KR20110095260A - 하나 이상의 조합가능 돌연변이를 포함하는 바실러스 서브틸리신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조작된 프로테아제 변이체를 제공한다. 특히, 상기 프로테아제 변이체는 선택된 적용에서 수득되는 변이체 효소의 하나 이상의 원하는 특성을 증강시키기 위해 효소의 전하 및/또는 소수성에 영향을 미치는 선택된 표면 위치에서의 조합가능 돌연변이를 포함한다. 또한, 상기 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다.

Description

하나 이상의 조합가능 돌연변이를 포함하는 바실러스 서브틸리신{BACILLUS SUBTILISIN COMPRISING ONE OR MORE COMBINABLE MUTATIONS}

본 출원은 본원에 참조로 인용되는 미국 가 특허 출원 일련 번호 61/113,545 (2008 년 11 월 11 일에 출원됨) 및 미국 가 특허 출원 일련 번호 61/218,802 (2009 년 6 월 19 일에 출원됨) 에 대해 우선권을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 조작된 프로테아제 변이체를 제공한다. 특히, 상기 프로테아제 변이체는 선택된 적용에서 수득되는 변이체 효소의 하나 이상의 원하는 특성을 증강시키기 위해 효소의 전하 및/또는 소수성에 영향을 미치는 선택된 표면 위치에서의 조합가능 돌연변이를 포함한다. 또한, 상기 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다.

세린 프로테아제는 광범위한 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 다양한 종류의 효소를 포함하는 카르보닐 히드롤라제의 하위그룹이다. 주로 세척 및 사료 적용에 있어서의 유용성으로 인해 서브틸리신에 대해 많은 연구가 수행되었다. 추가 연구는 다양한 적용에서 이들 효소의 기능성을 감소시킬 수 있는 유해한 환경 조건 (예를 들어, 산화제, 킬레이트제, 극한 온도 및/또는 pH 에의 노출) 에 초첨을 맞춰왔다. 그럼에도 불구하고, 이러한 유해한 조건에 저항할 수 있고 현재 당업계에 공지된 것보다 개선된 활성을 유지 또는 보유하는 효소계에 대한 필요가 당업계에 여전히 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 조작된 프로테아제 변이체를 제공한다. 특히, 상기 프로테아제 변이체는 선택된 적용에서 수득되는 변이체 효소의 하나 이상의 원하는 특성을 증강시키기 위해 효소의 전하 및/또는 소수성에 영향을 미치는 선택된 표면 위치에서의 조합가능 돌연변이를 포함한다. 또한, 상기 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다.

하나의 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens) 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 (Bacillus) 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 치환 T213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 프로테아제 변이체는 단백질분해 활성을 갖고, 치환 K213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태이다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 임의의 하나의 프로테아제 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 임의의 하나의 프로테아제 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 상기 기술된 임의의 하나의 프로테아제 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하는 세척 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 (heavy duty) 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 치환 T213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은, 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하는 세척 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 또다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 치환 K213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 펙테이트 리아제, 만난아제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은, 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 치환 T213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 또다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 치환 K213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 하나 이상의 프로테아제 변이체를 포함하고, 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함한다. 부가적 효소 또는 효소 유도체는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 셀룰라제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀 옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택된다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세제이다. 일부 구현예에서, 세제는 식기 세제이다. 다른 구현예에서, 세제는 세탁 세제 예를 들어 강력 액체 또는 건조 세탁 세제이다. 대안적 구현예에서, 세척 조성물은 하나 이상의 안정제를 추가로 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은, 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세척 조성물을 제공한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 2 이상의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되고, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 치환 T213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 하기:

에서 선택되는 치환의 조합을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 세척 조성물은 단백질분해 활성을 갖고, 치환 K213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체의 성숙 형태인 0.0001 중량 퍼센트 이상의 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 직물을 포함하는 물품 및/또는 표면을 임의의 하나의 기술된 세척 조성물과 접촉시키는 단계, 및 임의로 상기 표면 또는 물품을 세정 및/또는 헹구는 단계를 포함하는 세척 방법을 제공한다.

도 1 은 BPN' (SEQ ID NO:1) 와 함께 모체 프로테아제 GG36 (SEQ ID:4) 및 FNA (SEQ ID NO:7) 의 성숙 형태의 정렬을 제공한다. 다르게 구체화되지 않는 한, 치환 위치는 BPN' 에 대한 관계에서 제시된다.
도 2 는 pH 8.6 에서 아미노산 잔기 치환에 의한 전하 변화를 나타내는 전하 변화 매트릭스를 제공한다. 이 매트릭스로부터 모체 효소와 비교되는 변이체 효소의 순 전하 변화가 용이하게 확인될 수 있다.
도 3 은 아미노산 잔기 치환에 의한 친수성 (hydropathicity) 변화를 나타내는 Kyte-Doolittle 친수성 변화 매트릭스를 제공한다. 이 매트릭스로부터 모체 효소와 비교되는 변이체 효소의 순 친수성 변화가 용이하게 확인될 수 있다.
도 4 는 pAC-GG36ci 의 지도를 제공한다.
도 5 는 pAC-FNAre 의 지도를 제공한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 조작된 프로테아제 변이체를 제공한다. 특히, 상기 프로테아제 변이체는 선택된 적용에서 수득되는 변이체 효소의 하나 이상의 원하는 특성을 증강시키기 위해 효소의 전하 및/또는 소수성에 영향을 미치는 선택된 표면 위치에서의 조합가능 돌연변이를 포함한다. 또한, 상기 프로테아제 변이체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법이 제공된다.

본원에서 나타나는 바와 같이, 서브틸리신의 전하 및/또는 소수성에 영향을 미치는 치환의 도입은 모체 효소와 비교할 때 관심의 하나 이상의 특성에 대한 성능 지수가 0.5 초과인 변이체 프로테아제를 제공하는 하나 이상의 조합가능 돌연변이를 포함하는 효소를 초래한다. 조합가능 돌연변이는 다양한 적용에서 하나 이상의 원하는 효소 특성에 대한 성능 지수를 증강시키는 역할을 한다. 관심의 특성은 전하, 소수성, 용해도, 세척 성능 예를 들어 직물 및/또는 경질 표면으로부터의 얼룩 제거, 열 안정성, 저장 안정성, 세제 안정성, 기질 결합, 효소 억제, 발현 수준, 반응 속도 및 기질 분해를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 관심이 특성은 전하, 소수성, 발현 수준 (TCA PI) 및 세척 성능 예를 들어 얼룩 제거 (BMI PI) 에서 선택되는 하나 이상의 특성이다. 본원에서는 프로테아제 및 혈액, 우유 및 잉크 얼룩 (BMI) 과의 관계에서 기술되었지만, 본 발명의 프로테아제 변이체는 적용 예를 들어 세척 적용에 의해 지시되는 임의의 다양한 반응 매질에서의 임의의 효소-기질 상호작용에 대해 최적화되는 것으로 고찰된다.

이전에, 우수한 단백질을 개발하려는 노력은 표면에 대한 효소 결합을 최소화하는데 초점을 맞춰왔다. 예를 들어, 일부 방법은 서브틸리신 서열을 변경하는 것을 포함하여 불용성 기질에 대한 흡착이 감소된 변이체 효소를 수득했다 (예를 들어, WO 95/07991 참조). 또다른 접근에서는, 규정된 pH 에서 순 전하가 0 인 변이체 효소를 수득하기 위해 브틸리신의 pI 가 변경되었다 (예를 들어, WO 91/00345 참조). 그러나, 본 발명의 개발 동안 확인된 바와 같이, 상기 접근들이 항상 성공적인 것은 아니다. 본 발명의 개발 동안, 효소의 표면 특성이 일반적으로 표면 전하 및/또는 소수성의 변화의 함수로서 확인되는 최적값을 갖는지가 확인되었다. 심지어 정상적으로는 상당히 활성인 효소의 경우, 표면 특성은 일부 조건 하에서의 일부 기질과의 전반적 반응을 다른 조건 하에서 및/또는 다른 기질과의 반응보다 훨씬 더 느리게 만들 수 있다. 일부 구현예에서 본 발명은 효소 표면 위의 하나 이상의 아미노산의 성질을 변화시킴으로써 수득되는 개질된 표면 특성을 포함하는 변이체 프로테아제를 제공한다. 임의의 다른 아미노산과 상호작용하지 않고 효소 기능에 필수적이지 않은 표면 위의 자리에서 이들 변화가 만들어지는 경우, 본원에서 기술된 바와 같은 위치에서 치환된 아미노산의 특성에 기초하여 단백질의 특성이 예측된다.

자리는 구조 데이타로부터 용이하게 식별된다; 대안적으로는, 상동 서열 정렬, 자리 평가 라이브러리 데이타 및/또는 그의 임의의 조합이 이용된다. 아미노산 치환(들)을 안내하고 치환된 아미노산의 특성과 상관관계에 있는 단백질의 물리적 특성을 식별하기 위해 아미노산 스코어링 매트릭스 (예를 들어, 도 1) 및/또는 소수성 스케일 (예를 들어, 도 2) 이 이용된다.

정의

다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업계의 지식 내에 있는 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 분야에서 통상적으로 사용되는 종래의 기술을 수반한다. 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 당업자에게 공지된 다수의 문헌 및 참고 문헌에 기술되어 있다. 상기 및 하기 본원에 언급되는 모든 특허, 특허 출원, 논문 및 출판물은 본원에 명백히 참조로 인용된다.

본원에서 다르게 정의하지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용되지만, 일부 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 따라서, 하기 정의된 용어들은 전체로서 본 명세서를 참조하여 더욱 상세히 기술된다.

또한, 명백히 다르게 나타내지 않는 한, 본원에서 사용되는 단수형 표현은 복수형 표현을 포함한다. 수치 범위는 범위를 한정하는 수를 포함한다. 다르게 나타내지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 표기하며, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 각각 표기한다. 본 발명이 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다고 이해되어야 하는데, 이는 이들이 당업자에 의해 사용되는 상황에 따라 달라질 수 있기 때문이다.

본 명세서에서 제시된 모든 최대 수치적 한정은, 마치 낮은 수치적 한정이 본원에서 명백히 표기된 것처럼 모든 이러한 낮은 수치적 한정을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 제시된 모든 최소 수치적 한정은, 마치 높은 수치적 한정이 본원에서 명백히 표기된 것처럼 모든 이러한 높은 수치적 한정을 포함할 것이다. 본 명세서에서 제시된 모든 수치적 범위는, 마치 좁은 수치적 범위가 본원에서 명백히 표기된 것처럼, 넓은 수치적 범위에 포함되는 모든 이러한 좁은 수치적 범위를 포함할 것이다.

또한, 본원에서 제공되는 표제는 전체로서 본 명세서를 참조하여 얻어질 수 있는 본 발명의 다양한 양상 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 하기 정의된 용어는 전체로서 본 명세서를 참조하여 더욱 상세히 정의된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어가 이하 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "성능 지수 (PI)" 는 주어진 검정법에서 모체 또는 참조 효소의 성능에 대한 변이체 효소의 성능의 비를 언급한다. 세척 성능에 대한 PI 는 본원에서 혈액, 우유 및 잉크 얼룩 (BMI) 을 제거하는 성능으로서 제공되고, BMI PI 값으로서 제공된다. 발현 수준 성능에 대한 PI 는 트리클로로아세트 (TCA) 산 침전에 의해 측정된 생산된 단백질의 수준으로서 제공되고, TCA PI 값으로서 제공된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "조합가능 돌연변이" 는 그 돌연변이를 포함하는 변이체의 하나 이상의 특성에 대한 성능 지수 (PI) 값이 0.5 초과인 돌연변이이다. 조합가능 돌연변이는 하나 이상의 원하는 특성에 대해 적절한 성능 지수를 갖고, 전하 및/또는 소수성이 변화된 단백질을 산출하도록 조합될 수 있는 돌연변이이다. 돌연변이가 발생하는 위치는 하기와 같이 분류된다: 비제한적 위치는 하나 이상의 특성에 대해 20 % 의 중립 돌연변이를 갖고; 제한적 위치는 활성 및 안정성에 대해 20 % 미만의 중립 돌연변이를 갖는다.

용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 본래 환경 (예를 들어, 자연적으로 발생하는 경우 자연 환경) 으로부터 물질이 제거되는 것을 언급한다. 예를 들어, 물질은 자연 발생적 또는 야생형 유기체에 존재하는 것보다 높은 또는 낮은 농도로 특정 조성물에 존재하거나, 자연 발생적 또는 야생형 유기체로부터의 발현시 정상적으로는 존재하지 않는 성분과 함께 존재하는 경우 "정제되었다" 고 언급된다. 예를 들어, 살아있는 동물에 존재하는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니나, 자연계에 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드가 벡터의 일부이고/이거나, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 조성물의 일부인 경우, 이러한 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것이다. 바람직한 구현예에서, 예를 들어, 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔 또는 블롯에서 본질적으로 하나의 밴드를 생성하는 경우 정제되었다고 언급된다.

용어 "단리된" 은 DNA 서열을 언급할 때 사용되는 경우, 자연적인 유전 환경으로부터 제거되어 다른 외래의 또는 원치않는 코딩 서열이 없으며, 유전자 조작된 단백질 생산 시스템에서 사용하기에 적합한 형태의 DNA 서열을 언급한다. 이러한 단리된 분자는 자연 환경으로부터 분리된 것들이고, cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 단리된 DNA 분자는 통상적으로 관련되는 다른 유전자가 없으나, 프로모터 및 종결자와 같은 자연 발생적 5' 및 3' 미해독 영역을 포함할 수 있다. 관련된 영역의 식별은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78 [1985] 참조). 용어 "단리된 DNA 서열" 은 대안적으로는 "클로닝된 DNA 서열" 로 언급된다.

