KR20070004706A - 개구리밥에서의 플라스미노겐 및 마이크로플라스미노겐의발현 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편을 개구리밥 발현 시스템에서 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 개구리밥 발현 시스템을 사용하여 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐을 높은 수준으로 발현시킬 수 있다는 것을 새롭게 확인하였다. 본 발명의 개구리밥에서 생산된 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐을 활성화시켜 단백질 분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개구리밥에서 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편의 발현 방법, 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편 발현용 발현 카세트로 형질전환된 개구리밥 식물, 및 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 개구리밥에서 그것의 발현을 증가시키기 위해 변형된 것이다.

개구리밥, 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐

Description

개구리밥에서의 플라스미노겐 및 마이크로플라스미노겐의 발현 방법 {EXPRESSION OF PLASMINOGEN AND MICROPLASMINOGEN IN DUCKWEED}

본 발명은 재조합 단백질 생산 시스템에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 재조합 플라스미노겐과 재조합 마이크로플라스미노겐을 개구리밥에서의 발현시키는 방법 및 상기 발현에 사용되는 조성물에 관한 것이다.

개구리밥은 단자엽의 개구리밥 과(Lemnaceae)에 유일하게 속하는 식물이다. 5가지의 속 및 38가지의 종에 속하는 식물들은 모두, 식물지리학적으로 전 세계적으로 분포되어 있으며, 자유롭게 부유하는 담수 식물이다(Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae - A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). 가장 형태학적으로 작은 식물로 알려져 있지만, 대부분의 개구리밥 종들은 뿌리, 줄기, 꽃, 종자 및 잎을 포함하는, 훨씬 큰 식물의 조직 및 기관을 모두 가지고 있다. 개구리밥 종들에 대한 연구가 광범위로 진행되고 있으며, 이들의 생태학, 계통 분류학, 생활주기, 대사, 질병 및 해충 감수성, 생식 생물학, 유전자 구조 및 세포 생물학을 상세히 다루고 있는 문헌들이 상당히 있다(Hillman (1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae -A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).

개구리밥의 생장 습성은 미생물 배양 방법에 대해 이상적이다. 효모의 무성 번식과 유사한 거시적인 방식으로, 상기 식물은 새로운 잎의 무성적인 출아를 통해 빠르게 증식한다. 이러한 증식은 분열 세포에서의 식물 발아에 의해 이루어진다. 분열 부위는 작으며 잎의 하단면에서 발견된다. 분열 세포는 잎의 주간엽맥(midvein) 양쪽에 위치한 두개의 포켓에 있다. 작은 주간엽맥 부위에서 또한 뿌리가 시작되고, 작은 주간엽맥은 각 잎을 그 모체 잎에 연결시키는 줄기가 발생되는 부위이다. 분열 포켓은 조직 플랩(flap)에 의해 보호된다. 잎은 이들 포켓에서 엇갈리게 발아한다. 2배 증식되는 시간(Doubling time)은 종에 따라 다양하며, 짧게는 20-24시간이다(Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko and Mudd (1970) Plant Plzysiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 316).

개구리밥을 고밀도 배양하는 경우, 시간 단위당 최고 생중량(biomass) 축적율이 산출되었으며(Landolt and Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae A Monography Study Vol2: Phytochemistry, Pthysiology, Application, Bibliography, Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich), 건중량은 생체중량(fresh weight)의 6-15%에 이른다(Tillberg et al. (1979) Physiol . Plant . 46:5; Landolt (1957) Ber . Schweiz . Bot . Ges . 67:271; Stomp, unpublished data). 여러 조건에서 증식시킨 많은 개구리밥 종들 의 단백질 함량은, 건중량의 15-45%인 것으로 보고된 바 있다(Chang et al (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang and Chin (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251). 이러한 수치를 보면, 개구리밥에서의 배지 1 L당 단백질 생산 수준은 효모 유전자 발현 시스템과 동일한 규모이다.

아가로박테리움 매개성 유전자 전이, 탄도 충격(ballistic bombardment) 또는 전기충격을 포함한 여러가지 방법들중 임의의 방법에 의해, 원하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트로, 개구리밥 식물 또는 개구리밥 결절 배양물을 효율적으로 형질전환시킬 수 있다. 원하는 뉴클레오티드 서열과 선별 물질에 대해 내성을 부여하는 유전자 둘다를 개구리밥 세포에 형질전환시킨 후, 상기 선별 물질이 함유된 배지에서 형질전환된 세포를 배양함으로써, 안정적인 개구리밥 형질전환체를 분리할 수 있다(Stomp 등의 미국 특허 제 6,040,498호를 참조).

개구리밥 유전자 발현 시스템은 수많은 연구와 상업적 응용에 유용할 수 있는 중요한 기술을 제공한다. 식물 분자생물학 연구의 전반적인 측면에서, 효모의 실험적인 편의성을 갖추고 있으며 조작가능한 분화된 식물 시스템은, 분리한 유전자의 발생학적 및 생리학적 기능을 분석하는데 매우 신속한 시스템을 제공한다. 유용한 폴리펩티드의 산업적 생산에 있어서, 개구리밥을 근간으로하는 시스템은 기존의 미생물 또는 세포 배양 시스템 이상으로 수많은 이점을 가지고 있다. 식물은 포유류 세포와 유사한 번역후 처리 과정을 가지고 있어, 생물학적으로 활성인 포유류의 폴리펩티드를 미생물 세포를 이용하여 생산하는 경우에 발생되는 한가지 주된 문제점을 해소시키며, 식물 시스템은 미생물 시스템에서는 흔히 결여되어 있는 다수 서브유닛 단백질의 조합 능력을 지닌 것으로 입증되었다(Hiatt (1990) Nature 3 34:469). 개구리밥의 생중량을 재조합 단백질의 산업적 생산에 필요한 수준으로 규모를 확대시키는 것이 포유류 세포를 유사한 규모로 확대시키는 것보다 빠르고 비용면에서도 효율적이며, 제안된 다른 식물 생산 시스템, 예컨대 콩 및 담배들과는 달리, 개구리밥은 완전히 억제되고 조절된 생중량 생산 용기에서 생육가능하여 기존의 단백질 생산의 산업적 기반 조직에 상기 시스템을 용이하게 통합시킬 수 있다.

따라서, 개구리밥에서 원하는 단백질을 발현하기 위한 방법과 발현 조성물의 최적화가 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 개구리밥 발현 시스템에서 재조합 플라스미노겐(plasminogen), 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편을 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 개구리밥 발현 시스템은 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편을 높은 수준으로 생산하도록 최적화된다. 개구리밥에서 생산된 플라스미노겐와 마이크로플라스미노겐을 활성화하여 단백질분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 개구리밥에서의 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐의 발현 방법, 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐 발현용 발현 카세트로 형질전환된 개구리밥 식물, 및 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 상기 뉴클레오티드 서열은 개구리밥에서 그것의 발현을 증가시키기 위해 변형된 것이다.

따라서, 일 예로, 본 발명은 개구리밥에서의 플라스미노겐을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자로 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물세포 또는 개구리밥 결절(nodule)을 배양하는 단계, 및 상기 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물세포로부터 플라미노겐을 수집하는 단계를 포함한다. 일부 예들에서, 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하도록 연결되어 있다.

다른 예로, 본 발명은 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있으며 마이크로플라스미노겐을 배양 배지로 분비시키는 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자로, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물 배양물, 개구리밥 식물세포 또는 개구리밥 결절 배양물을, 개구리밥 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 개구리밥 배양 배지에서 상기 마이크로플라미노겐을 수집하는 단계를 포함하는 개구리밥에서 마이크로플라스미노겐을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 개구리밥에서 플라스미노겐이나 마이크로플라스미노겐을 발현용 발현 카세트로 형절전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 결절 및 개구리밥 식물 세포를 제공한다. 또한, 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐을 코딩하며, 개구리밥에서 최적화된 코돈을 포함하는, 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 상기한 측면 및 그외 측면들은 하기 상세한 설명에서 구체적으로 설명한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 개구리밥 발현 시스템에서의 재조합 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 신규한 발견은 개구리 발현 시스템을 사용하여 플라스미노겐 및 마이크로플라스미노겐을 높은 수준으로 생산할 수 있다는 것이다. 개구리밥에서 생산된 플라스미노겐 및 마이크로플라스미노겐을 활성화시켜 단백질분해 활성을 가지는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

플라스미노겐은 포유류에서 기본적인 피브린분해 효소인 플라스민의 불활성의 전구체 형태이다. 또한, 플라스민은 세포 이동, 조직 리모델링, 및 세균 침투에서 중요한 역할을 한다. 플라스민은 트립신보다 선택성이 보다 높으며, Lys-Xaa와 Arg-Xaa 사이를 선호적으로 절단 세린 단백질분해효소이다. 플라스미노겐 활성자, 예컨대 플라스미노겐 활성자(tPA) 또는 뉴로키나제는, 인간 플라스미노겐 분자의 Arg₅₆₀-Va1₅₆₁ 결합을 절단하여, 활성형의 플라스민을 생성한다. 제조된 플라스민의 2개의 체인은 체인간의 이황화 결합으로 결합된다. 경쇄(25 kDa)는 (촉매 삼분자(catalytic triad)를 포함하는) 촉매 센터를 가지고 있으며, 트립신과 그외 세린 단백질 분해효소와 서열 유사성을 공유하고 있다. 중쇄(60 kDa)는 크링글(kringle)이라고 하는 유사성이 높은 5개의 삼중-루프 구조를 이룬다. 일부 크링글은 피브린과 플라스미노겐/플라스민 상호작용을 매개하는 라이신 결합부를 포함하고 있다. 플라스민은 펩티다제 패밀리 S1에 속한다.

마이크로플라스미노겐은 펩티드 가닥과 N-말단에 부착된 몇개의 크링글 5 잔기(a few residues of kringle 5 attached at its N-terminal end)를 연결시키는 가닥을 가진, 플라스미노겐의 전효소(proenzyme) 도메인으로 이루어져 있다. 이는 플라스미노겐에 대한 플라스민의 작용에 의해 형성된다. 예로, Shi et al (1980) J. Biol. Chem. 263:17071-5를 참조한다. 플라스미노겐와 유사하게, 마이크로플라스미노겐은 tPA와 유로키나제에 의해 활성화되며, 단백질 분해로 활성의 분자가 생성된다. 인간 마이크로플라스민의 분자량은 약 29 kDa이며, 플라스민과 비교했을때 피브린에 대한 친수성이 보다 낮다.

