CN107815470B - 一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法，属于生物医学技术领域；本发明用TAT修饰脂质体作为高效的基因转染载体，将其包载于MMPs敏感肽交联的透明质酸凝胶中，从而构建一种内部包载脂质体的MMPs敏感型的基因活化支架；细胞在迁移和增殖的过程中分泌MMPs，使凝胶降解，一方面为细胞自身的迁移和增殖创造空间，避免凝胶的网状结构成为细胞迁移和增殖的物理屏障，另一方面释放出TAT‑脂质体，对周围细胞进行高效的原位转染，从而表达并分泌生长因子，促进组织修复与再生。

Description

一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法
技术领域
本发明涉及一种组织工程支架的制备方法，尤其涉及一种基质金属蛋白酶敏感的脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
随着医学技术的迅猛发展，利用组织工程技术进行缺损组织和器官的修复与再生已成为一种极具潜力的治疗手段，生长因子是组织工程中应用的重要的细胞营养物质，具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等多方面的生物功能。然而，生长因子多为蛋白类药物，其半衰期比较短，在体内容易失去生物活性，只能在短期内产生效果，此外，生长因子的价格昂贵，治疗成本高昂。
近年来，基因治疗技术的发展及其在组织工程领域的应用为这些问题的解决提供了新的策略。目前，关于GAM的研究热点主要集中于仿生支架的设计以及如何实现高效的DNA转染这两个方面。将编码有生长因子并具有转染能力的DNA融合于生物可降解材料中构建含DNA的生物支架，即基因活化支架(gene-activated matrix，GAM)。将GAM直接植入到组织缺损区，可在植入部位释放DNA并转染附近的细胞。一旦转染成功，细胞将成为生物反应器，持续表达并分泌基因所编码的生长因子，达到对细胞分化和组织再生调控的目的。尽管目前使用的支架材料通常为生物可降解的，但支架的降解速率仍不能与细胞的迁移和增殖同步，限制了细胞在凝胶内的迁移和增殖，同时也使得包裹于支架内的DNA不能有效释放出来转染周围细胞。此外，目前使用的基因转染载体通常是阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺PEI等，但其转染效率较低，进一步限制了GAM的研究与应用。
凝胶是组织工程中常用的支架形式，其交联网络的多孔结构利于细胞的迁移以及活性物质的传递。但是，凝胶支架在为细胞提供生长微环境的同时，也成为了细胞迁移和增殖的物理屏障。尽管组织工程中所用的凝胶材料通常都是生物可降解的，如壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸等，但是在凝胶制备过程中所用的人工合成的聚合物交联剂往往会影响凝胶的生物降解性能，使凝胶的降解速率不能与细胞的迁移和增殖同步，限制了细胞在凝胶内的迁移和增殖。
GAM需要将DNA复合物融合到支架材料中，因而，支架对DNA复合物的负载与有效释放是至关重要的。利用凝胶包载基因实现基因的局部用药已有广泛研究。裸DNA已被成功地包载到胶原、普朗尼克/透明质酸、聚乙二醇、海藻酸钠等材料制备的凝胶中，植入机体后实现了基因原位转染和体内组织修复，但是裸DNA较低的转染效率以及较慢的释放速率限制了它们的应用。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)属于细胞内的蛋白水解酶家族，在组织修复过程中，细胞能够分泌MMPs，它几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，从而为细胞的迁移与增殖提供空间。细胞穿膜肽TAT具有高效的入胞能力，能够迅速破坏内吞体膜，逃逸溶酶体。TAT已经成功携带多种生物活性物质及载体，包括蛋白质、DNA、多肽、纳米粒、脂质体等进行细胞内的传输，是一种新型而高效的药物递送工具。利用TAT修饰聚阳离子脂质体可以实现高效的基因转染。
