)와 424번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 69의 N 말단으로부터 138번째 세린(S) 잔기까지이며, 139번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 69의 N 말단으로부터 19번째 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 69의 20번째 글루타민(Q)인 것으로 생각된다.
<New102 경쇄 가변 영역>
Figure pct00036
<New102 경쇄 가변 영역>
Figure pct00037
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 70의 5' 말단으로부터 13번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 399번째 아데닌(A)와 400번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 71의 N 말단으로부터 129번째 리신(K) 잔기까지이며, 130번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 71의 N 말단으로부터 22번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 71의 23번째 아스파라긴산(D)인 것으로 생각된다.
Old6의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<Old6 중쇄 가변 영역>
Figure pct00038
<Old6 중쇄 가변 영역>
Figure pct00039
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 72의 5' 말단으로부터 10번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 417번째 아데닌(A)와 418번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 73의 N 말단으로부터 136번째 세린(S) 잔기까지이며, 137번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 73의 N 말단으로부터 19번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 73의 20번째 글루타민산(E)인 것으로 생각된다.
<Old6 경쇄 가변 영역>
Figure pct00040
Figure pct00041
<Old6 경쇄 가변 영역>
Figure pct00042
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 74의 5' 말단으로부터 13번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 399번째 아데닌(A)와 400번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 75의 N 말단으로부터 129번째 리신(K) 잔기까지이며, 130번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 75의 N 말단으로부터 23번째 시스테인(C)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 75의 24번째 알라닌(A)인 것으로 생각된다.
7G3의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 그리고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 이하에 나타낸다.
<7G3 중쇄 가변 영역>
Figure pct00043
Figure pct00044
<7G3 중쇄 가변 영역>
Figure pct00045
중쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 76의 5' 말단으로부터 16번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 427번째 아데닌(A)와 428번째 구아닌(G) 사이에 위치한다. 중쇄 아미노산 서열에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 77의 N 말단으로부터 139번째 알라닌(A) 잔기까지이며, 140번째 알라닌(A) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 중쇄의 시그널 서열은 서열번호 77의 N 말단으로부터 19번째 세린(S)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 77의 20번째 글루타민산(E)인 것으로 생각된다.
<7G3 경쇄 가변 영역>
Figure pct00046
<7G3 경쇄 가변 영역>
Figure pct00047
경쇄 DNA의 번역 개시점은, 서열번호 78의 5' 말단으로부터 11번째 아데닌(A)부터 시작되는 ATG 코돈이며, 항체 가변 영역과 정상 영역의 경계는 5' 말단으로부터 409번째 아데닌(A)와 410번째 시토신(C) 사이에 위치한다. 경쇄 아미노산 서열에 있어서, 경쇄 가변 영역은 서열번호 79의 N 말단으로부터 133번째 리신(K) 잔기까지이며, 134번째 아르기닌(R) 이후가 정상 영역이다. 유전자 서열 예측 소프트웨어(Signal P ver.2)에 의해, 경쇄의 시그널 서열은 서열번호 79의 N 말단으로부터 22번째 글리신(G)까지로 예측되었다. 성숙체의 N 말단은 서열번호 79의 22번째 아스파라긴산(D)인 것으로 생각된다.
(재조합형 항체의 제작)
구축한 6종류의 재조합형 항체 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여, 재조합형 항체 발현 세포를 제작했다. 발현을 위한 숙주 세포에는, HEK293F(invitrogen사)를 이용했다.
293 펙틴(invitrogen사)을 이용하여 HEK293F에 발현 벡터를 도입했다. HEK293F는, 쉐이커를 이용하여 CO2 5%, 37℃의 환경하에 배양하고, 약 5일후에 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을 rmp Protein A(아마샴파마시아바이오테크사) 및 정제량에 따라서 0.8×40 cm 컬럼(바이오래드사) 등을 이용하고, 흡착 완충액으로서 PBS, 용출 완충액으로서 0.02 M 글리신 완충액(pH 3)을 이용하여 어피니티 정제했다. 용출 획분은 1M Tris (pH 9.0)를 첨가하여 pH 7.2 부근으로 조정했다. 조제된 항체 용액은, 투석막(10000 컷트, Spectrum Laboratories사)을 이용하여 PBS로 치환하고, 구멍 직경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(미리포어사)로 여과 멸균하여, 정제 인간 항IL-3Rα 모노클로날 항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여, 1 ㎎/㎖를 1.4 OD로서 산출했다.
각 인간 항체의 CDR(상보성 결정 부위; complementarity-determining region)의 아미노산 서열 및 서열번호의 일람을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00048
Figure pct00049

실시예 5 하이브리도마 배양 상청으로부터 항IL-3Rα 인간 항체의 정제
하이브리도마는 실시예 3에서 이용된 IL-6이 들어간 DMEM 배지로부터, E-RDF 배지(쿄쿠도제약)에 순화시켜 배양한 후, 상기 배양 상청으로부터 항체를 정제했다. 항체 정제는, 실시예 4에 기재된 방법에 따라서 실시했다.
우선 인간 항IL-3Rα 모노클로날 항체 생성 하이브리도마를 10 ng/㎖ IL-6, 10% Fetal Calf Serum(FCS : SIGMA사) 함유 eRDF 배지(쿄쿠도제약사)에 순화했다. 다음으로, 소 인슐린(5 ㎍/㎖, 기브코ㆍ비알엘사), 인간 트랜스페린(5 ㎍/㎖, 기브코ㆍ비알엘사), 에탄올아민(0.01 mM, 시그마사), 아셀렌산나트륨(2.5×10-5 mM, 시그마사), 1% Low IgG FCS(HyClone사) 함유 eRDF 배지(쿄쿠도제약사)에 순화했다. 이 순화한 하이브리도마를 플라스크에서 배양하여, 배양 상청을 회수했다. 회수한 상청은, 10 ㎛과 0.2 ㎛의 필터(게르마늄사이언스사)에 이용하여, 하이브리도마 등의 잡폐물을 제거했다. 회수한 배양 상청으로부터, 실시예 4와 동일한 방법으로 항체를 정제했다.
실시예 6 정제한 항IL-3Rα 인간 항체를 이용한 결합 해리 정수의 산출
정제한 항IL-3Rα 항체의 결합 해리 정수를, 표면 플라즈몬 공명의 원리에 의한 해석 장치(Biacore, GE Healthcare사, 이하 GE사)를 이용하여 해석했다. 간단하게는, 항인간 항체 또는 항마우스 항체를 CM5 센서 칩에 고상화하고, 다음으로 항IL-3Rα 인간 또는 마우스 항체를 흘려 결합시키고, 이어서 실시예 2에서 제작한 가용화 IL-3Rα 단백질을 흘리고, 결합 해리를 Biacore2000을 이용하여 관찰했다. 전실험 공정을 통해, 기본적으로는 GE Healthcare사의 결합 해리 정수 산출을 위한 실험 방법을 참조했다.