플라스민과 마이크로플라스민은 심근 경색, 폐색성 발작(occlusive stroke), 심부 정맥 혈전증, 및 말초 동맥 질환을 포함한, 혈전용해 요법(thrombolytic therapy)에 다양한 용도로의 사용이 제안되었다. 그 예로, 미국 특허 제 5,407,673호, 제 6,355,243호, 미국 특허 출원번호 제 20030175264호, Lapchak et al. (2002) Stroke 33:2279-2284, 및 Nagai et al. (2003) J. Thromb. Haemost. 1:307-13를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 상기한 요법에 플라스민과 마이크로플라스민을 이용하는 한가지 목적은 tPA, 유로키나제 및 스트렙토키나제와 같은 플라스미노겐 활성자를 이용하여 요법의 부작용을 방지하는 것이다. 부작용으로는, 위장 및 두개내 출혈이 있다. 그러나, 안정적인 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐 전구체 단백질을 다량으로 생산하기 어려워, 치료제로서 플라스민과 마이크로플라스민을 사용하는 것은 다소 한계가 있다.

재조합 시스템에서 다량의 플라스미노겐을 발현시키는 것이 혈전 용해 요법에서 사용하기 위한 플라스미노겐을 수득하는 간편한 방법이지만, 세포내 플라스미노겐 활성자는 거의 모든 포유류 세포 타입에 존재하기 때문에, 발현 시스템에서 무손상 인간 플라스미노겐을 발현시키긴 매우 어렵다. 이러한 활성자의 존재는 생산된 플라스미노겐의 분해를 초래한다. 그 예로, Busy et al. (1988) Fibrinolysis 2:64를 참조한다.

본 발명은 안정한 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐을 높은 수준으로 발현할 수 있는 발현 시스템을 제공함으로써, 이러한 문제를 해결한다. 따라서, 일예로, 본 발명은 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자로 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물 또는 개구리 식물 세포를 배양하는 단계, 및 상기 개구리밥 식물이나 개구리밥 식물 세포로부터 플라스미노겐을 수집하는 단계를 포함하는, 개구리밥에서 플라스미노겐을 생산하는 방법을 제공한다. 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하도록 연결될 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 개구리밥에서 플라스미노겐을 높은 수준으로 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 예에서, 개구리밥 식물이나 개구리밥 식물 세포내의 수용성 단백질의 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상 또는 약 8% 이상이 플라스미노겐이다.

또한, 본 발명은 개구리밥에서 플라스미노겐을 생산하는 단계를 포함하는, 개구리밥에서 안정적인 플라스미노겐을 생산하는데 있어서의 개선 방법을 제공한다. 렘나(Lemmna)에서 생산된 플라스미노겐은 안정적이며, 렘나 조직 추출물에 하룻밤 보관하였을때 그 활성은 10% 미만으로 소실된다. 또한, 렘나에서 생산된 플라스미노겐은 냉동-해동 사이클 실시 이후에 렘나 조직 추출물내에서 10% 미만으로 분해된다.

다른 예에서, 본 발명은, 개구리밥 배양 배지에서 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 이와 작동가능하도록 연결된 마이크로플라스미노겐을 배양 배지로분비시키는 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는, 핵산 분자로 안정적으로 형질전환된, 개구리밥 식물 배양물 또는 개구리밥 결절 배양물을 배양하는 단계, 및 개구리밥 배양 배지에서 마이크로플라스미노겐을 수집하는 단계를 포함하는, 개구리밥에서 마이크로플라스미노겐 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 방법을 이용하여 개구리밥에서 마이크로플라스미노겐을 높은 수준을 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 예들에서, 개구리밥 배양 배지는 정량적 웨스턴 블롯팅으로 측정시, 약 1 mg/L 이상, 약 2 mg/L 이상, 약 5 mg/L 이상, 약 10 mg/L 이상, 약 15 mg/L 이상, 또는 약 20 mg/L의 마이크로플라스미노겐을 함유한다.

본 발명은 플라스미노겐 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 안정적으로 형질전환시킨 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물세포를 배양하는 단계, 및 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물세포 또는 개구리밥 배양 배지로부터 플라스미노겐 절편을 수집하는 단계를 포함하는 개구리밥에서 플라스미노겐 절편을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 플라스미노겐 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드에 대한 코딩 서열과 작동가능하도록 연결될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 일부 예들에서, 개구리밥에서의 발현을 증가시키기 위해, 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 또는 그의 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 변형한다. 이러한 변형의 예로는, 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐의 코딩 서열에 개구리밥 선호 코돈 사용, 코딩 서열의 상위에 삽입된 식물 인트론을 포함하는 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열의 사용, 및 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 번역을 증가시키는 리더 서열의 사용을 포함한다. 일부 예들에서, 이러한 변형예 2이상을 병용하여 사용한다. 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하도록 연결된 경우, 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 역시 개구리밥 선호 코돈을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 개구리밥에서 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐을 발현시킬 수 있는 발현 카세트로 형질전환된, 개구리밥 식물, 개구리밥 결절 및 개구리밥 식물 세포를 포함한다. 또한, 개구리밥에서 최적화된 코돈을 포함하는, 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

정의:

"폴리펩티드"는 단일 중합형의 또는 다중 중합형의 단백질 또는 펩티드를 의미한다.

"생물학적으로 활성의 폴리펩티드"는 생물학적 의미로 폴리펩티드에 정상적으로 부여된 한가지 이상의 기능이나 활성 세트를 수행할 수 있는 능력을 가진 폴리펩티드를 의미한다. 플라스미노겐이나 마이크로플라스미노겐과 같은 단백질 분해효소 전구체에 대해서, 생물학적 활성은 단백질 분해에 의해 활성의 분자를 생산하기 위하여, 폴리펩티드가 활성화되는 능력을 포함한다. 활성화 이후에, 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐의 단백질 분해 활성은, 본원에 기재된 바와 같이 발색성 기질을 이용하는 분석법을 포함하여, 당업계에 공지된 분석법으로 측정할 수 있다.

용어 "발현" 또는 "생산"은 전사, 번역 및 유전자 산물의 조합을 포함한, 유전자 산물의 생합성을 의미힌다.

용어 "개구리밥"은 개구리밥 과(Lemnaceae)에 속하는 일원을 의미한다. 상기 과는 현재 5개의 속과 38개의 종으로 분류된다: 렘나(Lemna) 속(렘나 에퀴녹티얼리스(Lemna aequinoctialis), 렘니 디스페르마(L. disperma), 렘나 에큐아도리엔시스(L. ecuadoriensis), 렘니 지바(L. gibba), 렘나 자포니카(L. japonica), 렘나 마이너(L. minor), 렘나 미니스큘라(L. miniscula), 렘나 오브스큐라(L. obscura), 렘나 페르푸실라(L. perpusilla), 렘나 테네라(L. tenera), 렘나 트리술카(L. trisulca), 렘나 투리오니페라(L. turionifera), 렘나 발디비아나(L. valdiviana)); 스피로델라(Spirodela) 속(스피로델라 인테메디아(S. intermedia), 스피로델라 폴리리자(S. polyrrhiza), 스피로델라 푼크타타(S. punctata)); 울피아(Wolffia) 속(울피아 안구스타(Wa. angusta), 울피아 아리자(Wa. arrhiza), 울피아 아우스트랄리나(Wa. australina), 울피아 보레알리스(Wa. borealis), 울피아 브라실리엔시스(Wa. brasiliensis), 울피아 컬럼비아나(Wa. columbiana), 울피아 엘롱가타(Wa. elongata), 울피아 글로보사(Wa. globosa), 울피아 마이크로스코피카(Wa. microscopica), 울피아 네글렉타(Wa. neglecta); 울피엘라(Wolfiella) 속(울피엘라 카우다타(Wl. caudata), 울피엘라 덴티큘라타(Wl. denticulata), 울피엘라 글라디아타(Wl. gladiata), 울피엘라 히알리나(Wl. hyalina), 울피엘라 린굴라타(Wl. lingulata), 울피엘라 레푼다(Wl. repunda), 울피엘라 로툰다(Wl. rotunda), 울피엘라 네오트로피카(Wl. neotropica)), 및 란돌티아(Landoltia) 속(란돌티아 푼크타타(L. punctata)). 그외 개구리밥과의 다른 속 또는 종 역시 본 발명에 포함된다. 렘나 종은 Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds. The family of Le,nnaceae - A Monograph Study Geobatathschen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich에 기재된 분류표에 따라 분류될 수 있다.

용어 "개구리밥 결절(duckweed nodule)"은, 세포의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 분화된 세포인, 개구리밥 세포를 포함하는 개구리밥 조직을 의미한다. "분화된 세포"는 미분화 세포 또는 다른 조직 유형에서 발견되는 세포와 식별되는 적어도 하나의 표현형 특징(예, 특이한 세포 형태 또는 마커 핵산 또는 단백질의 발현)이 있는 세포이다. 개구리밥 결절 배양물의 분화된 세포는, 이의 인접 세포 벽이 융합되어 상호연결된 세포의 타일형태로 덮힌 평활면을 형성하며, 조직 전역에 산재된 잎의 원시세포로 조직화되기 시작하는 결절을 가진다. 결절 배양물의 조직 표면은 플라스마데스마타(plasmadesmata)를 통해 서로 연결된 상피 세포를 가진다.

"개구리밥 선호 코돈"은 본원에서 개구리밥에서 코돈의 사용 빈도가 17% 이상인 코돈을 의미한다.

"렘나 선호 코돈"은 본원에서 렘나 속에서 코돈의 사용 빈도가 17% 이상인 코돈을 의미한다.

"렘나 지바 선호 코돈"은 본원에서 렘나 지바에서의 코돈 사용 빈도가 17% 이상인 코돈을 의미한다.

"번역 개시 코돈"은 본원에서 원하는 뉴클레오티드 서열로부터 전사된 mRNA의 번역을 개시하는 코돈이다.

"번역 개시 관여 뉴클레오티드 서열(translation initiation context nucleotide sequence)"은 본원에서 번역 개시 코돈의 바로 5'에 있는 3개의 뉴클레오티드를 의미한다.

"분비"는 숙주 식물 세포의 세포막을 통과하는 폴리펩티드의 전좌를 의미한다. 본 발명의 일부 예들에서, 폴리펩티드는 세포막과 세포벽의 사이 공간인 아포플라스트(apoplast)에서 유지된다. 다른 예로, 폴리펩티드는 식물 숙주 세포의 세포벽을 통과하여 전좌된다.

뉴클레오티드 서열에 대한 언급시 사용되는 "작동가능하게 연결된"은 서로 기능적으로 상호관련성 있게 배치된 다수의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며 리딩 프래임내에서 두개의 단백질의 코딩 부위를 연결하는 것이 필수적인 경우이다.

A. 발현 카세트

본 발명에 따른 안정적으로 형질전환된 개구리밥은, 플라스미노겐이나 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트로 형질전환함으로써, 수득한다. 발현 카세트는 원하는 핵산이나 유전자에 연결된 전사 개시 부위를 포함한다. 이러한 발현 카세트는 조절부의 전사 조절하에 있도록 원하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 다중의 제한 부위를 제공한다. 본 발명의 구체적인 예로, 전이되는 핵산은 각각이 적어도 하나 이상의 원하는 유전자를 각각 코딩하는 2이상의 발현 카세트를 포함한다.

