CN1812766A - 用于全身传递使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物的方法和*** - Google Patents

用于全身传递使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物的方法和*** Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于优化将能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性药物或基因治疗剂全身地传递给需要这种物质的动物或人的***和方法，其使用纳米级装配***如脂质体、可再吸收的和非聚集的纳米颗粒分散体、金属或半导体纳米颗粒、或聚合材料如树枝状聚合物或水凝胶，其分别具有更高的脂溶性、细胞透性、增长的循环半衰期，并具有更高的肿瘤或血管靶向性的药物动力学特征。

Description

用于全身传递使生长停滞的、 衍生于脂质的生物活性化合物的方法和***
技术领域
本发明涉及纳米技术领域。更具体地，本发明提供用于向需要此治疗的个体全身传递治疗性生物活性脂质化合物和/或疏水性化疗剂和/或核苷酸/基因物质的纳米级装配***。
背景技术
Richard Keynman在他的1959年的演讲“There′s Plenty of Room at theBottom”中提出了活细胞的复杂性和微小性，并挑战科学界来“制作非常小的、能实现我们的意图的东西”，由此开始，纳米技术已经错综复杂地与生命科学相关联(通常称作纳米生物技术)(Feynman，R.P.，1959，可从http：//www.zyvex.com/nanotech/feynman.Html得到)。尽管商业纳米生物技术仍然处于萌芽状态，但由于其具有独特的优点，即这些***能用于药物传递和治疗，因此纳米级装配***发展的速度在近十年来已经指数地增加。一些纳米级装配***的实例包括脂质体、聚合结构例如树枝状聚合物(dendrimer)和水凝胶，和称作量子点(quantum dot)的金属或半导体纳米颗粒。
许多有效的试剂可用于将转录活性的DNA、甚至功能肽和蛋白导入活细胞中。但是，通常无法将生物活性的脂质传递进入活细胞中。生物活性的鞘脂质和磷脂代谢物、类似物、模拟物(mimetic)或衍生物的传递以及它们向细胞中的***受到其理化性质的阻碍，该性质使这些脂质疏水且不可透过细胞。
神经酰胺是起衍生于脂质的第二信使的作用的鞘脂，其调控细胞分化、细胞周期停滞和/或细胞凋亡的诱导，它是外源性施用遇到问题的生物活性脂质的一个实例。许多刺激会引起胞内的神经酰胺累积，例如生长因子缺乏、细胞因子、化疗和其它细胞毒性剂、电离辐射、热激、和各种环境因子。已经发现这些刺激会启动神经酰胺介导的信号级联放大，包括抑制Akt促进存活的(pro-survival)途径和刺激半胱天冬酶活性，最终导致DNA断裂和细胞死亡。因而，基于神经酰胺对细胞生长、分化和死亡的有效调节，以及其为靶向于与增殖和/或存活有关的离散的激酶和信号途径的天然分子的事实，已经将神经酰胺视作癌症和心血管疾病的治疗剂。
Charles等以前已经证实，可透过细胞的神经酰胺类似物C6自药物-洗脱平台(drug-eluting platform)的局部传递可应用于临床(Circ.Res.2000Aug.18：87(4)：282-8)。更具体而言，曾证实被神经酰胺包裹的气囊导管会在拉伤的血管平滑肌细胞中诱导细胞周期停滞。尽管C6-神经酰胺自包裹的和膨胀的气囊中的传递允许直接传递于脉管***，但对于全身施用例如癌症化疗或靶向于扩散的动脉粥样硬化病变和易损斑块而言，神经酰胺的传递仍然有几个障碍。更具体而言，尽管使用短链的、更能透过细胞的衍生物，但神经酰胺的全身传递仍然存在3个重大的障碍。
首先，短链的、可透过细胞的神经酰胺类似物例如C2、C6和C8-神经酰胺仍然是脂质，因而其性质极为疏水，当在DMSO或乙醇载体中加入细胞介质中时，会沉淀成细小的脂质胶束悬浮液。其次，尽管短链的神经酰胺类似物比长链的生理神经酰胺(C18-C24-神经酰胺)更能透过细胞，但它们的鞘氨基醇(sphingoid)主链限制它们***质膜中。最后，循环的和胞内的神经酰胺酶的存在促进生物活性神经酰胺转化为促进凋亡(pro-apoptotic)效力更低的代谢物。
为了增强神经酰胺向细胞内的传递，已经研究了有机溶剂***。已经提出，在培养基中不溶的十二烷/乙醇溶剂***与神经酰胺一起沉淀出来，并形成非常小的能与质膜融合的液滴或胶束。这种沉淀溶剂的使用可能受到粒径的变异性和接近细胞膜的限制。蛋白佐剂，例如牛血清清蛋白，也可以通过非特异性的脂质/蛋白相互作用而在体外有助于神经酰胺传递，但是不能有效地将足够量的C6-神经酰胺传递至全身靶标。
因而，为了实现生物活性脂质或基因治疗剂的治疗益处，需要将这种疏水的或带电荷的化疗化合物传递进入需要这种治疗的动物或人的活细胞中的改进的全身传递***。
发明内容
本发明提供使用纳米级装配***优化能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性药物和/或化疗疏水剂和/或基因治疗剂向有此需要的动物或人中全身传递的***和方法，从而满足了该迫切的需要。
本发明提供最大化能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性治疗化合物和/或基因治疗剂向需要这种治疗的动物或人的活细胞中全身传递的方法和***，其使用纳米级装配***，例如脂质体、可再吸收的和非聚集的分散的纳米颗粒、金属或半导体纳米颗粒或聚合材料例如树枝状聚合物或水凝胶，其分别具有更高的脂溶性、细胞透性、更长的循环半衰期，以及具有更高的肿瘤或脉管靶向性的药物动力学特征。
在本发明的一个实施方案中，配制在本文中称作“PEG化的”脂质体的适用于传递生物活性脂质、蛋白和治疗剂的聚乙二醇450脂质体，其具有一个或多个膜，这些膜包含能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或基因治疗剂和/或胆固醇。这些PEG化的脂质体被配制成含有大小为750-5000MW的PEG C8(PEG化的可透过细胞的神经酰胺)和/或大小为2000-5000MW的PEG DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)。本实施方案使用PEG C8来稳定脂质双层，使脂质体含有高摩尔比(即，30％)的游离的生物活性C6神经酰胺。另外，本实施方案使用PEG C8作为含有生物活性神经酰胺和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂的脂质体的必备(integral)成分。而且，由PEG-C8配制的脂质体确保游离神经酰胺向富含小窝蛋白的脂筏中的最佳***和定位，这是膜内在化并向包括线粒体的亚细胞器转移以随后诱导靶组织或肿瘤的细胞凋亡或程序性细胞死亡的先决条件。PEG化的脂质体也称作“潜行”(stealth)脂质体，其能逃避不被网状内皮组织***(RES)从循环中清除，从而具有更高的循环半衰期和组织靶向性。通过与能促进向身体的特定细胞或组织中的靶向累积的特定靶向体(targeting moiety)如抗体和/或受体配体的结合，可以进一步实现靶向性。其它的实施方案指出，脂质治疗剂也可以在有或没有PEG-C8存在的情况下配制成包含阳离子脂质的“阳离子”脂质体，以有效地传递带负电荷的寡核苷酸；或在有或没有PEG-C8存在的情况下配制成“融合”(fusogenic)脂质体，其中脂质体的整个膜与靶位点的细胞膜融合，以将脂质体的成分和内容物传递到那里。
在本发明的另一个实施方案中，提供了具有磷硅酸钙(calciumphosphor-silicate，CPS)外壳的可再吸收的纳米颗粒，其中将能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物、和/或化疗疏水剂，和/或基因治疗剂载至可再吸收的纳米颗粒中。本发明的可再吸收的纳米颗粒可以将一般不能通过循环转运的化疗疏水性脂质或药物或基因治疗剂全身地向活细胞传递。合成可再吸收的纳米颗粒的关键特征是，纳米颗粒在水性液体介质中的适当分散(无聚集)。实现分散的一种方法是使用为用于具有含硅酸盐外壳的纳米颗粒特别改进的尺寸排阻高效液相色谱(SEC)。实现纳米颗粒的分散的另一种方法是使有机、无机或金属-有机分散剂结合到外部的CPS壳上。另外，可以使碳二亚胺-介导的(carbodiimide-mediated)聚乙二醇(PEG)偶联剂结合到烷基胺硅烷或烷基羧酸偶联剂上，以进一步确保纳米颗粒在体内的“分散的”非聚集状态，并提供靶向体在PEG偶联剂上的结合点，从而使纳米颗粒能靶向特定的位点，以实现胞内的药物传递。
在本发明的另一个实施方案中，可以组合各聚合物以形成“生物智能的”即对物理的或化学的刺激有反应、以及体内可生物降解的物质，并且其可以载有能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或基因治疗剂。
附图说明
图1.制备用于药物传递的具有可再吸收的包衣的心-壳颗粒(core-shell particle)的示意图。
图2A-B.脂质体制剂的表征。生产的脂质体制剂具有球形形态和均匀的大小分布。(A)PEG化的脂质体囊[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)]的代表性的TEM。使用常规的脂质体制剂[EPC/DOPE/CH/C6(6∶0.5∶1.5∶2)]观察到同样的显微照片(未显示数据)。囊的大小是直径为85-140nm；横条代表100nm。脂质溶液的挤出不会显著减少C6混入脂质体囊中。(B)脂质体制剂平均大小的图示。
图2C-D脂质体制剂的表征。(C)将由EPC/DOPE/CH/C6(6∶0.5∶1.5∶2)和痕量的[3H]C6组成、终浓度为10mg/ml的胶束制剂挤出，以生成所述的常规脂质体。平均值±标准误差，n＝3独立实验。在挤出脂质胶束溶液生成脂质体囊后，脂质组成保持一致。(D)使用CHCL3/MeOH/ddH2O(60∶25∶5)溶剂***所分离的常规脂质体制剂[EPC/DOPE/CH/C6(3.5∶3∶2∶1.5)和EPC/DOPE/CH/DHC6(3.5∶3∶2∶1.5)]的代表性的TLC。如所预期的，C6、而不是DHC6被染上碘，因为C6缺少DHC6的C4-5双键。
图3A.C6传递的体外药物动力学。C6的脂质体传递导致与非脂质体传递相比C6随时间的细胞累积更高。(A)用痕量的[3H]C6制备脂质体，以测定神经酰胺向MDA细胞传递的动力学。将添加给细胞的脂质体和非脂质体C6的总量设定为100％。在20μM，C6累积在约16小时时达峰。平均值±标准误差，n＝3独立实验。*，脂质体C6累积与非脂质体C6累积相比，p＜0.05。
图3B-C.C6传递的体外药物动力学。说明是脂质体C6、而不是胆甾(cholesteryl)-1，2-3H(N)十六烷基醚(3H-CHE)随着时间(B)和剂量(C)向MDA细胞膜中分配。用痕量的[3H C6]和[3H CHE]配制PEG化的脂质体[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)]，以评价神经酰胺(10uM)在指定的时期向MDA细胞传递的机制。在10小时的处理期间，研究了神经酰胺传递的剂量-依赖性机制。将传递给细胞的脂质的量计算为pmol/106细胞。平均值±标准误差，n＝3独立实验。*，各制剂中的C6累积和CHE累积相比，p＜0.05。
图4A-B.胸苷掺入生长实验(thymidine incorporation growth assay)证明，在***受体-阴性的MDA乳腺癌细胞中，脂质体C6传递比非脂质体C6更有效。(A)常规脂质体；(B)阳离子脂质体。