구체적으로는, 센서 칩은 CM5(리서치 등급)를 이용했다(모두 GE사). 우선, CM5 칩을 400 mM EDC(N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride)와 100 mM NHS(N-hydroxysuccinimide)를 등량 혼합한 것을 CM5 칩에 흘려 활성화시켰다. 다음으로, Human Antibody Capture Kit(GE사) 부속의 인간 항체에 대한 항체(이하, 항인간 항체 항체로 칭함)를 kit 부속의 용액에 희석하여 흘리고, CM5 칩에 항인간 항체 항체를 필요량 고상화시켰다. 대조가 되는 마우스 항체에 관해서는, Mouse Antibody Capture Kit(GE사) 부속의 마우스 항체에 대한 항체(이하, 항마우스 항체 항체로 칭함)를 kit 부속의 용액에 희석하여 흘리고, CM5 칩에 필요량 고상화시켰다. 다음으로, 1 Methanolamidehydrochloride를 흘리고, 활성화한 칩 표면을 블로킹하여 불활화시켰다. 여기까지의 공정에서, 해리 정수 KD를 측정할 수 있는 CM5 센서 칩의 준비가 완성되었다.
다음으로, 항IL-3Rα 항체를 1플로우셀에 1종류씩 HBS-EP 버퍼(GE사)에 5 ㎍/㎖로 희석하여 흘리고, 고상화된 항인간 항체 항체 또는 항마우스 항체 항체에 결합시켰다. 다음으로, 가용화 IL-3Rα 단백질을 흘렸다. 결합한 항IL-3Rα 항체 및 가용화 IL-3Rα 단백질을 해리시키기 위해, Human Antibody Capture Kit 부속의 3M MgCl2, 또는 Mouse Antibody Capture Kit 부속의 pH 1.7 Glycine-HCl을 kit 부속의 양을 흘렸다. 여기까지의 공정을 1 스텝으로 하고, 동일한 공정을 가용화 IL-3Rα 단백질을 복수의 농도로 반복함으로써, 결합 해리 정수를 산출하기 위한 데이터(센서그램)를 취득했다.
분석 물질로서 흘린 가용화형 인간 IL-3Rα 단백질의 농도는 실시예 2에 기술된 바과 같이, 280 nm의 흡광도를 측정하여, 1 ㎎/㎖를 1.4 OD로서 산출했다. 가용화형 인간 IL-3Rα 단백질의 분자량은 이하와 같이 산출했다. 인간 IL-3Rα 단백질의 분자량은, 아미노산 360 잔기에서, 6개소의 N형 당쇄 결합 부위를 가지며, 분자량은 70 KDa로 보고되어 있다(The Cytokine Facts Book 제2판, Academic Press). 따라서, 가용화형 인간 IL-3Rα 단백질의 분자량은, 문헌정보의 70 kDa로부터, 막관통 부위 및 막내 영역의 아미노산의 분자량을 빼고, Flag 서열의 아미노산을 더하여, 약 63 kDa로 산출했다.
해석은, Bia evaluation 소프트(GE사)를 이용하고, Bia evaluation Software Handbook을 참조했다. 구체적으로는, Kinetics 해석의 동시 해석을 실시하고, 기본적으로 1:1 Langmuir Binding의 반응 모델을 채택하여 피팅하고, 결합 속도 정수(Ka) 및 해리 속도 정수(Kd)를 산출하여, Kd/Ka의 계산에 의해 해리 정수 KD값을 산출했다.
결과를 이하의 표 2에 나타낸다.
Figure pct00050
실시예 7 항인간 IL-3Rα 인간 항체의 에피토프 해석
(IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 제작)
IL-3Rα 항체의 에피토프 해석을 실시하기 위해, IL-3Rα의 막외 영역의 일부를 GM-CSFRα와 치환한 키메라 단백질을 세포에 발현시키고, 그 세포에 대한 각 항IL-3Rα 항체의 결합성을 해석했다. 간단하게는, 첫째, IL-3Rα 분자 및 GM-CSFRα 분자를 3 영역으로 구분하고(전술한 N 말단으로부터 A, B, C 도메인), 둘째, IL-3Rα 분자의 A, B, C 도메인을 하나씩 GM-CSFRα의 해당하는 도메인과 치환한 분자를 발현시키는 벡터를 각각 구축하고, 셋째, HEK293F 세포에 강제 발현시키고, 넷째, 플로우 사이토메트리에 의해 형광 색소로 라벨한 각 항IL-3Rα 항체가 결합하는지 관찰했다.
(GM-CSFR/pEF6/Myc-HisC 플라스미드 DNA의 제작)
인간 GM-CSF 수용체 α쇄(GM-CSFRα, CD116)의 cDNA는 비장 유래 cDNA(CLONTECH Human MTC Panel)로부터 KOD-Plus-Ver.2(토요보세키 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 장치는 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드바이오시스템즈)을 이용했다. PCR 반응은 94℃ 2분간의 변성 단계에 이어서, 98℃ 10초-55℃ 30초-68℃ 75초의 3스텝 반응을 35 사이클 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00051
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 JETsorb 키트(Genomed, Bad Oeynhausen, Germany)를 이용하여 추출한 후, NotI 및 MfeI에서 소화했다. pEF6/Myc-HisC 플라스미드 DNA(인비트로젠사)를 EcoRI 및 NotI에서 소화했다. 각각의 DNA를 0.8% 아가로스겔 전기 영동하고, 1.2 kb 부근과 6 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 JETsorb kit(Genomed, Bad Oeynhausen, Germany)를 이용하여 추출했다. pEF6/Myc-HisC 플라스미드 DNA 유래 DNA 용액 0.5 uL과 PCR 산물 유래 DNA 용액 4 uL을 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH5alpha 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트에 뿌렸다. 인서트 체크는, LA Taq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 94℃ 5분간의 변성 단계에 이어서, 94℃ 30초-55℃ 30초-72℃ 2분의 3스텝 반응을 40 사이클 행한 후, 99℃ 30분간의 처리를 행했다.
이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00052
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1.2 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니를 대상으로, 다이렉트 시퀀싱법으로 염기 서열을 결정했다. 시퀀스 샘플의 반응은 Big Dye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(어플라이드바이오시스템즈)와 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드바이오시스템즈)을 이용했다(본 명세서에서의 모든 DNA 서열 해석에서 이들을 사용). 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00053
시퀀스 해석 장치는 ABI 3700 XL DNA analyzer(어플라이드바이오시스템즈)를 이용했다(본 명세서에서의 모든 DNA 서열 해석에서 이것을 사용). PCR에 의한 아미노산 서열의 변이가 일어나지 않은 클론을 선정하여, 라지프렙법(키아겐사)에 의해 플라스미드 DNA를 추출했다.
(IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1의 제작)
인간 IL-3Rα(CD123)의 전길이 cDNA를 PCR법으로 증폭시켜, 하류에 FLAG 태그를 연결했다(IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1).
인간 IL-3RA의 cDNA는 hCD123/pEGFP-N1 플라스미드 DNA를 주형으로 하고 LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 95℃ 30초의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 60초의 3스텝 반응을 10 사이클 행한 후, 2분간의 신장 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00054
얻어진 PCR 산물 2 uL을 주형으로, LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 60초의 3스텝 반응을 15 사이클 행한 후, 72℃ 2분간의 신장 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00055
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System을 이용하여 추출했다. 추출한 DNA 전량을 MfeI 및 NotI에서 소화하고, 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1 kb 부근의 밴드를 잘라내고, DNA를 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System을 이용하여 추출했다. 추출한 IL-3RA-FLAG cDNA 5uL과 EcoRI 및 NotI에서 개열한 pEGFP-N1 플라스미드 DNA DNA 1 uL을 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit(다카라바이오 주식회사)를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(카나마이신 함유)에 뿌렸다. 인서트 체크는, LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 60초의 3스텝 반응을 35 사이클 행한 후, 72℃ 2분간의 신장 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00056
0.8 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니로부터, 미니프렙법으로 플라스미드 DNA를 추출했다.
정제한 IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1 plasmid DNA는 DNA 서열 해석에 의해 PCR에 의한 변이가 들어가지 않은 것과 FLAG 태그의 존재를 확인했다. DNA 서열 해석에 이용한 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00057
(IL-3Rα의 도메인 맵핑)
BLASTP search(database : Protein Data Bank proteins(pdb))의 결과, IL-13 수용체 alpha쇄(IL-13Rα)가 가장 높은 스코어로 히트했다(PDB : 3BPNC; Chain C, Crystal Structure Of The Il4-Il4r-Il13ra Ternary Complex). Protein Data Bank로부터 다운로드한 PDB 파일과 그래픽소프트인 RasMol을 이용하여 IL-13Rα 단백질의 입체 구조를 가시화하고, 세포외 영역을 구성하는 3개의 도메인(전술한 A, B 및 C 도메인)을 분할했다. Multiple Alignment 소프트인 MUSCLE을 이용하여 IL-3Rα 아미노산 서열과 IL-13Rα 아미노산 서열을 비교하여, IL-3Rα 세포외 영역도 3개의 도메인으로 구분했다. 또한, GM-CSFRα와 IL-3Rα를 마찬가지로 비교하여, GM-CSFRα 세포외 영역도 3개의 도메인으로 구분했다.
항인간 IL-3Rα 인간 항체의 에피토프를 특정하기 위해, 상기와 같이 구분한 IL-3Rα의 3 도메인을 하나씩 GM-CSFRα의 상기 도메인으로 치환한 단백질을 제작하고, 세포막 상에 발현시켜, 항체의 결합의 유무를 확인했다.
IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1 플라스미드 DNA를 주형으로 하고 Prime STAR(R) HS DNA Polymerase(다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 98℃ 10초-68℃ 6분의 2스텝 반응을 25 사이클 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
A 도메인 결손;
Figure pct00058
B 도메인 결손;
Figure pct00059
C 도메인 결손;
Figure pct00060
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 증폭을 확인후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System을 이용하여 정제했다. 얻어진 DNA를 KpnI와 DpnI에서 소화후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System을 이용하여 정제하고, TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(카나마이신 함유)에 뿌렸다. 인서트 체크는, LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 40초의 3스텝 반응을 38 사이클 행한 후, 72℃ 2분간의 신장 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00061
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니로부터 미니프렙법으로 플라스미드 DNA를 추출했다.
GM-CSFR/pEF6/Myc-HisC 플라스미드 DNA를 주형으로 하고 Prime STAR(R) HS DNA Polymerase(다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 98℃ 10초-68℃ 30초의 2스텝 반응을 25 사이클 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
A 도메인 삽입;
Figure pct00062
B 도메인 삽입;
Figure pct00063
C 도메인 삽입;
Figure pct00064
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 증폭을 확인후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System을 이용하여 정제했다.
얻어진 DNA를 KpnI에서 소화후, QIAquick Gel Extraction Kit(키아겐사)를 이용하여 정제하고, 대응하는 도메인을 결손한 IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1 플라스미드 DNA(KpnI에서 개열, 정제 완료)와 혼합하고, TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 연결했다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(카나마이신 함유)에 뿌렸다. 인서트 체크는, LATaq(다카라바이오 주식회사)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR에 의해 행했다. PCR 반응은 95℃ 1분간의 변성 단계에 이어서, 95℃ 15초-56℃ 15초-72℃ 40초의 3스텝 반응을 38 사이클 행한 후, 72℃ 2분간의 신장 반응을 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
Figure pct00065
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 1 kb 부근의 증폭이 얻어진 콜로니로부터 미니프렙법으로 플라스미드 DNA를 추출했다.
(항IL-3Rα 항체의 형광 색소의 라벨화)
항인간 IL-3Rα 인간 항체가 결합하는지 확인하기 위해, 각 인간 항체를 형광 색소 Alexa Flour 488(Molecular Probe, invitrogen사)로 라벨했다. 라벨 방법은, invitrogen사에서 반포한 메뉴얼에 따라서, 검출은 플로우 사이토메트리(FACSCalibur, BD Biosciences사)의 FL1에서 형광을 검출했다.
구체적으로는, PBS에 용해되어 있는 항체 용액에, 1/10량의 1M Na2CO3을 첨가했다. 다음으로, tetrafluorophenyl(TFP)이 부가된 Alexa Flour 488의 분말이 포함되는 용기에 매뉴얼에 기재된 소정량의 항체 용액을 첨가하여, 교반시키면서 1시간 암소 실온에서 반응시켰다. 다음으로, 겔여과 컬럼(NAP-10 등, GE 헬스케어사)을 PBS로 충분히 치환한 후에, Alexa Flour 488로 반응시킨 항체의 용액을 첨가하여, 황녹색을 띤 항체 획분을 취득하면서, 항체 용액의 버퍼를 PBS로 치환했다. 이상과 같이 취득한 Alexa Flour 488을 라벨한 항인간 IL-3Rα 항체는, 흡광도계로 280 nm 및 494 nm의 파장의 흡광도(각각 A280, A494)를 측정하여, 다음 계산식으로 항체 농도를 산출했다.
