KR20020021396A

KR20020021396A - 입체적으로 보호된 에피토프 영역을 갖는 프로테아제콘쥬게이트

Info

Publication number: KR20020021396A
Application number: KR1020027000933A
Authority: KR
Inventors: 러빈돈넬톤; 웨이스거버데이비드존; 코레아폴엘리오트
Original assignee: 데이비드 엠 모이어; 더 프록터 앤드 갬블 캄파니
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2002-03-20
Also published as: CN1372593A; AU777550B2; CZ2002211A3; EP1196547A2; BR0012692A; JP2003505069A; WO2001007577A3; AU5928300A; CA2379723A1; MXPA02000837A; WO2001007577A2

Abstract

본 개시는 프로테아제 부분 및 한 개 이상의 첨가 부분을 포함하는 서브틸리신 프로테아제 콘쥬게이트에 관한 것이다. 각 첨가 부분은 프로테아제 부분의 에피토프 보호 위치에 공유 부착된다. 프로테아제 콘쥬게이트는 부모 프로테아제에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 나아가, 본 개시는 프로테아제 콘쥬게이트를 함유하는 세정 및 퍼스널 케어 조성물에 관한 것이다.

Description

입체적으로 보호된 에피토프 영역을 갖는 프로테아제 콘쥬게이트 {PROTEASE CONJUGATES HAVING STERICALLY PROTECTED EPITOPE REGIONS}

효소는 천연 생성 단백질의 가장 큰 군을 구성한다. 효소의 한 군에는 다른 단백질의 가수분해를 촉매하는 프로테아제가 포함된다. 단백질을 가수분해하는 상기 능력은, 천연 생성 프로테아제 및 유전적으로 조작된 프로테아제를 세정 조성물, 특히 세탁 용도에 적합한 것들에 도입함으로써, 전형적으로 이용되어 왔다.

세정 분야에서, 가장 널리 사용되는 상기 프로테아제는 세린 프로테아제이다. 상기 세린 프로테아제의 대부분은 박테리아 개체에 의해 생성되지만, 일부는 균류와 같은 다른 개체에 의해 생성된다. Siezen 등의 문헌 ["Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Protein Engineering, Vol. 4, No. 7, pp. 719 - 737 (1991)] 을 참조. 불행하게도, 천연 환경에서의 야생형 프로테아제의 유효성은 세정 조성물의 인공 환경에서는 자주 최적화되어 있지 않다. 구체적으로, 예를 들어 열 안정성, pH 안정성, 산화 안정성 및 기질 특이성과 같은 프로테아제 특징이, 프로테아제의 천연 환경 외부에서의 이용을 위해 반드시 최적화되어 있지는 않다.

비천연 세정 환경에서의 프로테아제 유효성을 증가시키기 위한 목적으로, 세린 프로테아제의 야생형 아미노산 서열을 변화시키려는 일부 접근법이 채택되고 있다. 상기 접근법에는, 상당히 다양한 조건 하에서 열 안정성을 증강시키고, 산화 안정성을 개선하기 위한 프로테아제의 유전적 재설계 및/또는 화학적 변형이 포함된다.

그러나, 상기 변형된 프로테아제는 포유류에게 외부물이므로, 잠재적인 항원이다. 항원으로서, 상기 프로테아제는 포유류에서 면역원성 및/또는 알러지성 반응 (본원에서는 총체적으로 면역원성 반응으로 기재함) 을 일으킨다.

또한, 프로테아제의 유전적 재설계 및 화학적 변형이, 세탁 용도를 위해 보다 크게 효과적인 프로테아제를 지속적으로 탐색하는데 탁월하지만, 상기 프로테아제는 퍼스널 케어 조성물 및 가사 경감 세제에 상업적으로 이용되고 있지 않다. 예를 들어, 비누, 젤, 바시 와시, 샴푸 및 가사 경감 식기 세제와 같은 제품에 상기 프로테아제가 없는 일차적인 이유는, 인간 감작으로 바람직하지 않은 면역원성 반응을 일으키는 문제 때문이다. 따라서, 면역원성 반응을 야기하지 않으면서 프로테아제의 클렌징 특성을 제공하는 퍼스널 케어 조성물 또는 가사 경감 세제를 제공하는 것이 매우 유익할 것이다.

최근에는, 화학적으로 변형된 프로테아제를 고정화, 과립화, 코팅 또는 용해시켜 이들이 풍매(風媒)화 (airborne) 되는 것을 방지함으로써, 프로테아제에 대한면역원성을 최소화할 수 있다. 상기 방법은, 소비자가 풍매화 프로테아제에 노출되는 것을 해결지만, 최종 조성물과의 연장된 조직 접촉 및 제조 도중 프로테아제 함유 먼지 또는 에어로졸에 대한 작업자 노출에 관련된 위험을 여전히 제공한다.

또한, 프로테아제에 중합체를 부착시킴으로써 프로테아제의 면역원성 감소를 달성할 수 있다고 제안된 바 있다. 예를 들어, 하기를 참조한다: 미국 특허 제 4,179,337 호, Davis 등, 1979. 12. 18. 허여; 미국 특허 제 5,856,451 호, Olsen 등, Novo Nordisk 출원, 1999. 1. 5. 허여; WO 99/00489, Olsen 등, Novo Nordisk 출원, 1999. 1. 7. 공개; WO 98/30682, Olsen 등, Novo Nordisk 출원, 1998. 7. 16. 공개; 및 WO 98/35026, Von Der Osten 등, 1998. 8. 13. 공개. 그러나, 상기 제안들은, 면역원성 반응에 관여하는 프로테아제의 아미노산 영역 (즉, 에피토프) 로의 중합체 부착의 중요성을 제시하지 못했다.

최근에, 서브틸리신 프로테아제에 세 개의 에피토프 영역이 포함되며, 프로테아제의 면역원성을 상당히 감소시키기 위해서는 한 개 이상의 중합체, 폴리펩티드 또는 다른 기의 접합물이 한 개 이상의 상기 영역에 부착되어야 함이 발견된 바 있다. 예를 들어, 하기를 참조한다: 미국 특허 출원 제 09/088,912 호, Weisgerber 등, The Procter & Gamble Co. 출원인이 1998. 6. 2. 출원.

본 발명자들은, 프로테아제의 한 개 이상의 에피토프 영역 근처를 입체적으로 보호하는 것이, 에피토프 제시를 억제하거나 지연시키고 프로테아제의 면역원성을 감소시키는 대안적 기전임을 발견한 바 있다. 따라서, 본 발명자들은 본원에서, 변형이 한 개 이상의 에피토프 영역에 입체적으로 가까운 영역에 일어난, 변형된 서브틸리신을 제공한다. 그러므로, 본 발명자들은 감소된 면역원성 반응을 야기하지만, 효율적이고 활성 있는 프로테아제로서의 그들의 활성은 유지되는 서브틸리신 프로테아제를 발견하였다. 따라서, 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는, 세탁, 식기, 경질 표면, 피부 케어, 모발 케어, 미용 케어, 구강 케어 및 콘택트 렌즈 조성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 유형의 조성물에 사용하기 적합하다.

발명의 개요

본 발명은, 프로테아제 부분 및 한 개 이상의 첨가 부분을 포함하는 프로테아제 콘쥬게이트에 관한 것으로, 각 첨가 부분은 프로테아제 부분의 에피토프 보호 위치에 공유 부착되며,

(a) 첫 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 및 216 로부터 선택되며;

(b) 두 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 로부터 선택되고;

(c) 세번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271,272 및 275 로부터 선택되고;

첨가 부분은 각각 독립적으로, 하기 구조를 갖는다:

(식 중, X 는 아무 것도 없는 것 및 연결 부분으로부터 선택되며; R₁은 아무 것도 없는 것, 첫 번째 폴리펩티드 및 첫 번째 중합체로부터 선택되고; R₂는 아무 것도 없는 것, 두 번째 폴리펩티드 및 두 번째 중합체로부터 선택되고; X, R₁및 R₂의 한 개 이상은 아무 것도 없는 것이 아니다).

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는 부모 프로테아제에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 따라서, 상기 프로테아제 콘쥬게이트는 세탁, 식기, 경질 표면, 피부 케어, 모발 케어, 미용 케어, 구강 케어 및 콘택트 렌즈 조성물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 여러 유형의 조성물에 사용하기 적합하다.

본 발명은, 예를 들어, 퍼스널 케어 조성물, 세탁 조성물, 경질 표면 클렌징 조성물 및 가사 경감 세정 조성물과 같은 조성물에 유용한 화학적으로 변형된 서브틸리신 프로테아제에 관한 것이다.

본 발명의 필수 성분을 본원에서 하기에 설명한다. 또한, 본 발명의 구현에 유용한, 다양한 선택적이고 바람직한 성분들의 비제한적 설명이 포함된다.

본 발명은, 본원에 기재된 임의의 필요하거나 선택적인 성분들 및/또는 제한들을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성될 수 있다.

모든 퍼센트 및 비는 달리 명시되지 않으면 중량으로 계산된다. 모든 퍼센트는 달리 명시되지 않으면 전체 조성물을 기준으로 계산된다.

모든 성분 또는 조성물 수준은 성분 또는 조성물의 활성 수준을 참고로 하였고, 시판원에 존재할 수 있는 불순물, 예를 들어 잔류 용매 또는 부산물은 배제된다.

모든 특허, 특허 출원 및 공보를 포함하는 본원에 참고된 모든 문헌은, 그들의 전문이 본원에 참고문헌으로 삽입된다.

본원에서는, 효소를 포함한 물질의 상표명을 참고하지만, 이에 제한되지는 않는다. 발명자들은 본원에서, 물질을 특정 상표명에 제한하고자 하는 것이 아니다. 참고된 상표명의 물질과 동등한 물질 (예로, 상이한 이름 또는 카탈로그 (참고) 번호로 상이한 회사에서 시판되는 것들) 을 본원의 프로테아제 콘쥬게이트 및 조성물에 대체하여 사용할 수 있다.

본원에서는, 약어를 사용하여 아미노산을 기재할 것이다. 표 I 은 본원에 사용되는 약어 리스트를 제공한다.

정의

본원에서 사용되는 용어 "변이" 는, 유전자 서열 및/또는 상기 유전자 서열에 의해 생성되는 아미노산 서열의 변화를 의미한다. 변이에는 야생형 단백질 서열에 대한 아미노산 잔기의 결실, 치환 및 첨가가 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "부모" 는, 본원의 프로테아제 콘쥬게이트를 형성하기 위한 추가 변형에 이용되는 단백질 (야생형 또는 변이체) 을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "야생형" 은, 변이되지 않은 개체에 의해 생성되는 단백질, 예를 들어 프로테아제 또는 다른 효소를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "변이체" 는, 상응하는 야생형 단백질과 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다.

본원에서 사용되는 모든 중합체 분자량은 중량 평균 분자량으로 표현된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 콘쥬게이트가 서브틸리신 BPN' 및 이들의 변이체를 포함하는 것들에 제한되지는 않지만, 모든 아미노산 숫자 지정은 서열번호 제 1 번에 나타내는 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열을 참고로 하였다. 서브틸리신 BPN' 의 아미노산 서열은 Wells 등의 문헌 [Nucleic Acids Research, Vol. Ⅱ, pp. 7911 - 7925 (1983)] 에서 더욱 설명된다.