용어 "단리된" 은 단백질을 언급할 때 사용되는 경우, 천연 환경 이외의 조건에서 발견되는 단백질을 언급한다. 바람직한 형태에서, 단리된 단백질은 다른 단백질, 특히 다른 상동 단백질이 실질적으로 없다. 단리된 단백질은 SDS-PAGE 에 의해 측정할 때 약 10 % 초과의 순도, 바람직하게는 약 20 % 초과의 순도, 더욱 바람직하게는 약 30 % 초과의 순도를 가질 수 있다. 본 발명의 추가의 양상은 SDS-PAGE 에 의해 측정할 때 고도로 정제된 형태 (즉, 약 40 % 초과의 순도, 약 60 % 초과의 순도, 약 70 % 초과의 순도, 약 80 % 초과의 순도, 약 90 % 초과의 순도, 약 95 % 초과의 순도, 약 97 % 초과의 순도, 및 심지어 약 99 % 초과의 순도) 의 단백질을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "모체" 단백질은 예를 들어 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 개질되어 모체 단백질의 하나 이상의 변이체를 생성하는 단백질을 언급한다. 따라서, 용어 "프로테아제 변이체" 및 "변이체 프로테아제" 는 특히 기능이 변이체 프로테아제와 유사하나, 아미노산 서열 내에 돌연변이를 가져서 1 내지 20 개의 아미노산 위치에서 모체 프로테아제의 서열과 상이한 모체 프로테아제를 언급할 때 사용된다. 예시적 모체 프로테아제의 성숙 영역의 아미노산 서열이 도 1 의 정렬에 제시되어 있다. FNA (SEQ ID NO:7) 및 GG36 (SEQ ID NO:4) 은 본 발명의 변이체 프로테아제를 생성하기 위해 하나 이상의 조합가능 치환을 함유하도록 개질된 성숙 모체 프로테아제이다. GG36 은 야생형 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) 프로테아제이고, FNA 는 Y217L 치환을 함유하는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) BPN' 프로테아제이다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "프로테아제" 및 "단백질분해 활성" 은 펩티드 연결을 갖는 펩티드 또는 기질을 가수분해하는 능력을 나타내는 단백질 또는 펩티드를 언급한다. 단백질분해 활성을 측정하기 위한 다수의 공지된 절차가 존재한다 (Kalisz, "Microbial Proteinases," In: Fiechter (ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, [1988]). 예를 들어, 단백질분해 활성은 상업적 기질을 가수분해하는 각각의 프로테아제 능력을 분석하는 비교 검정법에 의해 확인될 수 있다. 프로테아제 또는 단백질분해 활성의 분석에 유용한 예시적 기질은, 디-메틸 카세인 (Sigma C-9801), 소 콜라겐 (Sigma C-9879), 소 엘라스틴 (Sigma E-1625) 및 소 케라틴 (ICN Biomedical 902111) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 기질을 이용하는 비색 검정법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 모두 본원에 참조로 인용되는 WO 99/34011; 및 미국 특허 번호 6,376,450 호 참조). pNA 검정법 (예를 들어, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979] 참조) 이 또한 구배 용리 동안 수집된 분획에 대한 활성 효소 농도를 측정하는데 사용된다. 상기 검정법은 효소가 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐리드 (suc-AAPF-pNA) 를 가수분해할 때 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로부터의 황색의 생성 속도가 분광광도계로 410 nm 에서 측정되며, 활성 효소 농도에 비례한다. 또한, 총 단백질 농도를 측정하기 위해 280 nm 에서의 흡광도 측정이 사용될 수 있다. 활성 효소/총-단백질 비는 효소 순도를 제공한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "서브틸리신" 은 [MEROPS - The Peptidase Data base (Rawlings et al., MEROPS: the peptidase database, Nucleic Acids Res, 34 Database issue, D270-272, 2006, 웹사이트 merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=s08;action=.)] 에 기술된 바와 같은 S8 세린 프로테아제 패밀리의 임의의 일원을 언급한다. 하기 정보는 2008 년 11 월 6 일 현재 [MEROPS - The Peptidase Data base "Peptidase family S8 contains the serine endopeptidase subtilisin and its homologues (Biochem J, 290:205-218, 1993)] 에서 얻었다. 서브틸라제 패밀리로서도 알려진, 패밀리 S8 은 세린 펩티다제의 두번째로 큰 패밀리이고, 2 개의 서브패밀리, 서브패밀리 S8A 에 대한 유형-예인 서브틸리신 (S08.001) 및 서브패밀리 S8B 에 대한 유형-예인 켁신 (kexin) (S08.070) 으로 분류될 수 있다. 트리펩티딜-펩티다제 II (TPP-II; S08.090) 는 예전에 세번째 서브패밀리의 유형-예로 여겨졌으나, 이후 잘못 분류된 것으로 확인되었다. 패밀리 S8 의 일원은 서열 내에 Asp, His 및 Ser 순서로 효소 트리아드 (triad) 를 갖는데, 이는 패밀리 S1, S9 및 S10 과 순서가 상이하다. 서브패밀리 S8A 에서, 모티프 Asp-Thr/Ser-Gly (이는 클란 AA 내 아스파르틱 엔도펩티다제의 패밀리의 서열 모티프와 유사함), His-Gly-Thr-His 및 Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro 에서 활성 자리 잔기가 빈번하게 발생한다. 서브패밀리 S8B 에서, 모티프 Asp-Asp-Gly, His-Gly-Thr-Arg 및 Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro 에서 촉매 잔기가 빈번하게 발생한다. S8 패밀리의 대부분의 일원은 엔도펩티다제이고, 중성 내지 약알칼리 pH 에서 활성이다. 이 패밀리에 속하는 많은 펩티다제가 열안정성이다. 카세인은 종종 단백질 기질로서 사용되고, 전형적인 합성 기질은 suc-AAPF 이다. 이 패밀리의 대부분의 일원은 소수성 잔기 뒤에서의 절단이 선호되는 비특이적 펩티다제이다. 그러나, 켁신 (S08.070) 및 푸린 (furin) (S08.071) 과 같은 서브패밀리 S8B 의 일원은 이염기 아미노산 뒤에서 절단된다. S8 패밀리의 대부분의 일원은 DFP 및 PMSF 와 같은 일반적 세린 펩티다제 억제제에 의해 억제된다. 이 패밀리의 많은 일원이 안정성을 위해 칼슘에 결합하기 때문에, 메탈로펩티다제의 특이적 억제제로 종종 여겨지는 EDTA 및 EGTA 에 의해 억제가 나타날 수 있다. 단백질 억제제는 칠면조 난점질 세번째 도메인 (I01.003), 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 서브틸리신 억제제 (I16.003), 및 패밀리 I13 의 일원 예컨대 에글린 C (eglin C) (I13.001) 및 보리 억제제 CI-1A (I13.005) 를 포함하고, 이의 다수는 또한 키모트립신 (S01.001) 을 억제한다. 서브틸리신 프로펩티드는 그 자체로 억제성이고, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 로부터의 상동 프로티나제 B 억제제는 세레비신 (cerevisin) (S08.052) 을 억제한다. 현재 패밀리 S8 의 여러 일원에 대해 3 차 구조가 확인되었다. 전형적인 S8 단백질 구조는 2 층의 나선 사이에 7-가닥의 β 시트가 끼어 있는 3 개의 층으로 이루어진다. 서브틸리신 (S08.001) 은 클란 SB (SB) 에 대한 유형 구조이다. 상이한 구조에도 불구하고, 서브틸리신 및 키모트립신 (S01.001) 의 활성 자리는 겹쳐질 수 있는데, 이는 이 유사성이 분지 진화가 아닌 수렴 진화의 결과임을 시사한다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "바실러스" 및 "바실러스 속" 은 B. 서브틸리스 (B. subtilis), B. 리체니포르미스 (B. licheniformis), B. 렌투스 (B. lentus), B. 브레비스 (B. brevis), B. 스테아로테르모필루스 (B. stearothermophilus), B. 알칼로필루스 (B. alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스 (B. amyloliquefaciens), B. 클라우시 (B. clausii), B. 할로두란스 (B. halodurans), B. 메가테리움 (B. megaterium), B. 코아굴란스 (B. coagulans), B. 서큘란스 (B. circulans), B. 라우투스 (B. lautus) 및 B. 투린지엔시스 (B. thuringiensis) 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 (Bacillus) 속에 대한 분류학적 개편이 계속 진행 중인 것으로 인식된다. 따라서, 바실러스 속은 현재 "제오바실러스 스테아로테르모필루스 (GeoBacillus stearothermophilus)" 라고 명명되는 B. 스테아로테르모필루스와 같은 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다. 산소의 존재하에서의 내성 내생포자의 생산은, 이 특성이 또한 최근에 명명된 알리시클로바실러스 (AlicycloBacillus), 암피바실러스 (AmphiBacillus), 아네우리니바실러스 (AneuriniBacillus), 아녹시바실러스 (AnoxyBacillus), 브레비바실러스 (BreviBacillus), 필로바실러스 (FiloBacillus), 그라실리바실러스 (GraciliBacillus), 할로바실러스 (HaloBacillus), 파에니바실러스 (PaeniBacillus), 살리바실러스 (SaliBacillus), 테르모바실러스 (ThermoBacillus), 우레이바실러스 (UreiBacillus) 및 비르지바실러스 (VirgiBacillus) 에 적용됨에도 불구하고, 바실러스 속의 특징을 정의하는 것으로 간주된다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 호환되게 사용된다. [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)] 에 따라 정의된 아미노산에 대한 3 자리 코드가 본 명세서 전체에서 사용된다. 또한 유전적 코드의 퇴보로 인해 폴리펩티드가 하나 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다고 이해된다.

"전구서열 (prosequence)" 은 신호 펩티드와 프로테아제의 성숙 영역 사이의 아미노산 서열이다. 전구서열은 성숙 과정 동안 절단되어 프로테아제의 활성 성숙 형태의 생산을 초래한다.

용어 "신호 서열" 또는 "신호 펩티드" 는 단백질의 성숙 또는 전구체 형태의 분비에 참여하는 뉴클레오티드 및/또는 아미노산의 임의의 서열을 언급한다. 신호 서열에 대한 이 정의는 기능적인 것으로서, 단백질 분비의 수행에 참여하는, 단백질 유전자의 N-말단 부분에 의해 인코딩되는 모든 이러한 아미노산 서열들을 포함하는 것으로 의도된다. 이들은 종종, 보편적이지는 않지만, 단백질의 N-말단 부분 또는 전구체 단백질의 N-말단 부분에 결합된다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 단백질 (예를 들어, 프로테아제) 에 정상적으로 결합된 것이거나, 또다른 분비 단백질을 인코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 하나의 예시적인 외인성 신호 서열은 B. 렌투스 (ATCC 21536) 로부터의 서브틸리신의 신호 서열의 나머지에 융합된 B. 서브틸리스 서브틸리신으로부터의 신호 서열의 최초 7 개의 아미노산 잔기를 포함한다.

용어 "잡종 신호 서열" 은 신호 서열의 일부가 발현되는 유전자의 신호 서열에 융합된 발현 숙주로부터 수득되는 신호 서열을 언급한다. 일부 구현예에서, 합성 서열이 이용된다.

용어 단백질 또는 펩티드의 "성숙" 형태는 단백질 또는 펩티드의 최종적인 기능적 형태를 언급한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 FNA 프로테아제의 성숙 형태는 SEQ ID NO:7 의 아미노산 서열을 포함하는 한편, GG36 프로테아제의 성숙 형태는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "전구체" 는 본원에서 성숙 단백질의 아미노 또는 카르보닐 말단에 작동가능하게 연결된 전구서열을 갖는 펩티드 또는 단백질의 형태를 언급한다. 예를 들어, SEQ ID NO:3 및 6 은 각각 성숙 GG36 (SEQ ID NO:4) 및 FNA (SEQ ID NO:7) 의 전구체의 서열이다. 전구체는 또한 전구서열의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 "신호" 서열을 가질 수 있다. 전구체는 또한 번역후 활성에 관여하는 부가적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 그로부터 절단되어 단백질 또는 펩티드의 성숙 형태를 남기는 폴리뉴클레오티드) 를 가질 수 있다.

"자연 발생적 효소" 또는 "자연 발생적 단백질" 은 자연에서 발견되는 서열과 동일한 미개질 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 단백질을 언급한다. 자연 발생적 효소는 특정 미생물에서 자연적으로 발현되거나 발견되는 효소인 천연 효소를 포함한다.

용어 "~로부터 유래된" 및 "~로부터 수득된" 은 문제의 유기체의 균주에 의해 생산되거나 생산가능한 효소 (예를 들어, 프로테아제) 뿐만 아니라, 그러한 균주로부터 단리된 DNA 서열에 의해 인코딩되고 그러한 DNA 서열을 함유하는 숙주 유기체에서 생산된 효소를 언급한다. 부가적으로는, 상기 용어는 합성 및/또는 cDNA 기원의 DNA 서열에 의해 인코딩되고 문제의 효소의 확인된 특성을 갖는 효소를 언급한다.

본 정의의 범주 내의 "유도체" 는 일반적으로 유도체가 야생형, 천연 또는 모체 형태와 유사한 목적에 유용한 정도로 야생형, 천연 또는 모체 형태에서 관찰되는 특유의 단백질분해 활성을 보유한다. 기능성 효소 유도체는 모체 효소의 일반적 특징을 갖는 자연 발생적, 합성으로 또는 재조합으로 생산된 펩티드 또는 펩티드 조각을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "~에 상응하여" 는 단백질 또는 펩티드 내 열거된 위치에서의 잔기를 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "치환된" 및 "치환" 은 모체 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 핵산 염기의 대체(들)을 의미한다. 일부 구현예에서, 치환은 자연 발생적 잔기 또는 염기의 대체를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 아미노산이 치환되어 아미노산 치환의 조합을 포함하는 변이체 프로테아제가 생성된다. 일부 구현예에서, 치환의 조합은 치환이 발생하는 아미노산 위치에 의해 표시된다. 예를 들어, E6A-E30G 에 의해 표시되는 조합은 위치 6 의 글루탐산 (E) 이 알라닌 (A) 으로 치환되고 위치 30 의 글루탐산 (E) 이 글라이신 (G) 으로 치환되는 것을 의미한다. 아미노산 위치는 서브틸리신 BPN' (SEQ ID NO:1) 의 성숙 영역 내의 넘버링된 위치에 상응하여 제시된다.

구절 "2 이상의 위치에서의 치환" 은 본원에서 동일한 단백질에서 발생하는 2 이상의 치환의 조합을 언급한다. 따라서, "2 이상의 위치에서의 치환" 은 2, 3, 4, 5, 6 및 7 개 아미노산 치환의 조합 중 임의의 하나를 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현 카세트" 및 "발현 벡터" 는, 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 특정 핵산 요소들을 갖는, 재조합으로 또는 합성으로 생성된 핵산 구축물을 언급한다. 상기 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스 또는 핵산 조각 내로 통합될 수 있다. 전형적으로는, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은, 다른 서열 중에, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 벡터는 이종 DNA 조각을 숙주 세포 내로 도입하고 발현시키는 능력을 갖는다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 시판된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식에 속한다. 용어 "발현 카세트" 는 본원에서 "DNA 구축물" 및 이의 문법적 동등물과 호환되게 사용된다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식에 속한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형 내로 핵산을 도입시키도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 구축물을 언급한다. 벡터는, 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 카세트 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구축물은 적합한 숙주에서 DNA 의 발현을 수행할 수 있는 적합한 전구서열 (예를 들어, 분비성 등) 에 작동가능하게 연결된 프로테아제 (예컨대, 전구체 또는 성숙 프로테아제) 를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "플라스미드" 는 클로닝 벡터로서 사용되는 환형 이중 가닥 (ds) DNA 구축물을 언급하며, 이는 일부 진핵생물 또는 원핵생물에서 염색체외부 자가 복제 유전적 요소를 형성하거나, 숙주 염색체 내로 통합된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 균주" 또는 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 DNA 를 포함하는 발현 벡터에 적합한 숙주를 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "세척 조성물" 및 "세척 제형" 은 섬유, 식기, 콘택트 렌즈, 기타 고체 기질, 모발 (샴푸), 피부 (비누 및 크림), 치아 (구강세정제, 치약) 등과 같은 세척될 품목으로부터 원치않는 화합물을 제거하는데 사용되는 조성물을 언급한다. 이 용어는 원하는 세척 조성물의 특정 유형 및 제품 형태 (예를 들어, 액체, 겔, 과립, 분말 또는 스프레이 조성물) 에 대해 선택된 임의의 물질/화합물을 포함한다. 세척 조성물 물질의 구체적인 선택은 세척될 표면, 품목 또는 섬유, 및 사용 중 세척 조건에 대한 조성물의 원하는 형태를 고려하여 용이하게 이루어진다.

이 용어는 또한 임의의 대상 및/또는 표면을 세척, 표백, 소독 및/또는 살균하기에 적합한 임의의 조성물을 언급한다. 이 용어는 세제 조성물 (예를 들어, 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 미세 섬유 세제; 경질 표면 세척 제형, 예컨대 유리, 목재, 도자기 및 금속 조리대 및 창문용; 카페트 세척제; 오븐 세척제; 섬유 청정제; 섬유 유연제; 및 직물 및 세탁 얼룩 사전처리제 (pre-spotter) 뿐만 아니라 식기 세제) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 것으로 의도된다.

실제로, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세척 조성물" 은 다르게 나타내지 않는 한 과립 또는 분말 형태의 다목적 또는 강력 세정제, 특히 세척 세제; 액체, 겔 또는 페이스트 형태의 다목적 세정제, 특히 소위 강력 액체 (HDL) 유형; 액체 미세-섬유 세제; 손 식기세정제 또는 순한 식기세정제, 특히 고발포 유형의 것; 가정 및 영업용의 다양한 정제, 과립, 액체 및 헹굼 보조 유형을 포함하는 기계 식기세정제; 항균 손 세정 유형, 세척 바, 구강세정제, 의치 세척제, 차량 또는 카페트 샴푸, 욕실 세척제를 포함하는 액체 세척 및 소독제; 모발 샴푸 및 모발 린스; 샤워 젤 및 거품 목욕제 및 금속 세척제 뿐만 아니라; 표백 첨가제 및 "얼룩-막대 (stain-stick)" 또는 전처리 유형과 같은 세척 보조제를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "섬유 세척 조성물" 은 세탁 첨가 조성물, 및 얼룩진 섬유 (예를 들어, 의류, 린넨 및 기타 직물 물질) 의 담금 및/또는 전처리에 사용하기에 적합한 조성물을 비롯한 손 및 기계 세탁 세제 조성물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "비-섬유 세척 조성물" 은 식기세정 세제 조성물, 구강 세척 조성물, 양치 세척 조성물 및 개인 세척 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-직물 (즉, 섬유) 표면 세척 조성물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세제 조성물" 및 "세제 제형" 은 오염된 물체의 세척을 위해 세정 매질에서 사용될 것이 의도되는 혼합물을 언급할 때 사용된다. 바람직한 구현예에서, 이 용어는 식기, 식탁용 날붙이류 (cutlery) 등을 세척하는데 사용되는 세제 (예를 들어, "식기 세제" 또는 "식기세정제") 를 언급할 때 사용된다. 본 발명이 임의의 특정 세제 제형 또는 조성물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 이 용어는 본 발명의 하나 이상의 프로테아제를 함유하는 세제에 더하여, 계면활성제, 트랜스퍼라아제(들), 가수분해 효소, 산화 환원 효소, 세척강화제, 표백제, 표백 활성화제, 청색화제 (bluing agent) 및 형광 염료, 케이크화 (caking) 억제제, 차폐제, 효소 활성화제, 항산화제 및 가용화제를 함유하는 세제를 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "식기세정 조성물" 은 식탁용 날붙이류를 포함하는 식기류를 세척하기 위한 과립 및 액체 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 형태의 조성물을 언급한다. 본 발명이 임의의 특정 유형 또는 식기류 조성물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본 발명은 도자기, 플라스틱, 금속, 자기, 유리, 아크릴 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 물질의 식기류 (예를 들어, 접시, 컵, 유리제품, 사발 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 식기) 및 식탁용 날붙이류 (예를 들어, 숟가락, 칼, 포크, 서빙 도구 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 도구) 를 세척하는데 사용된다. 용어 "식기류" 는 본원에서 식기 및 식탁용 날붙이류를 언급할 때 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "식기세정 세제를 함유하는 비인산염" 은 0.5 % 이하의 인을 함유하는 (즉, 인이 미량 원소인) 세제이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 변이체 프로테아제의 "세정 성능" 또는 "세척 성능" 은 프로테아제 변이체의 부재 하에 수득되는 것과 비교할 때 변이체 프로테아제가 세척 조성물의 세척 능력에 주는 기여를 언급한다.

