JP2007521834A - ウキクサ中でのプラスミノ−ゲン及びミクロプラスミノ−ゲンの発現 - Google Patents
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Abstract
Description
「ポリペプチド」は、任意のモノマー又はマルチマータンパク質又はペプチドを指す。
本発明によれば、安定に形質転換されたウキクサは、プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列又はミクロプラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを用いた形質転換によって得られる。発現カセットは、当該の核酸又は遺伝子と連結した転写開始領域を含む。このような発現カセットは、制御領域の転写制御下にある当該のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を挿入するための複数の制限部位を備える。発現カセットは、当該の1つの遺伝子をコードすることができる。本発明の特定の実施形態では、移動する核酸は2つ以上の発現カセットを含み、そのそれぞれが少なくとも1つの当該の遺伝子をコードする。
本発明は、ウキクサ中でプラスミノ−ゲン、ミクロプラスミノ−ゲン、及びそれらの断片を発現させるための方法及び組成物を対象とする。ウキクサ中で発現されるプラスミノ−ゲンは、任意の哺乳動物源由来のものであってよい。幾つかの実施形態では、プラスミノ−ゲンはヒト又はブタ由来である。特定の実施形態ではプラスミノ−ゲンは、配列番号4で示すヒトプラスミノ−ゲンのアミノ酸配列を有する。他の実施形態ではプラスミノ−ゲンは、配列番号4で示すアミノ酸配列の生物学的に活性がある変異体である。
幾つかの実施形態では本発明は、発現させるヌクレオチド配列を修飾してウキクサ中でのその発現を増強させることを提供する。1つのこのような修飾は、植物選択コドンを使用する、プラスミノ−ゲン又はミクロプラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列の合成である。植物選択コドンを用いてヌクレオチド配列を合成するための方法が、当技術分野では利用可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,380,831号及び第5,436,391号;Perlak et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA15:3324;Iannacome et al.(1997) Plant Mol.Biol.34:485;及びMurray et al.(1989) Nucleic Acids.Res.17:477を参照のこと。ウキクサ中で発現するタンパク質中の最高頻度のコドンから、好ましいコドンを決定することができる。したがって、ウキクサ中の特定のコドンの使用頻度は、一群のウキクサのコード配列中のコドン使用を分析することにより決定することができる。幾つかのウキクサのコード配列は当業者に知られている;例えば、メリーランド州ベセスダに位置するNational Center for Biotechnology Information、National Library of Medicineの一部門のウェブサイトを介してアクセスすることができる、GenBank(登録商標)データベース中に含まれる配列を参照のこと。最新のGenBank(登録商標)リリース中に含まれる配列に基づくコドン使用の頻度を示す表は、日本国千葉のかずさDNA研究所のウェブサイト上で見ることができる;www.kazusa.or.jp/codon/を参照のこと。このデータベースは、Nakamura et al.(2000) Nucl.AcidsRes.28:292中に記載されている。
アミノ酸 コドン 数 /1000 分画
グリシン GGG 57.00 28.89 0.35
グリシン GGA 8.00 4.05 0.05
グリシン GGT 3.00 1.52 0.02
グリシン GGC 93.00 47.14 0.58
グルタミン酸 GAG 123.00 62.34 0.95
グルタミン酸 GAA 6.00 3.04 0.05
アスパラギン酸 GAT 6.00 3.04 0.08
アスパラギン酸 GAC 72.00 36.49 0.92
バリン GTG 62.00 31.42 0.47
バリン GTA 0.00 0.00 0.00
バリン GTT 18.00 9.12 0.14
バリン GTC 51.00 25.85 0.39
アラニン GCG 44.00 22.30 0.21
アラニン GCA 14.00 7.10 0.07
アラニン GCT 14.00 7.10 0.07
アラニン GCC 139.00 70.45 0.66
アルギニン AGG 16.00 8.11 0.15
アルギニン AGA 11.00 5.58 0.10
セリン AGT 1.00 0.51 0.01
セリン AGC 44.00 22.30 0.31
リシン AAG 116.00 58.79 1.00
リシン AAA 0.00 0.00 0.00
アスパラギン AAT 2.00 1.01 0.03
アスパラギン AAC 70.00 35.48 0.97
メチオニン ATG 67.00 33.96 1.00
イソロイシン ATA 4.00 2.03 0.06
イソロイシン ATT 0.00 0.00 0.00
イソロイシン ATC 63.00 31.93 0.94
スレオニン ACG 19.00 9.63 0.25
スレオニン ACA 1.00 0.51 0.01
スレオニン ACT 6.00 3.04 0.08