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는 프로테아제 부분 및 한 개 이상의 첨가 부분을 포함하는 화합물로, 프로테아제 부분 및 첨가 부분은 공유 부착 (즉, 공유 결합) 을 통해 연결된다.

프로테아제 부분

본원의 프로테아제 부분은 야생형 또는 이들의 변이체인 서브틸리신 유사 프로테아제이다. 본원에서 사용되는 용어 "서브틸리신 유사 프로테아제" 는, 서브틸리신 BPN' 의 서열과 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 프로테아제를 의미한다. 야생형 서브틸리신 유사 프로테아제는, 예를 들어, 바실러스 알칼로필러스 (Bacillus alcalophilus), 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 아밀로사카리쿠스 (Bacillus amylosaccharicus), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 렌투스 (Bacillus lentus) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 미생물에 의해 생성된다. 서브틸리신 유사 세린 프로테이제 및 이들의 동족체에 관한 논의는 Siezen 등의 문헌 ["Homology Modelling and Protein Engineering Strategy of Subtilases, the Family of Subtilisin-Like Serine Proteases", Protein Engineering, Vol. 4, No. 7, pp. 719 - 737 (1991)] 에서 찾아볼 수 있다.

본원에서 사용하기에 바람직한 프로테아제 부분에는, 예를 들어 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 리케니포르미스 (Bacillus licheniformis) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 에서 수득되는 것들, 서브틸리신 BPN, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 DY, 서브틸리신 309, 프로티나아제 K, 및 A/S Alcalase(덴마크, 코펜하겐, Novo Industries 에서 시판), Esperase(Novo Industries), Savinase(Novo Industries), Maxatase(Genencor International Inc. 에서 시판), Maxacal(Genencor International Inc.), Maxapem 15(Genencor International Inc.) 를 포함하는 테르미타아제, 및 상기물의 변이체가 포함된다. 본원에서 사용하기에 특히 바람직한 프로테아제 부분에는 바실러스 아밀로리케파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 에서 수득되는 것들 및 이들의 변이체가 포함된다. 본원의 가장 바람직한 프로테아제 부분은 서브틸리신 BPN' 및 이들의 변이체이다.

이하에서 "프로테아제 A" 로 언급되는, 본원의 부모 아미노산 서열로서 사용하기에 특히 바람직한 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 미국 특허 제 5,030,378 호 (Venegas, 1991. 7. 9. 허여) 에 개시되어 있고, 하기 변이를 갖는 서브틸리신BPN' 아미노산 서열로 특징지워진다:

(a) 위치 166 의 Gly 이 Asn, Ser, Lys, Arg, His, Gln, Ala 및 Glu 로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되고; 위치 169 의 Gly 이 Ser 으로 치환되고; 위치 222 의 Met 이 Gln, Phe, His, Asn, Glu, Ala 및 Thr 로부터 선택된 아미노산 잔기로 치환되거나;

(b) 위치 160 의 Gly 이 Ala 로 치환되고, 위치 222 의 Met 이 Ala 로 치환된다.

이하에서 "프로테아제 B" 로 언급되는, 본원의 부모 아미노산 서열로서 사용하기에 부가적으로 바람직한 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 EP 251,446 (Genencor International, Inc. 출원, 1988. 1. 7. 공개) 에 개시되어 있고, 한 개 이상의 하기 위치: Tyr21, Thr22, Ser24, Asp36, Ala45, Ala48, Ser49, Met50, His67, Ser87, Lys94, Val95, Gly97, Ser101, Gly102, Gly103, Ile107, Gly110, Met124, Gly127, Gly128, Pro129, Leu135, Lys170, Tyr171, Pro172, Asp197, Met199, Ser204, Lys213, Tyr214, Gly215 및 Ser221 에 변이를 갖거나; 상기 기재된 두 개 이상의 위치와, Asp32, Ser33, Tyr104, Ala152, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 및 Met222 로부터 선택되는 위치에서의 한 개 이상의 변이가 배합된 야생형 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열로 특징지워진다.

이하에서 "프로테아제 C" 로 언급되는, 본원에서 사용하기에 바람직한 기타 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 WO 95/10615 (Genencor International, Inc. 출원, 1995. 4. 20. 공개) 에 기재되어 있고, 위치 Asn76 에서의 변이와, Asp99, Ser101,Gln103, Tyr104, Ser105, Ile107, Asn109, Asn123, Leu126, Gly127, Gly128, Leu135, Glu156, Gly166, Glu195, Asp197, Ser204, Gln206, Pro210, Ala216, Tyr217, Asn218, Met222, Ser260, Lys265 및 Ala274 에서 선택되는 한 개 이상의 다른 위치에서의 변이가 배합된 야생형 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열로 특징지워진다.

이하에서 "프로테아제 D" 로 언급되는, 본원에서 사용하기에 바람직한 기타 서브틸리신 BPN' 의 변이체는 미국 특허 제 4,760,025 호 (Estell 등, 1988. 7. 26. 허여) 에 기재되어 있고, Asp32, Ser33, His64, Tyr104, Asn155, Glu156, Gly166, Gly169, Phe189, Tyr217 및 Met222 로 구성된 군으로부터 선택되는 한 개 이상의 아미노산 위치에 변이를 갖는 야생형 서브틸리신 BPN' 아미노산 서열로 특징지워진다.

본원의 보다 바람직한 프로테아제 부분은, 서브틸리신 BPN', 프로테아제 A, 프로테아제 B, 프로테아제 C 및 프로테아제 D 로 구성된 군으로부터 선택되며, 프로테아제 D 가 가장 바람직하다.

이론에 제한되지 않으면서, 본원의 프로테아제 부분은 하기의 세 개 에피토프 영역을 갖는다: 첫 번째 에피토프 영역, 두 번째 에피토프 영역 및 세번째 에피토프 영역. 첫 번째 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 70 - 84 에 있다; 두 번째 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 103 - 126 에 있다; 세번째 에피토프 영역은 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 220 - 246 에 있다. 예를 들어, 하기를 참조: 미국 특허 출원 제 09/088,912 호, Weisgerber등, The Procter & Gamble Co. 출원인이 1998. 6. 2. 출원; 계류중인 미국 가특허 출원 제 60/144,991 호, Rubingh 등, "Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions and Deletions in Epitope Regions", 1999. 7. 22. 출원; 및 계류중인 미국 가특허 출원 제 60/144,980 호, Sikorski 등, "Serine Protease Variants Having Amino Acid Substitutions in Epitope Regions", 1999. 7. 22. 출원.

놀랍게도, 본 발명자들은 상기 에피토프 영역의 한 개 이상에 입체적으로 가까운 에피토프 보호 위치를 발견하였다. 나아가, 한 개 이상의 첨가 부분을 에피토프 보호 위치에서 프로테아제 부분의 아미노산에 공유 부착시킴으로써, 상기 에피토프가 가수분해로부터 보호되어, 에피토프의 노출이 보호됨을 발견하였다.

첨가 부분으로 공유 변형시키기 적절한 에피토프 보호 위치는 어떤 에피토프를 보호하고자 하느냐에 기초한다. 가장 바람직하게는, 한 개 이상의 첨가 부분이 첫번 째 에피토프 영역에서 에피토프 보호 위치에 공유 부착된다.

첫 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 및 216 임이 발견되었다. 바람직하게는, 첫 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 214 및 215 이다. 가장 바람직하게는, 첫 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 17, 40, 41, 43, 67,86, 87 및 214 이다.

나아가, 두 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 임이 발견되었다. 바람직하게는, 두 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 27, 47, 48, 50, 52, 102, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 138 및 141 이다.

나아가, 세번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 로 구성된 군으로부터 선택됨이 발견되었다. 바람직하게는, 두 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 189, 197, 203, 204, 253, 254, 265 및 275 이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로테아제 부분에는 부모 아미노산 서열의 변형된 서열이 포함된다. 부모 아미노산 서열은, 상기 기재된 바와 동일한 바람직한 제한을 갖는, 상기 기재된 임의의 프로테아제일 수 있다. 상기 구현예에서, 부모 아미노산 서열은 한 개 이상의 부모 아미노산 잔기를 치환 아미노산으로 치환하여, 한 개 이상의 본 발명의 첨가 부분을 부착시키기 적합한 프로테아제 부분을 생성한다. 본 발명에 따라, 치환은 한 개 이상의 에피토프 보호 위치에서 만들어져야 한다. 에피토프 보호 위치 및 이들의 바람직한 제한은 상기에 기재된다.

한 개 이상의 에피토프 보호 위치에서, 한 개 이상의 첨가 부분을 프로테아제 부분에 가장 잘 선택적으로 부착시키기 위해서는, 부모 아미노산 서열에 없는 (그 서열에 유일한) 치환 아미노산으로 치환해야 한다. 상기 관점에서, 부모 아미노산 서열에 유일한 임의의 치환 아미노산을 이용할 수 있다. 예를 들어, 서브틸리신 BPN' 의 야생형 아미노산 서열에는 시스테인 잔기가 없으므로, 서브틸리신 BPN' 을 한 개 이상의 에피토프 보호 위치에서 한 개 이상의 시스테인 잔기로 치환하는 것이 본 발명을 위해 적합하다. 부모 아미노산 서열의 에피토프 보호 위치 이외의 위치에 시스테인 잔기가 있는 경우, 상기 위치 각각을 또다른 아미노산 잔기로 치환하여, 에피토프 보호 위치에 한 개 이상의 첨가 부분이 선택적으로 커플링될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 시스테인은 한 개 이상의 에피토프 보호 위치에 치환하기 위해 가장 바람직한 치환 아미노산이다.

다른 바람직한 치환 아미노산에는 라이신이 포함된다. 치환 아미노산이 라이신인 경우, 부모 아미노산 서열의 에피토프 보호 위치 이외의 위치에 있는 라이신 잔기를 또다른 아미노산 잔기로 변이시켜, 에피토프 보호 위치에서의 한 개 이상의 라이신 잔기의 관능화를 선택적으로 만드는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같은 에피토프 보호 위치인 서브틸리신 BPN' 의 위치 43 에 라이신 잔기가 있다. 서브틸리신 BPN' 서열에 있는 모든 다른 라이신 잔기의 부위선택적 변이를 수행한 후, 첨가 부분으로 위치 43 의 라이신 잔기의 선택적 관능화를 수행할 수 있다. 이와는 달리, 임의의 에피토프 보호 위치에서 아미노산 잔기들을(예를 들어) 라이신으로 변이시킨 후, 상기 위치들을 첨가 부분으로 선택적 관능화시킬 수 있다.

첨가 부분

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는 한 개 이상의 첨가 부분을 포함하며, 각 첨가 부분은 본원에 기재된 에피토프 보호 위치에서 한 개의 아미노산 잔기에 공유 부착된다. 첨가 부분은 임의의 화학적 구조일 수 있다. 바람직하게는, 첨가 부분은 부착된 에피토프 보호 위치 또는 상기에 정의된 임의의 다른 에피토프 보호 위치를 입체적으로 숨긴다. 첨가 부분의 비제한적 예에는 분자량 약 1600 미만, 바람직하게는 약 800 미만, 보다 바람직하게는 약 400 미만, 가장 바람직하게는 약 300 미만인 분자가 포함되지만 이에 제한되지는 않는 유기 분자; 폴리펩티드; 및 중합체가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 는, 두 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "중합체" 는, 두 개 이상의 동일한 (바람직하게는 5 개 이상의 동일한) 단량체 단위를 포함하는 임의 분자를 의미한다.

