KR20060015534A - 성장 억제, 지질 유래된 생활성 화합물의 전신 전달을 위한방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성장-억제 지질-유도된 생활성 약물 또는 유전자 치료제의 전신 전달을 필요로 하는 동물 또는 사람에게, 개선된 지질 용해도, 세포 투과성, 증가된 순환 수명 및 약동학적 특징을 나타내면서 개선된 종양 또는 혈관 표적화를 나타내는 나노스케일 어셈블리 시스템, 예컨대, 리포좀, 흡수성 및 비-응집성 나노입자 분산액, 금속 또는 반도체 나노입자, 또는 중합체 물질, 예컨대, 덴드리머 또는 히드로겔을 사용하여, 성장-억제 지질-유도된 생활성 약물 또는 유전자 치료제의 전신 전달을 최적화시키는 시스템 및 방법에 관한 것이다.

Description

성장 억제, 지질 유래된 생활성 화합물의 전신 전달을 위한 방법 및 시스템 {METHOD AND SYSTEM FOR SYSTEMIC DELIVERY OF GROWTH ARRESTING, LIPID-DERIVED BIOACTIVE COMPOUNDS}
본 발명은 나노기술 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 치료적 생활성 지질 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 누클레오티드/유전자 제제를 치료가 필요한 개인에 전신 전달하기 위한 나노스케일(nanoscale) 어셈블리 시스템을 제공한다.
나노기술은 1959 리챠드 케인만(Richard Keynman)에 의한 연설문("There's Plenty of Room at the Bottom", 이 연설문에서, 그는 살아 있는 세포의 복잡성 및 소규모성을 언급하였으며, 과학계에 "make a thing very small which does what we want"라고 제기하였다(Feyman, R.P., 1959, 접속가능: http://www.zyvex.com/nanotech/feynman.html))에 의해 발단된 이래 생명과학(일반적으로 나노생명공학으로서 언급됨)과 복잡하게 결부되어 왔다. 상용되는 나노생명공학이 여전이 초창기 수준에 머무르고 있지만, 나노스케일 어셈블리 시스템의 개발 속도는 이들 시스템이 약물 전달 및 치료제를 제공한다는 독특한 이점으로 인해, 지난 수십년 동안 기하급수적으로 증가하였다. 몇몇 나노스케일 어셈블리 시 스템의 예로는 리포좀; 덴드리머(dendrimer) 및 하이드로겔과 같은 폴리머 구조, 및 양자점(quantum dot)으로서 언급되는 금속 또는 반도체 나노입자를 포함한다.
전사적으로 활성인 DNA, 및 기능성 펩티드 및 단백질을 생존할 수 있는 세포에 도입하기 위해 많은 효과적인 시약을 이용할 수 있다. 그러나, 생활성 지질을 살아있는 세포로 전달하는 방법은 일반적으로 입수할 수 없다. 생활성 스핑고지질 및 인지질대사물질, 유사체, 모방체 또는 유도체의 세포로의 전달 및 이들의 삽입은 이들 이들을 소수성이게 하고, 세포 불침투성이게 하는 물리적-화학적 성질에 의해 방해받는다.
세포 분화, 세포 사이클 억제 및/또는 아폽토시스(apoptosis)의 유도를 조절하는 지질 유래된 제 2 메신저로서 작용하는 스핑고지질인 세라미드는 외인성 투여가 문제되는 생활성 지질의 예이다. 세포내의 세라미드 축적은 성장 인자 결손, 시토킨, 화학치료 및 그 밖의 세포독성제, 이온화 방사선, 열쇼크 및 여러가지 환경적 인자와 같은 다수의 자극으로부터 기인된다. 이러한 자극은 궁극적으로 DNA 분열 및 세포 치사를 유발하는 카스파제(caspase) 활성의 자극 및 Akt 생존전 경로의 억제를 포함하는 세라미드 매개된 연속 신호화를 개시시키는 것으로 관찰되었다. 따라서, 세포 성장, 분화 및 치사에 대한 세라미드의 효과적 조절과, 세라미드가 증식 및/또는 생존과 관련된 분리된 키나아제 및 신호화 경로를 표적하는 천연 분자라는 사실에 기초하여, 세라미드는 암 및 심장혈관 질환의 치료제로서 확인되었다.
세포 침투성 세라미드 유사체, C6의 약물 용리 플랫폼으로부터의 국부 전달에 대한 임상적 유용성은 이미 챨스(Charles) 등에 의해 입증되었다[참조: Circ. Res. 2000. Aug. 18:87(4): 282-8]. 구체적으로, 세라미드 코팅된 벌룬(balloon) 카테테르는 스트레치-손상된 혈관 평활근 세포에서 세포 사이클 억제를 유도하는 것으로 나타났다. 코팅되고 팽창된 벌룬으로부터 C6-세라미드의 전달이 혈관계로의 직접 전달을 가능하게 하지만, 전신 적용, 예컨대 암 화학치료 또는 확산성 죽상경화성 병변 및 취약 플라크(plague)의 표적화를 위한 세라미드의 전달에는 다수의 문제점이 존재한다. 특히, 단쇄이고, 보다 세포 침투성인 유도체를 사용함에도 불구하고, 전신 세라미드 전달에는 세가지의 주요 문제점이 존재한다.
첫째, C2, C6 및 C8-세라미드와 같은 단쇄의 세포 침투성 세라미드 유사체는 여전히 지질이고, 이에 따라 그 자체로서 매우 소수성이여서 DMSO 또는 에탄올 비히클 중에서 세포 배지에 첨가되면 미세한 지질 미셀 현탁액으로서 침전한다. 둘째, 단쇄 세라미드 유사체가 보다 장쇄 생리적 세라미드(C18-C24-세라미드) 보다 세포 침투성이긴 하지만, 이들의 스핑고이드 주쇄는 원형질막(plasma membrane)으로의 삽입을 제한한다. 마지막으로, 순환하는 세포내 세라미다아제의 존재가 생활성 세라미드의 보다 적은 전아폽토시스(pro-apoptotic) 대사물질로의 전환을 촉진시킨다.
유기 용매 시스템은 세포로의 세라미드 전달을 증대시키기 위해 개발되었다. 배지에 불용성인 도데칸/에탄올 용매 시스템은 세라미드를 침전시키고, 매우 작은 점적 또는 미셀을 형성하여 원형질막과 함께 융합하는 것으로 제안되었다. 이러한 침전화 용매의 사용은 입도의 가변성 및 세포막으로서 접근 방식에 의해 제한될 수 있다. 또한, 우혈청 알부민과 같은 단백질 애주번트는 비특이적 지질/단백질 상호작용을 통해 시험관내 세라미드 전달을 보조할 수 있으나, 충분량의 C6 세라미드를 전신 표적에 효과적으로 전달하지 못하게 할 수 있다.
따라서, 생활성 지질 또는 유전자 치료제의 치료적 이점을 실현하기 위해서, 이러한 치료가 필요한 동물 또는 사람의 살아있는 세포로의 이러한 소수성 또는 하전된 화학치료적 화합물의 개선된 전신 전달 시스템이 요구된다.
발명의 개요
본 발명은 나노스케일 어셈블리 시스템을 사용하여 성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 약물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 필요한 동물 또는 사람에게, 이러한 치료제의 전신 전달을 최적화하기 위한 시스템 및 방법을 제공하므로써 상기의 중요한 요구를 다루고 있다.
본 발명은 각각이 개선된 지질 용해성, 세포 침투성, 증가된 순환 반감기 및 개선된 종양 또는 혈관 표적화를 갖는 약동학적 프로파일을 나타내는 리포좀, 재흡수가능하고 비응집성인 분산된 나노입자, 금속 또는 반도체 나노입자 또는 폴리머 물질(예컨대, 덴드리머 또는 하이드로겔)과 같은 나노스케일 어셈블리 시스템을 사용하여, 이러한 치료가 필요한 동물 또는 사람의 살아있는 세포로의, 성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 치료 화합물 및/또는 유전자 치료제의 전신 전달을 최대화하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 성장 억제성인, 지질 유래된 생활성 화합물 및/또는 유전자 치료제 및/또는 콜레스테롤로 구성된 하나 이상의 막을 갖는, 생활성 지질, 단백질 및 치료제의 전달에 적합한, 본원에서 "페길화(pegylated)" 리포좀으로서 언급되는 폴리에틸렌글리콜 450 리포좀이 제형된다. 이러한 페길화 리포좀은 크기 범위가 750 내지 5000MW인 PEG C8(페길화 세포 침투성 세라미드) 및/또는 크기 범위가 2000 내지 5000MW인 PEG DSPE(디스테로일포스파티딜에탄올아민)을 함유하도록 제형되었다. 본 구체예에서는 지질 2층(bilayer)을 안정화시키는 PEG C8을 사용하여 리포좀이 높은 몰비율(즉, 30%)의 유리된 생활성 C6 세라미드를 함유하도록 허용한다. 또한, 상기 구체예에서는, 생활성 세라미드 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 함유하는 리포좀의 필수 성분(integral component)으로서 PEG C8을 사용한다. 또한 PEG C8 제형된 리포좀은 아폽토시스의 후속 유발 또는 표적화된 조직 또는 종양의 프로그래밍된 세포 치사를 위한 미토콘드리아를 포함하는 세포이하 기관으로서의 전달 및 막 내재화를 위한 전제 조건인 유리된 세라미드의 카베올린 부유 지질 라프트(raft)로의 적합한 삽입 및 편재화를 보장한다. 또한 "스텔스(stealth)" 리포좀으로서 공지된 페길화 리포좀은 세망내피계(RES)에 의해 순환으로부터의 제거를 피할 수 있어, 개선된 순환 반감기 및 조직 표적화를 유도한다. 표적화는 추가로 항체 및/또는 수용체 리간드와 같은 특정표적화 부분의 컨쥬게이션을 통해 달성될 수 있다. 추가의 구체예에서는, 지질 치료 제가 또한 음하전된 올리고누클레오티드를 효과적으로 전달하기 위해 PEG-C8의 존재 또는 부재하에서 양이온성 지질로 구성된 "양이온성" 리포좀으로, 또는 PEG-C8의 존재 또는 부재하에서 "융해성" 리포좀으로서 제형화될 수 있으며, 여기에서 리포좀 막 전체는 리포좀의 구성 성분 및 내용물을 그 안에 전달하기 위해 표적 부위의 세포막과 융해한다고 단언하고 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 칼슘 인-실리케이트(CPS) 쉘을 갖는 재흡수가능한 나노입자가 제공되며, 이러한 나노입자에 있어서, 성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 화합물, 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 재흡수가능한 나노입자에 부하된다. 본 발명의 재흡수가능한 나노입자는 일반적으로는 순환을 통해 운반할 수 없는, 소수성 화학치료 지질 또는 약물 또는 유전자 치료제를 살아있는 세포에 전신적으로 전달할 수 있다. 재흡수가능한 나노입자의 합성에 대한 주요 특징은 수성 액체 배지 중에서의 나노입자의 적합한 분산(비응집화)에 있다. 분산을 달성시키는 방법중 하나는 실리케이트 함유 쉘 나노입자에 대해 특이적으로 변형되는 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC)를 사용하는 것이다. 나노입자의 분산을 달성하는 또 다른 방법은 외부 CPS 쉘에 대해 유기, 무기 또는 금속-유기 분산제를 부착시키는 것이다. 추가로, 카르보디이미드 매개된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 커플링제가 알킬아민 실란 또는 알킬카르복실산 커플링제에 결합하여 생체내 나노입자의 "분산된" 비응집화 상태를 더욱 확실히 하고, PEG 커플링제에 표적화 부분에 대한 컨쥬게이션 지점을 제공하므로써 나노입자 가 세포내 약물 전달을 위한 특이적 부위를 표적할 수 있게 하는 것이다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 개개의 폴리머는 결합하여 둘 모두 "바이오-스마트(bio-smart)인, 즉, 물리적 또는 화학적 자극에 반응하며, 생체내 생분해가능하고, 성장 억제성인, 지질 유래된 생활성 화합물 및/또는 유전자 치료제가 부하될 수 있는 물질을 형성할 수 있다.
도 1은 약물 전달을 위한 재흡수가능한 코팅을 갖는 코어-쉘 입자의 개략적인 제조를 도시한 것이다.
도 2a-b는 리포좀 제형의 특징화를 도시한 것이다. 리포좀 제형은 구형태 및 균일한 크기 분포로 제조된다. 도 2a는 페길화 리포좀 소포[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4:3:1:1:1)]의 대표적인 TEM이다(데이타 미도시). 소포 크기는 직경이 85 내지 140nm이고, 막대는 100nm를 나타낸다. 지질 용액의 압출은 리포좀 비히클로의 C6 혼입을 현저히 감소시키지는 않는다. 도 2b는 리포좀 제형의 평균 크기를 도시한 것이다.
도 2c-d는 리포좀 제형의 특징화를 도시한 것이다. 도 2c는 기재된 바와 같은 종래의 리포좀을 제조하기 위해 압출 처리된, 미량의 [3H]C6과 함께 EPC/DOPE/CH/C6(6:0.5:1.5:2)로 구성된 최종 농도가 10mg/ml인 미셀 제형을 도시한 것이다. 평균 ± S.E., n= 3개의 개별적인 별개의 실험. 지질 조성물은 리포좀 소포를 생성하기 위한 지질 미셀 용액의 압출 후에도 일정하게 잔류한다. 도 2d는 CHCl3/MeOH/ddH2(60:25:5) 용매계를 사용하여 분리된 종래의 리포좀 제형[EPC/DOPE/CH/C6(3.5:3:2:1.5)의 대표적인 TLC를 도시한 것이다. 예상된 바와 같이, DHC6가 아니라 C6이 DHC의 C4 -5 이중 결합의 결여로 인해 요오드로 염색되었다.
도 3a는 C6 전달의 시험관내 약동학을 도시한 것이다. C6의 리포좀 전달은 비리포좀 전달에 비해 시간 함수로서 C6의 보다 큰 세포 축적을 초래하였다. 리포좀은 미량의 [3H]C6으로 제형되어 MDA 세포로의 세라미드 전달의 반응 속도를 측정하였다. 세포에 첨가되는 리포좀성 및 비리포좀성 C6의 총수는 100%로 설정되었다. 20μM에서, C6 축적은 대략 16시간 째에 피크를 이룬다. 평균 ± S.E., n = 3개의 개별적인 실험. *, 리포좀성 C6 축적을 비리포좀성 C6 축적과 비교한 경우 p<0.05.
도 3b-3c는 C6 전달의 시험관내 약동학을 도시한 것이다. 콜레스테릴-1,2-3H(N) 헥사데실 에테르(3H-CHE)가 아닌 리포좀성 C6이 시간(도 3b) 및 용량(C)의 함수로서 MDA 세포로 분할하는 것을 도시한 것이다. 페길화 리포좀[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4:3:1:1:1)]은 미량의 [3H C6] 및 [3H CHE]로 제형되어 지시된 시간 간격으로 MDA 세포로의 세라미드(10μM) 전달의 메카니즘을 평가하였다. 세라미드 전달의 용량 의존성 메카니즘을 10시간의 처리 기간에 걸쳐 조사하였다. 세포로 전달된 지질의 양을 pmol/106 세포로서 계산하였다. 평균 ± S.E., n = 3개의 별도 실험. *, 각각의 제형에서 C6 축적을 CHE 축적과 비교한 경우 p<0.05.
도 4a-4b는 리포좀성 C6 전달이 에스트로겐 수용체-음성 MDA 유방암 세포에서의 비리포좀성 C6보다 효능이 있음을 보여주는 티미딘 혼입 성장 검정을 도시한 것이다. 도 4a는 종래의 리포좀이고, 도 4b는 양이온성 리포좀이다.
도 4c는 페길화 리포좀성 C6 전달이 에스트로겐 수용체-음성 MDA 유방암 세포에서의 비리포좀성 C6보다 효능이 있음을 보여주는 티미딘 혼입 성장 검정을 도시한 것이다.
