KR20030085522A

KR20030085522A - 고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈을 갖는 담체

Info

Publication number: KR20030085522A
Application number: KR10-2003-7009899A
Authority: KR
Inventors: 다그마 스티메더
Original assignee: 니코메드 파르마 에이에스
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2003-11-05
Also published as: BG108123A; DE60207389D1; HUP0303893A3; IL157095A; BR0206705B1; CZ20032199A3; BG66439B1; AR032400A1; UA73028C2; JP4535678B2; JP2007190399A; BRPI0206708B8; NZ527167A; NO20033295D0; BG108121A; CN1246047C; KR100847417B1; CZ305120B6; WO2002058750A3; WO2002070594A3

Abstract

본 발명은

a) 다음 물리적 성질: 5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈, 1 내지 10 mg/cm³의 밀도, 0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 담체,

상기 담체에 균일하게 배치되고 고정된,

b) 고형 피브리노겐, 및

c) 고형 트롬빈을 주성분으로 하는, 조직 접합, 조직 봉합 및 지혈에 유용한 고체 조성물에 관한 것이다. 상기 담체는 폴리히알루론산, 폴리히드록시산, 예를 들면 젖산, 글루콜산, 히드록시부탄산, 셀룰로오스, 젤라틴, 또는 콜라겐 I형 섬유로 주로 구성된 콜라겐 스펀지와 같은 콜라겐 스펀지 등의 콜라겐과 같은 생분해성 중합체이다. 피브리노겐 및 트롬빈은 바람직하게는 인간의, 천연 공급원으로부터 정제된, 또는 형질전환 또는 재조합 인간 피브리노겐 및/또는 트롬빈이다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 아프로티닌, ε-아미노카프로산 또는 α2-안티플라스민과 같은 항섬유소용해제(antifibronolytic agent)를 함유하지 않는다.

Description

고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈을 갖는 담체 {Carrier with Solid Fibrinogen and Solid Thrombin}

응집 캐스케이드의 마지막 단계와 유사한 시판되는 피브린 접착물질은 외상이 존재하는 곳에 적용하기 전에 트롬빈 용액과 혼합하게 되어 있는 고농도의 피브리노겐 용액으로 구성된다. 상기 혼합물은 피브린분해 효소 플라스민에 의해 피브린 응혈의 때이른 용해를 방지하기 위해 예를 들면 아프로티닌 또는 s-아미노카프로산 같은 피브린분해 저해제를 함유한다. 상기 2-성분 피브린 접착물질은 다양한 외과적 처치에서 가치가 있지만 출혈이 심할 경우 지혈이 일어나기 전에 씻겨져 버릴 수 있다. 2-성분 피브린 접착물질은 또한 해동 또는 용해를 포함하는 약간의 준비 단계를 필요로 한다. 따라서 이들은 작업을 하기에 비실용적이고 귀찮으며, 상기 피브린 접착물질을 성공적으로 사용하려면 경험이 필요하다.

지난 10년 동안 많은 피브린 봉합물질이 많은 외과적 징후에서 선택의 방법이 되었다. 그러나 피브린 접착물질을 사용한 시도의 대부분에서 지혈 및 접착 성질을 개선하기 위해 콜라겐 조각(fleece)을 추가로 사용하였고, 그것의 단점과 외과의사들에 의해 제한된 사용의 결과가 나타났다.

콜라겐은 60년 대 후반부터 지혈제로 사용되어 왔다. 콜라겐은 모든 포유동물에서 가장 빈번히 나타나는 구조 단백질이다. 약 300 kDa의 단량체 단백질(트로포콜라겐)이 특정 부위에서 공유결합으로 가교되어 있다. 따라서 성숙한 단백질은 불용성이며 높은 인장 강도를 갖는 특징적인 세섬유(fibril)를 형성한다. 수많은 콜라겐의 부류가 개시되었고, 그 중 가장 흔한 것이 피부, 힘줄, 골격 및 각막의 주요 콜라겐 유형인 콜라겐 I형이다. 콜라겐은 약 290 nm의 길이를 갖는 삼중 나선으로 이루어진 섬유성 단백질이다. 이들 삼중 나선(트로포콜라겐 분자)의 다섯 개가 엇갈려서 직경이 약 3.6 nm인 미세섬유(microfibril)를 형성한다. 이들 미세섬유는 특이적 세섬유 사이 및 세섬유 내의 상호작용에 대하여 바로 이용할 수 있는 극성 및 비극성 단편을 갖는다. 미세섬유는 사각형 격자 내로 채워져 약 30 nm의 직경을 갖는 부섬유(subfibril)를 형성한다. 상기 부섬유들이 연결 조직의 기본 단위인 콜라겐 세섬유로 조립되며, 이것은 수백 nm의 직경을 가지므로 광학 현미경으로 보면 가는 선으로 보인다.

콜라겐은 가능하면 피브린 접착물질을 함유하는 피복과 함께, 상처를 봉합하기 위한 재료로 사용될 수 있다. 피브린 접착물질, 즉 피브리노겐, 트롬빈 및 아프로티닌의 조합은 조직과 신경을 접착시키고 출혈이 적은 경우의 표면을 봉합하는 치료에 성공적으로 사용되어 왔다. 피브린 접착물질의 한 단점은 출혈이 많을 경우에 피브린의 충분한 중합반응이 일어나기 전에 상기 접착물질이 일반적으로 씻겨 나간다는 점이었다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서 외과의사들은 콜라겐 조각과 같은 흡수성 담체에 액체 피브린 접착물질을 수동으로 도포하기 시작했다.

상기 조합된 적용의 감동적인 성공에도 불구하고, 이 방법은 몇 가지 단점으로 인하여 넓은 규모로 응용되지 못하였다. 제조하기가 비교적 불편하였고, 상기 방법은 경험과 숙련된 사람을 필요로 하였으며, 응급 상황에서는 그 제조가 쉽게 가능하지 못하였고 준비하는 시간이 10 내지 15 분 가량 걸렸다. 이러한 요인들이 개선된 제품의 개발을 자극하였고, 결과적으로 EP 0 059 265에 개시된 것과 같은 고형 피브리노겐, 고형 트롬빈 및 고형 아프로티닌의 피복으로 덮인 콜라겐 담체의 고정된 조합의 개발을 이끌었다.

EP 0 059 265에 개시된 콜라겐 담체의 기능은 주로 그것이 피복된 응집 제제를 흡착하고 그것에 기계적 안정성을 부여하는 담체의 기능이다.

피브린 접착물질의 지혈 특성과 콜라겐의 담체로서의 장점을 조합하는 제품이 개발되어 상표명 타코콤 (TachoComb)^(R)으로 생산되었다. 타코콤^(R)은 바로 사용하게 되어 있고, 다음과 같은 피브린 접착물질의 활성성분으로 피복된 콜라겐 패치의 쉽게 적용가능한 고정된 조합이다: 인간의 피브리노겐, 소의 트롬빈 및 소의 아프로티닌.

타코콤^(R)은 니코메드 파르마(Nycomed Pharma)에 의해 1990년대 초부터 시판되었고 유럽에서 2500 명이 넘는 환자에게 임상적 처치로 사용되었다. 또한 이 제품은 간 및 폐 절제, 담즙관, 비장, 신장 및 췌장 외과 수술, ENT 외과수술, 부인과 수술 및 혈관 수술과 같은 많은 다양한 경우에 있어서 일본 임상 프로그램의 700 명이 넘는 환자에게도 사용되었다. 타코콤^(R)은 효과적이고 안전한 것으로 알려졌다.

타코콤^(R)의 사용과 관련하여, 수행된 임상적 처치의 과정에서 임상적인 부작용이 보고된 것은 없다. 그러나 아프로티닌에 대한 항체가 일본 연구의 세 경우에 나타났다.