전사 개시부(예, 프로모터)는 천연적이거나 또는 숙주에 상동이거나, 외래적이거나 또는 이종적일 수 있으며, 천연 서열이거나 합성 서열일 수 있다. 외래적은 전사 개시부가 도입된 천연형 숙주에서는 전사 개시부가 발견되지 않는 것을 의미한다. 본원에서, 키메라 유전자는 코딩 서열에 이종적인 전사 개시부가 작동가능하도록 연결되어 있는 코딩 서열을 포함한다.

당업계에 공지된 (세균, 효모, 진균, 곤충, 포유류 및 식물 프로모터를 포함한) 임의의 공지된 적합한 프로모터를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 예컨대, 개구리밥 프로모터를 포함한 식물 프로모터를 사용한다. 프로모터의 예로는, 콜리플로워 모자이크 바이러스(Cauliflower Mosaic Virus) 35S 프로모터, 오핀 합성효소 프로모터(opine synthetase promoter, 예로, nos, mas, ocs 등), 유비퀴틴 프로모터(ubiquitin promoter), 액틴 프로모터, 리불로스 바이포스페이트(ribulose bisphosphate, RubP) 카르복실라제 스몰 서브유닛 프로모터, 및 알코올 디하이드로게나제 프로모터가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 개구리밥의 Rup 카르복실라제 스몰 서브유닛 프로모터가 당업계에 공지되어 있다(Silverthorne et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). 그외 식물, 바람직하기로는 개구리밥에 침입하는 바이러스 유래 프로모터가 바람직하며, 그 예로는 다센 모자이크 바이러스(Dasheen mosaic virus), 클로렐라 바이러스(예, 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트랜스퍼라제 프로모터; Mitra et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), 토마토 얼룩 시들음 바이러스(tomato spotted wilt virus), 담배 얼룩 바이러스(tobacco rattle virus), 담배 괴사 바이러스(tobacco necrosis virus), 담배 링 스팟 바이러스(tobacco ring spot virus), 토마토 링 스팟 바이러스, 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus), 땅콩 스텀프 바이러스(peanut stump virus), 알파파 모자이크 바이러스(alfalfa mosaic virus), 사탕수수 바실리폼의 바드나바이러스(sugarcane baciliform badnavirus) 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

마지막으로, 원하는 조절 수준을 제공하도록 프로모터를 선별할 수 있다. 예로, 구성적 발현(constitutive expression)을 부여하는 프로모터(예, 아그로박테리움 투메팩시엔스의 만노핀 합성효소 프로모터)를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 대안적으로, 그외에, 특정 환경 자극(예, 열 충격 유전자 프로모터, 결핍 유발성 유전자 프로모터, 병원체 유발성 유전자 프로모터, 상처 유발성 유전자 프로모터 및 명/암 유발성 유전자 프로모터)에 대한 반응시 활성화되는 프로모터, 또는 식물 성장 조절자(예, 아브시스산, 옥신, 사이토키닌 및 지베렐린산에 의해 유도되는 유전자의 프로모터), 또는 에탄올 또는 에틸렌과 같은 다른 화합물을 이용하는 것이 이로울 수 있다. 다른 대안으로서, 조직 특이적 발현(예, 뿌리, 잎 및 꽃-특이적인 프로모터)을 부여하는 프로모터를 사용할 수 있다.

주어진 프로모터의 전반적인 강도는 상위 활성화 서열(upstream activating sequence)과 같이 시스로 작용하는 뉴클레오티드 서열들의 조합 및 공간적 조직화에 의해 영향을 받을 수 있다. 예컨대, 아그로박테리움 튜메팩시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토핀 합성효소 유전자로부터 유래된 활성화 뉴클레오티드 서열(activating nucleotide sequence)은 아그로박테리움 튜메팩시엔스의 만노핀 합성효소 프로모터에서의 전사를 증가시킬 수 있다(예, Gelvin et al.의 미국 특허 제 5,955,646호 참조). 본 발명에서, 발현 카세트는 원하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 증강시키기 위해, 프로모터 서열의 상위에 삽입된 활성화 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 일 예로, 발현 카세트는, 아그로박테리움 뉴메팩시엔스의 만노핀 합성효소 유전자의 프로모터에, 작동가능하도록 연결된, 아그로박테리움 뉴메팩시엔스의 옥토핀 합성효소 유전자 유래 3종의 상위 활성화 서열을 포함한다(미국 특허 제 5,955,646호를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함됨).

전사 카세트는 5'-3' 방향의 전사에서 전사 및 번역 개시 부위, 원하는 뉴클레오티드 서열과 식물에서 기능하는 전사 및 번역 종결 부위를 포함한다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 종결 서열을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 종결 부위는 전사 개시 부위와 천연적일 수 있으며, 원하는 뉴클레오티드 서열과 천연적일 수 있으며, 또는 다른 기원으로부터 유래된 것일 수 있다. 옥토핀 합성효소(octopine synthetase) 및 노팔린 합성효소(nopaline synthetase) 종결 부위와 같이, 통상적인 종결 부위는 A. 튜메팩시엔스의 Ti-플라스미드에서 사용가능하다. 또한, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et al. (1991) Genes Dcv. 5:141; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261; Munroe et al. (1990) Gene 91:151; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891; 및 Joshi et al. (1987) Nuc!eic Acids Res. 15:9627를 참조한다. 종결 서열의 다른 예로는, 완두의 RubP 카르복실라제 스몰 서브유닛 종결 서열(pea RubP carboxylase small subunit termination sequence), 콜리플라워 모자이크 바이러스의 35S 종결 서열, 다수 식물 종들의 유비퀴틴 종결자가 있다. 그외 적합한 종결 서열들은 당업자에게 자명할 것이다.

발현 카세트는 형질전환된 식물에 전달되어 발현되는 2 이상의 유전자 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 각 핵산 서열은 5' 및 3' 조절 서열에 작동가능하도록 연결될 수 있다. 대안적으로는, 다수개의 발현 카세트를 제공할 수 있다.

일반적으로, 발현 카세트는 형질전환된 세포나 조직의 선별을 위한 선별성 마커 유전자를 포함할 것이다. 선별성 마커 유전자로는, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(NEO), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 III 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT)를 코딩하는 유전자와 같은 항생제 내성을 코딩하는 유전자 뿐만 아니라 제조체 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 내성 유전자는 일반적으로 제초제에 둔감한 변형된 표적 단백질이나 또는 제초제가 작용할 수 있기 전에 식물내에서 제초제를 분해하거나 또는 무독화시키는 효소를 코딩한다. DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock et al.(1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:833; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603 및 Frisch et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27:405-9을 참조한다. 예를 들어, 글리포스페이트 또는 설포닐유레아 제초제에 대한 내성은, 돌연변이 표적 효소들, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS) 및 아세토락테이트 신타제(acetolactate synthase, ALS)를 코딩하는 유전자를 이용하여 수득한다. 글루포시네이트 암모늄(glufosinate amnionium), 보로목시닐(boromoxynil) 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트(2,4-D)에 대한 내성은, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(phosphinothricin acetyltransferase), 니트릴라제(nitrilase) 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제(2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase)를 코딩하는 세균 유전자를 이용하여 수득하며, 이들은 각 제초제를 무독화한다.

본 발명의 목적에 있어서, 선별성 마커 유전자는, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 III(Frisch et al. (1995) PlantMol. Biol. 27: 405-9); 시안아미드 하이드라타제(Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4250); 아스파르테이트 키나제; 디하이드로디피콜린네이트 신타제(Perl et al. (1993) BioTechnology 11:715); bar 유전자(Told et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36:1367); 트립토판 디카르복실라제(Goddijn. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT 또는 HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); 2,2-디클로로프로피오닌산 디할로게나제(Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochern. 13D:330); 아세토하이드록시산 신타제(U.S. Pat. No. 4,761,373 to Anderson et al.; Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-에놀피루빌-시키메이트-포스페이트 신타제(aroA; Comai et al. (1985) Nature 3 17:741); 할로아릴니트릴라제(WO 87/04181 to Stalker et al.); 아세틸-코엔자임 A 카르복실라제(Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); 디하이드로프테로에이트 신타제(sulI; Guenineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); 및 32 kDa 광시스템 II 폴리펩티드(psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346 (1983))를 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 젠타마이신(예, aacC1, Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 2 17:202-208); 클로람페니콜(Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987); 메토트렉세이트(Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); 히그로마이신(Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807); 스트렙토마이신(Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210: 86); 스펙티노마이신(Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res. 5: 131); 블레오마이신(Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); 설폰아미드(Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. 15:127); 브로목시닐(Stalker et al. (1988) Science 242:419); 2,4-D(Streber et al. (1989) BioTechnology 7:811); 포스피노트리신(DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); 스펙티노마이신(Bretagne-Sagnard and Chupeau, Transgenic Research 5:131)에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다.

bar 유전자는, 포스피노트리신(PPT) 또는 비알라포스(bialaphos) 등과 같은 글루포시네이트 타입의 제초제에 대해, 제초제 내성을 부여한다. 전술한 바와 같이, 벡터 구조체에 사용될 수 있는 다른 선별성 마커로, 바이알라포스 및 포스피노트리신 내성에 대한 pat, 이미다졸린온 내성에 대한 ALS, 히그로마이신 내성에 대한 HPH 또는 HYG, 글리포세이트 내성에 대한 EPSP 신타제, Hc-독소 내성에 대한 Hm1 및 당업계에서 일상적으로 사용되며 알려져 있는 다른 선별제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Yarranton(1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff(1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Blol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:9 13; Hlavka.et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; Gill et al. (1988) Nature 334:721를 참조한다. 상기한 문헌들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

전술한 선별성 마커 유전자 리스트는 한정되는 것으로 의도되는 것은 아니다 본 발명에 임의의 치사 또는 비-치사성 선별 마커 유전자를 사용할 수 있다.

B. 플라스미노겐 및 마이크로플라스미노겐

본 발명은 개구리밥에서의 플라스미노겐, 마이크로플라스미노겐 및 그의 절편 발현을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 개구리밥에서 발현되는 플라스미노겐은 임의의 포유류 기원으로부터 유래될 수 있다. 일부 예들에서, 플라스미노겐은 인간 또는 돼지 유래이다. 특정 예에서 플라스미노겐은 서열번호 4로 기재된 인간 플라스미노겐의 아미노산 서열을 가진다. 다른 예로, 플라스미노겐은 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열의 생물학적으로 활성의 변이체이다.

이와 유사하게, 개구리밥에서 발현되는 마이크로플라스미노겐은 임의의 포유류 기원으로부터 유래될 수 있다. 일부 예들에서, 마이크로플라스미노겐은 인간 또는 돼지 유래이다. 특정 예에서, 마이크로플라스미노겐은 서열번호 6으로 기재된 인간 마이크로플라스미노겐의 아미노산 서열을 가진다. 다른 예로, 마이크로플라스미노겐은 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열의 생물학적으로 활성의 변이체이다.

