JP2666345B2 - リポソーム製剤およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリポソーム製剤およびその製造法に関する。

従来の技術 薬物を封入したリポソームを静脈内投与し、体内の限
定された部位に薬物をターゲットさせるDrug Delivery
System（DDS）の考えはすでに一般化されている［ジ
・グレゴリアディスら著：リセプター・メディエイテッ
ド・ターゲティング・オブ・ドラッグス、プレナム・プ
レス（G.Gregoriadis et al.,Receptor−mediated t
argeting of drugs,Plenum Press,New York,p243−
266（1980））］。そのようなDDSにおいてまず第一義的
に要求されるリポソームの特性は静脈内投与されたリポ
ソームがより長時間安定に血液とともに体内を循環する
ことである。本来、リポソームは、その膜成分である脂
質と血液中のリポプロテインなどの成分とのインターラ
クションにより、血液中ではそれほど安定ではない。ま
た、静脈内投与されたリポソームはその物理的形状や生
化学的特性によって、網内系（RES）により異物として
認識され、血中から消失しやすい特性を持つ。そのため
静脈内投与されたリポソームの血中からの消失は期待に
反して速い。従って、いかに血中でのリポソームの安定
化をはかり、RESによる認識を回避させて、リポソーム
の血中からの消失時間を延長させるかが、従来より重要
な検討課題とされてきた。例えば、リポソームの膜組成
にコレステロールを添加することにより血中でのリポソ
ームの安定性を増大させる報告がある（G.Scherphof e
t al.,“Liposomes;from physical structure to
therapeutic applications",Elsevier,North Holland
p310−311（1981））。しかし、その添加効果はもと
もと用いられているリポソームの膜組成に依存して大き
く異なるといえる（J.Senior etal.,Biochemical et
Biophysica Acta 839,1−８（1985））。またこれ
とは別にリポソームの膜組成にシアル酸基を有する糖蛋
白を用いてリポソームの膜表面をシアル酸で被覆するこ
とによりRESへの分布が抑えられるという報告がある
（M.Haga et al.,Chem.Pharm.Bull.,34,2979−2988
（1986））。また、それとは反対にそのようなシアル酸
を有する糖脂質がRESのひとつである肝臓によく分布す
るという報告もある（A.Surolia et al.,Biochemica
et Biophysica Acta.497,760−765（1977））。

一方、シアル酸を有する糖脂質であるガングリオシド
と天然由来の不飽和リン脂質またはこれにコレステロー
ルを加えて¹⁴C−ラベルEDTAを封入したリポソームを調
製し、これをマウスに静脈内投与した後、体内へのEDTA
の分布状態が調べられている［Biochemica et Biophy
sica Acta,541,321〜333（1978）］。

発明が解決しようとする課題 上記のように、リポソーム膜組成を改質する方法が種
々試みられているものの、静脈内投与後の血中からの消
失時間を延長させるための効果的でかつ実用性の高い手
段としては十分ではない。たとえば、ガングリオシドを
用いる前述の報告によると、得られたリポソームを静脈
内投与後１時間におけるEDTAの血中濃度は５％以下の値
を示し、リポソームの血中からの消失時間は非常に速
い。

課題を解決するための手段 上記の状況に鑑み、本発明者等は静脈内投与されたリ
ポソームが、より長時間、安定に血液とともに体内に循
環させるための方法をリポソーム膜組成にいろいろの成
分を添加して膜を改質することにもとめて種々検討した
結果、本発明を完成したものである。

すなわち本発明は、１）アシル基が飽和アシル基であ
るリン脂質とシアル酸基を有する糖脂質とを膜構成成分
とするリポソーム内に薬物を封入してなるリポソーム製
剤および２）薬物を封入してなるリポソーム製剤の製法
に際し、アシル基が飽和アシル基であるリン脂質とシア
ル酸基を有する糖脂質とを用いてリポソーム膜を構成さ
せることを特徴とするリポソーム製剤の製造法である。