图4C.胸苷掺入生长实验证实，在***受体-阴性的MDA乳腺癌细胞中，PEG化的脂质体C6传递比非脂质体C6更有效。
图5.PEG化的脂质体C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-Cer(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0)]传递增强C6的抗增殖活性。脂质体传递降低C6在410.4腺癌细胞中的IC50。混入PEG-C8至0.75允许混入30mol％的C6。结果代表着3次独立实验的平均值±标准误差。*p＜0.05。
图6.作为细胞凋亡的测量，脂质体C6传递增强MDA细胞中的半胱天冬酶-3/7活性。
图7A.脂质体C6传递增强胞内的C6的促凋亡活性。断裂的3′-OHDNA的TUNEL染色证实，C6处理(20μM)诱导MDA细胞的凋亡。在温育约16小时时，观察到发生细胞凋亡。非脂质体(20uM)C6和常规的脂质体C6[EPC/DOPE/CH/C6(6∶0.5∶1.5∶2)](20μM)以与DNA酶(DNase)阳性对照类似的方式诱导DNA断裂。通过膜联蛋白V染色测定，脂质体C6传递导致细胞凋亡的大量诱导。
图7B.用非脂质体C6(25μM)、PEG化的脂质体C6[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)](25μM)、或Ghost脂质体处理MDA细胞24小时，用FITC-膜联蛋白V染色，并通过流式细胞仪分析。平均值±标准误差，n＝3独立实验。*，p＜0.05；#p＜0.005，与未处理的对照组相比。
图8A-B.脂质体C6传递调控与生长抑制和/或细胞凋亡有关的信号级联放大。脂质体C6传递抑制MDA细胞中的Akt磷酸化。(A和B)用非脂质体C6(50μM)、PEG化的脂质体C6[DOPC/DOPE/CH/PEG-C8/C6(4∶3∶1∶1∶1)](50μM)、或Ghost脂质体预处理细胞8小时，然后用20ng/mlIGF-1另外刺激15分钟。用探针检测蛋白裂解产物中的Akt的天然的和活性的(磷酸化的)形式。(A)n＝3独立实验的代表性的印迹。(B)，平均值±标准误差，n＝3独立实验。*，p＜0.05，与未处理的IGF-刺激的对照相比。
图9A-B.脂质体C6传递导致C6向小窝(caveola)和线粒体结构内的累积。(A)从脂质体囊向细胞传递的NBD-C6的共焦显微图像证实，C6也累积在细胞线粒体中。NBD-C6共同定位(colocalize)在线粒体中。(B)使用[3H]-C6作为总C6的标记物，PEG化的脂质体传递导致神经酰胺在小窝脂质信号筏(signaling raft)中的时间依赖性累积。神经酰胺累积于蔗糖梯度的级分#4-5中，它代表富含小窝蛋白-1的脂筏(小窝)。
图10A-B.PEG化的脂质体C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-Cer(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0)]对肿瘤体积的影响。(A)在用12、24和36mg/kg脂质体C6和空脂质体载体处理过程期间和之后，检测接种了410.4腺癌细胞的动物的肿瘤体积。结果代表每组5只动物的平均值±标准误差。(B)于以40mg/kg处理1周的肿瘤的肿瘤冷冻切片染色证实细胞凋亡的TUNEL染色呈阳性。对于Ghost和未处理的肿瘤切片，明显的染色很少。代表性的载玻片来自每组3只动物和每个肿瘤切片的10个随机视域。
图11A-B.PEG化的脂质体C6在携带410.4肿瘤的Balb/C小鼠中的药物动力学。(A)10和40mg/kg剂量的脂质体-C6似乎遵守一级动力学，在24小时处维持与体外IC50相关联的足够的血浆浓度。(B)在这些剂量下，在约30分钟时，C6在肿瘤组织中达到稳态浓度。40mg/kg的剂量将浓度维持在理想的IC50以上达24小时。
图12.由具有热反应性和可生物降解性质的PLL、PLLA和NIPAAM聚合物组成的专有的树枝状结构。
图13A-B.树枝状聚合物的热反应性的和药物释放性质。A)使用Uv可见光谱研究合成的树枝状聚合物在0.5和0.1mg/ml时的透光率。在约34℃时观察到溶液浊度的急剧转变，代表着树枝状聚合物的LCST。B)载有C6的树枝状聚合物表现出确定的释放动力学和体外生物功效。在37℃和25℃下于含有0.5％(w/v)SDS的蒸馏水中C6从载有C6的树枝状聚合物中随时间的释放比率。在高于树枝状聚合物的LCST的温度37℃，树枝状聚合物更为疏水，从而导致C6从载有C6的树枝状聚合物中的释放曲线更加缓慢。树枝状聚合物的浓度是122μg/ml。
图14A-C.在树枝状聚合物的LCST以下(25℃)和LCST以上(37℃)的温度下，MDA细胞吸收浓度为100μg/ml的树枝状聚合物1小时。A&B)用绿FITC标记树枝状聚合物，用蓝DAPI对MDA细胞核染色。共焦显微术证实，在LCST以上的温度(37℃)树枝状聚合物优先累积在MDA细胞中。左上，蓝DAPI-染色的核；右下，绿FITC-树枝状聚合物；左下，相衬(phase/contrast)；右下，重叠。C)流式细胞仪分析证实，在树枝状聚合物LCST以上的温度(37℃)下，比在LCST以下(25℃)的温度显著地更多的树枝状聚合物内在化到MDA细胞中，*p≤0.005。
图15A-B.载有C6-神经酰胺的树枝状聚合物在体外表现出抗癌作用。A)在有5％FBS存在时，载有C6的树枝状聚合物允许向MDA细胞传递神经酰胺，导致即使不是更好也是与施用在DMSO中的游离C6类似的C6-诱导的细胞毒性。B)载有C6的树枝状聚合物导致比施用在DMSO中的游离C6显著更高的C6-诱导的细胞凋亡。*p≤0.05。
图16.NIPAAM-共-PLLA-共-葡聚糖水凝胶的结构，其中R是-CONHCH2CH＝CH2或H，且m和n是从约1至数千的整数。NIPAAM链段也可以具有从约10至数千的单元。
具体实施方式
本发明提供最大化地以及靶向地将能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性治疗化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂全身传递给需要这种治疗的动物或人的活细胞的方法和***，其使用纳米级装配***，例如脂质体、可再吸收的和非聚集的纳米颗粒、金属或半导体纳米颗粒或聚合材料例如树枝状聚合物或水凝胶，其分别都表现出更高的脂溶性、细胞透性、更长的循环半衰期和具有提高的肿瘤或血管靶向性的药物动力学特征。
如本文所使用的，“使生长停滞的”指活细胞不再对从临近组织释放出的生长因子或细胞因子发生反应。而且，“生长停滞的”指不再复制其DNA并增殖的细胞。
如本文所使用的，促进凋亡指经历程序化细胞死亡过程的活细胞或组织。
如本文所使用的，短语“衍生于脂质的”指为在生物膜中存在的天然脂质的代谢物的物质。
如本文所使用的，术语“生物活性的”指能转导信息和启动从细胞的质膜向核中的信号级联放大的活性剂，其中特定的基因被活化或失活，导致细胞表型发生变化(即，生长停滞和/或细胞凋亡)。
如本文所使用的，术语“纳米级”和“纳米大小”指细分的特定状态，暗示着颗粒具有小于约300nm的平均尺寸，且表现出体相通常不具备的性质，例如，量子光学效应。
如本文所使用的，短语“疏水性化疗剂”指用作药物来减少细胞增殖和/或诱导细胞凋亡、且相对难溶于水性环境中的小分子、肽、蛋白、肽模拟物和脂质模拟物。
如本文所使用的，术语“纳米复合颗粒”和“纳米颗粒”是可互换的。
如本文所使用的，术语“聚集(agglomeration)”指通过物理(范德华或疏水的)力或静电力在悬浮液中形成聚集体(aggregate)(由微粒亚单位组成的附着体)。得到的结构称作“聚集物(agglomerate)”。
如本文所使用的，非聚集的是“分散的”生物颗粒的状态。
更具体地，本发明提供将化疗的疏水性化合物全身地、长期地(chronic)或靶向地传递给需要这种治疗的动物或人的***和方法，其包括纳米级装配***和能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂。纳米级装配***可以包含但不限于脂质体、可以被磷硅酸钙(CPS)外壳包封的可再吸收的纳米颗粒、或能够制成生物反应性的(生物智能的)和可生物降解的聚合材料例如树枝状聚合物或水凝胶。
通过静脉内的、导管传递、输液泵、微球或药膏全身地传递能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂，以用于治疗涉及功能障碍性生长(dysfunctional growth)例如癌症、肿瘤、动脉炎症、动脉粥样硬化、再狭窄、易损斑块或糖尿病的病理。
能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物的实例包括但不限于生理性神经酰胺和/或衍生物、在SN-2位具有由2-10个碳单元组成的短链脂肪酸并可透过细胞的神经酰胺和/或衍生物、二甲基鞘氨醇(sphingosine)、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇或二氢鞘氨醇(sphinganine)。基因治疗剂的实例包括但不限于寡核苷酸、核酶、DNA-酶、质粒、反义或常规的Si-RNA或病毒(AAV，AV或lenti)表达的SiRNA。
在本发明的一个实施方案中，在这里将称作“PEG化的”脂质体的适用于传递疏水性生物活性脂质、蛋白和治疗剂的PEG-750-C8和/或PEG-DSPE(2000-5000MW)脂质体配制成具有一个或多个包含能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂和/或胆固醇的膜。用PEG-750-C8和PEG-DSPE(2000-5000)“PEG化的”脂质体也称作“潜行”脂质体，其可以制成能逃避不被网状内皮组织***(RES)从循环中清除，且其可以具有与其结合的结合物如抗体或受体配体以靶向身体的特定细胞或组织。与其它的胶粒一样，脂质体通常被RES、主要被肝的Kupfer细胞和脾的固定巨嗜细胞迅速从循环中清除。据信，RES摄入脂质体的速度与脂质体的调理作用或去调理作用(dysopsonization)的过程有关。因此，脂质体治疗功效依赖于逃避被RES识别并从而在循环中保留更长时间的能力。因此，术语“潜行”脂质体指该逃避性质，且用于指其膜含有双层相容物(biolayer-compatible species)例如聚乙二醇(PEG)-连接的脂质的脂质体。因而，“潜行”或PEG化的脂质体具有通过逃避RES来提高能释放药物的脂质体的亲水性和生物利用度的潜力，并且许多年来已经知道脂质体PEG化的制备方法，如Blume，G等(Biochim.Biophys.Acta，1029：91-97，1990)所报道。而且，通过将特定的靶向体例如抗体和/或受体配体结合到PEG上，可促进向身体的特定细胞或组织中的靶向累积，从而能够进一步实现靶向性。或者，该实施方案可以含有用于有效地传递带负电荷的寡核苷酸的阳离子脂质，例如二油酰基-1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷。另外，可以配制“融合”脂质体，其中脂质体的整个膜与靶位点的细胞膜融合，以将脂质体的成分和内容物传递于其中。融合脂质是不稳定的脂质，其在水溶液中形成六角形的构象，从而产生能通过内吞过程或“融合”过程结合到细胞膜上的反胶束(inversemicelle)。
因此，本发明的脂质体载体通过阻止生物活性脂质从溶液中沉淀出来，而使其能更有效地被传递到细胞中，从而改进了与全身传递衍生于脂质的生物活性化合物例如C6-神经酰胺有关的主要问题。而且，本实施方案使用PEG-C8来稳定脂质双层，使脂质体含有浓度高达至少40mol％的游离的生物活性的C6神经酰胺。另外，本实施方案使用PEG-C8作为含有生物活性神经酰胺和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂的脂质体的必备成分。而且，PEG-C8配制的脂质体能确保游离的神经酰胺向富含小窝蛋白的脂筏中的最佳***和定位，这是膜内在化以及向亚细胞器(例如线粒体)转移以随后诱导靶组织或肿瘤的细胞凋亡或程序化细胞死亡的先决条件。