도 5는 페길화 리포좀성 C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-Cer(3.75:1.75:0.75:0.75:3.0)] 전달이 C6의 항증식 활성을 증진시킴을 보여준다. 리포좀 전달은 410.4 선암 세포에서 C6의 IC50을 낮춘다. PEG-C8의 0.75로의 혼입은 30몰% C6의 혼입을 가능하게 한다. 결과는 세개의 개별적인 실험의 평균 ± S.E을 나타낸다. *p<0.05.
도 6은 아폽토시스의 측정으로서, 리포좀성 C6 전달이 MDA 세포내 카스파제-3/7 활성을 증대시킴을 보여준다.
도 7a는 세포내 C6의 전아폽토시스 활성을 증대시킴을 보여준다. 단편화된 3'-OH DNA의 TUNEL 염색은 C6 처리(20μM)가 MDA 세포내 아폽토시스를 유발함을 확 인시켜 준다. 아폽토시스는 대략 16시간의 인큐베이션 시에 발생하는 것으로 관찰되었다. 비리포좀 (20μM) C6 및 종래의 리포좀성 C6[EPC/DOPE/CH/C6(6:0.5:1.5:2)] (20μM)은 드나제-양성(Dnase-positive) 대조군과 유사한 방식으로 DNA 단편화를 유발하였다. 리포좀성 C6 전달은 아넥신(annexin) V 염색에 의해 측정된 바와 같이 상당한 세포 아폽토시스의 유발을 초래한다.
도 7b는 MDA 세포를 비리포좀성 C6(25μM), 페길화 리포좀성 C6[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4:3:1:1:1:)](25μM), 고스트(Ghost) 리포좀으로 24시간 동안 처리하고, FITC-아넥신 V로 염색시켜, 유세포 분류기에 의해 분석한 것을 보여준다. 평균 ± S.E., n=3개의 개별적인 실험. *, p<0.05; 비처리된 대조군과 비교한 경우 #p<0.005.
도 8a-8b는 리포좀성 C6 전달이 성장 억제 및/또는 아폽토시스와 관련된 연속되는 신호화를 조절함을 보여준다. 리포좀성 C6 전달은 MDA 세포내에서 Akt 포스포릴화를 억제한다. 도 8a 및 8b에서 세포를 비리포좀성 C6(50μM), 페길화 리포좀C6[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4:3:1:1:1:)](50μM) 또는 고스트 리포좀으로 8시간 동안 처리한 후, 추가의 15분 동안 20ng/ml IGF-1로 자극하였다. 도 8a는 n=3개의 개별적인 실험에 대한 대표적인 블롯을 나타낸다. 도 8b는 평균 ± S.E., n=3개의 개별적인 실험을 나타낸다. *, 비처리된 IGF-자극된 대조군과 비교한 경우 p<0.05.
도 9a-9b는 리포좀성 C6 전달이 카베올라 및 미토콘드리아 구조로의 C6 축적을 초래한다는 것을 보여준다. 도 9a는 리포좀 소포로부터 세포로의 NBD-C6 전달에 대한 공초점 현미경 이미지에 의해, C6 또한 세포 미토콘드리아내로 축적함을 입증하고 있다. 도 9b는 전체 C6에 대한 마아커로서 [3H]-C6을 사용하여, 페길화 리포좀 전달이 소포 지질 신호화 라프트에서 세라미드의 시간 의존성 축적을 초래함을 보여준다. 세라미드는 수크로스 구배의 단편 #4-5(이는 카베올린-1 지질 부유 라프트(카베올라)를 나타낸다)에서 축적되었다.
도 10a-10b는 종양 용적에 대한 페길화 리포좀성 C6[DOPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-Cer(3.75:1.75:0.75:0.75:3.0)]의 효과를 도시한 것이다. 도 10a는 410.4 선암 세포로 접종된 동물의 종양 부피를 12, 24 및 36MG/KG 리포좀성 C6 및 무 리포좀 비히클로 처리하는 동안 및 처리 이후 측정한 것이다. 결과는 각 그룹당 5마리의 동물의 평균 ± S.E.를 나타낸다. 도 10b는 40mg/kg으로 1주일 동안 종량 처리의 종양 동결절편의 염색은 아폽토시스에 대한 양성 TUNEL 염색을 입증하였다. 고스트 및 비처리 종양 부분에 대해서는 염색이 거의 없음이 분명하였다. 각 그룹 당 3마리의 동물로부터의 대표적인 슬라이드 및 종양 절편당 10개의 무작위 필드를 나타낸다.
도 11a-11b는 410.4 종양-보유 Balb/C 마우스에서의 리포좀성 C6의 약동학을 나타낸다. 도 11a에서 리포좀성-C의 10 및 40mg/kg 용량은 충분한 혈장 농도가 24시간 지속된 시험관내 IC50과 상호 연관되는 1차 반응속도를 따르는 것으로 보인다. 도 11b에서는, 상기 용량에서, 종양 조직내의 C6의 지속 상태 농도는 약 30분에서 달성됨을 보여준다. 40mg/kg 용량은 농도를 24시간까지 요구된 IC50 초과 농도로 유지시킨다.
도 12는 열반응성 및 생분해성을 지니는 PLL, PLLA 및 NIPAAM 폴리머로 구성된 본 발명의 수지상 구조체를 도시한 것이다.
도 13a-13b는 덴드리머의 열반응성 및 약물 방출성을 도시한 것이다. 도 13a는 자외선 분광법을 사용하여 0.5 및 0.1mg/ml에서 합성 덴드리머의 투과율을 조사한 것이다. 용액 와동 중에 예리한 전이 상태가 약 34℃에서 관찰되었으며, 이는 덴드리머의 LCST를 나타낸다. 도 13b는 C6-부하된 덴드리머가 제한된 방출약동학을 보이며 시험관내에서 생효율성을 나타냄을 도시한 것이다. 시간의 함수로서 37℃ 및 25℃에서 0.5%(w/v) SDS를 함유하는 증류수 중의 C6-부하된 덴드리머로부터의 C6의 분별 방출을 나타낸다. 덴드리머 LCST를 초과하는 온도인 37℃에서, 덴드리머는 보다 소수성이어서, C6-부하된 덴드리머로부터 더 늦은 방출 프로필을 나타낸다. 덴드리머의 농도는 122ug/ml였다.
도 14a-14c는 1시간 동안 LCST(25℃) 미만, 그리고 LCST(37℃) 초과의 온도에서 MDA 세포에 의한 100ug/ml 농도에서의 덴드리머의 흡수율을 도시한 것이다. 도 14a 및 14b에서 덴드리머는 미정제 FITC로 표지되며, MDA 세포 핵은 블루 DAPI 로 염색되었다. 공초점의 현미경측정에 의해 상기 덴드리머가 LCST(37℃) 초과의 온도에서 MDA 세포로 우선적으로 축적함을 입증하였다. 상단 좌측, 블루 DAPI-염색된 핵; 상단 우측, 미정제 FITC-덴드리머; 하단 좌측, 상/대비; 하단 우측, 오버레이(overlay). 도 14c는, 덴드리머의 LCST(25℃) 미만의 온도에서 보다 LCST(37℃) 초과의 온도에서 MDA 세포에 현저히 보다 많은 덴드리머가 내재화됨을 입증한다. * p≤0.005.
도 15a-15b는, C6-세라미드 부하된 덴드리머가 시험관내 항암 효과를 나타냄을 보여준다. 도 15a는 5% FBS의 존재하에서, C6-부하된 덴드리머가 세라미드의 MDA 세포로의 전달을 허용하여, 양호하지 않은 경우, DMSO 중의 유리된 C6 투여와 유사한 C6 유도된 세포독성을 초래함을 보여준다. 도 15b는 C6 부하된 덴드리머가 DMSO 중의 C6의 비투여보다 현저히 크게 C6 유도된 아폽토시스를 초래함을 보여준다. * p≤0.05.
도 16은 NIPAAM-co-PLLA-co-덱스트란 하이드로겔의 구조를 나타내며, 여기에서 R은 -CONHCH2CH=CH2 또는 H이고, m 및 n은 약 1 내지 수천의 정수를 나타낸다. NIPAAM 절편은 또한 약 10 내지 수천개의 유닛을 가질 수 있다.
본 발명은 각각이 개선된 지질 용해성, 세포 침투성, 증가된 순환 반감기 및 개선된 종양 또는 혈관 표적화를 갖는 약동학적 프로파일을 나타내는 리포좀, 재흡수가능하고 비응집성인 분산된 나노입자, 금속 또는 반도체 나노입자 또는 폴리머 물질(예컨대, 덴드리머 또는 하이드로겔)과 같은 나노스케일 어셈블리 시스템을 사용하여, 이러한 치료가 필요한 동물 또는 사람의 살아있는 세포로의, 성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 치료 화합물 및/또는 유전자 치료제의 전신 전달을 최대화시키기 위한 방법 및 시스템을 제공한다.
본원에서 사용되는 "성장 억제성"은 성장 인자 또는 이웃 조직으로 방출된 시토킨에 대해 더 이상을 반응성을 갖지 않는 살아있는 세포를 나타낸다. 또한 "성장 억제된"은 이들 세포가 DNA를 복제하여 증식하지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 "전아폽토시스"는 프로그래밍된 세포 치사 과정이 진행되는 살아있는 세포 또는 종양 조직을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "지질 유래된"은 생물학적 막에서 발견되는 천연 지질의 대사물인 물질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "생활성"은 세포의 혈장막으로부터 핵으로 정보를 변환하고 연속 신호화를 개시시키는 제제를 나타내며, 핵내 특정 유전자는 활성화되거나 불활성화되어 세포의 페노타입으로의 변경(즉, 성장 억제 및/또는 아폽토시스)을 일으킨다.
본원에서 사용되는 용어 "나노스케일" 및 "나노스케일"는 입자가 대략 300nm보다 작은 평균 치수를 가지며, 일반적으로 벌크상과 결부되지 않은 특성, 예를 들어, 양자 광학 효과를 나타내는 것을 내포하는 특별한 세분 상태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "소수성 화학치료제"는 세포 증식을 감소시키고/거나 세포 아폽토시스를 유발하는 약물로서 사용되고 수성 환경에서 비교적 불용성인 소분자, 펩티드, 단백질, 펩티드유사체 및 지질유사체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "나노복합 입자" 및 "나노입자"는 교체사용가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "응집화"는 물리적 힘(반데르 발스 또는 소수성) 또는 전정기력을 통해 현탁액 중에서 응집체(미립의 서브유닛으로 구성된 응집성 덩어리)의 형성을 나타낸다. 형성된 구조물은 "응결체"로서 불리운다.
본원에서 사용되는 비응집화는 생물학적미립물질의 "분산된" 상태를 나타낸다.
특히, 본 발명은 나노스케일 어셈블리 시스템 및 성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제를 포함하여, 이러한 치료가 필요한 동물 또는 사람으로의 소수성 화학치료 화합물의 전신적, 만성적 또는 표적화 전달을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 나노스케일 어셈블리 시스템은 리포좀; 칼슘 인-실리케이트(CPS) 쉘에 의해 캡슐화될 수 있는 재흡수가능한 나노입자; 또는 동시에 생물학적 반응성(바이오-스마트)이고 생분해성이 되도록 형성될 수 있는 덴드리머 또는 하이드로겔과 같은 폴리머 물질을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제는 암, 신생물, 동맥 염증 질환, 죽상경화증, 재발협착증, 취약 플라크 또는 당뇨병과 같은 기능장애성 성장을 포함하는 병리를 치료하기 위해 정맥내, 카테테르 전달, 주입 펌프, 마이크로구체를 통해, 또는 연고로 전신적으로 투여된다.
성장 억제성인, 전아폽토시스 지질 유래된 생활성 화합물의 예로는 SN-2위치에서 단쇄 지방산을 갖는, 생리적 세라미드 및/또는 유도체, 세포 침투성 세라미드 및/또는 유도체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니며, 2 내지 10개의 탄소 단위인, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르 결합된 디글리세라이드, 에테르 결합된 포스파티디드산, 스핑고신 또는 스핑가닌으로 구성된다. 유전자 치료제의 예로는 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라즈미드, 안티센스 또는 종래의 Si-RNA 또는 바이러스(AAV, AV 또는 렌티(lenti) 발현된 SiRNA를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에서 "페길화" 리포좀으로 언급되는, 성장 억제성인, 지질 유래된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제 및/또는 콜레스테롤로 이루어진 하나 이상의 막을 갖는, 소수성 생활성 지질 단백질 및 치료제의 전달에 적합한 PEG-750-C8 및/또는 PEG-DSPE(2000-5000MV)가 제형된다. 세망내피계(RES)에 의해 순환으로부터의 제거를 피할 수 있고, 특이적 체세포 또는 체조직을 표적하는 항체 또는 수용체 리간드와 같은, 부착되는 결합제를 가질 수 있는, "스텔스" 리포좀으로서도 공지되어 있는, PEG-750-C8 및 PEG-DSPE(2000-5000)으로 "페길화" 된 리포좀이 제형화될 수 있다. 다른 콜로이드성 입자와 같은 리포좀은 일반적으로 RES에 의해, 주로 간의 쿱퍼(Kupfer) 세포 및 비장의 고정된 마크로파지에 의해 순환으로부터 신속하게 소거된다. RES에 의한 리포좀 흡수율은 리포좀의 옵소닌 작용 또는 다이솝소니제이션(dysopsonization)의 과정과 관련된 것으로 여겨진다. 그러므로, 리포좀의 치료 효능은 RES에 의한 인지를 회피하는 능력에 의존하며, 이에 따라 장기간 동안의 순환에 잔류한다. 그러므로, 용어 "스텔스" 리포좀은 이러한 회피 특성을 나타내며, 그 막이 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-결합된 지질과 같은 2층 적합성 종을 함유하는 리포좀에 부여된다. 따라서, "스텔스" 또는 페길화 리포좀은 RES를 회피하므로써 약물 방출 리포좀의 친수성 및 생체이용성을 개선시키는 효능을 가지며, 리포좀 페길화 제조 방법은 블루메, 지.(Blume, G) 등에 의해 보고된 바와 같이 수년간 공지되어 왔다[참조: Biochim. Biophys. Acta, 1029:91-97, 1990]. 또한, 표적화는 추가로 항체 및/또는 수용체 리간드와 같은 특정 표적화 부분의 PEG로의 컨쥬게이션을 통해 달성될 수 있으며, 이는 특정 체세포 또는 체조직으로의 표적화된 축적을 촉진할 것이다. 다르게는, 본 구체예에서는 음하전된 올리고누클레오티드를 효과적으로 전달하기 위해 사용되는, 디올레오일-1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판과 같은 양이온성 지질을 함유할 수 있다. 추가로, 리포좀의 막 전체가 표적 부위의 세포막과 융해하여 그 안에 피로좀의 성분 및 내용물을 전달하는 "융해성" 리포좀이 제형될 수 있다. 융해성 지질은 수용액 중에서 육각형 형태를 형성하여, 내포작용 또는 "융해성" 과정을 통해 세포막에 결합하는 역미셀을 생성시키는 탈안정화 지질이다.
따라서, 본 발명의 리포좀 비히클은 생체활성 지질이 용액으로부터 침전되지 못하게 하여 세포에 더욱 효율적으로 전달될 수 있도록 함으로써 C6-세라미드와 같은 지질 유래 생체활성 화합물의 전신 전달과 관련된 주요 문제점을 개선시킨다. 더욱이, 이러한 구체예는 지질 이중층을 안정화시키기 위해 PEG-C8을 사용하며, 이는 리포좀이 유리된 생체활성 C6 세라미드의 농도를 40 몰% 이상까지 함유하게 한다. 또한, 이러한 구체예는 생체활성 세라미드 및/또는 소수성 화학요법제 및/또는 유전자 요법제를 함유하는 리포좀의 필수 성분으로서 PEG-G8을 사용한다. 더욱이, PEG-C8 포뮬레이션된 리포좀은 카베올린-풍부 지질 래프트(raft)내로의 유리된 세라미드의 최적 인터칼레이션 및 국재화를 보장하는데, 이는 표적화된 조직 또는 종양의 아폽토시스 또는 프로그램된 세포 치사의 후속 유도를 위한 미토콘드리아와 같은 세포내 소기관으로의 막 내재화 및 이동의 필요조건이다.
