KR100791090B1 - 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 - Google Patents

플라스미노겐 액티베이터 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 포함하는 식물 형질 전환용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물에 관한 것이다.
본 발명의 벡터를 식물세포에 도입하면 식물세포에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 활성있는 형태로 발현시킬 수 있기 때문에, 생산단가가 매우 저렴하여 효과적인 혈전용해제 개발에 이용할 수 있다.
TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열, 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator)

Description

플라스미노겐 액티베이터 유전자를 포함하는 식물 형질 전환용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물{Plant Transformation Vector Comprising Tissue-Type Plasminogen Activator Gene and Plant Transformed Thereby}
도 1a는 본 발명에 따른 식물 형질전환용 벡터의 모벡터(pBSNB22101)의 모식도(A) 이고,
도 1b는 본 발명에 따른 식물 형질전환용 벡터의 모식도(B)이다.
(P35S: cauliflower mosaic virus 35S 프로모터, bar: 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자, Ti7: T-DNA 유전자 7의 터미네이터 서열, TEV: tobacco etch virus 리더 서열, SS: 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열(signal sequence), T35S: cauliflower mosaic virus 35S 터미네이터)
도 2는 상기 벡터에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위하여 제한효소 처리한 결과이다.
(레인 1-12 : 식물 형질전환용 벡터, 레인 M: 분자량 마커)
도 3a는 선별된 제초제(바스타) 저항성 유전자(bar)를 갖는 담배 형질전환체 사진이고(화살표는 야생형(wild type)의 담배식물체를 나타냄),
도 3b는 바 스트립(bar strip)을 이용하여 형질전환체 식물에서 발현된 포스 피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(phophinothricin acetyl transferase)를 확인한 결과이다.
도 4a는 PCR을 이용한 형질전환체에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 삽입되었는지 확인한 결과이고,
(레인 1-30 : 형질전환체, wt : 야생종, p : 발현벡터 )
도 4b는 RT-PCR을 이용하여 재조합 플라스미노겐 액티베이터 유전자의 전사 유무를 확인한 결과이다.
(레인 1 : 발현벡터 PCR, 레인 2 : 형질전환체 PCR, 레인 3 : wt RT-PCR, 레인 4-11 : 형질전환체 RT-PCR)
도 5는 웨스턴 블럿을 통한 형질전환체에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 확인한 결과이다.
(t-PA : 대조군, wt : 야생형, T1, T17, T27, T29 : 형질전환체)
도 6은 ELISA를 통한 형질전환체에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 발현양을 확인한 결과이다.
(TSP : 총 가용성단백질(total soluble protein))
도 7은 형질전환체에서 발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터의 피브린 분해 활성을 피브린 플레이트법(fibrin-plate method)을 통해 확인한 결과이다.
(t-PA : 대조군, wt : 야생형, rTPA : 형질전환체)
도 8은 자이모그라피(Zymography)를 이용한 재조합 플라스미노겐 액티베이터의 분자량을 확인한 결과이다.
(t-PA : 대조군, wt : 야생형, T17, T29 : 형질전환체)
도 9는 SDS-PAGE를 이용한 피브린 특이 사슬 분해활성을 확인한 결과이다.
(t-PA : 대조군, rTPA : 형질전환체)
본 발명은 식물에서 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 식물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 식물에 관한 것이다.
조직형 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator, 이하 ‘t-PA’ 약칭함)는 피브린 용해에 수반되는 세린 프로테아제로써, t-PA는 혈관 내피세포 등의 인체 조직에서 생산되는 분자량 약 68,000 달톤 정도 크기의 당단백질로서 혈전 용해제로 사용되고 있다. 혈전이란 혈관내에 생기는 혈액의 덩어리로서 이로 인해 모세혈관이 막혀서 수족마비, 뇌 경색, 심근 경색 등이 발생한다. 혈 전의 주성분은 피브린이라는 당단백질이며, 플라스민에 의해 분해된다. t-PA는 혈전을 형성하는 피브린에 대한 친화성이 높을 뿐만 아니라 피브린이 존재할 때 그 활성도가 100-200배 증가하는 특성이 있어서 피브린 표면에서 국소적으로 작용하여 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키며, 스트랩토카이네이즈나 유로카이네이즈 등과 같은 다른 혈전용해제에 비해 특이성이 높은 것으로 알려져 있다(Bergmann, S. R. et al., Science 220: 1181-1183. 1981). 한편, 스트랩토카이네이즈나 유로카이네이즈 등은 혈액내에 순환하는 플라스미노겐까지도 활성화시키기 때문에 심한 출혈현상 등과 같은 부작용을 나타내기도 한다고 보고되어 있으나, 플라스미노겐 액티베이터에서는 이러한 부작용이 보고된 바 없다.