수천의 타코콤^(R)패치를 임상적으로 사용한 수년 간 단지 총 37 건의 자발적인 의약 부작용(ADR)이 보고되었다. 이들 ADR의 16 건은 타코콤^(R)성분에 대한 반응(열, 발열, 호산 백혈구 증가증, 연장된 프로트롬빈 시간, 과민증, 면역 또는 알레르기 반응)에 이론적으로 관련된 것일 수 있었다. 하나의 ADR(면역 반응)은 타코콤^(R)의 처치와 분명하게 관련된 것이었다.

WO 97/37694(Immuno France S.A.)에는 참고예 4에서 콜라겐 제품 또는 타코콤^(R)이 사용될 경우, 타코콤^(R)을 사용한 경우에는 죽음에 이르는 출혈이 지혈되지 않은 반면, 콜라겐 제품이 WO 97/37694에 따라 제조된 트롬빈 함량 없이 제조된 경우에는 5 분 내에 지혈되었음이 개시되어 있다.

WO 96/40033에는 타코콤^(R)에 사용된 소의 트롬빈의 단점이 강조된 바, 소나 다른 종의 트롬빈의 사용은 해로운 바이러스 오염 및 가능한 소의 질병, 예를 들면 광우병(bovine spongiform encephalitis)의 전이를 가져올 수 있다는 것이다.

본 발명은 피브린 접착물질(glue), 인간 피브리노겐 및 인간 트롬빈의 고체로 고정된 인간의 성분들로 피복된 담체로 주로 구성된, 조직 접합, 조직 봉합 및 지혈을 위한 즉시 사용할 수 있는 흡수성 조성물에 관한 것이다. 상기 고정된 조합물은 예를 들면 상처 표면에 직접 적용될 수 있다. 혈액, 체액 또는 생리적 식염수와 접촉하게 되면, 이 시스템의 메카니즘은, 트롬빈이 피브리노겐의 피브린으로의 변환 및 인자 XIII의 XIIIa로의 활성화를 촉매하는 응집 캐스케이드의 마지막 단계와 유사하다. 인자 XIIIa는 일단 형성되면 공유결합적 가교에 의해 피브린 응혈을 안정화한다.

2성분 접착제와 같이, 상처 표면과 담체는 중합반응에 의해 한데 접합된다. 약 3 내지 5 분 동안 계속되는 이 과정에서, 본 발명의 조성물은 상처 영역 위에 압착되는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물의 성분들은 적용 후 약 4 내지 6 개월 내에 효소 분해된다.

도면의 범례

도 1

1.1 Opraskin^(R): 피복되지 않은/ 피복된

1.2 피복된 Opraskin^(R): 내시경 장치 내로 삽입

1.3 피복된 Opraskin^(R): 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

도 2

2.1 Willospon^(R)포르테: 피복되지 않은/ 피복된

2.2 피복된 Willospon^(R)포르테: 내시경 장치 내로 삽입

2.3 피복된 Willospon^(R)포르테: 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

도 3

3.1 Willospon^(R)Spezial: 피복되지 않은/ 피복된

3.2 피복된 Willospon^(R)Spezial: 내시경 장치 내로 삽입

3.3 피복된 Willospon^(R)Spezial: 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

도 4

4.1 Ethisorb^(R)패치: 피복되지 않은/ 피복된

4.2 Ethisorb^(R)패치: 내시경 장치 내로 삽입

4.3 Ethisorb^(R)패치: 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

도 5

5.1 Tabotamp^(R)NU Knit: 피복되지 않은/ 피복된

5.2 피복된 Tabotamp^(R)NU Knit: 내시경 장치 내로 삽입

5.3 피복된 Tabotamp^(R)NU Knit: 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

도 6

6.1 스펀지 Nicomed: 피복되지 않은/ 피복된 [실험실 시료]

6.2 피복된 스펀지 Nycomed [실험실 시료]: 내시경 장치 내로 삽입

6.3 피복된 콜라겐 스펀지 Nycomed [실험실 시료]: 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

6.3 피복된 콜라겐 스펀지 Nycomed [제조 시료= 타코콤^(R)]: 내시경 장치 내로 삽입 후 펼침

도 7

내시경 장치: Endodock^(R)

도 8

혈액 응집 및 응혈의 붕해 및 담체 패치. 담체 피복의 활성 성분은 회색의 그늘진 칸으로 나타냄.

본 발명은 a) 다음 물리적 성질:

5 내지 100 N/cm, 예를 들면 10 내지 50 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³, 예를 들면 2 내지 7 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 담체, 및

상기 담체 상에 균일하게 분포되고 고정된,

b) 고형 피브리노겐, 및

c) 트롬빈을 주성분으로 하는 고체 조성물에 관한 것이다

조성물은 상기 언급된 물리적 성질의 둘, 셋 또는 모두를 가질 수도 있다. 현재 바람직한 구현예에서, 담체 재료는 DK PA 2001 00135에 기재된 것과 같이 제조되고, 상기 출원으로부터 우선권을 주장하여 2002년 1월 25일에 니코메드 파르마 AS에 의해 출원된 발명의 명칭이 "콜라겐 스펀지의 제조 방법, 콜라겐 발포체 및 신장된 콜라겐 스펀지의 부분을 추출하는 장치"인 출원에도 기재되어 있다. 본 명세서에서 "챔버 직경"이라는 용어는 챔버에서 가장 큰 직선의 벽 간 거리, 즉 챔버의 가장 큰 대각선 직선 거리로 이해되어야 한다. 챔버는 팔각형 같은 다각형의 형태일 수 있다. 즉 담체를 자를 경우, 챔버는 나뉘어지고 공동으로 잘라지게 된다. 고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈은 담체에 고정되고 그 대부분은 공동에 존재하여, 고형 트롬빈 및 고형 피브리노겐의 실질적으로 균일한 분포를 제공한다. 이러한 분포와 고정으로 인하여, 트롬빈 및 피브리노겐의 액체 조성물이 예를 들면 재료 상에 적가 또는 분무되는 경우와는 대조적으로, 상당한 양의 피브리노겐 및 트롬빈을 담체 상에 도입할 수 있다.

<피복된 담체의 제조>

피복된 담체의 제조는

- 활성 성분의 현탁액 제조

- 현탁액의 담체에의 고른 분포

- 피복된 담체를 고체 조성물이 되도록 건조 / 활성 성분의 담체로의 고정으로 주로 이루어진다.

피브리노겐 및 트롬빈을 갖는 현탁액의 제조는

- 피브리노겐과 에탄올 등의 알콜을 함유하는 피브리노겐 혼합물의 제공

- 트롬빈과 에탄올 등의 알콜을 함유하는 트롬빈 혼합물의 제공

- 피브리노겐 혼합물과 트롬빈 혼합물을 혼합하여 상기 현탁액을 수득하는 것을 포함한다.

혼합물을 제공하는 단계에서, 혼합물을 균질화 또는 체질하여 25 내지 100 μm의 포크 워드(Folk Ward) 평균 입자 직경을 갖는 피브리노겐 및 트롬빈 입자를 함유하는 현탁액을 수득할 수 있다. 온도는 0 내지 12℃이다.

담체는 콜라겐 스펀지와 같은 콜라겐 담체일 수 있다. 콜라겐 스펀지는 다음 기준의 적어도 하나, 바람직하게는 둘 이상을 만족시킬 것이다:

- 5.0 내지 6.0의 pH 값,

- 5% 이하의 젖산 함량,

- 0.5% 이하의 암모늄 함량,

- 0.5% 이하의, 알부민 함량으로 계산한 가용성 단백질 함량,

- 1.0% 이하의 황산염 회분 함량,

- 20 ppm 이하의 중금속 함량,

- 10³CFU/g 이하의 미생물학적 순도,

- 75 내지 100%의 콜라겐 함량,

- 1 내지 10 mg/cm³의 밀도

- 5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈.