항체 농도(㎎/㎖)=(A280-A494×0.11)/1.4
(라벨화 항IL-3Rα 항체를 이용한 IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 플로우 사이토메트리 해석)
IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 제작에는, HEK293T 세포(ATCC CRL 1268)를 이용했다. 293 펙틴(invitrogen사)을 이용하여, HEK293T에 상기에서 취득한 플라스미드 DNA를 발현 벡터로서 도입했다. 발현 벡터를 도입한 HEK293T는, 쉐이커를 이용하여 CO2 5%, 37℃의 환경하에 배양하여, 도입 2일후에 플로우 사이토메트리 해석에 이용했다.
키메라 단백질 발현 세포를 100,000?1,000,000개에 대하여, 1 ㎍/㎖의 농도의 Alexa Flour 488 라벨 인간 항체 또는 시판하는 FITC 라벨된 항IL-3Rα 마우스 항체(7G3,9F5 : 모두 BD Biosciences사, 6H6 : Acris Antibodies사, AC145 : MiltenyiBiotec사, 107D2.08 : Dendritics사)를, 30분간 빙상에서 반응시켰다. 항체 및 세포의 희석에는, 스테이닝 미듐(2% 소태아 혈청, 2 mM EDTA, 0.05% NaN3을 첨가한 Dulbecco's PBS)을 이용했다. 다음으로, 항체와 반응시킨 세포를 스테이닝 미듐으로 3회 세정하고, 플로우 사이토메트리로 세포에 라벨된 항체가 결합했는지를 확인했다.
그 결과를 도 1 및 2에 나타낸다. 7G3, 9F5, 6H6, AC145 항체는 A 도메인을 GM-CSFRα로 치환시킨 단백질 발현 세포에서만 반응이 소실되었다. 한편, Old4, Old5, Old19, New102, 항체는, B 도메인을 GM-CSFRα로 치환시킨 단백질 발현 세포에의 반응이 소실했다. Old19에 관해서는, A 도메인을 GM-CSFRα로 치환시킨 단백질 발현 세포에 대한 반응도 소실되었다. Old6, 107D2.08은, B 도메인, C 도메인을 치환시킨 단백질 발현 세포에 대한 반응이 소실되었다.
이상에서, 7G3, 9F5, 6H6, AC145는 A 도메인, Old4, Old5, New102는 B 도메인, Old19는 A 도메인과 B 도메인, Old6, 107D2.08은 B 도메인과 C 도메인을 각각 인식할 가능성이 나타났다. 따라서, 각종 항IL-3Rα 항체의 IL-3Rα의 A?C 도메인에 대한 반응성은 이하의 표 3과 같다.
Figure pct00066
실시예 8 항IL-3Rα 항체의 IL-3 시그널의 블로킹능의 해석
얻어진 IL-3Rα 항체가 IL-3 시그널을 저해하지 않는지 검토하기 위해, IL-3 또는 GM-CSF 의존성에 증식하는 세포주 TF-1(DMSZ no.ACC344)을 이용했다. 구체적으로는, TF-1 세포를, IL-3을 1 ng/㎖ 및 10% 소태아 혈청을 포함한 RPMI 1640 배지(TF-1 배지)에 희석하여, 96 웰 플레이트에 뿌렸다. 또한, 각종 IL-3Rα 항체 및 음성 컨트롤 항체로서 인간 혈청 유래 IgG를 TF-1 배지에 희석하여 96 웰 플레이트에 옮겨, 항체의 최종 농도가 10 및 100 ㎍/㎖의 최종 농도가 되도록 첨가했다. 대조로서, 세포없는 배지만의 웰, TF-1 세포가 첨가된 웰을 형성했다. 3일간 37℃ 5% CO2 환경하에 배양하여, CelltiterGlo(Promega사)를 배지와 동량 첨가했다. 30분 정치한 후, 플레이트 리더(ARBO, PerkinElmer사)를 이용하여 발광량을 정량했다.
증식의 저해율은, 이하의 계산을 행했다:
(샘플의 발광량-세포없는 웰)/(TF-1 세포만 첨가한 웰-세포없는 웰)×100(%)
시판 항체 9F5, 6H6, 107D2.08에 관해서는, 버퍼를 PBS로 치환하기 위해, NAP-5 컬럼을 이용했다. 구체적으로는, PBS로 충분히 치환한 NAP-5 컬럼에 0.5 ㎖의 항체 용액을 첨가했다. 다음으로 1.0 ㎖의 PBS를 첨가하고, 컬럼으로부터 나온 용액을 회수했다. 용액은, 구멍 직경 0.22 ㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(미리포어사)로 여과 멸균하여, PBS를 용매로 한 항체를 얻었다. 항체의 농도는 280 nm의 흡광도를 측정하여, 1 ㎎/㎖를 1.4 OD로서 산출했다.
결과를 도 5에 나타낸다. Old4 항체, Old5 항체, Old17 항체, Old19 항체, New102 항체, 9F5 항체, 6H6 항체는 IL-3 시그널을 저해하지 않는 것이 판명되고, 한편 7G3 항체, Old6 항체, 107D2.08 항체는 IL-3 시그널을 저해하는 것이 판명되었다.
실시예 9 항IL-3Rα 인간 항체를 이용한 콜로니 형성능에 대한 영향의 검토
각종 IL-3Rα 항체가 조혈 전구 세포에 의한 콜로니 형성 능력에 영향을 미치지 않는지 콜로니 분석을 행했다.
간단하게는, 에리트로포이에틴, IL-3, G-CSF, Stem Cell Factor를 첨가한 Methocult 배지(Stem Cell Technologie사)에, 제대혈 유래 CD34 양성 세포(All Cells사)를 400 cells/㎖로 첨가하여, 14일 내지 16일후에 콜로니수를 측정했다. 콜로니는, Granulocyte/Macrophage계 콜로니(CFU-GM), Erythroid계 콜로니(BFU-E), 혼합 콜로니(CFU-Mix 또는 CFU-GEMM)로 분류하여 계측했다. 콜로니의 종류의 분류 방법에 관해서는, Stem Cell Technologie사의 메뉴얼 또는 각종 혈액학 교과서를 참조했다.
항체는, 실시예 8에서 IL-3 시그널의 블로킹능이 인정된 항체로서 키메라 7G3 항체, 블로킹능이 인정되지 않은 항체로서 New102 항체를 각각 이용했다.