スレオニン ACC 50.00 25.34 0.66
トリプトファン TGG 45.00 22.81 1.00
終止 TGA 4.00 2.03 0.36
システイン TGT 0.00 0.00 0.00
システイン TGC 34.00 17.23 1.00
終止 TAG 0.00 0.00 0.00
終止 TAA 7.00 3.55 0.64
チロシン TAT 4.00 2.03 0.05
チロシン TAC 76.00 38.52 0.95
ロイシン TTG 5.00 2.53 0.04
ロイシン TTA 0.00 0.00 0.00
フェニルアラニン TTT 4.00 2.03 0.04
フェニルアラニン TTC 92.00 46.63 0.96
セリン TCG 34.00 17.23 0.24
セリン TCA 2.00 1.01 0.01
セリン TCT 1.00 0.51 0.01
セリン TCC 59.00 29.90 0.42
アルギニン CGG 23.00 11.66 0.22
アルギニン CGA 3.00 1.52 0.03
アルギニン CGT 2.00 1.01 0.02
アルギニン CGC 50.00 25.34 0.48
グルタミン CAG 59.00 29.90 0.86
グルタミン CAA 10.00 5.07 0.14
ヒスチジン CAT 5.00 2.53 0.26
ヒスチジン CAC 14.00 7.10 0.74
ロイシン CTG 43.00 21.79 0.35
ロイシン CTA 2.00 1.01 0.02
ロイシン CTT 1.00 0.51 0.01
ロイシン CTC 71.00 35.99 0.58
プロリン CCG 44.00 22.30 0.31
プロリン CCA 6.00 3.04 0.04
プロリン CCT 13.00 6.59 0.09
プロリン CCC 80.00 40.55 0.56
アミノ酸 コドン 数 /1000 分画
グリシン GGG 8.00 17.39 0.22
グリシン GGA 11.00 23.91 0.31
グリシン GGT 1.00 2.17 0.03
グリシン GGC 16.00 34.78 0.44
グルタミン酸 GAG 25.00 54.35 0.78
グルタミン酸 GAA 7.00 15.22 0.22
アスパラギン酸 GAT 8.00 17.39 0.33
アスパラギン酸 GAC 16.00 34.78 0.67
バリン GTG 21.00 45.65 0.53
バリン GTA 3.00 6.52 0.07
バリン GTT 6.00 13.04 0.15
バリン GTC 10.00 21.74 0.25
アラニン GCG 13.00 28.26 0.32
アラニン GCA 8.00 17.39 0.20
アラニン GCT 6.00 13.04 0.15
アラニン GCC 14.00 30.43 0.34
アルギニン AGG 9.00 19.57 0.24
アルギニン AGA 11.00 23.91 0.30
セリン AGT 2.00 4.35 0.05
セリン AGC 11.00 23.91 0.26
リシン AAG 13.00 28.26 0.68
リシン AAA 6.00 13.04 0.32
アスパラギン AAT 0.00 0.00 0.00
アスパラギン AAC 12.00 26.09 1.00
メチオニン ATG 9.00 19.57 1.00
イソロイシン ATA 1.00 2.17 0.08
イソロイシン ATT 2.00 4.35 0.15
イソロイシン ATC 10.00 21.74 0.77
スレオニン ACG 5.00 10.87 0.28
スレオニン ACA 2.00 4.35 0.11
スレオニン ACT 2.00 4.35 0.11
スレオニン ACC 9.00 19.57 0.50
トリプトファン TGG 8.00 17.39 1.00
終止 TGA 1.00 2.17 1.00
システイン TGT 1.00 2.17 0.12
システイン TGC 7.00 15.22 0.88
終止 TAG 0.00 0.00 0.00
終止 TAA 0.00 0.00 0.00
チロシン TAT 1.00 2.17 0.12
チロシン TAC 7.00 15.22 0.88
ロイシン TTG 3.00 6.52 0.08
ロイシン TTA 1.00 2.17 0.03
フェニルアラニン TTT 6.00 13.04 0.25
フェニルアラニン TTC 18.00 39.13 0.75
セリン TCG 11.00 23.91 0.26
セリン TCA 4.00 8.70 0.09
セリン TCT 6.00 13.04 0.14
セリン TCC 9.00 19.57 0.21
アルギニン CGG 4.00 8.70 0.11
アルギニン CGA 4.00 8.70 0.11
アルギニン CGT 0.00 0.00 0.00
アルギニン CGC 9.00 19.57 0.24
グルタミン CAG 11.00 23.91 0.73
グルタミン CAA 4.00 8.70 0.27
ヒスチジン CAT 0.00 0.00 0.00
ヒスチジン CAC 6.00 13.04 1.00
ロイシン CTG 9.00 19.57 0.24
ロイシン CTA 4.00 8.70 0.11
ロイシン CTT 4.00 8.70 0.11
ロイシン CTC 17.00 36.96 0.45
プロリン CCG 8.00 17.39 0.29
プロリン CCA 7.00 15.22 0.25
プロリン CCT 5.00 10.87 0.18
プロリン CCC 8.00 17.39 0.29