용어 "적절한 세정 조건" 은 본원에서 식기 또는 세탁 세제 시장 부문에서 가정에서 실제로 사용되는 조건, 특히 세정 온도, 시간, 세정 기계, 비누 (sud) 농도, 세제의 유형 및 물 경도를 나타낼 때 사용된다.

용어 "개선된 세정 성능" 은 적절한 세정 조건 하에 얼룩 제거에 있어서 더 양호한 최종 결과가 수득되거나, 또는 상응하는 야생형 또는 시작 모체 프로테아제와 동일한 최종 결과를 수득하기 위해 중량에 기초하여 정도가 덜한 변이체 프로테아제가 필요함을 나타낼 때 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "소독" 은 표면으로부터의 오염물질의 제거 뿐만 아니라, 품목의 표면 위의 미생물의 억제 또는 사멸을 언급한다. 본 발명이 임의의 특정 표면, 품목 또는 제거될 오염물질(들) 또는 미생물에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "유효량의 효소" 는 구체적 적용 (예를 들어, 개인 케어 제품, 세척 조성물 등) 에서 필요한 효소 활성을 달성하는데 필요한 효소의 양을 언급한다. 그러한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 확인되고, 많은 인자, 예컨대 사용된 특정 효소 변이체, 세척 적용, 세척 조성물의 구체적 조성, 및 액체 또는 건조 (예를 들어, 과립, 바) 조성물이 필요한지 여부 등에 기초한다.

본원의 세척 조성물의 "압축" 형태는 밀도에 의해, 그리고 조성에 있어서 무기 충전제 염의 양에 의해 가장 잘 반영된다. 무기 충전제 염은 분말 형태의 세제 조성물의 종래의 성분이다. 종래의 세제 조성물에서, 충전제 염은 상당한 양으로, 전형적으로는 총 조성물의 약 17 내지 약 35 중량% 로 존재한다. 반대로, 압축 조성물에서, 충전제 염은 총 조성물의 약 15 % 를 초과하지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 충전제 염은 조성물의 약 10 중량% 를, 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 를 초과하지 않는 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 무기 충전제 염은 술페이트 및 클로리드의 알칼리 및 알칼리 토금속 염에서 선택된다. 바람직한 충전제 염은 나트륨 술페이트이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "보조 성분" 또는 "보조 물질" 은 계면활성제, 세척강화제, 표백제, 표백 활성화제, 표백 촉매, 기타 효소, 효소 안정화 시스템, 킬레이트물질 (chelant), 형광 증백제, 오염 방출 중합체, 염료 전이제, 분산제, 비누 억제제, 염료, 향수, 착색제, 충전제 염, 굴수성 유발물질 (hydrotrope), 광활성화제, 형광물질, 섬유 컨디셔너, 가수분해가능 계면활성제, 보존제, 항산화제, 항수축제, 항구김제, 살균제, 살진균제, 색조 얼룩 (color speckle), 실버케어 (silvercare), 항변색제 및/또는 항부식제, 알칼리성 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료 및 pH 조절제 (예를 들어, 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,605,458 호, 5,705,464 호, 5,710,115 호, 5,698,504 호, 5,695,679 호, 5,686,014 호 및 5,646,101 호 참조) 를 포함되나 이에 제한되지 않는 세척 물질을 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "식기세정 조성물" 은 과립 또는 액체 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 형태의 식기 세척용 조성물을 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "섬유 세척 조성물" 은 과립, 액체 및 바 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 형태의 섬유 세척용 세제 조성물을 언급한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "섬유" 는 임의의 직물 물질을 포함한다. 따라서, 이 용어는 의류 뿐만 아니라 섬유, 실, 파이버 (fiber), 비직조 물질, 천연 물질, 합성 물질 및 임의의 기타 직물 물질을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "직물" 은 직조 섬유 뿐만 아니라, 실, 직조물, 니트 및 비직조 섬유로서 사용하거나 이들로 전환하기에 적합한 주요 파이버 및 필라멘트 (filament) 를 언급한다. 이 용어는 천연 뿐만 아니라 합성 (예를 들어, 제조된) 파이버로부터 제조된 실을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "직물 물질" 은 파이버, 실 중간체, 실, 섬유, 및 섬유로부터 제조된 제품 (예를 들어, 의류 및 기타 물품) 에 대한 일반 용어이다.

산업, 소비자 또는 제약 적용에서 단백질 성능을 개선시키기 위해 현재 이용되는 대부분의 전략은 촉매 효율을 증가시키기 위해 효소의 활성 자리에서의 또는 그 근처에서의 아미노산 치환에 초점을 맞춰 왔다. 그러나, 본 발명의 개발 동안, 효소 표면의 다른 곳에서의 돌연변이가 촉매 효율 개선을 통해 가능한 정도를 능가하여 효소 성능을 급격히 증가시킴을 확인했다. 기본적으로, 효소에 의해 매개되는 기질의 산물로의 전환을 지배하는 반응 속도는 화학적 촉매 전환 단계만의 속도에 의해 오직 부분적으로 제어된다. 효소 및 기질은 효소-기질 ES 복합체로서 연합되기 전 뿐만 아니라, 화학적 전환 이후 형성되는 효소-산물 EP 복합체로부터 해리되는 동안 콜로이드로서 상호작용한다. 반응 단계가 빠른 속도로 진행됨에도 불구하고, 효소의 기질로의 접근은 정전기적 척력이 작용하는 동일-부호 콜로이드의 경우와 같이 극도로 느릴 수 있다 (예를 들어, 확산-제한). 마찬가지로, 효소-산물 EP 복합체로부터 효소의 방출은 단거리 소수성 및 분산성 인력이 작용하는 콜로이드의 경우와 같이 극도로 느릴 수 있다 (예를 들어, 확산-제한). 상기 조건은 모두 기질에서 산물로의 효소 전이 시간을 증가시키고 화학적 전환과 비슷한 속도-단계 제한성이 된다. 반대로 대전된 콜로이드는 실제로 ES 복합체의 형성을 촉진할 것이라고 예상할 수 있지만 (예를 들어, 상기 확산 제한), 그 이후의 EP 복합체의 해리는 극도로 느릴 것이므로 (전하가 생성되지도 상실되지도 않는다고 추정할 때) 전체적 반응 속도는 감소할 것이다. 그러므로, ES 및 EP 복합체 모두에 대해 최소 전이 시간을 보장하기 위해 짝 상호작용 퍼텐셜의 비대칭이 이용된다. 이는 생명공학 산업에서 특히 중요한데, 그 이유는 종종 효소-제한 조건 하에 가능한 한 짧은 시간 안에 모든 기질을 산물로 전환시키는 것이 바람직하기 때문이다. 역사적으로, 단백질 공학자는 화학적 전환 단계의 특이적 효소-기질 상호작용에 초첨을 맞춰 왔고, 연합 및 해리 단계를 지배하는, 분자간 콜로이드 힘 및 표면력으로 인한, 단거리 및 장거리 비특이적 상호작용 모두의 기여를 인식하는데 실패했다. 본 발명의 하나의 목적은 화학적 전환 단계가 속도-제한성이 되도록 효소 표면 위의 하나 이상의 아미노산의 성질을 변화시켜 분자간 힘을 최적화함으로써 수득되는 변경된 표면 특성을 갖는 프로테아제 변이체를 제공하는 것이다.

표면 특성의 개질은 본원에서 기술된 방법을 사용하여 효소의 전하 및/또는 소수성을 변경하는 아미노산 치환을 도입함으로써 달성된다. 화학적 전환 단계가 속도 제한성이 되면, 효소 활성 자리 내 변화를 통해 변이체 효소 성능의 추가적 개선이 달성될 수 있다. 기질이 용액 중 소형 펩티드이든 불용성 미세한 기질이든 이 목적이 적용가능하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명을 제조하고 이용하기 위해 관련된 메카니즘(들)에 대한 지식은 필수적이지 않다. 본 발명이 임의의 특정 메카니즘에 제한되는 것으로 의도되지도 않는다.

간략히 본 발명의 프로테아제 변이체를 생성하는데 사용되는 방법은 (I) 물리적 특성 범위를 포괄하는 탐침 단백질의 검정; (II) 제시된 유리한 결과를 위한 물리적 특성 최적값의 결정; 및 (III) 물리적 특성 최적값을 갖는 변이체 단백질의 제공을 수반한다.

I. 탐침 단백질의 검정

탐침 단백질의 검정은 적절한 검정에서 관심의 물리적 특성 (즉, "관심의 특성") 의 범위를 포괄하는 다중 탐침 단백질 (즉, "탐침 단백질 폴드") 의 시험을 수반한다. 탐침 단백질은 제한된 세트의 단백질 및/또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 예시적 구현예에서, 하나 이상의 세린 프로테아제가 하나 이상의 유익에 대해 시험되었다. 예를 들어, 2 개의 세린 프로테아제, GG36 및 FNA 에 대한 모체 효소에 대한 변이체의 순 전하의 변화가 제공되었다. 본원에서 기술된 바와 같은 GG36 및 FNA 의 변이체에 대한 순 전하 변화는 각각의 모체 효소와 비교할 때 -7 내지 0 의 상대적 순 전하 변화 범위를 포괄한다.

II. 물리적 특성 최적값의 결정

물리적 특성 최적값의 결정 즉, 관심의 특성 최적값의 결정은 유리한 결과를 위한 물리적 특성 최적값 또는 그의 범위의 식별을 수반한다. 일부 예시적 구현예에서, 본원에서 FNA 및 GG36 프로테아제 변이체의 BMI PI 로서 제공되는, 세척 성능 지수가 측정되었다. 다른 구현예에서, 본원에서 FNA 및 GG36 프로테아제 변이체의 TCA PI 로서 제공되는, 발현 수준이 측정되었다. 본 구현예에서, 동일한 폴드를 갖는 단백질, 즉 세린 프로테아제로 수득되는 유익을 비교할 때, 상대값 (예를 들어, 야생형 또는 모체 단백질에 대한 순 전하 차이) 이 이용되었다. 대안적으로는, 상이한 폴드를 갖는 단백질, 예를 들어 세린 프로테아제 및 메탈로프로테아제로 수득되는 유익을 비교할 때, 공통의 물리적 특성 스케일 (예를 들어, 제타 전위로서 보고되는 단백질 전하) 이 이용되었다. 물리적 특성에 대한 최적값을 결정할 가능성을 증가시키기 위해 넓은 물리적 특성 범위를 포괄하는 탐침 단백질이 이용된다. 탐침 단백질을 검정함으로써 관심의 유익에 대한 최적 값 또는 최적 범위가 정립되면, 열등한 수행자 (예를 들어, 최적 범위의 밖에 있는) 를 우월한 수행자 (예를 들어, 최적 범위 내에 있는) 로 전환시키는데 필요할 수 있는 변화의 일반적 방향 및 규모를 예측하는 것이 가능하다.

하나 초과의 탐침 단백질 시리즈의 사용은 관심의 유익에 대한 상이한 물리적 특성 최적값의 식별을 가능하게 할 것으로 고찰된다. 예를 들어 일부 구현예에서, 세제 프로테아제 GG36 및 FNA 의 모체 효소에 대한 순 전하 및 소수성의 변화 모두가 혈액, 우유, 잉크 검정에서 세척 성능에 대해 시험된다. 일부의 경우에, 동일한 물리적 특성이 상이한 유익에 대한 상이한 최적값을 나타내는 것으로 고찰된다. 예를 들어, 발현 수준 (TCA PI) 에 대한 최적의 프로테아제 전하와 구별되는, FNA (BMI PI) 에 대한 세척 성능에 대한 최적의 프로테아제 전하가 존재한다.

일부 구현예에서, 측정된 제타 전위, 순 전하, 전하 밀도, 및/또는 이온화가능 기의 표면 계수의 면에서 전하-관련 물리적 특성이 모체 및 변이체 단백질 간에 비교된다. 일반적으로, 적정 또는 전기영동 측정으로부터 단백질 전하를 측정하는 임의의 방법이 상이한 단백질 폴드를 비교하는데 적합하다. 상이한 단백질 변이체의 비교는 입수가능한 경우 단백질 1차, 2차 및/또는 3차 서열 정보에 기초한 상기 양 중 하나 이상의 계산에 의해 수행된다. 이러한 목적에 이용되는 전형적인 생물정보학 도구는 헨더슨-하셀바하 방정식 (예를 들어, European Molecular Biology Laboratory) 또는 포아송-볼츠만 정전기 솔버 (solver) (예를 들어, DelPhi, MOE) 를 이용하는 등전점 계산을 포함한다.

III. 물리적 특성 최적값을 갖는 변이체 단백질의 제공

이전 단계에서 최적 값 또는 범위가 결정되면, 관심의 물리적 특성에 대해 한정된 복수의 후보 단백질이 제공된다. 후보 단백질을 제공하는 적합한 방법은 재조합 기술에 의한 인공 효소 변이체의 생산 뿐만 아니라, 크로마토그래피에 의한 자연 효소 변이체 (예를 들어, 상동체) 의 정제, 당화 또는 인산화 효소 변이체의 시험관내 합성 또는 효소 접합체의 시험관내 생산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당화를 통해 단백질의 소수성을 변경하는 또다른 방법은 효소의 표면에 새로운 당화자리를 생성한다. 이들 변이체는 발현 동안에 생체내 당화될 것이다.

일부 구현예에서, 모체 효소에 대한 수득되는 변이체의 소수성의 순 변화에 대한 치환된 잔기의 전체적 기여의 면에서 소수성-관련 물리적 특성이 프로테아제 변이체들 간에 비교된다. 일부 구현예에서, 단백질 1차, 2차 및/또는 3차 구조 정보를 고려하는, 문헌에서 입수가능한 당업자에게 공지된 많은 아미노산 소수성 스케일 중 하나 이상을 사용하여 전체적 소수성 기여가 계산된다. 천연 수성 환경과 소수성 상 사이에서 측정되는 단백질 분배의 면에서 소수성-관련 물리적 특성이 상이한 단백질 폴드들에 걸쳐서 비교되는 경우에, 예는 공기-물 또는 헵탄-물 경계면에서의 표면 장력 뿐만 아니라, 수성 및 고체 기질-함유 상 사이의 습윤성 측정 및 접촉 각도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 2 개의 상 사이의 단백질의 분배를 특징지우는데 적합한 임의의 방법, 예컨대 시각적 (예를 들어, 타원계측법, 표면 플라스몬 공명, 간섭법 및/또는 반사율), 음향적 (예를 들어, 수정진동자 마이크로밸런스), 형광, 분광법 (예를 들어, 감쇠 전반사 적외선법) 또는 농도 (예를 들어, 효소 활성) 측정이 본 발명에 사용하는데 적합하다.

하전된 잔기가 친수성 특징을 부가하므로 전하 및 소수성 스케일은 서로 독립적이지 않다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예는 단순히 하나의 스케일을 선택하고 다른 것을 제외하기 보다는, 물리적 특성 상관성을 식별하기 위해 복수의 상이한 스케일들 (예를 들어, 이론적 또는 실험적으로 측정되는) 을 이용한다. 23 개의 가장 통상적으로 사용되는 소수성 스케일에 대한 참조는 하기를 포함한다:

동일한 단백질 폴드 내에서 또는 상이한 단백질 폴드에 걸쳐서 프로테아제 및 그의 변이체 간에 비교되는 다른 물리적 특성은 용해도-관련 물리적 특성, 크기-관련 물리적 특성 및 단백질 용융 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 기술된 전하 및 소수성 스케일 모두의 면에서 용해도-관련 물리적 특성이 상이한 단백질 폴드들에 걸쳐서 비교된다. 일반적으로, 단백질-단백질 대 단백질-용매 상호작용을 특징지우는 임의의 열역학적 또는 동역학적 양은 본 발명의 방법과 함께 사용하기에 적합하다. 예를 들어 두번째 바이러스 계수 (참조, Wilson, Acta Crystallographica, D50:361-365 [1994]), 카이 매개변수, 삼투압, 및 이상적 혼합 행태로부터의 편차를 반영하는 활성 또는 퓨개시티 계수가 이용된다 (예를 들어, Reid et al., "The Properties of Gases and Liquids", 4^th Ed. McGraw-Hill, [1987] 참조). 단백질 또는 중합체 크기를 측정하는데 적합한 임의의 실험적 수단을 사용하여 크기-관련 물리적 특성이 상이한 단백질 폴드에 걸쳐 비교된다. 단백질 또는 중합체 입체형태 (코일, 구형, 분지형), 그들의 분자량과 유체역학적 또는 관성 반경 사이의 통상적으로 입수가능한 상관관계를 사용하여 분자량으로부터 크기가 추론된다. 크기 또는 분자량 측정을 위한 적합한 기술은 정적 및 동적 광 산란, 겔 전기영동, 질량 분광법 및 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로는, 실험적으로 결정된 단백질 결정 구조 또는 구조적 상동성 모델에 대한 지식으로부터 크기가 용이하게 추정된다.