바람직하게는, 첨가 부분은 하기 구조를 갖는다:

(식 중, X 는 아무 것도 없는 것 및 연결 부분으로부터 선택되며; R₁은 아무 것도 없는 것, 첫 번째 폴리펩티드 및 첫 번째 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; R₂는 아무 것도 없는 것, 두 번째 폴리펩티드 및 두 번째 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고, X, R₁및 R₂의 한 개 이상은 아무 것도 없는 것이 아니다).

바람직하게는, 프로테아제 콘쥬게이트는 1 내지 약 15, 보다 바람직하게는 약 2 내지 약 10, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 5 개의 첨가 부분을 포함한다.

R₁및 R₂가 각각 독립적으로 폴리펩티드 부분 또는 중합체 부분인 경우, R₁및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, R₁이 폴리펩티드 부분인 경우, R₂는 아무 것도 없는 것 및 폴리펩티드 부분으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 아무 것도 없는 것이다. 가장 바람직하게는, R₁이 폴리펩티드 부분인 경우, R₂는 아무 것도 없는 것 및 동일한 폴리펩티드 부분으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 아무 것도 없는 것이다. 바람직하게는, R₁이 중합체 부분인 경우, R₂는 아무 것도 없는 것 및 중합체 부분으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, R₁이 중합체 부분인 경우, R₂는 아무 것도 없는 것 및 동일한 중합체 부분으로부터 선택된다. R₁및 R₂중 한 개 이상이 각각 첫 번째 중합체 및 두 번째 중합체인 경우, X 는 바람직하게는 아무 것도 없는 것이 아니다.

폴리펩티드 부분

본원에 기재되는 폴리펩티드 부분에는 두 개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것들이 포함된다. 바람직한 폴리펩티드 부분은 효소를 포함하는 단백질로부터 선택된다. 바람직한 효소에는 프로테아제, 셀룰라아제, 리파아제, 아밀라아제, 페록시다아제, 마이크로페록시다아제, 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제 (예를 들어, NADH 리덕타아제 포함), 옥시다아제, 페놀옥시다아제, 리폭시게나아제, 리기니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 말라나아제, b-글루카나아제, 아라비노시다아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 트랜스퍼라아제, 이소머라아제 (예를 들어, 글루코오스 이소머라아제 및 자일로오스 이소머라아제 포함), 라이아제, 리가아제, 신터타아제 및 과일기재 효소 (예를 들어, 파파인 포함) 가 포함된다. 폴리펩티드 부분으로 사용하기에 보다 바람직한 효소에는 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 리파아제 및 과일기재 효소가 포함되며, 프로테아제가 보다 더 바람직하다.

폴리펩티드 부분으로 사용하기 위한 리파아제의 예에는 하기 미생물로부터 유래된 것들이 포함된다: 후미콜라 (Humicola), 슈도노마스 (Pseudonomas), 푸사리움 (Fusarium), 무코르 (Mucor), 크로모박테리움 (Chromobacterium), 아스퍼길러스 (Aspergillus), 칸디다 (Candida), 게오트리쿰 (Geotricum), 페니실리움 (Penicillium), 리조푸스 (Rhizopus) 및 바실러스 (Bacillus).

시판되는 리파아제의 예에는 Lipolase, Lipolase Ultra, Lipozyme, Palatase, Novozym435및 Lecitase(모두 덴마크 코펜하겐의 Novo Nordisk 에서 시판), Lumafast(뉴욕주 로체스터 Genencor, Int. 에서 시판) 및 Lipomax(Genencor, Int.) 가 포함된다.

폴리펩티드 부분으로 사용하기 위한 프로테아제의 예에는 세린 프로테아제, 키모트립신 및 엘라스타아제 유형의 효소가 포함된다. 본원에서 상기 "프로테아제 부분" 의 논의에서 정의된 바와 같은, 폴리펩티드 부분으로 사용하기에 가장 바람직한 프로테아제에는 세린 프로테아제가 포함된다.

가장 바람직하게는, 폴리펩티드 부분이 세린 프로테아제인 경우, 폴리펩티드 부분에는 독립적으로, 본원에서 상기에 기재된 프로테아제 부분의 정의가 수반된다. 바람직하게는, 상기 기재된 바와 같이, 폴리펩티드 부분은 부모 아미노산 서열의 변형된 아미노산 서열을 가지며, 여기서 변형은 본원에서 상기에 기재된 바와 같은 한 개 이상의 에피토프 보호 위치에 있다 (상기 부모 아미노산 서열을 "두 번째" 부모 아미노산 서열로 부를 수 있다). 이런 경우, 연결 부분 (연결 부분은 아무 것도 없는 것이 아니다) 또는 프로테아제 부분 (연결 부분은 아무 것도 없는 것이다) 의 한 개는, 폴리펩티드 부분의 한 개의 에피토프 보호 위치에 존재하는 한 개의 치환 아미노산을 통해 폴리펩티드 부분에 공유 부착된다. 폴리펩티드 부분이 세린 프로테아제인 경우, 프로테아제 부분 및 이들의 해당 부모 아미노산 서열에 대해, 본원에서 상기에 기재된 바와 동일한 바람직한 에피토프 보호 위치가 적용된다.

가장 바람직하게는, 폴리펩티드 부분이 세린 프로테아제인 경우, 폴리펩티드 부분 및 프로테아제 부분이 동등한 부분이다. 이런 경우, 폴리펩티드 부분 및 프로테아제 부분은 가장 바람직하게는 디술피드 결합을 통해 부착되며, 여기서 X 는아무 것도 없는 것이고, 가장 바람직하게는 R₂는 아무 것도 없는 것이다.

중합체 부분

본원의 첨가 부분에는 중합체 부분이 포함될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "중합체 부분" 은, 두 개 이상의 동일한 (바람직하게는 5 개 이상의 동일한) 단량체 단위를 포함하는 임의 분자를 의미한다. 적합한 중합체 부분의 예에는 폴리알킬렌 옥시드, 폴리알콜, 폴리비닐 알콜, 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 덱스트란, 전분, 글리코겐, 아가로오스, 구아 고무, 풀루란, 이눌린, 잔탄 고무, 카라게난, 펙틴, 알긴산 히드로실레이트 및 키토산의 히드로실레이트가 포함된다. 바람직한 폴리알킬렌 옥시드에는 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜이 포함된다. 바람직한 덱스트란에는 카르복시메틸덱스트란이 포함된다. 바람직한 셀룰로오스에는 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시에틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필셀룰로오스가 포함된다. 바람직한 전분에는 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분이 포함된다. 보다 바람직한 중합체는 폴리알킬렌 옥시드이다. 가장 바람직한 중합체 부분은 폴리에틸렌 글리콜이다.

R₁및 R₂가 각각 독립적으로 중합체 부분인 경우, R₁및 R₂는 바람직하게는 약 0.2 kD (킬로달톤) 내지 약 40 kD, 보다 바람직하게는 약 0.5 kD 내지 약 40 kD, 보다 더 바람직하게는 약 0.5 kD 내지 약 20 kD, 가장 바람직하게는 약 1 kD 내지 약 10 kD 의 합산 분자량 (즉, R₁의 분자량 더하기 R₂의 분자량) 을 갖는다.

R₁및 R₂가 각각 중합체 부분인 경우, R₁및 R₂는 각각 독립적으로, 바람직하게는 약 0.1 kD 내지 약 20 kD, 보다 바람직하게는 약 0.25 kD 내지 약 20 kD, 보다 더 바람직하게는 약 0.5 kD 내지 약 10 kD, 가장 바람직하게는 약 0.5 kD 내지 약 5 kD 의 분자량을 갖는다.

R₁및 R₂가 각각 중합체 부분인 경우, R₁대 R₂의 분자량 비는 바람직하게는 약 1:10 내지 약 10:1, 보다 바람직하게는 약 1:5 내지 약 5:1, 가장 바람직하게는 약 1:3 내지 약 3:1 의 범위이다.

R₁이 중합체 부분이고 R₂가 아무 것도 없는 것일 경우, R₁은 바람직하게는 약 0.1 kD 내지 약 40 kD, 보다 바람직하게는 약 0.5 kD 내지 약 40 kD, 보다 더 바람직하게는 약 0.5 kD 내지 약 20 kD, 가장 바람직하게는 약 1 kD 내지 약 10 kD 의 분자량을 갖는다.

연결 부분

본원에서 사용되는 X 는 아무 것도 없는 것이거나, 한 개 이상의 폴리펩티드 부분 또는 한 개 이상의 중합체 부분, 또는 둘 다에 선택적으로 공유 부착된 연결 부분일 수 있고, 또한 프로테아제 부분의 한 개의 에피토프 보호 위치에서 아미노산 잔기에 공유 부착된다. 연결 부분은, 일반적으로 임의 소분자, 즉, 약 1600 미만, 바람직하게는 약 800 미만, 보다 바람직하게는 약 400 미만, 가장 바람직하게는 약 300 미만의 분자량을 갖는 분자일 수 있다. 가장 바람직한 연결 부분에는, 시스테인 잔기 또는 라이신 잔기, 가장 바람직하게는 시스테인 잔기에 공유 결합할수 있는 것들이 포함된다.

연결 부분의 예 및 관련 화학은 하기에 개시되어 있다: 미국 특허 제 5,446,090 호, Harris, 1995. 8. 29. 허여; 미국 특허 제 5,171,264 호, Merrill, 1992. 12. 15. 허여; 미국 특허 제 5,162,430 호, Rhee 등, 1992. 11. 10. 허여; 미국 특허 제 5,153,265 호, Shadle 등, 1992. 10. 6. 허여; 미국 특허 제 5,122,614 호, Zalipsky, 1992. 6. 16. 허여; Goodson 등의 문헌 ["Site-Directed Pegylation of Recombinant Interleukin-2 at its Glycosylation Site", Biotechnology, Vol. 8, No. 4, pp. 343 - 346 (1990)]; Kogan 의 문헌 ["The Synthesis of Substituted Methoxy-Poly(ethylene glycol) Derivatives Suitable for Selective Protein Modification", Synthetic Communications, Vol. 22, pp. 2417 - 2424 (1992)]; 및 Ishii 등의 문헌 ["Effects of the State of the Succinimido-Ring on the Fluorescence and Structural Properties of Pyrene Maleimide-Labeled αα-Tropomyosin", Biophysical Journal, Vol. 50, pp. 75 - 80 (1986)]. 가장 바람직한 연결 부분은 치환 (예를 들어, 알킬 치환) 또는 비치환 숙신이미드이다.