本発明のリポソーム製剤の製造に用いられるアシル基
が飽和アシル基であるリン脂質（以下、単にリン脂質と
略称することがある）としては、アシル基が飽和アシル
基であるグリセロリン脂質あるいはスフィンゴリン脂質
があげられる。本リン脂質としては、たとえばその２個
のアシル基が炭素数８以上の飽和アルキルであり、少な
くともその一方が炭素数10以上、好ましくは12−18の飽
和アルキルであるものがあげられる。さらに両方の飽和
アシル基が炭素性12−18の飽和アルキルであるものがよ
り好ましくは用いられる。このようなリン脂質として
は、動植物起源のレシチン（例、卵黄レシチン、大豆レ
シチン）に水素添加して得られる水添レシチンやラウリ
ル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルなどの
組合せからなる半合成によりえられるホスファチジルコ
リン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジ
ルイノシトール、スフィンゴミエリンなどがあげられ
る。さらにくわしくは、それぞれの相転移温度が通常、
約20〜80℃のものを好ましく用いることができる。たと
えば相転移温度の実測値が以下の（ ）内で示されるよ
うな、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC,23.
9℃）、パルミトイルミリストイルホスファチジルコリ
ン（PMPC,27.2℃）、ミリストイルパルミトイルホスフ
ァチジルコリン（MPPC,35.3℃）、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン（DPPC,41.4℃）、ステアロイルパル
ミトイルホスファチジルコリン（SPPC,44.0℃）、パル
ミトイルステアロイルホスファチジルコリン（PSPC,47.
4℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC,5
4.9℃）、ジミリストイルホスファチジルエタノールア
ミン（DMPE,50℃）、ジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン（DPPE,60℃）、ジステアロイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（DSPE,60℃以上）、ジミリ
ストイルホスファチジルセリン（DMPS,38℃）、パジル
ミトイルホスファチジルセリン（DPPS,51℃）、ジステ
アロイルホスファチジルセリン（DSPS,50℃以上）、ジ
ミリストイルホスファチジルグリセロール（DMPG,23
℃）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DP
PG,41℃）、ジステアロイルホスファチジルグリセロー
ル（DSPG,55℃）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン
（DPSM,41℃）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（D
SSM,57℃）などがあげられる。

次に、本発明で用いられるシアル酸基を有する糖脂質
は、シアル酸基を１つあるいはそれ以上を有するスフィ
ンゴ糖脂質で、天然物または半合成的に得られるものを
いう（以下、単に糖脂質と略称することがある）。ここ
で、シアル酸（sialic cid）とは、ノイラミン酸（neu
raminic acid）およびそのアシル誘導体の一群の化合
物、たとえばＮ−アシルノイラミン酸類、そのエステ
ル、ヒドロキシ基のその他の誘導体をいう。このよう
な、糖脂質として具体的にはガングリオシド類があげら
れる。このガングリオシド類としては、炭素数16〜28の
飽和または不飽和の脂肪酸残基を有し、シアル酸基を１
〜４個有するものが用いられる。ガングリオシド類はシ
アル酸の結合数および結合位置によって多数の分子種が
あり、たとえば次の構造式に示すものが例示される。

Cer:セラミド,Glc:グルコース、Gal:ガラクトース,GalN
Ac:N−アセチルガラクトース,NeuAc:N−アセチルノイラ
ミン酸 本発明では、ガングリオシド類をそれぞれ単独もしく
は混合物として用いることができる。たとえば常法によ
り生体（例、牛脳）から抽出、精製したものが使用でき
る［例えば、Biochimica et Biophysica Acta 60,3
59〜365（1962）、特開昭61−180719号］。なかでも１
分子内にシアル酸基を多く含むガングリオシドの混合物
［相転移温度は、30℃および46℃、Biochimica et Bi
ophysica Acta 468,11−20（1977）］が好ましく用い
られる。

本発明においては、上記のようなリン脂質および糖脂
質を膜の構成成分としてリポソームを構成させる。

本発明におけるリン脂質と糖脂質の使用割合は、一般
にリン脂質の100重量部に対し糖脂質を約0.5−50重量
部、好ましくは約２−20重量部である。また本リポソー
ム膜は、その相転移温度が37−60℃、好ましくは約40−
55℃を示すように調製される。この相転移温度の調整
は、用いるリン脂質の各種類や配合割合などを適宜に選
択することによって行うことが出来る。