단백질 용융 온도 (T_m) 는 전형적으로는 온도 스캔 전체에 걸친 물리적 리포터 특성의 모니터링을 통해 측정된다. 적합한 방법은 시차주사 열량측정법, 원편광 이색성 분광법, 동적 광 산란, 및 UV-가시광선 분광법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

세린 프로테아제 효소에 대한 적용

프로테아제 변이체를 생성하기 위해 만들어진 조합가능 돌연변이는 다양한 적용에서 하나 이상의 원하는 효소 특성에 대한 성능 지수를 증강시키는, 예를 들어, 성능 최적값을 결정하는 역할을 하는 것으로 고찰된다. 성능/특성 최적값의 결정은 이용되는 매질 (예를 들어, 세제 제형, pH, 이온 강도 등) 뿐만 아니라, 관심의 효소의 아미노산 잔기의 순 전하 및 전하 분포에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서, 다양한 pH, 이온 강도, 계면활성제 유형 및 비, 세척강화제 및 킬레이터 (이들 모두는 정전기 현상에 영향을 미침) 를 갖는 상이한 제형에 대해 최적의 효소가 존재하는 것으로 고찰된다. 광범위한 조건에 적합한 제형 (예를 들어, 물 경도가 상이한 상이한 지리 또는 현장에서 판매되는 세제 제형 중 프로테아제) 의 생산을 위해, 블렌드의 각각의 일원이 상이한 전하 최적값을 보유하는 효소 블렌드의 사용이 고찰된다. 다양한 얼룩의 세척에 적합한 제형의 생산을 위해, 블렌드의 각각의 일원이 상이한 얼룩의 세척에 뛰어난 효소 블렌드의 사용이 또한 고찰된다. 또한, 효소 기질 자체가 효소 반응 동안 전하 변화를 겪는 경우, 블렌드의 각각의 일원이 상이한 전하 최적값을 보유하는 효소 블렌드의 사용이 고찰된다.

본원에서 프로테아제와 혈액, 우유 및 잉크 얼룩과의 관계에서 기술됨에도 불구하고, 본 발명의 프로테아제 변이체는 적용, 예를 들어, 세척 적용에 의해 지시되는 임의의 다양한 반응 매질 (즉, 조건) 내 임의의 효소-기질 상호작용에 대해 최적화된다.

본원에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 변이체 프로테아제는 그들을 특정 적용에 매우 적합하게 만드는 중요한 특징을 갖는다. 예를 들어, 일부 바람직한 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 일부 현재 사용되는 프로테아제에 비해 변경된 전하 및/또는 소수성을 갖는다. 따라서, 이들 프로테아제는 세척 조성물에서 특히 유용하다. 실제로, 특정 세정 조건 하에서, 본 발명의 프로테아제는 현재 사용되는 서브틸리신 프로테아제에 비해 비교적 또는 증강된 발현 및/또는 얼룩 제거 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 세척 및/또는 효소 조성물이 다양한 세척 조성물로 제공될 것으로 고찰된다. 따라서, 본 발명의 프로테아제는 다양한 세척 조성물 뿐만 아니라, 동물 사료 적용, 가죽 가공 (예를 들어, 연화 (bating)), 단백질 가수분해 및 직물 용도에 사용된다. 식별된 프로테아제는 또한 개인 케어 적용에서 사용된다.

실제로, 본 발명의 프로테아제 변이체는 다수의 산업적 적용에서, 특히 세척, 소독, 동물 사료 및 직물/가죽 산업에서 이용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 프로테아제(들)은 세제, 세척강화제, 표백제 및 기타 종래의 성분들과 조합되어 세탁 및 기타 세척 기술에 유용한 다양한 신규한 세척 조성물 예컨대, 예를 들어, 세탁 세제 (분말 및 액체 모두), 세탁 미리담금세제 (pre-soak), 모든 섬유 표백제, 자동 식기세정 세제 (액체 및 분말 모두), 가정용 세척제, 특히 바 및 액체 비누 적용, 및 배수관 뚫는약을 생산한다. 또한, 상기 변이체 프로테아제는 콘텍트 렌즈 뿐만 아니라 다른 품목을 세척 조성물의 수용액과 접촉시킴으로써 세척하는데 이용된다. 또한 이들 변이체 프로테아제는 예를 들어 펩티드 가수분해, 쓰레기 처리, 직물 적용, 의료 기구 세척, 생물막 제거에서 및 단백질 생산시 융합-절단 효소로서 사용될 수 있다. 이들 제품의 조성은 변이체 프로테아제(들)이 사용되는 조건에서 그들의 기능을 유지하는 한 본 발명에 중요하지 않다. 일부 구현예에서, 조성물은 세척 유효량의 프로테아제 변이체 또는 변이체 프로테아제 효소 제제를 포함하는 효소 조성물을 그러한 조성물의 종래의 성분과 당업계에 공지된 양으로 조합함으로써 용이하게 제조된다.

세척 조성물

다르게 언급하지 않는 한, 본원에서 제공된 모든 성분 또는 조성물 수준은 그 성분 또는 조성물의 활성 수준과 관련하여 결정되고, 불순물, 예를 들어, 시판되는 공급원에 존재할 수 있는 잔류 용매 또는 부산물은 제외한다. 효소 성분 중량은 총 활성 단백질에 기초한다. 다르게 나타내지 않는 한 모든 백분율 및 비는 중량으로 계산된다. 다르게 나타내지 않는 한 모든 백분율 및 비는 총 조성물에 기초한다. 예시된 세제 조성물에서, 효소 수준은 총 조성물의 중량에 의한 순수한 효소로 표현되고, 다르게 나타내지 않는 한, 세제 성분은 총 조성물의 중량으로 표현된다.

본원에서 나타나는 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 계면활성제, 세척강화제, 표백제, 표백 활성화제, 표백 촉매, 기타 효소, 효소 안정화 시스템, 킬레이트물질, 형광 증백제, 오염 방출 중합체, 염료 전이제, 분산제, 비누 억제제, 염료, 향수, 착색제, 충전제 염, 굴수성 유발물질, 광활성화제, 형광물질, 섬유 컨디셔너, 가수분해가능 계면활성제, 보존제, 항산화제, 항수축제, 항구김제, 살균제, 살진균제, 색조 얼룩, 실버케어, 항변색제 및/또는 항부식제, 알칼리성 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료 및 pH 조절제 (예를 들어, 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,605,458 호, 5,705,464 호, 5,710,115 호, 5,698,504 호, 5,695,679 호, 5,686,014 호 및 5,646,101 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 보조 물질을 추가로 포함한다. 특이적 세척 조성물 물질의 구현예는 이하에서 상세히 예시된다. 세척 보조 물질이 세척 조성물 중 본 발명의 변이체 프로테아제와 상용성이지 않은 구현예에서, 세척 보조 물질과 프로테아제(들)을 이 두 성분의 조합이 적절할 때까지 분리된 채로 유지하는 (즉, 서로 접촉되지 않음) 적합한 방법이 사용된다. 이러한 분리 방법은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 포함한다 (예를 들어, 젤리캡슐 (gelcap), 캡슐화, 정제, 물리적인 분리 등).

본 발명의 세척 조성물은 예를 들어 세탁 적용, 경질 표면 세척, 식기 세정 적용 뿐만 아니라 의치, 치아, 모발 및 피부와 같은 미용 적용에 유리하게 사용된다. 또한, 더 낮은 온도의 용액에서 효율성이 증가되는 고유한 장점으로 인해, 본 발명의 효소는 세탁 적용에 이상적으로 적합하다. 또한, 본 발명의 효소는 과립 및 액체 조성물 모두에서 사용된다.

본 발명의 변이체 프로테아제는 또한 세탁 첨가제 제품에서 사용된다. 일부 구현예에서, 저온 용액 세탁 적용물이 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 부가적인 표백 효과가 요구되는 세정 과정에 포함시키기에 이상적으로 적합한 본 발명의 하나 이상의 효소를 포함하는 세척 첨가제 제품을 제공한다. 그러한 경우는 저온 용액 세척 적용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 첨가제 제품은, 가장 단순한 형태로, 하나 이상의 프로테아제일 수 있다. 일부 구현예에서, 첨가제는 세척 과정에 추가하기 위한 투여 형태로 포장된다. 일부 구현예에서, 첨가제는 과산소 (peroxygen) 의 공급원이 이용되고 증가된 표백 효과가 요구되는 세척 과정에 추가하기 위한 투여 형태로 포장된다. 알약, 정제, 젤리캡슐, 또는 미리측정된 분말 또는 액체와 같은 다른 단일 투여 단위를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 단일 투여 단위 형태가 본 발명과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물의 부피를 증가시키도록 충전제(들) 또는 담체 물질(들)이 포함된다. 적합한 충전제 또는 담체 물질은 술페이트, 카르보네이트 및 실리케이트의 다양한 염 뿐만 아니라 탈크, 점토 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 액체 조성물에 적합한 충전제 또는 담체 물질은 물 또는 저분자량 1 차 및 2 차 알코올 (폴리올 및 디올을 포함함) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 알코올의 예는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5 % 내지 약 90 % 의 상기 물질을 함유한다. 산성 충전제가 pH 를 감소시키는데 사용된다. 대안적으로는, 일부 구현예에서, 세척 첨가제는 이하에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같은 보조 성분을 포함한다.

본 발명의 세척 조성물 및 세척 첨가제는, 단독의 또는 다른 프로테아제 및/또는 부가적 효소와 조합된, 본원에 제공되는 하나 이상의 프로테아제 변이체의 유효량을 필요로 한다. 효소의 필요 수준은 본 발명의 하나 이상의 프로테아제 변이체의 첨가에 의해 달성된다. 전형적으로는 본 발명의 세척 조성물은 약 0.0001 중량% 이상, 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량%, 또는 심지어 약 0.01 중량% 내지 약 0.1 중량% 의, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함한다.

세척 조성물은 본원에서 전형적으로는, 수성 세척 작업에서 사용하는 동안 세정수의 pH 가 약 5.0 내지 약 11.5, 또는 심지어 약 7.5 내지 약 10.5 가 되도록 제형화된다. 액체 제품 제형은 전형적으로는, 순 pH 가 약 3.0 내지 약 9.0, 또는 심지어 약 3 내지 약 5 가 되도록 제형화된다. 과립 세탁 제품은 전형적으로는, pH 가 약 9 내지 약 11 이 되도록 제형화된다. 권고되는 이용 수준에서 pH 를 조절하는 기술은 완충액, 알칼리, 산 등의 사용을 포함하며, 당업자에게 공지되어 있다.

적합한 저 pH 세척 조성물은 전형적으로는 순 pH 가 약 3 내지 약 5 이고, 전형적으로는 이러한 pH 환경에서 가수분해하는 계면활성제를 함유하지 않는다. 그러한 계면활성제는 하나 이상의 에틸렌 산화물 부분 또는 심지어 약 1 내지 약 16 몰의 에틸렌 산화물을 포함하는 나트륨 알킬 술페이트 계면활성제를 포함한다. 이러한 세척 조성물은 전형적으로는, 수산화나트륨, 모노에탄올아민 또는 염산과 같은 pH 조절제를, 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 세척 조성물을 제공하기에 충분한 양으로 포함한다. 이러한 조성물은 전형적으로는 하나 이상의 산 안정 효소를 포함한다. 일부 구현예에서 조성물은 액체이고, 다른 구현예에서 조성물은 고체이다. 상기 액체 조성물의 pH 는 전형적으로는 순 pH 로서 측정된다. 상기 고체 조성물의 pH 는 용매가 증류수인 상기 조성물의 10 % 고체 용액으로서 측정된다. 이러한 구현예에서, 다르게 나타내지 않는 한 모든 pH 측정은 20 ℃ 에서 수행된다.

일부 구현예에서, 변이체 프로테아제(들)이 과립 조성물 또는 액체로 사용되는 경우, 보관하는 동안 변이체 프로테아제를 과립 조성물의 다른 성분으로부터 보호하도록 변이체 프로테아제가 캡슐화된 입자의 형태인 것이 바람직하다. 또한, 캡슐화는 세척 과정 동안 변이체 프로테아제의 이용성을 제어하는 수단이기도 하다. 일부 구현예에서, 캡슐화는 변이체 프로테아제(들) 및/또는 부가적 효소의 성능을 증강시킨다. 이와 관련하여, 본 발명의 변이체 프로테아제는 당업계에 공지된 임의의 적합한 캡슐화 물질로 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 전형적으로는 본 발명의 변이체 프로테아제(들) 에 대한 촉매의 일부 이상을 캡슐화한다. 전형적으로는, 캡슐화 물질은 수용성 및/또는 수분산성이다. 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 유리 전이 온도 (Tg) 가 0 ℃ 이상이다. 유리 전이 온도는 WO 97/11151 호에 더욱 상세히 기술되어 있다. 캡슐화 물질은 전형적으로는 탄수화물, 천연 또는 합성 고무, 키틴, 키토산, 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체, 실리케이트, 포스페이트, 보레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 파라핀 왁스 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 캡슐화 물질이 탄수화물인 경우, 이는 전형적으로는 단당류, 올리고당류, 다당류 및 이의 조합에서 선택된다. 일부 전형적인 구현예에서, 캡슐화 물질은 전분이다 (예를 들어, EP 0 922 499 호; US 4,977,252 호; US 5,354,559 호 및 US 5,935,826 호 참조). 일부 구현예에서, 캡슐화 물질은 열가소물, 아세토니트릴, 메타크릴로니트릴, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메타크릴로니트릴 및 이의 혼합물과 같은 플라스틱으로부터 제조되는 마이크로스피어이고; 사용되는 시판 마이크로스피어는 EXPANCEL® (Stockviksverken, Sweden), 및 PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL® 및 SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) 에 의해 공급되는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에 기술되는 바와 같이, 본 발명의 변이체 프로테아제는 특히 세탁 및 식기 세제를 포함하나 이에 제한되지 않는 세척 산업에서 사용된다. 이들 적용은 다양한 환경 스트레스 하에서 효소를 배치한다. 본 발명의 변이체 프로테아제는 다양한 조건하에서의 안정성으로 인해, 현재 사용되는 많은 효소보다 유리하다.

실제로, 세정에 관여하는 프로테아제가 노출되는, 다양한 세제 제형, 세정수 부피, 세정수 온도 및 세정 시간을 비롯한 다양한 세정 조건이 존재한다. 또한, 상이한 지리적 영역에서 사용되는 세제 제형은 상이한 농도의 관련 성분이 세정수에 존재한다. 예를 들어, 유럽 세제는 전형적으로는 약 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하고, 일본 세제는 전형적으로는 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다. 북미, 특히 미국에서, 세제는 전형적으로는 약 975 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다.

저 농도 세제 시스템은 약 800 ppm 미만의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제를 포함한다. 일본 세제는 전형적으로는 대략 667 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 저 농도 세제 시스템으로 간주된다.

중간 농도 세제는 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제를 포함한다. 북미 세제는 대략 975 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 일반적으로 중간 농도 세제 시스템으로 간주된다. 브라질 세제는 전형적으로는 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다.

고 농도 세제 시스템은 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세정수에 존재하는 세제를 포함한다. 유럽 세제는 대략 4500-5000 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 일반적으로 고 농도 세제 시스템으로 간주된다.

남미 세제는 일반적으로 고 비누 인산염 세척강화제 세제이며, 남미에서 사용되는 세제의 범위는 1500 내지 6000 ppm 범위의 세제 성분이 세정수에 존재하므로 중간 및 고 농도 세제 모두에 속할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 브라질 세제는 전형적으로는 대략 1500 ppm 의 세제 성분이 세정수에 존재한다. 그러나, 기타 남미 국가에 제한되지 않는 기타 고 비누 인산염 세척강화제 세제 지역은, 약 6000 ppm 이하의 세제 성분이 세정수에 존재하는 고 농도 세제 시스템을 가질 수 있다.

이에 비추어 보아, 세계적으로 전형적인 세정액 중의 세제 조성물의 농도가 약 800 ppm 미만의 세제 조성물 ("저 농도 세제 지역") (예를 들어, 일본에서 약 667 ppm) 에서부터, 약 800 ppm 내지 약 2000 ppm ("중간 농도 세제 지역") (예를 들어, 미국에서 약 975 ppm 그리고 브라질에서 약 1500 ppm), 약 2000 ppm 초과 ("고 농도 세제 지역") (예를 들어, 유럽에서 약 4500 ppm 내지 약 5000 ppm 그리고 고 비누 인산염 세척강화제 지역에서 약 6000 ppm) 까지 다양하다는 것이 명백하다.

전형적인 세정액의 농도는 경험적으로 결정된다. 예를 들어, 미국에서는 전형적인 세탁기가 약 64.4 L 부피의 세정액을 담는다. 따라서, 세정액 중에 약 975 ppm 의 세제 농도를 수득하기 위해 약 62.79 g 의 세제 조성물을 64.4 L 의 세정액에 첨가해야 한다. 이 양은 세제와 함께 제공되는 계량컵을 사용하여 소비자가 세정수로 측정한 전형적인 양이다.