而且，本发明的脂质体可以用于局部地和和全身地传递治疗性神经酰胺类似物。例如，已证实在牵张损伤后的兔中，从栓子清除术导管的涂覆有神经酰胺的气囊局部地和直接地传递C6-神经酰胺会限制新内膜增生(再狭窄)(Charles等，Circ.Res.2000Aug.18：87(4)：282-8)。其它人员已经证实，池内和静脉内传递的在DMSO载体中的可透过细胞的神经酰胺类似物在局灶性脑缺血后的大鼠中诱导神经保护作用。在脂质体囊中包裹传递C6-神经酰胺和其它治疗剂的临床潜力巨大。研究已经证实，神经酰胺可以与化疗剂例如紫杉醇和芬维A胺协同作用。因而，在C6-配制的脂质体中组合传递化疗剂可以进一步增强凋亡作用，并通过有效地降低在脂质体制剂中使用的每种试剂的浓度，从而同时减少副作用。而且，与肿瘤特异性抗体或受体配体结合的靶向免疫脂质体也可有利地混入C6-神经酰胺。
很大程度上尚不清楚神经酰胺参与细胞凋亡程序的机制，尽管神经酰胺累积似乎与许多凋亡标志有关，例如聚(A)DP核糖聚合酶(PARP)切割、DNA断裂、磷脂酰丝氨酸暴露和锥虫蓝摄入(Kolesnick，R.N.等，Annu.Rev.Physiol.，60：643-665，1998)。而且，内源性的神经酰胺在线粒体膜内累积，且部分地诱导细胞色素C释放从而导致线粒体功能障碍和最终的细胞凋亡。神经酰胺可以通过细胞内的不同的代谢途径生成。例如，已经证实，存在由对细胞的不同处理例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、抗Fas、血清抽取、和其它物质引起的、应激诱导的鞘磷脂酶催化的鞘磷脂向神经酰胺的代谢转换。另外，神经酰胺能够通过从头合成途径生成，其中丝氨酸棕榈酰转移酶和/或神经酰胺合酶的活化起关键作用(Garzotto，M.等，Cancer Res.，58：2260-2264，1998)。外源地添加的神经酰胺通常能以立体特异性的方式模拟应激诱导的细胞凋亡，且已经证实，在有些情况下，抑制神经酰胺的形成会抑制细胞凋亡的发展(Wiesner，D.A.等，J.Biol.Chem.，272：9868-9876，1997)。外源的神经酰胺在富含小窝蛋白的质膜脂筏内的***和累积可以促进这些域向包含线粒体的亚细胞器中的内在化。
细胞凋亡涉及细胞的协调的死亡(orchestrated death)，且已经证实，这是生物体在增殖的组织和***如免疫***或在发炎的调节障碍的细胞或组织中维持体内平衡的重要方式，如经常在癌症、再狭窄或动脉粥样硬化中观察到的(Frasca，L.，等，Crit.Rev.Immunol.，18：569-594，1998)。实际上，细胞凋亡控制的丧失是癌形成的标志。已经证实，神经酰胺类似物在体外诱导肿瘤细胞中发生细胞的凋亡。但是，迄今为止，由于全身传递时有限的溶解度，还没有研究证实神经酰胺的体内凋亡和化疗作用。术语细胞凋亡经常与程序性细胞死亡可互换地使用。其由于缺少有关的炎性反应，从而与坏死导致的死亡相区别。细胞凋亡的特征在于发生了一个或多个细胞事件，包括线粒体完整性的丧失、核浓缩、膜起泡、染色质断裂或膜完整性的丧失，导致磷脂酰丝氨酸暴露和锥虫蓝摄入(Wyllie，A.H.，J.Cell Biol.，73：189-197，1997)。很大程度上尚不清楚分别调节这些细胞特征的生化机制。但是据信，称作半胱天冬酶的半胱氨酸蛋白酶家族的活化在细胞凋亡过程的发展中起重要作用(Thornberry，N.A.等，Science，281：1312-1316，1998)。在该半胱天冬酶家族中，通过凋亡刺激活化启动型半胱天冬酶(initiator caspase)，并随后活化下游的执行型半胱天冬酶(effector caspase)。这些执行型半胱天冬酶又具有大量的胞内底物，其中包括对于细胞动态平衡必需的成分。剪切这些底物中的一种或多种会使细胞功能失调，并促进细胞凋亡程序的特定的形态特征(Thomberry，N.A.等，Science，281：1312-1316，1998)。本发明的一个重要实施方案是PEG-C8稳定化脂质体、使高达约40摩尔％的游离的生物活性神经酰胺可以用于膜***和内在化并随后诱导细胞凋亡的机制。因而，化合物例如C6-神经酰胺对凋亡过程的调控可以提供有价值的治疗方法。
在本发明的另一个实施方案中，将能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或基因治疗剂载于用于药物和基因治疗的、具有磷硅酸钙(CPS)外壳和药心(drug core)可再吸收的纳米颗粒中。本发明的可再吸收的纳米颗粒可以将通常不能通过循环转运的疏水性脂质或蛋白药物或基因治疗剂全身地传递给活细胞。可再吸收的纳米颗粒可以具有1-300nm的直径，优选地小于50nm，最优选地为20nm或更小。具有约20nm或更小的直径的纳米颗粒能透过血脑屏障(BBB)，从而能将药物直接传递进入中枢神经***；这是治疗致癌的脑或神经病变的重大的优点。这些纳米***也适用于实体瘤，不限于腺癌、黑素瘤、***癌、结肠癌、肺癌(气雾剂传递)和乳腺癌，以及非实体瘤例如白血病。药心可以作为固体或在水溶液中传递。制备心-壳颗粒的示意图如图1所示。
更具体而言，合成可再吸收的纳米颗粒的方法包含能与水和疏水性非水溶剂例如环己烷或异辛醇结合以形成反胶束结构的将非离子型表面活性剂如聚(氧乙烯)壬基苯基醚(IGEPALTM 520CO)，或任何其它的含有极性头部基团和非极性尾部的两性化合物与水和疏水的非水性溶剂例如环己烷或异辛醇混合，以形成反胶束结构。能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的化合物或基因治疗剂可以悬浮到水相中，形成水和药物或水和基因治疗剂的溶液、悬浮液或胶束混合物。所得到的在其核心含有活性物质的反胶束包有无机的可再吸收的、在生理的、即等渗的环境中生物降解的包衣。CPS是可再吸收的包衣的实例，其具有下述组成：Cax(PO4)yzSiO2，其中0.1≤x≤10 0.1，0.1≤y≤10，并且0≤z≤10。可以调节该组成以提供外壳在生理环境中的不同再吸收速度，更高的硅和更低的钙和磷酸根浓度导致更慢的再吸收速度。
合成可再吸收的纳米颗粒的一个关键特征是纳米颗粒在液体介质中的适当分散。合适的液体可包含但不限于去离子水、盐水溶液、水-乙醇混合物或适用于生理环境和/或任何其它处理步骤如制粒工艺，例如在制成经口传递的片剂之前的喷雾干燥的其它液体-悬浮介质。这是如下完成的：首先洗涤纳米颗粒以去除过量的两性化合物和任何其它的离子或添加剂，从而确保能实现纳米颗粒的最佳分散。另外，在洗涤过程中必须浓缩悬浮液以生成足够高浓度的悬浮液，从而以足够的剂量传递药物或基因治疗剂。这是使用为用于含硅酸盐外壳的纳米颗粒而特别改进的尺寸排阻高效液相色谱(SEC)实现的。这种改进是防止接触的纳米颗粒之间形成固体桥从而导致永久性聚集所必需的。根据本发明的方法生产的初级纳米颗粒(primary nanoparticle)的大小范围是约1.0-300nm。该方法能防止纳米颗粒的聚集，如通过粒径分布测量技术如准弹性光散射或测定离心或沉降的光密度所测量的，颗粒的聚集可以大大超过1微米。因而，由于在洗涤和回收步骤过程中的聚集，没有经过如本文所述的处理的纳米微粒悬浮液会导致比初级尺寸的纳米颗粒的情况明显改变的流动单元(flow unit)。
SEC收集和纳米颗粒的洗涤步骤中的关键改进包括，使用装有直径约20微米的微孔硅颗粒的更短的洗脱柱，以及进行化学修饰。化学修饰包括但不限于在合成纳米颗粒后向反胶束悬浮液中添加乙醇或任何其它合适的醇，以生成均质的纳米颗粒悬浮液。用醇代替典型地使用的水或丙酮防止形成具有比初级纳米颗粒粒径更大的流动单元的纳米颗粒聚集块(agglomerated mass)。另一种至关重要的化学修饰是与能作用于纳米颗粒的表面以提供能防止纳米颗粒永久聚集的电位层(electrosteric layer)的有机或无机分散剂结合。合适的有机分散剂包括但不限于柠檬酸、酒石酸或醋酸。合适的金属有机分散剂包括但不限于烷基胺硅烷偶联剂如氨基丙基三氯硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)、3-氨基丙基硅倍半氧烷)、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)、三甲氧基甲硅烷基-丙基二亚乙基三胺(DETA)、3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酐、以及烷基羧酸硅烷偶联剂如酰胺连接的羧基。合适的离子分散剂包括但不限于过量的钙、磷酸盐或焦磷酸盐。
而且，必需用相同的分散剂处理用于填充SEC柱的微孔硅颗粒的表面，以生成阻止纳米颗粒在通过柱子的过程中粘附到微孔硅表面上的电位屏障。在SEC纳米颗粒浓缩和洗涤步骤中，还必须控制pH水平。因而，为了将pH水平维持在约6和8之间而根据需要加入酸，例如但不限于硝酸、醋酸或盐酸；或碱，例如但不限于氢氧化钠或氢氧化钾。当pH大于8时，纳米颗粒的表面上的电荷太低而形成聚集。当pH小于6时，酸或碱的浓度太高，得到的离子强度在洗涤步骤中造成聚集。神经酰胺和其它衍生于脂质的生物活性介体能抵抗所有这些酸性或碱性过程。
另外，可以将碳二亚胺介导的聚乙二醇(PEG)偶联剂结合到烷基胺硅烷或烷基羧酸偶联剂上，以进一步确保纳米颗粒在体内的分散状态，并为结合剂例如抗体或表达的受体的配体提供结合到PEG偶联剂上的结合点，从而实现富集神经酰胺或包封有神经酰胺的纳米颗粒的靶向肿瘤特定位点的胞内药物传递。
在本发明的另一个实施方案中，纳米级装配***包含聚合材料，例如载有能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或基因治疗剂的树枝状聚合物或水凝胶。该树枝状聚合物或水凝胶是独立的聚合物，它们组合形成生物智能的即能对刺激反应的、和可体内生物降解的材料。在研究和实验后发现，结合智能链段和可降解的疏水性和/或亲水性链段的材料可以用于药物传递。链段被认为是材料的共价结合部分，且可具有许多聚合的单元。例如，链段可以包括若干聚合单体单元至约数千个聚合单体单元。这些链段可以具有任意的长度和任意的分子量，但是，每个链段优选地具有大致足够大的分子量以使该聚合物链段具有与预期的近似的理想性质。
当单独使用时，所述聚合物受到不能达到最佳的或非生物降解性的限制。因而，将智能聚合物链段和可生物降解的聚合物链段相结合产生比各材料更通用得多的材料。通过结合生物反应性和可生物降解的聚合物形成既可生物降解又对生理刺激有反应的药物传递***。更具体而言，本发明提供包含智能链段和可生物降解链段的多功能聚合物，其中可生物降解链段包含疏水性链段(适用于结合化疗剂或与化疗剂相互作用)和亲水性链段。
已知许多天然的和合成的可生物降解的聚合物。某些已经得以研究，包括聚酯例如聚丙交酯(PLA)、聚(L-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、生物素化的聚(乙二醇-乳酸嵌段共聚物)、聚(烷基氰基丙烯酸酯)和聚(ε-己内酯)，聚酸酐例如聚(双(p-羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)(PCPP-SA)、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、聚氨基甲酸酯、和聚(氨基酸)，多糖例如葡聚糖，其可为微囊、微粒、纳米颗粒、水凝胶和胶束的形式。所有这种可生物降解的聚合物都包含在本发明中，作为多功能材料的链段。