또한, 본 발명의 리포좀은 치료용 세라미드 유사체의 국소 전달 및 진신 전달 둘 모두에 적용될 수 있다. 예를 들어, 색전제거술 카테테르의 세라미드 코팅된 벌룬(balloon)으로부터의 C6-세라미드의 국소적 직접 전달은 당김 손상 후 토끼에서 신생내막(neointimal) 과형성 (재협착)을 제한한다는 것이 입증되었다 (Charles et al. Circ. Res. 2000 Aug. 18:87(4):282-8). 다른 연구자들은 수조내 경로 및 정맥내 경로 둘 모두로 전달된 DMSO 비히클 중의 세포-투과성 세라미드 유사체가 국소 뇌허혈 후의 래트에서 신경보호 효과를 유도한다는 것을 입증하였다. 리포좀 소포 중에서 C6-세라미드를 추가의 치료제와 패키지 형태로 전달하는 것에 대한 임상적 잠재성은 현저하다. 실험을 통해 세라미드는 파클리탁셀 및 펜레티니드와 같은 화학요법제와 상승적으로 작용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, C6-포뮬레이션된 리포좀 중에 화학요법제를 함께 전달하는 것은 아폽토시스 작용을 추가로 향상시킬 수 있고, 동시에 리포좀 포뮬레이션에 사용된 각각의 작용제의 농도를 효율적으로 낮춤으로써 부작용을 감소시킬 수 있다. 더욱이, 종양 특이적 항체 또는 수용체 리간드와 컨쥬게이션된 표적화된 면역리포좀은 또한 C6-세라미드 통합이 유리할 수 있다.
아폽토시스 프로그램에서 세라미드 관련된 메커니즘은 거의 알려져 있지 않지만, 세라미드 축적은 다수의 아폽토시스 특징, 예를 들어 폴리(A)DP-리보오스 중합효소 (PARP) 절단, DNA 단편화, 포스파티딜세린 노출 및 트립판 블루 흡수와 관련된 것으로 여겨진다 (Kolesnick, R.N. et al., Annu. Rev. Physiol., 60:643-665, 1998). 더욱이, 내인성 세라미드는 미토콘드리아 막내에 축적되고, 부분적으로 시토크롬 C 방출 및 이에 따른 미토콘드리아 기능부전을 유도하여 궁극적으로 아폽토시스를 일으킨다. 세라미드는 세포내에서 다양한 대사 경로를 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, 다양한 세포 처리제, 예를 들어 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 항-Fas, 혈청 회수제(withdrawal), 및 그 밖의 작용제에 반응하여 스핑고미엘리나아제 효소에 의한 스핑고미엘린의 세라미드로의 스트레스 유도된 대사적 전환이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 세라미드는 새로운 합성 경로를 통해 생성될 수 있는데, 이러한 경로에서 세린 팔미토일 트랜스퍼라아제 및/또는 세라미드 신타아제의 활성화가 중추적인 역할을 할 수 있다 (Garzotto, M. et al., Cancer Res., 58:2260-2264, 1998). 외인적으로 첨가된 세라미드는 일반적으로 입체특이적 방식으로 스트레스 유도된 아폽토시스를 의태할 수 있고, 세라미드 형성의 억제는 몇몇 경우에서 아폽토시스의 진행을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Wiesner, D.A. et al., J. Biol. Chem., 272:9868-9876, 1997). 카베올린-풍부 혈장막 지질 래프트내에서의 외인성 세라미드 인터칼레이션 및 축적은 미토콘드리아를 포함하는 세포내 소기관내로의 이들 도메인의 내재화를 촉진시킬 수 있다.
아폽토시스는 세포의 조직화된 치사를 수반하며, 이는 생물체가 암, 재협착 또는 아폽토시스에서 종종 관찰되는 바와 같이 면역 시스템과 같은 증식성 조직 및 시스템 또는 염증이 있는 비조절되는 세포 또는 조직에서 항상성을 유지하는 중요한 수단인 것으로 밝혀졌다 (Frasca, L., et al., Crit. Rev. Immunol., 18:569-594, 1998). 실제로, 아폽토시스 조절의 손실은 발암의 특징이다. 세라미드 유사체는 시험관내에서 종양발생성 세포의 세포성 아폽토시스를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 전신 전달시의 제한된 용해도로 인해, 아직까지 생체내에서 세라미드의 아폽토시스 및 화학요법 작용을 입증하는 실험은 없다. 아폽토시스란 용어는 종종 프로그램된 세포 치사와 상호교환적으로 사용된다. 이는 관련 염증 반응이 없다는 점에서 괴사에 의한 치사와 구별된다. 아폽토시스는 미토콘드리아 완전성의 손실, 핵 응축, 막 수포형성(blebbing), 크로마틴 단편화의 손실 또는 포스파티딜세린 노출 및 트립판 블루 흡수를 일으키는 막 완전성의 손실을 포함하는 하나 이상의 세포 현상의 출현을 특징으로 한다 (Wyllie, A.H., J. Cell Biol., 73:189-197, 1997). 이러한 세포성 특징 각각을 조절하는 생화학적 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 그러나, 카스파아제로서 공지된 시스테인 프로테아제 패밀리의 활성화가 아폽토시스 작용의 진행에서 중요한 역할을 하는 것으로 믿어진다 (Thornberry, N.A. et al., Science, 281:1312-1316, 1998). 이러한 카스파아제 패밀리내에서, 개시제 카스파아제는 아폽토시스 자극을 통해 활성화된 후, 다운스트림 이펙터 카스파아제를 활성화시킨다. 이러한 이펙터 카스파아제는 또한 다수의 세포내 기질을 지니는데, 이러한 기질 중에는 세포 항상성에 결정적으로 필요한 성분이 존재한다. 이들 기질 중 하나 이상의 절단은 세포 기능의 조절을 방해하여 아폽토시스 프로그램의 특정한 형태학적 특징을 촉진시킨다 (Thornberry, N.A. et al., Science, 281:1312-1316, 1998). 막 인터칼레이션 및 내재화 및 후속 아폽토시스의 유도를 위해 약 40% 이하의 몰비의 유리된 생체활성 세라미드가 이용가능하도록 PEG-C8이 리포좀을 안정화시키는 메커니즘은 본 발명의 주된 구체예이다. 따라서, C6-세라미드와 같은 화합물에 의해 아폽토시스 작용을 조절하는 것은 가치있는 치료 방법을 제공할 수 있다.
또 다른 본 발명의 구체예에서, 성장-억제성인 지질 유래된 생체활성 화합물 및/또는 유전자 요법제는 칼슘 인-실리케이트 (CPS) 쉘(shell) 및 약물 코어(core)를 지닌 약물 및 유전자 요법을 위한 재흡수가능한 나노입자내로 로딩된다. 본 발명의 재흡수가능한 나노입자는 순환을 통해서는 통상적으로 이동될 수 없는 소수성 지질 또는 단백질 약물 또는 유전자 요법제를 살아있는 세포로 전신적으로 전달할 수 있다. 재흡수가능한 나노입자는 1 내지 300nm, 바람직하게는 50nm 미만, 가장 바람직하게는 20nm 이하의 직경을 지닐 수 있다. 약 20nm 이하의 직경을 지닌 나노입자는 혈뇌 장벽 (BBB)를 가로질러 이동할 수 있어서 약물이 중추신경계내로 직접 전달될 수 있게 하는데, 이는 발암성 뇌 또는 신경 병변의 치료를 위한 주된 이점이다. 이러한 나노시스템은 백혈병과 같은 비고형 종양 뿐만 아니라 선암종, 흑색종, 전립선, 결장, 폐 (에어로졸 전달) 및 유방 종양을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 고형 종양에 또한 적합하다. 약물 코어는 고형물로서 또는 수용액 형태로 전달될 수 있다. 코어-쉘 입자의 제조는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.
특히, 재흡수가능한 나노입자를 위한 합성 방법은 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리(옥시에틸렌) 노닐페닐 에테르 (IGEPALTM 520 CO), 또는 극성 헤드 그룹 및 비극성 테일을 함유하는 그 밖의 임의의 양쪽친화성 화합물을 포함하며, 이러한 물질은 역미셀(reverse micelle) 구조를 형성하기 위해 시클로헥산 또는 이소옥탄올과 같은 소수성 비수성 용매 및 물과 배합된다. 성장-억제성이고 향아폽토시스성인 지질 유래된 화합물 또는 유전자 요법제는 용액, 현탁액 또는 물과 약물 또는 물과 유전자 요법제의 미셀 혼합물로서 수성상에 현탁될 수 있다. 코어내에 활성물질을 함유하는 생성된 역미셀은 생리학적, 즉, 등장 환경에서 생분해되는 재흡수가능한 무기 코팅으로 코팅된다. CPS는 하기 조성을 지닌 재흡수가능한 코팅의 예이다: Ca x ( PO 4 ) y zSiO 2 (여기서, 0.1≤x≤10, 0.1≤y≤10, 및 0≤z≤10 ). 조성은 생리학적 환경에서 쉘의 다양한 재흡수 속도를 제공하도록 조정될 수 있는데, 실리카 농도가 높고 칼슘 및 포스페이트 농도가 낮을수록 재흡수 속도가 느려진다.
재흡수가능한 나노입자의 합성의 핵심적 특징은 액체 매질 중의 나노입자의 적절한 분산이다. 적합한 액체는 탈이온수, 식염수 용액, 물-에탄올 혼합물, 또는 생리적 환경 및/또는 임의의 추가의 공정 단계, 예를 들어 경구 전달을 위한 정제 포뮬레이션 전의 분무-건조와 같은 제립 공정에 적합한 그 밖의 액체-현탁 매질을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 이는 나노입자의 최적 분산이 이루어짐을 보장하도록 먼저 나노입자를 세척하여 과량의 양쪽친화성 화합물 및 그 밖의 임의의 이온 또는 첨가제를 제거함으로써 수행된다. 또한, 약물 또는 유전자 요법제를 충분한 용량으로 전달하기 위해 세척 동안 현탁액을 농축시켜서 현탁액을 충분히 높은 농도로 생성시킬 필요가 있다. 이는 특히 실리케이트-함유 쉘 나노입자에 대해 변형된 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 달성된다. 이러한 변형은 계속적인 응집을 일으키는 접촉하는 나노입자 사이의 고형 다리 형성을 억제하기 위해 필요하다. 본 발명의 방법에 따라 생성된 주된 나노입자의 크기는 약 1.0 내지 300nm일 수 있다. 이러한 절차는 준탄성 광산란 또는 원심분리 또는 광학 밀도 측정을 수반하는 침강과 같은 입자 크기 분포 측정 기술에 의해 측정하여 1 마이크론을 훨씬 넘을 수 있는 나노입자의 응집을 억제한다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 처리되지 않은 나노입자 현탁액은 주된 크기의 나노입자의 경우에서 보다 세척 및 회수 단계 동안 응집으로 인해 현저히 변화된 유량 단위를 유도할 수 있다.
나노입자의 SEC 수집 및 세척 단계의 중요한 변형은 화학적 변형 뿐만 아니라 약 20 마이크론의 직경을 지닌 미세다공성 실리카 입자를 함유하는 보다 짧은 용리 컬럼을 사용하는 것을 포함한다. 화학적 변형은 균일한 나노입자 현탁액을 생성시키기 위해 나노입자의 합성 후에 역미셀 현탁액에 에탄올 또는 그 밖의 임의의 적합한 알코올을 첨가하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 전형적으로 물 또는 아세톤을 사용하는 대신 알코올을 사용하면 주된 나노입자 크기의 유량 단위 보다 훨씬 큰 유량 단위를 지닌 나노입자의 응집된 덩어리의 형성이 억제된다. 또 다른 결정적으로 중요한 화학적 변형은 나노입자가 계속적으로 응집되지 못하게 하는 일렉트로스테릭(electrosteric) 층을 제공하기 위해 나노입자의 표면상에 작용하는 유기 또는 무기 분산제를 부착하는 것이다. 적합한 유기 분산제로는 시트르산, 타르타르산 또는 아세트산이 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 적합한 금속-유기 분산제로는 알킬아민 실란 커플링제, 예를 들어 아미노프로필트리클로로실란; 3-아미노프로필트리메톡시실란 (APS); 3-아미노프로필실세스퀴옥산); 3-글리시독시프로필-트리메톡시실란 (GPS); 트리메톡시실릴-프로필디에틸렌트리아민 (DETA); 3-트리메톡시실리프로필숙산산 무수물; 및 알킬카르복실산 실란 커플링제, 예를 들어 아미드-결합된 카르복실기가 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 적합한 이온성 분산제로는 과량의 칼슘, 포스페이트 또는 피로포스페이트가 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 나노입자가 컬럼을 통과하는 동안 미세다공성 실리카 표면에 부착하지 못하게 하는 일렉트로스테릭 장벽을 생성시키기 위해 SEC 컬럼을 패킹하는데 사용되는 미세다공성 실리카 입자를 동일한 분산제를 사용하여 표면 처리하는 것이 필요하다. 또한, SEC 나노입자 농축 및 세척 단계 동안 pH 수준을 조절할 필요가 있다. 따라서, 산, 예를 들어 제한없이 질산, 아세트산 또는 염산; 또는 염기, 예를 들어 제한없이 수산화나트륨 또는 수산화칼륨이 필요에 따라 약 6 내지 8 내의 pH 수준을 유지하기 위해 첨가된다. 8 보다 큰 pH의 경우, 나노입자의 표면상의 전하가 너무 적어서 응집이 일어난다. 6 보다 작은 pH의 경우, 산 또는 염기의 농도가 너무 높아서 생성된 이온 강도가 세척 단계 동안 응집을 일으킬 수 있다. 세라미드 및 그 밖의 지질 유래된 생체활성 매개체는 이러한 모든 산성 또는 알칼리성 절차에 대해 내성이다.
또한, 카르보디이미드 매개된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 커플링제는 알킬아민 실란 또는 알킬카르복실산 커플링제에 부착되어 생체내에서의 나노입자의 분산된 상태를 추가로 보장하고, PEG 커플링제상으로의 결합제, 예를 들어 발현된 수용체에 대한 항체 또는 리간드의 부착점을 제공하며, 이로써 세라미드 농축되거나 캡슐화된 나노입자의 표적화 종양 특이적 부위로의 세포내 약물 전달을 가능하게 한다.
또 다른 본 발명의 구체예에서, 나노스케일 어셈블리 시스템은 성장-억제성이고 향아폽토시스성인 지질 유래된 생체활성 화합물 및/또는 유전자 요법제가 로딩된 중합체 물질, 예를 들어 덴드리머(dendrimer) 또는 하이드로겔로 이루어져 있다. 덴드리머 또는 하이드로겔은 바이오-스마트(bio-smart), 즉, 자극에 반응하고, 생체내에서 생분해성인 물질을 형성하도록 결합되는 개별 중합체이다. 스마트 세그먼트를 생분해성인 소수성 및/또는 친수성 세그먼트와 결합시키는 물질이 약물 전달을 위해 사용될 수 있다는 것이 조사 및 실험 후에 발견되었다. 세그먼트는 물질의 공유 결합된 부분인 것으로 간주되며, 다수의 중합된 단위를 지닐 수 있다. 예를 들어, 세그먼트는 수 개의 중합된 단량체 단위에서 약 수 천개 이하의 중합된 단량체 단위를 포함할 수 있다. 이들 세그먼트는 임의의 길이 및 임의의 분자량을 지닐 수 있지만, 각각의 세그먼트가 대략 그러한 중합체 세그먼트에 대해 예상되는 요망 특성에 근접하기에 충분히 큰 분자량을 지니는 것이 바람직하다.
단독으로 사용되는 경우 중합체 물질은 부최적 또는 비생분해성에 의해 제한된다. 따라서, 스마트 중합체 세그먼트를 생분해성 중합체 세그먼트와 결합시키면 개개의 물질 보다 훨씬 더 다능성인 물질이 생성된다. 생체반응성이고 생분해성인 중합체들을 결합시킴으로서, 생분해성이고 생리적 자극에 반응성인 약물 전달 시스템이 형성된다. 특히, 스마트 세그먼트와 생분해성 세그먼트를 포함하는 다작용성 중합체 물질이 제공되며, 여기서 생분해성 세그먼트는 소수성 세그먼트 (화학요법제와 결합하거나 이와 상호작용하는데 적합함) 및 친수성 세그먼트를 포함한다.