플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐의 절편은 본 발명에 따라 제조할 수 있다. 상기 절편은 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상, 95개 이상, 101개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 377개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 500개 이상, 550개 이상, 600개 이상, 650개 이상, 700개 이상, 750개 이상의 플라스미노겐 단백질의 연속된 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 제조할 수 있는 절편의 예로는, 미니플라스미노겐과 안지오스타틴을 포함한다. 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐 절편의 비제한적인 예들은, O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315-28; Sim et al. (1997) Cancer Res. 57:1329-34; 미국 특허 제 5,972,896호 및 미국 특허 공개공보 제 20020164717호, 제 20020037847호 및 제 20010016644호에 기재되어 있으며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 일부 예들에서, 절편은 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐의 효소적 활성, 예컨대 단백질분해 활성을 유지하고 있다.

플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐의 "생물학적으로 활성의 변이체"는 천연 단백질의 N 또는/및 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 결손( 절단(truncation)이라 함) 또는 첨가; 단백질내 1곳 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결손 또는 첨가; 또는 단백질내 1곳 이상의 부위에 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해, 상기한 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드이다. 본 발명에 포함되는 생물학적으로 활성의 변이체 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐 폴리펩티드는, 생물학적으로 활성이며, 즉 이들은 단백질 분해효소의 플라스민 패밀리(Enzyme Class 3.4.21.7)의 단백질분해 활성을 가지는 단백질을 생산하기 위해 활성화되어질 수 있다. 이런 생물학적으로 활성의 변이체는, 에컨대 유전자 다형성(genetic polymorphism) 또는 인간의 조작(human manipulation)으로 발생될 수 있다. 본 발명에 따른 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐의 생물학적으로 활성의 변이체는 서열번호 4 또는 6에 기재된 아미노산 서열과, 약 50% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 일반적으로 약 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 바람직하기로는 약 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 예컨대 약 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐의 생물학적으로 활성의 변이체는 서열번호 4 및 6에 기재된 아미노산 서열과, 1-15개, 1-10개, 예컨대 6-10개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기가 상이할 수 있다. 플라스미노겐의 생물학적 활성의 변이체 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제 5,190,756호에 기재되어 있다. 생물학적 활성을 유지시키기 위해, 임의의 치환이 천연적으로 보존적인 것이 바람직하며, 절단 및 치환은 일반적으로 단백질 분해 활성에 필요하지 않는 잔기에서 행해질 수 있다. 플라스민/플라스미노겐 및 마이크로플라스민/마이크로플라스미노겐의 활성이 있는 잔기 및 도메인들은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대, Kolev et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:13666-675; de los Santos et al. (1997) Ciba Found. Symp. 212:66-76, Peisach et al. (1999) Biochemistiy 38:11180-11188, 및 Turner et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:33-68-74에 개시되어있으며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

두가지 서열간의 서열 비교, 및 상동성%과 유사성% 결정은, 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 예로, 2개의 뉴클레오티드 서열간의 상동성%는 Needleman and Wunsch(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453의 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있는데, 상기 알고리즘은 BLOSUM62 행렬(matrix) 또는 PAM25O 행렬중 어느 하나와, 갭 웨이트(gap weight) 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 그리고 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하는, GCG 소프트웨어 패키지(www.accelrys.com)의 GAP 프로그램에 병합되어 있다. 다른 바람직한 예로, 두가지 뉴클레오티드 서열간의 상동성%는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램, BLOSUM62 측정 행렬(scoring matrix)(Henikoff et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89:10915) 및 갭 웨이트 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하여 결정한다. 특히 바람직한 매개변수 세트(및 분자가 본 발명의 서열 상동성 한정 범위내인지를 결정하기 위하여, 적용해야하는 매개변수가 불확실한 경우에 사용되어야 하는 매개변수는)는 갭 웨이트 60, 길이 웨이트 3의 BLOSUM62 측정 행렬을 이용한다.

또한, 두가지 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열간의 상동성%는 E. Meyers and W. Miller (1989) CABIOS 4:11-17의 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있으며, 상기 알고리즘은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 있으며, PAM12O 웨이트 잔기 테이블(weight residue table), 갭 길이 패널티(gap length penalty) 12 및 갭 패널티 4를 이용한다.

C. 개구리밥에서 발현 증강을 위한 뉴클레오티드 서열 변형

일부 예들에서, 본 발명은 개구리밥에서의 그것의 발현을 증강시키기 위해 발현되는 뉴클레오티드 서열의 변형을 제공한다. 이러한 변형의 한가지 방법은, 개구리밥 선호 코돈으로 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하는 것이다. 식물 선호 코돈으로 뉴클레오티드 서열을 합성하는 방법은 당업계에서 이용가능한 방법이다. 예컨대, 미국 특허 제 5,380,831호 및 제 5,436,391호, Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:3324; Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; 및 Murray et al., (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 바람직한 코돈은 개구리밥에서 발현되는 단백질에서 가장 빈도가 높은 코돈으로 결정할 수 있다. 따라서, 개구리밥에서의 특정 코돈의 사용 빈도는, 개구리밥 코딩 서열의 그룹들에서 코돈 사용을 분석함으로써 결정할 수 있다. 개구리밥 코딩 서열 다수가 당업자들에게 공지되어 있으며, 그 예로, 메를랜드 베데스다에 위치한 국립 의학 라이브러리의 분과인 국립 생물공학 정보 센터의 웹사이트를 통해 접속할 수 있는 GenBank^® 데이타베이스에 포함되어 있다. 가장 최근에 포함된 서열을 기초로 코돈의 사용 빈드가 표시된 표를, 일본 시바현의 카즈사 DNA 연구소의 웹사이트, www.kazusa.or.jp/codon/에서 확인할 수 있다. 이 데이타베이스는 Nakaamura et al, (2000) Nucl. Acids Res. 28:292에 개시되어 있다.

개구리밥과 그외 단자엽 식물에서의 발현이 최적화된 유전자를 본 발명의 방법에 이용할 수 있는 것으로 이해된다. 예로, EP 0359472, EP 0385 962, WO 91/16432; Perlak et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88.:3324; Iannacome et al.(1997) Plant Mol. Biol. 34:485; 및 Murray et al.(1989) Nuc. Acids Res. 17:477 등을 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 유전자 서열의 전체나 또는 임의의 일부를 최적화하거나 합성할 수 있는 것으로 또한 이해된다. 즉, 전체적으로 최적화되거나 또는 부분적으로 최적화된 서열을 또한 이용할 수 있다. 예로, 코돈의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 개구리밥 선호 코돈일 수 있다. 일예로, 플라스미노겐 또는 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 개구리밥 선호 코돈은 50-100%이거나, 또는 70-100%이다. 일 예로, 토돈들의 90 내지 96%는 개구리밥 선호 코돈이다. 원하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열은 개구리밥에서 17% 이상의 빈도로 사용되는 코돈들을 포함할 수 있다. 렘나 지바(Lemna gibba)와 렘나 마이너(Lemna minor)의 코돈 사용은 하기 표 1 및 2에 나타낸다. 일부 예들에서, 표1 또는 표2를 사용하여 개구리밥 선호 코돈을 선별한다. 특정 예에서, 플라스미노겐을 코딩하는 최적화된 개구리밥 코돈 서열은 서열번호 3의 서열이며, 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 최적화된 개구리밥 코돈 서열은 서열번호 5의 서열이다.

표 1: GenBank^®Release 139^*로부터의 렘나 지바(Lemna gibba)의 코돈 사용

아미노산 코돈 수 /1000 분율

표 2: GenBank^®Release 139^*로부터의 렘나 마이너(Lemna minor)의 코돈 사용

아미노산 코돈 수 /1000 분율

또한, 개구리밥에서의 발현을 증강시키기 위해, 원하는 뉴클레오티드 서열에 그외 변형을 만들 수 있다. 이러한 변형으로는, 가폴리아데닐레이션 신호(spurious polyadenylation signal)의 코딩 서열, 엑손-인트론 스플라이스 사이트 신호(exon-intron splice site signal)의 코딩 서열, 트랩스포존 유사 반복부(transposon-like repeat)의 코딩 서열 제거과 유전자 발현에 유해할 수 있는 그외 특정화된 서열의 제거를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 서열의 G-C 비율을 주어진 세포 숙주에서의 평균 수준으로 조절할 수 있으며, 이는 숙주 세포에서 발현된 공지 유전자를 참조로 계산된다. 가능한 경우, 서열은 추정되는 헤어핀 이차 mRNA 구조를 방지하기 위해 변형할 수 있다.

동물 및 식물에서 번역 개시 코돈에 대한 최적의 번역 개시 관여 뉴클레오티드 서열들간에 상이성이 알려져 있으며, 이들 번역 개시 관여 뉴클레오티드 서열의 구성이 번역 개시 효율에 영향을 미칠 수 있다. 그 예로, Lukaszewicz et al. (2000) Plant Science 154:89-98와 Joshi et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:993-1001를 참조한다. 본 발명에서 원하는 뉴클레오티드 서열의 변역 개시 코돈에 대한 번역 개시 관여 뉴클레오티드 서열은 개구리밥에서의 발현을 증강시키기 위해 변형시킬 수 있다. 일 예에서, 뉴클레오티드 서열은 원하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시 코돈의 상위에 있는 3개의 뉴클레오티드가 "ACC"이도록 변형한다. 두번째 예로, 상기 뉴클레오티드는 "ACA"이다.

또한, 개구리밥에서 트랜스유전자(transgene)의 발현을5' 리더 서열을 이용하여 증강시킬 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 증강시키는 역할을 수행할 수 있다. 1종 이상의 리더 서열을 표적 뉴클레오티드 서열의 발현을 증강시키기 위해 조합하여 사용할 수도 있다. 번역 리더는 당업계에 공지되어 있으며, 피코르나바이러스의 리더, 예로 EMCV 리더(Encephalomyocarditis 5'noncoding region; Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6126); 포티바이러스(potyvirus)의 리더, 예로, TEV 리더(Tobacco Etch Virus; Allison et al. (1986) Virology 154:9); 인간 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP; Macajak and Sarnow (1991) Nature 353:90); 알파파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA의 미번역 리더(untranslated leader from the coat protein niRNA of alfalfa mosaic virus)(AMY RNA 4; Jobling and Gelirke (1987) Nature 325:622); 담배 모자이크 바이러스의 리더(TMV; Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56); 감자 에츠 바이러스(potato etch virus)의 리더(Tomashevskaya et al. (1993) J. Gen. Virol. 74:2717-2724); Fed-l 5' 미번역부위(Dickey (1992) EMBO J. 11:2311-2317); RbcS 5' 미번역 부위(Silverthome et al. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58); 및 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(maize chlorotic mottle virus)의 리더(MCMV; Lommel et al. (1991) Virology 8 1:382)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 옥수수 디하이드로게나제 1 유전자, 피마자 식물의 카탈라제 유전자 또는 아라비돕시스의 트립토판 경로 유전자 PAT1을 포함한, 인트론 서열을 포함하는 리더 서열은, 식물에서 번역 효율을 증가시키는 것으로 입증되었다(Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Mascareuhas et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). 본 발명의 일예에서, 서열번호 1의, 옥수수의 알코올 디하이드로게나제 1 유전자(GenBank Accession Number X04049)의 뉴클레오티드 1222-1775에 해당되는 뉴클레오티드 서열을, 번역 효율을 증대시키기 위해 원하는 뉴클레오티드 서열의 상위에 삽입한다. 다른 예로, 발현 벡터는 렙나 지바의 리불로스-비스-포스페이트 카르복실라제 스몰 서브유닛 5B 유전자의 리더를 함유한다(Buzby et al. (1990) Plant Cell 2:805-8 14).