한편, 종래 플라스미노겐 액티베이터를 생산하는 방법으로는 미국특허 제4,853,330호, 제5,869,314호에 사람조직 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 대장균과 차이니즈 햄스터의 난소세포인 CHO 세포에서 발현하는 방법이 개시된 바 있으며, 미국특허 제 5,106,741호에 플라스미노겐 액티베이터 변이체를 대장균과 효모에서 발현시키는 방법이 개시된 바 있다. 그러나 미생물 발현의 경우 대부분은 불용성 형태로 발현되고, 재접힘 반응을 필수적으로 행하여야 하며, 당이 붙지 않는 문제점이 있었고, 동물세포 발현의 경우에는 생산단가에 있어 고비용이 소요되므로 가격경쟁력 측면에서 비효율적이라는 단점이 있었다. 따라서, 기존의 혈전용해제에 비하여 획기적인 가격 경쟁력을 갖으며, 활성형태의 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 생산방법이 요구되었다.
이에, 본 발명자들은 식물에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현시키는 방법을 연구하던 중 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자를 식물에 도입시켜 발현시킬 경우 활성형태의 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현시킬 수 있으며, 그 발현효율도 뛰어남을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 식물을 제조방법 및 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해서 유전자가 도입된 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질의 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적으로 플라스미노겐 액티베이터 및 그 변이체의 생산은 CHO 세포, 대장균을 이용하여 생산하며, 식물세포에서 플라스미노겐 액티베이터를 발현시키는 것은 보고된 바 없다. 그러나 본 발명자들은 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터를 이용하여 식물체내에 상기 유전자를 도입함으로써 식물세포에서 최초로 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 생산하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 식물 세포에서 생산되는 플라스미노겐 액티베이터 단백질이 불용성 형태가 아닌 활성있는 형태로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터를 제공한다.
상기 ‘TEV(tobacco etch virus) 리더 서열’은 재조합 번역 단계에서 단백질의 발현양의 증대를 가져오는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 사용한 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열은 GenBank No. M15239에 개시되어 있는 것으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가진다.
상기 ‘알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열’은 GenBank No. M8023에 개시되어 있는 것으로 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가진다.
본 발명에서는 플라스미노겐 액티베이터의 글라이코실레이션(glycosylation)과 올바른 폴딩(folding) 구조를 가지도록 하기 위하여, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서 열을 플라스미노겐 액티베이터 유전자의 상부에 삽입하였다
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 사용되는 ‘플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자’는 플라스미노겐 액티베이터 단백질 또는 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 상기 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 기능적 동등물이란 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 상기에서 '동등한 생리활성'이란 피브린 분해 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물이란 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 플라스미노겐 액티베이터의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 4로 표시되는 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 천연형의 플라스미노겐 액티베이터 유전자 대신 플라스미노겐 액티베이터의 유전자 변이체를 이용할 수 있는데, 상기 플라스미노겐 액티베이터의 변이체에 대해서는 미국특허 제4,963,357호, 제5,037,752호, 제5,087,572호, 제5,094,953호, 제5,100,666호, 제5,106,741호, 제5,108,901호, 제5,156,969호, 제5,185,259호, 제5,232,847호, 제5,242,819호, 제5,244,676호, 제5,258,180호, 제5,258,298호, 제5,262,170호, 제5,270,198호, 제5,302,390호, 제5,314,818호, 제5,338,546호, 제5,346,824호, 제5,366,886호, 제5,376,547호, 제5,385,732호, 제5,405,771호, 제5,411,871호, 제5,486,471호, 제5,504,001호, 제5,520,911호, 제5,520,913호, 제5,556,621호, 제5,580,559호, 제5,589,361호, 제5,614,190호, 제5,616,486호, 제5,648,250호, 제5,714,144호, 제5,714,145호, 제 5,714,372호, 제5,728,565호, 제5,728,566호, 제5,728,567호, 제5,736,134호, 제5,739,012호, 제5,753,486호, 제5,756,093호, 제5,770,425호, 제5,770,426호, 제5,821,105호, 제5,830,849호, 제5,840,533호, 제5,840,564호, 제5,869,314호, 제5,908,625호 및 제6,706,504에 개시되어 있으며, 이에 대한 설명은 본원에 인용된다.