다수의 천연 및 합성 생분해성 중합체가 알려져 있다. 마이크로캡슐, 마이크로입자, 나노입자, 하이드로겔 및 미셀 형태의, 폴리에스테르, 예를 들어 폴리락티드 (PLA), 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA), 비오티닐화된 폴리(에틸렌 글리콜-블록-락트산), 폴리(알킬시아노아크릴레이트) 및 폴리(엡실론-카프로락톤); 폴리안하이드라이드, 예를 들어 폴리(비스(p-카르복시페녹시) 프로판-세바스산) (PCPP-SA), 폴리오르토에스테르, 폴리포스포에스테르, 폴리포스파젠, 폴리우레탄, 및 폴리(아미노산), 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트란을 포함하는 일부 중합체가 연구되었다. 이러한 모든 생분해성 중합체는 다작용성 물질의 세그먼트로서 본 발명에서 고려된다.
전술한 중합체는 주쇄의 가수분해적 또는 효소적 절단에 의해 분해되며, 이로써 약물 고갈 후에 비독성이고 비염증성이다. 중합체의 분해 특성은 이들의 화학적 조성, 입체규칙성, 결정성, 몰질량, 형태학, 크기 및 형태, 및 pH 및 온도에 좌우된다. 생분해성 중합체의 화학적 및 물리적 특성은 약물 방출 패턴에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 로딩된 약물의 방출 동력학은 약물 확산 및 중합체 분해 둘 모두에 의해 조절된다.
덴드리머 또는 하이드로겔의 분해 속도에 영향을 주는 또 다른 방법은 PLL의 전하, 친수성 및 표적화 능력으로 인해 폴리-L-리신 (PLL)을 사용하여 소수성 물질, 예를 들어 PLA 및 PLGA 마이크로/나노입자를 코팅하거나 그래프팅하는 것을 포함한다. 예를 들어, PLL을 사용하여 그래프팅된 폴리(L-락트산-코-L-리신)으로 구성된 마이크로입자는 PLL 측쇄가 없는 마이크로입자와 비교하여 로다민 B의 방출 속도가 현저히 증가된 것으로 밝혀졌다. 또한, PLL 미셀로 그래프팅된 PLGA는 PLL 보다 10배 높은 트랜스펙션 효율 및 5배 낮은 세포독성을 나타낸다. 본 발명은 친수성-소수성 생분해성 세그먼트를 제공하는데 있어서 이러한 코팅 및 그래프팅 기술을 사용하는 것을 고려한다.
덴드리머는 비교적 단순분산, 트리(tree)-유사 또는 제네레이션(generational) 구조를 유도하는 규칙적이고 매우 분지된 세그먼트로 정의된다. 덴드리머는 하기 세 가지 특색있는 구조적 특징을 지닌다: 코어; 코어에 방사상으로 연결된 반복 단위 또는 제네레이션의 분지상 분지 (branch upon branch)를 함유하는 내부 영역; 및 최외각 제네레이션에 부착된 말단 부분의 외부 또는 표면 영역. 덴드리머는 이러한 세 가지 구조적 성분들을 조정함으로써 다수의 구조물로 형성될 수 있다. 고도로 분지되고 반응성 3차원 거대분자인 덴드리머는 이들의 높은 분자 균일도, 협소한 분자량 분포, 특정 크기 및 흥미로운 구조적 특성, 예를 들어 내부 공극 및 공동, 및 매우 작용성인 말단 표면으로 인해 생체의학 분야에서 점점 더 중요해졌다. 공간적으로 배열된 작용기는 다양한 분자, 예를 들어 이들의 혈액 순환 시간을 증가시키기 위해 친수성 분자, 예를 들어 PEO와 반응할 수 있고, 자기 공명 영상 (MRI)에 사용하기 위해 조영제와 반응할 수 있고, 요망되는 조직 부위에 국재화시키기 위해 표적화 분자와 반응할 수 있다.
현재 이용가능한 덴드리머는 벤질 에테르, 프로필렌이민, 아미도아민, L-리신, 에스테르 및 카르보실란 수지상 세그먼트를 함유한다. 이들 중에서, 양이온성 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머가 광범위하게 연구되었고, 이들은 덴드리머-DNA 비, 크기 및 특히 덴드리머의 가요성에 의존하여 광범위하게 다양한 세포에서 높은 수준의 유전자 트랜스펙션을 매개하는 것으로 보고되었다. PAMAM 덴드리머는 표적화된 전달 시스템으로서 간주되며, 특정 종양 미세맥관구조내에서 축적을 향상시킬 수 있고, 종양 조직내로의 유출을 증가시킬 수 있다. 폴리(L-리신) (PLL) 덴드리머는 다수의 표면 아민을 함유하는 또 다른 다중양이온성 덴드리머이며, 다중양이온, 예를 들어 핵산, 세포외 매트릭스에서 발견되는 프로테오글리칸 및 세포막의 인지질과 정전기적 상호작용을 할 수 있는 것으로 간주된다. 이러한 중합체는 지질 유래된 생체활성이고 성장 억제성이며 향아폽토시스성인 대사물질 또는 작용제를 포함하는 약물을 표적화된 막에 국재화시킬 수 있다
그러나, 다중양이온성 덴드리머는 여전히 생체내 독성 문제를 지니고, 체내에서의 분해에 대해 내성이며, 이로써 약물 전달에 대해 덜 적합하다. PAMAM 덴드리머의 세포독성을 개선시키기 위해, 덴드리머의 양이온성 아민 말단기가 음이온성 카르복실레이트 말단기로 대체될 수 있다. 본 발명의 물질은 덴드리머 구조물의 아암(arm), 분지 또는 덴드론(dendron)으로서 생분해성 스마트 세그먼트들을 결합시킴으로써 개개의 성분들로부터 제조된 덴드리머 구조물의 단점의 일부를 해결한다. 이러한 덴드리머 물질은 화학 결합 형성 반응으로 열반응성 중합체 세그먼트를 생분해성 중합체 세그먼트와 커플링시킴으로써 제조될 수 있다.
또한, 덴드리머는 나노 크기 입자로서 제조될 수 있다. 약 1nm 내지 1000nm의 크기를 지닌 입자는 약물을 염증성, 증식성 또는 형질전환된 조직으로 수송하고 표적화하는 데에 있어서 현저한 이점을 보유하는 것으로 믿어진다. 약물은 흡착, 포획 및 공유 부착에 의해 나노 크기 덴드리머내로 로딩되고, 탈착, 확산, 중합체 부식 또는 상기 메커니즘 중 임의의 메커니즘 또는 전부의 특정 조합에 의해 나노 크기 덴드리머로부터 방출된다. 시험관내 및 생체내 실험은 나노 크기 덴드리머가 덱스트란에 의해 안정화되고 폴리소르베이트 80으로 코팅된 경우에 긴 혈액 순환 시간 및 낮은 RES 흡수율을 지닐 수 있음을 보여준다. 나노 크기 덴드리머는 혈관 또는 고형 종양과 상호작용한 후, 엔도사이토시스에 의해 이러한 세포에 의해 흡수될 수 있다. 따라서, 덴드리머는 증가된 순환 반감기로 인해 약물을 종양형성성 또는 염증성/증식성 조직에 전달하기 위한 커다란 잠재성을 지니는 것으로 믿어진다.
최근 나노기술의 진보는 소수성 치료제의 조절된 전달 및 표적화된 방출을 위한 매우 큰 잠재성을 제공한다. 본 발명의 나노스케일 덴드리머 어셈블리 시스템은 온도 자극에 반응성이며 가수분해적으로 생분해성이어서, C6의 고형 종양으로의 표적화된 지연 전달을 가능하게 한다. C6가 온도 민감성 "스마트(smart)" 덴드리머에 로딩될 수 있고, 이러한 약물-중합체 복합체가 MDA 에스트로겐 네거티브 유방암 세포의 증식을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 이러한 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 것으로 입증되었다. 열 팩(pack) 또는 초음파를 통한 고형 종양 영역으로의 단기 국소적 고온의 적용은 C6의 질병 조직내로의 방출을 촉발시킬 것이다. 따라서, 열 반응성 나노스케일 덴드리머는 세라미드를 포함하는 치료제의 고형 종양 조직으로의 표적화되고 조절된 전달을 위한 최적의 해법으로서 작용할 수 있으며, 이는 "생리학적 고온 약물 전달"로서 정의된다.
약물 전달에 있어서 덴드리머.
리포좀 약물 전달 기술은 약물 전달 이점의 동적 배열을 지닌 안정한 나노입자를 공학처리하기 위해 중합체 화학 기술이 통합된 보다 진보된 약물 전달 시스템에 의해 서서히 빛을 잃어가고 있다. 예를 들어, 중합체 나노입자는 장기간의 생체이용률, 질병 세포 표적화 및 생체반응성이고 조절된 약물 방출을 가능케 한다 (17). 약물은 흡착, 포획 및 공유 부착에 의해 중합체 나노입자내로 로딩되고, 탈착, 확산, 중합체 부식 또는 상기 메커니즘 중 임의의 메커니즘 또는 전부의 특정 조합에 의해 나노입자로부터 방출된다. 고도로 분지되고 반응성인 3차원 나노입자인 덴드리머는 이들의 높은 분자 균일도, 협소한 분자량 분포, 특정 크기 및 흥미로운 구조적 특성, 예를 들어 내부 공극 및 공동, 및 매우 작용성인 말단 표면으로 인해 생체의학 분야에 적합하다. 본 발명의 덴드리머는 다중양이온성 중합체 (폴리(L-리신), PLL), 생분해성 중합체 (폴리(L-락트산), PLLA) 및 열반응성 중합체 (폴리(N-이소프로필아크릴아미드), PNIPAAM)으로 이루어져 있다. 소수성 작용제, 예를 들어 C6은 PLLA와의 소수성-친수성 상호작용에 의해 1000mg/ml 이하의 농도로 덴드리머내로 로딩된다. 반응성 중합체를 생분해성 중합체와 통합시키는 것은 생리학적 자극, 예를 들어 온도에 반응하여 약물의 지연 방출을 달성하는 데에 있어서 이점을 지닌다.
스마트 또는 반응성 중합체는 물리적, 화학적 또는 생물학적 자극, 예를 들어 온도, 용매 조성, pH, 이온 강도, 압력, 전기장, 광 및 대사물질에 반응성이다. 열반응성 중합체 중에서, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (PNIPAAM)이 조절된 약물 전달과 관련하여 광범위하게 사용되어 왔는데, 이는 이것이 32℃ 부근의 수용액중에서 보다 낮은 임계 용액 온도 (LCST)에서 독특한 용해도 전이를 나타내기 때문이다. 이는 LCST 미만으로 냉각된 경우에 팽창하고 팽윤되며, LCST 보다 높게 가열되는 경우에 수축하고 찌부러진다. PNIPAAM의 LCST는 소수성 및 친수성 단위, 및 가교제를 PNIPAAM내로 통합시킴으로써 약물의 로딩 및 방출을 조절하기 위해 조작될 수 있다.
중요하게는, PNIPAAM-기초 중합체는 부위 특이적 약물 전달을 위한 가역적 표적화 부분으로서 사용될 수 있다. 본 발명에서, 중합체는 37℃ 내지 42℃의 LCST를 지니도록 설계된다. LCST 미만인 37℃의 체온에서, 중합체는 생리학적 유체에 가용성이고, 신체의 세망내피계 (RES)를 회피하며, 로딩된 약물의 혈액 순환 시간을 증가시킨다. 국소적 초음파 및/또는 열 패치 (이에 제한되지 않음)를 통해온도가 표적화 부위에서 중합체의 LCST 보다 높은 온도인 42℃로 증가하는 경우, 중합체는 표적화 부위에 축적되고, 높은 국소 농도로 치료 약물을 방출시킨다. 마우스에서 40℃의 LCST를 지닌 폴리(NIPAAM-코-아크릴아미드)의 전신 주입은 가열된 그룹 및 가열되지 않은 대조 그룹 보다 2배 이상 높은 정도로 국소적 고온에 의해 고형 종양에 공중합체를 축적시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드-코-N,N-디메틸아크릴아미드)-b-폴리(D,L-락티드)로 구성된 생분해성 및 열반응성 미셀은 40℃의 LCST를 지니도록 제조되었다. 소과동물 대동맥 내피 세포에 대한 미셀내에 로딩된 항암 약물 아드리아마이신의 세포독성은 세포에 의한 미셀의 가속된 흡수로 인해 LCST 보다 높은 42.5℃에서 유리된 아드리아마이신의 세포독성 보다 높은 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 수지상 나노입자는 PNIPAAM의 열반응성 특성을 섭렵하는데, 이는 중합체가 다중양이온성 PLL (친수성 및 안정성) 및 생분해성 PLLA (소수성, 조절 방출)에 공유 결합되어 있기 때문이다. 더욱이, 이러한 다작용성 덴드리머에는 유방암 세포 아폽토시스를 유도하기 위해 향아폽토시스성 지질 C6가 로딩될 수 있다.
히드로겔은 다량의 물을 흡수하므로써 수성 환경에서 팽창되나 이의 구조는 유지하는 삼차원 가교된 중합체 네트워크이다. 이들의 높은 물 함량, 생체적합성, 및 독특한 대사 특성으로 인해, 히드로겔은 약물 전달 및 조직 조작과 같은 생물의학 분야에서 많은 관심을 받았다. 본 발명의 환경적으로 민감한 히드로겔은 환경적 자극 예컨대, 온도, pH, 전기 시그널, 이온 강도 등에 대하여 이의 구조를 변화시키므로써 약물 방출을 제어할 수 있다. 공유적 및 비공유적 (물리적) 가교된 온도 민감성 생분해가능한 겔은 히드로겔로서 바람직한 물질이다.
특히, 히드로겔은 활발하거나 반응적인 성분으로서 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAAM) 또는 이의 유도체; 가수분해가능한 소수성 성분으로서의 폴리(L-락트산)(PILA) 또는 이의 유도체; 및 효소적으로 분해가능한 친수성 조성물로서의 덱스트란 또는 이의 유도체로 구성된 공중합체 네트워크로서 제조된다. 성분 또는 세그먼트는 약 3 모노머 유닛 내지 약 10,000 모노머 유닛 예를 들어, 약 3 내지 5,000 유닛을 포함하는 임의의 길이일 수 있다. 물질 또는 세그먼트는 추가로 기타 모노머 유닛을 포함하여 물질의 특성을 조절할 수 있다. 예를 들어, 히드로겔은 또한 겔의 pH 및 이온강도 민감성을 증가시키기 위해 음이온 (아크릴산) 및 양이온 (아크릴 아미드) 유닛을 포함할 수 있다.
PNIPAAM-PLLA-덱스트란 히드로겔은 약 32℃에서 낮은 임계용해온도 (LCST)를 나타내는 열반응성을 띠며, 이들의 팽윤성은 온도 변화, 친수성/소수성 성분의 균형 및 PLLA 성분의 분해에 매우 의존적이다. ATR-FTIR 및 중량 손실 측정에 의해 측정한 바에 따르면 PLLA 성분에서 에스테르 결합의 가수분해에 의해 유도된 히드로겔의 분해는 LCST를 초과하는 37℃ 보다 LCST 미만인 25℃에서 더욱 빠르다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 치료학적 화합물 예컨대, 성장 억제, 프로-아폽토시스 유발, 지질 유도 생활성 화합물 및/또는 유전자 치료제가 나노스케일 어셈블리 시스템 예컨대, 리포좀, 재흡수가능한 비응집성 나노입자 또는 중합성 물질 예컨대, 덴드리머 또는 히드로겔에 혼입되는 경우, 암성 세포로의 이들의 전신성 전달이 증가되며, 따라서 성장 억제, 프리-아폽토시스 유도 화합물의 효능을 매우 증대시킨다. 또한, 세라미드 풍부 또는 캡슐화 나노기법은 감소된 부작용과 함께 더 높은 효율을 달성하기 위한 복합 치료법으로서 더 낮은 용량의 기타 소수성 화학요법제 또는 유전자 치료제를 전달하도록 조작될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 구체예를 추가로 설명하고자 하는 것이지 이를 제한하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 단지 일정한 실험을 이용하여 본원에 기술된 특이적 물질 및 공정과의 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다.