추가 예로서, 상이한 지역은 상이한 세정 온도를 사용한다. 일본에서의 세정수 온도는 전형적으로는 유럽에서 사용되는 온도보다 낮다. 예를 들어, 북미 및 일본에서의 세정수 온도는 전형적으로는 약 10 ℃ 내지 약 30 ℃ (예를 들어, 약 20 ℃) 인 한편, 유럽에서의 세정수 온도는 전형적으로는 약 30 ℃ 내지 약 60 ℃ (예를 들어, 약 40 ℃) 이다. 그러나, 에너지를 절약하기 위해, 많은 소비자들은 냉수 세정을 사용하는 것으로 전환한다. 또한, 일부 다른 지역에서는, 세탁 뿐만 아니라 식기 세정 적용에서 전형적으로 냉수가 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 "냉수 세정" 은 약 10 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 10 ℃ 내지 약 30 ℃, 또는 약 15 ℃ 내지 약 25 ℃ 뿐만 아니라, 약 10 ℃ 내지 약 40 ℃ 범위 내의 모든 기타 조합의 온도에서의 세정을 이용한다. 추가 예로서, 상이한 지역은 전형적으로는 물 경도가 상이하다. 물 경도는 일반적으로 갤론 당 그레인 (grains per gallon) 혼합된 Ca²⁺/Mg²⁺ 으로 기술된다. 경도는 물 중의 칼슘 (Ca²⁺) 및 마그네슘 (Mg²⁺) 의 양의 측정값이다. 미국에서 대부분의 물은 경질이나, 경도의 정도는 다양하다. 중간 경질 (60-120 ppm) 에서 경질 (121-181 ppm) 인 물은 60 내지 181 백만 당 부 (parts per million) (미국 갤론 당 그레인으로 전환된 백만 당 부는 17.1 에 동일한 갤론 당 그레인으로 나눠진 ppm # 이다) 의 경질 광물을 함유한다.

유럽의 물 경도는 전형적으로는 약 10.5 초과 (예를 들어, 약 10.5 내지 약 20.0) 갤론 당 그레인 혼합된 Ca²⁺/Mg²⁺ (예를 들어, 약 15 갤론 당 그레인 혼합된 Ca²⁺/Mg²⁺) 이다. 북미의 물 경도는 전형적으로는 일본의 물 경도보다 높으나, 유럽의 물 경도보다 낮다. 예를 들어, 북미의 물 경도는 약 3 내지 약 10 그레인, 약 3 내지 약 8 그레인 또는 약 6 그레인일 수 있다. 일본의 물 경도는 전형적으로는 북미의 물 경도보다 낮으며, 일반적으로 약 4 미만, 예를 들어 약 3 갤론 당 그레인 혼합된 Ca²⁺/Mg²⁺ 이다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 세정 조건의 하나 이상의 세트 (예를 들어, 물 온도, 물 경도, 및/또는 세제 농도) 에서 놀라운 세정 성능을 나타내는 변이체 프로테아제를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 다른 서브틸리신 프로테아제와 세정 성능이 비슷하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 프로테아제는 현재 시판되는 서브틸리신 프로테아제에 비해 증강된 세정 성능을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 본원에 제공되는 변이체 프로테아제는 증강된 산화 안정성, 증강된 열 안정성, 다양한 조건 하에서의 증강된 세척 능력, 및/또는 증강된 킬레이트제 안정성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는, 단독의 또는 세척강화제 및 안정제와 조합된, 세제를 포함하지 않는 세척 조성물에 사용된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 세척 조성물은 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 수준으로 포함하고, 세척 보조 물질을 포함하는 세척 조성물의 나머지를 예를 들어 조성물의 약 99.999 중량% 내지 약 90.0 중량% 수준으로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세척 조성물은 하나 이상의 변이체 프로테아제를 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 수준으로 포함하고, 세척 보조 물질을 포함하는 세척 조성물의 나머지를 예를 들어 조성물의 약 99.9999 중량% 내지 약 90.0 중량%, 약 99.999 중량% 내지 약 98 중량%, 약 99.995 중량% 내지 약 99.5 중량% 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 세척 성능 및/또는 섬유 케어 및/또는 식기세정 유익을 제공하는 하나 이상의 부가적 세제 효소를 포함한다. 적합한 효소의 예는 헤미셀룰라제, 셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 큐티나제, 펙티나제, 펙테이트 리아제, 만난아제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 종래의 적용가능한 효소 예컨대 프로테아제, 리파제, 큐티나제 및/또는 셀룰라제를 아밀라제와 함께 포함하는 효소의 조합 (즉, "칵테일") 이 사용된다.

본원에서 제공되는 프로테아제 변이체 외에도, 임의의 기타 적합한 프로테아제가 본 발명의 조성물에 사용된다. 적합한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것들을 포함한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, 미생물 프로테아제가 사용된다. 일부 구현예에서, 화학적으로 또는 유전적으로 개질된 돌연변이체가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 바람직하게는 알칼리 미생물 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제이다. 알칼리 프로테아제의 예는 서브틸리신, 특히 바실러스 종 (예를 들어, 서브틸리신, 렌투스, 아밀로리퀘파시엔스, 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168) 으로부터 유래된 것들을 포함한다. 추가의 예는 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936 호 및 6,482,628 호에 기술된 돌연변이체 프로테아제를 포함한다. 추가의 프로테아제의 예는 트립신 (예를 들어, 돼지 또는 소 기원의 것), 및 WO 89/06270 호에 기술된 푸사리움 (Fusarium) 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 사용되는 시판 프로테아제 효소는 MAXATASE®, MAXACAL™, MAXAPEM™, OPTICLEAN®, OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT® PROPERASE®, EXCELLASE^TM, PURAFAST^TM 및 PURAFECT® OXP (Genencor); ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, LIQUANASE®, KANNASE®, NEUTRASE®, RELASE® 및 ESPERASE® (Novozymes); 및 BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Germany) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다양한 프로테아제들이 WO 95/23221 호, WO 92/21760 호, 미국 특허 출원 번호 2008/0090747, 및 미국 특허 번호 5,801,039 호, 5,340,735 호, 5,500,364 호, 5,855,625 호, US RE 34,606 호, 5,955,340 호, 5,700,676 호, 6,312,936 호 및 6,482,628 호, 및 다양한 기타 특허에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, WO 07/044993 호에 기술된 중성 메탈로프로테아제를 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 메탈로프로테아제가 본 발명에 사용된다.

또한, 임의의 적합한 리파제가 본 발명에서 사용된다. 적합한 리파제는 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화학적으로 또는 유전적으로 개질된 돌연변이체가 본 발명에 포함된다. 유용한 리파제의 예는 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa) 리파제 (예를 들어, EP 258 068 호 및 EP 305 216 호 참조), 리조무코르 미에헤이 (Rhizomucor miehei) 리파제 (예를 들어, EP 238 023 호 참조), 칸디다 (Candida) 리파제, 예컨대 C. 안타르크티카 (C. antarctica) 리파제 (예를 들어, C. 안타르크티카 리파제 A 또는 B; 예를 들어, EP 214 761 호 참조), 슈도모나스 (Pseudomonas) 리파제, 예컨대 P. 알칼리제네스 (P. alcaligenes) 및 P. 슈도알칼리제네스 (P. pseudoalcaligenes) 리파제 (예를 들어, EP 218 272 호 참조), P. 세파시아 (P. cepacia) 리파제 (예를 들어, EP 331 376 호 참조), P. 스투트제리 (P. stutzeri) 리파제 (예를 들어, GB 1,372,034 호 참조), P. 플루오레세인 (P. fluoresceins) 리파제, 바실러스 리파제 (예를 들어, B. 서브틸리스 리파제 [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131:253-260 [1993]); B. 스테아로테르모필러스 리파제 [예를 들어, JP 64/744992 호 참조]; 및 B. 푸밀러스 (B. pumilus) 리파제 [예를 들어, WO 91/16422 호 참조]) 를 포함한다.

게다가, 페니실리움 카멤베르티 (Penicillium camembertii) 리파제 (Yamaguchi et al., Gene 103:61-67 [1991] 참조), 제오트리쿰 칸디둠 (Geotricum candidum) 리파제 (Schimada et al., J. Biochem., 106:383-388 [1989] 참조), 및 다양한 리조푸스 (Rhizopus) 리파제, 예컨대 R. 델레마르 (R. delemar) 리파제 (Hass et al., Gene 109:117-113 [1991] 참조), R. 니베우스 (R. niveus) 리파제 (Kugimiya et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:716-719 [1992]) 및 R. 오리자에 (R. oryzae) 리파제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 클로닝된 리파제가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

또한 슈도모나스 멘도시나 (Pseudomonas mendocina) 유래의 큐티나제 (WO 88/09367 호 참조), 및 푸사리움 솔라니피시 (Fusarium solanipisi) 유래의 큐티나제 (WO 90/09446 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 큐티나제와 같은 다른 유형의 지방분해 효소가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다.

추가의 적합한 리파제는 시판 리파제, 예컨대 M1 LIPASE™, LUMA FAST™ 및 LIPOMAX™ (Genencor); LIPOLASE® 및 LIPOLASE® ULTRA (Novozymes); 및 LIPASE P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japan) 를 포함한다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 리파제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 리파제 수준으로, 그리고 세척 보조 물질의 조성물의 나머지를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세척 조성물은 또한 리파제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 리파제 수준으로 포함한다.

본 발명의 일부 구현예에서, 임의의 적합한 아밀라제가 본 발명에 사용된다. 일부 구현예에서, 알칼리 용액에서 사용하기에 적합한 임의의 아밀라제 (예를 들어, 알파 및/또는 베타) 가 또한 사용된다. 적합한 아밀라제는 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화학적으로 또는 유전적으로 개질된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 본 발명에 사용되는 아밀라제는 B. 리체니포르미스로부터 수득된 α-아밀라제 (예를 들어, GB 1,296,839 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용되는 시판 아밀라제는 DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTLRA®, NATALASE® 및 BAN™ (Novozymes) 뿐만 아니라, POWERASE^TM, RAPIDASE® 및 MAXAMYL® P (Genencor) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 아밀라제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 아밀라제 수준으로, 그리고 세척 보조 물질의 조성물의 나머지를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세척 조성물은 또한 아밀라제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 아밀라제 수준으로 포함한다.

일부 추가의 구현예에서, 임의의 적합한 셀룰라제가 본 발명의 세척 조성물에서 사용된다. 적합한 셀룰라제는 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화학적으로 또는 유전적으로 개질된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 적합한 셀룰라제는 휴미콜라 인솔렌 (Humicola insolens) 셀룰라제 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,435,307 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히 적합한 셀룰라제는 색조 케어 유익을 갖는 셀룰라제 (예를 들어, EP 0 495 257 호 참조) 이다. 본 발명에 사용되는 시판 셀룰라제는 CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) 및 KAC-500(B)™ (Kao Corporation) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 셀룰라제는 N-말단 부분이 결실된, 성숙 야생형 또는 변이체 셀룰라제의 일부 또는 조각으로서 포함된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,874,276 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 셀룰라제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 셀룰라제 수준으로, 그리고 세척 보조 물질의 조성물의 나머지를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세척 조성물은 또한 셀룰라제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 셀룰라제 수준으로 포함한다.

세제 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 만난아제가 또한 본 발명에서 사용된다. 적합한 만난아제는 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화학적으로 또는 유전적으로 개질된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 본 발명에서 사용되는 다양한 만난아제가 공지되어 있다 (예를 들어, 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 6,566,114 호, 미국 특허 번호 6,602,842 호 및 미국 특허 번호 6,440,991 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 만난아제를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 만난아제 수준으로, 그리고 세척 보조 물질의 조성물의 나머지를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세척 조성물은 또한 만난아제를, 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 만난아제 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼옥시다제는 본 발명의 조성물에서 과산화수소 또는 그의 공급원 (예를 들어, 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 또는 퍼술페이트) 과 조합되어 사용된다. 일부 대안적인 구현예에서, 옥시다제는 산소와 조합되어 사용된다. 상기 두가지 유형의 효소는 바람직하게는 강화제 (예를 들어, WO 94/12621 호 및 WO 95/01426 호 참조) 와 함께, "용액 표백" (즉, 세정액에서 섬유가 함께 세정될 때, 염색된 섬유로부터 또다른 섬유로 직물 염료가 전이되는 것을 방지하기 위해) 에 사용된다. 적합한 퍼옥시다제/옥시다제는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 화학적으로 또는 유전적으로 개질된 돌연변이체가 일부 구현예에 포함된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 퍼옥시다제 및/또는 옥시다제 효소를 조성물의 약 0.00001 중량% 내지 약 10 중량% 의 부가적인 퍼옥시다제 및/또는 옥시다제 효소 수준으로, 그리고 세척 보조 물질의 조성물의 나머지를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 본 발명의 세척 조성물은 또한 퍼옥시다제 및/또는 옥시다제 효소를 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.001 중량% 내지 약 2 중량%, 약 0.005 중량% 내지 약 0.5 중량% 퍼옥시다제 및/또는 옥시다제 효소 수준으로 포함한다.

일부 구현예에서, 퍼히드롤라제 (예를 들어, WO 05/056782 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 부가적인 효소가 사용된다. 또한, 일부 특히 바람직한 구현예에서, 상기 언급된 효소의 혼합물, 특히 하나 이상의 부가적인 프로테아제, 아밀라제, 리파제, 만난아제, 및/또는 하나 이상의 셀룰라제의 혼합물이 본원에 포함된다. 실제로, 이러한 효소의 다양한 혼합물이 본 발명에 사용될 것으로 고려된다. 또한, 변이체 프로테아제(들) 및 하나 이상의 부가적인 효소의 다양한 수준은 모두 독립적으로 약 10 % 범위일 수 있고, 세척 조성물의 나머지는 세척 보조 물질인 것으로 고찰된다. 세척 보조 물질의 구체적인 선택은 세정될 표면, 품목 또는 섬유, 및 사용 동안 (예를 들어, 세정 세제 사용 동안) 의 세정 조건에 대한 조성물의 원하는 형태를 고려하여 용이하게 이루어질 수 있다.

적합한 세척 보조 물질의 예는 계면활성제, 세척강화제, 표백제, 표백 활성화제, 표백 촉매, 기타 효소, 효소 안정화 시스템, 킬레이트물질, 형광 증백제, 오염 방출 중합체, 염료 전이제, 염료 전이 억제제, 촉매성 물질, 과산화수소, 과산화수소의 공급원, 기성 과산, 중합체성 분산제, 점토 오염 제거제, 구조 탄성화제, 분산제, 비누 억제제, 염료, 향수, 착색제, 충전제 염, 굴수성 유발물질, 광활성화제, 형광물질, 섬유 컨디셔너, 섬유 유연제, 담체, 굴수성 유발물질, 가공 보조제, 용매, 안료, 가수분해가능 계면활성제, 보존제, 항산화제, 항수축제, 항구김제, 살균제, 살진균제, 색조 얼룩, 실버케어, 항변색제 및/또는 항부식제, 알칼리성 공급원, 가용화제, 담체, 가공 보조제, 안료 및 pH 조절제 (예를 들어, 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,605,458 호, 5,705,464 호, 5,710,115 호, 5,698,504 호, 5,695,679 호, 5,686,014 호 및 5,646,101 호 참조) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구체적 세척 조성물 물질의 구현예가 이하에서 상세히 예시된다. 세척 보조 물질이 세척 조성물 중 본 발명의 변이체 프로테아제와 상용성이지 않은 일부 구현예에서, 세척 보조 물질과 프로테아제(들)을 이 두 성분의 조합이 적절할 때까지 분리된 (즉, 서로 접촉되지 않은) 채로 유지하는 적합한 방법이 사용된다. 이러한 분리 방법은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 포함한다 (예를 들어, 젤리캡슐, 캡슐화, 정제, 물리적인 분리, 등).

일부 바람직한 구현예에서, 본원에서 제공되는 유효량의 하나 이상의 변이체 프로테아제(들)이 단백질성 얼룩 제거가 필요한 다양한 표면의 세척에 유용한 조성물에 포함된다. 이러한 세척 조성물은 세척 경질 표면, 섬유 및 식기와 같은 적용을 위한 세척 조성물을 포함한다. 실제로, 일부 구현예에서 본 발명은 섬유 세척 조성물을 제공하나, 다른 구현예에서 본 발명은 비-섬유 세척 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 또한 구강 케어 (치분, 치약, 구강세정제 등 뿐만 아니라 의치 세척 조성물을 포함함), 피부 및 모발 세척 조성물을 비롯한 개인 케어에 적합한 세척 조성물을 제공한다. 본 발명이 임의의 형태 (즉, 액체, 과립, 바, 반고체, 젤, 에멀젼, 정제, 캡슐 등) 의 세제 조성물을 포함하는 것으로 의도된다.

예를 들어, 본 발명의 변이체 프로테아제가 사용되는 여러 세척 조성물이 이하에서 더욱 상세히 기술된다. 본 발명의 세척 조성물이 세탁기 세정법(들) 에서 사용하기에 적합한 조성물로 제형화되는 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는, 하나 이상의 계면활성제 및 하나 이상의 세척강화제 화합물 뿐만 아니라, 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 표백제, 부가적인 효소, 비누 억제제, 분산제, 석회-비누 분산제, 오물 현탁 및 재침착방지제 및 부식 억제제로부터 선택되는 하나 이상의 세척 보조 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 세탁 조성물은 또한 유연제를 (즉, 부가적인 세척 보조 물질로서) 함유한다. 또한 본 발명의 조성물은 고체 또는 액체 형태의 세제 첨가제 제품을 사용한다. 이러한 첨가제 제품은 종래의 세제 조성물의 성능을 보충 및/또는 강화시키려는 것이고, 세척 과정의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서 본원의 세탁 세제 조성물의 밀도는 약 400 내지 약 1200 g/리터의 범위이고, 다른 구현예에서는 약 20 ℃ 에서 측정된 조성물의 약 500 내지 약 950 g/리터 범위이다.

수동 식기세정 방법에 사용하기 위한 조성물로서 제형화된 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제 및, 바람직하게는 유기 중합체 화합물, 비누 증강제, II 족 금속 이온, 용매, 굴수성 유발물질 및 부가적인 효소에서 선택되는 하나 이상의 부가적인 세척 보조 물질을 함유한다.