分泌されるタンパク質は通常は前駆体ポリペプチドから翻訳され、前駆体ポリペプチドは、小胞体(ER)の膜上の受容体タンパク質と相互作用して、細胞から分泌させるための膜を超えた小胞体への増強するポリペプチド鎖の移動を誘導する「シグナルペプチド」を含む。このシグナルペプチドはしばしば前駆体ポリペプチドから切断されて、シグナルペプチドを欠く「成熟」ポリペプチドが生成する。本発明の一実施形態では、生物学的活性があるポリペプチドが、培養培地中へのポリペプチドの分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結したヌクレオチド配列から、ウキクサ中で発現される。(細胞の外側へ分泌させるための)小胞体へのタンパク質移動を標的化する、植物のシグナルペプチドは当技術分野で知られている。例えば、Lee et alへの米国特許第6,020,169号を参照のこと。本発明では、任意の植物のシグナルペプチドを使用して、ERに対するポリペプチド発現を標的化することができる。幾つかの実施形態では、シグナルペプチドはArabidopsis thalianaの塩基性エンドキチナーゼシグナルペプチド、エクステンシンシグナルペプチド(Stiefel et al.(1990) Plant Cell2:785-793)、又はコメαアミラーゼシグナルペプチド(配列番号8;NCBIタンパク質アクセッション番号AAA33885のアミノ酸1−31)である。他の実施形態ではシグナルペプチドは、分泌されるウキクサのタンパク質のシグナルペプチドに対応する。
本発明を使用して安定に形質転換されるウキクサは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。一実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第6,040,498号、或いは米国特許公開第20030115640号、20030033630号、又は20020088027号中に開示された遺伝子移動法の1つによって得る。これらの方法には、当該のヌクレオチド配列を含む核酸でコーティングされたマイクロ弾を用いた衝撃ボンバードメントによる遺伝子移動、エレクトロポレーションによる遺伝子移動、及び当該のヌクレオチド配列を含むベクターを含むアグロバクテリウムによって仲介される遺伝子移動がある。幾つかの実施形態では、安定に形質転換されたウキクサは、Stomp et alへの米国特許第6,040,498号中で開示されたアグロバクテリウム仲介の方法のいずれか1つによって得る。使用するアグロバクテリウムは、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)又はアグロバクテリム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)である。
以下の実施例は、例示を目的として示すものであり、これらに限定されない。
本発明の実施例で使用する発現ベクターは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第5,955,646号中に記載されたpBMSP-1の修飾型である。ベクターの転写カセットは、アグロバクテリウム・トゥメファシエンスオクトピン合成酵素由来の転写活性化ヌクレオチド配列、及びアグロバクテリウム・トゥメファシエンスマンノピン合成酵素遺伝子、アグロバクテリウム・トゥメファシエンスマンノピン合成酵素遺伝子由来のプロモーター領域、当該のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入用のポリリンカー部位由来の他の転写活性化ヌクレオチド配列、及びアグロバクテリウム・トゥメファシエンスノパリン合成酵素遺伝子由来の停止配列の3つのコピーを含んでいた(それぞれ参照により本明細書に組み込まれている、van Engelen et al.(1995) 4:288-290;Ni et al.(1995) Plant J.7:661-76;及びLuehrsen et al.(1991) Mol.Gen.Genet.225:81-93を参照のこと)。
(これらの実施例中ではコウキクサ系統8627に由来する)ウキクサの葉又はウキクサの根粒培養物を、アグロバクテリウム仲介の形質転換法を使用して前に記載した発現構築体を用いて形質転換した。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス系統C58Z707、解除型広範囲の宿主C58系統(Hepburn et al.(1985) J.Gen.Microbiol.131:2961-2969)は、これらの実施例中では形質転換用に使用する。前に記載した発現構築体はエレクトロポレーションによって、或いは移動プラスミドpRK2013(Hoekema et al.(1983) Nature303:179-180; Ditta et al.(1980) Proc Natl.Acad.Sci.USA77:7347-7350)を含む大腸菌MM294を使用する3親交雑手順によってA.tumefaciensに移動させた。前に記載した発現構築体を含むC58Z707系統は、AB最小培地(Chilton et al.(1974) Proc Nat.Acad.Sci.USA71:3672-3676)上、或いは500mg/Lのストレプトマイシン、50mg/Lのスペクチノマイシン、及び50mg/Lの硫酸カナマイシンを含むYEB又はLB培地(1g/Lの酵母菌エキス、5g/Lのビーフエキス、5g/Lのペプトン、5g/Lのスクロース、0.5g/LのMgSO4)中に画線培養し、28℃で一晩増殖させる。