현재의 바람직한 구현예에서, 콜라겐 담체는 DK PA 2001 00135에 기재된 대로 제조되었다. 콜라겐 담체의 세가지 예의 물리적 성질을 다음 표에 제공한다:

실시예	I	II	III
pH 값	5.3	5.1	5.4
젖산 함량	2.3%	2.8%	2%
암모늄 함량	0.1%	0.2%	0.1%
가용성 단백질 함량	0.04%	0.05%	0.08%
황산염 회분 함량	0.3%	0.3%	0.3%
미생물학적 순도(CFU/g)	< 12-345	< 18-124	< 11-33
콜라겐 함량(건조 질량)	95%	95%	98%
수분 함량	14%	15%	16%
탄성 모듈	10.4-42.1 N/cm	15-50 N/cm	12.3-41.0 N/cm
세공 크기(직경, 평균값)	2.9 mm	2.1 mm	2.9 mm
밀도	2.9-5.3 mg/cm³	2.9-5.9mg/cm³	2.4-5.0 mg/cm³

현탁액의 균일한 분포는 미국 특허 제 5,942,278 호 및 6,177,126 호에 개시된 것과 같은 장치 상의 적하(drip-on-device)를 이용하여 수행되거나, 담체 상에 현탁액을 도포하기 위해 적어도 하나의 분출구(jet)를 포함하는 도포기를 이용할 수 있다. 분출 도포기는 담체와 분출구가 서로에 대하여 상대적으로 움직이면서 현탁액을 분출구를 통해 밀어낸다. 도포기는 컨베이어 벨트, 펌프 또는 펌프의 시스템이나 다른 공급 장치에 연결된 교반 단위, 및 횡단하여 움직이는, 예를 들면 컨베이어 벨트에 직각인 분사장치 또는 분사장치 시스템를 포함하거나 그 근처에 배치된다. 매질의 특이적 성질에 따라, 분사장치 또는 분사장치 시스템은 다양한 형태 및 크기를 가질 수 있다. 분사장치 또는 분사장치 시스템은 관을 통하여 공급 장치에 연결될 수 있다. 공급 장치는 교반 단위로부터 피복 매질을 분사장치 시스템으로 진행시킬 수 있다. 피복 공정 도중, 분사장치 시스템은 담체를 가로질러 움직일 수도 있다. 분사장치 시스템은 그 대기 위치에서 컨베이어 벨트의 한쪽을 지탱할 수 있다. 피복 공정은 컨베이어 벨트 상에 담체의 존재를 감지하는 광 장벽에 의해 개시될 수 있고, 비슷한 방식으로 광 장벽 신호에 의해 중지될 수 있다. 이러한 도포기는 비교적 작은 무효 부피를 부여하며 청소를 포함한 취급이 용이하다. 또한, 상기 도포기는 하시라도 피복 공정을 중단시킬 수 있는 가능성을 제공하고 비교적 넓은 범위의 점도에서 도포가 가능하며, 균질의 피복을 부여한다.

두 시스템 모두 담체 cm²당 0.08 ml 내지 0.12 ml 부피의 현탁액을 도포한다.

중요한 단계는 담체의 피복 표면 상에 습윤 피복으로 적용된 피브리노겐, 트롬빈 및 알코올의 현탁액을 건조시키는 것이다. 방법의 한 예를 들면, 피복된 담체에 1000 mbar 미만의 압력을 가하여 담체 상에 건조된 피복 표면을 수득하고, 상기 건조된 피복을 피복 표면에 고정시키는 것을 포함한다. 진공을 적용하고 건조 공정에 진공을 사용하여, 낮은 온도(2 내지 10 ℃) 및 높은 상대 습도(80 내지 95%)를 유지함으로써 담체, 특히, 콜라겐 스펀지 같은 콜라겐 형태의 담체의 구조 및 물리적 성질, 및 피브리노겐 및 트롬빈의 구조 및 물리적 성질을 유지할 수 있다.

"주성분으로 하는"이라는 용어는 세가지 성분이 본 발명에 모두 필수 불가결하다는 의미이다. 그러나 칼슘 이온 및 리보플라빈 같은 착색 표시제 등 필수적이지 않은 첨가제도 조성물에 존재할 수 있다. 조성물은 또한 예를 들면 항균제 또는 항사상균제 및 항종양제 등의 항생제로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 1종 이상의 약제학적 활성 물질 등의 기타 유용한 첨가제를 더 함유할 수 있다.

담체 물질은 포유동물의, 형질전환 (transgenic) 또는 재조합의 공급원으로부터 얻어진 콜라겐 I형의 물질을 포함하는 콜라겐 스펀지가 바람직하지만, 다른 종류의 콜라겐, 즉 I, II, III, IV, VII 및 X형의 콜라겐을 이용하여 제조될 수도 있다. 그러나 담체는 폴리히알루론산, 폴리히드록시 산, 예를 들면 젖산, 글루콜산, 히드록시부탄산, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등의 생분해성 중합체일 수도 있음이 나타났다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 조성물은 피브리노겐이 2 내지 10 mg/cm², 예를 들면 4.3 내지 6.7 mg/cm², 바람직하게는 약 5.5 mg/cm²의 양으로 존재하고, 트롬빈이 1.0 내지 5.5 IU/cm², 바람직하게는 약 2.0 IU/cm²의 양으로 존재하는 하나 이상의 활성 측면을 갖는 담체를 포함한다. 피브리노겐 및/또는 트롬빈은 바람직하게는 인간의, 예를 들면 당업자에게 공지된 방법에 의해 천연 공급원에서 정제되거나, 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조된 형질전환 또는 재조합 인간 피브리노겐 및/또는 트롬빈이다.

타코콤^(R), 베리플라스트 (Beriplast)^(R)및 티슈실 (TissueSeal)^(R)과 같은 종래 기술의 제품들은 모두 아프로티닌 또는 유사한 항섬유소용해제를 포함한다. 아프로티닌은 소의 근원에서만 제공될 수 있다. 본 발명의 목적은 개선된 담체 재료, 및 인간, 재조합 또는 형질전환 근원의 성분 만으로 된 조성물을 개발하는 것이었다. 따라서, 담체 재료에 관한 개발이 이루어졌고, 소의 트롬빈을 인간 트롬빈으로 대체하며 아프로티닌을 배제할 수 있는지가 연구되었다. 본 발명자들은 두 단계 공정을 통하여 상기 목적을 향해 연구하였다.

제일 먼저, 타코콤 H가 타코콤^(R)의 후속 제품으로서, 예를 들면 소의 트롬빈을 인간 트롬빈으로 대체하여 개발되었다. 타코콤 H의 임상적 경험이 지혈, 조직 접합 및 조직 봉합의 경우에 다수의 치료적 확증(IIIa 단계)의 임상적 시도와 관련하여 수행되었다. 이 연구에 있어서 아직 발행되지 않은 결과들이 타코콤 H의 혈액 및 공기 누수의 제어에서의 효능과 안전성을 확인하였고, 따라서 외과 수술 도중 지혈, 조직 접합 및 조직 봉합에서 꿰매는 것에 보조 요법으로 작용한다. 특히, 타코콤 H의 국소적 지혈 효능은 대조예에 비하여 지혈 시간의 현저한 감소로 표현되어 혈관 및 간 수술에서도 유사하게 확신있게 나타났다.

또한, 타코콤 H는 공기 누수의 보다 빠른 해결을 초래하여 폐 결함의 크기를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났으므로, 심각한 폐의 누수 및 폐기종의 봉합에 유용할 것이다.