전술한 개구리밥에서의 발현을 증강시키는 뉴클레오티드 서열 변형 모두 본 발명에 사용할 수 있을 것으로 이해되며, 임의의 한가지의 변형 또는 임의의 가능한 변형들의 병용을 포함한다. 본원에서, 표현 "개구리밥에서의 발현 증강을 위해 변형된"은 임의의 한가지의 변형 또는 임의의 가능한 변형들의 병용을 포함하는 핵산 서열을 나타낸다.

D. 신호 펩티드

분비된 단백질은 제조되는 폴리펩티드 체인을 막을 통과시켜 전좌시키고, 세포에서 ER로 분비하기 위해, ER(endoplasmic reticulum) 막의 수용체 단백질과 상호작용하는 "신호 펩티드"를 포함하는 폴리펩티드 전구체로부터, 일반적으로 번역된다. 종종 폴리펩티드 전구체에서 신호 펩티드가 절단되어, 신호 펩티드가 없는 "성숙형" 폴리펩티드가 생산된다. 본 발명의 일예에서, 개구리밥에서 생물학적으로 활성의 폴리펩티드는, 배양 배지로 폴리펩티드의 분비를 인가하는, 신호 펩티드의 코딩 뉴클레오티드 서열과 작동가능하도록 연결된, 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다. (세포외로의 분비를 위한) ER로 단백질 전좌를 표적화하는 식물의 신호 펩티드들은, 당업계에 알려져 있다. 그 예로, Lee et al의 미국 특허 제 6,020,169호를 참조한다. 본 발명에서, 임의의 식물 신호 펩티드를 사용하여 ER로의 폴리펩티드 발현을 표적화할 수 있다. 일부 예들에서, 신호 펩티드는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 염기성 엔도키티나제 신호 펩티드(basic endochitinase signal peptide), 익스텐신 신호 펩티드(extensin signal peptide)(Stiefel et al. (1990) Plant Cell 2:785-793), 또는 벼의 알파-아밀라제 신호 펩티드(서열번호 8; NCBI Protein Accession No. AAA33885의 아미노산 1-31)이다. 다른 예로, 신호 펩티드는 분비된 개구리밥 단백질의 신호 펩티드에 해당된다.

대안적으로, 포유류의 신호 펩티드도 유전학적으로 조작된 개구리밥에서 발현되는 재조합 폴리펩티드의 분비를 표적화하기 위해, 사용할 수 있다. 식물 세포는 ER을 표적으로 하는 포유류의 신호 펩티드를 인지하며, 이러한 신호 펩티드는 식물 세포 벽과 세포 막을 통해 폴리펩티드의 분비를 인가할 수 있는 것으로 입증되었다. Hiatt et al의 미국 특허 제 5,202,422호와 제 5,639,947를 참조한다.

일부 예들에서, 신호 펩티드의 코팅 뉴클레오티드 서열은 개구리밥에서의 발현 증대를 위해, 원하는 뉴클레오티드 서열에 대해 전술한 B에서 설명한 임의의 변형이나 변형들의 병용을 이용하여, 변형시킨다. 예컨대, 벼의 알파-아밀라제의 신호 펩티드를 코딩하는 개구리밥에서 최적화된 서열은 서열번호 7로 나타낸다. 상기 서열은 약 93%의 개구리밥 선호 코돈을 포함하고 있다.

분비된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 배양 배지에서 회수하여, 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 용매-용매 추출 등으로 정제할 수 있다.

E. 형질전환된 개구리밥 식물과 개구리밥 결절 배양물

본 발명에서 이용한 안정적으로 형질전환된 개구리밥은 당업계에 공지된 임의 방법으로 수득할 수 있다. 일 예로, 안정적으로 형질전환된 개구리밥은 미국 특허 제 6,040,498호 또는 미국 특허 공개번호 20030115640, 20O30033630, 또는 20020088027에 개시된 유전자 전달 방법들 중 하나의 방법으로 수득하며, 이들 각각은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 이러한 방법들로는, 원하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 코팅된 미세발사체로 탄도 충격에 의한 유전자 전달, 전기영동에 의한 유전자 전달, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있는 벡터를 함유한 아그로박테리움 매개의 유전자 전달이 있다. 일부 예들로, 안정적으로 형질전환된 개구리밥은 Stomp et al의 미국 특허 제 6,040,498호에 개지된 아그로박테리움-매개 방법들 중 어느 한가지 방법을 통해 수득한다. 아그로박테리움은 아그로박테리움 뉴메팩시엔스(Agrobacterium turnefaciens)나 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)를 사용한다.

안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물은 또한 엽록체 형질전환으로 수득할 수 있다. 그 예로, 2003년 8월 1일자로 출원된 표제 "개구리밥의 엽록체 형질전환", 미국 가출원번호 60/492,179를 참조한다. 또한, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 세포주는 식물 바이러스 발현 벡터를 이용하여 생산할 수 있다. 그 예로, 미국 특허 제 6,632,980호와, Koprowski and Yusibov (2001) Vaccine 19:2735-2741을 참조한다.

이러한 방법에 따른 안정적으로 형질전환된 개구리밥은 정상적인 형태를 보이며, 유성 생식으로 수정하는 것이 바람직하다. 바람직하기로는, 본 발명의 형질전환된 식물은 전달된 핵산을 한 카피로 포함하며, 전달된 핵산에는 주목할만한 재정렬(rearrangement)이 없다. 또한, 전달된 핵산이 적은 카피수로 (즉, 형질전환된 세포당 핵산의 카피수가 12 카피수 이하, 8 카피수 이하, 5 카피수 이하, 3 카피수 이하, 3카피수 미만) 존재하는 개구리밥 식물이 바람직하다.

도 1은 플라스미노겐 발현 구조체 BAP01로 형질전환시킨 56개의 개구리밥 세포주에서 ELISA로 측정한, 조직 균질물내 플라미스노겐의 농도를 나타낸 것이다. 플라스미노겐의 농도는 균질물내 총 수용성 단백질에 대한 백분율로 나타내었다. 부가적인 상세 사항들은 실시예 1의 실험 부분을 참조한다.

도 2는 tPA를 이용하여 개구리밥에서 생산된 플라스미노겐을 활성화시켜 제조한 플라민(plasmin)의 활성을 나타낸 것이다. 부가적인 상세 사항들은 실시예 1의 실험 부분을 참조한다.

도 3은 스트렙토키나제로 활성화한 이후에 플라스민 활성으로 비교한 ELISA을 통한 플라스미겐의 정량화를 나타낸 것이다. 테스트한 세포주들에서, ELISA에 의한 정량과 스트렙토키나제 활성 분석으로 유사한 값이 나왔으며, 이는 렘나(Lemna)에서 생산된 플라스미노겐이 대조군 단백질과 유사한 특이 활성을 가진다는 것을 의미한다.

도 4는 렘나 조직 추출물내에서의 인간 플라스미노겐의 안정성을 나타낸다. 추가적인 상세 사항들은 실시예 1의 실험 부분을 참조한다.

도 5는 활성 분석으로 측정한, 냉동/해동한 다음 조직 추출물내에서의 렘나 플라스미노겐 안정화를 나타낸다. 추가적인 상세 사항들은 실시예 1의 실험 부분을 참조한다.

도 6은 렘나에서 생산된 플라스미노겐의 유로키나제 또는 tPA를 이용한 활성화 이후의 플라스민 생성을 나타낸 것이다. "BAP"는 렘나에서 생산된 플라스미노겐이다. 좌측 패널은 조직 플라스미노겐 활성자(tPA)를 이용한 활성화를, 우측 패널은 유로키나제(uK)를 이용한 활성화를 나타낸다. 추가적인 상세 사항들은 실시예 1의 실험 부분을 참조한다.

도 7은 마이크로플라스미노겐 발현 구조체 BAMP01로 형절전환한 79개의 개구리밥 세포주에서, ELISA로 측정한 배지내 마이크로플라스미노겐의 농도이다. 추가적인 상세 사항들은 실시예 2의 실험 부분을 참조한다.

도 8은 tPA에 의한 활성화 이후에 렘나에서 생산된 마이크로플라스미노겐의 효소도(zymogram)를 분석한 것이다. 도는 농축된 대조군 배지에는 없는 활성형의 단백질 분해 밴드의 존재를 나타낸다. 추가적인 상세 사항들은 실시예 2의 실험 부분을 참조한다.

하기 실시예들은 예시하기 위한 것으로, 이로 한정되는 것은 아니다.

개구리밥에서 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐 생산을 위한 발현 구조체

본 발명의 실시예에서 사용된 발현 벡터는 미국 특허 제 5,955,646호에 개시된 pBMSP-1의 변형 버전으로, 상기 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 벡터의 전사 카세트는, 아그로박테리움 투메팩시엔스의 옥토피 신타제로부터 유래된 전사 활성화 뉴클레오티드 서열의 3 카피, 아그로박테리움 투메팩시엔스의 만노핀 신 타제 유전자로부터 유래된 추가적인 전사 활성화뉴클레오티드 서열, 아그로박테리움 투메팩시엔스의 만노핀 신타제 유전자 유래 프로모터 부분, 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 폴리링커 부위 및 아그로박테리움 투메팩시엔스의 노팔린 신타제 유전자 유래 종결 서열이 포함되어 있다(van Engelen et al. (1995) 4:288-290; Ni et al. (1995) Plant J. 7:661-76; and Luehrsen et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:81-93을 참조, 이들은 각각 원용에 의해 본 발명에 포함됨)

또한, 발현 벡터는 선별 마커로서 젠타마이신 내성을 암호화하는 젠타마이신 아세틸트랜스퍼라제-3-I, aacCl(Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 2 17:202-208)의 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유한다. 선별 마커 서열의 전사는 아그로박테리움 투메팩시엔스의 노팔린 신타제 II 유전자 유래 프로모터에 의해 이루어진다.

발현 벡터는 부가적으로 렘나 지바의 리불로스-비스-포스페이트 카르복실라제 스몰 서브유닛 5B 유전자 유래 리더 서열(nucleotides 689-751 of NCBI Accession No. S45167, Buzby et al. (1990) Plant Gell 2:805-814)과, 프로모터와 폴리링커 사이에 삽입된 옥수수 알코올 디하이드로게나제 유전자(GenBank Accession Number X04049)의 1222 -1775 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인트론 서열은 서열번호 1에, 리더 서열은 서열번호 2에 나타낸다.