결과를 도 6에 나타낸다. 에리트로포이에틴, IL-3, G-CSF, Stem Cell Factor를 첨가한 콜로니 분석에서, IL-3 시그널의 블로킹능을 갖는 7G3 항체의 첨가에 의해, 콜로니수의 감소 및 콜로니 사이즈의 감소가 보였다. 한편 New102 항체 첨가에 의한 콜로니수의 변화는 보이지 않았다. 이 결과에서, IL-3 시그널을 저해 또는 블로킹하지 않는 쪽이, 정상적인 조혈 기능에 미치는 영향이 작고, 부작용이 적은 것이 추측된다.
실시예 10 항IL-3Rα 인간 항체를 이용한 마우스 담암 모델에서의 항종양 효과
얻어진 항IL-3Rα 항체를 마우스 담암 모델에 투여하여, 그 항종양 효과를 검토했다. 간단하게는, 마우스에게 백혈병 세포를 미정맥으로부터 이입하고, 다음날에 항체를 투여하여, 약 3주후에 마우스의 뼈에서 채취한 골수 세포중의 백혈병 세포의 수를 계측했다.
구체적으로는, scid 마우스(일본구레아)에 항아시알로 GM1 항혈청(와코준야쿠) 0.01 ㎖ 상당을 생리식염수에 희석하여 투여했다(Day-1). 다음날에, 급성 골수성 백혈병의 세포주인 MOLM13(ATCC)을 50만개 미정맥으로부터 이식했다(Day0). 또한 그 다음날(Day1)에, 항IL-3Rα 항체 10 ㎍를 복강내 투여했다. Day21에 마우스를 도살하고, 대퇴골ㆍ경골로부터 골수를 채취하여, 골수 세포를 FITC 표지 인간 CD45 항체 및 PE 표지 항IL-3Rα 항체(모두 BD Biosciences)로 염색했다. 구체적으로는 100만개 정도의 골수 세포에, 최종 농도가 각 1 ㎍/㎖이 되도록 항체를 첨가하고, 30분 빙상에서 차광하여 정치했다. 그 후, 스테이닝 미듐(PBS(GIBCO)에 2% 소태아 혈청, 0.05% 아지화나트륨, 2 mM EDTA를 첨가한 용액)을 이용하여, 항체로 염색한 세포를 3회 세정하고, 플로우 사이토메트리(FACSCalibur, BD Biosciences)로 인간 CD45 양성 및 인간 IL-3Rα 양성의 세포를 검출했다. 또, 마우스 골수를 채취할 때, 골수 세포수를 투르크액을 이용하여 계측했다. 또한, 정량된 형광 비드(Flow-Count, Beckman Coulter)를 상기 항체 염색시에 동시에 첨가함으로써, 대퇴골 1개당에 포함되는 MOLM13 세포의 절대수를 계측했다.
결과를 도 7에 나타낸다. 항체를 투여한 군은, 모두 항체를 투여하지 않은 Vehicle군에 비해 대퇴골 골수내의 MOLM13 세포수가 현저하게 감소한 것이 확인되었다. 이 결과는, 항IL-3Rα 항체는, 백혈병에 대한 치료약으로서의 가능성을 시사하고 있다.
실시예 11 항IL-3Rα 항체에 의한 IL-3Rα 발현 세포주 상해성 시험
항체를 통한 세포 상해 활성[항체 의존성 세포성 세포 상해 활성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) 이하, ADCC로 약기]을 측정하기 위해, 항체의 존재하에 이펙터로서 인간 말초혈 유래 단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cells 이하, PBMC)를 이용하여 실시했다.
건강한 자원봉사자로부터 말초혈을 채취하여, 항응고재를 첨가했다. 혈액을 Ficoll-Plaque Plus(GE Healthcare사) 상에 정치하고, 계면을 어지럽히지 않도록 대형 원심기(CF9RX, 히타치 등)를 이용하여 2000 rpm 20분 원심 분리했다. 세포가 포함되는 중간층을 모아 PBS를 이용하여 세정하고, 900 rpm 20분의 원심에 의해 혈소판을 제거하여, 말초혈 유래 단핵 세포(PBMC)를 ADCC를 발휘하는 이펙터로서 이용했다.
또한, 인간 IL-2(Peprotech사)를 최종 농도 4 ng/㎖(40 IU/㎖ 이상)로 첨가한 10% 소태아 혈청이 들어간 RPMI 1640 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 환경하에 하룻밤 배양한 PBMC에 관해서도 ADCC 분석의 이펙터로서 이용했다.
방법은 간단하게는, 타겟 세포를 항체 및 PBMC 존재하에 배양하여, 항체에 의한 특이적인 타겟 세포의 용해율을 계측하는 것이다.
용해율의 측정에는, 이하의 「Colon-26/hCD123 ADCC 측정법」을 이용했다. 구체적으로는 타겟 세포로서 IL-3Rα 강제 발현 Colon-26 세포를 방사성 동위원소 51Cr로 라벨된 크롬산나트륨(Na2 51CrO4, PerkinElmer사, NEZ030S)과 37℃, 5% CO2 존재하에 1시간 배양함으로써 타겟 세포를 51Cr로 라벨했다. 라벨한 타겟 세포는, 3회 세정하여 여분의 51Cr를 제거한 후에 배지에 현탁하고, 미리 각종 농도로 항체가 첨가된 96 웰 플레이트에 옮겼다. PBMC를 배지에 현탁하고, 타겟 세포 및 항체가 첨가된 플레이트에 옮겼다(이펙터/타겟율=100). 항체로는, 실시예 4에서 정제한 항IL-3Rα 항체, 음성 컨트롤로서 인간 혈청 유래 IgG(시그마사)를 이용했다. 각종 대조로서, 배지와 타겟 세포만의 웰, PBMC와 타겟만의 웰, Triton-X가 첨가된 웰을 준비했다. 혼합액이 들어간 96 웰 플레이트는, 37℃, 5% CO2 존재하에 4시간 배양했다.
플레이트를 원심한 후, 상청을 신틸레이터가 들어간 96 웰 플레이트(Lumaplate-TM, PerkinElmer사)로 50 uL 옮겨, 56℃, 2시간 건조시켰다. 플레이트를 밀봉하고(TopSeal-A, Packard사), 마이크로플레이트 리더(Top Count, PerkinElmer사)로 측정했다.
타겟 세포의 용해도는, 세포가 용해되어 배지중에 방출된 크롬산나트륨 중의 51Cr양을 측정했다. 즉, 각 웰의 값으로부터 항체가 첨가되지 않은 웰의 값을 뺀 값을, Triton-X100을 첨가한 웰(특이적 용해율 100%로 한다)의 값으로부터 항체가 첨가되지 않은 웰의 값을 뺀 값으로 나눔으로써, 「특이적 용해율」을 산출했다.