실시예 1 - 리포좀 전달을 통한 유방암 세포의 C 6 - 세라미드 -유도된 아폽토시스
재료 및 세포 배양
에그 포스파티딜콜린 (EPC), 디올레일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 디올레오일 포스파티딜콜린 (DOPC), 콜레스테롤 (CH), 폴리에틸렌글리콜 (2000-5000)-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (PEG-DSPE), D-에리트로-헥사노일-스핑고신 (C6-세라미드), 폴리에틸렌글리콜-750-C8-세라미드 (PEG-C8), 디올레오일-1,2-디아실-3-트리메틸-암모늄-프로판 (DOTAP)을 아반티 폴라 리피드 (Avanti Polar Lipids : Alabaster, AL)로부터 구입하였다. 디-히드로에리트로 헥사노일-스핑고신 (DHC6)을 바이오몰 (Biomol: Plymouth Meething, PA)로부터 구입하였다. [3H]-C6를 ARC (세인트 루이스, MO)로부터 구입하고, [3H]-티미딘을 ICN(코스타 메사, CA)로부터 구입하고, 콜레스테릴-1,2-3H(N) 헥사데실 에테르 ([3H]-CHE)를 페르킨엘머(PerkinElmer: Boston, MA)로부터 수득하였다. 실리카 겔 60 박층 크로마토그래피 플레이트를 EMD 케미칼 (EMD Chemicals; Gibbstown, NJ)로부터 구입하였다. 포름바르/카본-피복된 400 메쉬 구리 그리드를 일렉트론 마이크로스코피 사이언스(Electron Microscopy Sciences: Fort Washington, Pa)로부터 구입하고, 폴리-L-리신을 시그마 (세인트 루이스, MO)로부터 구입하였다.
포스포릴화된-Akt (pAkt)에 특이적인 항체 및 Akt-1,2,3을 셀 시그널링 (Cell signaling: Beverly, MA)로부터 구입하였다. 인슐린형 성장 인자-1 (IGF-1)을 칼바이오켐 (CalBioChem: 샌디에고, CA)으로부터 구입하였다. 웨스턴 블롯팅에 있어서, 4%-12% 프리-캐스팅된 SDS-PAGE 구배 겔을 인비트로겐 (Invitrogen: 칼스배드, CA)로터 구입하고, ECL 시약은 아머샴 (Amersham: 피스카터웨이, NJ)로부터 구입하였다. TUNEL 아폽토시스 디텍션 키트 (TUNEL Apoptosis Detection Kit)를 업스테이트 바이오테크놀로지 (UpState Biotechnology: 왈탐, MA)로부터 구입하였다. 바이브란트 아폽토시스 어세이 키트 #3 (Vybrant Apotosis Assay Kit #3)를 몰레큘러 프로브 (Molecular Probes: 유젠, OR)로부터 구입하고, Apo-ONE 호모지니어스 카스파제-3/7 어세이 (Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay)를 프로메가 (Promega: 매디슨, WI)로부터 구입하였다. RNAse를 로쉐 (Roche; 인디아나폴리스, IN)로부터 구입하고, 프로피디움 요오다이드 (PI)를 시그마 (세인트 루이스, MO)로부터 구입하였다. 사람 MDA-MB-231 (MDA) 유방 아데노칼시노마 세포를 ATCC (마나사스, VA)로부터 구입하고, 10% FBS로 보충한 RPMI 1640중에서 37℃하에 성장시켰다. 이러한 세포주는 사람 유방 암의 매우 공격적인 전이성 에스트로겐 수용체 네거티브 모델이다.
리포좀 포뮬레이션 및 유출
지질을 포뮬레이션시키고, C6을 리포좀 약물 전달 비히클로 혼입시키는 능력에 대해 시험하였다. 간단하게는, 클로로포름 (CHCl3)중에 용해된 지질을 특정 몰비로 혼합하고, 지질 전이 온도를 넘는 온도하에서 질소 스트림하에 건조시키고, 멸균성 포스페이트-완충된 염수 (PBS)로 수화시켰다. 생성된 용액을 2분 동안 초음파 처리하고, 100nm 폴리카보네이트 막을 통해 유출시켰다. 혼입력은 포뮬레이션중에 미량의 [3H]C6을 혼입하고, CHCl3/MeOH(2:1)중에 구성적 지질을 유출시키고, 신틸레이션 카운터를 사용하여 압출 전 및 후에 방사능을 비교하므로써 측정하였다. 생체내 투여를 위한 포뮬레이션은 DSPC:DOPE:DSPE-PEG(5000):C8-세라미드-PEG(750):C6-세라미드(3.75:1.75:0.75:0.75:3.0, 몰비)로 구성된다. PEG(750)-C8 첨가는 30몰% 이하의 C6-세라미드에 대해 허용가능하다. 이러한 페길화된 포뮬레이션의 생활성은 410.4 유방 아데노칼시노마 세포에서 확인되었다. 포뮬레이션화된 리포좀 조성을 클로로포름/메탄올 (2:1)중의 구성분 지질을 추출하고, CHCl3/MeOH/ddH20(60:25:4) 용매 시스템을 사용하여 예열된 실리카 겔 60 박막층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트상에서 분석하므로써 확인하였다. 지질을 요오드 챔버중에서 가시화시켰다. 투과전자현미경 (TEM)을 사용하여 포물레이션된 리포좀의 크기 및 형태를 특성결정하였다.
투과전자현미경 ( TEM )
포뮬레이션화된 리포좀의 크기 및 형태를 특성결정하기 위해, TEM를 사용하였다. 초기에는, 소수성 그리드로의 시각적 결합을 촉진하기 위해 포름바르(formvar) 탄소-피복된 400 메쉬 구리 그리드를 폴리-L-리신으로 10분 동안 피복하였다. 그 후, 리포좀 샘플을 건조된 그리드에 도포시키고, 5분 동안 접착시켰다. 건조된 그리드에 1% 포스포툰스틱 산(pH7.0)을 추가로 5분 동안 도포하여 네거티브 스테이닝을 수행하였다. 샘플을 60kV의 가속된 전압으로 21,500X 배율로 관찰하였다.
모든 포뮬레이션에 대해서 85 내지 140nm 직경의 균질한 크기 분포를 갖는 C6-혼입된 리포좀 비히클이 생성되는지를 TEM 검정으로 확인하였다 (도 2A). 도 2B는 리포좀 포뮬레이션의 평균 크기를 나타낸다. 통상적인 포뮬레이션으로의 미량의 [3H]C6의 혼입시, 본 발명자들인 추출 과정 동안 세라미드의 현저한 손실이 없음을 관찰하였다 (도 2C). 또한, 통상적인 리포좀으로부터의 지질 추출물을 TLC 플레이트에서 수행하여, 추출 과정 동안 지질 구성분의 시각적 감소가 없음을 확인하였다 (도 2D).
실험관내 약동학
미량의 [3H]C6을 리포좀 포뮬레이션에 혼입시켜 비리포좀 투여와 비교하여 리포좀 전달량을 정량하였다. 사람 MDA-MB-231(MDA) 유방 아데노칼시노마 세포를 24-웰 플레이트에서 3.5x104 세포/웰로 시딩하고, 10% FBS를 함유하는 배지에서 밤새 성장시켰다. 그 후, 세포를 다양한 시간 간격 동안 1% FBS가 보충된 배지중에 미량의 [3H]C6 또는 [3H]CHE을 함유하는 리포좀 또는 비리포좀 C6로 처리하였다. 리포좀 C6를 세포 배지에 직접 첨가하고, 최종 농도 ≤0.1% (v/v)가 되도록 디메틸술폭시드 (DMSO) 비히클중의 비리포좀 C6를 첨가하였다. 지적된 시점에서, 배지를 제거하고, 세포를 냉 PBS로 1회 세척하여 리포좀/막-비특이적 상호작용을 분리시켰다. 그 후, 세포를 1% SDS로 용해시키고, 신틸레이션 계수기로 MDA 세포로의 [3H]C6 또는 [3H]CHE 축적을 평가하였다.
결과는 리포좀 포뮬레이션이 1% FBS의 존재하에 C6 비리포좀 투여보다 더욱 효과적이고 효율적으로 C6를 전달하였음을 보여준다 (도 3A). 양이온성 리포좀 전달은 MDA 세포에 의한 세라미드 축적에서 2배 증가를 나타내었으며, 약 16h째에서 최대 축적이 관찰되었다. 통상적인 페길화된 리포좀은 유사한 실험관내 약동학적 프로파일을 갖는 것으로 관찰되었다.
다음으로, C6이 리포좀 비히클로부터 세포막으로 방출되거나 전달되는 메카니즘을 조사하였다. 리포좀/세포 막 결합에 대한 프로브로서 이동불가능한 콜레스테롤 지질 마커인 [6H]CHE를 사용하여, 리포좀을 [3H]C6 또는 [3H]CHE로 태깅하고, 지정된 기간 동안 MDA 세포와 인큐베이션시켰다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 리포좀은 약물 비히클로부터 세포막으로의 C6의 이동은 매개하나, 콜레스테롤의 이동은 매개하지 않는다. 또한, C6 축적은 시간에 따라 증가하지만, CHE 축적은 배경 수준을 넘어서까지 현저하게 증가하지 않았다. 세라미드와 콜레스테롤 축적간의 불균형은 또한 용량 의존 방식으로도 관찰되었다 (도 3C). 이는 C6가 지질 이동 공정을 통해 전달되는 것을 암시하며, 이는 C6가 결합된 리포좀/세포막의 융합 없이 리포좀 층으로부터 혈장막으로 분할되게 한다.
[ 3 H]- 티미딘 세포 증식
단쇄 세라미드를 MDA 세포로 절단하기 위한 통상적인 지질 포뮬레이션의 유용성을 측정하기 위해, [3H]티미딘 증식 검정을 수행하였다. 간단하게는, MDA 세포를 24-웰 플레이트에 3.5x104 세포/웰로 시딩하고, 밤새 성장시키고, 24h 동안 영양 부족 상태가 되게 하였다. 영양부족 12시간째에, 나머지 영양 부족 기간에 대해서 세포를 리포좀 또는 비리포좀 C6로 처리하였다. 그 후, 영양 부족 처리 후, 배지를 추가의 12h 동안 FBS(10% 최종 농도)로 보충하고, 최종 4h 동안 0.5mCi/ml [3H]티미딘을 첨가하여 세포 증식을 검정하였다. 세포를 냉 PBS로 1회 세척하고, 10% 트리클로릭 아세트산으로 10분 동안 2회 세척하였다. 세포를 0.3N NaOH로 용해시키고, 산 불용해성 DNA로의 [3H]티미딘의 혼입을 신틸레이션 계수기로 평가하였다.
도 4A에 도시된 바와 같이, C6로 보충된 에그 포스파티딜콜린 (EPC) 및 콜레스테롤 (CH) (직선)을 함유하는 통상적인 리포좀은 MDA 세포 증식의 현저한 용량 의존적 억제를 나타내었다. 소포-불안정화 지질인 디올레일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)의 통상적인 포뮬레이션으로의 첨가는 C6의 생활성을 증진시켰다. 25μM 이상의 리포좀 C6로 처리할 경우, 10% FBS의 존재하에 12h 동안 처리시 MDA 세포는 완전히 성장 억제되었다. 리포좀 포뮬레이션중의 C6의 전달은 IC50을 약 3배 감소시켰으며, 이는 비리포좀에 있어서의 15μM를 리포좀에 있어서의 5μM로 감소시킨 것이다. 이러한 통상적인 포뮬레이션은 DMSO 비히클 (점선, 백색 원형)중의 C6의 비리포좀 투여와 비교하여 MDA 세포중의 증가된 용량 의존적 성장 억제를 나타내었으며, 이는 증가된 효력 및 효율을 나타낸다. C6이 없는 리포좀 (고스트: 점선, 백색 사각형) 및 PBS 대조군은 현저한 성장 억제를 나타내지 않으며, 이는 단지 생활성제로서만의 C6를 의미한다. 이러한 연구는 C6-포뮬레이션된 통상적인 리포좀이 자유롭게 투여된 C6 보다 항증식제로서 더욱 효과적이라는 것을 입증해준다.
다음으로, 양이온성 지질 포뮬레이션으로의 C6-혼입을 연구하였다 (도 4B). 파지티브로 하전된 지질인 디올레오일-1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP)로 포뮬레이션된 고스트 양이온 리포좀 (점선, 백색 삼각형)이 단독으로 MDA 세포 증식을 증가시킨다 하더라도, C6-혼입된 양이온성 리포좀(직선, 백색 삼각형)은 용량 의존적으로 MDA 세포 증식을 감소시킨다. 이러한 양이온성 포뮬레이션을 비리포좀 C6 투여 (점선, 백색 원형) 보다는 더욱 효과적이나, 통상적인 포뮬레이션 (직선, 백색 사각형) 만큼 효과적이지는 않다. 이는 양이온성 리포좀 포뮬레이션이 생활성 세라미드를 전달하는데 사용되어 세포 증식을 용량 의존적으로 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
다음은, C6의 생활성을 추가로 증가시키기 위한 페길화된 지질의 역할을 연구하였다. C8-세라미드 (PEG-C8)을 리포좀/막 융합을 촉진시키는 이의 추가적인 잠재적인 이점으로 인해 선택하였다. 또한, PEG-C8을 포함시키면 생체이용율 신장의 추가된 이점과 함께 리포좀 이중층의 시간 지연 특성을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 게다가, 본 구체예는 PEG C8을 사용하여 지질 이중층을 안정화시켜, 리포좀이 적어도 30 몰% 이하의 농도로 자유 생활성 C6 세라미드를 함유할 수 있게 하였다. 또한, 본 구체예는 생활성 세라미드 및/또는 소수성 화학요법제 및/또는 유전자 치료제를 함유하는 리포좀의 내재성 성분으로서 PEG C8을 사용한다. 또한, PEG-C8 포뮬레이션화된 리포좀은 유리 세라미드의 카베올린 풍부 지질 래프트(raft)로의 최적의 삽입 및 위치화, 막 내재화를 위한 요건, 및 표적화된 조직 또는 종양의 아폽토시스 또는 프로그래밍된 세포 치사의 후속적 유도를 위한 미토콘드리아를 포함하는 세포하 세포기관으로의 이동을 보장한다.
페길화된 리포좀은 MDA 세포 증식에 현저한 영향을 끼치지 않으며, 이는 PEG-C8이 생화학적으로 불활성이라는 것을 입증해준다. 그러나, C6-혼입된 페길화된 리포좀이 더욱 효과적이지 않다 하더라도, 10 및 25μM에서 통상적인 리포좀 만큼은 효과적이다 (도 4C). 이는 진신성 약물 전달을 위해 고안된 페길화된 리포좀 포뮬레이션이 또한 MDA 세포 증식의 C6-매개된 억제에 효과적인 비히클이라는 것을 나타낸다. 조합하면, 다중 리포좀 포뮬레이션으로 전달된 C6은 비리포좀 C6와 비교하여 개선된 용량-반응 성장억제를 나타내며, 이는 개선된 효능 및 효율을 나타낸다.