一般にリポソーム膜の相転移温度は用いられる個々の
脂質の相転移温度を重量比例配分して求められる相転移
温度に近いので［文献:C.G.Knight,“Liposomes:from
physical structureto therapeutic applications",
Elsevier,North Holland p310−311（1981）］、この
関係を用いて、目的とする膜の相転移温度となるように
脂質組成を選ぶことができる。

通常、上記のような割合でリン脂質と糖脂質とを使用
することにより膜の相転移温度を上記にしめすような範
囲に調整することができ、得られるリポソーム製剤の血
中での消失時間を長くするという本発明の目的が達せら
れる。本リポソームの調製に際しては、本発明の目的を
阻害しない範囲において、抗酸化剤やその他の添加剤
（例、浸透圧調整剤としての糖類）を用いてもよい。

本発明はリポソーム膜の構成成分として上記のような
リン脂質および糖脂質を用いることが特徴であって、リ
ポソーム膜の構成法および薬物の封入法自体は公知の技
術に従って実施できる。例えば、飽和系のアシル基を有
するリン脂質とシアル酸基を有する糖脂質とをジエチル
エーテル、イソプロピルエーテル、またはクロロホルム
などの有機溶媒に溶解した後、さらに薬物含有液を加え
て乳化し、W/O型エマルジョンをえて、40℃以下の温度
の減圧下で有機溶媒を蒸発除去してリバース フェイズ
エバポレイションベシクル（REV）をえることができ
る。また上記脂質有機溶媒溶液の有機溶媒を減圧下で蒸
発除去して薄膜とした後に、薬物含有液を加えて、40℃
以上の温度で混合することによって、マルチラメラーベ
シクル（MLV）をえることができる。またさらに、MLVを
プローブ型超音波振盪機で振盪することによってスモー
ルユニラメラーベシクル（SUV）をえることができる。
さらに他のリポソーム製法としてはステイブル プリラ
メラー ベシクル（SPLV）法（特表昭59−500952）や、
デハイドレイション レハイドレイション ベシクル法
（C.Kirby et al.,Biotechnology,Nov.,979（198
4））が挙げられる。また上記のようにシアル酸基を有
する糖脂質を有機溶媒に溶解させるかわりに薬物含有液
に分散して用いることもできる。さらに、飽和アシル基
を有するリン脂質で予め薬物を封入するリポソームを調
製した後に、これをシアル酸基を有する糖脂質を含む水
分散液に加えて加温下で混合することにより、既にでき
たリポソーム膜にシアル酸基を有する糖脂質を配列させ
る方法を採用することもできる。

また脂溶性であって水への溶解度が低い薬物の場合
は、薬物を上記脂質有機溶媒溶液に溶かして薬物を封入
するリポソームをえることができる。本発明は、とりわ
けREVの製造に好ましく適用できる。

このようにして得られる薬物を封入したリポソームは
そのまま使用してもよいが、必要に応じて好ましい粒子
サイズに調製することができる。この調製法としては、
ニュークリポアーフィルターあるいはゲル濾過などが利
用できる。また、本リポソーム製剤の使用に際しては、
リポソーム内に封入されなかった薬物を例えば、遠心分
離、ゲル濾過あるいは透析によって分離除去した後用い
るのが一般に好ましい。