在药物耗尽后，前述聚合物通过主链的水解或酶切降解，是无毒的和非炎性的。聚合物的降解性质依赖于它们的化学成分、立构规整度、结晶度、摩尔质量、形态学、大小和形状，以及pH和温度。已知可生物降解的聚合物的化学和物理性质会影响药物释放特征，且所载的药物的释放动力学由药物扩散和聚合物降解控制。
由于聚-L-赖氨酸(PLL)的电荷、亲水性和靶向能力，因此影响树枝状聚合物或水凝胶的降解速率的另一个方法包括用PLL对疏水性材料如PLA和PLGA微粒/纳米颗粒包衣或接枝。例如已经证实，与没有PLL侧链的那些相比，由PLL进行接枝的聚(L-乳酸-共-L-赖氨酸)组成的微粒具有显著提高的罗丹明B释放速度。而且，用PLL胶束接枝的PLGA表现出比PLL高10倍的转染效率和低5倍的细胞毒性。本发明包括这种包衣和接枝技术在提供亲水性-疏水性可降解链段中的应用。
树枝状聚合物定义为规则的、多枝的链段，其导致相对单分散的、树状的或多代的结构(generational structure)。树枝状聚合物具有3个显著的结构特征：核心、含有重复单元或代并与核心径向连接的多枝状内部区域；与最外层代相连的末端部分的外部或表面区域。通过调整这3个结构成分，可以将树枝状聚合物限定成许多结构。由于其高度的分子一致性、狭窄的分子量分布、特定的大小和令人感兴趣的结构性质例如内部空隙和空腔、以及高度功能性的末端表面，高度枝化和反应性的三维大分子树枝状聚合物已经在生物医药应用方面变得越来越重要。空间上排列的官能团可以与许多分子例如亲水性分子如PEO反应，以增加它们的血液循环时间，与造影剂反应以用于磁共振成像(MRI)，以及与靶向分子反应以定位到理想的组织位点。
目前可得到的树枝状聚合物包含二甲苯醚、丙烯亚胺、酰氨基胺(amidoamine)、L-赖氨酸、酯和碳硅烷树枝状链段。其中，已经广泛地研究了阳离子聚酰氨基胺(PAMAM)树枝状聚合物，且据报道，视树枝状聚合物-DNA比率、树枝状聚合物的大小以及尤其是柔性而定，其在多种细胞中介导高水平的基因转染。PAMAM树枝状聚合物被认为是靶向传递***，且能够增强在某些肿瘤微脉管***内的累积，增加向肿瘤组织内的外渗。聚(L-赖氨酸)(PLL)树枝状聚合物是另一种聚阳离子树枝状聚合物，其含有大量的表面胺，且被认为能与聚阴离子如核酸、胞外基质中存在的蛋白聚糖以及细胞膜的磷脂发生静电相互作用。这些聚合物可以将包括衍生于脂质的生物活性的能使生长停滞的、促进凋亡的代谢物或物质的药物定位到目标膜上。
但是，聚阳离子树枝状聚合物仍然具有体内毒性问题，且能抵抗体内降解，因而不太适用于药物传递。为了改善PAMAM树枝状聚合物的细胞毒性，可以将树枝状聚合物的阳离子胺末端基团替换为阴离子羧基末端基团。通过结合智能的和可降解的链段作为树枝状聚合结构的臂、枝或树突(dendron)，本发明的材料解决了由单独的组分制备的树枝状聚合结构的一些缺点。通过在化学键形成反应中将热反应性聚合物链段与可生物降解的聚合物链段偶联即可制备出这种树枝状聚合材料。
还可以将树枝状聚合物制成纳米大小的颗粒。据信，大小为约1nm-1000nm的颗粒在将药物转运和靶向到发炎的、增殖的或转化的组织方面具有显著的优点。通过吸附、包埋和共价结合将药物载至纳米大小的树枝状聚合物中，并通过脱附、扩散、聚合物侵蚀或任意或全部上述机制的组合将药物从纳米大小的树枝状聚合物释放出来。体外和体内实验证实，当以葡聚糖稳定化并用聚山梨醇酯80包衣时，纳米大小的树枝状聚合物可以具有较长的血液循环时间和较低的RES摄取。纳米大小的树枝状聚合物能与血管或实体瘤相互作用，然后被这些细胞通过内吞作用摄入。因此据信，由于提高的循环半衰期，树枝状聚合物具有非常大的将药物传递给发生肿瘤的或发炎的/增殖的组织中的能力。
纳米技术近期的发展提供了受控地传递和靶向地释放疏水性治疗剂的巨大潜力。本发明的纳米级树枝状聚合物装配***既对温度刺激反应又可通过水解而可被生物降解，允许将C6靶向地和持续地传递给实体瘤。已经证实，可以将C6载至温度敏感的、“智能的”树枝状聚合物中，且该药物-聚合物复合物可以有效地抑制MDA***-阴性的乳腺癌细胞的增殖以及诱导细胞凋亡。通过热敷袋或超声波向实体瘤区域施以急性局部高温会触发C6向患病组织内释放。因而，热反应性纳米级树枝状聚合物可以用作向实体瘤组织靶向地和控制地传递包括神经酰胺的治疗剂的最佳方案，该概念被称作“生理高温的药物传递”(physiologicalhyperthermic drug delivery)。
树枝状聚合物在药物传递中的应用
脂质体药物传递技术的光芒逐渐被通过采用聚合物化学技术以设计制造具有一系列药物传递动力学优势的稳定纳米颗粒的更先进的药物传递***所盖过。例如，聚合纳米颗粒能够延长生物利用度、靶向于疾病细胞、以及具有生物反应性和控制的药物释放(17)。通过吸附、包埋和共价结合将药物载至聚合的纳米颗粒中，并通过脱附、扩散、聚合物侵蚀或任意或全部上述机制的组合，将药物从纳米颗粒释放出来。由于其高度的分子一致性、狭窄的分子量分布、特定的大小和令人感兴趣的结构性质如内部空隙和空腔，以及高度功能性的末端表面，因此树枝状聚合物——高度枝化的和反应性的三维纳米颗粒——适用于生物医药应用。本发明的树枝状聚合物包含聚阳离子聚合物(聚(L-赖氨酸)，PLL)、可生物降解的聚合物(聚(L-乳酸)、PLLA)、以及热反应性的聚合物(聚(N-异丙基丙烯酰胺)，PNIPAAM)。通过与PLLA的疏水-疏水相互作用将疏水物质例如C6以高达1000mg/ml的浓度载至树枝状聚合物中。反应性聚合物与可生物降解的聚合物的结合在响应生理刺激例如温度实现药物的持续释放方面具有优势。
智能的或反应性的聚合物对物理的、化学的或生物的刺激如温度、溶剂组成、pH、离子强度、压力、电场、光和代谢物有反应。在热反应性聚合物中，聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAM)已经广泛地用于受控的药物传递，因为它在约32℃的水溶液中，在低临界溶液温度(LCST)下表现出独特的溶解度转变(solubility transition)。当冷却至低于LCST时，其扩大和膨胀，当加热至高于LCST时，其收缩和崩溃。可以通过向PNIPAAM中混入疏水性和亲水性单元以及交联剂而操控PNIPAAM的LCST，从而控制载药和药物的释放。
重要的是，基于PNIPAAM的聚合物可用作用于位点特异性的药物传递的可逆的靶向体。在本发明中，将聚合物设计成具有37℃至42℃之间的LCST。在低于LCST的37℃体温时，聚合物可溶于生理性液体中，逃避身体的网状内皮组织***(RES)，并增加所载药物的血液循环时间。当通过但不限于局部的超声波和/或热贴片使温度升至高于聚合物在靶位点的LCST的42℃时，聚合物在靶位点累积，并以较高的局部浓度释放出治疗药物。已经证实，在小鼠中全身注射LCST为40℃的聚(NIPAAM-共-丙烯酰胺)，局部高温使共聚物在实体瘤处累积的程度比加热的和未加热的对照组高2倍。另外，已经制备LCST为40℃的由聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-N，N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚(D，L-丙交酯)组成的可生物降解的和热反应性胶束。已经证实，在高于LCST的42.5℃，由于细胞对胶束的摄入加快，载于胶束中的抗癌药物阿霉素对牛主动脉内皮细胞的细胞毒性比游离的阿霉素高。由于PNIPAAM共价地与聚阳离子PLL(亲水性和稳定性)和可生物降解的PLLA(疏水性、受控的释放)连接，本发明的树枝状纳米颗粒扩展了PNIPAAM的热反应性质。而且，该多功能的树枝状聚合物可载有促凋亡的脂质C6以诱导乳腺癌细胞凋亡。
水凝胶是三维交联的聚合物网络，其在水性环境吸收大量的水而膨胀，同时维持它们的结构。由于它们的高水含量、生物相容性和独特的机械性质，水凝胶已经在生物医药应用如药物传递和组织工程学方面引起了广泛的兴趣。通过响应环境刺激如温度、pH、电信号、离子强度等而改变其结构，本发明的对环境敏感的水凝胶可以控制药物释放。共价地和非共价地(物理地)交联的对温度敏感的、可生物降解的凝胶是作为水凝胶的优选材料。
更具体而言，将水凝胶制备成由下述成分组成共聚网络：N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAM)或其衍生物作为智能的或反应性成分、聚(L-乳酸)(PLLA)或其衍生物作为可水解地降解的和疏水性的成分、以及葡聚糖或其衍生物作为可酶促地降解的和亲水性的成分。各成分或链段可以是任意的长度，包括约3个单体单元至约10,000个单体单元，例如约3至5,000个单元。该材料或链段还可以进一步包含其它的单体单元以该调节材料的性质。例如，该水凝胶还可以包含阴离子(丙烯酸)和阳离子(丙烯酰胺(acrylic amine))单元以增加凝胶的pH和离子强度敏感性。
PNIPAAM-PLLA-葡聚糖水凝胶是热反应性的，低临近溶液温度(LCST)在约32℃，且它们的溶胀性质强烈地依赖于温度变化、亲水性/疏水性成分的平衡以及PLLA成分的降解。通过ATR-FTIR和重量减少实验测得，PLLA成分中酯键水解断裂造成的水凝胶的降解在低于LCST的25℃时比在高于LCST的37℃时更快。
不受理论的约束，据称，当将治疗化合物如能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或基因治疗剂混入纳米级装配***如脂质体、可再吸收的非聚集的纳米颗粒、或聚合材料如树枝状聚合物或水凝胶中时，它们向癌细胞的全身传递增强，从而极大地增强了能使生长停滞的、促凋亡的化合物的效力。另外，可以应用富集或包封有神经酰胺的纳米技术在复合疗法中传递更小剂量的其它疏水性化疗剂或基因治疗剂，以实现更高的功效且具有更低的副作用。
下面的实施例用于进一步解释本发明的某些优选实施方案，而不具备限制的性质。仅仅使用常规实验，本领域技术人员就能够认识到或能够确定许多与本文所述的具体物质和方法等同的方案。
实施例
实施例1-通过脂质体传递的C6-神经酰胺-诱导的乳腺癌细胞凋亡
材料和细胞培养
卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、胆固醇(CH)、聚乙二醇(2000-5000)-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、D-赤-己酰基-鞘氨醇(C6-神经酰胺)、聚乙二醇-750-C8-神经酰胺(PEG-C8)、二油酰基-1，2-二酰基-3-三甲基-铵-丙烷(DOTAP)购自Avanti Polar Lipids(Alabaster，AL)。二氢-赤-己酰基-鞘氨醇(DHC6)购自Biomol(Plymouth Meeting，PA)。[3H]-C6购自ARC(St.Louis，MO)，[3H]-胸苷购自ICN(Costa Mesa，CA)，胆甾-1，2-3H(N)十六烷基醚([3H]-CHE)购自Perkin Elmer(Boston，MA)。Silica gel 60薄层色谱板购自EMD Chemicals(Gibbstown，NJ)。Formvar/碳包裹的400目铜网购自Electron Microscopy Sciences(Fort Washington，Pa)，聚-L-赖氨酸购自Sigma(St Louis，MO)。
对磷酸化的-Akt(pAkt)和Akt-1，2，3特异性的抗体购自Cell Signaling(Beverly，MA)。***-1(IGF-1)购自CalBiochem(San Diego，CA)。为了进行Western印迹分析，4％-12％预制的SDS-PAGE梯度凝胶购自Invitrogen(Carlsbad，CA)，ECL试剂购自Amersham(Piscataway，NJ)。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自UpState Biotechnology(Waltham，MA)。Vybrant细胞凋亡实验试剂盒#3购自Molecular Probes(Eugene，OR)，Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7Assay购自Promega(Madison，WI)。RNA酶购自Roche(Indianapolis，IN)，碘化丙啶(PI)购自Sigma(St.Louis，MO)。人MDA-MB-231(MDA)乳腺癌细胞购自ATCC(Manassas，VA)，并在37℃、于添加了10％FBS的RPMI 1640中生长。该细胞系是人乳腺癌的高侵蚀转移的、***受体-阴性的模型。