개구리밥의 형질전환

아그로박테리움 매개 형질전환 방법으로, 전술한 발현 구조체를 개구리밥 잎 또는 개구리밥 결절 배양물(본 실시예에서는 렘나 마이너 주 8627)에 형질전환하였다. 아그로박테리움 투메팩시엔스 주 C58Z707, 디스암의(disarmed), 넓은 숙주 범위 C58 균주(Hepburn et al. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969)를 본 실시예의 형질전환에 사용하였다. 전술한 발현 구조체를 전기충격으로, 또는 가동성 플라스미드 pRK2O13(Hoekema et al. (1983) Nature 303: 179-180; Ditta et al. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 7347-7350)을 가지는 E. coli MM294를 이용한 3가지 모체 짝찌은 방법(triparental mating procedure)으로 아그로박테리움 투메팩시엔스에 이동시켰다. 전술한 발현 구조체를 포함하는 C58Z707 균주를 AB 최소 배지(Chilton et al., (1974) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71: 3672 -3676)나, 스트렙토마이신 500 mg/L, 스펙티노마이신 50 mg/L 및 카나마이신 설페이트 50 mg/L이 함유된 YEB 또는 LB 배지 (1 g/L yeast extract, 5 g/L beef extract, 5 g/L peptone, 5 g/L sucrose, 0.5 g/L MgSO₄)에 스트리킹하여, 28 ℃에서 하룻밤 배양하였다.

형질전환을 위한 개구리밥 결절 배양물은 다음과 같이 준비하였다. 개구리밥 잎을 취하고, 멸균 메스를 이용하여 뿌리를 제거한 후, 잎의 하면이 아래가 되도록, 5 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.5 μM의 1-페닐-3(1,2,3-티아디아졸-5-일)유레아 티디아주론(Sigma P6186), 3% 자당, 0.4% 디프코 박터-아가(Fisher Scientific) 및 0.15% 젤리트(Sigma)가 보충된 MS 배지(Murashige and Skoog medium (1962) Physiol. Plant. 15:473) pH5.6 상에 두었다. 5 내지 6주간 잎을 배양하였다. 이때, 일반적으로 결절(작고, 노르스름한 세포 덩어리)이 잎 하면의 중심부에 나타난다. 상기 결절 조직 조직을 모체 잎에서 탈착하여, 3% 자당, 0.4% 디프코 박터-아가, 0.15% 젤리트, 1 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 2 μM의 벤질아데닌이 보충된 MS 배지에서 배양하였다.

개구리밥 결절 배양물은 다음과 같이 형질전환하였다. 적당한 아그로박테리움 투메팩시엔스 균주를 감자 덱스트로스 아가나, 50 mg/L의 카나마이신 및 100 μM의 아세토시린곤(acetosyringone)이 보충된 YEB 또는 LB 배지에서 배양한 다음, 0.6 M 만니톨 및 100 μM의 아세토시린곤이 첨가된 MS 배지에 재현탁하였다. 결절 배양 조직은 1-2분간 재현탁한 세균 용액에 침지함으로써 접종한 다음, 블롯하여 과잉의 액체를 제거하고, 결절 생장 촉진을 최적화하는 옥신 및 사이토키닌과, 100 μM의 아세토시린곤이 보충된 MS 배지로 이루어진 공동-배양 배지에 넣었다. Yamamoto et al. (2001) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 37:349-353을 참조한다.

선별시, 결절 배양 조직을 재생 배지: 1% 자당, 0.4 % 디프코 박토-아가, 0.15% 겔리트, 500 mg/L 세포탁심(cefotaxime) 및 6 mg/L 제네티신(geneticin)로 이동시킨 다음, 광 조건(20-40 μM/m²ㆍsec)하에서 약 6-8주간 배양하였다. 결절 조직의 배지는 7일마다 신선한 배양 배지로 교체하였다. 결절 조직이 선별 물질에서 왕성하게 성장할때, 선별을 완료한다.

하기 실시예들은 생물학적으로 활성의 플라스미노겐과 마이크로플라스미노겐 의 개구리밥에서의 발현을 기술한다.

실시예 1: 플라스미노겐의 생산

인간 플라스미노겐을 다음과 같이 개구리밥에서 발현시켰다. 인간 플라스미노겐을 코딩하는 개구기밥 코돈으로 최적화한 합성 서열을, 전술한 발현 벡터에 삽입하였다. 코딩된 플라스미노겐의 아미노산 서열은 서열번호 4로 기재하며, 개구리밥 최적 코딩 서열은 서열번호 3으로 기재한다. 또한, 발현 벡터는 플라스미노겐 코딩 서열의 5'에 삽입된, 개구리밥에서 최적화된 벼의 알파 아밀라제 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 신호 펩티드의 뉴클레오티드 코딩 서열은 두가지 코딩 서열이 하나의 단백질로 번역되도록 인간 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연결되어 있다. 벼의 알파 아밀라제 신호 펩티드를 코딩하는, 개구리밥에서 최적화된 코딩 서열은 서열번호 7로 기재하며, 코딩된 펩티드는 서열번호 8로 기재한다. 이러한 플라스미노겐 발현 벡터는 본 실시예에서 BAPO1라고 명한다.

BAPO1 발현 벡터로 형질전환한 개구리밥 세포주를 전술하 바와 같이 제조하였다. 플라스미노겐의 큰 사이즈로 인해, 형질전환주의 일차 스크리닝에 배지 및 조직 균질체(homogenate)의 분석을 포함하였다. 발현된 단백질의 거의 대부분은 조직내에 있었다. 총 81개의 주가 제조되었으며, 플라스미노겐은 많게는 식물 추출물내 총 수용성 단백질의 6%를 차지하였다(ELISA로 측정). 도 1은 56개의 형질전환주에서 측정한 플라스미노겐 수준을 나타낸다. 상기 수준은 시험관에서 2주간 배양한 식물에서 수득하였다. 상업적으로 이용가능한 플라스미노겐을 본 분석에 표준물질로 사용하였다.

개구리밥에서 발현된 플라스미노겐의 활성을 7종의 상이한 형질전환주의 조직 추출물에서 결정하였다. 개구리밥에서 발현된 플라스미노겐을 스트렙토키나제로 활성화시켜, 활성의 복합체를 생산하였다. 스트렙토키나제에 의한 활성화에는 플라스민의 생성이 관여하지 않지만, 스트렙토키나제/플라스미노겐 복합체 형성으로 발생되는 형태 이동(conformational shift)에 의해 발생된다. 제조되는 복합체의 활성은 이후 서열번호 9의 발색성 기질, Glu-Phe-Lys-pNA(Chromgenix Instrumentation Laboratory SpA, Milano Italy)(pNA = p-니트로아닐라이드)의 절단을 405 nm에서 분석하여, 측정하였다(Gram J. and Jespersen 1. Thromb. Haemost. 53, 255-259(1985) and Robbins, K.C. Semin.. Thromb. Haemost. 13(2), 131-138(1987)). 테스트한 형질전환주 7종 각각에서, 활성 수준은 ELISA로 결정하였을때 단백질 발현 수준과 밀접하게 관련있었으며, 이는 렘나에서의 플라스미노겐 생산이 상업적으로 이용가능한 대조군 단백질과 유사한 특이적 활성을 가짐을 시사한다.

플라스미노겐을 과다 발현하도록 조작된 다수의 개구리밥 세포주들은 빨리 노화되었다. 그러나, 이들 세포주에서의 노화는 식물 배양시 통기 및 배지 용적을 증대시킴으로써, 감소시킬 수 있었다. 또한, 접종물의 밀도 차이 역시 식물의 건강에 영향을 미칠 수 있다. 형질전환된 개구리밥 세포주 8개의 배양 규모를 증가시켰으며, 이들 세포주들중 BAPO1-B1-95를 선택하여 추가적으로 분석하였다. 상기 세포주는 생중량 축적, 플라스미노겐 발현율(ELISA로 결정시 식물 조추출물내 총 수용성 단백질 함량의 3.3%), 및 총체적인 식물의 건강성을 토대로 선택하였다.

다음과 같이, BAPO1-Bl-95 세포주에서 플라스미노겐을 회수하였다. 벌크한 개구리밥 조직을 균질화하고, 원심분리로 맑게한 다음 0.22 μM 필터로 여과하였고, 이를 Dowex 이온교환 수지 컬럼(Dow Chemical, Midland, Mink)을 통과시킨 다음, 하이신 세파로스 크로마토그래피로 친화성 정제를 수행하였다. 친화성 컬럼에 결합된 물질들은 ε-아미노 카프로익산으로 용출시켰다. ELISA 측정에 따라 총 수용성 단백질의 3.3%로 플라스미노겐을 함유하고 있는 식물들에서, 조직 조 추출물을 수득하였다.

tPA, 유로키나제 및 스트렙토키나제에 의한 활성화 이후에 개구리밥에서 생산된 플라스미노겐의 활성을 또한 분석하였다. tPA 또는 유로키나제로 활성화한 플라스미노겐의 활성은 도 2에 나타낸 바와 같이, 활성화된 플라스민을 생성하였다. 웨스턴 블롯팅 분석시, 개구리밥에서 생산된 플라스미오겐의 활성화에 의해 생산된 플라스민의 중쇄 및 경쇄는, 대조군으로 사용한 상업적으로 이용가능한 플라스민과 동일하게 이동하였다(도 6). 또한 스트렙토키아제를 이용한 활성화시, 서열번호 3의 활성화된 플라스미노겐이 생산되었다. 이러한 분석에서, 플라스미노겐은 스트렙토키나제에 의해 활성화되어, 활성형 복합체를 형성하며, 이는 이후 발색 기질(Coamatic ^®brand plasminogen kit, DiaPharma, West Chester, OH)을 절단한다. 도 3은 테스트 세포주들에 대한 ELISA에 의한 정량 및 스트렙토키나제 활성 분석에서의 유사한 결과가 나타남을 보인 것으로, 이는 렙나에서 생산된 플라스미 노겐이 대조군 단백질과 유사한 특이 활성을 가짐을 나타내는 것이다.

개구리밥에서 생산된 플라스미노겐의 크기를 American Diagnostica, Inc. Greenwich, CT사의 항-플라스미노겐 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 이 분석으로 개구리밥에서 생산된 플라스미노겐의 60%가 개구리밥에서 생산한 플라스미노겐의 전장 N 말단 서열을 가지며, 이후 첫 74개의 아미노산이 없는 폴리펩티드로 추가적으로 처리되는 것으로 나타났다. 인간 혈청에서, 플라스미노겐을 미처리된 '글루-플라스미노겐' 혼합물로서 분리하고, 처리된 여러 버전을 69, 77 또는 78의 N-말단 아미노산이 제거된 'lys-플라스미노겐'으로 두었다. 이러한 절단은 활성에 영향을 주지 않는다.