本发明用TAT修饰脂质体作为高效的基因转染载体，将其包载于MMPs敏感肽(HS-MMP-SH)交联的透明质酸凝胶中，从而构建一种内部包载脂质体的MMPs敏感型的基因活化支架。细胞在迁移和增殖的过程中分泌MMPs，使凝胶降解，一方面为细胞自身的迁移和增殖创造空间，避免凝胶的网状结构成为细胞迁移和增殖的物理屏障，另一方面释放出TAT-脂质体，对周围细胞进行高效的原位转染，从而表达并分泌生长因子，促进组织修复与再生。
发明内容
本发明目的是针对基因活化支架研究现状的不足，提供一种基质金属蛋白酶敏感的脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基质金属蛋白酶敏感的脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)按照阳离子磷脂:胆固醇＝1:0.5～1的摩尔比将两者溶解在适量氯仿中，薄膜分散法制备脂质体，适量HEPES缓冲液(10mM,pH 7.4)水合，经超声和挤压过膜，制备粒径小而分布均匀的阳离子脂质体，4℃保存；
步骤(1)所述阳离子磷脂为(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)。
(2)精确称取一定量鱼精蛋白，溶于HEPES缓冲液(10mM,pH 7.4)中，配成浓度为1mg/mL的鱼精蛋白溶液；将鱼精蛋白和DNA按照0.6～0.8:1(W/W)的比例涡旋混合，室温静置20min制备成鱼精蛋白/DNA纳米复合物；
(3)将步骤(1)所得阳离子脂质体与步骤(2)所得鱼精蛋白/DNA复合物涡旋混合，室温静置30min，即得Liposome-Protamine-DNA复合物(缩写为LPD)。
其中，步骤(3)中所述步骤(1)所得阳离子脂质体与步骤(2)所得鱼精蛋白/DNA纳米复合物的用量为12μmol:1μg。
(4)将步骤(3)所得LPD与不同用量的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-细胞穿膜肽TAT(DSPE-PEG-TAT)涡旋混合(DSPE-PEG-TAT的用量为LPD脂质总量的0％～20％)，50～60℃孵育10min，冷至室温，制备不同含量DSPE-PEG-TAT修饰的LPD(即TAT-LPD)。
(5)称取一定量透明质酸(HA)溶于一定体积去离子水，配成浓度为10mg/mL的HA溶液，按质量比HA:1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC):己二酸二酰肼(ADH)＝0.5:1:9加入EDC和ADH，溶解完全后将体系的pH值调为4.8，室温反应12h，去离子水透析一周(8000～14000MWCO)，冻干，得HA-ADH。
将HA-ADH溶于一定体积HEPES缓冲液(10mM，pH 7.2)中，按质量比HA:N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NHS-AC)＝0.5:0.4加入NHS-AC，反应12h，去离子水透析一周(8000～14000MWCO)，冻干，即得透明质酸-丙烯酸酯(缩写为HA-AC)。
所述溶解透明质酸的去离子水用量与溶解HA-ADH的HEPES缓冲液的用量相同。
(6)按照质量比为3～2:1分别称取一定量HA-AC和MMPs敏感***联剂(HS-MMP-SH多肽，序列为GCRDGPQGIWGQDRCG)，溶于0.3M TEA缓冲液(pH 8.0)中。将步骤(4)所得TAT-LPD与HA-AC和HS-MMP-SH溶液混匀，37℃反应30min成凝胶，即得内部包载TAT-LPD的MMPs敏感性支架。其中HA-AC在整个凝胶中所占比例为2～5％(质量体积浓度)。
优选的，步骤(1)中所制备的阳离子脂质体进行荧光素标记；步骤(2)中制备的鱼精蛋白/DNA复合物用罗丹明标记。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
目前报道和使用的基因活化支架，其降解速率不能与细胞的迁移和增殖同步，限制了细胞在凝胶内的迁移和增殖，同时也使得包裹于支架内的DNA不能有效释放并转染周围细胞。此外，使用的基因转染载体通常是阳离子聚合物PEI，对干细胞的转染效率较低，进一步限制了GAM的研究与应用。