脂质体制剂和挤出
配制了脂质并测试了它们将C6混入脂质体药物传递囊中的能力。简而言之，将溶解到氯仿(CHCl3)中的脂质以特定的摩尔比混合，在高于脂质转变温度的氮气流下干燥，并用无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)水合。超声处理得到的溶液2分钟，随后通过100nm聚碳酸酯膜挤出。通过将痕量的[3H]C6混入制剂中，在CHCl3/MeOH(2∶1)中萃取脂质组分(constituent lipid)，使用闪烁计数器对比挤出前后的放射活性，从而确定混入的效率。用于体内施用的制剂包含DSPC∶DOPE∶DSPE-PEG(5000)∶C8-神经酰胺-PEG(750)∶C6-神经酰胺(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0，摩尔比)。加入PEG(750)-C8，允许含高达30mol％的C6-神经酰胺。在410.4乳腺癌细胞中确定这些PEG化的制剂的生物活性。通过在氯仿/甲醇(2∶1)中萃取脂质组分，随后使用CHCl3/MeOH/ddH2O(60∶25∶4)溶剂***，在预热的硅胶60薄层色谱(TLC)板上拆分，从而验证了所配制的脂质体的组成。在碘室中使脂质可视化。使用透射电子显微术(TEM)来表征所配制的脂质体的大小和形态学。
透射电子显微术(TEM)
为了表征所配制的脂质体的大小和形态学，使用了TEM。最初，用聚-L-赖氨酸包裹formvar碳-包裹的400目铜网10分钟，以促进囊向疏水网的结合。接着，将脂质体样品应用到干网上，并使其附着5分钟。将1％磷钨酸(pH 7.0)施用到干网上再5分钟以进行负染色。使用60kV的加速电压，在21,500×放大率下观察样品。
TEM分析证实了，对于所有的制剂，所生产的混有C6的脂质体载体具有均匀的大小分布，直径介于85至140nm之间(图2A)。图2B说明脂质体制剂的平均大小。随着痕量的[3H]C6向常规制剂中的混入，我们发现在挤出过程中没有显著的神经酰胺损失(图2C)。另外，在TLC板上分析从常规脂质体萃取的脂质，证实了在挤出过程中没有可视的脂质组分减少(图2D)。
体外药物动力学
将痕量的[3H]C6混入脂质体制剂中以确定脂质体传递与非脂质体施用相比的量。以3.5×104细胞/孔将人MDA-MB-231(MDA)乳腺癌细胞接种到24-孔板中，在含有10％FBS的培养基中生长过夜。然后在添加了1％FBS的培养基中，用含有痕量的[3H]C6或[3H]CHE的脂质体或非脂质体C6以不同的时间间隔处理细胞。将脂质体C6直接添加到细胞培养基中，将非脂质体C6加入二甲基亚砜(DMSO)载体中，至终浓度≤0.1％(v/v)。在指定的时间点去除培养基，用冷PBS洗涤细胞1次以分离脂质体/膜-非特异性的相互作用。然后用1％SDS溶解细胞，使用闪烁计数器确定MDA细胞中的[3H]C6或[3H]CHE累积。
结果表明，在有1％FBS存在的情况下，脂质体制剂传递的C6比C6的非脂质体施用效力更强、效率更高(图3A)。阳离子脂质体传递使MDA细胞的神经酰胺累积增加了2倍，在约16小时时观察到了最大累积。发现常规的和PEG化的脂质体具有类似的体外药物动力学特征。
然后，研究了C6从脂质体载体释放或转移到细胞膜内的机制。使用不可转移的胆固醇脂质标记[3H]CHE作为脂质体/细胞膜联合的探针，用[3H]C6或[3H]CHE标记脂质体，并与MDA细胞一起温育指定的时间。如图3B所示，脂质体会介导C6、而不是胆固醇从药物载体向细胞膜转移。而且，随着C6随时间累积，CHE累积不能显著增加到背景水平以上。还以剂量-依赖性的方式观察到了神经酰胺和胆固醇累积之间的不一致(图3C)。这表明，C6是通过脂质转移过程传递，该过程使得无需相关的脂质体/细胞膜融合C6即可从脂质体分配出来进入质膜双层。
[3H]-胸苷细胞增殖
为了确定常规的脂制剂向MDA细胞传递短链神经酰胺的应用，进行了[3H]胸苷增殖实验。简而言之，将MDA细胞以3.5×104细胞/孔接种到24-孔板中，并生长过夜，随后血清饥饿24小时。在血清饥饿的第12小时，在剩余的血清饥饿期间用脂质体或非脂质体C6处理细胞。血清饥饿后，给培养基添加FBS(10％终浓度)再经过12小时，通过在最后的4小时处理中加入0.5mCi/ml[3H]胸苷检测细胞的增殖。用冷PBS洗涤细胞1次，然后用10％三氯醋酸洗涤2次、10分钟。用0.3N NaOH溶解细胞，使用闪烁计数器检测混入酸不溶性DNA中的[3H]胸苷。
如图4A所示，补充了C6的含有卵磷脂酰胆碱(EPC)和胆固醇(CH)的常规脂质体(实线)表现出对MDA细胞增殖的明显的剂量依赖性抑制。将泡囊-去稳定的脂质、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)加入常规制剂中也增强C6的生物活性。在有10％FBS存在、处理12小时的情况下，当用25uM或更多的脂质体C6处理时，完全抑制了MDA细胞的生长。在脂质体制剂中传递C6，使IC50减少了约3倍，从非脂质体至脂质体分别从15降至5uM。与在DMSO载体中的非脂质体地施用的C6(虚线，空心圆)相比，这些常规制剂表现出提高的对MDA细胞的生长的剂量-反应性抑制，表明具有提高的效力和功效。不含有C6的脂质体(Ghost；虚线，空心正方形)以及PBS对照组未表现出显著的生长抑制，表明C6是唯一的生物活性剂。该研究证实了C6-配制的常规脂质体作为抗增殖剂比游离地施用的C6更有效。
接着，研究了C6-向阳离子脂质制剂中的混入(图4B)。尽管用带正电荷的脂质、二油酰基-1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)配制的Ghost阳离子脂质体(虚线，空心三角形)自身即增强MDA细胞增殖，但混有C6的阳离子脂质体(实线，空心三角形)剂量-依赖性地减少了MDA细胞增殖。该阳离子制剂比非脂质体C6施用(虚线，空心圆)更有效，但是不如常规制剂有效(实线，空心正方形)。这表明，阳离子脂质体制剂也可以用于传递生物活性的神经酰胺，以剂量-依赖性地抑制细胞增殖。
接着，研究了PEG化的脂质进一步增强C6的生物活性的作用。选择了C8-神经酰胺(PEG-C8)，因为它还有促进脂质体/膜融合的潜在优点。另外，已知包含PEG-C8会促进脂质体双层的时间-释放性质，具有生物利用度扩展的附加优点。而且，本实施方案使用PEG C8来稳定脂质双层，使脂质体含有浓度高达至少30mol％的游离的生物活性C6神经酰胺。另外，本实施方案使用PEG C8作为脂质体的必备成分，所述脂质体含有生物活性的神经酰胺和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂。而且，PEG-C8配制的脂质体能确保游离的神经酰胺向富含小窝蛋白的脂筏中的最佳***和定位，这是膜内在化和向包括线粒体的亚细胞器转移，以随后诱导靶组织或肿瘤的细胞凋亡或程序性细胞死亡的先决条件。
PEG化的脂质体没有显著地影响MDA细胞增殖，表明PEG-C8是生化惰性的。但是，在10和25uM时，混有C6的PEG化的脂质体在抑制增殖方面好像不比常规脂质体更有效(图4C)。这表明设计用于全身药物传递的PEG化的脂质体制剂也是C6-介导的对MDA细胞增殖的抑制的有效的载体。总之，在多种脂质体制剂中传递的C6表现出比非脂质体C6对生长具有更高的剂量-反应性抑制，表明具有更高的效力和功效。
MTS细胞毒性实验
为了评价用于体内研究的PEG化的制剂的体外功效，我们在鼠410.4乳腺癌细胞上测试了该制剂。将410.4细胞接种到96-孔板中，在添加了1％FBS的培养基中，用PEG化的脂质体或游离的C6处理24小时。根据生产商的说明，使用Promega Cell Titer Proliferation Kit(Promega)评价细胞毒性。PEG化的脂质体-C6传递导致增强的细胞毒性。与在DMSO载体中游离地施用C6相比，施用脂质体-C6制剂会降低C6的IC50。这些数据表明，当在PEG-C8脂质体制剂中传递时，C6-神经酰胺的IC50降低35-40％。在有1％FBS存在的情况下进行处理24小时。
半胱天冬酶实验
细胞凋亡与半胱天冬酶活性的上调有关，因而对用PEG化的脂质体处理MDA细胞后的半胱天冬酶-3/7的活性进行评价。简而言之，将MDA细胞以6.0×103细胞/孔的密度接种到96-孔板中，并在含有10％FBS的培养基中生长48小时。然后在含有1％FBS的培养基中用脂质体或非脂质体C6处理细胞24小时。根据本领域已知的标准方法，使用Apo-ONEHomogeneous caspase-3/7 Assay(Promega，Madison，WI)检测半胱天冬酶-3/7的酶活性水平。
结果表明，用PEG化的脂质体神经酰胺处理的MDA细胞表现出比用非脂质体神经酰胺处理的细胞显著更大的半胱天冬酶-3/7活性(图6)。用Ghost处理没有观察到半胱天冬酶-3/7活性的显著变化。总之，这些结果表明，C6-配制的脂质体比C6的非脂质体施用更有效，导致MDA细胞增殖的显著抑制和最终的凋亡性死亡。
细胞凋亡检测
进行了研究以确定C6-依赖性的生长抑制是否与增强的细胞凋亡相关。为了证实C6传递会导致MDA细胞凋亡，进行了TUNEL分析(UpstateBiotechnology，Lake Placid，NY)，它会对细胞凋亡的标志——断裂的DNA进行染色(图7A)。
用脂质体和非脂质体C6处理的连续***的、血清喂养的MDA细胞的TUNEL染色证实了在8小时时没有DNA断裂。脂质体和非脂质体C6处理以与DNA酶阳性对照类似的方式诱导DNA断裂。在与C6传递的体外药物动力学特征一致的时间点处理16小时时，观察到了断裂的3′-OH DNA的染色。对Ghost制剂没有观察到细胞凋亡。
为了定量C6-诱导的细胞凋亡，使用Vybrant细胞凋亡实验试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)进行了处理的连续***的MDA细胞的膜联蛋白V染色和膜联蛋白V-染色的细胞的流式细胞仪分析。
处理24小时后，PEG化的脂质体C6诱导了比非脂质体C6显著地更多的膜联蛋白V染色，而Ghost制剂无影响(图7B)。
对促存活激酶活化的AKT的评价
使用Western印迹分析研究了用脂质体和C6非脂质体制剂处理的MDA细胞中的神经酰胺-调节的Akt信号途径。简而言之，将MDA细胞以4.0×105细胞/孔接种到60mm板中，生长过夜，然后进行24小时血清饥饿。在血清饥饿的第16小时，在剩余的血清饥饿期间用脂质体或非脂质体C6处理细胞。在血清饥饿的第24小时，将IGF-1(20ng/ml)加入细胞培养基中15分钟。用冷PBS洗涤细胞1次，然后在冰上加入150μl冷的裂解液(1％Triton X-100、20mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、2.5mM Na4P2O7、1mMβ-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1μg/ml在ddH2O中的亮肽素，pH 7.5)。在冰上裂解细胞15分钟，收集细胞裂解物，并以15,000×G离心15分钟。将35μg蛋白载样于4％-12％预制的SDS-PAGE梯度凝胶中检测pAkt。剥离印迹并重新探测Akt-1，2，3以证实载样量相同。使用ECL化学发光使蛋白条带可视化，并通过密度测定法定量。结果表明，在降低IGF-1-刺激的pAkt水平方面，PEG化的脂质体C6比非脂质体神经酰胺更有效，而Ghost制剂对pAkt水平无作用(图8A和8B)。与非脂质体DHC6相比，脂质体二氢-赤-己酰基-鞘氨醇(DHC6)也表现出对IGF-1-刺激的Akt磷酸化的抑制。选择了C6处理的8小时，因为该时间点对应着C6向MDA细胞中几乎最大的累积。该研究结果证实了脂质体C6通过长期抑制Akt信号级联放大而诱导细胞生长抑制和细胞凋亡。