부가적 예로서, 하기의 비제한적 시약을 이용하여, 연결 부분을 형성할 수 있다: N-[알파-말레이미도아세톡시]숙신이미드 에스테르; N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시숙신이미드; 비스말레이미도헥산; N-[베타-말레이미도프로필옥시]숙신이미드 에스테르; 비스[2-(숙신이미딜옥시카르보닐옥시)-에틸]술폰; 비스[술폰숙신이미딜]수버레이트; 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠; 디메틸아디피메이트ㆍ2 HCl; 디메틸피멜이미데이트ㆍ2 HCl; 디메틸수베르이미데이트ㆍ2 HCl; 디숙신이미딜 글루타레이트; 디숙신이미딜 수버레이트; m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르; N-히드록시숙신이미딜-4-아지도살리실산; N-숙신이미딜-6-[4'-아지도-2'-니트로페닐아미노]헥사노에이트; N-히드록시숙신이미딜 2,3-디브로모프로피오네이트; 숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트; 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트; 숙신이미딜-6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트]; 비스[2-(술포숙신이미딜옥시카르보닐옥시)-에틸]술폰; N-[감마-말레이미도부티릴옥시]술폰숙신이미드 에스테르; N-히드록시술포숙신이미딜-4-아지도벤조에이트; N-[카파-말레이미도운데카노일옥시]술포숙신이미드 에스테르; m-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르; 술포숙신이미딜[4-아지도살리실아미도]헥사노에이트; 술포숙신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트; 술포숙신이미딜 6-[4'-아지도-2'-니트로페닐아미노]헥사노에이트; 술포숙신이미딜 4-[p-아지도페닐]부티레이트; 술포숙신이미딜[4-요오도아세틸]아미노벤조에이트; 술포숙신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트; 및 술포숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트. 각각의 상기 시약은 일리노이주, 록포드의 Pierce Chemical Co. 에서 시판된다.

선택적 부분

프로테아제 콘쥬게이트는 부가적으로, 본원에 예시되지 않은 프로테아제의 다른 잔기 또는 첨가 부분 (본원의 "추가 부분" 으로 언급함) 이 없는 에피토프 보호 위치에 부착된, 예를 들어 한 개 이상의 소분자, 폴리펩티드 및/또는 중합체를포함하는, 한 개 이상의 화학적 구조를 포함할 수 있다. 추가 부분에는 본원에서 상기에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 부분, 중합체 부분 및 연결 부분이 포함될 수 있다. 덧붙여, 예를 들어 약 100 Da 내지 약 5000 Da, 바람직하게는 약 100 Da 내지 약 2000 Da, 보다 바람직하게는 약 100 Da 내지 약 1000 Da, 보다 더 바람직하게는 약 100 Da 내지 약 750 Da, 가장 바람직하게는 약 300 Da 의 분자량을 갖는 한 개 이상의 중합체 (가장 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜) 는, 본원에 예시된 것들 이외의 잔기에서, 프로테아제 부분에 공유 부착될 수 있다. 상기 중합체 부분은, 본원에 기재되고 당 분야에 널리 공지된 기술 (본원에 기재된 바와 같이 연결 부분을 통하는 것을 포함) 을 이용하여 프로테아제 부분의 임의 위치에서, 본원의 프로테아제 부분에 직접 부착될 수 있다. 상기 선택적 유형의 중합체 접합의 비제한적 예는, WO 99/00849 (Olsen 등, Novo Nordisk A/S, 1999. 1. 7. 공개) 에 나타난다.

제조 방법

한 개 이상의 에피토프 보호 위치 (또는 프로테아제 부분의 임의의 다른 위치) 에 치환을 갖는 프로테아제 부분은, 부모 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 변이시켜 제조한다. 상기 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다; 상기 방법의 한 비제한적 예를 하기에 나타낸다:

야생형 서브틸리신 BPN' 유전자 (Mitchison, C. 및 J. A. Wells, "Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN'", Biochemistry, Vol. 28, pp. 4807 - 4815 (1989)) 를 포함하는 파지미드 (pSS-5) 를 대장균 (Escherichiacoli)dut- ung-균주 CJ236 에 형질전환시키고, VCSM13 헬퍼 파지 (Kunkel 등, "Rapid and Efficient Site-Specific Mutagenesis Without Phenotypic Selection", Methods in Enzymology, Vol 154, pp. 367 - 382 Yuckenberg 등이 변형시킴, (1987) "Site-Directed in vitro Mutagenesis Using Uracil-Containing DNA and Phagemid Vectors", Directed Mutagenesis - A Practical Approach, McPherson, M. J. 편저, pp. 27 - 48 (1991)) 를 이용하여, 단일 사슬의 우라실 함유 DNA 주형을 제조한다. Zoller, M. J. 및 M. Smith 의 문헌 ["Oligonucleotide - Directed Mutagenesis Using M13 - Derived Vectors: An Efficient and General Procedure for the Production of Point Mutations in any Fragment of DNA", Nucleic Acids Research, Vol. 10, pp. 6487 - 6500 (1982)] 에 개시된 방법에서 변형된, 프라이머 부위 지정 변이화를 이용하여, 모든 변이체를 제조한다 (본질적으로, Yuckenberg 등이 상기 문헌에 나타낸 대로).

380B DNA 합성기 (Applied Biosystems Inc.) 를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 제조한다. 변이화 반응 생성물을 대장균 균주 MM294 (American Type Culture CollectionE. coli33625) 로 형질전환시킨다. 모든 변이를 DNA 서열분석으로 확인하고, 단리된 DNA 를 바실러스 서브틸리스 발현 균주 PG632 (Saunders 등의 "Optimization of the Signal-Sequence Cleavage Site for Secretion fromBacillus subtilisof a 34-Amino Acid Fragment of Human Parathyroid Hormone", Gene, Vol. 102, pp. 277 - 282 (1991) 및 Yang 등의 "Cloning of the Neutral Protease Gene ofBacillus subtilisand the Use of the Cloned Gene to Createan in vitro - Derived Deletion Mutation", Journal of Bacteriology, Vol. 160, pp. 15 - 21 (1984)) 로 형질전환시킨다.

발효는 하기와 같이 수행한다. 대상 프로테아제를 포함한 바실러스 서브틸리스 세포 (PG632) 를, 글루코오스 10 g/L 함유 LB 브로쓰 1 리터 중에서 로그상 중간까지 배양하고, 총 9 리터 부피의 Biostat C 발효기 (Braun Biotech, Inc., Allentown, PA) 내에 접종한다. 발효 배지에는 효모 추출물, 카제인 히드로실레이트, 가용성-부분 가수분해된 전분 (Maltrin M-250), 소포제, 완충액 및 미량 미네랄 ("Biology of Bacilli: Applications to Industry", Doi, R. H. 및 M. McGloughlin 편저 (1992) 참조) 이 함유된다. 브로쓰는 발효 수행 중에 pH 7.5 로 일정하게 유지된다. 변이된 플라스미드의 항생제 선별을 위해, 카나마이신 (50 ㎍/mL) 을 첨가한다. A₆₀₀이 약 60 이 될 때까지, 세포를 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하여, 산물을 회수한다.

발효 브로쓰로 하기 단계를 따라, 순수한 프로테아제를 수득한다. 브로쓰를 0.16 ㎛ 막을 통해 수직으로 흘려서, 바실러스 서브틸리스 세포를 제거한다. 이어서, 무세포 브로쓰를 8,000 분자량 컷오프 막으로 초여과하여 농축한다. 진한 MES 완충액 (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 으로 pH 를 5.5 로 조정한다. S-세파로오스로 양이온 교환 크로마토그래피하고 NaCl 농도구배로 용출하여, 프로테아제를 후속 정제한다. Scopes, R. K. 의 문헌 ["Protein Purification Principles and Practice", Springer-Verlag, New York (1984)] 를 참조.

pNa 분석법 (DelMar 등의 Analytical Biochemistry, Vol. 99, pp. 316 - 320 (1979)) 을 이용하여, 농도구배 용출 중에 수합된 분획들의 활성 프로테아제 농도를 측정한다. 상기 분석법은, 프로테아제가 가용성 합성 기질인 숙시닐-알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-p-니트로아닐린 (sAAPF-pNA) 을 가수분해함에 따라 p-니트로아닐린이 방출되는 속도를 측정한다. 가수분해 반응으로부터의 황색 생성 속도는 분광기 상 410 nm 에서 측정되며, 활성 프로테아제 부분의 농도에 비례한다. 또한, 280 nm 에서의 흡광도 측정을 이용하여, 전체 단백질 농도를 측정한다. 활성 프로테아제/전체 단백질 비로 프로테아제 순도를 얻고, 스톡 용액을 풀링하기 위한 분획을 확인하는데 사용한다.

보관 중 프로테아제의 자가분해를 방지하기 위해, 동량의 프로필렌 글리콜을 크로마토그래피 칼럼으로부터 수득하여 풀링된 분획에 첨가한다. 정제 공정의 완료 시, 스톡 프로테아제 용액의 순도를 SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 로 확인하고, 트립신 저해제 유형 Ⅱ-T 인 칠면조 난백 (미주리주, 세인트루이스의 Sigma Chemical Company) 을 이용한 활성 부위 적정 방법을 통해 절대 효소 농도를 측정한다.

사용을 위한 제조 시, 프로테아제 스톡 용액을 세파덱스-G25 (뉴저지주, 피스카타웨이, Pharmacia) 크기 배제 칼럼을 통해 용출하여, 프로필렌 글리콜을 제거하고 완충액을 교환한다. 효소 스톡 용액 중의 MES 완충액을 0.01 M KH₂PO₄용액, pH 5.5 로 교환한다.

제조된 프로테아제를 한 개 이상의 첨가 부분으로 관능화시키는데 사용하여, 프로테아제 콘쥬게이트를 제조할 수 있다. 첨가 부분의 전구체 (첨가 부분의 전구체는 프로테아제 부분의 전구체와 반응하여, 첨가 부분 및 프로테아제 부분으로 구성되는 프로테아제 콘쥬게이트를 형성한다) 를 바람직하게는 활성화시켜, 프로테아제 부분의 전구체에 대한 반응성을 증강시킨다. 상기 활성화는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 프로테아제 콘쥬게이트 제조 방법의 비제한적 예를 하기에 제공한다.

실시예 1

한 개의 에피토프 보호 위치에 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 프로테아제를 하기 방법을 이용하여, 상기 도식에 따라 중합체 부분과 커플링시킨다 (여기서, "P" 는 프로테아제 부분에서 시스테인 치환으로 생성된 티올기를 뺀 것을 나타내며, n 은 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단량체 단위의 수이다 (예를 들어, n = 77)).

위치 217 의 티로신을 류신으로 치환하고, 위치 3 의 세린을 시스테인으로 치환한 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 인산염 완충액 (pH 5.5) 중에서변이체를 약 2 mg/mL 의 농도로 만든다. 이어서, 묽은 수산화나트륨으로 pH 를 7.5 로 높인다. 변이체를 모노메틸 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드와 25:1 로, 활성화된 중합체에 변이체가 과량이 되도록 혼합한다. 상온에서 한 시간 동안 혼합한 후, 혼합물의 pH 를 묽은 인산으로 5.5 로 조정하고, 분자량 컷오프 초여과기를 통해 여과하여, 과량의 중합체를 제거한다. 농축물에는 정제된 프로테아제 콘쥬게이트가 함유되어 있다.

실시예 2

한 개의 에피토프 보호 위치에 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 프로테아제 부분을 하기 방법을 이용하여, 상기 도식에 따라 중합체 부분과 커플링시킨다 (여기서, "P" 는 프로테아제 부분에서 시스테인 치환으로 생성된 티올기를 뺀 것을 나타내며, n 은 각 폴리에틸렌 글리콜의 반복 단량체 단위의 수이다 (예를 들어, n= 77)).