본 발명의 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터는 공지의 식물 형질전환용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 Ti 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용하고 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 도 1에 개시된 개열지도를 포함한다. 즉, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 칼리플라워 모자이크 바 이러스 35S 프로모터, 선택 표지 유전자로서 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(제초제 저항성 유전자), T-DNA 유전자 7의 터미네이터 서열, TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열(signal sequence) 및 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 터미네이터가 순차적으로 연결된 유전자 구조물을 포함한다.
본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터 및 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터를 포함하며, 바람직하게는 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터를 사용한다.
또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP(green fluorescence protein) 유전자, GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만 그 것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ(NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있지만, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제가 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법을 사용하여, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열과 연결되어 있는 t-PA 유전자(1668 bp)를 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, TEV(tobacco etch virus) 리더서열 및 35S 터미네이터를 포함하는 식물 발현 벡터 (p221a)에 클로닝하여 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 선택 표지 유전자로서 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(제초제 저항성 유전자), T-DNA 유전자 7의 터미네이터 서열, TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열(signal sequence) 및 T35S 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 터미네이터가 순차적으로 연결된 벡터 pBS221t-PA를 제조하여 사용하였다(도 1 참조).
상기의 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법인 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989; by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1984; and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience , 1987).
한편, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 유전자가 도입되도록 하였다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 세균을 제공한다. 상기 세균으로는 아그로박테리움 속 세균이 있다. 형질전환용 숙주로 사용되는 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다.
본 발명은 또한, 상기 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기의 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물의 제조방법 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 의해 제조되는 플라스미노겐 액티베이터는 활성 형태의 단백질으로 본 발명의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물로부터 공지된 방법에 의해 추출 및 정제하여 생산할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물에 도입하는 방법으로는 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al., EMBO J 4:227-288,1985).
본 발명에서 ‘식물’ 이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 버즈풋 트레포일, 감자, 개구리밥, 들깨, 비둘기콩 및 완두가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 담배를 사용하였다.(실시예 2 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 합성 유전자가 도입되도록 하였다(실시예 2 참조).
한편, 상기와 같은 방법으로 본 발명의 합성 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기와 같이 재분화된 식물체내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여, 형질전환체 시료에 플라스미노겐 액티베이터 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과, DNA 레벨에서 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인하였다(도 4 참조)
본 발명의 다른 실시예에서는 상기와 같이 재분화된 식물체내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 단백질로 안정하게 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 형질전환체 시료를 사용하여 웨스턴 블럿 및 ELISA를 한 결과, 단백질 레벨에서도 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).
또한 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 방법에 의해 생산된 플라스미노겐 액티베이터 단백질이 활성 형태인지 여부를 피브린 플레이트법을 통하여 확인한 결과 피브린의 분해 활성이 있는 것을 확인하였고(도 7 참조), SDS-PAGE를 이 용한 피브린 특이 사슬 분해활성을 확인한 결과 양성 대조군의 t-PA와 유사한 활성을 나타내는 것을 확인하여(도 9 참조) 본 발명의 방법에 의해 생산된 플라스미노겐 액티베이터 단백질이 활성 형태임을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
식물 형질전환용 벡터 및 아그로박테리움 형질전환체 제조
<1-1> 식물 형질전환용 벡터의 제작
알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질 (GenBank accession no. M80235)의 신호서열과 연결되어 있는 t-PA 유전자(1668 bp)를 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, TEV(tobacco etch virus) 리더서열 및 35S 터미네이터를 포함하는 식물 발현 벡터 (p221a)에 클로닝하기 위해서 다음과 같이 발현 벡터를 제조하였다.