일부 구현예에서, 미국 특허 번호 6,605,458 호에 제시된 것과 같은 다양한 세척 조성물이 본 발명의 변이체 프로테아제에 사용된다. 따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 압축 과립 섬유 세척 조성물이고, 다른 구현예에서 상기 조성물은 색조 섬유의 세탁에 유용한 과립 섬유 세척 조성물이고, 추가의 구현예에서 상기 조성물은 세정 용량을 통해 연화시키는 과립 섬유 세척 조성물이고, 부가적인 구현예에서 상기 조성물은 강력 액체 섬유 세척 조성물이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호 및 미국 특허 번호 6,376,450 호에 기술된 바와 같은 섬유 세척 조성물이다. 또한, 본 발명의 변이체 프로테아제는 유럽 또는 일본 세정 조건 하에서 특히 유용한 과립 세탁 세제 조성물에 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,610,642 호 참조).

일부 대안적인 구현예에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 경질 표면 세척 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호, 6,376,450 호 및 6,376,450 호에 기술된 바와 같은 경질 표면 세척 조성물이다.

일부 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 식기세정 조성물을 제공한다. 따라서, 일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,610,642 호 및 6,376,450 호에 기술된 바와 같은 경질 표면 세척 조성물이다. 일부 추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에서 제공되는 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 식기세정 조성물을 제공한다. 일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 하나 이상의 변이체 프로테아제를 포함하는 조성물은 미국 특허 번호 6,376,450 호 및 6,376,450 호에 기술된 바와 같은 구강 케어 조성물을 포함한다. 상기 언급된 미국 특허 번호 6,376,450 호, 6,605,458 호, 6,605,458 호 및 6,610,642 호에 포함된 화합물 및 세척 보조 물질의 제형 및 설명은 본원에서 제공되는 변이체 프로테아제에 사용된다.

본 발명의 세척 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택되는 임의의 방법으로 제조되며, 이의 비제한적인 예는 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,565,422 호, 제 5,516,448 호 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기술되어 있다. 저 pH 의 세척 조성물이 필요한 경우, 이러한 조성물의 pH 는 모노에탄올아민과 같은 물질 또는 HCl 과 같은 산성 물질의 첨가를 통해 조정된다.

본 발명의 목적을 위해 필수적이지는 않지만, 이하에서 설명되는 보조제의 비제한적인 목록은 본 세척 조성물에서 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 이러한 보조제는 예를 들어, 세척될 기질의 처리를 위해 세척 성능을 보조 또는 증강시키거나, 향수, 착색제, 염료 등의 경우에서와 같이 세척 조성물의 심미감을 변화시키기 위해 포함된다. 이러한 보조제가 본 발명의 변이체 프로테아제에 추가되는 것으로 이해된다. 이러한 추가적인 성분의 명확한 성질, 및 그의 포함 수준은 조성물의 물리적 형태 및 사용될 세척 작업의 성질에 따라 다를 것이다. 적합한 보조 물질은 계면활성제, 세척강화제, 킬레이트제, 염료 전이 억제제, 침착 보조제, 분산제, 부가적 효소, 및 효소 안정제, 촉매성 물질, 표백 활성화제, 표백 촉진제 (bleach booster), 과산화수소, 과산화수소 공급원, 기성 과산 (preformed peracid), 중합체성 분산제, 점토 오염 제거제/재침착방지제, 증백제, 비누 억제제, 염료, 향수, 구조 탄성화제, 섬유 유연제, 담체, 굴수성 유발물질, 가공 보조제 및/또는 안료를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하기 설명에 부가하여, 이러한 기타 보조제의 적합한 예 및 사용 수준은 참조로 인용되는 미국 특허 번호 5,576,282 호, 제 6,306,812 호 및 제 6,326,348 호에 기술되어 있다. 상기 언급된 보조 성분은 본 발명의 세척 조성물의 나머지를 구성할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 세척 조성물은 하나 이상의 계면활성제 및/또는 계면활성제 시스템을 포함하며, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양쪽성 계면활성제, 쯔비터성 계면활성제, 반극성 비이온성 계면활성제 및 이의 혼합물로부터 선택된다. 일부 저 pH 세척 조성물 구현예에서 (예를 들어, 순 pH 가 약 3 내지 약 5 인 조성물), 조성물은 전형적으로는 알킬 에톡시화 술페이트를 함유하지 않는데, 이는 그러한 계면활성제가 그러한 조성물 산성 내용물에 의해 가수분해될 수 있다고 여겨지기 때문이다. 일부 구현예에서 계면활성제는 세척 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 60 중량% 의 수준으로 존재하고, 대안적 구현예에서 그 수준은 약 1 중량% 내지 약 50 중량% 이고, 추가의 구현예에서 그 수준은 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 하나 이상의 세제 세척강화제 또는 세척강화제 시스템을 포함한다. 하나 이상의 세척강화제를 포함하는 일부 구현예에서, 세척 조성물은 세척 조성물의 약 1 중량% 이상, 약 3 중량% 내지 약 60 중량%, 또는 심지어 약 5 중량% 내지 약 40 중량% 의 세척강화제를 포함한다. 세척강화제는 알칼리 금속, 폴리포스페이트의 암모늄 및 알카놀암모늄 염, 알칼리 금속 실리케이트, 알칼리 토금속 및 알칼리 금속 카르보네이트, 알루미노실리케이트, 폴리카르복실레이트 화합물, 에테르 히드록시폴리카르복실레이트, 말레산 무수물과 에틸렌 또는 비닐 메틸 에테르와의 공중합체, 1,3,5-트리히드록시 벤젠-2,4,6-트리술폰산, 및 카르복시메틸옥시숙신산, 다양한 알칼리 금속, 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 니트릴로트리아세트산과 같은 폴리아세트산의 암모늄 및 치환 암모늄 염 뿐만 아니라, 폴리카르복실레이트 예컨대 멜리트산, 숙신산, 시트르산, 옥시디숙신산, 폴리말레산, 벤젠 1,3,5-트리카르복실산, 카르복시메틸옥시숙신산, 및 이의 가용성 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실제로, 임의의 적합한 세척강화제가 본 발명의 다양한 구현예에 사용될 것으로 고찰된다.

일부 구현예에서, 세척강화제는 수용성 경도 이온 착물 (예를 들어, 봉쇄 (sequestering) 세척강화제), 예컨대 시트레이트 및 폴리포스페이트 (예를 들어, 나트륨 트리폴리포스페이트 및 나트륨 트리폴리포스페이트 헥사히드레이트, 칼륨 트리폴리포스페이트, 및 혼합 나트륨 및 칼륨 트리폴리포스페이트 등) 를 형성한다. 당업계에 공지된 것 (예를 들어, EP 2 100 949 참조) 을 비롯한 임의의 적합한 세척강화제가 본 발명에 사용될 것으로 고찰된다.

일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 하나 이상의 킬레이트제를 함유한다. 적합한 킬레이트제는 구리, 철 및/또는 망간 킬레이트제 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 킬레이트제가 사용되는 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 주제 세척 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량% 또는 심지어 약 3.0 중량% 내지 약 10 중량% 의 킬레이트제를 포함한다.

일부의 추가의 구현예에서, 본원에서 제공되는 세척 조성물은 하나 이상의 침착 보조제를 함유한다. 적합한 침착 보조제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리카르복실레이트, 오염 방출 중합체 예컨대 폴리테레프탈산, 점토 예컨대 카올리나이트, 몬트모릴로나이트, 아타풀가이트, 일라이트, 벤토나이트, 할로이사이트 및 이의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 나타나는 바와 같이, 일부 구현예에서, 재침착방지제는 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 비이온성 계면활성제가 사용된다. 예를 들어, 자동 식기세정 구현예에서, 막 (filming) 및 얼룩 (spotting) 을 없애고 광택을 개선하기 위한 표면 개질 목적을 위해, 특히 시팅 (sheeting) 을 위해 비이온성 계면활성제가 사용된다. 이들 비이온성 계면활성제는 또한 오염의 재침착을 방지하는데 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 재침착방지제는 당업계에 공지된 비이온성 계면활성제이다 (예를 들어, EP 2 100 949 참조).

일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 하나 이상의 염료 전이 억제제를 포함한다. 적합한 중합체성 염료 전이 억제제는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-산화물 중합체, N-비닐피롤리돈 및 N-비닐이미다졸, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸의 공중합체 또는 이의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 염료 전이 억제제가 사용되는 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 약 0.0001 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 심지어 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 의 염료 전이 억제제를 포함한다.

일부 구현예에서, 실리케이트가 본 발명의 조성물에 포함된다. 일부 그러한 구현예에서, 나트륨 실리케이트 (예를 들어, 나트륨 디실리케이트, 나트륨 메타실리케이트, 및 결정성 파일로실리케이트) 가 사용된다. 일부 구현예에서, 실리케이트는 약 1 % 내지 약 20 % 의 수준으로 존재한다. 일부 바람직한 구현예에서, 실리케이트는 조성물의 약 5 중량% 내지 약 15 중량% 의 수준으로 존재한다.

일부의 부가적인 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 또한 분산제를 함유한다. 적합한 수용성 유기 물질은 폴리카르복실산이 2 개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리된 2 개 이상의 카르복실 라디칼을 포함하는, 단일중합체성 또는 공중합체성 산 또는 이의 염을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 추가의 구현예에서, 세척 조성물에서 사용되는 효소는 임의의 적합한 기술로 안정화된다. 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 효소는 칼슘 및/또는 마그네슘 이온을 효소에 제공하는 최종 조성물 중 상기 이온의 수용성 공급원의 존재로 안정화된다. 일부 구현예에서, 효소 안정제는 올리고당, 다당, 및 알칼리 토금속을 포함하는 무기 2가 금속 염, 예컨대 칼슘 염을 포함한다. 효소 안정화를 위한 다양한 기술이 본 발명에 사용될 것으로 고찰된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 효소는 아연 (II), 칼슘 (II) 및/또는 마그네슘 (II) 이온 뿐만 아니라, 다른 금속 이온 (예를 들어, 바륨 (II), 스칸듐 (II), 철 (II), 망간 (II), 알루미늄 (III), 주석 (II), 코발트 (II), 구리 (II), 니켈 (II) 및 옥소바나듐 (IV)) 을 효소에 제공하는 최종 조성물 중 상기 이온의 수용성 공급원의 존재로 안정화된다. 클로리드 및 술페이트가 또한 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 적합한 올리고당 및 다당 (예를 들어, 덱스트린) 의 예가 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, WO 07/145964 참조). 일부 구현예에서, 가역 프로테아제 억제제가 또한 사용되고, 원하는 경우 예컨대 보론-함유 화합물 (예를 들어, 보레이트, 4-포르밀 페닐 보론산) 및/또는 트리펩티드 알데히드가 안정성을 추가로 개선하기 위해 사용된다.

일부 구현예에서, 표백제, 표백 활성화제 및/또는 표백 촉매가 본 발명의 조성물에 존재한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 무기 및/또는 유기 표백 화합물(들)을 포함한다. 무기 표백제는 퍼히드레이트 염 (예를 들어, 퍼보레이트, 퍼카르보네이트, 퍼포스페이트, 퍼술페이트 및 퍼실리케이트 염) 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 무기 퍼히드레이트 염은 알칼리 금속 염이다. 일부 구현예에서 무기 퍼히드레이트 염은 결정성 고체로서 추가의 보호 없이 포함되나, 일부 다른 구현예에서는 염이 코팅된다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 염이 본 발명에 사용된다 (예를 들어, EP 2 100 949 참조).

일부 구현예에서, 표백 활성화제가 본 발명의 조성물에 사용된다. 표백 활성화제는 전형적으로는 온도 60 ℃ 이하의 세척 과정에서 표백 작용을 증강시키는 유기 과산 전구체이다. 본원에서의 사용에 적합한 표백 활성화제는 과가수분해 조건 하에 바람직하게는 탄소수가 약 1 내지 약 10 인, 특히 탄소수가 약 2 내지 약 4 인 지방족 퍼옥시카르복실산, 및/또는 임의로 치환된 퍼벤조산을 생성한다. 부가적 표백 활성화제가 공지되어 있고, 본 발명에 사용된다 (예를 들어, EP 2 100 949 참조).

또한, 일부 구현예에서 그리고 본원에서 추가로 기술된 바와 같이, 본 발명의 세척 조성물은 하나 이상의 표백 촉매를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 망간 트리아자시클로노난 및 관련 착물 뿐만 아니라, 코발트, 구리, 망간 및 철 착물이 사용된다. 부가적 표백 촉매가 본 발명에 사용된다 (예를 들어, US 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, WO 99/06521 및 EP 2 100 949 참조).

일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 하나 이상의 촉매적 금속 착물을 함유한다. 일부 구현예에서, 금속-함유 표백 촉매가 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 금속 표백 촉매는 한정된 표백 촉매 활성의 전이 금속 양이온 (예를 들어, 구리, 철, 티타늄, 루테늄, 텅스텐, 몰리브덴 또는 망간 양이온), 표백 촉매 활성이 없거나 거의 없는 보조 금속 양이온 (예를 들어, 아연 또는 알루미늄 양이온), 및 촉매적 및 보조 금속 양이온에 대해 한정된 안정성 상수를 갖는 격리제를 포함하는 촉매계를 포함하고, 특히 에틸렌디아민테트라아세트산, 에틸렌디아민테트라(메틸렌포스폰산) 및 이의 수용성 염이 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,430,243 호 참조). 일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 망간 화합물에 의해 촉매화된다. 이러한 화합물 및 사용 수준은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,576,282 호 참조). 부가적 구현예에서, 코발트 표백 촉매가 본 발명의 세척 조성물에 사용된다. 다양한 코발트 표백 촉매가 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,597,936 호 및 5,595,967 호 참조), 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다.

부가적 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 마크로폴리시클릭 강성 리간드 (MRL) 의 전이 금속 착물을 포함한다. 제한이 아닌 실시적인 문제로서, 일부 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물 및 세척 방법은 수성 세정 매질 중 약 일억분의 1 이상의 활성 MRL 종류가 제공되도록 조정되고, 일부 바람직한 구현예에서, 세정액 중 약 0.005 ppm 내지 약 25 ppm, 더욱 바람직하게는 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 가장 바람직하게는 약 0.1 ppm 내지 약 5 ppm 의 MRL 이 제공될 것이다.

본 전이-금속 표백 촉매에서의 바람직한 전이-금속은 망간, 철 및 크롬을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 MRL 은 가교된 특정 초-강성 리간드 (예를 들어, 5,12-디에틸-1,5,8,12-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸) 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 전이 금속 MRL 은 공지된 절차에 의해 용이하게 제조된다 (예를 들어 WO 2000/332601 및 미국 특허 번호 6,225,464 호).

일부 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 금속 케어 물질을 포함한다. 금속 케어 물질은 알루미늄, 스테인리스 스틸 및 비-철 금속 (예를 들어, 은 및 구리) 을 비롯한 금속의 변색, 부식 및/또는 산화를 방지 및/또는 감소시키는데 사용된다. 적합한 금속 케어 물질은 EP 2 100 949, WO 9426860 및 WO 94/26859 에 기술된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 금속 케어 물질은 아연 염이다. 일부 추가의 구현예에서, 본 발명의 세척 조성물은 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 의 하나 이상의 금속 케어 물질을 포함한다.

상기 지시된 같이, 본 발명의 세척 조성물은 임의의 적합한 형태로 제형화되고 제형자에 의해 선택된 임의의 방법에 의해 제조되며, 이의 비제한적 예는 모두 본원에 참조로 인용되는 미국 특허 번호 5,879,584 호, 제 5,691,297 호, 제 5,574,005 호, 제 5,569,645 호, 제 5,516,448 호, 제 5,489,392 호 및 제 5,486,303 호에 기술되어 있다. 저 pH 세척 조성물이 바람직한 일부 구현예에서, 그러한 조성물의 pH 는 HCl 과 같은 산성 물질의 첨가에 의해 조성된다.

본원에 기술된 세척 조성물은 위치 (situs) (예를 들어 표면, 식기 또는 섬유) 를 세척하는데 사용된다. 전형적으로는, 위치 중 일부 이상은 세정액 중 희석된 또는 순수 형태인 본 발명의 세척 조성물의 구현예와 접촉된 후, 상기 위치는 임의로 세정되고/거나 헹구어진다. 본 발명의 목적을 위해서, "세정" 은 문질러 닦는 것, 및 기계적 교반을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 세척 조성물은 전형적으로는 용액 중 약 500 ppm 내지 약 15,000 ppm 의 농도로 이용된다. 세정 용매가 물인 경우, 물 온도는 전형적으로는 약 5℃ 내지 약 90 ℃ 의 범위이고, 위치가 섬유를 포함하는 경우, 물 대 섬유 질량비는 전형적으로는 약 1:1 내지 약 30:1 이다.

실험

하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구현예 및 양상을 설명하고 추가로 예시하기 위해 제공되고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 않된다.