本发明利用细胞穿膜肽TAT修饰聚阳离子脂质体基因载体(TAT-LPD)，TAT具有高效的入胞以及溶酶体逃逸能力，可以提高转染效率；用MMPs敏感性多肽(SH-MMP-SH)作为交联剂制备凝胶，可以使凝胶具有MMPs敏感性降解能力；将TAT-LPD包载到凝胶支架中，一方面利用细胞在迁移和增殖的过程中分泌MMPs，使凝胶降解，为细胞自身的迁移和增殖创造空间，避免凝胶的网状结构成为细胞迁移和增殖的物理屏障，另一方面释放出TAT-LPD，对周围细胞进行高效的原位转染，从而表达并分泌DNA编码的生长因子。这些功能环环相扣、相互促进，为解决目前基因活化支架仿生性能不足、基因难以控释，转染效率低等问题提供切实可行的方法。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有很好的研究与应用前景。
附图说明
图1是实施例4透明质酸(HA)和透明质酸-丙烯酸酯(HA-AC)的1H-NMR图谱。
图2是实施例5中MMPs敏感的脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备示意图。
图3是实施例8中TAT-LPD的透射电镜图片。
图4是实施例8脂质体/凝胶支架的照片(右上角所示)及扫描电子显微镜图片。
图5是实施例9脂质体/凝胶支架在不同释放介质中的释放曲线。
图6是实施例10荧光素(A)和罗丹明(B)双标记脂质体/凝胶支架释放液的激光共聚焦显微镜照片；C为Merge。
图7是实施例11脂质体/凝胶支架体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的显微镜照片，其中A为显微镜下观察结果，B为荧光显微镜下观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：TAT-LPD的制备
首先，制备空白阳离子脂质体。按照DOTAP:胆固醇＝1:1摩尔比将两者溶解在氯仿中，旋转蒸发仪上减压蒸发，除去氯仿，得到脂质薄膜，适量HEPES(10mM,pH 7.4)水合，使最终的脂质浓度为10mM，超声3～5分钟，使用Extruder推脂质体过0.4μm的膜11次，再推脂质体过0.1μm的膜11次制备粒径小而分布均匀的阳离子脂质体，4℃保存，备用。
第二步，制备鱼精蛋白/DNA复合物。精确称取一定量鱼精蛋白，溶于HEPES(10mM,pH 7.4)中，配成浓度为1mg/mL的鱼精蛋白溶液。将鱼精蛋白和绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N1按照质量比为0.6:1涡旋混合，室温静置20min使成鱼精蛋白/DNA纳米复合物。
第三步，将空白阳离子脂质体与鱼精蛋白/DNA复合物涡旋混合(最终采用的比例是DOTAP:鱼精蛋白:DNA＝12μmol:0.6μg:1μg)，室温静置30min，即得LPD。
最后，将LPD与DSPE-PEG-TAT涡旋混合(DSPE-PEG-TAT的用量为LPD脂质总量的10％)，50～60℃孵育10min，冷至室温，即得TAT-LPD。
实施例2：0％DSPE-PEG-TAT修饰LPD的制备
首先，制备空白阳离子脂质体。按照DOTAP:胆固醇＝1:0.5摩尔比将两者溶解在氯仿中，旋转蒸发仪上减压蒸发，除去氯仿，得到脂质薄膜，适量HEPES(10mM,pH 7.4)水合，使最终的脂质浓度为10mM，超声3～5分钟，使用Extruder推脂质体过0.4μm的膜11次，再推脂质体过0.1μm的膜11次制备粒径小而分布均匀的阳离子脂质体，4℃保存，备用。
第二步，制备鱼精蛋白/DNA复合物。精确称取一定量鱼精蛋白，溶于HEPES(10mM,pH 7.4)中，配成浓度为1mg/mL的鱼精蛋白溶液。将鱼精蛋白和绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N1按照质量比为0.8:1涡旋混合，室温静置20min使成鱼精蛋白/DNA纳米复合物。
第三步，将空白阳离子脂质体与鱼精蛋白/DNA复合物涡旋混合(最终采用的比例是DOTAP:鱼精蛋白:DNA＝12μmol:0.6μg:1μg)，室温静置30min，即得LPD。
最后，将LPD于50～60℃孵育10min(即DSPE-PEG-TAT的用量为LPD脂质总量的0％)，冷至室温，即得未进行TAT修饰的LPD。
实施例3：荧光素和罗丹明双标记TAT-LPD的制备