그러나 타코콤^(R)및 타코콤 H는 모두 제품의 필수 부분으로서 아프로티닌을 함유한다. 아프로티닌은 피브리노겐 성분 중 소량의 플라스미노겐의 플라스민으로의 가능한 변환을 저해하여 피브린 응혈, 특히 과피브린분해 조건 하에서 상기 응혈의 미숙한 분해를 방지하는 데 필요한 것으로 생각된다.

본 발명자들은 아프로티닌이 필수적이라는 상기 가설을 시험하기 위해 새로운 실험을 고안하였다. 생체외 실험은 응혈 중 아프로티닌의 항섬유소용해 방지를 나타내었고, 아프로티닌이 없는 타코콤^(R)(타코콤 S)은 매우 짧은 시간 내에 용해되지 않았음을 나타내었다. 따라서 스트레스가 많은 동물 모델을 고안하여 유사한 효능을 입증하기 위해 타코콤 S를 타코콤 H와 비교하였다. 모든 모델에서 타코콤 H 또는 S 는 각각 유일한 지혈 수단으로 사용되었다.

네 가지 광범한 실험 시리즈가 본 발명의 바람직한 구현예인 타코콤 S의 타코콤 H에 비교한 효능과 조직병리학적 패턴을 연구하기 위해 수행되었다. 타코콤 S 또는 타코콤 H를 개, 돼지 또는 토끼의 간, 지라, 췌장 또는 뇌/뇌막의 기관에 적용하였다. 상기 실험은 통상의 외과수술 조건, 심하게 스트레스가 많은 조건 및 과피브린분해 조건에 유사한 방식으로 고안되었다.

상기 네가지 연구에서 수득된 결과는 타코콤 S 와 타코콤 H의 사이에 어떠한 관련된 차이를 나타내지 않았다. 두 제품 모두 증가된 기관내 압력 또는 국소 r-tPA 적용에 의해 유도된 과피브린분해 같은 심하게 스트레스가 많은 조건을 포함하는 지혈 및 상처 봉합 효능에 관련하여 유사하게 작용하였다.

타코콤 H의 한 성분으로서 아프로티닌의 전반적인 필요성을 평가하기 위해 고안된 예비임상적 프로그램은 타코콤 H 와 타코콤 S의 효능이 유사함을 입증한 것으로 결론지을 수 있다. 두 제품 모두 모든 실험 조건 하에 지혈, 조직 접합 및 조직 봉합의 유일한 수단으로 성공적으로 사용되었다. 동물 실험의 과정에서, 바람직하지 못한 조직 반응은 없었다. 결과적으로, 아프로티닌은 본 발명의 조성물로부터 제거되었다.

본 발명의 조성물은 종래 사용되던 것과 동일한 지혈, 조직 접합 및 조직 봉합 성질을 가지며 동일하거나 심지어는 더 만족스러운 안전성 프로필을 갖는 것으로 임상적으로 기대된다. 현재로서는 오직 소에서만 입수가능한 아프로티닌의 부재는 과민 반응에 대한 안전성을 더해준다. 이와 관련해서, 세 가지 일본의 연구에서 나타난 아프로티닌에 대한 항체를 주목해야 한다. 아프로티닌이 없는 조성물에서는 이러한 면역 반응이 관여하지 않는다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 다음 물성:

5 내지 100 N/cm, 예를 들면 10 내지 50 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³, 예를 들면 2 내지 7 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 유연성 담체를 포함하며,

고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈을 더 포함하고,

아프로티닌, ε-아미노카프로산 또는 α2-안티플라스민 등의 항섬유소용해제를 포함하지 않으며,

상기 고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈은, 피복된 재료의 시료가 약 1000 rpm의 진동수에서 2 분 동안 Vibrofix 진탕기 상에서 흔들었을 때 1.0 mg/cm²미만의 마모를 갖도록 상기 담체에 고정되어 있으며,

피복된 담체 재료가 내시경 장치 내로 삽입된 후 제거될 경우에, 상기 재료가 실질적으로 변화하지 않으며, 담체의 유연성 및 고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈의 견고한 접착의 표시로서 피복 재료의 벗겨짐이 20% 미만이며,

상기 재료는 실질적으로 기밀 및 액체밀폐되어, 피복된 담체를 라텍스 시트에 고정시키고, 압력에 의해 라텍스를 세번 팽창시키며, 세번째에 라텍스 시트 팽창의 최고점에서의 피복된 담체의 면적을 측정하고, 피복된 담체의 팽창된 면적을 피복된 영역의 초기 면적과 비교하는 것을 포함하는 시험에 의해 결정된 1.25 이상의 탄성 역가를 갖는,

지혈, 조직 봉합 및 조직 접합용 조성물에 관한 것이다.

피브리노겐 및 트롬빈이 인간의 것, 예를 들면 천연에서 정제되거나 형질전환 또는 재조합의 인간 피브리노겐 및 트롬빈인 본 발명의 바람직한 조성물은 유연한 담체 상에 활성 성분의 고정된 조합과 함께 입수가능한 소의 것이 아닌 피브린 봉합제일 뿐이며, 이는 몇가지 장점을 갖는다:

바로 사용할 수 있음, 시간이 걸리는 해동이나 준비 과정이 필요하지 않음,

대부분의 조직 및 기관 표면 상에 직접 쉽게 적용됨,

내시경적 적용이 가능함,

지혈적 흘려보냄 또는 목적 부위를 헹궤내는 데 문제가 없음,

피브린 응혈의 접착 효과 및 유연성 담체의 기계적 지지의 조합,

매우 유연하며 심한 당김이나 압착을 견딤,

3 내지 5 분 내에 효과적인 지혈 및 조직 봉합,

적절한 안전성 프로필, 즉, 소에서 유래된 성분 없음,

적은 조직 흉터 만을 남기는 생분해성,

+2 내지 +8℃에서 보관 가능하며 36 개월의 예상되는 저장 수명,

또는 실온에서 적어도 2년 까지 보관가능.

본 발명의 바람직한 조성물을 개발해야 하는 이유는 광우병(TSEs)을 포함하는 소로부터 인간에 질병의, 심지어는 이론적일지라도, 임의의 전이 위험을 방지하기 위해 종래의 소 유래 성분을 제거하고자 하는 바램에서 출발하였다. 따라서 활성 성분인 피브리노겐 및 트롬빈은 인간 근원으로 하였고, 피브린 분해 효소 플라스민의 저해제인 소의 아프로티닌을 제거하였다. 즉 소에서 유래된 성분을 함유하지 않는 본 발명의 바람직한 조성물의 장점은, 소에서 유래된 물질을 통한 광우병(BSE)을 포함하는 질병의 전이 위험을 제거하였다는 것이다.

다른 피브린 접착물질과 유사하게, 본 발명의 조성물은 혈액 응집 캐스케이드의 마지막 단계를 재생함으로써 작용한다. 피브리노겐과 트롬빈의 혼합물이 유연한 담체의 표면 상에 고정된 고형층을 형성한다. 예를 들면 출혈 표면, 체액 또는 생리적 염수 등의 유체와 접촉하면, 상기 층의 성분이 용해되고 상처의 공동 내로 확산되어 반응하기 시작한다.

중합반응 공정이 상처 표면과 담체 패치 사이에 강한 접착을 생성한다. 접착에 필요한 시간, 즉 3 내지 5 분 동안, 본 발명의 조성물을 상처 표면 위에 가볍게 눌러주는 것이 바람직하다. 담체 패치는 상처의 삽입(tamponage)을 허용하는 기계적 지지체를 제공한다. 패치는 상처가 과다 출혈할 경우에 응집 성분을 제자리에 유지시키고 잠재적인 재출혈을 방지한다. 작용 메카니즘은 펩타이드를 분리시킴으로써 트롬빈에 의한 피브리노겐의 피브린으로의 변환을 수반한다. 피브린 단량체는 자발적으로 중합되어 점성 및 탄성의 응혈을 형성하는 피브린 가닥을 형성하고, 이것이 담체 패치를 상처 표면에 접착시킨다. 피브린 매트릭스는 이어서 피브리노블라스트 이동(도 8)을 위한 골격으로 작용하게 된다.