次に、本発明において使用される薬物は、DDSの目的
で使用されるものであれば特に限定されず、たとえば白
金化合物（例、シスプラチン、カルボプラチン、スピロ
プラチンなど）、アドリヤマイシン、マイトマイシン
Ｃ、アクチノマイシン、アンサマイトシン、ブレオマイ
シン、５−FU、メトトレキセートのような抗癌剤、天然
型あるいは遺伝子組換え型インターフェロン（α、β、
γ）や天然型あるいは遺伝子組換え型インターロイキン
２のようなリンホカイン類、マンガンスーパーオキサイ
ドデスムターゼ（SOD）あるいはその誘導体であるスー
パーオキサイドデスムターゼPEG（PEG−5000）（特開昭
58−16685、EPC公開公報No.0210761）のような生理活性
ペプチド類、スルファゼシンのようなベーターラクタム
系抗生物質、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カ
ナマイシンのようなアミノ配糖体系抗生物質、シアノコ
バラミン、ユビキノンのようなビタミン類、アンチモン
酸メグルミンのような抗原虫薬、アルカリホスファター
ゼ等の酵素剤、ヘパリン等の抗血液凝固剤、アンレキサ
ノックス等の抗アレルギー剤、ムラミルジペプチド、ム
ラミルトリペプチド、TMD−66（Gann 74（２）,192〜1
95（1983））のような免疫賦活剤、プロプラノロールの
ような循環器用薬、グルタチオンのような代謝賦活薬が
あげられる。本発明は、その目的上、とりわけ水溶性薬
物に好ましく適用できる。たとえば、オクタノール／水
間の分配率の対数値が10以下の薬物があげられる。ま
た、薬物の封入量は、対象とする薬物の種類や薬効量等
を考慮し、その有効量が封入されるように適宜に選択す
ればよい。

本発明のリポソーム製剤は一般に水剤あるいは乳剤と
して治療目的に応じて適宜の量を生理食塩水等に分散し
て注射あるいは点滴などにより静脈内に投与して用いら
れる。

実 施 例 以下に実施例、試験例および実験例をあげて本発明を
さらに具体的に説明する。なお、以下においてはガング
リオシドは全てシグマ社製品を用いた。本品は牛脳より
抽出精製して得られたものである［Biochimica et Bi
ophysica Acta,60,359−365（1962）］。また相転移温
度の測定は示差熱分析法によった。

実施例１ 270mgのDPPC、30mgのDSPCおよび30mgのガングリオシ
ドを１リッターのビーカー内でクロロホルムとイソプロ
ピルエーテルの1:1の混合溶液70mlに溶解させた。それ
にあらかじめ生理食塩液と同じ浸透圧となるように調製
しておいたpH7の６−カルボキシフルオレッセイン（６
−CF）水溶液を10ml加えプローブ型超音波振盪機（Ohta
ke）で乳化し、W/O型エマルジョンを作製した。超音波
の照射は50ワットの条件で30秒間、10回くりかえして行
った。このようにしてえたエマルジョンをロータリーエ
バポレーターにかけて、60℃、減圧下で有機溶媒を留去
しREVをえた。エバポレーターの真空度は初めは高く、
有機溶媒の蒸発が進むにつれて真空度をさげて突沸しな
いように調節した。その後さらにREV中に残存する少量
の有機溶媒を窒素ガスをふきつけることにより留去し
た。さらにえられたREVに適当量の生理食塩溶液を加え1
0mlとし、1.2ミクロンのフィルター（Acrodisc,Gelma
n）で濾過し、透析膜（Spectrapor,Spectrum Medica
l）を用いて生理食塩溶液下で24時間透析することによ
り６−CFを封入した本発明のリポソームをえた。さら
に、リポソーム中に封入された６−CFの量を定量するこ
とにより（註１）、その封入率は21.2％であることがわ
かった。また、このリポソーム膜の相転移温度は42.3℃
であった。

（註１）リポソーム註の含量の測定および封入率の計算 リポソーム0.1mlをリン酸緩衝生理食塩溶液（PBS、pH
7.2）で100倍希釈後、さらに0.02％トリトンＸ−100を
含有するPBSで100倍希釈し、60℃、30分加温して、リポ
ソームを破壊し、その溶液の蛍光強度を測定（日立、F3
000蛍光スペクトロメーター、励起波長494nm、測定波長
515nm）することによりリポソーム分散液中の総６−CF
量を求めた。またそれとは別にリポソーム0.1mlをPBSで
10000倍希釈し、その2.5mlを遠心分離型フィルター（Ce
ntrisart、SM13249E、Sartorius）で濾過し、その濾液
の蛍光強度を測定することにより封入されないでリポソ
ーム分散液中に残存する遊離の６−CF量をもとめた。