首先，制备荧光素标记的阳离子脂质体。按照DOTAP:胆固醇＝1:1摩尔比将两者溶解在氯仿中，用毛细管蘸取少量荧光素磷脂Fluorescein DHPE(Molecular Probes,USA)溶解到上述氯仿溶液中，混匀，旋转蒸发仪上减压蒸发，除去氯仿，得到脂质薄膜，适量HEPES(10mM,pH 7.4)水合，使最终的脂质浓度为10mM，超声3～5分钟，使用Extruder推脂质体过0.4μm的膜11次，再推脂质体过0.1μm的膜11次制备粒径小而分布均匀的荧光素标记的阳离子脂质体，4℃避光保存，备用。
第二步，制备罗丹明标记的鱼精蛋白/DNA复合物。用Label
Figure GDA0002241094450000051
TM-Rhodamine Kit试剂盒(Mirus,USA)将pEGFP-N1质粒用罗丹明标记。精确称取一定量鱼精蛋白，溶于HEPES(10mM,pH 7.4)中，配成浓度为1mg/mL的鱼精蛋白溶液。将鱼精蛋白和罗丹明标记的pEGFP-N1质粒按照质量比为0.6:1涡旋混合，室温静置20min使成罗丹明标记的鱼精蛋白/DNA纳米复合物。
第三步，将荧光素标记的阳离子脂质体与罗丹明标记的鱼精蛋白/DNA复合物涡旋混合(DOTAP:鱼精蛋白:DNA＝12μmol:0.6μg:1μg)，室温静置30min，即得荧光素和罗丹明双标记LPD。
最后，将荧光素和罗丹明双标记LPD与DSPE-PEG-TAT涡旋混合(DSPE-PEG-TAT的用量为LPD脂质总量的10％)，50～60℃孵育10min，冷至室温，即得荧光素和罗丹明双标记TAT-LPD。
实施例4：透明质酸-丙烯酸酯(HA-AC)的合成
称取0.5g透明质酸(HA，42kDa MW)溶于50mL去离子水，加入1g EDC和9g ADH，溶解完全后将体系的pH值调为4.8，室温反应12h，去离子水透析一周(8000～14000MWCO)，冻干，得HA-ADH。将HA-ADH溶于50mL HEPES缓冲液(10mM，pH 7.2)中，加入0.4gNHS-AC，反应12h，去离子水透析一周(8000～14000MWCO)，冻干，即得HA-AC。HA及HA-AC的核磁共振图谱见附图1。由图可知，相比于HA，HA-AC在δ＝6.2有明显的多重峰，这应归属于丙烯酸酯基团中的顺式(cis)和反式(trans)氢，1H-NMR结果表明丙烯酸酯已成功连接在透明质酸骨架上。
实施例5：脂质体/凝胶复合支架的制备
称取20mg HA-AC，溶于300μL 0.3M TEA缓冲液(pH 8.0)中，按实施例1的方法制备含15μgpEGFP-N1质粒的TAT-LPD。称取7mg HS-MMP-SH，溶于30μL 0.3M TEA缓冲液(pH 8.0)中。将TAT-LPD和HS-MMP-SH溶液均加入HA溶液中，补充适量TEA缓冲液使体系的最终体积为500μL，混匀，37℃反应30min成凝胶，即得负载TAT-LPD的MMPs敏感型凝胶支架。制备示意图见附图2。
实施例6：脂质体/凝胶复合支架的制备
称取20mg HA-AC，溶于300μL 0.3M TEA缓冲液(pH 8.0)中，按实施例1的方法制备含15μg pEGFP-N1质粒的TAT-LPD。称取10mg HS-MMP-SH，溶于30μL 0.3M TEA缓冲液(pH8.0)中。将TAT-LPD和HS-MMP-SH溶液均加入HA溶液中，补充适量TEA缓冲液使体系的最终体积为500μL，混匀，37℃反应30min成凝胶，即得负载TAT-LPD的MMPs敏感型凝胶支架。
实施例7：荧光素和罗丹明双标记脂质体/凝胶复合支架的制备
称取20mg HA-AC，溶于300μL 0.3M TEA缓冲液(pH 8.0)中，按实施例3的方法制备荧光素和罗丹明双标记TAT-LPD。称取7mg HS-MMP-SH，溶于30μL 0.3M TEA缓冲液(pH 8.0)中。将实施例3制备的荧光标记TAT-LPD和HS-MMP-SH溶液均加入HA溶液中，补充适量TEA缓冲液使体系的最终体积为500μL，混匀，37℃反应30min成凝胶，即得负载荧光标记TAT-LPD的MMPs敏感型凝胶支架。
实施例8：TAT-LPD以及脂质体/凝胶支架的表征
(1)TAT-LPD的粒径与电位
将实施例1制备的鱼精蛋白/DNA复合物和TAT-LPD，用纳米粒径电位分析仪(ZetasizerNano ZS90,Malvern Instrument,UK)测定其粒径分布与电位，结果见表1。结果表明，DOTAP脂质体能够与负电性的鱼精蛋白/DNA复合物结合，从而完成对DNA的压缩，使电位发生反转，粒径变小；由于PEG的空间位阻与屏蔽作用，TAT-LPD粒径稍微增大，电位减小。