그 결과를 도 8 및 9에 나타낸다. 각종 IL-3Rα 항체는, 농도 의존적으로 타겟 세포에 대한 ADCC 활성이 보인다. 또, 대조가 되는 키메라 7G3 항체에 비하여, 높은 ADCC능을 발휘했다. 이것은, IL-3Rα 항체는 IL-3Rα 발현 세포에 대하여 높은 ADCC능을 발휘하여, IL-3Rα 양성 세포 제거를 약효로 한 치료의 가능성을 나타내는 것이다.
실시예 12 항IL-3Rα 항체의 원숭이 IL-3Rα 단백질에 대한 결합성 시험
취득한 항인간 IL-3Rα 항체의 원숭이 IL-3Rα에 대한 결합의 유무는, 실시예 1에서 제작한 게잡이 원숭이 IL-3Rα 강제 발현 세포에, 실시예 7에서 제작한 항인간 IL-3Rα 항체가 결합하는지를 플로우 사이토메트리를 이용하여 해석했다.
구체적으로는, 2×105개의 원숭이 IL-3Rα 강제 발현 L929 세포를 항인간 IL-3Rα 항체의 최종 농도가 10 ㎍/㎖가 되도록 100 ㎕로 4℃, 30분 반응시켰다. 항체는, 음성 컨트롤로 하여 항디니트로페놀(DNP) 인간 IgG1 항체(자사 제조), Old4, Old5, Old17, Old19, New102, 키메라 키메라 7G3 항체를 이용했다. 그 후, 스테이닝 미듐(2% 소태아 혈청, 2 mM EDTA, 0.05% NaN3을 첨가한 Dulbecco's PBS)으로 3회 세정했다. 다음으로, PE 표지 항인간 항체 γ쇄 특이적 항체(서던바이오사)를 최종 농도 1 ㎍/㎖로 스테이닝 미듐 중에서 반응시키고, 마찬가지로 3회 스테이닝 미듐으로 세정했다. 마지막으로, 스테이닝 미듐으로 세포를 혼합하여, 플로우 사이토메트리로 PE의 양성의 유무를 해석했다.
그 결과를 도 10에 나타낸다. 항인간 IL-3Rα 인간 항체인 Old4, Old5, Old17, Old19, New102 및 키메라 7G3 항체는 게잡이 원숭이 IL-3Rα에 반응하는 것이 확인되었다.
실시예 13 항인간 IL-3Rα 인간 항체의 상세한 에피토프 해석
(IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 제작)
IL-3Rα 항체의 보다 상세한 에피토프 해석을 실시하기 위해, IL-3Rα의 막외 영역의 도메인보다 작은 영역을 GM-CSFRα와 치환한 키메라 단백질을 세포에 발현시켜, 그 세포에 대한 각 항IL-3Rα 항체의 결합성을 해석했다. 간단하게는, 첫째, IL-3Rα 분자의 입체적인 구조 예측으로부터 외측에 위치하고 있다고 생각되는 영역을 결정하고, 둘째, 그 작은 영역을 GM-CSFRα로 치환한 IL-3Rα 분자를 발현시키는 벡터를 각각 구축하고, 셋째, HEK293F 세포에 강제 발현시키고, 넷째 플로우 사이토메트리로 형광 색소로 라벨한 각 항IL-3Rα 항체가 결합하는지 관찰했다.
(IL-3Rα의 도메인 맵핑)
실시예 7에서 구분한 3 도메인 중, 취득한 항체 Old19 및 New102가 인식하는 A, B 도메인에 집중하여 상세히 해석했다. IL-4 수용체 alpha쇄(IL-4Rα, CD124)(PDB : 3BPNC; ChainC, Crystal Structure Of The Il4-Il4r-Il13raTernary Complex)의 입체 구조를 바탕으로, SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)을 이용하여 IL-3Rα 단백질의 입체 구조를 호몰로지 모델링했다. 예측된 IL-3Rα 단백질 구조를 그래픽소프트 RasMol(http://rasmol.org/)를 이용하여 가시화하고, IL-3Rα 분자의 외측에 위치한다고 생각되는 아미노산 영역 7개소를 결정했다(도 4).
항인간 IL-3Rα 인간 항체의 에피토프를 특정하기 위해, 상기와 같이 구분한 IL-3Rα의 아미노산 영역 6개소를 각각 GM-CSFRα의 상기 영역에 치환한 단백질을 제작하고, 세포막 상에 발현시켜, 항체의 결합의 유무를 확인했다.
IL-3RA-FLAG/pEGFP-N1 플라스미드 DNA를 주형으로 하고 Prime STAR(R) HS DNA Polymerase (다카라바이오 주식회사)를 이용한 PCR법으로 증폭시켰다. PCR 반응은 98℃ 10초-68℃ 5분의 2스텝 반응을 25 사이클 행했다. 이용한 PCR 프라이머는 이하와 같다:
영역 1 결손;
Figure pct00067
영역 2 결손;
Figure pct00068
영역 3 결손;
Figure pct00069
영역 4 결손;
Figure pct00070
영역 5 결손;
Figure pct00071
영역 6 결손;
Figure pct00072
얻어진 PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기 영동(135 V, 15분, TAE buffer)을 행했다. DNA는 에티듐브로마이드 염색에 의해 가시화했다. 증폭을 확인후, Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System을 이용하여 정제했다. 얻어진 DNA를 Polynucleotidekinase(New England Biolabs)로 인산화하고, 에탄올 침전후, 일부를 TaKaRa Ligation Kit를 이용하여 반응시켰다. 형질전환은, 라이게이션 샘플과 DH10B 컴피턴트 세포와 혼합하여, LB 플레이트(카나마이신 함유)에 뿌렸다. 얻어진 콜로니로부터 Miniprep법으로 플라스미드 DNA를 추출하고, XhoI 및 NotI에서 소화하여, 인서트를 확인했다.
(라벨화 항IL-3Rα 항체를 이용한 IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 플로우 사이토메트리 해석)
IL-3Rα/GM-CSFRα 키메라 단백질 발현 세포의 제작의 제작에는, HEK293T 세포를 이용했다. 리포펙션법을 이용하여, HEK293T에 상기에서 취득한 플라스미드 DNA를 발현 벡터로서 도입했다. 발현 벡터를 도입한 HEK293T는, CO2 5%, 37℃의 환경하에 배양하여, 도입 2일후에 플로우 사이토메트리 해석에 이용했다.