하기 실험 설명에서, 하기 약어가 적용된다: ℃ (섭씨 온도); rpm (분 당 회전수); H₂O (물); HCl (염산); aa 및 AA (아미노산); bp (염기쌍); kb (킬로염기쌍); kD (킬로달톤); gm (그램); ㎍ 및 ug (마이크로그램); ㎎ (밀리그램); ng (나노그램); ㎕ 및 ul (마이크로리터); ㎖ (밀리리터); ㎜ (밀리미터); ㎚ (나노미터); μm 및 um (마이크로미터); M (몰); mM (밀리몰); μM 및 uM (마이크로몰); U (단위); V (볼트); MW (분자량); sec (초); min(s) (분(s)); hr(s) (시(s)); MgCl₂ (염화 마그네슘); NaCl (염화 나트륨); OD₂₈₀ (280 nm 에서의 광학 밀도); OD₄₀₅ (405 ㎚ 에서의 광학 밀도); OD₆₀₀ (600 nm 에서의 광학 밀도); PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동); EtOH (에탄올); PBS (포스페이트 완충 식염수 [150 mM NaCl, 10 mM 나트륨 포스페이트 완충액, pH 7.2]); LAS (라우릴 나트륨 술포네이트); SDS (나트륨 도데실 술포네이트); Tris (트리스(히드록시메틸)아미노메탄); TAED (N,N,N'N'-테트라아세틸에틸렌디아민); BES (폴리에스테르술폰); MES (2-모르폴리노에탄술폰산, 모노히드레이트; f.w. 195.24; Sigma # M-3671); CaCl₂ (염화 칼슘, 무수; f.w. 110.99; Sigma # C-4901); SRI (얼룰 제거 지수), BMI (혈액 우유 잉크) 및 BMI PI (혈액 우유 잉크 성능 지수), TCA (트리클로로아세트산) 및 TCA PI (트리클로로아세트산 성능 지수).

또한 물질은 하기 기관 중 일부에서 입수했다:

실시예 1

검정

하기 실시예에서, 판독의 용이성을 위해 하기 제시된 다양한 검정법을 사용했다. 하기 제공되는 프로토콜로부터의 임의의 편차가 표시되어 있다.

A. 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내 단백질 함량 측정을 위한 TCA 검정

FNA (예를 들어, 모체 프로테아제) 및 그의 변이체의 경우, 본 검정은 가습 통기 및 230 rpm 에서 교반하면서 33 ℃ 로 3-4 일 성장시킨 마이크로타이터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 시작했다. 본 검정을 위해 새로운 96 웰 평평 바닥 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 를 사용했다. 먼저, 각 웰에 0.25 N HCl 을 100 ㎕/웰로 넣었다. 그 후, 50 ㎕ 의 여과된 배양 브로스를 첨가했다. 그 후 "블랭크 (blank)" 판독값을 제공하기 위해 405 ㎚ 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기에서 5 초 혼합 방식을 사용함) 를 측정했다. 시험을 위해, 플레이트에 15 % (w/v) 트리클로로아세트산 (TCA) 을 100 ㎕/웰로 넣고, 실온에서 5 내지 30 분 인큐베이션시켰다. 그 후 405 ㎚ 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기에서 5 초 혼합 방식을 사용함) 를 측정했다.

GG36 (예를 들어, 모체 프로테아제) 및 그의 변이체의 경우, 본 검정은 가습 통기 및 300 rpm 에서 교반하면서 37 ℃ 로 대략 3 일 성장시킨 마이크로타이터 플레이트로부터의 여과된 배양 상청액을 사용하여 수행했다. 본 검정에서, 96 웰 평평 바닥 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 의 0.25 M HCl 용액을 첨가했다. 이어서, 여과된 배양 상청액의 25 ㎕ 분취물 (프로테아제를 함유함) 을 웰에 첨가했다. 그 후 "블랭크" 판독값을 제공하기 위해 405 ㎚ 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기에서 5 초 혼합 방식을 사용함) 를 측정했다. 이 측정 후, 각 웰에 100 ㎕ 의 30 % (w/v) TCA 용액을 첨가하고, 마이크로타이터 플레이트를 실온에서 5 내지 15 분 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 405 ㎚ 에서의 광 산란/흡광도 (플레이트 판독기에서 5 초 혼합 방식을 사용함) 를 측정했다.

사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX (type 340; Molecular Devices) MTP Reader 였고; 상기 MTP 제품은 Costar (type 9017) 로부터였다. 사용된 기기는 Biomek FX Robot (Beckman Coulter) 및 SpectraMAX type 340 (Molecular Devices) MTP Reader 였고; 상기 MTP 제품은 type 9017 (Costar) 이었다.

TCA 에 의한 시험 판독값에서 블랭크 (TCA 없음) 를 빼서 계산하여, 샘플 내 단백질 함량의 상대적인 측정값을 제공했다. 원하는 경우, 클론의 AAPF 검정에 의한 TCA 판독값을 공지된 전환 인자로 조정함으로써 표준 곡선을 생성할 수 있다. 그러나, TCA 결과는 1 ㎖ 당 50 내지 500 마이크로그램의 단백질 농도 (ppm) 에 대해 선형이므로, 양호한 성능 변이체를 선택하기 위해 효소 성능에 대해 직접적으로 그릴 수 있다. 샘플 내 탁도/광 산란 증가는 배양 상청액 중 침전가능한 단백질의 총량과 상관관계에 있다.

B. 세척 성능 검정

마이크로견본에서 참조 세린 프로테아제 및 그의 변이체의 얼룩 제거 성능을 시판되는 TIDE® 2× Cold 세제 중 마이크로타이터 플레이트 (MTP) 스케일로 측정했다. 프로테아제 활성의 결여가 확인된 열 불활성화된 TIDE® 2× Cold (기성품 세제) 를 검정에 사용했다. 시판 세제 포뮬라의 열 불활성화는 비효소 성분의 특성을 유지하면서 임의의 단백질 성분의 효소 활성을 파괴하는 역할을 한다. 따라서 이 방법은 본 발명의 효소 변이체를 시험하는데 사용하기 위해 시판 세제를 제조하기에 적합했다. 사용한 시료는 하기와 같았다: 5 mM HEPES, pH 8.0 또는 5 mM MOPS, pH 7 완충액, 중간 물 경도: (CaCl₂: MgCl₂·6H₂O) 의 경우 3:1 Ca:Mg; 6 갤론 당 그레인 (gpg) 으로 희석된 15000 gpg 저장액. CFT 에 의해 가공된 EMPA-116 BMI (혈액/우유/잉크) 면 견본을 1 웰 당 2 개를 사용했다. 마이크로견본을 탈이온수에서 20 분 동안 주위 온도에서 전-세정했다. 전-세정 단계 후, 견본을 종이 타월 위에 놓아 건조시켰다. 그 후, 공기-건조된 견본을 압박방출 압착기 (expulsion press) 에서 ¼" 환형 다이를 사용하여 펀칭했다. 마지막으로 2 개의 마이크로견본을 96 웰 MTP 의 각각의 웰 내에 수직으로 놓아 전체 표면 영역을 노출시켰다 (즉 웰의 바닥에 평평하지 않음). 작업 세제 용액이 하기 표 1-1 에 나타나 있다.

인큐베이터를 16 ℃ 로 설정했다. ~10 ppm 효소의 모 희석 플레이트로부터의 10 ㎕ 샘플을 상기 열거된 190 ㎕ 작업 세제 용액과 함께 BMI 2-견본 플레이트에 첨가했다. 검정 플레이트 내 변이체의 최종 농도가 0.5 ppm 이 되도록 부피를 조정했다. 플레이트를 iEMS 인큐베이터/진탕기 (Thermo/Labsystems) 로 즉시 옮기고; 30 분 동안 제시된 온도에서 1400 rpm 으로 진탕하면서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 100 ㎕ 의 상청액을 새로운 96 웰 플레이트 (Costar type 9017, 인큐베이션 후 반응 플레이트를 판독하는데 사용함) 로 옮기고, SpectraMAX MTP Reader (type 340; Molecular Devices) 로 405 ㎚ 및/또는 600 ㎚ 에서 흡광도를 측정했다. 프로테아제 샘플을 첨가하지 않은 세제 및 2 개의 마이크로견본을 함유하는 대조용 웰을 또한 시험에 포함시켰다. 405 ㎚ 에서의 측정은 더 높은 값을 제공하고, 안료 제거를 추적하는 한편, 600 nm 에서의 측정은 탁도 및 세척을 추적했다. 이 분석에서, 프로테아제는 기질을 가수분해하고, 안료 및 불용성 입자를 기질로부터 해방시킨다. 따라서 탁도의 비는 효소 활성의 척도이다.

얼룩 제거 활성의 계산

수득된 흡광도 값을 블랭크 값 (효소 없는 기질) 에 대해 보정하여, 가수분해 활성의 측정값을 제공했다. 각각의 샘플 (변이체) 에 대해 성능 지수를 계산했다. 성능 지수로 동일한 단백질 농도에서 변이체 (실제 값) 및 표준 효소 (이론 값) 의 성능을 비교했다. 또한, 이론 값은 표준 효소의 랑뮈르 방정식의 매개변수를 사용하여 계산할 수 있다.

성능 지수

성능 지수로 동일한 단백질 농도에서 변이체 (실제 값) 및 모체 프로테아제 (이론 값) 의 성능을 비교했다. 또한, 이론 값은 표준 프로테아제의 결합 곡선 (즉, 랑뮈르 방정식) 의 매개변수를 사용하여 계산할 수 있다. 하나 이상의 특성에 대해 성능 지수 (PI) 는 값이 0.5 를 초과하는 경우는, 하나 이상의 돌연변이와 조합되어 PI 값이 0.5 초과로 측정된 관심이 특성 이외의 또는 이에 더하여 관심의 하나 이상의 특성에 대해 적절한 성능 지수를 갖는 단백질을 생성할 수 있는, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체를 식별시킨다.

실시예 2

바실러스 서브틸리스 GG36 서브틸리신 변이체

본 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 GG36 (본원에서 바실러스 렌투스 서브틸리신으로도 불림) 을 제조하기 위해 수행한 실험이 기술되어 있다. 형질전환을 당업계에 공지된 바와 같이 수행했다 (예를 들어, WO 02/14490 참조).

바실러스 서브틸리스에서 GG36 프로테아제의 생산

발현 플라스미드 pAC-GG36ci 를 공통 aprE 프로모터 및 BPN' 전사 종결자의 통제 하에서 aprE 신호 서열의 8 번째 코돈에서 융합된 GG36 코돈-개선된 유전자를 사용하여 조립했다. 하기에 제시된 서열 (SEQ ID NO:2) 에서, 굵은 이태리체는 공통 aprE 프로모터를 표시하고, 일반 글씨체는 신호 서열을 표시하고, 밑줄친 글씨체는 프로 서열을 표시하고, 굵은 글씨체는 GG36 성숙 프로테아제를 인코딩하는 DNA 를 표시하고, 밑줄친 이태리체는 BPN' 종결자를 표시한다. GG36 성숙 영역을 인코딩하는 DNA 서열 (SEQ ID NO:4) 의 측면에 클로닝을 위한 KpnI 및 XhoI 제한 자리가 있다 (도 4 참조).

도 4 에 제시된 플라스미드 pAC-GG36ci 를 B. 서브틸리스에서 GG36 프로테아제의 발현에 사용했다. 플라스미드 요소는 하기와 같다: pUB110 = 플라스미드 pUB110 으로부터의 DNA 조각 [McKenzie T., Hoshino T., Tanaka T., Sueoka N. (1986) The Nucleotide Sequence of pUB110: Some Salient Features in Relation to Replication and Its Regulation. Plasmid 15:93-103], pBR322 = 플라스미드 pBR322 로부터의 DNA 조각 [Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113], pC194 = 플라스미드 pC194 로부터의 DNA 조각 [Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol 150:815-825].

플라스미드 특징은 하기와 같다: B. 서브틸리스에 대한 Ori = pUB110 으로부터의 복제 기점, CAT = pC194 로부터의 클로람페니콜 내성 유전자, pMB1 기점 = pBR322 로부터의 복제 기점, bla = pBR322 로부터의 베타-락타마제, 짧은 aprE 프로모터 = 공통 전사 프로모터, 신호 펩티드 (Signal Peptide) = 신호 펩티드, 프로 펩티드 = GG36 프로 영역, GG36ci 성숙 펩티드 = 성숙 GG36 (본 연구에서 발현된 각각의 변이체에 대한 코딩 영역으로 대체됨), BPN' 종결자 = 서브틸리신 BPN' 로부터의 전사 종결자.

GG36 전구체 단백질의 아미노산 서열이 하기 제시되어 있다 (SEQ ID NO:3). 이 서열에서, 굵은 글씨체는 SEQ ID NO:4 로도 제시되는 성숙 GG36 프로테아제 (야생형) 를 표시한다:

바실러스 렌투스 서브틸리신 (= GG36 ) 조합 전하/소수성 라이브러리 ( CCHL ) 의 디자인 및 생성

바실러스 렌투스 서브틸리신 조합 전하/소수성 라이브러리 (CCHL) 를 7 개의 잘 분배된, 표면 노출된 아미노산을 식별함으로써 디자인했다. 이들 잔기는 S24, R45, S101, Q109, G118, T213 및 L217 이다. 치환 위치의 번호는 BPN' 서브틸리신 내 열거된 위치에 상응한다 (BPN' 넘버링; 도 1). 33-일원 조합 소수성 라이브러리 (GH2-GH33) 를 표 2-1 에 제시된 바화 같이 각각의 자리에서 하기 4 가지 가능성의 조합을 만들어서 생성했다: 야생형, 글루타민 (Q), 글루탐산 (E), 류신 (L) 및 아르기닌 (R).

코돈-개선된 GG36 유전자를 함유하는 pAC-GG36ci 플라스미드를 CHL 의 생성을 위해 DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) 에 보냈다. GG36 변이체 서브틸리신을 인코딩하는 DNA 의 형질전환을 위해 바실러스 서브틸리스 균주 (유전자형: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 를 숙주 균주로서 제공했다. 변이체를 96 웰 플레이트 내 글리세롤 저장액으로서 공급했다.

표 2-1 은 변이체를 생성하기 위해 GG36 에 생성된 치환을 나타낸다. 표 2-1 은 또한 변이체 GG36 과 야생형 사이의 순 전하 및 소수성 차이를 제공한다.

프로테아제 변이체의 발현

GG36 또는 FNA 발현 벡터를 함유하는 바실러스 서브틸리스 클론을 글리세롤 저장액으로부터 200 ㎕ 의 LB 배지 + 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 96 웰 배양 플레이트 (BD, 353075) 로 습윤 공간에서 37 ℃, 220 rpm 에서 밤새 성장시켜 스틸 96 웰 레플리케이터로 복제했다. 밤샘 배양물로부터 200 ㎕ 분취물을 사용하여 5 ㎖ 플라스틱 진탕 튜브 내 2000 ㎕ 규정 배지 + 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 접종했다. 배양 배지는 주 질소 공급원으로서 우레아, 주 탄소 공급원으로서 글루코오스가 함유되고, 로부스트 세포 성장을 위해 1 % 소이톤이 보충된 MOPs 완충액 기반의 풍부 반-규정 배지였다. 진탕 튜브를 37 ℃, 220 rpm 에서, 60 시간 동안 인큐베이션시켰다. 60 시간 후, 원심분리기에서 8000 × RCF 초과에서 상청액을 스핀단운했다. 저장을 위해 용액을 15 ㎖ 폴리프로필렌 원뿔 튜브에 따라부었다. 추가 정제 또는 농축은 수행하지 않았다. 상청액 저장액을 장기간 안정성을 위해 40 % 프로필렌 글리콜 최종 농도로 제형화하고, 4 ℃ 에서 저장했다.

실시예 3

바실러스 서브틸리스 FNA 서브틸리신 변이체

B. 서브틸리스에서 FNA 프로테아제의 생산

이 실시예에서는, B. 서브틸리스에서 FNA (본원에서 또한 바실러스 서브틸리스 서브틸리신 BPN'-Y217L (=FNA) 로도 언급됨) 를 생산하기 위해 수행한 실험을 기술한다. 형질전환을 당업계에 공지된 바와 같이 수행했다 (예를 들어, WO 02/14490 참조).

발현 플라스미드 pAC-FNAre 를 공통 aprE 프로모터 및 BPN' 전사 종결자의 통제 하에서 aprE 신호 서열의 8 번째 코돈에서 융합된 FNA 유전자를 사용하여 조립했다. 하기에 제시된 서열 (SEQ ID NO:5) 에서, 굵은 이태리체는 공통 aprE 프로모터를 표시하고, 일반 글씨체는 신호 서열을 표시하고, 밑줄친 글씨체는 프로 서열을 표시하고, 굵은 글씨체는 FNA 성숙 프로테아제를 인코딩하는 DNA 를 표시하고, 밑줄친 이태리체는 BPN' 종결자를 표시한다. FNA 성숙 영역은 클로닝을 위한 KpnI 및 XhoI 제한 자리를 함유한다 (도 5 참조).

도 5 에 제시된 플라스미드 pAC-FNAre 를 B. 서브틸리스에서 FNA 프로테아제의 발현에 사용했다. 플라스미드 요소는 하기와 같다: pUB110 = 플라스미드 pUB110 으로부터의 DNA 조각 [McKenzie T., Hoshino T., Tanaka T., Sueoka N. (1986) The Nucleotide Sequence of pUB110: Some Salient Features in Relation to Replication and Its Regulation. Plasmid 15:93-103], pBR322 = 플라스미드 pBR322 로부터의 DNA 조각 [Bolivar F, Rodriguez RL, Greene PJ, Betlach MC, Heyneker HL, Boyer HW. (1977) Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. Gene 2:95-113], pC194 = 플라스미드 pC194 로부터의 DNA 조각 [Horinouchi S., Weisblum B. (1982) Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance. J. Bacteriol 150:815-825].