pCAMBIA 2300(CAMBIA, 호주)를 먼저 제한 효소 Hind III로 절단 후 탈인산화 효소(calf intestine phosphatase)를 사용하여 탈인산화하였다. 그런 후 플라스미드 pDPG165 (Kausch et al., 2001)를 Hind III로 절단 후 상기 Hind III로 절단 된 pCAMBIA 2300에 연결하여 플라스미드 pBS221를 제조하였다. 상기 플라스미드 pBS221에 있는 제한효소 (BamH I, Kpn I, Xba I) 자리를 제거하기 위해서 각각의 제한 효소로 절단 후 T7 폴리머라제로 중합 반응을 실시하였다.
한편, pBI221(클론텍회사)에 폴리클로닝 위치를 삽입하고자, pBI221을 Sac I과 Xba I으로 절단한 후 합성된 올리고뉴클레오티드(서열번호 5 : 5'-GACGCGTGAGCTCGGTACCTCGCGAGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTG-3')와 연결시킨 다음, T7 폴리머라제로 중합 반응 후 블런트로 삽입하였다. 상기 올리고뉴클레오티드가 삽입된 pBI221에서 CaMV 35 프로모터, 폴리클로닝 위치와 Nos 터미네이터가 포함된 절편을 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 프라이머-1 및 프라이머-2 (primer-1; 5'-CGGAATTCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAG-3', primer-2; 5'-CGGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3')를 사용하여 PCR (반응조건 : 95도 5분, 1회; 94도 30초, 60도 30초, 72도 2분, 30회; 72도 7분, 1회)을 이용하여 증폭하였으며, 제한효소 EcoR I를 사용하여 절단 후 상기 pBS221에 클로닝하여 벡터 pBSNB22101를 제조하였다(도 1 참조). 두개의 선택적 마커 (npt II and bar)가 포함되어 있는 상기 벡터에서 하나의 선택적 마커만 남도록 하기 위하여, 상기 벡터를 Hind III와 Xho I으로 절단하여 선택적 마커 중 하나인 npt II를 제거하여 pBSB22101이라 명명하였다. 또한 발현양 증대를 위하여 pRTL2(Carrington and Freed et al., J. Virol.64, 1990)를 템플레이트로 사용하여 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 프라이머-3 및 프라이머-4(primer-3: 5'-CGACGCGTAAATAACAAATCTCAACACAACATATAC-3', primer-4: 5'-CGGGATCCAAATAACAAATCTCAACACAACATATA-3')를 이용하여 TEV 리더 서열을 PCR로 증폭 (반응조건 : 95도 5분, 1회; 94도 30초, 60도 30초, 72도 1분, 30회; 72도 7분, 1회)후 Mlu I과 Kpn I로 절단한 다음에, pBSB22101의 Mlu I과 Kpn I에 위치에 삽입하여 p221a를 제조하였다. 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열을 t-PA의 5‘쪽에 부치기 위해서 다음과 같이 실험을 수행하였다. 먼저 서열번호 2포 표시되는 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열의 합성된 올리고뉴클레오티드와 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 끓는 물에 5분간 가열 후 상온에서 30분 어닐링(annealing)하였다. 그리고 서열번호 10으로 표시되는 프라이머 5와 서열번호 11로 표시되는 프라이머 6을 이용하여 (프라이머 5 : 5'-TCTTACCAAGTGATCTGCAGAG-3', 프라이머 6 : 5'-CCCAAGCTTTCACGGTCGCATGTTGTCACG-3') 증폭된 t-PA PCR 산물과 혼합 후 T4 DNA 라이게이즈 (다카라회사)를 이용하여 16도에서 30분간 배양 하였다. 그리고 서열번호 12로 표시되는 프라이머 7과 상기 서열번호 11로 표시되는 프라이머 6(프라이머 7 : 5'-CGGGGTACCATGAAAATGGAGATGCATCAGATC-3')을 사용하여 PCR (반응조건 : 95도 5분, 1회; 94도 30초, 60도 30초, 72도 2분, 30회; 72도 7분, 1회)을 하여 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질의 신호서열을 포함하는 t-PA PCR 산물을 얻었다. 상기 t-PA PCR 산물을 Kpn I과 Hind III 로 절단하여 1668bp의 t-PA 유전자를 상기 p221a 벡터에 클로닝하여 pBS221t-PA를 제작하였다(도 1의 B 참조).