위치 217 의 티로신을 류신으로 치환하고, 위치 17 의 페닐알라닌을 시스테인으로 치환한 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 인산염 완충액 (pH 5.5) 중에서 변이체를 약 2 mg/mL 의 농도로 만든다. 이어서, 묽은 수산화나트륨으로 pH 를 7.5 로 높인다. 변이체를 디메틸 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드와 25:1 로, 활성화된 중합체에 변이체가 과량이 되도록 혼합한다. 상온에서 한 시간 동안 혼합한 후, 혼합물의 pH 를 묽은 인산으로 5.5 로 조정하고, 분자량 컷오프 초여과기를 통해 여과하여, 과량의 중합체를 제거한다. 농축물에는 정제된 프로테아제 콘쥬게이트가 함유되어 있다.

실시예 3

숙신이미드-보호 중합체를 한 개 이상의 에피토프 보호 위치의 라이신에 선택적으로 커플링시킨다 (여기서, "MPEG" 및 "PEGM" 은 동등하며, 모노메틸 폴리에틸렌 글리콜을 나타내고, "P" 는 프로테아제 부분에서 나타낸 라이신 아민기를 뺀 것을 나타낸다):

실시예 4

카르보디이미드-보호 중합체를 한 개 이상의 에피토프 보호 위치의 라이신에 선택적으로 커플링시킨다 (여기서, "MPEG" 및 "PEGM" 은 동등하며, 모노메틸 폴리에틸렌 글리콜을 나타내고, "P" 는 프로테아제 부분에서 나타낸 라이신 아민기를 뺀 것을 나타내고, X 및 X' 은 카르보디이미드 부분을 포함하는 측쇄, 예를 들어 알킬이다):

실시예 5

한 개의 에피토프 보호 위치에 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 프로테아제 부분을 하기 방법을 이용하여, 알킬 말레이미드와 커플링시킨다 (여기서, "P" 는 프로테아제 부분에서 시스테인 치환으로 생성된 티올기를 뺀 것을 나타내며, "R" 은 알킬기이다). 상기 예에서, R₁및 R₂는 각각 아무 것도 없는 것이고, 연결 부분은 알킬 말레이미드에서 유래된다.

위치 217 의 티로신을 류신으로 치환하고, 위치 86 의 세린을 시스테인으로 치환한 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 변이체의 용액 20 mL 을, 0.01 M KH₂PO₄완충액 (pH 7) 중에 약 1 mg/mL 의 농도로 제조한다. 상기 용액에, 알킬 말레이미드 (예를 들어, 메틸 말레이미드) 1.5 당량을 용액에 첨가한다. 용액을 상온에서 약 1 시간 동안 부드럽게 혼합한다. 생성 프로테아제 콘쥬게이트를 표준 방법에 의해 용액으로부터 수득한다.

실시예 6

한 개의 에피토프 보호 위치에 한 개의 시스테인 잔기를 포함하는 프로테아제 부분을 하기 방법을 이용하여, 이중체로 형성한다 (여기서, "P" 는 프로테아제 부분에서 시스테인 치환으로 생성된 티올기를 뺀 것을 나타낸다). 상기 예에서, 프로테아제 부분 및 폴리펩티드 부분은 동등하다 (X 는 아무 것도 없는 것이다).

위치 217 의 티로신을 류신으로 치환하고, 위치 214 의 세린을 시스테인으로 치환한 서브틸리신 BPN' 의 변이체를 제조한다. 변이체의 용액 20 mL 을, 0.01 M KH₂PO₄완충액 (pH 8.6) 중에 약 1 mg/mL 의 농도로 제조한다. 산소를 상온에서 약 1 시간 동안 용액을 통해 부드럽게 버블링시켜, 목적하는 프로테아제 콘쥬게이트 이중체를 형성한다. 생성 프로테아제 콘쥬게이트를 표준 방법에 의해 용액으로부터 수득한다.

분석 방법

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트를 하기의 방법을 이용하여 효소 활성 및면역원성 반응에 대하여 시험할 수 있으며, 이 두 방법은 모두 당업자에게 공지되어 있다. 당 분야에 널리 공지된 다른 방법들도 대안적으로 사용될 수 있다.

프로테아제 콘쥬게이트 활성

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트의 프로테아제 활성은 당 분야에 널리 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 두 개의 상기 방법을 본원에서 하기에 나타낸다:

피부 박편 (flake) 활성 방법

Scotch#375OG 테이프를 이용하여, 테이프가 박편에 의해서 실질적으로 불투명해질 때까지, 인간 피부 박편을 피험자의 다리로부터 반복적으로 박리시킨다. 이어서 테이프를 1 인치 x 1 인치 조각으로 절단하여 준비하여 둔다. 10 mm x 35 mm 페트리 접시에, 2 mL 의 대조군 효소 (0.75 mg/mL) (예를 들어, 서브틸리신 BPN') 또는 시험하려는 프로테아제 콘쥬게이트를 0.01 M KH₂PO₄pH 5.5 완충액에 첨가한다. 상기 용액에, 2.5% 소듐 라우레이트 pH 8.6 용액 1 mL 을 첨가한다. 용액을 플래트폼 쉐이커에서 부드럽게 혼합한다. 계속하여 부드럽게 혼합하면서, 미리 준비된 테이프 조각을 상기 용액에 (박편을 위로 함) 10 분 동안 침지시킨다. 이어서 테이프 조각을 15 초 동안 수돗물에 부드럽게 헹군다. Stevenel Blue Stain (3 mL, 미주리주, 세인트루이스의 Sigma Chemical Co. 에서 시판) 을 깨끗한 페트리 접시로 피펫팅한다. 헹궈진 테이프 조각을 부드럽게 혼합하면서 3 분 동안 염색약에 (박편을 위로 함) 놓아둔다. 테이프 조각을 염색약으로부터 꺼내 연속적으로 2 개의 300 mL 증류수 비이커에서 15 초씩 헹군다. 테이프 조각을 대기 건조시킨다. 대조군 효소로부터 수득한 테이프 조각과 프로테아제 콘쥬게이트로부터 수득한 테이프 조각 사이의 색상의 강도를 육안 또는 색도계를 이용하여 비교한다. 대조군 효소 테이프 조각에 비하여 덜한 색상 강도를 보이는 프로테아제 콘쥬게이트 테이프 조각은, 프로테아제 콘쥬게이트가 더 높은 활성을 가짐을 나타낸다.

염색된 콜라겐 활성 방법

0.01 M CaCl₂를 함유하는 0.1 M 트리스 완충액 (트리스-히드록시메틸-아미노메탄) (pH 8.6), 50 mL 과 아조콜 (아조 염료가 함침된 콜라겐, 미주리주, 세인트루이스, Sigma Chemical Co. 에서 시판) 0.5 g 을 합한다. 상기 혼합물을 플래트폼 쉐이커를 이용하여 부드럽게 혼합하면서 25 ℃ 에서 인큐베이션한다. 0.2 미크론 시린지 필터를 통해 혼합물 2 mL 을 여과한 후, 분광계를 이용하여 520 nm 에서의 혼합물의 흡광도를 0 으로 읽는다. 대조군 효소 (예를 들어, 서브틸리신 BPN') 또는 시험하려는 프로테아제 콘쥬게이트 1 ppm 을, 남아있는 트리스/아조콜 혼합물 48 mL 에 첨가한다. 총 10 분 동안 매 2 분 마다, 대조군/프로테아제 콘쥬게이트 함유 용액 2 mL 을 0.2 미크론 시린지 필터를 통해 여과한다. 여과된 각 시료에 대하여, 520 mn 에서의 흡광도를 즉시 읽는다. 결과를 시간에 따른 그래프로 작성한다. 대조군 및 시험 콘쥬게이트의 기울기는 시료의 상대적 활성을 나타낸다. 기울기가 클수록 더 높은 활성을 나타낸다. 시험 프로테아제 콘쥬게이트 활성 (기울기) 을 대조군 활성 (기울기) 의 퍼센트로 나타낼 수 있다.

면역원성에 대한 마우스 비강내 시험

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트의 잠재적 면역원성은 당 분야에 공지된 방법 또는 본원에서 하기에 나타내는 면역원성에 대한 마우스 비강내 시험으로 측정될 수 있다. 상기 시험은 Robinson 등의 문헌 ["Specific Antibody Responses to Subtilisin Carlsberg (Alcalase) in Mice: Development of an Intranasal Exposure Model", Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 34, pp. 15 - 24 (1996)] 및 Robinson 등의 문헌 ["Use of the Mouse Intranasal Test (MINT) to Determine the Allergenic Potency of Detergent Enzymes: Comparison to the Guinea Pig Intratracheal (GPIT) Test", Toxicological Science, Vol. 43, pp. 39 - 46 (1998)] 에 기재되어 있는 분석법과 유사하며, 이 두 분석법은 본원에서 하기에 나타내는 시험을 대신하여 이용될 수 있다.

체중이 약 18 내지 약 20 g 인 암컷 BDF1 마우스 (Charles River Laboratories, Portage, MI) 를 시험에 이용한다. 마우스는 투여 1 주일 전에 격리시킨다. 마우스는 습도 (30 - 70%), 온도 (67 - 77℉) 및 12 시간의 명암 주기로 조절되는 실내에서 목재칩으로 잠자리가 마련된 케이지에 수용된다. 마우스에 Purina마우스 사료 (Purina Mills, Richmond, IN) 및 물을 자유로이 공급한다.

시험하려는 잠재적 항원 (양성 대조군으로서 서브틸리신 BPN' 또는 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트) 을 5 마리 마우스로 이루어진 일군에 투여한다. 투여 전, 각 마우스를 Ketaset (88.8 mg/kg) 및 Rompun (6.67 mg/kg) 의 혼합물을 복강내 주사하여 마취시킨다. 마취된 동물을 손바닥에 등이 아래로 가도록 눕혀, 완충 용액 (0.01 M KH₂PO₄, pH 5.5) 중의 프로테아제 5 ㎕ 을 비강내 투여한다. 각 군에 동일한 용량을 투여하지만, 다양한 용량을 시험할 수도 있다. 투여 용액을 각 비강의 외부에 부드럽게 놓아 마우스가 흡입하게 한다. 투여는 3, 10, 17 및 24 일째에 반복된다.

혈청 시료를 29 일째에 채취한다. 마우스 혈청 내 효소특이적 IgG1 항체를 항원 캡쳐 ELISA 방법으로 측정한다. 표준 ED₅₀값을 이용하여, 프로테아제 콘쥬게이트의 면역원성을 서브틸리신 BPN' 의 면역원성과 비교할 수 있다.

본 발명의 조성물

본원의 프로테아제 콘쥬게이트는 각각의 부모 프로테아제에 적합한 임의의 용도로 사용될 수 있다. 상기 예의 하나로 세정 조성물이 포함된다. 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트의 바람직하게 감소된 면역원성 특성 때문에, 프로테아제 콘쥬게이트를, 역사적으로 프로테아제를 사용함으로써 별다른 혜택을 받지 못한 용도들에 더욱 사용할 수 있다. 상기 용도들의 예로는 퍼스널 케어 조성물의 사용에서와 같은, 프로테아제 콘쥬게이트가 포유류 피부 (특히, 인간 피부) 와 필연적으로 밀접하게 접촉하게 되는 것들이 포함된다.