MTS 세포독성 검정
생체내 연구를 위해 사용된 페길화된 포뮬레이션의 실험관내 효율을 평가하기 위해, 본 발명자들은 뮤린 410.4 유방 아데노칼시노마 세포에 대한 포뮬레이션을 시험하였다. 410.4 세포를 96-웰 플레이트에 플레이팅시키고, FBS를 1% 보충한 배양 배지에서 24시간 동안 페길화된 리포좀 또는 자유 C6로 처리하였다. 제조업자 지시에 따라 프로메가 셀 티터 프롤리퍼레이션 키트 (Promega Cell Titer Proliferation Kit: Promega)를 사용하여 세포독성을 평가하였다. 페길화된 리포좀-C6 전달은 증가된 세포 독성을 초래하였다. 리포좀-C6 포뮬레이션의 투여는 DMSO 비히클중의 C6의 자유 투여와 비교하여 C6의 IC50을 저하시켰다 (도 5). 이러한 데이타는 PEG-C8 리포좀 포뮬레이션으로 전달될 경우 C6-세라미드의 IC50를 35-40% 감소시키는 것을 의미한다. 처리는 24시간 동안 1% FBS의 존재하에 수행하였다.
카스파제 검정
아폽토시스는 카스파제 활성의 상향 조절과 관련이 있으며, 따라서 MDA 세포를 페길화된 리포좀으로 처리한 후 카스파제-3/7 활성을 평가하였다. 간단하게는, MDA 세포를 96-웰 플레이트중에 6.0 x 103 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 10% FBS를 함유하는 배양 배지중에서 48시간 동안 성장시켰다. 그 후, 세포를 1% FBS를 함유하는 배지중에서 24h 동안 리포좀 또는 비리포좀 C6로 처리하였다. 카스파제-3/7 효소 활성 수준을 당해분야에 공지된 표준 프로토콜에 따라 Apo-ONE 동종 카스파제-3/7 검정(Promega, Madison, WI)을 사용하여 측정하였다.
결과는, 페길화된 리포좀 세라미드로 처리한 MDA 세포가 비리포좀 세라미드로 처리한 세포보다 현저하게 더 큰 카스파제-3/7 활성을 나타낸다는 것을 보여주었다 (도 6). 고스트 처리로는 카스파제-3/7 활성에 대한 현저한 변화가 관찰되지 않았다. 조합하면, 이들 결과는 C6-포뮬레이션된 리포좀이 C6의 비리포좀 투여보다 더욱 효과적이며, 이는 MDA 세포 증식 및 실질적이 아포톱시스 치사의 현저한 억제를 초래한다.
아폽토시스 검출
C6-의존성 성장 억제가 증가된 아폽토시스와 관련이 있는지의 여부를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. C6 전달이 MDA 세포 아폽토시스를 유도하는지를 확인하기 위해, TUNEL 검정 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)를 수행하였으며, 이는 절단된 DNA를 염색하는 것이며, 세포 아폽토시스를 증명한다 (도 7A).
리포좀 및 비리포좀 C6로 처리된 순환하는 혈정 공급된 MDA 세포의 TUNEL 염색은 8h째에 DNA 단편이 발생하지 않음을 입증해준다. 리포좀 및 비리포좀 C6 처리는 Dnase-파지티브 대조군과 유사한 방식으로 DNA 단편을 유도하였다. 절단된 3'-OH DNA의 염색은 처리 후 16h 째에 관찰되었으며, 이 시점이 C6 전달의 실험관내 약동학적 프로파일과 일치하는 시점이다. 고스트 포뮬레이션으로는 아폽토시스가 관찰되지 않았다.
C6-유도된 아폽토시스를 정량하기 위해서, 비브란트 아폽토시스 검정 키트 (Vybrant apoptosis assay kit: Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여, 처리된 순환하는 MDA 세포의 부가적 V 염색, 및 부가적 V-염색된 세포의 유동세포계수 분석을 수행하였다.
24h 처리 후, 페길화된 리포좀 C6는 비리포좀 C6와 비교하여 현저하게 더 많은 양의 추가적 V 염색을 유도한 반면, 고스트 포뮬레이션은 어떠한 효과도 없었다 (도 7B).
활성화된 AKT 즉, 프로-생존 키나아제의 평가
리포좀 및 C6 비리포좀 포뮬레이션으로 처리한 MDA 세포에서 세라미드-조절된 Akt 시그널링 경로를 웨시턴 블롯 검정을 이용하여 조사하였다. 간단하게는, MDA 세포를 60mm 플레이트에 4.0x105 세포/웰로 시딩하고, 밤새 성장시키고, 24시간 후에 영양 부족 상태가 되게 하였다. 영양부족 상태 16시간째에, 나머지 영양 부족 상태의 기간을 위해 세포를 리포좀 또는 비리포좀 C6로 처리하였다. 영양 부족 24시간째에, IGF-1(20ng/ml)을 15분 동안 세포 배지에 첨가하였다. 세포를 냉 PBS로 1회 세척한 후, 얼음상의 150㎕의 세포용해 냉 완충액 (1% 트리톤 X-100, 20mM 트리스, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 2.5mM Na4P2O7, 1mM β-글리세롤포스페이트, 1mM Na3VO4, ddH2O중의 1㎕/ml 류펩틴, pH7.5)을 첨가하였다. 세포를 얼음상에서 15분 동안 세포용해시키고, 세포 용해물을 채취하고, 15,000XG에서 15분 동안 원심분리하였다. 35㎍의 단백질을 4%-12% 사전 캐스팅된 SDS-PAGE 구배 겔에 로딩하고, pAkt에 대해 프로빙하였다. 블롯을 스트립핑하고, Akt-1,2,3에 대해 재프로빙하여 동등한 로딩을 입증하였다. ECL 케미루미네슨스를 사용하여 단백질 밴드를 시각화시키고, 밀도측정기에 의해 정량하였다. 결과는, 페길화된 리포좀 C6가 IGF-1 자극 pAkt 수준을 감소하는데 비리포좀 세라미드보다 더욱 효과적인 반면, 고스트 포뮬레이션은 pAkt 수준에 어떠한 영향도 끼치지 않았다 (도 8A 및 8B). 리포좀 디히드로-에리트로헥사노일-스핑고신 (DHC6)은 또한 비리포좀 DHC6와 비교하여 IGF-1-자극된 Akt 포스포릴화의 억제를 나타내었다. C6로의 8시간 처리를 선택하였으며, 이러한 시점은 MDA 세포로의 C6의 근접한 최대 축적에 상응한다. 이러한 연구의 뒷받침은 리포좀 C6가 Akt 시그널링 케스캐이드의 장기간 억제를 통해 아폽토시스 및 세포 성장 억제를 유도한다는 것을 보여주었다.
공초점 연구
410.4 뮤린 유방 아데노칼시노마 세포로의 C6의 세포 축적을 입증하기위해, 본 발명자들은 C6에 대한 마커로서 10 몰% NBD-C6를 갖는 리포좀-C6 포뮬레이션을 투여하였다. 세포를 비교를 위해 DAPI(핵) 및 미트로트래커 레드(MitroTraker Red: 미토콘드리아)로 대비염색하였다. C6 전달을 60X 배율에서 공초점 현미경으로 평가하였다. 리포좀 비히클로부터의 세포로의 NBD-C6 전달의 공초점 현미경 이미지 (도 9A). NBD-C6(녹색)은 미토콘드리아 (미토트래커 레드)와 함께 위치하며; 청색 염색은 DAPI 염색된 핵을 나타낸다.
수크로스 구배
리포좀 포뮬레이션으로의 미량의 [3H]-C6의 혼입을 이용하여 전체 세포 및 카베올라-풍부 지질 래프트 둘 모두에서 시간 의존적 세포 축적을 평가하였다. 이들 지질 래프트가 세라미드를 포함한 다중 경로의 시그널 변환을 촉진하는 것으로 여겨지기 때문에, 리포좀-C6 투여는 C6의 지질 래프트로의 축적을 촉진시켜야 한다. 이러한 현상을 평가하기 위해, 세포 용해물의 수크로스 구배 (5%, 35% 및 45% 수크로스)를 카베올라-풍부 지질 래프트를 분리하기 위해 수행하였다. 구배의 각각 1ml 분획 (총 12 분획)의 동등한 분취물을 제거하고, 신틸레이션 계수계를 사용하여 계수하였다. 총 C6에 대한 마커로서 [3H]-C6를 사용하여, 리포좀 전달은 카베올라 지질 시그널링 래프트에서 세라미드의 시간 의존적 축적을 유도하였다 (도 9B). 세라미드는 수크로스 구배 분획물 제 4번 및 제 5번에서 축적되었으며, 이들은 카베올린-1 풍부 지질 래프트(카베올라)임을 나타낸다 (도 9B).
실험관내 요약
유방 아데노칼시노마의 생체내 마우스 모델 시스템을 사용하여, 고형 종양의 치료를 위한 C6의 전신 전달에 대한 방법을 평가하였다. 생체내 데이타는 410.4 종양 함유 BALB/c 마우스에서 페길화된 리포좀 포뮬레이션이 항암 활성을 가질 가망성을 시사한다 (도 10A-B). 이러한 생체내 결과는 빈 고스트 리포좀과 비교하여 리포좀 C6로 종양 부피를 용량 반응적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 이는 종양발생원의 생체내 모델에서 전신성 C6 포뮬레이션의 효율을 입증하는 첫번째 연구이다. 게다가, 생체내 약동학적 분석은 전신성 리포좀 C6 전달이 24시간에 걸쳐 종양 조직에서 C6의 정상상태의 생활성 농도의 달성 및 유지를 유도하였음을 입증한다 (도 11A-B). C6가 혈액 및 주요 제 1 통과 기관으로부터 신속하게 제거됨에도 불구하고, 이러한 정상상태의 생활성 농도가 유지되었다. 조합하며, 이는 C6의 전신성 포뮬레이션이 실험관내 및 생체내 둘 모두에서 유리한 약동학적 효율을 나타낸다는 것을 보여주었다. 게다가, 스위스 웹스터 마우스를 사용하여, 페길화된 리포좀-C6 포뮬레이션이 100mg/kg 이하로의 정맥내 주사 후 독성 부작용을 나타내지 않은 것으로 입증된 반면, DMSO중의 자유 C6의 주입은 10mg/kg의 농도로 마우스의 50%를 치사시켰다.
생체내 항암 효능
전신성 리포좀-C6 전달의 생체내 효능을 평가하기 위해, 5 x 106 410.4 세포를 Balb/C 마우스의 오른쪽 뒤 옆구리에 피하내 주사하였다. 410.4 세포의 주입 후 4일째에, 마우스에 리포좀-C6, 빈 리포좀 (고스트) 또는 0.9% NaCl을 정맥내 (i.v.) 주입하였다. 마우스를 매 2일마다 처리하였다. 처리 직후, 마우스의 체중을 달고, 종양을 평가하였다. 종양 크기는 캘리퍼스로 측정하였으며, 종양 부피는 헤미엘립소이드(hemiellipsoid) 방정식을 이용하여 계산하였다: V = π/6 x L x W2 ; 여기서, V = 종양 부피, L = 길이 및 W = 폭임.
리포좀-C6 [DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-세라미드 (3.75:1.75:0.75:3.0)] 전달은 세라미드-유도된 아폽토시스를 통해 용량 의존적인 항종양 활성을 나타내었다. 리포좀-C6의 전신성 전달은 빈 고스트 리포좀과 비교하여 종양의 성장을 용량 의존적인 방식으로 억제하였다 (도 10A). 40mg/kg 리포좀-C6으로 1주일 처리한 후, 종양을 제거하고, 조직학적 검정을 위한 시로-섹션을 생성시켰다 (도 10B). 종양 섹션을 TUNEL 키트로 염색하여 유도된 아폽토시스의 정도를 평가하였다; DAPI는 핵을 염색한다.
생체내 약동학
C6 전달에 대한 마커로서 [3H]-C6를 사용하여, 종양 함유 마우스에 10 및 40mg/kg 리포좀-C6를 주입하고, 혈액, 종양, 비장, 신장, 간 및 심장 조직을 선택된 시점에서 회수하였다. 조직의 중량을 달고, 가용화시키고, 신틸레이션 계수기를 사용하여 계수하였다. 조직의 mg (또는 혈액의 ml) 당 총 C6의 양을 각각의 취해진 조직에 대해 계산하고, 약동학적 프로파일을 평가하였다. C6 분포에 대한 리포좀 비히클의 전달을 추적하기 위해, [3H]-CHE를 전달 비히클에 대한 마아커로서 리포좀 제형에 혼입시켰다.
10 및 40 mg/kg 리포좀-C6의 용량은 일차 역학을 따르며, 실험관내 IC50과 관련하여 충분한 혈장 농도를 24시간째에 염색하였다 (도 11A). 이러한 투여량에서, 종양 조직중의 정상 상태 농도의 C6를 약 30분에 달성하였다 (도 11B). 40mg/kg 투여량은 24시간 이하로 목적하는 IC50을 초과하는 농도를 유지하였다. 페길화된 리포좀 비히클에 대한 마아커로서 [3H]-CHE를 사용하여, 리포좀이 종양 조직에서 시간 의존적인 방식으로 축적되는 것으로 나타났다. 이는 종양 조직에서 C6의 정상 상태 농도가 페길화된 리포좀의 연속된 축적으로 인해 유지될 수 있으며, 따라서 종양에서 대사된 C6를 보충한다는 것을 의미할 수 있다.
실시예 2 - C 6 - 세라미드 약물 전달 비히클로서의 덴드리머
덴드리머 합성
덴드리머를 PLLA가 이식된 PNIPAAM와 폴리(L-리신)(PLL)을 콘쥬게이팅하므로써 합성하였다. PLLA가 이식된 PNIPAAM을 유리 라디칼 중합에 의해 합성하였다 (도 12).
덴드리머 열-반응성
UV-vis 분광기 (Perkin Elmer Lamda 25, Shelton, CT)를 사용하여 PBS (pH =7.4)중의 덴드리머의 500nm에서의 투과율을 다양한 농도로 1℃/30분으로 온도를 증가시키면서 연구하였다 (도 13A). 덴드리머는 열-반응성이며, 각각 1, 0.5, 0.1 및 0.05mg.ml-1의 농도에서 31, 32, 34 및 39℃의 낮은 임계용해온도 (95%의 최대 투과율에서의 온도로서 정의됨)을 나타낸다. LCST는 덴드리머의 농도가 감소함에 따라 불분명해졌다. LCST 초과시, 투과율 등급은 중합체의 상호작용의 증가로 인해 농도를 증가시키므로써 감소되었다. PNIPAAM 및 PLLA로 이식된 PNIPAAM의 LCST는 대수 농도에 대해 직선 관계로 감소하였으며, 후자는 PPLA의 소수성으로 인해 농도에 걸쳐 전자보다 2℃ 낮았다. 그러나, PPL이 PPLA로 이식된 PNIPAAM의 양 말단으로 컨쥬게이팅되는 경우, 덴드리머의 LCST는 대수 농도에 대해 비직선형 관계를 나타내며, PPL의 파지티브 전하 및 친수성으로 인해 중합체의 기타 두가지 유형의 값과 비교하여 가장 높은 값을 나타내었다.
덴드리머의 열반응성은 동적광산란법(DLS)(ALV, Germany)을 이용하여 온도에 대한 덴드리머의 유체역학적 크기를 측정하므로써 추가로 확인되었다. 세 농도 1, 0.5 및 0.1mg.ml-1에서 PBS(pH=7.4)중의 엔드리머의 분명한 유체역학적 직경(Dh)은 각각 세 영역에서 온도 의존적이라는 것을 보여주었다 (데이타 미도시). 더 낮은 온도 범위에서, Dh는 용액 온도가 증가함에 따라 현저하게 감소하였으며, 이는 개별적 사슬의 수축을 반영한다. 중간 온도 영역에서, Dh는 이의 최대 값에 도달하기 전에 증가하였으며, 이는 덴드리머 나노입자가 사슬간 결합으로 이한 서로 응집되었음을 나타낸다. 더 높은 온도 범위에서, Dh는 응집 온도가 사슬간 수축으로 인해 증가함에 따라 감소한다. 덴드리머의 LCST는 각각 세 농도 1. 0.5 및 0.1mg.ml-1에서 Dh-온도 곡선의 초기 세 휴지점으로 규정된 29 (25 내지 29℃일 수 있음), 30 및 31℃이었다. 낮은 온도 범위 및 중간 온도 범위 둘 모두에서, Dh는 농도 증가에 따라 증가하는데, 이는 사슬간 상호작용이 농도가 증가함에 따라 증가하기 때문이다. DLS에 의해 측정된 LCST는 동일한 용액 농도에 있어서 UV-vis 분광기로 측정한 값 보다 약간 낮았으며, 이는 상이한 측정 장치로 인한 측정으로 기인한 것이다. DLS 및 UV-vis 결과 둘 모두는 농도가 증가함에 따라 LCST가 감소한다는 것을 입증해준다.