2-성분 접착제와 같이, 상처 표면과 담체는 중합에 의해 한데 접착된다. 담체 패치의 기계적 안정성은 피브린 응혈의 지혈 효과에 삽입 효과를 더한다. 또한 활성 성분은 오직 상처면에 마주하는 담체 표면에만 존재하고, 삽입 효과와 가벼운 압력의 덕분으로 담체를 통해 확산되지는 않는다. 결과적으로, 대부분의 피브린 접착물질을 사용하는 경우와는 대조적으로, 본 발명의 조성물을 사용할 경우에는 본 발명의 조성물로 덮인 상처면과 다른 기관 또는 부분 사이에 접착이 일어나지 않는다.

연조직에 대해 고도로 조직독성인 시아노아크릴레이트 및 젤라틴-레소신-포름알데히드(GRF) 접착물질과는 달리, 본 발명의 고형 조성물은 적용 후 수주 또는 수 개월 내에 주로 다음 두 메카니즘에 의하여 생리적으로 분해되어 조직으로 대체된다:

1. 피브린 응혈이 피브린분해에 의해 일부 분해되고 일부는 세포 식균 작용에 의해 분해된다.

2. 담체는 흡수성 과립화 조직에 의해 층층이 분해되어 내생의 연결 조직을 구성하는 모조-캡슐(pseudo-capsule)로 변환된다.

본 발명의 조성물은 식도, 위, 소장, 대장, 직장과 같은 위장 계에서, 간,지라, 췌장, 신장, 폐, 부신, 갑상선 및 림프 절과 같은 연조직 상에, 심혈관계 외과수술, 기관, 기관지 및 폐 수술을 포함하는 흉부 외과수술, 치과 수술을 포함하는 이비인후(ENT) 영역, 부인과, 비뇨기과, 골격(예, 스폰지오사(sponsiosa) 절제) 및 응급 외과, 신경외과, 임파선, 답즙 및 뇌척수(CSF) 관에서의 외과적 삽입술, 및 흉부 및 폐부 외과 수술 도중의 공기 누수를 포함하는 외과적 삽입술에 유용하다. 따라서 본 발명은 또한 상술한 조성물의 상기 목적에의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 실질적으로 기밀(air tight) 및 액체 밀폐성(liquid tight)이므로 상기 제품이 림프계, 담즙질 및 뇌척수(CSF) 관, 및 폐부 및 흉부 외과 수술 도중의 공기 누수를 처치하는 데 특별히 유용하다는 점이 강조되어야 한다. 또한, 본 제품은 실질적으로 액체 밀폐성이므로 간이나 지라와 같이 출혈이 많은 기관의 외과 수술, 및 예를 들면 위장관에서의 외과 수술에 매우 유용하다.

본 발명의 제품은 출혈 또는 림프, 담즙, 공기 또는 CSF 누수가 종래의 방법으로는 제어될 수 없는 경우, 또는 상기 방법이 만족스럽지 않은 결과를 가져오는 경우에 적용되어야 한다.

담체는 바람직하게는 콜라겐 스펀지, 조각(fleece) 또는 패치이며, 이들 용어는 본 명세서 및 청구 범위에서 동의어로 사용된다. 콜라겐, 피브리노겐 및 트롬빈 성분은 포유동물 유래의 것이 바람직하다. 바람직하게는 고형 성분은 인간 유래의 것이다. 콜라겐, 피브리노겐 및 트롬빈은 천연 공급원으로부터 정제된 것 또는 재조합이나 형질전환 인간 피브리노겐 및/또는 트롬빈일 수 있다.

현재 바람직한 콜라겐의 공급원은 말이다. 콜라겐 패치로 인하여 인간에 병원성인 말의 바이러스 감염으로 인한 바이러스 전이를 방지하기 위해, 원료 물질의 적절한 선택과 제조 과정에 의해 잠재적인 병원성 시약을 비활성화하는 것이 예방책으로서 중요하다.

이하의 실시예 I 내지 IV는 상이한 피브리노겐 및 트롬빈 원료를 가지고 피복된 콜라겐 스펀지를 제조하는 여러가지 방법을 예시한다.

피브리노겐 원료

성분	총 물질의 %
성분	조성 A	조성 B	조성 C
인간 피브리노겐	36-52	42-47	36-52
인간 알부민	16-24	20-24	16-24
총 단백질	52-76	62-71	52-76
염화 나트륨	8-14	0	8-14
트리 소듐 시트레이트	2-4	1-3	2-4
아르기닌 (히드로클로라이드)	15-26	15-21	15-26
글리신	0	6-9	1-2
히스티딘	0	3-5	0
자당	0	0	1-2
잔류 수분	<= 2	2-4	<=1,5

트롬빈 원료

조성	활성(I.U/mg 물질)	잔류 수분	추가의 첨가 물질
인간 트롬빈 A	360-540	<= 3%	인간 알부민, 염화 나트륨, 소듐 시트레이트
인간 트롬빈 B	7-10	<= 3%	인간 알부민, 염화 나트륨, 소듐 시트레이트
인간 트롬빈 C	35-60	<= 3%	인간 알부민, 염화 나트륨, 소듐 아세테이트, 글리신

실시예 I

본 실시예에서 현탁액은 인간 피브리노겐 조성물 B 및 인간 트롬빈 조성물 B를 함유한다.

다음 양과 변수들을 적용하여 3500 ml 부피의 최종 현탁액을 수득하였다:

피브리노겐 혼합물:

- 2800 ml 에탄올 (2 ~ 8℃에서 94%)

- 492.5 g의 인간 피브리노겐 조성물 B

- 493.5 mg의 리보플라빈

피브리노겐 혼합물을 2 ~ 8℃에서 8 내지 16 시간 동안 교반하면서 보관하였다.

트롬빈 혼합물:

- 100 ml 에탄올 (-30℃에서 100%)

- 12.27 g의 인간 트롬빈 조성물 B

트롬빈 혼합물을 -30℃에서 8 내지 16 시간 동안 보관하였다.

현탁액:

- 157 ml의 트롬빈 혼합물을 피브리노겐 혼합물에 가한다.

- 2 ~ 8℃에서 94%의 에탄올을 가하여 최종 현탁액 부피 3500 ml가 되도록 채웠다.

현탁액 특성:

1. 에탄올 농도: 94.3 %

2. 침강 특성:

a) 개시 후 5 분의 침강 부피: 시험 부피의 98%,

b) 개시 후 24 시간의 침강 부피: 시험 부피의 64%.

3. 입자 크기 (Folk Ward 평균 직경): 56.4 +/- 1.3 μm

콜라겐 스트립 형태의 담체를 현탁액으로 피복하였다. 먼저, 다음 조건의 냉각 챔버에서 48 개의 콜라겐 스펀지 스트립을 예비-항온처리하였다:

- 온도: 5.2 ℃

- 절대 습도: 공기 1 kg 당 4.8 g의 물

- 항온 시간 : 18.5 시간

피복된 콜라겐 스펀지 스트립을 다음과 같이 건조시켰다:

피복된 스트립을 5.2℃의 온도, 4.8 g 물/kg 공기의 절대 습도에서 15 분 동안 항온처리하였다.