実施例２ 実施例１の方法において、30mgガングリオシドの代わ
りに15mgのガングリオシドを用いて、この他は実施例１
と同じ方法で調製して、６−CF封入率24.4％、相転移温
度42.5℃のリポソームをえた。

実施例３ 実施例１の方法において、30mgガングリオシドの代わ
りに45mgのガングリオシドを用いて、その他は実施例１
と同じ方法で調製し、６−CF封入率18.3％、相転移温度
42.1℃のリポソームをえた。

実施例４ 実施例１の方法において、270mgのDPPC、30mgのDSPC
の代わりに、210mgのDPPC、90mgのDSPCを用いて、その
他は実施例１と同じ方法で調製し、６−CF封入率31.7
％、相転移温度44.7℃のリポソームをえた。

実施例５ 実施例１の方法において、ガングリオシドをクロロホ
ルム、イソプロピルエーテルの混合溶液に溶解させる代
わりに、そこで用いられる６−CF水溶液に分散させて、
その他は実施例１と同じ方法で調製し、６−CF封入率2
2.5％、相転移温度42.3℃のリポソームをえた。

実施例６ 360mgのDPPC、40mgのDPSCおよび40mgのガングリオシ
ドを１リッタービーカー内で、クロロホルム40mlに溶解
させた。さらに、ロータリーエバポレーターを用いて有
機溶媒を留去し、ガラス壁に脂質薄膜を形成させた。薄
膜中に残存する微量の有機溶媒は、窒素ガスをふきつけ
ることにより除去した。このようにして作製した薄膜
に、60℃の温度下で、あらかじめ60℃に保っておいた実
施例１で用いた６−CF水溶液を10ml加えて、ボルテック
スすることによりMLVをえた。このようにしてえられたM
LVに対して実施例１で用いられるプローブ型超音波振盪
機を用いて超音波の照射を50ワットの条件で約10分間行
いSUVをえた。さらに実施例１と同じ方法で濾過および
透析を行い、６−CF封入率4.9％、相転移温度42.3℃の
リポソームをえた。

実施例７ 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに、
500μg/ml濃度のシスプラチン（CDDP）生理食塩溶液を
用いて、その他は実施例１と同じ方法で調製し、CDDPの
封入率が23.0％（註２）で相転移温度42.3℃のリポソー
ム製剤をえた。

（註２）リポソーム中のCDDP含量の測定方法 リポソーム0.1mlを5mlの生理食塩溶液に分散させ、そ
の2.5mlを凍結ならびに加温処理してリポソームを破壊
し、得られたリポソームの破壊液約2.5mlをCentrisalt
で濾過し、その濾液0.1mlにジエチルジチオカルバメー
ト（DDTC）を10％含有する0.1N NaOH溶液を2ml加え、30
分間室温下で放置後えられるアダクトをｎ−ヘキサン5m
lで抽出して、その抽出液をHPLC（カラム;Zorbax CN、
溶液;n−ヘキサン／イソプロピルアルコール＝8/2;UV＝
250nm）で定量し、リポソーム分散液の総CDDP量をもと
めた。またそれとは別に、リポソームの生理食塩溶液へ
の分散液の残り約2.5mlをCentrisaltで濾過し、同上の
条件でリポソームに封入されないで存在する遊離のCDDP
量を定量した。

実施例８ 実施例７の方法において、CDDP溶液の代わりに６−CF
とCDDPをそれぞれ25mM、250μg/ml濃度で含有する混合
溶液を用いて、実施例10と同じ方法で６−CFおよびCDDP
をそれぞれ封入率19.2％および18.6％で同時に封入し、
相転移温度42.3℃のリポソーム製剤をえた。

実施例９ 実施例７の方法において、30mgガングリオシドの代わ
りに15mgのガングリオシドを用いて、その他は実施例７
と同じ方法で調製し、CDDP封入率20.2％、相転移温度4
2.5℃のリポソーム製剤をえた。