기존 자료들은 재조합 시스템에서 안정적인 플라스미노겐을 생산하기 어려운 것으로 보고하였기에, 렘나 시스템에서 생산된 플라스미노겐의 안정성을 테스트하였다. 도 4는 렘나 조직 추출물에 첨가한, 인간 플라스미노겐의 안정성을 나타낸다. 상기 도는 인간 플라스미노겐을 렘나 추출물에 하룻밤동안 방치하였을때도, 그것의 활성이 거의 모두 유지됨을 입증한다. 도 5는 냉동-해동 사이클 이후에 렘나 조직 추출물내에서의 렘나에서 생산한 플라스미노겐의 안정성을 나타낸 것이다. 상기 도는, 렘나에서 생산한 단백질인 냉동-해동 사이클 이후에도 안정적임을 입증한다.

실시예 2: 개구리밥에서의 마이크로플라스미노겐의 생산

인간 마이크로플라스미노겐을 다음과 같이 개구리밥에서 발현시켰다. 인간 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 개구리밥 코돈으로 최적화된 합성 서열을 전술한 발현 벡터에 삽입하였다. 코딩된 마이크로플라스미노겐의 아미노산 서열은 서열번호 6에, 개구리밥에서 최적화된 코딩 서열은 서열번호 5로 기재한다. 또한, 발현 벡터는 플라스미노겐 코딩 서열의 5'에 삽입된 벼의 알파 아밀라제 신호 펩티드를 코딩하는 개구리밥에서 최적화된 코딩서열을 포함하고 있다. 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 두개의 코딩 서열들이 하나의 단백질로 변역되도록 인간 마이크로플라스미노겐를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 작동가능하도록 연결되어 있다. 벼의 알파 아밀라제 신포 펩티드를 코딩하는 개구리밥에서 최적화된 코딩 서열은 서열번호 7에, 코딩된 펩티드는 서열번호 8에 기재한다. 이러한 마이크로플라스미노겐 발현 벡터는 BAMp01로 명명한다.

BAMPO1 발현 벡터로 형질전환된 개구리밥 세포주를 전술한 바와 같에 제조하였다. 발현되는 마이크로플라스미노겐 대부분은 배양 배지로 분비되었다. 79개의 형질전환주를 스크리닝하여, 마이크로플라스미노겐의 발현율을 측정하였다. 도 7은 상기 주들에서 발현되는 마이크로플라스미노겐의 수준을 나타낸다. 첫 42 개의 주들은 7일간 생장하였으나, 이차 37개의 주들은은 6일간 생육하였다. 개구리밥은 매우 희석된 수계 매질의 무기성 배지에서, 단백질 함량이 매우 낮은 상태에서 생장하며, 발효 시스템과 포유류 세포성 발현 시스템과는 구별됨을 유념하여야 한다. 개구리밥의 생장 배지는 전형적으로 단지 숙주 식물 단백질 30 mg/L만을 함유한다. 이러한 매우 낮은 수준의 숙주 식물의 단백질은 분비된 단백질을 이후 정제할때 유리하다.

BAMPO1 형질전환주들중, BAMPO1-Bl-58를 선택하여, 추가적인 실험을 수행하 였다. 마이크로플라스미노겐을 다음과 같이 BAMPO1-Bl-58 세포주의 배양 배지에서 회수하였다. 배양 배지는 초여과 및 정용여과(diafiltration)로 처리한 다음, Dowex 이온 교환 수지 컬럼(Dow Chemical, Midland, Mich.)을 통과시켜, 저분자량의 식물 대사산물들을 제거하였다. 수계 조 배지에서 마이크로플라스미노겐을 농축하기 전 농도는 정량적인 웨스턴 블롯팅에 따르면 약 20 mg/L이었다.

개구리밥에서 생산된 마이크로플라스미노겐의 크기를 항-플라스미노겐 항체(American Diagnostica Inc. Greenwich, CT)를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 측정하였다. 상기 분석으로, 개구리밥에서 생산된 마이크로플라스미노겐의 대부분이 전장을 가지는 것으로 확인되었다. 무손상 N-말단은 N-말단 서열분석으로 검증하였다.

개구리밥에서 발현된 마이크로플라스미노겐의 활성을 BAMPO1-Bl-58 형질전환주에서 측정하고, 스트렙토키나제에 의한 활성화하여 플라스미노겐에 대한 전술한 활성형의 복합체를 제조하였다. 개구리밥에서 생산된 마이크로플라스미노겐은 스트렙토키나제 부재시 일부 활성을 나타내었으며, 스트렙토키나제에 의한 활성화 이후에 현저하게 활성이 증가되었다.

플라스미노겐과 유사하게, 마이크로플라스미노겐은 유로키나제 및 tPA에 의해 활성화될 수 있었지만, B-체인만 생산되었다. 웨스턴 블롯 분석으로, 개구리밥에서 생산된 마이크로플라스미노겐을 유로키나제 또는 tPA로 활성화시킨 후, 플라스민의 B 체인을 검증하였다.

렘나에서 생산된 마이크로플라스미노겐으로부터의 플라스민 활성을 확인하기 위해, 젤라틴 효소도(gelatin zymogram)를 tPA에 의한 활성화 이후에 농축된 배지에서 전개하였다. 도 8은 농축된 대조군 배지에 없는 활성의 단백질 분해 밴드가 있음을 나타낸다.

본 명세서에 언급된 모든 공개물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자의 수준에서 나타낸다. 모든 공개물 및 특허 출원은, 각각의 공개물 또는 특허 출원이 원용에 의해 포함되는 것으로 특별히 개별적으로 제시되어 있지만, 이들은 동일한 범위로 원용에 의해 본원에 포함된다.

전술한 발명은 예시에 의해 일부 상세히 설명하고 이해를 명확히하기 위한 실시예를 개시하지만, 특정한 변경 및 수정이 첨부된 청구범위내에서 실시될 수 있음이 명백하다.

SEQUENCE LISTING <110> Biolex, Inc. Spencer, David Dickey, Lynn F. Gasdaska, John R. Wang, Xiaowei Cox, Kevin M. Peele, Charles G. <120> EXPRESSION OF PLASMINOGEN AND MICROPLASMINOGEN IN DUCKWEED <130> 40989/288596 <150> US 60/543,487 <151> 2004-02-11 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 554 <212> DNA <213> Zea mays <400> 1 gatcaagtgc aaaggtccgc cttgtttctc ctctgtctct tgatctgact aatcttggtt 60 tatgattcgt tgagtaattt tggggaaagc ttcgtccaca gttttttttt cgatgaacag 120 tgccgcagtg gcgctgatct tgtatgctat cctgcaatcg tggtgaactt atgtctttta 180 tatccttcac taccatgaaa agactagtaa tctttctcga tgtaacatcg tccagcactg 240 ctattaccgt gtggtccatc cgacagtctg gctgaacaca tcatacgata ttgagcaaag 300 atctatcttc cctgttcttt aatgaaagac gtcattttca tcagtatgat ctaagaatgt 360 tgcaacttgc aaggaggcgt ttctttcttt gaatttaact aactcgttga gtggccctgt 420 ttctcggacg taaggccttt gctgctccac acatgtccat tcgaatttta ccgtgtttag 480 caagggcgaa aagtttgcat cttgatgatt tagcttgact atgcgattgc tttcctggac 540 ccgtgcagct gcgg 554 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Lemna gibba <400> 2 gaaactcccg aggtgagcaa ggatccggag tcgagcgcga agaagagaaa 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tac atc ctc caa ggc gtc acg tcc tgg ggc ctc ggc tgc gca cgc cct 2304 Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro 755 760 765 aac aag ccg ggc gtc tat gtg cgc gtg tcc cgc ttc gtg acc tgg atc 2352 Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile 770 775 780 gag ggc gtg atg cgc aac aac taa 2376 Glu Gly Val Met Arg Asn Asn * 785 790 <210> 4 <211> 791 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of mature human plasminogen <400> 4 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser 1 5 10 15 Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala 20 25 30 Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His 35 40 45 Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met 85 90 95 Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser 100 105 110 Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu 115 120 125 Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp 130 135 140 Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu 145 150 155 160 Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly 165 170 175 Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser 180 185 190 Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys 195 200 205 Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro 210 215 220 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile 225 230 235 240 Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys 245 250 255 Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val 260 265 270 Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His 275 280 285 Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr 290 295 300 Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn 305 310 315 320 Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser 325 330 335 Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr 340 345 350 Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly 355 360 365 Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser 370 375 380 Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala 385 390 395 400 Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro 405 410 415 Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu 420 425 430 Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val 435 440 445 Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe 450 455 460 Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly 465 470 475 480 Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile 485 490 495 Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys 500 505 510 Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn 515 520 525 Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro 530 535 540 Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly 545 550 555 560 Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln 565 570 575 Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu 580 585 590 Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser 595 600 605 Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val 610 615 620 Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu 625 630 635 640 Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala 645 650 655 Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr 660 665 670 Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Val Thr Gly Trp Gly Glu Thr 675 680 685 Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val 690 695 700 Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val 705 710 715 720 Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser 725 730 735 Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys 740 745 750 Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro 755 760 765 Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile 770 775 780 Glu Gly Val Met Arg Asn Asn 785 790 <210> 5 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Duckweed codon optimized sequence encoding human microplasminogen <221> CDS <222> (1)...(780) <400> 5 gag ccc ctg gac gac tac gtg aac acg cag ggc ccg tcc ttc gac tgc 48 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Pro Ser Phe Asp Cys 1 5 10 15 ggg aag cca cag gtg gaa ccg aag aag tgc cct ggc cgc gtg gtc gga 96 Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly 20 25 30 ggg tgc gtg gcc cac ccg cac tcc tgg ccc tgg caa gtc agc ctg cgc 144 Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg 35 40 45 acc cgc ttc ggc atg cac ttc tgc ggc ggc acc ctc atc tcc ccg gag 192 Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu 50 55 60 tgg gtt ctg acc gcc gct cac tgc ctc gag aag tcc ccg agg ccc tcc 240 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser 65 70 75 80 tcc tac aag gtc atc ctg ggc gcc cac cag gag gtg aac ctc gag ccg 288 Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro 85 90 95 cac gtt cag gag atc gag gtg tcc cgc ttg ttc ctg gag ccc acg cgc 336 His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg 100 105 110 aag gat atc gcc ctg ctc aag ctc tct agc ccg gcc gtc atc acc gac 384 Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp 115 120 125 aag gtt atc ccg gcc tgc ctt ccc tcc ccg aac tac gtg gtc gct gac 432 Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp 130 135 140 cgc acc gag tgc ttc gtt acc ggc tgg ggc gag acc cag gga acg ttc 480 Arg Thr Glu Cys Phe Val Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe 145 150 155 160 ggc gcg ggc ctc ctc aag gag gcc cag ctc ccg gtg att gag aac aag 528 Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys 165 170 175 gtg tgc aac cgt tac gag ttc ctg aac ggg cgc gtc cag tcc acc gaa 576 Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu 180 185 190 ctc tgc gcc ggg cac ttg gcc ggc ggc acc gac agc tgc cag ggc gac 624 Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp 195 200 205 agc ggc ggg ccg ctg gtg tgc ttc gag aag gac aag tac atc ctc caa 672 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln 210 215 220 ggc gtc acg tcc tgg ggc ctc ggc tgc gca cgc cct aac aag ccg ggc 720 Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly 225 230 235 240 gtc tat gtg cgc gtg tcc cgc ttc gtg acc tgg atc gag ggc gtg atg 768 Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met 245 250 255 cgc aac aac taa 780 Arg Asn Asn * <210> 6 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of mature human microplasminogen <400> 6 Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Pro Ser Phe Asp Cys 1 5 10 15 Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly Arg Val Val Gly 20 25 30 Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg 35 40 45 Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Glu 50 55 60 Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro Arg Pro Ser 65 70 75 80 Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn Leu Glu Pro 85 90 95 His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu Pro Thr Arg 100 105 110 Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Asp 115 120 125 Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val Val Ala Asp 130 135 140 Arg Thr Glu Cys Phe Val Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln Gly Thr Phe 145 150 155 160 Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile Glu Asn Lys 165 170 175 Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln Ser Thr Glu 180 185 190 Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp 195 200 205 Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr Ile Leu Gln 210 215 220 Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn Lys Pro Gly 225 230 235 240 Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu Gly Val Met 245 250 255 Arg Asn Asn <210> 7 <211> 96 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (4)...(96) <400> 7 acc atg cag gtc ctg aac acg atg gtc aac aag cac ttc ctc tcc ctg 48 Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu 1 5 10 15 tcc gtc ctc atc gtc ctc ctc ggg ctg agc agc aac ctc acc gcc ggc 96 Ser Val Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 8 Met Gln Val Leu Asn Thr Met Val Asn Lys His Phe Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ser Asn Leu Thr Ala Gly 20 25 30 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Substrate for plasmin <400> 9 Glu Phe Lys 1