다음, 피복된 스트립을 다음 건조 조건의 진공 건조 챔버에서 건조시켰다:

- 공기 조건: 5.2℃의 온도, 4.8 g 물/kg 공기의 절대 습도

- 흡입 밸브를 통한 공기 흐름: 23 m³/hr

- 진공: 59 mbar

- 건조 시간: 4 시간

콜라겐 스펀지 스트립 상에 수득된 피복의 마모는 진동수 800 내지 1200 rpm의 Vibrofix 진탕기에서 2 분 간 흔들었을 때 약 0.2 mg/cm²이었다.

실시예 II

본 실시예에서 현탁액은 인간 피브리노겐 조성물 C 및 인간 트롬빈 조성물 C를 함유한다.

피브리노겐 혼합물:

- 2252 ml 에탄올 (2 ~ 8℃에서 94%)

- 370.7 g의 인간 피브리노겐 조성물 C

- 493.5 mg의 리보플라빈

트롬빈 혼합물:

- 188 ml 에탄올 (-30℃에서 100%)

- 12 바이얼의 인간 트롬빈 조성물 C (10650 I.U./바이얼)/ 12 ml의 주사용 물

트롬빈 혼합물을 -30℃에서 8 내지 16 시간 동안 보관하였다.

현탁액:

- 164.5 ml의 트롬빈 혼합물을 피브리노겐 혼합물에 가하였다.

현탁액 특성:

1. 에탄올 농도: 94.1 %

2. 침강 특성:

a) 개시 후 5 분의 침강 부피: 시험 부피의 94%,

b) 개시 후 24 시간의 침강 부피: 시험 부피의 71%.

3. 입자 크기 (Folk Ward 평균 직경): 49.2 +/- 0.93 μm

- 온도: 4.8 ℃

- 상대 습도: 90.3 %

- 항온 시간 : 22.25 시간

피복된 콜라겐 스펀지 스트립을 다음과 같이 건조시켰다:

피복된 스트립을 4.9℃의 온도, 4.8 g 물/kg 공기의 절대 습도에서 13 분 동안 항온처리하였다.

- 공기 조건: 5.2℃의 온도, 4.9 g 물/kg 공기의 절대 습도

- 흡입 밸브를 통한 공기 흐름: 25 m³/hr

- 진공: 60 mbar

- 건조 시간: 4 시간

콜라겐 스펀지 스트립 상에 수득된 피복의 마모는 진동수 800 내지 1200 rpm의 Vibrofix 진탕기에서 2 분 간 흔들었을 때 약 0.3 mg/cm²이었다.

실시예 III

다음 양과 변수들을 적용하여 780 ml 부피의 최종 현탁액을 수득하였다:

피브리노겐 혼합물:

- 700 ml 에탄올 (2 ~ 8℃에서 94%)

- 84.42 g의 인간 피브리노겐 조성물 C

- 110 mg의 리보플라빈

트롬빈 혼합물:

- 35 ml 에탄올 (-30℃에서 100%)

- 0.54 g의 인간 트롬빈 조성물 C

트롬빈 혼합물을 -30℃에서 8 내지 16 시간 동안 보관하였다.

현탁액:

- 23.0 ml의 트롬빈 혼합물을 피브리노겐 혼합물에 가하였다.

- 2 ~ 8℃에서 100%의 에탄올을 가하여 최종 현탁액 부피 780 ml가 되도록 채웠다.

현탁액 특성:

1. 에탄올 농도: 94 %

2. 침강 특성:

a) 개시 후 5 분의 침강 부피: 시험 부피의 92%,

b) 개시 후 24 시간의 침강 부피: 시험 부피의 72%.

3. 입자 크기 (Folk Ward 평균 직경): 60.5 +/- 0.5 μm

콜라겐 스트립 형태의 담체를 현탁액으로 피복하였다. 먼저, 다음 조건의 냉각 챔버에서 8 개의 콜라겐 스펀지 스트립을 예비-항온처리하였다:

- 온도: 6.0 ℃

- 상대 습도: 85 %

- 항온 시간 : 18.5 시간

피복된 콜라겐 스펀지 스트립을 다음과 같이 건조시켰다:

피복된 스트립을 5℃의 온도, 85%의 상대 습도에서 45 분 동안 항온처리하였다.

- 공기 조건: 5℃의 온도, 85%의 상대 습도

- 흡입 밸브를 통한 공기 흐름: 1.2 m³/hr

- 진공: 35 mbar

- 건조 시간: 4 시간

실시예 IV

본 실시예에서 현탁액은 인간 피브리노겐 조성물 A 및 인간 트롬빈 조성물 A를 함유한다.

다음 양과 변수들을 적용하여 3120 ml 부피의 최종 현탁액을 수득하였다:

피브리노겐 혼합물:

- 2540 ml 에탄올 (2 ~ 8℃에서 100%)

- 311.6 g의 인간 피브리노겐 조성물 A

- 440 mg의 리보플라빈

트롬빈 혼합물:

- 210 ml 에탄올 (-30℃에서 100%)

- 229 g의 인간 트롬빈 조성물 A

현탁액:

- 87.3 ml의 주사용 물을 피브리노겐 혼합물에 가하였다.

- 2 ~ 8℃에서 100%의 에탄올을 가하여 최종 현탁액 부피가 되도록 채웠다.

현탁액 특성:

1. 에탄올 농도: 97 %

2. 침강 특성:

a) 개시 후 5 분의 침강 부피: 시험 부피의 95.6%,

b) 개시 후 24 시간의 침강 부피: 시험 부피의 63.5%.

3. 입자 크기 (Folk Ward 평균 직경): 51.8 +/- 0.8 μm

콜라겐 스트립 형태의 담체를 현탁액으로 피복하였다. 먼저, 다음 조건의냉각 챔버에서 48 개의 콜라겐 스펀지 스트립을 예비-항온처리하였다:

- 온도: 6.5 ℃

- 상대 습도: 90 %

- 항온 시간 : 22.5 시간

피복된 콜라겐 스펀지 스트립을 다음과 같이 건조시켰다:

피복된 스트립을 6.5℃의 온도, 90%의 상대 습도에서 10 분 동안 항온처리하였다.

- 공기 조건: 6.5℃의 온도, 90%의 상대 습도

- 흡입 밸브를 통한 공기 흐름: 21 m³/hr

- 진공: 58 mbar

- 건조 시간: 4 시간

콜라겐 스펀지 스트립 상에 수득된 피복의 마모는 진동수 800 내지 1200 rpm의 Vibrofix 진탕기에서 2 분 간 흔들었을 때 0.1 mg/cm²미만이었다.

실시예 1

타코콤 ^(R) 의 성분으로서의 아프로티닌

생체 내 상황에서와 유사한 씻어 내는(wash-out) 조건 하에서 항-피브린분해 활성의 생체외 연구

본 연구의 목적은 생체외 시험 모델을 사용하여 과피브린분해 조건 하에 타코콤 H의 성분으로서의 아프로티닌의 효능을 나타내기 위한 것이다.

타코콤 S는 회백색의 피복된 스펀지같은 패치이다. 발포된 건조 콜라겐의 패치가 활성 고형 성분의 담체로 사용된다. 패치의 크기는 9.5 x 4.8 x 0.5 cm이다. 활성인 측면은 황색을 띤다. 1 cm²의 타코콤 S 패치(두께 0.5 cm)는 다음으로 이루어진다:

다음으로 피복된 말에서 유래된 콜라겐2.1 mg

인간 피브리노겐5.5 mg

인간 트롬빈2.0 I.U.

리보플라빈 (피복된 면적의 표시로서 황색)16.5 μg

실험적인 생체 내 투여량-찾기 시험은 상기 트롬빈과 피브리노겐 농도가 최대의 접착 강도를 나타내었음을 확인하였다(실시예 3 참조).

인간 트롬빈, 인간 피브리노겐 및 아프로티닌을 함유하는 타코콤 H를 인간 트롬빈 및 인간 피브리노겐 만을 활성 성분으로 함유하는 타코콤 S와 비교하였다.