実施例10 実施例８の方法において、30mgガングリオシドの代わ
りに15mgのガングリオシドを用いて、その他は実施例８
と同じ方法で調製し、６−CFおよびCDDPをそれぞれ封入
率17.6％および18.0％で同時に封入し、相転移温度42.5
℃のリポソーム製剤をえた。

実施例11 実施例７の方法において、30mgガングリオシドの代わ
りに45mgのガングリオシドを用いて、その他は実施例７
と同じ方法で調製し、CDDP封入率19.7％、相転移温度4
2.1℃のリポソーム製剤をえた。

実施例12 実施例８の方法において、30mgガングリオシドの代わ
りに45mgのガングリオシドを用いて、その他は実施例８
と同じ方法で調製し、６−CFおよびCDDPをそれぞれ封入
率18.8％および17.6％で同時に封入し、相転移温度42.1
℃のリポソーム製剤をえた。

実施例13 実施例７の方法において、270mgのDPPCおよび30mgのD
SPCの代わりに、210mgのDPPCおよび90mgのDSPCを用い
て、その他は実施例７と同じ方法で調製し、CDDP封入率
24.1％、相転移温度44.7℃のリポソーム製剤をえた。

実施例14 実施例８の方法において、270mgのDPPCおよび30mgのD
SPCの代わりに、210mgのDPPCおよび90mgのDSPCを用い
て、その他は実施例８と同じ方法で調製し、６−CFおよ
びCDDPをそれぞれ封入率20.7％および21.2％で同時に封
入し、相転移温度44.7℃のリポソーム製剤をえた。

実施例15 実施例６の方法において、６−CF水溶液の代わりにCD
DP生理食塩溶液を用いて、その他は実施例７と同じ方法
で調製し、CDDP封入率7.2％、相転移温度42.3℃のリポ
ソーム製剤をえた。

実施例16 実施例15の方法において、CDDP溶液の代わりに６−CF
とCDDPの混合溶液を用いて、その他は実施例８と同じ方
法で調製し、６−CFおよびCDDPをそれぞれ封入率6.8％
および5.9％で同時に封入し、相転移温度42.3℃のリポ
ソーム製剤をえた。

実施例17 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに30
8μｇプロテイン/mlのインターロイキン２（IL−２）水
溶液（溶液の種類;25mM酢酸アンモニウム溶液pH6）を用
いて、その他は実施例１と同じ方法で調製しIL−２の封
入率が20.1％（註３）である本発明のリポソームをえ
た。なおリポソーム中の遊離のIL−２は、遠心分離機
（Sorvall、Sorvall、分離条件;50000g,30分）で分離し
た。

（註３）リポソーム中のIL−２含量の測定方法 超遠心分離により遊離のIL−２を除去した後、IL−２
を封入するリポソームに等量の0.4％トリトンＸ−100水
溶液（v/v）を加え、37℃で30分インキュベイションす
ることによりリポソームを破壊し、遊離してくるIL−２
または、超遠心分離によりえられる上清をグラジエント
を用いたHPLC（カラム;Ultrapore,UV＝210nm）で定量し
た。なおHPLCの溶離液としては、アセトニトリル／水
（40/60v/v）に0.1％のトリフロロ酢酸（v/v）を含む液
（Ａ液）およびアセトニトリル／水（65/35v/v）に0.1
％のトリフロロ酢酸（v/v）を含む液（Ｂ液）を用い、
以下の条件でグラジエントを行った。時 間 Ａ 液 Ｂ 液 ０分 90％ 10％ 20分 ０％ 100％ 25分 ０％ 100％ 30分 90％ 10％ 流速;0.9ml/分 実施例18 実施例17の方法において、IL−２溶液の代わりに６−
CFとIL−２のそれぞれ25mM、154μｇプロテイン/ml濃度
である混合溶液を用いて、その他は実施例17と同じ方法
で調製して、６−CFおよびIL−２をそれぞれ封入率18.7
％および19.9％で同時に封入し、相転移温度42.3℃のリ
ポソーム製剤をえた。

実施例19 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに、
100μg/mlの濃度のアンサマイトシン生理食塩溶液を用
いて、その他は実施例１と同じ方法で調製し、アンサマ
イトシンを封入し、相転移温度42.3℃のリポソーム製剤
をえた。