C 6 세라미드 및 바이오-스마트 나노덴드리머
LCST 미만 및 초과의 온도, 즉 25 및 37℃에서 및 1mg·ml-1에서 PBS(pH=7.4)중의 덴드리머의 역학적 분해는 각각 MALDI-TOF를 사용한 시간의 함수로서 덴드리머의 몰 질량 변화를 측정함으로써 조사되었다. 1 개월까지는 덴드리머의 몰수 질량(Mn)이 감소하였으며, 25℃에서 보다 37℃에서 더 빠르게 감소하였고, 두 온도 모두에서 19일 후에 비교적 안정한 값에 도달하였다. 흥미롭게도, 19일 후의 안정한 Mn은 약 2700 g·mol-1이었으며, 초기 Mn(약 4200g·mol-1)로부터 이를 감하면 약 1500g·mol-1가 되어 PLLA의 Mn과 동일하였다. 이러한 결과는 덴드리머가 분해되었으며 그러한 분해가 덴드리머의 PLLA 성분의 가수분해성 분해에 기여할 수 있슴을 제시한다. 이러한 설명을 지지하도록, 시간의 함수로서 덴드리머의 FTIR 분광 및 점도를 각각 측정하였다(데이타를 도시하지 않음). PLLA의 에스테르 C=O 스트레칭에 기인하는 약 1760cm-1에서의 피크 세기는 시간에 따라서 명백하게 감소하였으며 19일 후에는 사라졌다. PNIPAAM 및 PLL의 아미드 C=O 스트레칭에 기인된 약 1660cm-1에서의 피크는 상대적으로 안정했기 때문에 약 1760cm-1에서의 피크 세기를 표정하는 참조 피크로 사용하였다. 생성되는 피크 높이 백분율은 시간에 따라 감소하였으며, 19일 후에 0이 되었다(데이타 도시되지 않음). 또한, 덴드리머의 점도(ASTM D 445 및 ISO 3104 과정 후에 캐논-우벨로드 타입 점도계(Cannon-Ubbelohde type viscometer))는 시간에 따라 감소하였으며, 25℃에서 보다 37℃에서 더 신속하게 감소하였고, 19일 후에 안정한 값에 도달하였다(데이타는 도시되지 않음). 따라서, 점도계 및 MALDI-TOF 결과와 함께 FTIR 결과는 발명된 덴드리머가 PLLA 성분의 가수분해성 분해에 기인되어 생분해됨을 강하게 제시하고 있다.
C6 로딩 효율을 위한 방법. C6을 증류수, 에탄올 및 N-디메틸포름아미드(DMF)(증류수/에탄올/DMF{5:5:3, v/v/v)로 구성된 1mg/ml의 농도의 용매 시스템중에서 3:1(C6:덴드리머, w/w)의 비로 덴드리머와 혼합하고, 밀봉하여, 실온에서 7 시간 동안 저장하였다. C6/덴드리머 용액을 셀룰로오즈 막(MWCO-3500)에 붓고, 에탄올(50ml)에 대해서 투석시켜 막 내부로부터 C6를 제거하였다. 셀룰로오즈 막 내부 및 외부의 C6의 양은 MALDI-TOF 질량분광기로 측정하였다. 막 내부 및 외부의 두 용액 모두 2,5-디히드록시벤조산의 매트릭스 용액과 1:9(샘플:매트릭스)로 혼합하였다. C16-세라미드(C16)를 내부 표준 물질로서 사용하고, 각각의 용액에 가하였다. 시간의 함수(2, 4, 6 및 10 시간)로서 C6의 양을 각각 424 및 562m/z에서 C6 및 C16 질량 피크의 상대적 세기로 계산되었다. C6을 덴드리머내로 3:1(C6:덴드리머)의 비로 부하시키면 약 35.9±1.2%의 로딩 효율이 얻어졌다.
덴드리머로부터 C6 방출을 위한 방법. C6와 덴드리머의 상호작용을 검정하기 위해서, 덴드리머로부터 C6의 방출 운동역학을 평가하는 것이 필요하다. C6의 분별 방출(Mt/Wω, 여기서 Mt 및 Wω는 각각 시간 t에서 방출된 C6의 양 및 방출된 C6의 최대량이다)은 덴드리머의 가수분해성 분해에 기인하여 시간에 따라 증가하였다. 덴드리머-C6 복합체를 무균 PBS(pH=7.4)에 용해시키고, 셀룰로오즈 막(MWCO=3500)에 넣고, 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 0.5%(w/v)로 함유하는 무균 PBS(pH=7.4)(50ml)에 대해서 투석시켰다. C6는 극히 소수성이기 때문에, 세정제, 예컨대, SDS의 존재하에 투석을 수행하는 것이 필요했다. 덴드리머의 최종 농도는 LCST 미만(25℃) 및 초과(37℃)의 온도에서 계속된 자기 교반하에 0.02, 0.05, 0.1 및 0.5mg/ml였다. 소정의 시간 간격으로(0 내지 30일), 1ml의 완충 용액을 제거하고, 새로운 완충액으로 대체시켜서 방출된 C6의 농도를 측정하였다. 덴드리머로부터의 C6-방출을 정량화하기 위해서, 셀룰로오즈 막 내부 및 외부의 C6의 양을 내부 표준으로서 C16을 사용한 MALDI-TOF 질량 분광분석으로 측정하였다. 37℃, 즉, 덴드리머의 LCST 초과의 온도에서, 덴드리머는 더욱 더 소수성이어서, C6-로딩된 덴드리머로부터의 더 늦은 C6의 방출 프로필을 나타낸다(도 13B).
덴드리머 분해성
중합성 나노입자가 상기된 바와 같이 리포좀성 기술과 비교되는 이점에 기인하여, 본 발명자들은 온도 유도된 전달 방법을 사용한 고형 종양을 표적화하기 위해서 C6를 감온성 덴드리머 나노입자내로 로딩시켰다. 본 발명의 덴드리머 나노입자는 PLLA, PLL, 및 PNIMPAM으로 구성되어 있다. 상기된 바와 같이, UV-vis 분광기를 사용하여 온도를 증가시키면서 덴드리머 용액 투과율을 모니터하여, 예리한 전이를 관찰하였으며, 이는 이들 덴드리머가 열반응성임을 입증하고 있는 것이다. 이들 양성자성 덴드리머에 대한 대략적인 LCST는 100㎍/ml에서 약 34℃인 것으로 밝혀졌다. MALDI-TOF 질량 분광기를 사용하여, 본 발명자들은 덴드리머의 몰 질량이 시간에 따라 감소하여, 이들이 생분해성임을 입증하였다(데이타는 도시되지 않음). 공초점형 현미경분석으로 분석하여, 덴드리머가 LCST 미만의 온도(25℃) 보다는 LCST 초과의 온도(37℃)에서 우선적으로 MDA 세포내로 축적되며(도 14A), 이는 증가된 소수성에 기인되는 듯하다. 더욱이, 유세포분석법을 이용하여 FITC-표지된 덴드리머의 세포내 축적 및 흡수를 정량화함으로써, 본 발명자들은 현저하게 더 많은 덴드리머 흡수가 LCST 미만의 온도(25℃) 보다는 LCST 초과의 온도(37℃)의 MDA 세포에서 유도되었음을 입증하였다. (도 14B). 더욱 중요하게는, MDA 세포를 이들 C6-로딩된 덴드리머로 처리하면 현저한 성장 억제/세포독성이 유발되지만, 덴드리머 단독은 세포독성이 없었다(도 15A). 성장 억제를 유도하는 것 외에, C6-농축된 덴드리머는 MDA 세포의 아포프토시스를 유도하였다(도 15B). 종합하면, 본 발명에서의 데이타는 덴드리머가 항암 약물 C6의 방출을 효과적으로 조절하고 있음을 입증하고 있다. 이러한 구체예를 최적화는 생리학적 고온 약물전달이 가능하도록 생리학적 온도를 약간 초과하는 LCST로 중합성 덴드리머의 발명을 포함한다.
C 6 - 세라미드를 위한 약물전달 비히클로서 덴드리머 : 로딩 및 방출
본 발명의 일차 목적은 C6와 복합되며, 정맥내 주입되고, 장시간 동안 혈액에 용해되어 고형 종양을 표적으로 하고 이에 지속적으로 전달할 수 있는 생분해성 및 감온성 수지상 나노입자를 제공하는 것에 관한 것이다. 덴드리머를 고형 종양에 열적으로 표적화시키기 위한 약 40℃의 LCST를 지니는 덴드리머를 생성시키기 위해서, NIPAAM, 소수성 PLLA 및 친수성 PLL 사이의 상대적인 몰 비율이 중요한 역할을 한다. 호모폴리머 NPIPAAM은 LCST가 32℃인 것으로 공지되어 있다{Eeckman, 2001 #52}. 이러한 LCST는 각각 혼입되는 소수성 또는 친수성 성분의 양을 증가시킴으로써 감소 또는 증가될 것이다{Eeckman, 2001 #52}.
덴드리머 구조는 생리학적 온도를 초과하는 국소 고온요법의 유도 시에 C6를 방출시키는 생-반응성, 스마트 덴드리머를 형성하도록 최적화되었다. 37℃ 약간 초과의 최적의 LCST를 지닌 덴드리머를 발명하기 위해서, 본 발명자들은 PLLA를 보다 유연하며 무정형인 폴리머, 예컨대, 몰 질량이 800, 2000 및 4000g/mol인 폴리(D,L-락트산)(PDLLA)로 대체하였다. 두 번째로, 본 발명자들은 PLL의 상이한 제네레이션(수지상 구조의 연속적인 중심 고리들), 예컨대, 3, 4 또는 5 제네레이션을 사용하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 PDLLA 거대단량체와 NIPAAM 단랸체 사이의 상이한 몰 비율, 예컨대, 0.02, 0.05 및 0.1mol%를 이용하였다. 생성되는 덴드리머의 LCST는 UVvis 분광법으로 온도의 함수로서 투과율을 측정하고, 광 산란으로 온도의 함수로서 수력학적 크기를 측정함으로써 검정된다.
덴드리머의 LCST는 이소프로필메타크릴아미드(NIMAAM)과의 공중합에 의해서 상승한다. 생성되는 덴드리머는 NIMAAM 단량체를 NIPAAM의 50, 60, 및 70%로 각각 증가시킴에 따라 36, 42 및 44℃의 LCST를 나타냈다. 이러한 방법으로, 본 발명자들은 국소 온열법을 통해서 종양 표적화를 통한 고형 종양에 대한 성장 억제, 아포프토틱 지질-유도된 제 2 메신저를 포함한 소수성 화학치료제를 방출시키도록 조작될 수 있는 생-스마트 덴드리머를 발명하고 있다. 국소 가열은 초음파 또를 가열 패치 장치를 사용하여 덴드리머의 LCST 초과의 국소 종양 온도를 상승시킴으로써 적용될 수 있다. 이러한 과정은 "생리학적 고온 약물 전달로 정의된다.
덴드리머 세포 생존율
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하고자 하는 것이다.
실시예 3- 전신 전달을 위한 세라미드 함유 칼슘 포스포 - 실리케이트 쉘 흡수 가능한 나노입자의 합성
역 미셀은 추가의 정제 없이 비이온성 계면활성제 폴리(옥시에틸렌) 노닐페닐 에테르(Igepal CO-520, Aldrich Chemical Co.)를 사용함으로써 제조하였다. 시클로헥산, 탈이온수 및 C6-세라미드를 합성을 위해서 수용하여 사용하였다.
4mL 이게팔, 10mL 시클로헥산 및 탈이온수로 구성된 20mL 전체 용적의 마이크로에멀션을 신속하게 교반하면서 30mL 바이알에서 주위 온도로 제조하였다. 이러한 과정은 균일 혼합물을 생성시키며 그러한 혼합물에 미량의 C6가 수성상으로 물과 약물의 미셀성 혼합물로서 첨가되었다. C6을 함유하는 생성되는 미셀 구조을 CPS 함유 조성물 Cax(PO4)yzSiO2로 코팅시켰으며, 상기 식에서, x, y, 및 z 값은 각각 0.1≤x≤10, 0.1≤y≤10, 및 0.1≤z≤10이다. 생성되는 나노입자의 크기는 물 대 계면활성제의 비(R=[물]/[계면활성제])를 변화시킴으로써 조절되었다.
역 미셀을 CPS 코팅으로 캡슐화시킨 후에, 나노입자를 세척하고, C6-코팅 쉘 나노입자를 위해서 특이적으로 변경된 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피를 사용함으로써 농축시켰다. 약 20 마이크론 직경을 지니는 미세기공 실리카 입자를 함유하는 표준 보다 짧은 용리 컬럼을 사용하였으며, 에탄올이 용리액으로 첨가되었다. 나노입자를 분산시키기 위해서, 알킬아민 실란 결합제, 아미노프로필트리클로로실란을 현탁액에 가하였다. 이러한 결합제는 또한 SEC 컬럼을 충진하도록 사용된 미세기공 실리카 입자에 첨가되었다. 현탁된 나노입자의 pH는 요구되는 양의 아세트산 또는 수산화나트륨을 첨가함으로써 약 7.0으로 유지되었다. 또한, 카르보디이미드-매개된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 결합제를 알킬아민 결합제에 결합시켰다.
실시예 4- C 6 - 세라미드 방출 비히클로서 히드로겔
열반응성 및 생분해성을 지니는 9개의 다작용성 히드로겔을 합성하고 특성화시켰다. 히드로겔은 열반응성 성분으로서 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAAM), 가수분해 가능하며 소수성인 성분으로서 폴리(L-락트산)(PLLA) 및 효소분해 가능하며 친수성인 성분으로서 덱스트란으로 구성된 코폴리머 네트워크이다. 이들의 다작용성으로 인해서, 발명된 히드로겔은 약물 전달 및 조직 조작을 포함한 생의학적 적용에 적합하다(도 16).
히드로겔은 열반응성을 나타내며 LCST는 PNIPAAM의 LCST에 전형적인 약 32℃였다. 히드로겔은 또한 약 4개월 후에 기공 크기가 증가하면서 가수분해적으로 생분해 가능하였다. 히드로겔의 습윤 성향은 LCST 초과의 온도(37℃) 및 LCST 미만의 온도(25℃)에서 상이하였으며, 코폴리머의 친수성 및 소수성에 크게 좌우되었다. 결론적으로, 히드로겔은 이들의 코폴리머 조성 및 생분해 가능성의 변화를 통해서 C6-세라미드의 조절 및 지연된 방출에 아주 효능적이다.
본원에 기재된 실시예 및 구체예는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것이며, 이들의 다양한 변화 및 변경도 당업자에게 제안될 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위내에 포함되는 것이다.

Claims (77)

  1. 치료 화합물의 전달을 필요로 하는 동물 또는 사람에게 성장-억제, 전아폽토시스, 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 함유한 나노스케일 어셈블리 시스템를 포함하는 치료 화합물을 전달하는 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물이 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제 1항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물이 단쇄 세라미드 유사체임을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제 1항에 있어서, 성장 억제 지질 유도된 생활성 화합물이 SN-2 위치에서 2 내지 10 개 탄소의 단쇄 지방산을 함유하는 세라미드 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제 1항에 있어서, 성장 억제 지질 유도된 생활성 화합물이 SN-2 위치에서 12 내지 24개 탄소의 장쇄 지방산을 함유하는 생리학적 세라미드 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제 1항에 있어서, 유전자 치료제가 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라스미드, 안티센스 또는 Si-RNA로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제 1항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 함유한 나노스케일 어셈블리 시스템가 정맥내, 카테테르 전달, 주입 펌프, 미소구체 또는 샐브(salve)를 통해서 전신 전달됨을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제 1항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 기능장애 세포성장을 포함한 병을 치료하도록 전신 전달됨을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제 8항에 있어서, 병이 암, 종양, 동맥 염증 질환, 죽상경화증, 재협착 또는 취약 플라크(vulnerable plaque), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제 1항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템가 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및 콜레스테롤로 구성된 하나 이상의 막을 지니는 리포좀 조성물임을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제 1항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템가 성장-억제 전아폽토시스 지질-유도된 생활성 화합물, 콜레스테롤 및 양이온성 지질로 구성된 하나 이상의 막을 지니는 리포좀 조성물임을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제 11항에 있어서, 양이온성 지질이 디올레오일-1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판임을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제 1항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템가 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물, 콜레스테롤 및 페길화된 지질로 구성된 하나 이상의 막을 지니는 리포좀 조성물임을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제 13항에 있어서, 페길화된 지질이 폴리에틸렌글리콜-450-C8-세라미드임을 특징으로 하는 시스템.