한편, 상기 발현 벡터에 플라스미노겐 엑티베이터 유전자가 제대로 삽입되었는지 유무를 확인하기 위해서 Kpn I과 Hind III로 절단 후 1% 아가로스 젤 전기영 동을 실시하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 약 2kbp의 유전자의 삽입 유무를 확인하였다.
<1-2> 아그로박테리움 형질전환체 제조
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 pBS221t-PA 벡터를 동결-해동(freeze-thaw) 방법(Glevin et al., Plant molecular biology. Kluwer academic Publishers A3/7, 1988)으로 아그로박테리아 EHA105(prodigene.com)에 도입시켰다. 이후, 상기 형질전환된 아그로박테리아를 2일간 YEP 배지(10g/ℓ 박토 이스트 추출물, 10g/ℓ 박토 펩톤, 5g/ℓ NaCl)에서 배양하여 이를 1/2 MS 배지에 재현탁시켰다.
<실시예 2>
담배 형질전환체의 제조
플라스미노겐 액티베이터 유전자를 담배에서 발현하고자 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 아그로박테리아 EHA105를 담배 잎에 형질전환하였다.
소독한 담배 종자를 파종하여 2주 이상 무균 배양한 신선하고 어린 담배잎을 채취하였다. 흡광도 0.4로 정량된 아그로박테리아를 상기 담배 자엽에 30분간 감염 후 MS 배지에 이틀간 암조건에서 공동 배양하였다. 이틀 후 MS-비타민 포함 배지(Duchefa)에 3.0% 수크로스, 1 mg/ℓ BA (benzyladenine), 0.1 mg/ℓ NAA (napthalene acidic acid), 0.3% 파이타젤, 4 mg/ℓ 피피티 (phosphinothricin) 및 500 mg/ℓ 카르베니실린을 첨가한 선발 배지 (pH 5.8)에서 재분화를 유도하였다. 14일 간격으로 캘러스와 잎 조직을 계대하였다. 4주 후에 재분화된 줄기는 MS 배지에서 뿌리를 유도하였고 순화 과정을 거친 후 온실에서 재배하였다. 형질전환체를 판별하기 위해서 유모에 4일 간격으로 바스타 0.5%를 두 번 처리 후 저항성을 갖는 형질전환체를 구별하였다
실험결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 0.5%(v/v) 바스타 살포에 의해 형질전환체를 선별할 수 있었으며(도 3의 A), 바 스트립(bar strip)을 이용하여 PAT(phosphinothricin acetyl transferase) 단백질이 발현됨을 확인한 결과, 형질전환체에서 PAT 단백질이 발현되어 제초제 저항성이 유지됨을 확인할 수 있었다(도 3의 B).
<실험예 1>
PCR을 이용한 형질전환체에서의 플라스미노겐 액티베이터 유전자 확인
바스타 처리 후 생존하는 식물체의 성숙된 잎에서 게노믹 DNA를 분리 후(Edwards, K., et. al., Nucleic acid Research, 19, 1349, 1991) PCR을 이용하여 형질전환체 식물내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자의 삽입을 확인하였다.
플라스미노겐 액티베이터를 증폭하기 위하여, 정방향 프라이머로는 서열번호 13으로 표시되는 프라이머-8(5‘-cggggtaccggagggatttatgtcttaccaag-3’)을 사용하였고, 역방향 프라이머로는 서열번호 11로 표시되는 프라이머-6을 사용하여 PCR 하 였으며, 상기 PCR 조건은 95oC에서 5분간 전처리 후 94oC에서 30초, 60oC에서 30초, 72oC에서 2분간 30회 반복한 다음 72oC에서 7분간 연장(extension)하였다.
실험결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, 대략 1.7 kbp에 해당하는 PCR 산물이 증폭되어, 형질전환 식물체내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 제대로 삽입된 것을 확인할 수 있었다.