共焦研究
为了证实C6在410.4鼠乳腺癌细胞中的细胞累积，我们施用了含有10摩尔％NBD-C6作为C6标记的脂质体-C6制剂。使用DAPI(核)对细胞复染色(counter-stain)，MitroTraker Red(线粒体)作为参考。通过60×放大率的共焦显微术评价了C6传递。获得NBD-C6自脂质体囊向细胞传递的共焦显微图像(图9A)。NBD-C6(绿色)共定位于线粒体(MitoTraker-Red)；所染上的蓝色代表染有DAPI的核。
蔗糖梯度
将痕量的[3H]-C6混入脂质体制剂中用以评价C6在全部细胞和富集小窝的脂筏中的时间-依赖性的细胞累积。由于认为这些脂筏会促进多种途径包括神经酰胺的信号转导，因此施用脂质体-C6应当会促进C6在脂筏中的累积。为了评价该现象，以细胞裂解物的蔗糖梯度(5％、35％、和45％蔗糖)分离富集小窝的脂筏。取出梯度的每1ml级分(共12个级分)的等分试样，使用闪烁计数器计数。使用[3H]-C6作为全部C6的标记，脂质体传递导致神经酰胺在小窝蛋白脂信号筏中的时间-依赖性的累积(图9B)。神经酰胺累积在蔗糖梯度的级分4和5中，它们代表着小窝蛋白-1富集的脂筏(小窝)(图9B)。
体内总结
使用乳腺癌的体内小鼠模型***，建立了用于全身传递C6治疗实体瘤的方法。体内数据表明了PEG化的脂质体制剂在410.4携带肿瘤的BALB/c小鼠中具有有希望的抗癌活性(图10A-B)。这些体内结果证实，与空Ghost脂质体相比，使用脂质体C6时肿瘤体积的剂量-反应性减少。这是在肿瘤发生的体内模型中证实全身的C6制剂的功效的第一个实验。而且，体内药物动力学分析证实，全身的脂质体C6传递导致C6在肿瘤组织中达到并维持稳态生物活性浓度达24小时(图11A-B)。尽管C6被迅速地从血液和主要的首过器官中清除，但该稳态生物活性浓度得以维持。总之，证实了C6的全身制剂在体外和体内均表现出了具有优越的药物动力学的功效。而且，使用Swiss Webster小鼠证实了PEG化的脂质体-C6制剂在静脉内注射高达100mg/kg后，没有毒副作用，而以10mg/kg注射在DMSO中的游离C6杀死50％的小鼠。
体内抗癌功效
为了评价全身的脂质体-C6传递的体内功效，将5×106个410.4细胞皮下注射进Balb/C小鼠的右后肋侧。注射410.4细胞4天后，给小鼠静脉内(i.v.)注射脂质体-C6、空脂质体(Ghost)、或0.9％NaCl。每2天治疗小鼠。在即将治疗前，对小鼠称重，并测量肿瘤。用卡尺测量肿瘤大小，并使用下面的半椭球体公式计算肿瘤体积：
V＝π/6×L×W2，其中V＝肿瘤体积，L＝长度，且W＝宽度。
脂质体-C6[DSPC/DOPE/DSPC-PEG(5000)/C8-PEG(750)/C6-神经酰胺(3.75∶1.75∶0.75∶0.75∶3.0)]传递通过神经酰胺-诱导的细胞凋亡表现出剂量-依赖性的抗肿瘤活性。与空ghost脂质体相比，全身传递脂质体-C6以剂量-依赖性的方式抑制肿瘤生长(图10A)。在用40mg/kg脂质体-C6处理1周后取出肿瘤，制作冷冻切片用于组织学分析(图10B)。用TUNEL试剂盒对肿瘤切片染色，以评价诱导的细胞凋亡的程度、DAPI-染色的核。
体内药物动力学
使用[3H]-C6作为C6传递的标记，给携带肿瘤的小鼠注射10和40mg/kg脂质体-C6，在选定的时间点取出血液、肿瘤、脾、肾、肝和心脏组织。对组织称重、溶解、使用闪烁计数器计数。对取出的每种组织计算每mg组织(或ml血液)的总C6量，并评价药物动力学特征。为了相对于C6的分布示踪脂质体载体的传递，将[3H]-CHE掺入脂质体制剂中作为传递载体的标记。
10和40mg/kg剂量的脂质体-C6似乎遵循一级动力学，在24小时时维持与体外IC50相关联的足够的血浆浓度(图11A)。在这些剂量下，在约30分钟时肿瘤组织中达到C6的稳态浓度(图11B)。40mg/kg的剂量使浓度维持在理想的IC50以上达24小时。使用[3H]-CHE作为PEG化的脂质体载体的标记，脂质体似乎以时间依赖性的方式累积在肿瘤组织中。这可能意味着由于PEG化的脂质体的连续累积，因而补充在肿瘤中代谢的C6，因此C6在肿瘤组织中的稳态浓度可得以维持。
实施例2-树枝状聚合物作为C6-神经酰胺药物传递载体
树枝状聚合物合成
通过使聚(L-赖氨酸)(PLL)树突与接枝有PLLA的PNIPAAM结合而合成了树枝状聚合物。通过自由基聚合反应合成了接枝有PLLA的PNIPAAM(图12)。
树枝状聚合物热反应性性质
在不同的浓度下，以1℃/30分钟的速度升高温度，在500nm处使用UV-可见光谱仪(Perkin Elmer Lamda 25，Shelton，CT)来研究树枝状聚合物在PBS(pH＝7.4)中的透光率(图13A)。树枝状聚合物是热反应性的，分别在1、0.5、0.1、和0.05mg/ml的浓度表现出31、32、34、和39℃的低临界溶液温度(LCST)(定义为在95％最大透光率时的温度)。随着树枝状聚合物浓度的降低，LCST变得模糊。在LCST以上，由于聚合物的相互作用增加，透光率大小随着浓度的增加而降低。PNIPAAM和接枝有PLLA的PNIPAAM的LCST随着对数浓度线性下降，由于PLLA的疏水性，后者在各浓度比前者低2℃。但是，当PLL结合到接枝有PLLA的PNIPAAM的两端时，由于PLL的正电荷和亲水性，树枝状聚合物的LCST表现出与对数浓度的非线性关系，并且与其它2种聚合物相比其值最高。
使用动态光散射(DLS)(ALV，Germany)通过测量树枝状聚合物对温度的流体动力学大小，进一步确认了树枝状聚合物的热反应性性质。树枝状聚合物在PBS(pH＝7.4)中的表观流体动力学直径(Dh)在3种浓度1、0.5和0.1mg/ml下、分别在3个区域表现出温度依赖性(未显示数据)。在低温范围，Dh随着溶液温度的升高而略有降低，反映了各链的收缩。在中温范围，Dh在达到它们的最大值之前增加，表明树枝状聚合物纳米颗粒由于链间结合而彼此聚集。在高温范围，由于链内收缩，Dh随着聚集温度的升高而降低。树枝状聚合物的LCST是29(可能在25和29℃之间)、30和31℃，分别定义为在3种浓度1、0.5和0.1mg/ml时的Dh-温度曲线的最初的拐点。在低温范围和中温范围，Dh随着浓度的增加而增加，因为链间相互作用也随着浓度的增加而增加。对于相同的溶液浓度，通过DLS测得的LCST略低于通过UV-可见光谱测得的值，这归因于测量装置的不同。DLS和UV-可见结果都证实，LCST随着浓度的增加而降低。
C6神经酰胺和生物智能纳米树枝状聚合物
使用MALDI-TOF，通过测量树枝状聚合物的摩尔质量随时间的变化，从而检测了1mg/ml的树枝状聚合物分别在低于和高于LCST的温度的25和37℃、于PBS(pH＝7.4)中的动态降解。在达1个月的时间内，树枝状聚合物的摩尔质量数(Mn)随时间而降低，且在37℃比在25℃降低得更快，且在两个温度都在19天后达到相对稳定的值。有趣的是，19天后稳定的Mn是约2700g/mol，将其从起始Mn(约4200g/mol)中减去后约是1500g/mol，等于PLLA的摩尔质量数。该结果表明，树枝状聚合物降解、且它们的降解可能归因于树枝状聚合物的PLLA成分的水解性降解。为了支持上面的观点，分别随时间测量了树枝状聚合物的FTIR光谱和粘度(未显示数据)。发现在约1760cm-1的归因于PLLA的酯C＝O伸缩振动的峰强度清楚地随着时间而降低，并在19天后消失。因为在约1660cm-1的归因于PNIPAAM和PLL的酰胺C＝O伸缩振动的峰相对稳定，因此它们用作参比峰以标准化在约1760cm-1的峰强度。得到的峰高度百分比随着时间而降低，并在19天后变为0(未显示数据)。另外，发现树枝状聚合物的粘度(通过Cannon-Ubbelohde型粘度计测量，按照ASTM D 445和ISO 3104的方法)随着时间而降低，且在37℃比在25℃降低得快，并在19天后达到稳定值(未显示数据)。因此，FTIR结果以及粘度测量和MALDI-TOF结果强烈地表明，由于PLLA成分的水解性降解，所设计的树枝状聚合物可生物降解。
C6包封率的方法学。在包含蒸馏水、乙醇和N-二甲基甲酰胺(DMF)(蒸馏水/乙醇/DMF{5∶5∶3，v/v/v})的溶剂***中，在1mg/ml的浓度下将C6以3∶1(C6∶树枝状聚合物，w/w)的比率与树枝状聚合物混合，密封、并在室温储存7小时。将C6/树枝状聚合物溶液置于纤维素膜(MWCO-3500)中，并在乙醇(50ml)中透析，从膜的内侧去除游离的C6。通过MALDI-TOF质谱分析测量纤维素膜内侧和外侧的C6的量。以1∶9(样品∶基质)的比例将膜内侧和外侧的溶液与2，5-二羟基苯甲酸的基质溶液混合。使用C16-神经酰胺(C16)作为内标物，并加入每种溶液中。通过分别在424和562m/z的C6和C16质谱峰的相对强度随时间(2、4、6、和10小时)计算出C6的量。以3∶1的比率将C6载至树枝状聚合物中(C6∶树枝状聚合物)，产生约35.94±1.2％的包封率。
从树枝状聚合物释放C6的方法学。为了评价C6和树枝状聚合物之间的相互作用，必须评价C6从树枝状聚合物释放的动力学。由于树枝状聚合物的水解性降解，C6的释放率(Mt/Wω，其中Mt和Wω分别是在时间t释放出的C6的量和释放出的C6的最大量)随着时间而增加。将树枝状聚合物-C6复合物溶于无菌的PBS(pH＝7.4)中，并置于纤维素膜(MWCO＝3500)中，在含有0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的无菌PBS(pH＝7.4)(50ml)中透析。由于C6是非常疏水的，必须在有去污剂(例如SDS)存在的情况下进行透析。在连续磁力搅拌下，在低于(25℃)和高于(37℃)LCST的温度时，树枝状聚合物的终浓度是0.02、0.05、0.1和0.5mg/ml。在选定的时间(0至30天)间隔处取出1ml缓冲溶液，并用新鲜的缓冲液替换，以测定所释放的C6的浓度。为了定量C6从树枝状聚合物中的释放，使用C16作为内标，通过MALDI-TOF质谱分析测量了纤维素膜内侧和外侧的C6的量。在温度高于树枝状聚合物的LCST的37℃，树枝状聚合物更为疏水，因而导致C6从载有C6的树枝状聚合物中的释放更加缓慢(图13B)。
树枝状聚合物的降解性质
由于聚合的纳米颗粒与脂质体技术相比具有如上所述的优点，我们将C6载至温度敏感的树枝状聚合物纳米颗粒中，以使用温度-诱导的传递策略靶向于实体瘤。我们专有的树枝状聚合物纳米颗粒包含PLLA、PLL、和PNIMPAM。如上所述，使用UV-可见光谱监控树枝状聚合物溶液的透光率随着逐渐升高的温度的变化，我们观察到急剧的转变，证实了这些树枝状聚合物确实是热反应性的。发现这些原型的树枝状聚合物在100μg/ml时的近似LCST是约34℃。使用MALDI-TOF质谱分析，我们证实了树枝状聚合物的摩尔质量随着时间而降低，这验证了它们也是可生物降解的(未显示数据)。如共焦显微术所分析的，在温度高于LCST(37℃)时比低于LCST(25℃)时树枝状聚合物在MDA细胞中优先累积(图14A)，这可能是由于增加的疏水性。而且，使用流式细胞仪来定量FITC-标记的树枝状聚合物的胞内累积和摄入，我们证实了在温度高于LCST(37℃)时比低于LCST(25℃)时，MDA细胞中有明显更多的树枝状聚合物摄入(图14B)。更重要的是，用这些载有C6的树枝状聚合物处理MDA细胞产生显著的生长抑制/细胞毒性，而树枝状聚合物自身不表现出细胞毒性(图15A)。除了诱导生长停滞外，C6-富集的树枝状聚合物还诱导MDA细胞的凋亡(图15B)。总之，我们的临床前数据证实树枝状聚合物能有效地控制抗癌药物C6的释放。该实施方案的优化已经包括设计具有略高于生理温度的LCST的聚合的树枝状聚合物以允许生理的高温的药物传递。