実施例20 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに、
5mg/mlの濃度のメトトレキセート生理食塩溶液を用い
て、その他は実施例１と同じ方法で調製し、メトトレキ
セートを封入し、相転移温度42.3℃のリポソーム製剤を
えた。

実施例21 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに、
200μg/ml濃度のマイトマイシンＣ生理食塩溶液を用い
て、その他は実施例１と同じ方法で、マイトマイシンＣ
を封入し、相転移温度42.3℃のリポソーム製剤をえた。

実施例22 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに、
1mg/mlの濃度のアドリヤマイシン生理食塩溶液を用い
て、その他は実施例１と同じ方法で調製し、アドリヤマ
イシンを封入し、相転移温度42.3℃のリポソーム製剤を
えた。

実施例23 実施例１の方法において、６−CF水溶液の代わりに、
3mg/mlの濃度のブレオマイシン生理食塩溶液を用いて、
その他は実施例１と同じ方法で調製し、ブレオマイシン
を封入し、相転移温度42.3℃のリポソーム製剤をえた。

実験例１−１ 実施例１、２、３、４および６のリポソームに対応し
て、ガングリオシドを含まないリポソームをそれぞれ作
製した。また、実施例１の270mgのDPPC、30mgのDSPCお
よび30mgのガングリオシドの代わりに、250mgの卵黄レ
シチン、40mgのコレステロールおよび40mgのガングリオ
シドを用いて実施例１と同じ方法でリポソームを作製
し、一方この方法においてガングリオシドを含まないリ
ポソームも合せて作製した。

実験例１−２ 実施例１、２、３、４および６のリポソームとこれら
のリポソームに対応するガングリオシドを含まないリポ
ソーム0.1−0.5mlをそれぞれラットに静脈内投与した
後、経時的に血中からリポソームの消失状況を調べた
（註４）。その結果を第１、２、３、４および５図に示
す。ガングリオシドを含む本発明の実施例で得た各リポ
ソーム（図中、 で示される）の30分後、１時間後および４時間後の血中
濃度はいずれもそれを含まない対象リポソーム（図中、
……×……で示される）よりも高く、それぞれの各経過
時において平均6.8、8.8および3.4倍となった。一方、
卵黄レシチンおよびコレステロールより調製した場合
は、第６図に示されるようにガングリオシド添加品（図
中、 で示される）あるいは無添加品（図中、……×……で示
される）のいずれのリポソームも血中からの消失は、速
いことがわかった。これらの結果が示すように、リポソ
ーム膜組成として飽和系のアシル基を有するリン脂質と
シアル酸基を有する糖脂質を用いる本発明のリポソーム
の製法は、リポソームの静脈内投与後の血液中からの消
失時間を延長させるための効果的でかつ実用性の高い手
段といえる。

実験例１−３ 実験例１−２で用いたリポソームをラットに静脈内投
与して１時間後の肝臓中の６−CF濃度を測定しリポソー
ムのRESへの分布を調べると（註４）、表１の結果をえ
た。これらの結果は、リポソーム血中からの消失時間の
延長は肝臓などのRESへの分布の減少によるものである
ことを示している。

（註４）６−CFリポソームの血中濃度および肝臓中濃度 の測定方法 尾静脈よりえたヘパリン処理血液0.2mlに10mlのPBSを
加えて、血液分散液を調製した。さらにこれを遠心分離
（3000rpm,10分）してえられる分離上清5mlに２％トリ
トンＸ−100を0.05ml加えて60−70℃加温下でリポソー
ムを破壊し、放出される６−CFの蛍光を測定することに
より、血中のリポソーム濃度を求めた。また開腹脱血後
えられた肝臓を0.02％トリトンＸ−100を含有するPBSに
浸漬し、100mlの容積とし組織破壊機（Polytron、Kinem
atica）で組織を破壊し、さらに60−70℃で加温処理し
た後、６−CFがすべて遊離するホモジネートをえた。こ
のホモジネートは超遠心分離（50000g、10分）した後20
−50倍希釈後0.45ミクロンのメンブランフィルター（Ac
rodisk,Gelman）で濾過後その蛍光を測定することによ
り肝臓中のリポソーム濃度をもとめた。