외과적 조건에 필적한 것으로 생각될 수 있고 실질적인 효과를 나타내기 위해 필요한 다수의 실험을 수행하는 것을 가능하게 하는 과피브린분해 조건 하에, 효능의 정량적 결정을 위한 두 개의 시험 모델을 개발하였다.

시험 모델 1에서는, 시험 시료를 부착 표면으로서의 합성 직물에 도포하였다. 정의된 구멍을 직물 내로 잘라내어 예를 들면 혈관의 천공을 모의실험하였다. 그 구멍을 통하여 두 개의 상이한 피브린분해 용액(항온 용액)으로 봉합을 노출시켰다. 상기 용액 중 하나는 항섬유소용해 성분인 α₂-안티플라스민을 더 함유하였다.

항온 용액의 조성:

모든 물질을 완충액 1에 희석하였다: 50 mM 트로메타몰, 100 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, 2 mg/ml BSA (프로테아제 미함유), 0.5 mg/ml Na-azid/ml

항온 용액 I (1 μmole 플라스미노겐, 1 nmole 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 1 μmole α₂-안티플라스민)

49 μl 완충액 1, pH 7.4

51 μl 플라스미노겐 용액 (진한 4.9 μmole Coachrom 인간 플라스미노겐 활성)

50 μl tPA 용액 (50 nmole)

100 μl α₂-안티플라스민 용액 (2.5 μmole)

항온 용액 II (1 μmole 플라스미노겐, 1 nmole 조직 플라스미노겐 활성화제)

149 μl 완충액 1, pH 7.4

50 μl tPA 용액 (50 nmole)

항온 용액을 2-시간 주기로 교환하여 씻어내리는(wash-out) 현상을 모의실험하였다. 이러한 경우에 접착이 제어되었다. 50 mbar의 압력이 시료에 가해졌다. 시료가 50 mbar이하의 압력에서 떨어질 때의 시간을 기록하였다.

시험 모델 2는 손상된 소장 조직의 피브린분해 작용을 나타내었다. 시험 시료를 접착 표면으로서의 돼지 소장(생체 외)에 적용하였다. 정의된 구멍을 소장 내로 잘라내어 항온 용액이 피브린 응혈과 접촉하여 씻어내는 효과를 모의실험하게 하였다. 항온 용액을 등록된 시간에 교환하고, 그 시각에 시료에 50 mbar의 압력을 가하였다. 시료가 50 mbar 이하의 압력에서 떨어질 때의 시간을 기록하였다.

결과는 아프로티닌을 함유하는 타코콤 H와 아프로티닌을 함유하지 않는 타코콤 S 사이의 현저한 차이를 나타내었다.

조직 플라스미노겐 활성화제, 플라스미노겐 및 α₂-안티플라스민을 함유하는 항온 용액을 사용하는 시험 모델 1에서, 타코콤 H의 피브린분해 시간은 41.2 ± 7.3 시간인 한편, 타코콤 S의 경우에는 12.8 ± 2.8 시간이었다.

조직 플라스미노겐 활성화제 및 플라스미노겐 만을 함유하는 항온 용액을 사용하는 시험 모델 1에서, 타코콤 H의 피브린분해 시간은 31.6 ± 5.3 시간인 한편, 타코콤 S의 경우에는 8.3 ± 1.8 시간이었다.

시험 모델 2에서 타코콤 H의 분리(detachment) 시간은 78.4 ± 16.3 시간인 한편, 타코콤 S의 경우에는 6.5 ± 1.8 시간이었다.

시험 시료에서는 여전히 많은 피브린이 관찰될 수 있었다. 그러나 시료는 소장 표면으로부터 압력 하에 분리되었는데, 그 이유는 피브린 응혈과 소장 표면 간의 접착 강도가 약해졌기 때문이다.

두 모델 모두에서 타코콤 H 중 활성 성분인 아프로티닌의 항섬유소용해 작용이 매우 명확하게 보여질 수 있었다.

시험 모델 1에서 타코콤 H의 활성성분인 아프로티닌으로 인한 피브린분해 시간의 연장은 α₂-안티플라스민을 함유하는 항온 용액 I에서 320%, α₂-안티플라스민을 함유하지 않는 항온 용액 II에서 380%였다.

또한 시험 모델 1은 타코콤 H의 31.6 시간으로부터 41.2 시간으로의 피브린분해 시간 연장 및 타코콤 S의 8.3 시간으로부터 12.8 시간으로의 피브린분해 시간 연장에 의해 α₂-안티플라스민의 추가적인 항섬유소용해 작용을 나타내었다.

실시예 2

피복된 니코메드 스펀지(타코콤 S)의 타코콤 S와 동일하게 피복된 다른 담체 제품과의 비교

층의 접착

방법

1. 상이한 담체의 피복

브랜드 명	재료	제조/판매
Opraskin^(R)	콜라겐 스펀지	Lohmann, Pastfach 2343, D-56513 Neuwied
Willospon^(R)포르테	콜라겐 스펀지 (송아지)	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Willospon^(R)스페셜	젤라틴 스펀지	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Ethisorb^(R)패치	폴리글락틴 910/폴리디옥사논	Johnson/Johnson(제조원)Ethicon, Robert-Koch-Str.1D-22851 Norderstedt
Tabotamp^(R)NU Knit	산화된 재생 셀룰로오스	Johnson/Johnson(제조원)Ethicon, Robert-Koch-Str.1D-22851 Norderstedt
콜라겐 스펀지 Nycomed	말의 콜라겐 스펀지	Nycomed AustriaSankt-Peter-Str. 25A-4021 LINZ

각 담체의 2 x 4.5 cm²면적을 타코콤 S 피복 현탁액으로 피복하였다. 피복 현탁액의 양은 타코콤 명세(5.5 mg 피브리노겐/cm²)에 상응하였다. 시료를 건조시켰다.

2. 각 피복된 담체로부터 시료 1 x 4 cm²를 제조하였다.

3. 층의 접착을 다음과 같이 시험하였다.

방법 명세

장치

분석 화학저울 (측정 정밀도 ±0.5 mg)

고정 장치와 결합된 Vibrofix 진탕기

밀리미터 눈금의 자

초시계, 외과용 메스, 마개가 있는 내경 2 cm의 시험관

방법

피복된 담체로부터 외과용 메스를 사용하여 4 x 1 cm²의 피복된 면적을 잘라낸다. 시료를 칭량한 마개 있는 시험관에 넣는다. 다음 Vibrofix 진탕기(진동수: 약 1000 rpm)에서 2 분 동안 흔든다. 시트를 제거하고 피복 물질의 남은 양(마모: mg/cm²)을 다시 칭량한다.

계산

마모 (mg/cm²) = {잔류 중량(mg) - 용기 중량(mg)} / 4 cm²

결과

담체	물질	마모 (mg/cm2)
Opraskin^(R)	동결건조 콜라겐	2.1
Willospon^(R)포르테 (3 mm)	동결건조 콜라겐	1.2
Willospon^(R)Spezial (1 mm)	젤라틴	2.1
Ethisorb^(R)패치 (ZVP609)	폴리글락틴/디옥사논	14.3
Tabotamp^(R)NU Knit	산화 셀룰로오스	9.2
콜라겐 스펀지 Nycomed	콜라겐, 발포된	0.15

코멘트

니코메드 콜라겐 스펀지를 제외한 모든 담체는 피복 후 유연한 것이다. 시료는 매우 조심스럽게 절단되어야 한다. 가위를 사용하여 절단할 경우, 그 안의 층이 강성이므로 많은 피복 재료가 얇은 조각으로 떨어진다. Ethisorb^(R)패치는 거의 모든 피복 재료와 연결이 없는 것으로 나타났다. 약간 흔들어 줄 경우, 피복의 전부가 "카펫"처럼 벗겨졌다.