ヒトプラスミノ−ゲンをウキクサ中で以下のように発現させた。ヒトプラスミノ−ゲンをコードする合成ウキクサ−コドン最適化配列を、前に記載した発現ベクター中に挿入した。コードされたプラスミノ−ゲンのアミノ酸配列は配列番号4に示し、ウキクサ−最適化コード配列は配列番号3に示す。発現ベクターは、プラスミノ−ゲンコード配列の5’に挿入された、コメのαアミラーゼシグナルペプチドをコードするウキクサ最適化コード配列も含んでいた。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、2つのコード配列が1つのタンパク質として翻訳されるように、ヒトプラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結させた。コメのαアミラーゼシグナルペプチドをコードするウキクサ最適化コード配列は配列番号7に示し、コードされているペプチドは配列番号8に示す。このプラスミノ−ゲン発現ベクターは、この実施例中ではBAP01と呼ぶ。
ヒトミクロプラスミノ−ゲンをウキクサ中で以下のように発現させた。ヒトミクロプラスミノ−ゲンをコードする合成ウキクサ−コドン最適化配列を、前に記載した発現ベクター中に挿入した。コードされたミクロプラスミノ−ゲンのアミノ酸配列は配列番号6に示し、ウキクサ−最適化コード配列は配列番号5に示す。発現ベクターは、プラスミノ−ゲンコード配列の5’に挿入された、コメのαアミラーゼシグナルペプチドをコードするウキクサ最適化コード配列も含んでいた。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、2つのコード配列が1つのタンパク質として翻訳されるように、ヒトミクロプラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結させた。コメのαアミラーゼシグナルペプチドをコードするウキクサ最適化コード配列は配列番号7で与え、コードされているペプチドは配列番号8に示す。このミクロプラスミノ−ゲン発現ベクターは、この実施例中ではBAMP01と呼ぶ。
Claims (55)
- ウキクサ中でプラスミノ−ゲンを生産するための方法であって、
(a)ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞若しくは根粒を培養するステップであって、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞若しくは根粒を、プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を用いて安定に形質転換するステップ、及び
(b)前記ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞若しくは根粒から前記プラスミノ−ゲンを回収するステップ
を含む方法。 - プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列が、培養培地中へのミクロプラスミノ−ゲンの分泌を誘導するシグナルペプチドのコード配列と動作可能に連結している、請求項1に記載の方法。
- プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列が、
(a)前記プラスミノ−ゲンに関するコード配列中のウキクサ選択コドン、
(b)コード配列の上流に挿入された植物のイントロンを含む動作可能に連結したヌクレオチド配列、及び
(c)プラスミノ−ゲンをコードする前記ヌクレオチド配列の翻訳を増強させるリーダー配列を含む、動作可能に連結したヌクレオチド配列
からなる群から選択される少なくとも1つの特徴を有する、請求項1に記載の方法。 - プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列が、70%〜100%のウキクサ選択コドンを含む、請求項3に記載の方法。
- 植物のイントロンがトウモロコシのアルコール脱水素酵素1の遺伝子に由来する、請求項3に記載の方法。
- 植物のイントロンが配列番号1に示される配列から本質的になる、請求項5に記載の方法。
- リーダー配列がイボウキクサのリブロース−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの5B遺伝子に由来する、請求項3に記載の方法。
- リーダー配列が配列番号2に示されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項7に記載の方法。
- プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列が配列番号3に示されるヌクレオチド配列である、請求項3に記載の方法。
- プラスミノ−ゲンがヒトプラスミノ−ゲンである、請求項1に記載の方法。
- プラスミノ−ゲンが、配列番号4に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項10に記載の方法。
- ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞中の少なくとも2%の可溶性タンパク質がプラスミノ−ゲンである、請求項1に記載の方法。
- ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞中の少なくとも3%の可溶性タンパク質がプラスミノ−ゲンである、請求項12に記載の方法。
- ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞中の少なくとも4%の可溶性タンパク質がプラスミノ−ゲンである、請求項13に記載の方法。
- ウキクサ中でミクロプラスミノ−ゲンを生産するための方法であって、