세정 조성물

프로테아제 콘쥬게이트는 세탁 조성물, 경질 표면 세정 조성물, 식기 세정 조성물을 포함하는 가사 경감 세정 조성물 및 자동 식기세척기 세제 조성물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 세정 조성물에 사용될 수 있다.

본원의 세정 조성물은 유효량의 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트 및 세정 조성물 담체를 함유한다.

본원에서 사용되는 "유효량의 프로테아제" 등은, 특정 세정 조성물에 필요한 단백질분해 활성을 얻는데 필요한 프로테아제 콘쥬게이트의 양을 의미한다. 상기 유효량은 당업자에 의해서 쉽게 확인되며, 많은 요소, 예컨대, 사용되는 특정 프로테아제 콘쥬게이트, 세정 용도, 세정 조성물의 특정 조성 및 액체 또는 건조 (예, 과립, 바) 조성물의 필요 여부 등에 기초한다. 바람직하게는, 세정 조성물은 약 0.0001% 내지 약 10%, 보다 바람직하게는 약 0.001% 내지 약 1%, 가장 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.1% 의 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트를 함유한다. 프로테아제 콘쥬게이트가 채택될 수 있는 다양한 세정 조성물의 여러 예가 하기에 보다 자세히 논의된다.

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트에 덧붙여, 본 발명의 세정 조성물은 부가적으로 프로테아제 콘쥬게이트에 상용성인, 한 개 이상의 세정 조성물 재료를 포함하는 세정 조성물 담체를 함유한다. 본원에서 사용되는 용어 "세정 조성물 재료" 는, 목적하는 세정 조성물의 특정 유형 및 제품의 형태 (예, 액체, 과립, 바, 스프레이, 스틱, 페이스트, 젤) 을 위해 선택된 임의의 재료를 의미하며, 이 재료들은 또한 조성물에 사용되는 프로테아제 콘쥬게이트와 상용성이다. 세정 조성물 재료의 특정 선택은 세정하려는 표면 재료, 사용 중 세정 조건에 대한 조성물의 목적 형태 (예, 워시 세제 사용을 통해) 를 고려하여 용이하게 수행된다. 본원에서 사용되는 용어 "상용성" 은, 세정 조성물 재료가 정상적인 사용 환경 중에, 프로테아제가 목적하는 바와 같이 효과적이지 않을 정도로 프로테아제 콘쥬게이트의 단백질 분해 활성을 감소시키지 않는 것을 의미한다. 특정 세정 조성물 재료는 이하에 자세히 예시된다.

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는 고 거품성 (sudsing) 및 양호한 클렌징이 요망되는 다양한 세제 조성물에 사용될 수 있다. 따라서, 프로테아제 콘쥬게이트를 다양한 통상의 성분들과 함께 사용하여, 완전히 제형화된 경질 표면 클리너, 식기 세정 조성물, 직물 세탁 조성물 등을 제공할 수 있다. 상기 조성물은 액체, 과립, 바 등의 형태일 수 있다. 상기 조성물은 계면활성제를 약 30 중량% 내지 약 60 중량% 함유하는 "농축" 세제로 제형화될 수 있다.

본원의 세정 조성물은 선택적으로 및 바람직하게, 다양한 계면활성제 (예, 음이온성, 비이온성 또는 쯔비터이온성 계면활성제) 를 함유할 수 있다. 상기 계면활성제는 전형적으로 조성물의 약 5% 내지 약 35% 의 수준으로 존재한다.

본원의 유용한 계면활성제의 비제한적 예에는 통상의 C₁₁-C₁₈알킬 벤젠 술포네이트, 및 일차 및 랜덤 알킬 술페이트, 화학식 CH₃(CH₂)_x(CHOS0₃ ^-M⁺)CH₃및 CH₃(CH₂)_y(CHOSO₃ ^-M⁺)CH₂CH₃(식 중, x 및 (y+l) 은 약 7 이상, 바람직하게는 약 9 이상의 정수이고, M 은 수용성 양이온, 특히 소듐이다) 의 C₁₀-C₁₈이차 (2,3) 알킬 술페이트, C_1O-C_l8알킬 알콕시 술페이트 (특히 EO 1-5 에톡시 술페이트), C_1O-C₁₈알킬 알콕시 카르복실레이트 (특히 EO 1-5 에톡시카르복실레이트), C₁₀-C_l8알킬 폴리글리코시드 및 이들의 대응하는 술페이트화 폴리글리코시드, C₁₂-C₁₈α-술폰화 지방산 에스테르, C₁₂-C₁₈알킬 및 알킬 페놀 알콕실레이트 (특히 에톡실레이트 및 혼합 에톡시/프로폭시), C₁₂-C₁₈베타인 및 술포베타인 ("술타인"), C₁₀-C₁₈아민 옥시드 등이 포함된다. 알킬 알콕시 술페이트 (AES) 및 알킬 알콕시 카르복실레이트 (AEC) 가 본원에서 바람직하다. 상기 계면활성제와 아민 옥시드 및/또는 베타인 또는 술타인 계면활성제를 병용하는 것이, 제형자의 목적에 따라 또한 바람직하다. 기타 통상의 유용한 계면활성제가 표준 텍스트에 열거된다. 특히 유용한 계면활성제에는 미국 특허 제 5,194,639 호 (Connor 등, 1993. 3. 16. 허여) 에 개시된 C_1O-C_l8N-메틸 글루카미드가 포함된다.

예를 들어, 기타 활성 성분, 담체, 히드로트로프, 가공보조제, 염료 또는 안료 및 액체 제형용 용매를 포함하는, 세제 세정 조성물에 유용한 다양한 다른 성분들이 본원의 조성물에 함유될 수 있다. 거품성의 부가적 증가가 필요하다면, C_1O-C₁₆알콜아미드와 같은 거품 부스터 (sud booster) 를 조성물에 전형적으로 약 1% 내지 약 10% 수준으로 혼입시킬 수 있다. C_1O-C₁₄모노에탄올 및 디에탄올 아미드가 상기 거품 부스터의 전형적인 군을 나타낸다. 상기 거품 부스터와 함께 상기 언급된 아민 옥시드, 베타인 및 술타인과 같은 고 거품성 보조 계면활성제의 사용이 또한 유리하다. 필요하다면, 가용성 마그네슘염, 예컨대, MgCl₂, MgSO₄등을 전형적으로 약 0.1% 내지 약 2% 의 수준으로 첨가하여, 부가적 거품성을 제공할 수 있다.

본원의 액체 세제 조성물은 물 및 다른 용매를 담체로서 함유할 수 있다. 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 예시되는 저분자량의 일차 또는 이차 알콜이 적합하다. 일가 알콜이 계면활성제의 용해를 위해 바람직하지만, 폴리올, 예를 들어 약 2 내지 약 6 개의 탄소 원자 및 약 2 내지 약 6 개의 히드록시기를 포함하는 것 (예컨대, 1,3-프로판디올, 에틸렌 글리콜, 글리세린 및 1,2-프로판디올) 또한 사용될 수 있다. 조성물은 약 5 % 내지 약 90 %, 전형적으로는 약 10 % 내지 약 50 % 의 상기 담체를 함유할 수 있다.

본원의 세제 조성물은 바람직하게는 수성 세정 작업에서 사용되는 동안, 세정수가 약 6.8 내지 약 11 의 pH 를 갖도록 제형화될 것이다. 따라서, 최종 생성물은 전형적으로는 상기 범위로 제형화된다. 권장되는 사용 수준으로 pH 를 조절하는 기술에는, 예를 들어 완충액, 알칼리 및 산의 사용이 포함된다. 상기 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 경질 표면 세정 조성물 및 직물 세정 조성물을 제형화할 경우, 제형자가 약 5 중량% 내지 약 50 중량% 의 수준의 다양한 빌더 (builder) 를 채택하는 것을 기대할 수 있다. 전형적인 빌더에는 1-10 미크론 제올라이트, 폴리카르복실레이트, 예를 들어 시트레이트 및 옥시디숙시네이트, 층화 (layered) 실리케이트, 포스페이트 등이 포함된다. 다른 통상적인 빌더들이 표준 제형물로 나열된다.

이와 같이, 제형자가 상기 조성물에 다양한 부가적 효소, 예를 들어 셀룰라아제, 리파아제, 아밀라아제 및 프로테아제를, 전형적으로는 약 0.001 중량% 내지 약 1 중량% 의 수준으로 채택하도록 기대할 수 있다. 다양한 세제 및 직물 케어 효소는 세탁 세제 분야에 널리 공지되어 있다.

다양한 표백 화합물, 예를 들어 퍼카르보네이트, 퍼보레이트 등이 상기 조성물에, 전형적으로는 약 1 중량% 내지 약 15 중량% 의 수준으로 사용될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 조성물은 또한 표백 활성제, 예를 들어 테트라아세틸 에틸렌디아민, 노나노일옥시벤젠 술포네이트 등을 함유할 수 있고, 이들 역시 당 분야에 공지되어 있다. 사용 수준은 전형적으로는 약 1 중량% 내지 약 10 중량% 범위이다.

오염 방출제, 특히 음이온성 올리고에스테르 유형의 오염 방출제, 킬레이트제, 특히 아미노포스포네이트 및 에틸렌디아민디숙시네이트, 점질토 제거제, 특히 에톡실화 테트라에틸렌 펜타민, 분산제, 특히 폴리아크릴레이트 및 폴리아스파라테이트, 광택제, 특히 음이온성 광택제, 거품 억제제, 특히 실리콘 및 이차 알콜, 직물 유연제, 특히 스멕타이트 점토 등이 모두 상기 조성물에, 약 1 중량% 내지 약 35 중량% 의 범위 수준으로 사용될 수 있다. 표준 제형 및 공개된 특허에는 상기 통상적인 물질의 복합적이고 상세한 설명이 포함된다.

효소 안정화제가 또한 세정 조성물에 사용될 수 있다. 상기 효소 안정화제에는 프로필렌 글리콜 (바람직하게는 약 1 % 내지 약 10 %), 소듐 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 1 %) 및 칼슘 포르메이트 (바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 1 %) 가 포함된다.

본 발명의 변이체는 경질 표면 세정 조성물에 유용하다. 본원에서 사용되는 "경질 표면 세정 조성물" 은 경질 표면, 예를 들어 바닥, 벽, 욕실 타일 등을 세정하기 위한 액체 및 과립형 세제 조성물을 의미한다. 본 발명의 경질 표면 세정 조성물은 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트의 유효량, 바람직하게는 조성물의 프로테아제 콘쥬게이트의 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%, 더욱 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 더욱 더 바람직하게는 약 0.05 중량% 내지 약 1 중량% 를 함유한다. 한 개 이상의 프로테아제 콘쥬게이트를 함유하는 것 외에도, 상기 경질 표면 세정 조성물은 전형적으로 계면활성제 및 수용성 격리 빌더를 함유한다. 그러나, 분사식 윈도우 클리너와 같이 특정의 구체화된 제품에서는, 유리 표면 상에 막 및/또는 줄무늬의 잔류물을 생성할 수 있으므로 계면활성제가 때때로 사용되지 않는다.