树枝状聚合物作为C6-神经酰胺的药物传递载体：装载和释放
主要目的是生成可生物降解的和温度-敏感的树枝状的纳米颗粒，其可以与C6复合、静脉内注射、溶于血流中较长的时间，并实现治疗剂向实体瘤的靶向的和持续的传递。为了产生LCST为约40℃的树枝状聚合物以将树枝状聚合物经热方法(thermally)靶向于实体瘤，NIPAAM、疏水性PLLA和亲水性PLL之间的相对摩尔比起关键作用。众所周知，均聚物PNIPAAM具有32℃的LCST{Eeckman，2001#52}。通过分别增加掺入的疏水性或亲水性成分的量，可以降低或增加该LCST{Eeckman，2001#52}。
为了设计制造生物反应性的、智能的、能在高于生理温度的局部高温诱导下释放C6的树枝状聚合物，对树枝状聚合物结构进行优化。为了设计具有略高于37℃的最佳LCST的树枝状聚合物，我们将PLLA替换为更柔性的和无定形的聚合物，例如摩尔质量为800、2000和4000g/mol的聚(D，L-乳酸)(PDLLA)。其次，我们使用PLL的不同代(树枝状的结构的连续的同心环)，例如3、4或5。最后，我们使用PDLLA大分子和NIPAAM单体之间的不同摩尔比，例如0.02、0.05和0.1mol％。通过随温度测量透光率以UV可见光谱评价、通过随温度测量流体动力学大小以光散射评价得到的树枝状聚合物的LCST。
通过与N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIMAAM)的共聚增加树枝状聚合物的LCST。在50、60、和70％的NIPAAM单体时，随着NIMAAM单体的增加，得到的树枝状聚合物分别表现出36、42、和44℃的LCST。以此方式，我们已经设计了生物智能的、能通过局部高温靶向于肿瘤从而将疏水性化疗剂释放于实体瘤的树枝状聚合物，所述疏水性化疗剂包括能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的第二信使。可以通过使用超声波或热贴片装置把局部肿瘤温度升高到树枝状聚合物的LCST之上，从而实施局部加热。该过程称作“生理的高温的药物传递”。
树枝状聚合物的细胞存活性。
下面的实施例将进一步说明。
实施例3-合成用于全身传递的含有神经酰胺的具有磷硅酸钙外壳的可再吸收的纳米颗粒
使用未经进一步纯化的非离子型表面活性剂聚(氧乙烯)壬基苯基醚(Igepal CO-520，Aldrich Chemical Co.)制备了反胶束。环己烷、去离子水和C6-神经酰胺原样用于合成。
在快速搅拌下，在环境温度、30mL小瓶中制备了由4mL Igepal、10mL环己烷和去离子水组成的总体积为20mL的微乳。这生成了均匀的混合物，向其中加入在水相中的痕量C6作为水和药物的胶束混合物。得到的含有C6的胶束结构被CPS包裹，CPS的组成为Cax(PO4)yzSiO2，其中0.1≤x≤100.1，0.1≤y≤10，并且0≤z≤10。通过改变水和表面活性剂的比率(R＝[水]/[表面活性剂])控制得到的纳米颗粒的大小。
将反胶束包封在CPS包衣中后，洗涤纳米颗粒，使用为用于具有含C6的外壳的纳米颗粒特别改进的尺寸排阻高效液相色谱(SEC)浓缩。使用比普通柱短的、含有直径约20微米的微孔硅颗粒的洗脱柱，向其中加入乙醇作为洗脱剂。为了分散纳米颗粒，将烷基胺硅烷偶联剂、氨基丙基三氯硅烷加入悬浮液中。该偶联剂也加入用于填充SEC柱的微孔硅颗粒中。根据需要，通过加入醋酸或氢氧化钠将悬浮的纳米颗粒的pH维持在约7.0。另外，使碳二亚胺-介导的聚乙二醇(PEG)偶联剂结合到烷基胺偶联剂上。
实施例4-水凝胶作为C6-神经酰胺释放载体
合成并表征了9种多功能的具有热反应性和可生物降解性质的水凝胶。水凝胶是共聚的网络，其由下述组分组成：N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAM)作为热反应性成分、聚(L-乳酸)(PLLA)作为可水解地降解的和疏水性成分、且葡聚糖作为可酶促地降解的和亲水性成分。由于它们的多功能性质，设计的水凝胶适用于生化应用，包括药物传递和组织工程(图16)。
水凝胶表现出热反应性的性质，且LCST是约32℃，对于PNIPAAM是典型的。在约4个月后，水凝胶也是可随孔径的增加而水解地生物降解的。在高于(37℃)和低于(25℃)LCST的温度下，水凝胶的溶胀行为是不同的，且强烈地依赖于共聚物的亲水性和疏水性。总之，通过改变其共聚物组分和热反应性和可生物降解性质，水凝胶具有很大的潜力来受控地和持续地释放C6-神经酰胺。
应当明白，本文所述的实施例和实施方案仅仅用于解释目的，本领域的技术人员参考它们会作出各种改进或变化，这些改进或变化也包括在本申请的精神和范围内。

Claims (77)

1.一种用于将治疗性化合物传递给需要这种传递的动物或人的***，其包括纳米级装配***，所述纳米级装配***含有能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂。
2.权利要求1的***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物选自以下组中：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇。
3.权利要求1的***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物是短链神经酰胺类似物。
4.权利要求1的***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物包括在SN-2位含有2-10个碳的短链脂肪酸的神经酰胺或其衍生物。
5.权利要求1的***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物包括在SN-2位含有12-24个碳的长链脂肪酸的生理神经酰胺或其衍生物。
6.权利要求1的***，其中基因治疗剂选自以下组中：寡核苷酸、核酶、DNA-酶(DNA-zyme)、质粒、反义或Si-RNA。
7.权利要求1的***，其中含有能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂的纳米级装配***通过静脉内、导管传递、输液泵、微球或药膏全身传递。
8.权利要求1的***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂被全身地传递以治疗涉及细胞生长障碍的病理。
9.权利要求8的***，其中病理选自以下组中：癌症、肿瘤、动脉炎症疾病、动脉粥样硬化、再狭窄或易损斑块以及糖尿病。
10.权利要求1的***，其中纳米级装配***是脂质体组合物，其具有一个或多个包含能使生长停滞的、衍生于脂质的、生物活性化合物和胆固醇的膜。
11.权利要求1的***，其中纳米级装配***是脂质体组合物，其具有一个或多个包含能使生长停滞的、促进凋亡的、衍生于脂质的生物活性化合物、胆固醇和阳离子脂质的膜。
12.权利要求11的***，其中阳离子脂质是二油酰基-1，2-二酰基-3-三甲基铵-丙烷。
13.权利要求1的***，其中纳米级装配***是脂质体组合物，其具有一个或多个包含能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物、胆固醇和PEG化的脂质的膜。
14.权利要求13的***，其中PEG化的脂质是聚乙二醇-450-C8-神经酰胺。
15.权利要求14的***，其中将PEG化的脂质体配制为含有大小为750-5000的PEG化的可透过细胞的神经酰胺(PEG-C8)和/或大小为2000-5000的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG DSPE)。
16.权利要求15的***，其中含有PEG-C8的PEG化的脂质体稳定脂质双层，从而允许脂质体含有浓度高达至少40mol％的游离生物活性C6神经酰胺。
17.权利要求16的***，其中含有PEG-C8的PEG化的脂质体是所述含有生物活性神经酰胺和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂的脂质体的必备成分。
18.权利要求17的***，其中含有PEG-C8的PEG化的脂质体确保游离的神经酰胺向富含小窝蛋白的脂筏中的最佳***和定位，这是膜内在化和向亚细胞器如线粒体中转移的先决条件。
19.权利要求18的***，其中含有PEG-C8的PEG化的脂质体确保线粒体功能障碍并随后诱导靶组织或肿瘤的细胞凋亡或程序性细胞死亡。
20.权利要求1的***，其中纳米级装配***是脂质体组合物，其具有一个或多个包含能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物、胆固醇和融合脂质的膜，所述的脂质体组合物含有用于传递给动物或人的治疗性化合物。
21.权利要求20的***，其中融合脂质是去稳定脂质，其在水溶液中形成六角形的构象，生成反胶束。
22.权利要求1的***，其中纳米级装配***包含具有磷硅酸钙外壳的可再吸收的纳米颗粒，所述的可再吸收的纳米颗粒含有能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂。
23.权利要求22的***，其中可再吸收的纳米颗粒的直径范围为约1-300nm。
24.权利要求22的***，其中可再吸收的纳米颗粒的直径小于50nm。
25.权利要求22的***，其中可再吸收的纳米颗粒的直径为约20nm或更小。
26.一种合成权利要求22的可再吸收的纳米颗粒的方法，其包含：
a)通过混合非离子型表面活性剂、疏水性有机溶剂、水和能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂制备反胶束；
b)用磷硅酸钙外壳包裹反胶束；
c)向磷硅酸钙外壳中加入分散剂；以及
d)洗涤并使用包含洗脱柱和直径约20微米的微孔硅颗粒的改进的尺寸排阻高压液相色谱技术浓缩可再吸收的纳米颗粒，其中将与加入到磷硅酸钙外壳中的相同的分散剂加入微孔硅颗粒中。
27.权利要求26的方法，其中分散剂是酸、金属-有机化合物或无机化合物。
28.权利要求27的方法，其中酸选自以下组中：柠檬酸、酒石酸和醋酸。
29.权利要求27的方法，其中金属-有机化合物是烷基胺硅烷偶联剂或烷基羧酸硅烷偶联剂。
30.权利要求29的方法，其中烷基胺硅烷偶联剂选自以下组中：氨基丙基三氯硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)、3-氨基丙基硅倍半氧烷)、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)、三甲氧基甲硅烷基-丙基二亚乙基三胺(DETA)、3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酐、以及烷基羧酸硅烷偶联剂如酰胺-连接的羧基。
31.权利要求30的方法，其中烷基羧酸硅烷偶联剂是酰胺-连接的羧基。
32.权利要求27的方法，其中无机化合物选自以下组中：钙、磷酸盐和焦磷酸盐。
33.权利要求26的方法，其还包括将碳二亚胺-介导的聚乙二醇(PEG)偶联剂加入分散剂中，以为结合体提供结合点。
34.权利要求33的方法，其中结合体是靶向于身体的致癌的或发炎的或增殖的细胞或组织的抗体或受体配体。
35.权利要求26的方法，其中改进的尺寸排阻高压液相色谱技术包括缩短洗脱柱和使用乙醇代替其中的水或丙酮。