(a)ウキクサ培養培地内でウキクサ植物の培養物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサ根粒培養物を培養するステップ、或いは前記ウキクサ植物培養物、植物の細胞、又は根粒培養物を、ミクロプラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列と培養培地中へのミクロプラスミノ−ゲンの分泌を誘導するシグナルペプチドの動作可能に連結したコード配列とを含む核酸分子を用いて安定に形質転換するステップ、及び
(b)ウキクサ培養培地から前記ミクロプラスミノ−ゲンを回収するステップ
を含む方法。 - ミクロプラスミノ−ゲンをウキクサ培養培地中に分泌させる、請求項15に記載の方法。
- ウキクサ培養培地が、定量ウエスタンブロッティングにより測定して少なくとも1mg/Lのミクロプラスミノ−ゲンを含む、請求項16に記載の方法。
- ウキクサ培養培地が、定量ウエスタンブロッティングにより測定して少なくとも2mg/Lのミクロプラスミノ−ゲンを含む、請求項16に記載の方法。
- ウキクサ培養培地が、定量ウエスタンブロッティングにより測定して少なくとも5mg/Lのミクロプラスミノ−ゲンを含む、請求項16に記載の方法。
- ウキクサ培養培地が、定量ウエスタンブロッティングにより測定して少なくとも10mg/Lのミクロプラスミノ−ゲンを含む、請求項19に記載の方法。
- ミクロプラスミノ−ゲン及びシグナルペプチドの動作可能に連結したコード配列をコードするヌクレオチド配列が、
(a)前記ミクロプラスミノ−ゲンに関するコード配列中のウキクサ選択コドン、
(b)前記シグナルペプチドに関するコード配列中のウキクサ選択コドン、
(c)ミクロプラスミノ−ゲンに関するコード配列の上流に挿入された植物のイントロンを含む動作可能に連結したヌクレオチド配列、及び
(d)プラスミノ−ゲンをコードする前記ヌクレオチド配列の翻訳を増強させるリーダー配列を含む動作可能に連結したヌクレオチド配列
からなる群から選択される少なくとも1つの特徴を有する、請求項15に記載の方法。 - プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列が、70%〜100%のウキクサ選択コドンを含む、請求項21に記載の方法。
- シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、70%〜100%のウキクサ選択コドンを含む、請求項22に記載の方法。
- 植物のイントロンがトウモロコシのアルコール脱水素酵素1の遺伝子に由来する、請求項21に記載の方法。
- 植物のイントロンが配列番号1に示される配列から本質的になる、請求項24に記載の方法。
- リーダー配列がイボウキクサのリブロース−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの5B遺伝子に由来する、請求項21に記載の方法。
- リーダー配列が配列番号2に示されるヌクレオチド配列から本質的になる、請求項26に記載の方法。
- ミクロプラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列が配列番号5に示されるヌクレオチド配列である、請求項21に記載の方法。
- ミクロプラスミノ−ゲンがヒトミクロプラスミノ−ゲンである、請求項15に記載の方法。
- ミクロプラスミノ−ゲンが、配列番号4に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項29に記載の方法。
- シグナルペプチドがコメのαアミラーゼポリペプチドである、請求項15に記載の方法。
- シグナルペプチドのコード配列が配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項31に記載の方法。
- シグナルペプチド配列が配列番号8に示されるアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の方法。
- ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞がウキクサ属、ミジンコウキウサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属及びアオウキクサ属からなる群から選択される属に由来する、請求項1に記載の方法。
- ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞がウキクサ属、ミジンコウキウサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属及びアオウキクサ属からなる群から選択される属に属する、請求項15に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法に従ってプラスミノ−ゲンを生産することを含む、安定したプラスミノ−ゲンを生産する改良された方法。
- ウキクサ中でプラスミノ−ゲン断片を生産するための方法であって、
(a)ウキクサ培養培地内でウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞若しくは根粒を培養するステップであって、前記ウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞若しくは根粒を、プラスミノ−ゲン断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を用いて安定に形質転換するステップ、及び
(b)前記ウキクサ植物、前記ウキクサ植物の細胞、前記ウキクサ植物の根粒、又は前記ウキクサ培養培地から選択される少なくとも1つの供給源から前記プラスミノ−ゲン断片を回収するステップ