또한 형질전환체에 삽입된 플라스미노겐 액티베이터 유전자의 전사 유무를 알아보기 위해서 RT-PCR을 실시하였다. 담배 잎 (150 mg)에서 전체 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Breda, Netherlands)을 사용하여 정제를 하였으며, RT-PCR 분석을 위하여, 전체 RNA 시료는 DNase(타카라)를 사용하여 오염된 게노믹 DNA를 제거하였으며, 1 μg의 RNA를 다음과 같은 조성으로 구성된 완충용액 (1x 원 스텝 RNA PCR 버퍼, 0.8 U RNase 억제제, 프라이머 0.4μM, 0.1AMV RTase XL, 0.1 U AMV-최적화된 Taq DNA 폴리머라제, 5 mM dNTP and 5MgCl2)에서 다음과 같은 조건으로 반응을 실시하였다. 담배잎에서 분리한 토탈 RNA를 주형으로 서열번호 14로 표시되는 정방향 프라이머-9(5′- TCTTACCAAGTGATCTGCAGAG-3′)와 서열번호 15로 표시되는 역방향 프라이머-10(5′- TCACGGTCGCATGTTGTCAC-3′)을 사용하여 50°C에서 30분, 94°C에서 2분간 전처리한 다음에 94°C에서 30초, 60°C에서 30초, 72°C에서 2분씩 35회를 반복하였다. 실험결과, 선별된 형질전환체에서 전사가 정상적으로 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다. 대조군으로 사용된 야생종에서는 어느 밴드도 볼 수 없었다 (도 4B).
<실험예 2>
웨스턴 블럿을 이용한 형질전환체에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 확인
형질전환체에서 발현된 재조합 단백질의 분자량을 측정하고자 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다.
1X PBS버퍼 1 ml에 형질전환체 200 mg을 호모게나이즈 하였다. 그런 후 4℃에서 30분 방치 후 12,000 rpm에서 30분간 원심분리 후 상층액(100 )을 형질전환체의 PBS(Phosphate buffer saline) 추출시료로 사용하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 웨스턴 블랏 후 t-PA에 대한 다클로날(polyclonal)항체(Abcam)를 사용하여 하룻밤동안 4oC에서 배양하였고, PBS-0.05% Tween 20 용액으로 5회 세척한 다음, HRP (horseradish peroxidase)가 붙어 있는 이차 항체(Pierce)와 상온에서 4시간 배양 후 5회 세척하였으며 마지막으로 4-클로로나프톨(4-chloronaphthol)을 이용하여 발색 반응을 실시하였다.
실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이 형질전환체에서 약 68,000 Da의 플라스미노겐 액티베이터 단백질 밴드가 확인되어, 단백질 레벨에서도 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.
<실험예 3>
ELISA을 이용한 형질전환체에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 발현율 확인
발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 항원력 검증과 발현양을 측정하고자 ELISA를 실시하였다. soluble t-PA ELISA 키트( CalBiochem사)를 이용하여 형질전환체내의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 양을 측정하였다.
상기 실험예 2에서 제조한 PBS 추출 시료 50 ㎍/100 ㎕와 상온에서 1시간 반응 후 PBS-0.05% Tween으로 3회 세척 후 HRP가 붙어 있는 이차 항체를 사용하여 상온에서 2시간 반응 후 다시 PBS-0.05% Tween으로 3회 세척 후 100 ㎕의 TMB (tetramethyl-benzidine)를 처리 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 도 6에 나타난 바와 같이 1, 5, 6, 17, 19, 21, 27, 29번 형질전환체 등 7계통에서 0.012 ㎍/㎎ 이상으로 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 대조군으로 사용된 야생형(wt)에서는 흡광도의 변화가 없었다.
<실험예 4>
피브린 플레이트법(fibrin-plate method)을 통한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 효소 활성 확인
형질전환체에서 발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터의 피브린 분해활성을 측정하고자 피브린 플레이트법을 이용하여 재조합 효소의 피브린 분해능을 측정하였다.