  15. 제 14항에 있어서, 페길화된 리포좀이 크기가 750 내지 5000 범위인 페길화 된 세포-투과성 세라미드(PEG-C8) 및/또는 크기가 2000 내지 5000 범위인 디스테로일포스파티딜에탄올아민(PEG DSPE)를 함유하도록 포뮬레이션됨을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제 15항에 있어서, 리포좀이 유리(free) 생활성 C6 세라미드를 약 40몰 백분율까지의 농도를 함유하도록 PEG-C8을 함유하는 페길화된 리포좀이 지질 이중층을 안정화시킴을 특징으로 하는 시스템.
  17. 제 16항에 있어서, PEG-C8을 함유하는 페길화된 리포좀이 생활성 세라미드 및/또는 수소성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 함유하는 리포좀의 필수성분(integral component)임을 특징으로 하는 시스템.
  18. 제 17항에 있어서, PEG-C8을 함유하는 페길화된 리포좀이 세포내 소기관, 예컨대, 미토콘드리아에 대한 막 내재화 및 전달을 위한 선결요건으로서 유리 세라미드를 카베올린-강화 지질 래프트(raft) 내로 최적으로 삽입시키고 편재시킴을 가능하게 함을 특징으로 하는 시스템.
  19. 제 18항에 있어서, PEG-C8을 함유하는 페길화된 리포좀이 표적된 조직 또는 종양의 미토콘드리아성 기능장애 및 후속된 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 치 사 유도를 가능하게 함을 특징으로 하는 시스템.
  20. 제 1항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템가 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물, 콜레스테롤 및 융합 지질로 구성된 하나 이상의 막을 지니며 동물 또는 사람에게 전달하기 위한 치료 화합물을 함유하는 리포좀 조성물임을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제 20항에 있어서, 융합 지질이 수용액에서 육각형을 형성하여 역 미셀을 생성하는 탈안정화 지질임을 특징으로 하는 시스템.
  22. 제 1항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템가 칼슘 인-실리케이트 쉘을 지니며 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제를 함유하는 흡수성 나노입자로 구성됨을 특징으로 하는 시스템.
  23. 제 22항에 있어서, 흡수성 나노입자의 직경이 약 1 내지 300nm 범위임을 특징으로 하는 시스템.
  24. 제 22항에 있어서, 흡수성 나노입자의 직경이 50nm 미만임을 특징으로 하는 시스템.
  25. 제 22항에 있어서, 흡수성 나노입자의 직경이 약 20nm 이하임을 특징으로 하는 시스템.
  26. 제 22항의 흡수성 나노입자를 합성하는 방법으로서,
    a) 비이온성 계면활성제, 소수성 유기 용매, 물 및 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제를 혼합함으로써 역 미셀을 제조하는 단계;
    b) 역 미셀을 칼슘 인-실리케이트 쉘로 코팅하는 단계;
    c) 분산제를 칼슘 인-실리케이트 쉘에 첨가하는 단계; 및
    d) 용리 컬럼과 직경이 약 20 마이크론인 미세기공 실리카 입자로 구성된 변형된 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 기술을 이용하여 흡수성 나노입자를 세척하고 농축시키는 단계를 포함하며,
    칼슘 인-실리케이트 쉘에 첨가되는 동일한 분산제가 미세기공 실리카 입자에 첨가되는, 흡수성 나노입자를 합성하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 분산제가 산, 금속-유기 화합물 또는 무기 화합물임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 산이 시트르산, 타르타르산 및 아세트산으로 이루어진 군으로 부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 금속-유기 화합물이 알킬아민 실란 결합제 또는 알킬카르복실산 실란 결합제임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 알킬아민 실란 결합제가 아미노프로필트리클로로실란; 3-아미노프로필트리메톡시실란(APS); 3-아미노프로필실세스퀴옥산); 3-글리시드옥시프로필트리메톡시실란 (GPS); 트리메톡시실릴-프로필디에틸렌트리아민 (DETA); 3-트리메톡시실릴프로필숙신산 무수물; 및 알킬카르복실산 실란 결합제, 예컨대, 아미드-결합된 카르복실기로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 알킬카르복실산 실란 결합제가 아미드-결합된 카르복실기임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 27항에 있어서, 무기 화합물이 칼슘, 인산염 및 피로인산염으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 26항에 있어서, 바인더(binder)에 대한 결합 지점을 제공하도록 카르보디이미드-매개된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 결합제를 분산제에 첨가하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 결합제가 신체의 발암성 또는 염증성 또는 증식성 세포 또는 조직에 대한 항체 또는 수용체 리간드임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 26항에 있어서, 변형된 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 기술이 용리 컬럼을 단축시키고 그 내부에 물 또는 아세톤 대신 에탄올을 사용함을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템가 화학치료제를 전달할 수 있는 바이오-스마트 단편 및 생분해성 단편을 포함하는 중합체 물질이며, 생분해성 단편이 소수성 단편 및 친수성 단편을 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  37. 제 36항에 있어서, 소수성 또는 친수성 단편이 가수분해 또는 효소분해에 의해 분해 가능함을 특징으로 하는 시스템.
  38. 제 36항에 있어서, 스마트 단편이 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(N-알킬아크릴아미드), 폴리(N-n-프로필아크릴아미드), 폴리(N-이소프로필메타크릴아미드), 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드), 엘라스틴-유사 폴리펩티드, 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  39. 제 36항에 있어서, 바이오-스마트 단편이 물리적, 화학적 또는 생물학적 자극에 반응성이며, 이로 제한되는 것은 아니지만, 표적된, 국소 초음파 및/또는 열 패치에 의해서 유도된 국소 고온화 후에, 소수성 생활성 지질, 화학치료제 및 유전자 제제로 이루어진 군으로부터 선택된 제제를 방출함을 특징으로 하는 시스템.
  40. 제 36항에 있어서, 중합체 물질이 화학치료제의 전달을 증진시키는 덴드리머이며, 덴드리머가 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 단편 또는 이의 유도체, 폴리(라이신) 단편 또는 이의 유도체, 및 폴리(락트산) 단편 또는 이의 유도체로 구성됨을 특징으로 하는 시스템.
  41. 제 40항에 있어서, 덴드리머가 생리학적 고온 약물 전달을 위해서 LCST가 37℃를 초과하고, 폴리(락트산)이 폴리(DL-락트산)으로 대체되며; 3 초과 제네레이션(generation)의 PLL 덴드론이 혼입되어 있고; 폴리(락트산) 또는 폴리(DL-락트산)에 대한 NIPAAM의 비율이 증가하며; NIPAAM을 NIMAAM(N-이소프로필메틸-아크릴아미드)와 공중합시킴을 포함하는 바이오-스마트, 생분해성 나노덴드리머임을 특징으로 하는 시스템.
  42. 제 36항에 있어서, 공중합 물질이 히드록겔임을 특징으로 하는 시스템.
  43. 제 42항에 있어서, 히드로겔 물질이 바이오-스마트 단편 및 생분해성 단편으로 구성되며, 생분해성 단편이 덱스트란, 폴리락트산, 또는 이의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
  44. 조성물의 투여를 필요로 하는 동물 또는 사람에게 제 1항의 나노스케일 어셈블리 시스템를 투여함을 포함하여, 동물 또는 사람에게 조성물을 투여하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 나노스케일 어셈블리 시스템중에 함유된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제의 농도가 약 1000mg ml-1 이하임을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 조성물의 약 40중량%임을 특징으로 하는 방법.
  47. 치료 화합물의 전달을 필요로 하는 동물 또는 사람에게 치료 화합물을 전달하기 위한 리포좀 조성물로서, 콜레스테롤로 구성된 하나 이상의 막을 지닌 리포좀, 및 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물을 포함하며; 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물, 및/또는 소수성 화 학치료제 및/또는 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라스미드, 안티센스 또는 Si-RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 치료제를 함유하는 리포좀 조성물.
  48. 제 47항에 있어서, 세라미드 및 이의 유도체가 SN-2 위치에서 2 내지 10개 탄소의 단쇄 지방산 또는 SN-2 위치에서 12 내지 24개 탄소의 장쇄 지방산으로 구성됨을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
  49. 제 48항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 기능장애 세포 성장을 포함하는 병을 치료하도록 전신 전달됨을 특징으로 하는 리포좀 조성물.
  50. 제 49항에 있어서, 병이 암, 종양, 동맥 염증 질환, 죽상경화증, 재협착 또는 취약 플라크(vulnerable plaque), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 리포좀 시스템.
  51. 조성물의 투여를 필요로 하는 동물 또는 사람에게 제 50항의 리포좀 조성물을 투여함을 포함하여 조성물을 투여하는 방법으로서, 조성물 중에 함유된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제 의 농도가 약 1000mg ml-1 이하임을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제가 조성물의 약 40중량%임을 특징으로 하는 방법.
  53. 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제의 전달을 필요로 하는 동물 또는 사람에게 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 전달하기 위한 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템로서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자치료제를 함유하는 칼슘 인-실리케이트 쉘 나노입자를 포함하며, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물이 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 유전자 치료제가 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라스미드, 안티센스 또는 Si-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  54. 제 53항에 있어서, 흡수성 나노입자의 직경이 약 20nm 이하임을 특징으로 하는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  55. 제 54항에 있어서, 세라미드 및 이의 유도체가 SN-2 위치에서 2 내지 10개 탄소의 단쇄 지방산 또는 SN-2 위치에서 12 내지 24개 탄소의 장쇄 지방산으로 구성됨을 특징으로 하는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  56. 제 55항에 있어서, 분산제가 나노입자의 응집을 방지하도록 칼슘 인-실리케이트 쉘에 결합되며, 아미노프로필트리클로로실란; 3-아미노프로필트리메톡시실란(APS); 3-아미노프로필실세스퀴옥산); 3-글리시드옥시프로필-트리메톡시실란 (GPS); 트리메톡시실릴-프로필디에틸렌트리아민 (DETA); 3-트리메톡시실리프로필숙신산 무수물; 및 알킬카르복실산 실란 결합제, 예컨대, 아미드-결합된 카르복실기로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  57. 제 56항에 있어서, 바인더, 예컨대, 항체에 대한 결합 지점을 제공하도록 카르보디이미드-매개된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 결합제를 분산제에 첨가함을 특징으로 하는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  58. 제 57항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 기능장애 세포 성장을 포함하는 병을 치료하도록 전신 전달됨을 특징으로 하는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  59. 제 58항에 있어서, 병이 암, 종양, 동맥 염증 질환, 죽상경화증, 재협착 또는 취약 플라크(vulnerable plaque), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 흡수성 나노입자 어셈블리 시스템.
  60. 조성물의 투여를 필요로 하는 동물 또는 사람에게 제 59항의 흡수성 어셈블리 시스템를 투여함을 포함하여 조성물을 투여하는 방법으로서, 조성물 중에 함유된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제의 농도가 약 1000mg ml-1 이하임을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제가 조성물의 약 40중량%임을 특징으로 하는 방법.
  62. 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제의 전달을 필요로 하는 동물 또는 사람에게, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 전달하기 위한 덴드리머 어셈블리 시스템로서, 덴드리머가 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 단편 또는 이의 유도체, 폴리(라이신) 단편 또는 이의 유도체, 및 폴리(락트산) 단편 또는 이의 유도체이고, 성장 억제 지질 유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제로 로딩되는 덴드리머 어셈블리 시스템.
  63. 제 62항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물이 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 유전자 치료제가 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라스미드, 안티센스 또는 Si-RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 덴드리머 어셈블리 시스템.
  64. 제 63항에 있어서, 세라미드 및/또는 이의 유도체가 SN-2 위치에서 2 내지 10개 탄소의 단쇄 지방산 또는 SN-2 위치에서 12 내지 24개 탄소의 장쇄 지방산으로 구성됨을 특징으로 하는 덴드리머 어셈블리 시스템.
  65. 제 64항에 있어서, 폴리(라이신) 단편 또는 이의 유도체가 폴리(L-라이신) 또는 이의 유도체이며, 폴리(락트산) 단편 또는 이의 유도체가 폴리(D,L-락트산) 단편 또는 이의 유도체임을 특징으로 하는 덴드리머 어셈블리 시스템.
  66. 제 65항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제가 기능장애 세포 성장을 포함하는 병을 치료하도록 전신 전달됨을 특징으로 하는 덴드리머 어셈블리 시스템.
  67. 제 66항에 있어서, 병이 암, 종양, 동맥 염증 질환, 죽상경화증, 재협착 또는 취약 플라크(vulnerable plaque), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 덴드리머 어셈블리 시스템.
  68. 조성물의 투여를 필요로 하는 동물 또는 사람에게 제 67항의 덴드리머 어셈블리 시스템를 투여함을 포함하여 조성물을 투여하는 방법으로서, 조성물 중에 함유된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제의 농도가 약 1000mg ml-1 이하임을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제가 조성물의 약 40중량%임을 특징으로 하는 방법.
  70. 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제의 전달을 필요로 하는 동물 또는 사람에게 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 전달하기 위한 히드로겔 어셈블리 시스템로서, 히드로겔이 바이오-스마트 단편 및 생분해성 단편으로 구성되며, 생분해성 단편이 덱스트란, 폴리아세트산, 또는 이의 유도체를 포함하며, 또한, 생분해성 단편이 성장 억제 지질 유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화학치료제 및/또는 유전자 치료제를 함유하는 히드로겔 어셈블리 시스템.
  71. 제 70항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물이 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 유전자 치료제가 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라스미드, 안티센스 또는 Si-RNA로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 히드로겔 어셈블리 시스템.
  72. 제 71항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물이 세라미드 및/또는 이의 유도체, 디메틸 스핑고신, 트리메틸 스핑고신, 에테르-결합된 디글리세라이드, 에테르-결합된 포스파티드산, 스핑고신 및 스핑가닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 유전자 치료제가 올리고누클레오티드, 리보자임, DNA-자임, 플라스미드, 안티센스 또는 Si-RNA로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 히드로겔 어셈블리 시스템.
  73. 제 72항에 있어서, 세라미드 및/또는 이의 유도체가 SN-2 위치에서 2 내지 10개 탄소의 단쇄 지방산 또는 SN-2 위치에서 12 내지 24개 탄소의 장쇄 지방산으로 구성됨을 특징으로 하는 히드로겔 어셈블리 시스템.
  74. 제 73항에 있어서, 성장 억제 지질-유도된 생활성 화합물 및/또는 소수성 화 학치료제 및/또는 유전자 치료제가 기능장애 세포 성장을 포함하는 병을 치료하도록 전신 전달됨을 특징으로 하는 히드로겔 어셈블리 시스템.
  75. 제 74항에 있어서, 병이 암, 종양, 동맥 염증 질환, 죽상경화증, 재협착 또는 취약 플라크(vulnerable plaque), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 히드로겔 어셈블리 시스템.
  76. 조성물의 투여를 필요로 하는 동물 또는 사람에게 제 75항의 히드로겔 어셈블리 시스템를 투여함을 포함하여 조성물을 투여하는 방법으로서, 조성물 중에 함유된 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제의 농도가 약 1000mg ml-1 이하임을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 76항에 있어서, 성장-억제 지질-유도된 생활성 화합물 또는 유전자 치료제가 조성물의 약 40중량%임을 특징으로 하는 방법.
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