を含む方法。 - プラスミノ−ゲン断片をコードするヌクレオチド配列が、培養培地中へのミクロプラスミノ−ゲンの分泌を誘導するシグナルペプチドのコード配列と動作可能に連結している、請求項37に記載の方法。
- プラスミノ−ゲン断片をコードするヌクレオチド配列が、
(a)前記プラスミノ−ゲン断片に関するコード配列中のウキクサ選択コドン、
(b)コード配列の上流に挿入された植物のイントロンを含む、動作可能に連結したヌクレオチド配列、及び
(c)プラスミノ−ゲン断片をコードする前記ヌクレオチド配列の翻訳を増強させるリーダー配列を含む、動作可能に連結したヌクレオチド配列
からなる群から選択される少なくとも1つの特徴を有する、請求項37に記載の方法。 - プラスミノ−ゲン断片をコードするヌクレオチド配列が、70%〜100%のウキクサ選択コドンを含む、請求項39に記載の方法。
- 植物のイントロンがトウモロコシのアルコール脱水素酵素1の遺伝子に由来する、請求項39に記載の方法。
- プラスミノ−ゲン断片が成熟プラスミノ−ゲンアミノ酸配列の少なくとも80個の隣接アミノ酸を含む、請求項37に記載の方法。
- 請求項1に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又は根粒。
- ウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒がウキクサ属、ミジンコウキウサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属及びアオウキクサ属からなる群から選択される属に由来する、請求項43に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又は根粒。
- ウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒がコウキクサ、レムナサエ・ミニスクラ、ナンゴクウアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項44に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒。
- 請求項15に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒。
- ウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒がウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属及びアオウキクサ属からなる群から選択される属に由来する、請求項46に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒。
- ウキクサ植物又はウキクサの根粒がコウキクサ、レムナサエ・ミニスクラ、ナンゴクウアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項47に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞。
- 請求項37に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒。
- ウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒がウキクサ属、ミジンコウキクサ属、ウォルフィエラ属、ランドルティア属及びアオウキクサ属からなる群から選択される属に由来する、請求項49に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物、ウキクサ植物の細胞、又はウキクサの根粒。
- ウキクサ植物又はウキクサの根粒がコウキクサ、レムナサエ・ミニスクラ、ナンゴクウアオウキクサ、及びイボウキクサからなる群から選択される種のメンバーである、請求項50に記載の安定に形質転換されたウキクサ植物又はウキクサ植物の細胞。
- (a)配列番号4に示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号4に示されるプラスミノ−ゲン配列の変異体のアミノ酸配列であって、前記変異体が配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
(c)配列番号6に示されるアミノ酸配列、及び
(d)配列番号6に示されるミクロプラスミノ−ゲン配列の変異体のアミノ酸配列であって、前記変異体が配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が70%〜100%のウキクサ選択コドンを含む、単離された核酸分子。 - (a)配列番号3に示されるヌクレオチド配列、及び
(b)配列番号5に示されるヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項49に記載の核酸分子。 - 安定に形質転換されたウキクサ植物であって、前記ウキクサが以下の動作可能に連結した成分、リーダー配列、プロモーター配列、プラスミノ−ゲンをコードするヌクレオチド配列、及び転写停止配列を含むDNA構築体を含み、前記リーダー配列、前記プロモーター配列及び前記停止配列がいずれもウキクサ中で機能する、ウキクサ植物。
- リーダー配列が配列番号2に示される配列であり、プラスミノ−ゲンをコードする配列が配列番号3に示される配列である、請求項54に記載の植物。
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