키메라 단백질 발현 세포를 100,000?1,000,000개에 대하여, 1 ㎍/㎖의 농도의 Alexa Flour 488 라벨 인간 항체 또는 시판하는 FITC 라벨된 항IL-3Rα 마우스 항체(7G3, 9F5 : 모두 BD Biosciences사, 6H6 : Acris Antibodies사)를, 30분 빙상에서 반응시켰다. 항체 및 세포의 희석에는, 스테이닝 미듐(2% 소태아 혈청, 2 mM EDTA, 0.05% NaN3을 첨가한 Dulbecco's PBS)을 이용했다. 다음으로, 항체와 반응시킨 세포를 스테이닝 미듐으로 3회 세정하여, 플로우 사이토메트리로 세포에 라벨된 항체가 결합했는지를 확인했다.
그 결과를 도 3에 나타낸다. c7G3 항체는, 영역 1을 GM-CSFRα로 치환시킨 단백질 발현 세포에서만, 반응이 소실되었다. Old19는, A 도메인 내의 영역 2 및 영역 3, B 도메인 내의 영역 5 및 영역 6을 GM-CSFRα로 치환시킨 단백질 발현 세포에 대한 반응이 소실되었다. New102는, B 도메인의 영역 5 및 영역 6을 GM-CSFRα로 치환시킨 단백질 발현 세포에 대한 반응이 소실되었다.
이상에서, Old19 항체는 A 및 B 도메인의 영역 2?3 및 영역 5?6을, New102 항체는 B 도메인의 영역 5?6을, 각각 인식할 가능성이 나타났다.
이상의 결과를 표 4로 통합했다.
Figure pct00073
본 발명에 의하면, 인간 IL-3Rα 단백질(별칭 : 인간 CD123)에 대한 항체 및 인간 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로 하는 골수성 악성 종양, 특히 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 치료약 및 진단약을 제공한다.
[서열표 프리텍스트]
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SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Krin Co., Ltd <120> Anti-IL-3Ralpha Antibody for treatment of blood tumors <130> 1001P12041 <150> US 61/172923 <151> 2009-04-27 <160> 160 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 378 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu 1 5 10 15 Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met 20 25 30 Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr 35 40 45 Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn 50 55 60 Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn 65 70 75 80 Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe 85 90 95 Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys 100 105 110 Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn 130 135 140 Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly 145 150 155 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cttgatatct ggggccaagg gacaatggtc 420 accgtctctt cagctagcac caa 443 <210> 53 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (143)..(143) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 53 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Thr Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gly Pro Asp Val Leu Asp Ile 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Xaa 130 135 140 <210> 54 <211> 412 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 cacagatctc tcaccatgga catgagggtc cccgctcagc tcctggggct cctgctgctc 60 tggctcccag gtgccagatg tgtcatctgg atgacccagt ctccatcctt actctctgca 120 tctacaggag acagagtcac catcagttgt cggatgagtc agggcattag gagttattta 180 gcctggtatc agcaaaaacc agggaaagcc cctgagctcc tgatctatgc tgcatccact 240 ttgcaaagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc 300 accatcagca gcctgcagtc tgaagatttt gcaacttatt actgtcaaca gtattatagt 360 ttcccgtaca cttttggcca ggggaccaag ctggagatca aacgtacggt gg 412 <210> 55 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (133)..(133) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 55 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Arg Cys Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Arg Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 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tctcctgcaa gacttctgga ggcaccttca gcaactttgc tatcagctgg 180 gtgcgacagg cccctggaca agggcttgag tggatgggag ggatcatccc tatctttggt 240 tcaacaaact acgcacagaa gttccagggc agagtcacga ttaacgcgga cgaatccacg 300 agcacagcct acatggagct gagcagtctg agatctgagg acacggccgt gtattactgt 360 gcgggtggag acaaatatgg tccttactac tttcactact ggggccaggg aacccttgtc 420 accgtctcct cagctagc 438 <210> 61 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Phe Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Thr Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Asn Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Phe His 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65 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly His Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 <210> 66 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 agatctctca ccatggacat gagggtcctc gctcagctcc tggggctcct gctgctctgt 60 ttcccaggtg ccagatgtga catccagatg acccagtctc catcctcact gtctgcatct 120 gtaggagaca gagtcaccat cacttgtcgg gcgagtcagg gtattagcag ctggttagcc 180 tggtatcagc agaaaccaga gaaagcccct aagtccctga tctatgctgc atccagtttg 240 caaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300 atcagcagcc tgcagcctga agattttgca acttattact gccaacagta taatagttac 360 cctcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gtacggtggc t 411 <210> 67 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala 130 <210> 68 <211> 435 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 tcgaccacca tggactggac ctggaggttc ctctttgtgg tggcagcagc tacaggtgtc 60 cagtcccagg tccagctggt gcagtctggg gctgaggtga agaagcctgg atcctcggtg 120 aaggtctcct gcatggcttc aggaggcacc gtcagcagct acgctatcag ctgggtgcga 180 caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggagagatca tccctatctt tggtatagta 240 aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgaacaca 300 gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gaggacacgg ccatatatta ctgtgcgaga 360 gagacagcag tggctggtat tcttggttac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420 tcagctagca ccaag 435 <210> 69 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Met Ala Ser Gly Gly Thr Val 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Glu Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val Asn Tyr Ala 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser 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<400> 73 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser His Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Trp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 <210> 74 <211> 407 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 agatctctca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggggcttct gctgctctgg 60 ctcccaggtg ccagatgtgc catccagttg acccagtctc catcctccct gtctgcatct 120 gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg gcaagtcagg gcattagcag tgatttagcc 180 tggtatcagc agaaaccagg gaaagctcct aagctcctga tctatgatgc ctccagtttg 240 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Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser 130 135 140 <210> 78 <211> 412 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 agatctcacc atggaatcac agactcaggt cctcatgtcc ctgctgttct gggtatctgg 60 tacctgtggg gactttgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga 120 gaaggtcact atgagctgca agtctagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa 180 ctacttgacc tggtatctgc agaaaccagg gcagcctcct aaattgttga tctattgggc 240 atccactagg gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt 300 cactctcacc atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga 360 ttatagttat ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gt 412 <210> 79 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr 20 25 30 Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Leu Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg 130 <210> 80 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116Fw-MfeI <400> 80 cggcaattgc caccatgctt ctcctggtga caagcct 37 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116Rv-NotI <400> 81 attgcggccg ctcaggtaat ttccttcacg g 31 <210> 82 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116Fw-MfeI <400> 82 cggcaattgc caccatgctt ctcctggtga caagcct 37 <210> 83 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116Rv-NotI <400> 83 attgcggccg ctcaggtaat ttccttcacg g 31 <210> 84 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116Fw-MfeI <400> 84 cggcaattgc caccatgctt ctcctggtga caagcct 37 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116Rv-NotI <400> 85 attgcggccg ctcaggtaat ttccttcacg g 31 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116SeqFw1 <400> 86 tgaactgtac ctgggcgagg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116SeqFw2 <400> 87 ctggcacgga aaacctactg 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD116SeqRv1 <400> 88 cctgaatttg gataaagcag 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer T7 <400> 89 taatacgact cactataggg 20 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer hCD123-C-FLAG-R1 <400> 90 tcgtcatcgt ccttgtagtc agttttctgc acgacctgta 40 <210> 91 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer IL-3RA_Fw <400> 91 cggcaattgc caccatggtc ctcctttggc tcac 34 <210> 92 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer C-FLAG-NotR2 <400> 92 aaaagcggcc gctcacttgt cgtcatcgtc cttgtagtc 39 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Fw <400> 93 cgtgtacggt gggaggtcta 20 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Re <400> 94 tttatgtttc aggttcagg 19 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Fw <400> 95 cgtgtacggt gggaggtcta 20 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Re <400> 96 tttatgtttc aggttcagg 19 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123R11pEGFPN1 <400> 97 aaaggtaccg aattcgaagc ttgagctc 28 <210> 98 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123F11 <400> 98 aaaggtaccg ggaagccttg ggcaggt 27 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123R12-2 <400> 99 aaaggtacca ctgttctcag ggaagaggat 30 <210> 100 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123F12-2 <400> 100 aaaggtaccc agattgagat attaactcc 29 <210> 101 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123R13 <400> 101 aaaggtacct gaaaagacga caaactt 27 <210> 102 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123F13 <400> 102 aaaggtacct cgctgctgat cgcgctg 27 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Fw <400> 103 cgtgtacggt gggaggtcta 20 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Re <400> 104 tttatgtttc aggttcagg 19 <210> 105 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GM-CSFRF11 <400> 105 aaaggtaccg ccaccatgct tctcctggtg aca 33 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GM-CSFRR11 <400> 106 aaaggtacct gaatttggat aaagcag 27 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GM-CSFRF12 <400> 107 aaaggtaccg gaagggaggg taccgct 27 <210> 108 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GM-CSFRR12 <400> 108 aaaggtaccc tttgtgtcca aaagtga 27 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GM-CSFRF13 <400> 109 aaaggtacca aaatagaacg attcaac 27 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer GM-CSFRR13 <400> 110 aaaggtacca atgtacacag agccgag 27 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Fw <400> 111 cgtgtacggt gggaggtcta 20 <210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer pEGFP-N1-Re <400> 112 tttatgtttc aggttcagg 19 <210> 113 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 115 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Gly Gly Gly Ser Gly Pro Asp Val Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 116 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 117 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Gly Leu Ile Pro Ile Phe Asp Ile Glu Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 118 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Gly Gly Gly Ser Gly Pro Asp Val Leu Asp Ile 1 5 10 <210> 119 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Asn Phe Ala Ile Ser 1 5 <210> 120 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 121 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Gly Asp Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Phe His Tyr 1 5 10 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 123 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Gly His Lys Tyr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Glu Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Glu Thr Ala Val Ala Gly Ile Leu Gly Tyr 1 5 10 <210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ser His Asn Met Asn 1 5 <210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Glu Asp Trp Gly Tyr Phe Asp 1 5 <210> 131 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Arg Met Ser Gln Gly Ile Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 134 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Arg Met Ser Gln Gly Ile Arg Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 135 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 137 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 140 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5 <210> 143 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 147 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 149 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Fw21 <400> 149 cgtggaaccc gcagtgaaca atagctatt 29 <210> 150 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Re21 <400> 150 actctgttct ttttaacaca ctcgatatcg 30 <210> 151 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Fw22 <400> 151 ctttatccaa ataacagtgg gaagccttg 29 <210> 152 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Re22 <400> 152 cagtttctgt tggaatggtg ggttggccac t 31 <210> 153 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Fw23 <400> 153 agggagggta ccggtgcgga gaatctgacc tgct 34 <210> 154 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Re23 <400> 154 tcctgaattt ggatagaaga ggatccacgt gg 32 <210> 155 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Fw24 <400> 155 ggtccgacgg cccccgcgga cgtccagta 29 <210> 156 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Re24 <400> 156 cctcgcccag gtacagctca agaaatccac gt 32 <210> 157 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Fw25 <400> 157 acggaaccag cgcagccttc ggtatcccct 30 <210> 158 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Re25 <400> 158 taaccagaaa gtgggaactt tgagaacc 28 <210> 159 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Fw26 <400> 159 tctttgattc atttgtcgtc ttttcaca 28 <210> 160 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer CD123-Re26 <400> 160 attggatgcc gaaggctgcg ctcctgccc 29

Claims (9)

  1. IL-3 시그널을 저해하지 않고, 인간 IL-3Rα쇄의 B 도메인에 결합하며, C 도메인에는 결합하지 않는, 인간 IL-3Rα쇄에 대한 항체.
  2. 제1항에 있어서, 높은 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)을 추가로 갖는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 높은 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)이, IL-2로 배양한 PBMC를 이용한 Colon-26/hCD123 ADCC 측정법에 있어서, 항체 농도가 0.01 ㎍/㎖ 이하이고 특이적 용해율 10%가 되는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이하의 (a)?(e)로 이루어진 군에서 선택된 중쇄의 CDR과 경쇄의 CDR의 아미노산 서열을 갖는 항체:
    (a) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 113?115로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 131?133으로 표시되는 아미노산 서열,
    (b) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 116?118로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 134?136으로 표시되는 아미노산 서열,
    (c) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 119?121로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 137?139로 표시되는 아미노산 서열,
    (d) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 122?124로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 140?142로 표시되는 아미노산 서열,
    (e) 중쇄의 CDR1?3이 서열번호 125?127로 표시되는 아미노산 서열 및 경쇄의 CDR1?3이 서열번호 143?145로 표시되는 아미노산 서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 이하의 (a)?(f)로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체:
    (a) 서열번호 53으로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 55로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 발린(V)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    (b) 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 발린(V)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    (c) 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    (d) 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 139번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    (e) 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열의 20번째 글루타민(Q)부터 138번째 세린(S)까지의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열의 23번째 아스파라긴산(D)부터 129번째 리신(K)까지의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    (f) (a)?(e)로 표시되는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역에 1?3개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는, 피검체에 있어서, 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα가 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 IL-3Rα 항체를 유효 성분으로 하는 조성물을 피검체에 대하여 투여하는 것을 포함하는 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα가 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양의 치료 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 IL-3Rα 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 피험체로부터의 생물학적 검체에 있어서, 골수 또는 말초혈에 IL-3Rα 발현하고 있는 세포가 보이는 혈액 종양을 검출하기 위한 조성물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액 종양이 급성 골수성 백혈병(AML)인 조성물 또는 방법.
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