존재할 경우, 계면활성제 성분은 본원의 조성물의 0.1 % 만큼이 함유될 수 있으나, 전형적으로는 조성물은 약 0.25 % 내지 약 10 %, 더욱 바람직하게는 약 1 % 내지 약 5 % 의 계면활성제를 함유할 것이다.

전형적으로는 조성물은 약 0.5 % 내지 약 50 %, 바람직하게는 약 1 % 내지 약 10 % 의 세제 빌더를 함유할 것이다.

바람직하게는, pH 는 약 7 내지 12 의 범위에 있어야 한다. 조정이 요구되는 경우, 통상적인 pH 조정제, 예를 들어 수산화나트륨, 탄산나트륨 또는 염화수소산이 사용될 수 있다.

용매가 조성물에 함유될 수 있다. 유용한 용매에는 글리콜 에테르, 예를 들어 디에틸렌글리콜 모노헥실 에테르, 디에틸렌글리콜 모노부틸 에테르, 에틸렌글리콜 모노부틸 에테르, 에틸렌글리콜 모노헥실 에테르, 프로필렌글리콜 모노부틸 에테르, 디프로필렌글리콜 모노부틸 에테르, 및 디올, 예를 들어 2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄디올 및 2-에틸-1,3-헥산디올이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 사용될 경우, 상기 용매는 전형적으로는 약 0.5 % 내지 약 15 %, 더욱 바람직하게는 약 3 % 내지 약 11 % 의 수준으로 존재한다.

부가적으로, 조성물을 표면에 "완전 강도" 로 적용한 후 표면을 헹구지 않는 경우, 표면으로부터의 조성물의 더욱 빠른 증발을 촉진하기 위해, 고휘발성 용매, 예를 들어 이소프로판올 또는 에탄올이 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 사용될 경우, 휘발성 용매는 전형적으로 조성물에서 약 2 % 내지 약 12 % 의 수준으로 존재한다.

실시예 7 - 12

액체 경질 표면 세정 조성물

	실시예 7	실시예 8	실시예 9	실시예 10	실시예 11	실시예 12
실시예 3 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.05 %	0.50 %	0.02 %	0.03 %	0.30 %	0.05 %
EDTA	-	-	2.90 %	2.90 %	-	-
소듐 시트레이트	-	-	-	-	2.90 %	2.90 %
NaC₁₂알킬-벤젠 술포네이트	1.95 %	-	1.95 %	-	1.95 %	-
NaC₁₂알킬술페이트	-	2.20 %	-	2.20 %	-	2.20 %
NaC₁₂(에톡시)술페이트	-	2.20 %	-	2.20 %	-	2.20 %
C₁₂디메틸아민 옥시드	-	0.50 %	-	0.50 %	-	0.50 %
소듐 쿠멘 술포네이트	1.30 %	-	1.30 %	-	1.30 %	-
헥실 카르비톨	6.30 %	6.30 %	6.30 %	6.30 %	6.30 %	6.30 %
물	90.4 %	88.3 %	87.53 %	85.87 %	87.25 %	85.85 %

모든 제형물은 pH 7 로 조정된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 식기세척 조성물은 한 개 이상의 본 발명의 변이체를 함유한다. 본원에서 사용되는 "식기세척 조성물" 은 과립 및 액체 형태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 모든 형태의 식기 세정용 조성물을 의미한다.

실시예 13 - 16

액체 식기 세제

	실시예 13	실시예 14	실시예 15	실시예 16
실시예 1 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.05 %	0.50 %	0.02 %	0.40 %
C₁₂-C₁₄N-메틸 글루카미드	0.90 %	0.90 %	0.90 %	0.90 %
C₁₂에톡시 (1) 술페이트	12.0 %	12.0 %	12.0 %	12.0 %
2-메틸 운데칸산	4.50 %	4.50 %	4.50 %	4.50 %
C₁₂에톡시 (2) 카르복실레이트	4.50 %	4.50 %	4.50 %	4.50 %
C₁₂알콜 에톡실레이트 (4)	3.00 %	3.00 %	3.00 %	3.00 %
C₁₂아민 옥시드	3.00 %	3.00 %	3.00 %	3.00 %
소듐 쿠멘 술포네이트	2.00 %	2.00 %	2.00 %	2.00 %
에탄올	4.00 %	4.00 %	4.00 %	4.00 %
Mg²⁺(MgCl₂로서)	0.20 %	0.20 %	0.20 %	0.20 %
Ca²⁺(CaCl₂로서)	0.40 %	0.40 %	0.40 %	0.40 %
물	65.45 %	65 %	65.48 %	65.1 %

모든 제형물은 pH 7 로 조정된다.

실시예 17 - 19

액체 직물 세정 조성물

	실시예 17	실시예 18	실시예 19
실시예 4 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.05 %	0.03 %	0.30 %
소듐 C₁₂-C₁₄알킬 술페이트	20.0 %	20.0 %	20.0 %
2-부틸 옥탄산	5.0 %	5.0 %	5.0 %
소듐 시트레이트	1.0 %	1.0 %	1.0 %
C₁₀알콜 에톡실레이트 (3)	13.0 %	13.0 %	13.0 %
모노에탄올아민	2.50 %	2.50 %	2.50 %
물/프로필렌 글리콜/에탄올 (100:1:1)	58.45 %	58.47 %	58.20 %

퍼스널 케어 조성물

본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는 특히 퍼스널 케어 조성물, 예를 들어 리브-온 (leave-on) 및 린스-오프 (rinse-off) 헤어 컨디셔너, 샴푸, 리브-온 및 린스-오프 여드름 조성물, 페이셜 밀크 및 컨디셔너, 샤워 젤, 비누, 거품성 및 비-거품성 페이셜 클렌져, 화장품, 손, 얼굴, 및 바디 로숀, 보습제, 패치 및 마스크,리브-온 페이셜 보습제, 화장용 및 클렌징 와이프, 구강 케어 조성물, 생리대 및 콘택트 렌즈 케어 조성물에 사용하기 적합하다. 본 발명의 퍼스널 케어 조성물은 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트 및 퍼스널 케어 담체를 함유한다.

예시를 위하여, 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트는 하기 참고문헌에 기재된 조성물에 함유되기에 적합하다: 미국 특허 제 5,641,479 호, Linares 등, 1997. 6. 24. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,599,549 호 Wivell 등, 1997. 2. 4. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,585,104 호, Ha 등, 1996. 12. 17. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,540,852 호, Kefauver 등, 1996. 7. 30. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,510,050 호, Dunbar 등, 1996. 4. 23. 허여 (피부 클렌져); 미국 특허 제 5,612,324 호, Guang Lin 등, 1997. 3. 18. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,587,176 호, Warren 등, 1996. 12. 24. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,549,888 호, Venkateswaran, 1996. 8. 27. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,470,884 호, Corless 등, 1995. 11. 28. 허여 (항-여드름 제제); 미국 특허 제 5,650,384 호, Gordon 등, 1997. 7. 22. 허여 (샤워 젤); 미국 특허 제 5,607,678 호, Moore 등, 1997. 3. 4. 허여 (샤워 젤); 미국 특허 제 5,624,666 호, Coffindaffer 등, 1997. 4. 29. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,618,524 호, Bolich 등, 1997. 4. 8. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,612,301 호, Inman, 1997. 3. 18. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,573,709 호, Wells, 1996. 11. 12. 허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 샴푸); 미국 특허 제 5,482,703 호, Pings, 1996. 1. 9. 허여 (헤어 컨디셔너및/또는 샴푸); 미국 특허 제 Re. 34,584 호, Grote 등, 1994. 4. 12. 재허여 (헤어 컨디셔너 및/또는 삼푸); 미국 특허 제 5,641,493 호, Date 등, 1997. 6. 24. 허여 (화장품); 미국 특허 제 5,605,894 호, Blank 등, 1997. 2. 25. 허여 (화장품); 미국 특허 제 5,585,090 호, Yoshioka 등, 1996. 12. 17. 허여 (화장품); 미국 특허 제 4,939,179 호, Cheney 등, 1990. 7. 3. 허여 (손, 얼굴 및/또는 바디 로션); 미국 특허 제 5,607,980 호, McAtee 등, 1997. 3. 4. 허여 (손, 얼굴 및/또는 바디 로션); 미국 특허 제 4,045,364 호, Richter 등, 1977. 8. 30. 허여 (화장용 및 클렌징 와이프); 유럽 특허 출원 EP 0 619 074, Touchet 등, 1994. 10. 12. 공개 (화장용 및 클렌징 와이프); 미국 특허 제 4,975,217 호, Brown-Skrobot 등, 1990. 12. 4. 허여 (화장용 및 클렌징 와이프); 미국 특허 제 5,096,700 호, Seibel, 1992. 3. 17. 허여 (구강 세정 조성물); 미국 특허 제 5,028,414 호, Sampathkumar, 1991. 7. 2. 허여 (구강 세정 조성물); 미국 특허 제 5,028,415 호, Benedict 등, 1991. 7. 2. 허여 (구강 세정 조성물); 미국 특허 제 5,028,415 호, Benedict 등, 1991. 7. 2. 허여 (구강 세정 조성물); 미국 특허 제 4,863,627 호, Davies 등, 1989. 9. 5. (콘택트 렌즈 세정 용액); 미국 특허 제 Re. 32,672, Huth 등, 1988. 5. 24. 재허여 (콘택트 렌즈 세정 용액); 및 미국 특허 제 4,609,493 호, Schafer, 1986. 9. 2. 허여 (콘택트 렌즈 세정 용액).

본 발명의 구강 세정 조성물을 보다 설명하기 위해서, 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트의 약물학적으로 허용되는 양이 치아 또는 의치로부터 단백질성 얼룩 제거에 유용한 조성물 내에 함유된다. 본원에서 사용되는 "구강 세정 조성물" 은 덴티프리스, 치약, 크림 치약, 가루 치약, 구강청결제, 구강용 스프레이, 구강용 젤, 츄잉 검, 약용 박하 드롭스 (lozenges), 구강용 향 (sachets), 정제, 바이오젤, 예방용 페이스트, 치과용 치료 용액 등을 의미한다. 구강 세정 조성물은, 바람직하게는 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 20 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.001 중량% 내지 약 10 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량% 의 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트, 및 약물학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 본원에서 사용되는 "약물학적으로 허용가능한" 은, 부적절한 독성, 비상용성, 불안정성, 과민증, 알러지성 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직에 접촉하여 사용되기에 적합하며, 합리적인 효과/위험 비로 균형잡힌 약물, 의약 또는 불활성 성분을 의미한다.

전형적으로는, 구강 세정 조성물의 구강 세정 성분들의 약물학적으로 허용가능한 구강 세정 담체 성분은, 일반적으로 조성물의 약 50 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 65 중량% 내지 약 99.99 중량%, 보다 바람직하게는 약 65 중량% 내지 약 99 중량%로 함유될 것이다.