実験例１−４ 実施例１、２、３および４のリポソームとこれらの各
リポソームに対応するガングリオシドを含まないリポソ
ームをそれぞれPBSで10000倍に希釈した。この希釈液を
加温したときのリポソームからの６−CF放出量を、昇温
システムと連結した蛍光測定装置を用いて連続的に測定
して、リポソーム膜の相変化（ゲルからの液晶への変
化）を調べた。この放出曲線より求めた熱放出開始温度
の結果を表２に示す。

実験例２−１ 実施例８、10、14および16の各リポソームに対応し
て、ガングリオシドを含まないリポソームをそれぞれ作
製した。

実験例２−２ 実施例８、10、14および16の各リポソームとこれらの
リポソームに対応するガングリオシドを含まないリポソ
ーム0.1−0.5mlをそれぞれラットに静脈内投与して、６
時間までの血中での６−CF濃度を測定することにより血
中からのリポソームの消失状況を調べた。その結果、ガ
ングリオシドを含む本発明の各実施例のリポソームは、
30分後、１時間後および２時間後において、その血中濃
度はいずれもそれを含まない対照リポソームよりも高
く、それぞれ平均2.2、9.8および3.7倍となった。また
１時間までの血中でのCDDP濃度を測定すると（註５）、
いずれも６−CFと同程度の濃度を示し、CDDPが血中で６
−CFと共にリポソームに封入されて存在することを示し
た。これらの結果から明らかなように、リポソーム膜組
成として飽和系のアシル基を有するリン脂質とシアル酸
基を有する糖脂質を用いる本発明のリポソームの製法
は、リポソームの静脈内投与後の血液中からの消失時間
を延長させるための効果的でかつ実用性の高い手段とい
える。

（註５）CDDPの血中濃度の測定方法 尾静脈よりえたヘパリン処理血液を0.2mlに2mlのPBS
を加えて、血液分散液を調製した。さらにこの遠心分離
してえられる分離上清1mlにDDTC溶液1mlを加えて前述の
CDDPの定量方法と同様にして血中の総CDDP量を定量し
た。

発明の効果 本発明のリポソーム製剤は、静脈内投与後、長時間安
定に血液とともに体内を循環し、そのことにより薬物本
来の毒性を緩和するとともに特定の病巣への薬物のター
ゲット効果を増大させ、薬物の持続的治療効果をたかめ
るために有用である。この血液中での安定効果は、不飽
和アシル基を有するリン脂質とシアル酸基を有する糖脂
質あるいは飽和アシル基を有するリン脂質とシアル酸基
を有しない糖脂質のいずれの組み合せのリポソームより
も高い。とりわけ、抗癌剤を封入してなる本発明のリポ
ソーム製剤は、癌の加温療法時に投与することによって
治療効果の向上が期待でき、この場合にはリポソーム膜
の相転移温度が約40−55℃のものが好ましい。

【図面の簡単な説明】

第１、２、３、４および５図は、それぞれ実施例１、
２、３、４および６で得られたリポソーム製剤をラット
に静脈内投与した後の経過時間とリポソーム製剤の血中
濃度との関係を示す。また、同様に第６図は、実験例１
−１の方法で得られたリポソームの血中濃度変化を示
す。各図中、 はガングリオシド添加リポソームをまた……×……はガ
ングリオシド無添加リポソームをそれぞれ示す。血中濃
度は、投与量に対する、百分率を意味し、ラットの全血
液量は体重の１割とした。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アシル基が飽和アシル基であるリン脂質と
   シアル酸基を有する糖脂質とを膜構成成分とするリポソ
   ーム内に薬物を封入してなるリポソーム製剤。
2. 【請求項２】薬物を封入してなるリポソーム製剤の製造
   に際し、アシル基が飽和アシル基であるリン脂質とシア
   ル酸基を有する糖脂質とを用いてリポソーム膜を構成す
   ることを特徴とするリポソーム製剤の製造法。