进一步说明，鱼精蛋白/DNA复合物原本为负电性的，与DOTAP磷脂孵育后变成正电性，说明DOTAP脂质体成功地包裹在鱼精蛋白/DNA表面，完成了LPD的制备。加入DSPE-PEG-TAT后电位减少，粒径变大，这些都是PEG修饰的典型特征，表明DSPE-PEG-TAT成功锚定在LPD表面，从而证明TAT-LPD的构建是成功的。
表1.实施例1制备的基因载体的粒径与电位
Figure GDA0002241094450000071
(2)TAT-LPD的形态学观察
将实施例1制备的TAT-LPD悬液滴于含有碳膜的铜网上，自然干燥，醋酸双氧铀负染15s，透射电子显微镜(Tecnai 12,Philips,Netherlands)下观察粒子的大小和形态，结果见附图3，可见制备的TAT-LPD具有较好的分散性，粒径在200nm左右，与粒径测定结果一致。
(3)脂质体/凝胶支架的形态学观察
将实施例5制备的脂质体/凝胶支架置于洁净台面上，相机拍摄，结果见附图4(右上角)，可见支架呈透明的半固体状；将实施例5制备的脂质体/凝胶支架冷冻干燥，置于载物台上，喷金，采用扫描电子显微镜(SIRION,FEI,Netherlands)进行观察，结果见附图4，具有凝胶典型的相互交联和多孔结构。
实施例9：脂质体/凝胶支架的MMPs敏感性释放研究
配制两种释放介质：PBS缓冲液(pH 7.4)和PBS缓冲液(pH 7.4，含0.5U·mL-1胶原酶)。将实施例5制备的脂质体/凝胶支架分别浸泡在1mL上述两种不同的释放介质中，置于37℃恒温振荡箱中，于不同时间点取出释放液800μL，并补充新鲜释放介质。
将各时间点取出的释放液分别取50μL置于2mL EP管中，每管加入50μL预先配制的含有肝素(10mg·mL-1)和1％Triton的TE缓冲液，涡旋混匀，放置15min，使DNA与磷脂及鱼精蛋白充分分离，然后用PicoGreen dsDNA定量试剂盒检测各个时间点DNA的释放情况，绘制释放曲线。结果见附图5。
结果表明，PBS缓冲液体系中DNA的释放呈现明显的缓释行为，这是由于凝胶的包载作用；相反，PBS缓冲液(含0.5U·mL-1胶原酶)中DNA的释放明显快于PBS缓冲液，表明该支架具有明显的MMPs敏感性。
实施例10：脂质体/凝胶支架释放液中DNA存在形式考察
将实施例7制备的荧光素和罗丹明双标记脂质体/凝胶支架浸泡在1mLPBS缓冲液(pH 7.4，含0.5U·mL-1胶原酶)中，37℃恒温振荡12h，取适量释放液滴于载玻片上，立即用盖玻片封片，用激光共聚焦显微镜(TCS SP5II,Leica,Germany)观察。结果见附图6。
由图可见，释放液中仍然存在大量罗丹明标记的DNA(红色)，并且呈颗粒状分布，表明DNA能从支架中释放出来，并且释放的DNA仍以纳米粒的形式存在；此外，还能看到明显的绿色颗粒(荧光素标记的脂质体)，并且大部分绿色颗粒与红色颗粒重合，说明释放后脂质体仍然包裹在鱼精蛋白/DNA复合物表面，即仍以TAT-LPD的形式存在，这将为以后的细胞转染研究奠定基础。
实施例11：脂质体/凝胶支架体外转染能力的评价
取生长旺盛的第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs，齐氏生物科技有限公司)，弃去培养基，胰蛋白酶消化，轻轻吹打细胞至完全脱落并分散后，离心弃去上清液，加适量培养液吹散所得细胞。按照1×105细胞/孔接种于24孔板，加不含抗生素的完全培养基(10％胎牛血清+LG-DMEM培养液)，于37℃、5％二氧化碳环境下培养。次日，待贴壁后，换不含抗生素的完全培养基，于每孔加入实施例5制备的支架，37℃、5％二氧化碳环境下继续培养3天，弃去培养基并去除支架，于荧光显微镜下观察。结果见附图7。
结果显示，转染3天去除支架后，显微镜下观察可见细胞呈单层贴壁生长，形态呈典型多角形细胞，细胞生长状态良好(图7A)。荧光显微镜下观察到部分细胞呈现绿色(图7B)，说明有绿色荧光蛋白EGFP的表达，表明从支架中释放的DNA粒子能够对周围细胞进行转染，使细胞表达DNA所编码的蛋白。

Claims (10)

1.一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）将阳离子磷脂和胆固醇溶解在适量氯仿中，薄膜分散法制备脂质体，适量HEPES缓冲液水合，经超声和挤压过膜，制备粒径小而分布均匀的阳离子脂质体，4℃保存；