Claims (55)

1. (a) 플라스미노겐(plasminogen)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로 안정적으로 형질전환시킨 개구리밥 식물, 개구리밥 식물세포 또는 개구리밥 결절(nodule)을 배양하는 단계; 및

   (b) 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물세포 또는 개구리밥 결절로부터 플라미노겐을 수집하는 단계;

   를 포함하는, 개구리밥에서 플라스미노겐을 생산하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마이크로플라스미노겐을 배양 배지로분비시키는 신호 펩티드를 코딩하는 서열과 작동가능하도록 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아래 (a) 내지 (c)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 속성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법:

   (a) 상기 플라스미노겐에 대한 코딩 서열내 개구리밥 선호 코돈(duckweed-preferred codon).

   (b) 상기 코딩서열의 상위에 삽입된 식물 인트론을 포함하는, 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열, 및

   (c) 플라스미노겐을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 번역을 증가시키는 리더 서열을 포함하는, 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열.
4. 제 3항에 있어서, 상기 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 70 내지 100%의 개구리밥 선호 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3항에 있어서, 상기 식물 인트론은 옥수수의 알코올 디하이드로게나제 1 유전자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 식물 인트론은 서열번호 1에 기재된 서열을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 3항에 있어서, 상기 리더 서열은 렘나 지바(Lemna gibba)의 리불로스-비스-포스페이트 카르복실라제 스몰 서브유닛 5B 유전자(ribulose-bis-phosphate carboxylase small subunit 5B gene)로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 3항에 있어서, 상기 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 인간 플라스미노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 플라스미노겐은 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에 있어서, 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물 세포내 수용성 단백질의 2% 이상이 플라스미노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물 세포내 수용성 단백질의 3% 이상이 플라스미노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물 세포내 수용성 단백질의 4% 이상이 플라스미노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
15. (a) 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과, 상기 뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결되어 마이크로플라스미노겐을 배양 배지로 분비시키는 포함하는, 핵산 분자로 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물 배양물, 개구리 밥 식물세포 또는 개구리밥 결절 배양물을, 개구리밥 배양 배지에서 배양하는 단계; 및

    (b) 상기 개구리밥 배양 배지에서 상기 마이크로플라미노겐을 수집하는 단계;

    를 포함하는, 개구리밥에서 마이크로플라스미노겐을 생산하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 마이크로플라스미노겐은 개구리밥 배양 배지로 분비되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 개구리밥 배양 배지는 정량적 웨스턴 블롯팅으로 측정하였을 때 1 mg/L 이상의 마이크로플라스미노겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 16항에 있어서, 상기 개구리밥 배양 배지는 정량적 웨스턴 블롯팅으로 측정하였을 때 2 mg/L 이상의 마이크로플라스미노겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 16항에 있어서, 상기 개구리밥 배양 배지는 정량적 웨스턴 블롯팅으로 측정하였을 때 5 mg/L 이상의 마이크로플라스미노겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 개구리밥 배양 배지는 정량적 웨스턴 블롯팅으로 측정하였을 때 10 mg/L 이상의 마이크로플라스미노겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 15항에 있어서, 상기 마이크로플라스미노겐과 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아래 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 속성을 가진 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 상기 마이크로플라스미노겐의 코딩 서열내 개구리밥 선호 코돈,

    (b) 상기 신호 펩티드를 코딩하는 서열내 개구리밥 선호 코돈,

    (c) 마이크로플라스미노겐의 코딩 서열 상위에 삽입된 식물 인트론을 포함하는, 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열, 및

    (d) 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 번역을 증가시키는 리더 서열을 포함하는, 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열.
22. 제 21항에 있어서, 상기 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 70 내지 100%의 개구리밥 선호 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 신호 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 70 내지 100%의 개구리밥 선호 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21항에 있어서, 상기 식물 인트론은 옥수수의 알코올 디하이드로게나제 1 유전자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24항에 있어서, 상기 식물 인트론은 서열번호 1에 기재된 서열을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 21항에 있어서, 상기 리더 서열은 렘나 지바(Lemna gibba)의 리불로스-비스-포스페이트 카르복실라제 스몰 서브유닛 5B 유전자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 21항에 있어서, 상기 마이크로플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 15항에 있어서, 상기 마이크로플라스미노겐은 인간 마이크로플라스미노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 29항에 있어서, 상기 마이크로플라스미노겐은 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 15항에 있어서, 상기 신호 펩티드는 벼의 알파 아밀라제 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31항에 있어서, 상기 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 서열번호 7에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 15항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 1항에 있어서, 상기 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물 세포는 스피로델라(Spirodela) 속, 울피아(Wolffia) 속, 울피엘라(Wolfiella) 속 및 렘나(Lemna) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 15항에 있어서, 상기 개구리밥 식물 또는 개구리밥 식물 세포는 스피로델라(Spirodela) 속, 울피아(Wolffia) 속, 울피엘라(Wolfiella) 속 및 렘나(Lemna) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 1항의 방법에 따라 플라스미노겐을 생산하는 단계를 포함하는, 안정적인 플라스미노겐 생산을 개선시키는 방법.
37. (a) 플라스미노겐 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로 안정적으로 형질전환시킨 개구리밥 식물, 개구리밥 식물세포 또는 개구리밥 결절을 개구리밥 배양 배지에서 배양하는 단계; 및

    (b) 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물세포, 개구리밥 결절 또는 개구리밥 배양물로부터 선택된 한가지 이상의 배양물로부터 플라스미노겐 절편을 수집하는 단계;

    를 포함하는, 개구리밥에서 플라스미노겐 절편을 생산하는 방법.
38. 제 37항에 있어서, 상기 플라스미노겐 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 마이크로플라스미노겐을 배양 배지로 분비시키는 신호 펩티드를 코딩하는 서열과 작동가능하도록 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 37항에 있어서, 상기 플라스미노겐 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아래 (a) 내지 (c)로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 속성을 가진 것을 특징으로 하는 방법:

    (a) 상기 플라스미노겐의 코딩 서열내 개구리밥 선호 코돈

    (b) 상기 코딩 서열의 상위에 삽입된 식물 인트론을 포함하는, 작동가능하도 록 연결된 뉴클레오티드 서열, 및

    (c) 플라스미노겐을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열의 번역을 증가시키는 리더 서열을 포함하는, 작동가능하도록 연결된 뉴클레오티드 서열.
40. 제 39항에 있어서, 상기 플라스미노겐 절편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 70 내지 100%의 개구리밥 선호 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 39항에 있어서, 상기 식물 인트론은 옥수수의 알코올 디하이드로게나제 1 유전자로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 37항에 있어서, 상기 플라스미노겐 절편은 성숙형 플라스미노겐 아미노산 서열에서 80개 이상의 연속적인 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 1항의 방법에 따라 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
44. 제 43항에 있어서, 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절은 스피로델라(Spirodela) 속, 울피아(Wolffia) 속, 울피엘라(Wolfiella) 속 및 렘나(Lemna) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속인 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
45. 제 44항에 있어서, 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절은 렘나 마이너(Lemna minor), 렘나 미니스큘라(Lemna miniscula), 렘나 에퀴녹티얼리스(Lemna aequinoctialis) 및 렘나 지바(Leinna gibba)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 일원인 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
46. 제 15항의 방법에 따라 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
47. 제 46항에 있어서, 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절은 스피로델라(Spirodela) 속, 울피아(Wolffia) 속, 울피엘라(Wolfiella) 속 및 렘나(Lemna) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속인 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
48. 제 47항에 있어서, 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절은 렘나 마이너(Lemna minor), 렘나 미니스큘라(Lemna miniscula), 렘나 에퀴녹티얼리스(Lemna aequinoctialis) 및 렘나 지바(Leinna gibba)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 일원인 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
49. 제 37항의 방법에 따라 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
50. 제 49항에 있어서, 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절은 스피로델라(Spirodela) 속, 울피아(Wolffia) 속, 울피엘라(Wolfiella) 속 및 렘나(Lemna) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 속인 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
51. 제 50항에 있어서, 상기 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절은 렘나 마이너(Lemna minor), 렘나 미니스큘라(Lemna miniscula), 렘나 에퀴녹티얼리스(Lemna aequinoctialis) 및 렘나 지바(Leinna gibba)로 이루어진 군으로부터 선택된 종의 일원인 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물, 개구리밥 식물 세포 또는 개구리밥 결절.
52. 아래 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산으로서;

    (a) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열,

    (b) 서열번호 4에 기재된 플라스미노겐 서열의 변이체에 대한 아미노산 서열로서, 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열,

    (c) 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열, 및

    (d) 서열번호 6에 기재된 마이크로플라스미노겐 서열의 변이체에 대한 아미노산 서열로서, 서열번호 6의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열,

    상기 뉴클레오티드 서열은 70-100%의 개구리밥 선호 코돈을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 핵산.
53. 제 52항에 있어서, 상기 핵산 분자는 (a) 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 서열번호 5에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
54. DNA 구조체를 포함하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물로서,

    상기 DNA 구조체는 작동가능하도록 연결된 요소들, 리더 서열, 프로모터 서열, 플라스미노겐을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 전사 종결 서열을 포함하며,

    상기 리더 서열, 프로모터 서열 및 종결 서열은 모두 개구리밥에서 기능하는 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 개구리밥 식물.
55. 제 54항에 있어서, 상기 리더 서열은 서열번호 2에 기재된 서열이고, 플라스미노겐을 코딩하는 서열은 서열번호 3에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는, 안정 적으로 형질전환된 개구리밥 식물.

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