0.8%의 피브리노겐(fibrinogen) 용액 10 ml과 10 유닛의 트롬빈 용액 0.5 ml, 플라스미노겐(plasminogen) 0.5 ml을 혼합한 후 플레이트상에 붓고 30분간 상온에 방치하여 피브린을 형성시켰다. 상기 피브린 플레이트에 양성 대조군인 t-PA 0, 100pg, 300pg, 1000pg, 3000pg과 형질전환체 T17, T29의 PBS 추출물 25 ㎍을 점적한 후 습도가 높은 37oC 배양기에서 하룻밤 정치하였다.
실험결과, 도 7에 나타난 바와 같이 효소의 피브린 분해활성은 본 발명의 형질전환체 추출시료 25 ㎍과 양성대조군 3000pg이 유사한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로 사용된 야생형 담배의 추출물에서는 어떠한 분해활성 반응도 찾아볼 수 없었다.
<실험예 5>
자이모그라피(Zymography)를 이용한 재조합 플라스미노겐 액티베이터의 분자량 확인
상기 실험예 4에서 피브린 플레이트를 통해 피브린 분해활성 확인된 형질전환체에서 발현된 효소의 분자량을 측정하고자 자이모그라피(zymography)를 실시하였다.
0.7% 피브리노겐 5 ml, 2% 아가로스 5 ml, 5 NIH 트롬빈 1 ml을 혼합한 후 상온에서 30분간 방치하였다. 상기 실험예 2에서 제조된 PBS 추출시료 100 ㎍을 10% SDS-PAGE 한 후 2.5% Triton X-100 용액으로 3번 세척 후 아가로스 피브린 판 에 올려놓은 후 습도가 높은 37oC 배양기에서 하룻밤 방치하였다.
실험결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 두 계통의 형질전환체 (T17, T19)에서 피브린이 분해되는 것을 확인할 수 있었으며, 양성대조군으로 사용된 t-PA와 같은 분자량을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
<실험예 6>
SDS-PAGE를 이용한 피브린 특이 사슬 분해활성 확인
상기 실험예 4에서 피브린 플레이트를 통해 피브린 분해활성 확인된 형질전환체에서 발현된 효소의 피브린 특이 사슬 분해 활성을 측정하고자 트롬빈과 Factor XIIIa로 결합된 섬유소에 다양한 시간 배양 후 (0-24시간) SDS-PAGE를 실시하였다.
5 mM 이미다졸-살린-5 mM CaCl2에 녹여진 1 mg/ml 피브리노겐 0.1 ml, 0.25 NIH U 트롬빈 0.02 ml, 0.125 U Factor XIII 0.02 ml을 혼합한 후 상온에서 30분간 방치하였다. 그런 후 5 mM 이미다졸-살린-5 mM CaCl2완충용액으로 3번 세척 후 PBS 추출 시료 20 ㎍을 0 내지 24 시간 배양 후 SDS-PAGE를 실시하였다.
실험결과, 도 9에 나타난 바와 같이, T17 형질전환체 (rTPA)와 양성 대조군인 t-PA (Calbiochem)는 섬유소 γ-γ 사슬과 (B)β 사슬을 분해하는 양상이 비슷한 것을 확인할 수 있었다.
상기한 바와 같이, TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 포함하는 식물 형질전환용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 식물 및 이를 이용한 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 생산방법은 식물세포에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 활성 있는 형태로 발현시킬 수 있기 때문에 기존의 혈전용해제 생산방법에 비하여 생산단가가 매우 저렴하게 부작용이 없는 혈전용해제를 생산할 수 있는 효과가 있다.
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Claims (10)

  1. TEV(tobacco etch virus) 리더 서열, 알팔파 유래의 글루코오스 조절 소포체 단백질(glucose-regulated endoplasmic reticular protein)의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 TEV(tobacco etch virus) 리더 서열은 서열번호 1으로 기재되는 염기서열을 가지며, 상기 신호 서열은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지며, 상기 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 식물 형질전환용 벡터는 도 1B에 개시된 개열지도를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중에서 선택된 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 세균.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세균이 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumeficiens)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세균.
  7. 제1항의 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물이 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물.
  9. 제1항의 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물의 제조방법.
  10. 제1항의 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질의 생산방법.
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