36.权利要求1的***，其中纳米级装配***是包含能传递化疗剂的生物智能链段和可生物降解链段的聚合材料，其中可生物降解链段包括疏水性链段和亲水性链段。
37.权利要求36的***，其中疏水性或亲水性链段可水解地或酶促地降解。
38.权利要求36的***，其中智能链段包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N-烷基丙烯酰胺)、聚(N-正丙基丙烯酰胺)、聚(N-异丙基甲基丙烯酰胺)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)、弹性蛋白样多肽、或其衍生物。
39.权利要求36的***，其中生物智能链段是对物理的、化学的或生物学刺激有反应的，且在由不限于靶向的、局部超声波和/或热贴片导致的局部高温诱导后释放选自以下组中的物质：疏水性生物活性脂质、化疗剂和基因物质。
40.权利要求36的***，其中聚合材料是用于增强所述的化疗剂的传递的树枝状聚合物，其中所述的树枝状聚合物包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)链段或其衍生物、聚(赖氨酸)链段或其衍生物、以及聚(乳酸)链段或其衍生物。
41.权利要求40的***，其中树枝状聚合物是生物智能的、可生物降解的、LCST大于37℃的、用于生理性高温药物传递的纳米树枝状聚合物，其包括：用聚(DL-乳酸)代替聚(乳酸)，混入超过3代的PLL树突；增加NIPAAM与聚(乳酸)或聚(DL-乳酸)的比率，以及使NIPAAM和NIMAAM(N-异丙基-甲基-丙烯酰胺)共聚。
42.权利要求36的***，其中聚合材料是水凝胶。
43.权利要求42的***，其中水凝胶材料包含生物智能链段和可生物降解链段，其中可生物降解链段包括葡聚糖、聚乳酸、或其衍生物。
44.一种将组合物施用于需要它的动物或人的方法，其包括将权利要求1的纳米级装配***施用于动物或人。
45.权利要求44的方法，其中包含在纳米级装配***中的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂的浓度高达约1000mg/ml。
46.权利要求45的方法，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂占组合物的约40wt％。
47.一种用于将治疗性化合物传递给需要这种传递的动物或人的脂质体组合物，其包括具有一个或多个膜的脂质体，所述的膜包含胆固醇和选自以下组中的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇；其中所述的脂质体组合物中含有选自以下组中的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇；和/或疏水性化疗剂和/或选自以下组中的基因治疗剂：寡核苷酸、核酶、DNA酶、质粒、反义或Si-RNA。
48.权利要求47的脂质体组合物，其中神经酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的具有2-10个碳的短链脂肪酸或在SN-2位的12-24个碳的长链脂肪酸。
49.权利要求48的脂质体组合物，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂被全身地传递以治疗涉及细胞生长障碍的病理。
50.权利要求49的脂质体组合物，其中病理选自：癌症、肿瘤、动脉炎症疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、易损斑块和糖尿病。
51.一种将组合物施用于需要它的动物或人的方法，其包括将权利要求50的脂质体组合物施用于动物或人，其中所包含的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂的浓度高达1000mg/ml。
52.权利要求51的方法，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂占组合物的约40wt％。
53.一种用于将能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂传递给需要这种传递的动物或人的可再吸收的纳米颗粒装配***，其包括含有能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂的具有磷硅酸钙外壳的纳米颗粒，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物选自以下组中：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇；且基因治疗剂选自以下组中：寡核苷酸、核酶、DNA-酶、质粒、反义或Si-RNA。
54.权利要求53的可再吸收的纳米颗粒装配***，其中可再吸收的纳米颗粒的直径为约20nm或更小。
55.权利要求54的可再吸收的纳米颗粒装配***，其中神经酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的2-10个碳的短链脂肪酸或在SN-2位的12-24个碳的长链脂肪酸。
56.权利要求55的可再吸收的纳米颗粒装配***，其中使分散剂结合到磷硅酸钙外壳上以防止纳米颗粒的聚集，所述的分散剂选自以下组中：氨基丙基三氯硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APS)、3-氨基丙基硅倍半氧烷)、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS)、三甲氧基甲硅烷基丙基二亚乙基三胺(DETA)、3-三甲氧基甲硅烷基丙基琥珀酐、和烷基羧酸硅烷偶联剂如酰胺-连接的羧基。
57.权利要求56的可再吸收的纳米颗粒装配***，其中将碳二亚胺-介导的聚乙二醇(PEG)偶联剂加入到分散剂中为结合体如抗体提供结合点。
58.权利要求57的可再吸收的纳米颗粒装配***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂被全身地传递以治疗涉及细胞生长障碍的病理。
59.权利要求58的可再吸收的纳米颗粒装配***，其中病理选自：癌症、肿瘤、动脉炎症疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、易损斑块和糖尿病。
60.一种将组合物施用给需要它的动物或人的方法，其包括将权利要求59的可再吸收的装配***施用给动物或人，其中所包含的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂的浓度高达约1000mg/ml。
61.权利要求60的方法，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂占组合物的约40wt％。
62.一种用于将能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂传递给需要这种传递的动物或人的树枝状聚合物装配***，其中树枝状聚合物包含聚(N-异丙基丙烯酰胺)链段或其衍生物、聚(赖氨酸)链段或其衍生物、以及聚(乳酸)链段或其衍生物，且另外其中树枝状聚合物载有能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂。
63.权利要求62的树枝状聚合物装配***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物选自以下组中：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇；且基因治疗剂选自以下组中：寡核苷酸、核酶、DNA-酶、质粒、反义或Si-RNA。
64.权利要求63的树枝状聚合物装配***，其中神经酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的2-10个碳的短链脂肪酸或在SN-2位的12-24个碳的长链脂肪酸。
65.权利要求64的树枝状聚合物装配***，其中聚(赖氨酸)链段或其衍生物是聚(L-赖氨酸)或其衍生物，且聚(乳酸)链段或其衍生物是聚(D，L-乳酸)链段或其衍生物。
66.权利要求65的树枝状聚合物装配***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂被全身地传递以治疗涉及细胞生长障碍的病理。
67.权利要求66的树枝状聚合物装配***，其中病理选自以下组中：癌症、肿瘤、动脉炎症疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、易损斑块和糖尿病。
68.一种将组合物施用给需要它的动物或人的方法，该方法包括将权利要求67的树枝状聚合物装配***施用给动物或人，其中所包含的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂的浓度高达约1000mg/ml。
69.权利要求68的方法，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂占组合物的约40wt％。
70.一种用于将能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂传递给需要这种传递的动物或人的水凝胶装配***，其中水凝胶包含生物智能链段和可生物降解链段，其中可生物降解链段包含葡聚糖、聚乳酸、或其衍生物，且另外其中可生物降解链段包含能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂。
71.权利要求70的水凝胶装配***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物选自以下组中：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇；且基因治疗剂选自以下组中：寡核苷酸、核酶、DNA-酶、质粒、反义或Si-RNA。
72.权利要求71的水凝胶装配***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物选自以下组中：神经酰胺和/或其衍生物、二甲基鞘氨醇、三甲基鞘氨醇、醚连接的甘油二酯、醚连接的磷脂酸、鞘氨醇和二氢鞘氨醇；且基因治疗剂选自以下组中：寡核苷酸、核酶、DNA-酶、质粒、反义或Si-RNA。
73.权利要求72的水凝胶装配***，其中神经酰胺和/或其衍生物包含在SN-2位的2-10个碳的短链脂肪酸或在SN-2位的12-24个碳的长链脂肪酸。
74.权利要求73的水凝胶装配***，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物和/或疏水性化疗剂和/或基因治疗剂被全身地传递以治疗涉及细胞生长障碍的病理。
75.权利要求74的水凝胶装配***，其中病理选自以下组中：癌症、肿瘤、动脉炎症疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、易损斑块和糖尿病。
76.一种将组合物施用给需要它的动物或人的方法，该方法包括将权利要求75的水凝胶装配***施用给动物或人，其中所包含的能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂的浓度高达约1000mg/ml。
77.权利要求76的方法，其中能使生长停滞的、衍生于脂质的生物活性化合物或基因治疗剂占组合物的约40wt％。
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