플라스미드 특징은 하기와 같다: B. 서브틸리스에 대한 Ori = pUB110 으로부터의 복제 기점, CAT = pC194 로부터의 클로람페니콜 내성 유전자, pMB1 기점 = pBR322 로부터의 복제 기점, bla = pBR322 로부터의 베타-락타마제, 짧은 aprE 프로모터 = 공통 전사 프로모터, 신호 펩티드 (Signal Peptide) = 신호 펩티드 [구체화], 프로 펩티드 = FNA 프로 영역, FNA 성숙 펩티드 = 성숙 FNA (본 연구에서 발현된 각각의 변이체에 대한 코딩 영역으로 대체됨), BPN' 종결자 = 서브틸리신 BPN' 로부터의 전사 종결자.

FNA 전구체 단백질의 아미노산 서열이 하기 제시되어 있다 (SEQ ID NO:6). 이 서열에서, 굵은 글씨체는 SEQ ID NO:7 로도 제시되는 성숙 FNA 프로테아제 (야생형) 를 표시한다.

서브틸리신 BPN'-Y217L (=FNA) 조합 전하/소수성 라이브러리 (CHL) 의 디자인 및 생성

서브틸리신 BPN'-Y217L 조합 전하 소수성 라이브러리를 7 개의 잘 분배된, 표면 노출된 아미노산을 식별함으로써 디자인했다. 이들 잔기는 S24, A45, S101, N109, N118, K213 및 L217 이다. 32-일원 조합 소수성 라이브러리 (FH2-FH33) 를 표 3-1 에 제시된 바와 같이 각각의 자리에서 하기 4 가지 가능성의 조합을 만들어서 생성했다: 야생형, 글루타민 (Q), 글루탐산 (E), 류신 (L) 및 아르기닌 (R).

FNA 유전자를 함유하는 pAC-FNAre 플라스미드를 조합 소수성 라이브러리의 생성을 위해 DNA 2.0 Inc. (Menlo Park, CA) 에 보냈다. FNA 변이체 치환을 인코딩하는 DNA 의 형질전환을 위해 바실러스 서브틸리스 균주 (유전자형: ΔaprE, ΔnprE, ΔspoIIE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) 를 제공했다. 변이체를 96 웰 플레이트 내 글리세롤 저장액으로서 공급했다.

표 3-1 은 변이체를 생성하기 위해 FNA 에 생성된 치환을 나타낸다. 표 3-1 은 또한 변이체 FNA 와 야생형 사이의 순 전하 및 소수성 차이를 제공한다.

프로테아제 변이체의 발현

GG36 또는 FNA 발현 벡터를 함유하는 바실러스 서브틸리스 클론을 글리세롤 저장액으로부터 200 ㎕ 의 LB 배지 + 25 ㎍/ml 클로람페니콜을 함유하는 96 웰 배양 플레이트 (Becton Dickinson, 353075) 로 습윤 공간에서 37 ℃, 220 rpm 에서 밤새 성장시켜 스틸 96 웰 레플리케이터로 복제했다. 밤샘 배양물로부터의 200 ㎕ 분취물을 사용하여 5 ㎖ 플라스틱 진탕 튜브 내 2000 ㎕ 규정 배지 + 25 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 접종했다. 배양 배지는 주 질소 공급원으로서 우레아, 주 탄소 공급원으로서 글루코오스가 함유되고, 로부스트 세포 성장을 위해 1 % 소이톤이 보충된 MOPs 완충액 기반의 풍부 반-규정 배지였다. 진탕 튜브를 37 ℃, 220 rpm 에서, 60 시간 동안 인큐베이션시켰다. 60 시간 후, 원심분리기 내에서 8000 × RCF 초과에서 상청액을 스핀다운했다. 저장을 위해 용액을 15 ㎖ 폴리프로필렌 원뿔 튜브에 따라부었다. 추가 정제 또는 농축은 수행하지 않았다. 상청액 저장액을 장기간 안정성을 위해 40 % 프로필렌 글리콜 최종 농도로 제형화하고, 4 ℃ 에서 저장했다.

실시예 4

얼룩 제거 및 상대적 발현의 평가

이 실시예는 BMI 마이크로견본 분석에서 GG36 및 FNA 조합 소수성 라이브러리 변이체의 시험을 기술한다. 실시예 1 에 제시된 방법을 사용했다. 결과가 표 4-1 (GG36) 에 나타나 있고, 표 4-2 (FNA) 는 성능 지수이고 여기서 상대적 단백질 발현 (TCA PI) 및 얼룩 제거 활성 (BMI PI) 에 대해 변이체의 성능이 각각의 모체와 비교되었다. 성능 지수가 0.5 초과 (PI >0.5) 인 변이체는 개선된 성능을 갖는다. 0.05 이하의 성능 지수는 0.05 로 설정했고 굵은 이태리체로 표시되어 있다. ND 는 측정되지 않았음을 표시한다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 발행물은 본 발명이 속하는 당업자의 수준을 나타낸다. 당업자는 본 발명이 목적을 실행하고, 언급된 목표 및 장점뿐만 아니라 그안에 내재된 것을 수득하기 위해 잘 조정된다는 것을 용이하게 이해한다. 본원에 기술된 조성물 및 방법은 바람직한 구현예를 나타내고, 예시적이며, 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다. 본 발명의 범주 및 취지에서 벗어남 없이 본원에 기술된 본 발명에 다양한 치환 및 변형이 만들어질 수 있음이 당업자에게 명백하다.

본원에 설명으로 기술된 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이도 적합하게 실시될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명을 위해 사용되며, 이러한 용어 및 표현을 사용하면서 제시되고 기술된 특징 또는 그의 일부의 임의의 동등물을 제외하려는 의도는 없으나, 청구된 본 발명의 범주 내에서 다양한 변형이 가능하다고 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 재분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변화는 본원에 의해 규정된 본 발명의 범주 내로 여겨지는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되어 있다. 속명 개시 내에 포함되는 더 좁은 종명 및 하부 속명 그룹 각각이 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 배제된 물질이 본원에 구체적으로 언급되었는지의 여부와 관계없이 속명으로부터 임의의 대상을 제외하는 조건 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 속명 기술을 포함한다.

SEQUENCE LISTING <110> DANISCO US INC ESTELL, David A. CASCAO-PEREIRA, Luis G. KELLIS, James T. <120> PROTEASES COMPRISING ONE OR MORE COMBINABLE MUTATIONS <130> 31065WO-B <140> PCT/US09/63837 <141> 2009-11-10 <150> US 61/113,545 <151> 2008-11-11 <150> US 61/218,802 <151> 2009-06-19 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> B. amyloliquefaciens <400> 1 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val 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aaatatttaa ttggctttaa tgagcaggaa 240 gctgtcagtg agtttgtaga acaagttgag gcaaatgacg aggtagccat tctctctgag 300 gaagaggaag tcgaaattga attgcttcat gaatttgaaa cgattcctgt tctgtccgtt 360 gagttaagcc cagaagatgt ggacgcgtta gagctcgatc cagctatttc ttatattgaa 420 gaggatgcag aagtaactac aatggcgcaa tcggtaccat ggggaattag cagagtacaa 480 gccccagctg cacataaccg tggattgaca ggttctggtg taaaagttgc tgtccttgat 540 accggtattt ccactcatcc agacttaaat attcgtggtg gagctagctt tgtaccaggg 600 gaaccatcca ctcaagatgg caatggacat ggcactcatg ttgccggcac aatcgcggct 660 cttaacaatt caattggtgt tcttggcgta gcgccaagcg cagaactata cgctgttaaa 720 gtattaggag caagcggttc aggctctgtc agctctattg cccaaggatt ggaatgggca 780 gggaacaatg gcatgcacgt tgctaatctt agtttaggat ctccttcgcc aagtgccaca 840 cttgagcaag ctgttaatag cgcgacttct agaggcgttc ttgttgtagc ggcctctgga 900 aattcaggtg caggctcaat cagctatccg gcccgttatg cgaacgctat ggcagtcgga 960 gctactgacc aaaacaacaa ccgcgccagc ttttcacagt atggcgcagg gcttgacatt 1020 gtcgcaccag gtgtaaacgt gcagagcact tacccaggtt caacatatgc cagcttaaac 1080 ggtacatcaa tggctactcc tcatgttgca ggtgcggctg cacttgttaa acaaaagaac 1140 ccatcttggt ccaatgtaca aatccgcaat catcttaaga atacggcaac tagcttagga 1200 agcacaaact tgtatggaag cggacttgtc aatgcagaag ctgcaactcg ttaaaagctt 1260 aactcgagat aaaaaaccgg ccttggcccc gccggttttt tat 1303 <210> 3 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized GG36 precursor protein <400> 3 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe 35 40 45 Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu 50 55 60 Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val 65 70 75 80 Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp 85 90 95 Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala 100 105 110 Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His 115 120 125 Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr 130 135 140 Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe 145 150 155 160 Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His 165 170 175 Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly 180 185 190 Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser 195 200 205 Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly 210 215 220 Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro 225 230 235 240 Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val 245 250 255 Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr 260 265 270 Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn 275 280 285 Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val 290 295 300 Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala 305 310 315 320 Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala 325 330 335 Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg 340 345 350 Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr 355 360 365 Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 370 375 380 <210> 4 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Chemically synthesized mature GG36 protease <400> 4 Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala 1 5 10 15 His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser 35 40 45 Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr 50 55 60 His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu 65 70 75 80 Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala 100 105 110 Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser 115 120 125 Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly 130 135 140 Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln 165 170 175 Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile 180 185 190 Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr 195 200 205 Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile 225 230 235 240 Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu 245 250 255 Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg 260 265 <210> 5 <211> 1309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized oligonucleotide used in FNA protease production <400> 5 gaattcatct caaaaaaatg ggtctactaa aatattattc catctattat aataaattca 60 cagaatagtc ttttaagtaa gtctactctg aattttttta aaaggagagg gtaaagagtg 120 agaagcaaaa aattgtggat cagtttgctg tttgctttag cgttaatctt tacgatggcg 180 ttcggcagca catccagcgc gcaggctgca gggaaatcaa acggggaaaa gaaatatatt 240 gtcgggttta aacagacaat gagcacgatg agcgccgcta agaagaaaga cgtcatttct 300 gaaaaaggcg ggaaagtgca aaagcaattc aaatatgtag acgcagctag cgctacatta 360 aacgaaaaag ctgtaaaaga attgaaaaaa gacccgagcg tcgcttacgt tgaagaagat 420 cacgtagcac acgcgtacgc gcagtccgtg ccatatggcg tatcacaaat taaagcccct 480 gctctgcact ctcaaggcta caccggttca aatgttaaag tagcggttat cgacagcggt 540 atcgattctt ctcatccaga tcttaaagta gcaggcggag ccagcatggt tccttctgaa 600 acaaatcctt tccaagacaa caactctcac ggaacacacg ttgctggtac cgttgcggct 660 cttaataact caatcggtgt attaggcgtt gcgccaagcg catcacttta cgctgtaaaa 720 gttctcggcg ccgacggttc cggccaatac agctggatca ttaacggaat cgagtgggcg 780 atcgcaaaca atatggacgt tattaacatg agcctcggcg gaccgtccgg ttctgctgct 840 ttaaaagcgg cagttgataa agccgttgca tccggcgtcg tagtcgttgc ggcagccggc 900 aacgaaggca cttccggcag ctcaagcaca gtgggctacc ctggtaaata cccttctgtc 960 attgcagtag gcgctgtcga cagcagcaac caaagagcat ctttctcaag cgtaggacct 1020 gagctcgatg tcatggcacc tggcgtatct atccaaagca cgcttcctgg aaacaaatac 1080 ggcgcgttga acggtacatc aatggcatct ccgcacgttg ccggagccgc ggctttgatt 1140 ctttctaagc acccgaactg gacaaacact caagtccgca gctctctaga aaacaccact 1200 acaaaacttg gtgattcttt ctactatgga aaagggctga tcaatgtaca ggcggcagct 1260 cagtaaaact cgagataaaa aaccggcctt ggccccgccg gttttttat 1309 <210> 6 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized FNA precursor protein <400> 6 Met Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Ala Leu 1 5 10 15 Ile Phe Thr Met Ala Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ala Gln Ala Ala Gly 20 25 30 Lys Ser Asn Gly Glu Lys Lys Tyr Ile Val Gly Phe Lys Gln Thr Met 35 40 45 Ser Thr Met Ser Ala Ala Lys Lys Lys Asp Val Ile Ser Glu Lys Gly 50 55 60 Gly Lys Val Gln Lys Gln Phe Lys Tyr Val Asp Ala Ala Ser Ala Thr 65 70 75 80 Leu Asn Glu Lys Ala Val Lys Glu Leu Lys Lys Asp Pro Ser Val Ala 85 90 95 Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Tyr Ala Gln Ser Val Pro 100 105 110 Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu His Ser Gln Gly Tyr 115 120 125 Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp Ser Gly Ile Asp Ser 130 135 140 Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser 145 150 155 160 Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala 165 170 175 Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala 180 185 190 Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser 195 200 205 Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn 210 215 220 Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala 225 230 235 240 Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val 245 250 255 Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val 260 265 270 Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp 275 280 285 Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu Leu Asp 290 295 300 Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr Leu Pro Gly Asn Lys 305 310 315 320 Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly 325 330 335 Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Trp Thr Asn Thr Gln 340 345 350 Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gly Asp Ser Phe 355 360 365 Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala Ala Ala Gln 370 375 380 <210> 7 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized mature FNA protease <400> 7 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide motif <400> 8 His Gly Thr His 1 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide motif <220> <221> site <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Gly Thr Ser Met Ala Xaa Pro 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide motif <400> 10 His Gly Thr Arg 1 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide motif <220> <221> site <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ala or Val <220> <221> site <222> (5)..(5) <223> Xaa is Ala or Ser <400> 11 Gly Thr Ser Xaa Xaa Pro 1 5

Claims (19)

1. 단백질분해 활성을 갖고, 위치 24, 45, 101, 109, 118, 213 및 217 에서 선택되는 2 이상의 위치에서의 치환을 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신의 성숙 형태인 단리된 서브틸리신 변이체.
2. 제 1 항에 있어서, 상대적 단백질 발현 수준 성능 지수 (TCA PI) 및/또는 얼룩 제거 활성 성능 지수 (BMI PI) 가 0.5 이상인 단리된 서브틸리신 변이체.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바실러스 서브틸리신이 GG36 이고, 2 이상의 위치에서의 치환이 하기:
   

   

   
   에서 선택되며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 단리된 서브틸리신 변이체.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바실러스 서브틸리신이 FNA 이고, 2 이상의 위치에서의 치환이 하기:
   

   

   
   에서 선택되며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 단리된 서브틸리신 변이체.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 바실러스 서브틸리신이 GG36 이고, 2 이상의 위치에서의 치환이 하기:
   

   

   
   에서 선택되며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 단리된 서브틸리신 변이체.
6. 단백질분해 활성을 갖고, 치환 T213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하는, 바실러스 서브틸리신 GG36 의 성숙 형태인 단리된 서브틸리신 변이체.
7. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 이상의 위치에서의 치환이 하기:
   

   

   
   에서 선택되며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 의 BPN' 서브틸리신의 위치에 상응하는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 단리된 서브틸리신 변이체.
8. 단백질분해 활성을 갖고, 치환 K213Q 를 포함하며, 상기 위치는 SEQ ID NO:1 로 제시되는 B. 아밀로리퀘파시엔스 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열에 상응하여 넘버링되는, 바실러스 서브틸리신 FNA 의 성숙 형태인 단리된 서브틸리신 변이체.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 서브틸리신 변이체를 인코딩하는 단리된 핵산.
10. 제 9 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
11. 제 10 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서브틸리신 변이체를 포함하는 세척 조성물.
13. 제 12 항에 있어서, 세제인 세척 조성물.
14. 제 13 항에 있어서, 세제가 강력 액체 또는 건조 세탁 세제인 세척 조성물.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 세제가 식기 세제인 세척 조성물.
16. 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤미셀룰라제, 셀룰라제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 자일라나제, 리파제, 포스포리파제, 에스테라제, 퍼히드롤라제, 큐티나제, 펙티나제, 펙테이트 리아제, 만난아제, 케라티나제, 리덕타제, 옥시다제, 페놀옥시다제, 리폭시게나제, 리그니나제, 풀루라나제, 탄나제, 펜토사나제, 말라나제, ß-글루카나제, 아라비노시다제, 히알루로니다제, 콘드로이티나제, 락카제 및 아밀라제, 또는 그의 혼합물에서 선택되는 하나 이상의 부가적 효소 또는 효소 유도체를 추가로 포함하는 세척 조성물.
17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 안정제를 추가로 포함하는 세척 조성물.
18. 0.0001 중량 퍼센트 이상의 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 서브틸리신 변이체, 및 임의로, 하나 이상의 적합한 보조 성분을 포함하는 세척 조성물.
19. 하기 단계를 포함하는 세척 방법:
    a) 섬유를 포함하는 물품 및/또는 표면을 제 11 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 세척 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 표면 또는 물품을 임의로 세정하고/거나 헹구는 단계.
    
    
    

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