（2）精确称取一定量鱼精蛋白，溶于HEPES缓冲液中，配成鱼精蛋白溶液；将鱼精蛋白和DNA涡旋混合，室温静置后制备成鱼精蛋白/DNA纳米复合物；
（3）将步骤（1）所得阳离子脂质体与步骤（2）所得鱼精蛋白/DNA复合物涡旋混合，室温静置，即得脂质体-鱼精蛋白-DNA（Liposome-Protamine-DNA）复合物，缩写为LPD；
（4）将步骤（3）所得LPD与不同用量的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-细胞穿膜肽TAT（DSPE-PEG-TAT）涡旋混合，孵育后，冷至室温，制备不同含量DSPE-PEG-TAT修饰的LPD，即TAT-LPD；
（5）称取一定量透明质酸（HA）溶于一定体积去离子水，配成HA溶液，然后加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺（EDC）和己二酸二酰肼（ADH），溶解完全后调节混合溶液体系的pH值，室温反应后，去离子水透析一周，冻干，得HA-ADH；
将HA-ADH溶于一定体积 HEPES缓冲液中，加入N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NHS-AC），反应后，去离子水透析一周，冻干，即得透明质酸-丙烯酸酯，缩写为HA-AC；
（6）分别称取一定量HA-AC和基质金属蛋白酶（MMPs）敏感***联剂HS-MMP-SH，溶于0.3M pH8.0 的TEA 缓冲液中；将步骤（4）所得TAT-LPD与HA-AC和HS-MMP-SH溶液混匀，反应一段时间后成凝胶，即得内部包载TAT-LPD的MMPs敏感性支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述阳离子磷脂为(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺（DOTAP）；
所述阳离子磷脂:胆固醇的摩尔比为1:0.5-1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述鱼精蛋白溶液的浓度为1 mg/mL；所述鱼精蛋白和DNA的质量比为0.6～0.8:1（W/W）；所述静置20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中，步骤（3）中所述阳离子脂质体与鱼精蛋白/DNA纳米复合物的用量为 12μmol: 1μg；所述静置30min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述DSPE-PEG-TAT的用量为LPD脂质总量的0%～20%；所述孵育为50～60℃孵育10min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述溶解透明质酸的去离子水用量与溶解HA-ADH的HEPES缓冲液的用量相同；
所述HA溶液浓度为10 mg/mL；所述HA、EDC和ADH的质量比为0.5:1:9；所述调节混合溶液体系的pH为4.8；所述室温反应时间为12h；
所述HA与NHS-AC的质量比为0.5:0.4；所述反应时间为12h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中所述HA-AC和HS-MMP-SH的质量比为3～2:1；所述反应为37℃反应30 min；
其中HA-AC在整个凝胶中所占比例为2～5%（质量体积浓度）。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所制备的阳离子脂质体进行荧光素标记；步骤（2）中制备的鱼精蛋白/DNA复合物用罗丹明标记。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架，其特征在于，所述支架呈透明的半固体状；具有凝胶典型的相互交联和多孔结构。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的一种脂质体/凝胶复合型基因活化支架在基因转染载体中的非治疗目的的应用。
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