본 발명의 구강 세정 조성물에 함유될 수 있는 약물학적으로 허용가능한 담체 성분 및 선택적 성분은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 구강 세정 조성물에 유용한 매우 다양한 조성물 유형, 담체 성분 및 선택적 성분이 상기에 인용된 참고 문헌에 개시되어 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 구강 외부의 의치 세정을 위한 의치 세정 조성물은 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트를 함유한다. 상기 의치세정 조성물은 유효량, 바람직하게는 조성물의 약 0.0001 중량% 내지 약 50 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.001 중량% 내지 약 35 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 20 중량% 의 한 개 이상의 프로테아제 콘쥬게이트, 및 의치 세정 담체를 함유한다. 거품 정제 등과 같은 다양한 의치 세정 조성물 포맷이 당 분야에 널리 공지되어 있으며 (미국 특허 제 5,055,305, Young 참조), 일반적으로 의치로부터의 단백질성 얼룩 제거를 위해서는, 한 개 이상의 프로테아제 콘쥬게이트가 혼입되기에 적당하다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 콘택트 렌즈 세정 조성물은 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트를 함유한다. 상기 콘택트 렌즈 세정 조성물은 유효량, 바람직하게는 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 50 중량%, 보다 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 약 20 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 1 중량% 내지 약 5 중량% 의 한 개 이상의 프로테아제 콘쥬게이트, 및 콘택트 렌즈 세정 담체를 함유한다. 정제, 액체 등과 같은 다양한 콘택트 렌즈 세정 조성물 포맷은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 콘택트 렌즈로부터의 단백질성 얼룩 제거를 위해서는, 한 개 이상의 본 발명의 프로테아제 콘쥬게이트의 혼입에 적당하다.

실시예 20 - 23

콘택트 렌즈 세정 용액

	실시예 20	실시예 21	실시예 22	실시예 23
실시예 5 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.01%	0.5%	0.1%	2.0%
글루코오스	50.0%	50.0%	50.0%	50.0%
비이온성 계면활성제 (폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체)	2.0%	2.0%	2.0%	2.0%
음이온성 계면활성제 (폴리옥시에틸렌-알킬페닐에테르 소듐 술프릭에스테르)	1.0%	1.0%	1.0%	1.0%
염화나트륨	1.0%	1.0%	1.0%	1.0%
보락스	0.30%	0.30%	0.30%	0.30%
물	45.69%	45.20%	45.60%	43.70%

실시예 24 - 27

바디워시 제품

	실시예 24	실시예 25	실시예 26	실시예 27
물	62.62%	65.72%	57.72%	60.72%
디소듐 EDTA	0.2%	0.2%	0.2%	0.2%
글리세린	3.0%	3.0%	3.0%	3.0%
폴리쿼터늄 10	0.4%	0.4%	0.4%	0.4%
소듐 라우레트 술페이트	12.0%	12.0%	12.0%	12.0%
코카미드 MEA	2.8%	2.8%	2.8%	2.8%
소듐 라우라포아세테이트	6.0%	6.0%	6.0%	6.0%
미리스트산	1.6%	1.6%	1.6%	1.6%
마그네슘 술페이트 헵타히드레이트	0.3%	0.3%	0.3%	0.3%
트리히드록시스테아린	0.5%	0.5%	0.5%	0.5%
PEG-6 카프릴산/카프르산 트리글리세리드	3.0%	-	-	-
코토네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르	3.0%	-	-	-
베헤네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르	3.0%	-	4.0%	-
페트로라툼	-	4.0%	8.0%	-
미네랄 오일	-	-	-	6.0%
DMDM 히단토인	0.08%	0.08%	0.08%	0.08%
실시예 6 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.1%	2.0%	2.0%	5.0%
시트르산	1.40%	1.40%	1.40%	1.40%

실시예 28 - 31

세안 제품

	실시예 28	실시예 29	실시예 30	실시예 31
물	66.52%	65.17%	68.47%	68.72%
디소듐 EDTA	0.1%	0.1%	0.2%	0.2%
시트르산	-	-	1.4%	1.4%
소듐 라우레트-3 술페이트	3.0%	3.5%	-	-
소듐 라우레트-4 카르복실레이트	3.0%	3.5%	-	-
라우레트-12	1.0%	1.2%	-	-
폴리쿼터늄 10	-	-	0.4%	0.4%
폴리쿼터늄 25	0.3%	0.3%	-	-
글리세린	3.0%	3.0%	3.0%	3.0%
소듐 라우로암포아세테이트	-	-	6.0%	6.0%
라우르산	6.0%	6.0%	3.0%	3.0%
미리스트산	-	-	3.0%	3.0%
마그네슘 술페이트 헵타히드레이트	2.3%	2.0%	2.0%	2.0%
트리에탄올 아민	4.0%	4.0%	4.0%	4.0%
트리히드록시스테아린	0.5%	0.5%	0.5%	0.5%
베헤네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르	2.0%	2.0%	-	-
코토네이트 지방산의 수크로오스 폴리에스테르	3.0%	2.0%	-	-
PEG-6 카프릴산/카프르산 트리글리세리드	-	-	-	2.0%
페트로라툼	-	-	4.0%	-
미네랄 오일	-	-	-	2.0%
코카미도프로필 베타인	2.0%	3.0%	1.8%	1.8%
라우릴 디메틸아민 옥시드	1.0%	1.2%	1.2%	1.2%
덱스 판테놀	1.0%	0.25%	0.25%	-
DMDM 히단토인	0.08%	0.08%	0.08%	0.08%
실시예 2 의 프로테아제 콘쥬게이트	1.0%	2.0%	0.5%	0.5%
향료	0.2%	0.2%	0.2%	0.2%

실시예 32 - 33

리브-온 피부 보습용 조성물

	실시예 32	실시예 33
글리세린	5.0%	-
스테아르산	3.0%	-
C_11-13이소파라핀	2.0%	-
글리콜 스테아레이트	1.5%	-
프로필렌 글리콜	-	3.0%
미네랄 오일	1.0%	10.0%
참기름	-	7.0%
페트로라툼	-	1.8%
트리에탄올아민	0.7%	-
세틸 아세테이트	0.65%	-
글리세릴 스테아레이트	0.48%	2.0%
TEA 스테아레이트	-	2.5%
세틸 알콜	0.47%	-
라놀린 알콜	-	1.8%
DEA-세틸 포스페이트	0.25%	-
메틸파라벤	0.2%	0.2%
프로필파라벤	0.12%	0.1%
카르보머 (Carbomer) 934	0.11%	-
디소듐 EDTA	0.1%	-
실시예 4 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.1%	0.5%
물	84.32%	71.1%

실시예 34

클렌징 와이프 조성물

프로필렌 글리콜	1.0%
암모늄 라우릴 술페이트	0.6%
숙신산	4.0%
소듐 숙시네이트	3.2%
Triclosan	0.15%
실시예 1 의 프로테아제 콘쥬게이트	0.05%
물	91.0%

상기 조성물은, 흡수용 시트의 약 250 중량% 인 셀룰로오스 및/또는 폴리에스테르로 구성되는 흡수용 직포 시트 상에 주입된다.

Claims

첫 번째 에피토프 영역, 두 번째 에피토프 영역 및 세번째 에피토프 영역을 포함하는 프로테아제 부분 및 각각 프로테아제 부분의 에피토프 보호 위치에 공유 부착되는 한 개 이상의 첨가 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 프로테아제 콘쥬게이트에 있어서,

(a) 첫 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215 및 216 로 구성된 군으로부터 선택되며;

(b) 두 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 25, 26, 27, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 144 및 145 로 구성된 군으로부터 선택되고;

(c) 세번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 9, 10, 22, 23, 24, 62, 63, 143, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제 콘쥬게이트.
제 1 항에 있어서, 각 첨가 부분이 독립적으로 하기 구조를 갖는 프로테아제콘쥬게이트:

(식 중, X 는 아무 것도 없는 것 및 연결 부분으로 구성된 군으로부터 선택되며; R₁은 아무 것도 없는 것, 첫 번째 폴리펩티드 및 첫 번째 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; R₂는 아무 것도 없는 것, 두 번째 폴리펩티드 및 두 번째 중합체로 구성된 군으로부터 선택되고; X, R₁및 R₂의 한 개 이상은 아무 것도 없는 것이 아니다).
제 2 항에 있어서, 프로테아제 부분이 부모 아미노산 서열의 변형된 아미노산 서열을 갖는 프로테아제 콘쥬게이트에 있어서, 변형된 아미노산 서열에는 한 개 이상의 에피토프 보호 위치에서 아미노산을 치환한 치환이 포함되며, 각 첨가 부분은 한 개의 치환 아미노산에 공유 부착되는 프로테아제 콘쥬게이트.
제 3 항에 있어서, 치환하는 아미노산이 시스테인인 프로테아제 콘쥬게이트.
제 4 항에 있어서, 부모 아미노산 서열이 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스베르그 (Carlsberg), 서브틸리신 DY, 서브틸리신 309, 프로티나아제 K, 테르미타아제, 프로테아제 A, 프로테아제 B, 프로테아제 C 및 프로테아제 D, 및 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제 콘쥬게이트.
제 5 항에 있어서,

(a) 첫 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 17, 40, 41, 43, 67, 86, 87, 89, 206, 209, 214 및 215 로 구성된 군으로부터 선택되며;

(b) 두 번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 27, 47, 48, 50, 52, 102, 127, 128, 130, 131, 132, 134, 138 및 141 로 구성된 군으로부터 선택되고;

(c) 세번째 에피토프 영역에 대한 에피토프 보호 위치는, 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 22, 23, 24, 143, 146, 155, 173, 189, 197, 203, 204, 253, 254, 265 및 275 로 구성된 군으로부터 선택되는 프로테아제 콘쥬게이트.
제 6 항에 있어서, R₁및 R₂가 각각 아무 것도 없는 것인 프로테아제 콘쥬게이트.
제 6 항에 있어서, R₁이 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스베르그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 309, 프로티나아제 K, 테르미타아제, 프로테아제 A, 프로테아제 B, 프로테아제 C 및 프로테아제 D, 및 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 첫 번째 폴리펩티드인 프로테아제 콘쥬게이트.
제 8 항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드가 서브틸리신 BPN' 에 대응하는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 17, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 36, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 62, 63, 67, 86, 87, 89, 91, 99, 100, 101, 102, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 154, 155, 156, 157, 172, 173, 187, 189, 195, 197, 203, 204, 206, 209, 210, 212, 213, 214, 215, 216, 253, 254, 256, 265, 267, 269, 271, 272 및 275 로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서, 연결 부분 또는 프로테아제 부분에 공유 부착되는 프로테아제 콘쥬게이트.
제 9 항에 있어서, X 가 아무 것도 없는 것이고, 프로테아제 부분 및 첫 번째 폴리펩티드가 디술피드 결합을 통해 공유 부착된 프로테아제 콘쥬게이트.
제 6 항에 있어서, R₂가 아무 것도 없는 것이고, 첫 번째 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 프로테아제 콘쥬게이트.
제 11 항에 있어서, 한 개 이상의 첨가 부분이, 첫 번째 에피토프 영역, 두 번째 영역 및 세번째 영역으로 구성된 군으로부터 선택되는 에피토프 영역에 대한에피토프 보호 위치에 공유 부착되는 프로테아제 콘쥬게이트.
제 1 항에 따른 프로테아제 콘쥬게이트 및 세정 조성물 담체를 함유하는 세정 조성물.
제 1 항에 따른 프로테아제 콘쥬게이트 및 퍼스널 케어 담체를 함유하는 퍼스널 케어 조성물.