니코메드 콜라겐 스펀지와 다른 담체 재료 사이의 차이는 매우 현저한 것으로 나타났다.

습윤 피복된 담체의 탄성

방법

1. 다양한 담체의 피복

각 담체의 2 x 4.5 cm²의 면적을 타코콤 S 피복 현탁액으로 피복하였다. 피복 현탁액의 양은 타코콤 명세(5.5 mg 피브리노겐/cm²)에 준하였다. 시료를 건조시켰다.

2. 각 피복된 담체로 약 5 내지 7 cm²의 시료를 제조하였다. 건조 시료의 정확한 개시 면적을 측정하였다.

3. 시료를 적시고, 표제 "방법"에 상술한 것과 같은 특수 장치에 고정된 탄성 라텍스 시트 상에 놓았다. 다음 라텍스 시트에 압력을 가하여 팽창시켰다. 2 회의 팽창 및 이완 후, 시트를 세번째 팽창시켰다. 최고 팽창점에서 담체의 면적을 측정하였다.

방법 명세

장치/시약

연동 펌프 (IKA PA-SF)

압력 완충 병 (3 구)

VDO 압력계 (0 내지 250 mbar)

유리 깔때기 (지름/ 통로 1: 30 mm, 통로 2: 15 mm)

실리콘 관 및 클램프, 라텍스 장갑(Semper med), 외과용 메스, 밀리미터 눈금의 자, 가위

생리적 염수

방법

다음 장치를 실리콘 관을 통하여 압력 완충 병의 세 출구에 기밀하게 연결한다:

a) 연동 펌프

b) 압력계

c) 유리 깔때기/ 통로 2

라텍스 장갑으로부터 약 8 x 8 cm²의 두 장의 시트를 잘라낸다. 상기 시트를 유리 깔때기/통로 1에 기밀하게 고정시킨다.

외과용 메스를 이용하여 피복된 담체로부터 약 5 내지 7 cm²의 피복된 면적을 절단해낸다.

시료의 면적을 측정한다(개시 면적). 시료의 피복을 염수로 적시고 라텍스 시트 상에 놓는다. 다음, 그를 약 1 분 동안 라텍스 시트에 대하여 손으로 누른다.

연동 펌프를 사용하여 라텍스 시트를 약 70 mbar의 압력을 적용하여 팽창시킨다. 팽창 후 라텍스 시트를 이완시키면서 이를 두 번 반복한다. 세번째 팽창시에, 피복된 담체의 면적(길이 및 폭)을 라텍스 시트 팽창의 최고점에서 측정한다.

계산:

"탄성" 역가 = (세번째 팽창 시 담체의 면적) / (시료의 초기 면적)

결과

담체	물질	탄성 역가
Opraskin^(R)	동결건조 콜라겐	1.78
Willospon^(R)포르테 (3 mm)	동결건조 콜라겐	1.53
Willospon^(R)Spezial (1 mm)	젤라틴	1.79
Ethisorb^(R)패치 (ZVP609)	폴리글락틴/디옥사논	1.0
Tabotamp^(R)NU Knit	산화 셀룰로오스	1.15
콜라겐 스펀지 Nycomed	콜라겐, 발포된	1.55

코멘트

적신 콜라겐 스펀지 니코메드(타코콤 S)의 탄성은 제품의 중요한 특성의 하나이다. 탄성은 흉부 및 복부 외과 수술에서 필수적이다. 담체를 접착시킨 후 폐나 소장의 예를 들면 팽창 및 이완 운동이 뒤따를 수 있다. 특히 Ethisorb^(R)은 전혀 탄성을 나타내지 않았다. 그것은 피복으로부터 즉시 분리되었다. 피복된 Willospon^(R)Spezial 및 Opraskin^(R)은 시험 도중 구조적 결함을 나타내었다.

피복된 담체의 내시경 수술에의 사용

방법:

1. 다양한 담체의 피복

각 담체의 2 x 4 cm²의 면적을 타코콤 S 피복 현탁액으로 피복하였다. 피복 현탁액의 양은 타코콤 명세(5.5 mg 피브리노겐/cm²)에 준하였다. 시료를 건조시켰다.

2. 내시경 수술에 사용할 피복된 담체 시료의 취급 및 상기 취급으로 인한 피복의 소실은 디지털 사진-장치로 기록되었다.

방법 명세

장치

엔도독(Endodock): 내시경 수술에 타코콤^(R)을 사용하기 위해 고안된 내시경 장치(도 7 참고). 디지털 사진-장치.

조사한 담체 목록

담체	담체 재료
Opraskin^(R)	동결건조 콜라겐
Willospon^(R)포르테 (3 mm)	동결건조 콜라겐
Willospon^(R)Spezial (1 mm)	젤라틴
Ethisorb^(R)패치 (ZVP609)	폴리글락틴/디옥사논
Tabotamp^(R)NU Knit	산화 셀룰로오스
콜라겐 스펀지 Nycomed	콜라겐, 발포된

방법

각 담체로부터 일련의 사진을 찍었다:

1. 사진: 피복되지 않은 및 피복된 담체 시료의 기록.

2. 사진: 피복된 시료를 내시경 장치(Endodock) 내로 삽입한다. 시료는 그주위를 안내 "핀"으로 쌀 수 있도록 손으로 편평하게 만들어야 한다. 다음 시료를 직경 10 mm의 강철 관 내로 조심스럽게 삽입한다. 엔도독(Endodock) 관 내에 부분적으로 삽입된 시료를 기록.

3. 사진: 시료를 조심스럽게 밀어 낸다. 다음 시료를 펼쳐야 한다. 상기 취급으로 인하여 담체의 분열이 있는 피복은 담체 옆으로 수집한다. 내시경 장치 내로 삽입 후 펼쳐진 시료 및 상기 취급으로 인한 피복의 손실을 기록한다.

코멘트

내시경 수술에서 타코콤 S(피복된 말 콜라겐 스펀지/Nycomed)는 본 제품의 가장 요구되는 응용이다. 타코콤 S는 내시경 장치 내로 삽입된다. 상기 장치의 관은 일반적으로 직경 10 내지 13 mm의 것이다. 관 내로 삽입되기 위해서 타코콤 S는 편평하게 된 다음 안내 "핀" 주위로 감싸진 다음 관 내로 조심스럽게 삽입된다. 따라서 담체에로의 피복의 연결 및 그 자체 내부의 연결은 강해야 하나 제품은 건조 조건에서도 굽히거나 말아질 수 있도록 충분히 유연성을 유지해야 한다. 수술 부위로 가져왔을 때, 타코콤 S는 조심스럽게 관 밖으로 잡아 당겨진다. 다음 싼 것을 풀고 상처 표면에 놓여야 한다. 이것이 종종 약간의 조정을 필요로 한다. 따라서 층의 담체에의 부착은 상기 취급을 견딜 수 있도록 충분히 강해야 한다.

결과

결과를 첨부 도 1 내지 도 6에 나타낸다. 피복 재료의 벗겨짐(cast)의 개략은 다음과 같다:

Opraskin^(R)30-40%

Willospon^(R)포르테60-70%

Willospon^(R)Spezial50%

Tacotamp^(R)NU knit60-70%

Ethisorb^(R)패치95%

콜라겐 스펀지 니코메드<5%

Ethisorb^(R)은 매우 단단한 담체이므로 피복의 부착이 매우 나쁘다. 따라서 피복된 Ethisorb^(R)은 본 연구에서 피복의 거의 모두를 소실하였다. 니코메드의 피복된 콜라겐 스펀지에 비하여 모든 다른 연구한 담체들은 편평한 피복될 표면을 갖는다. 따라서 피복은 담체 상에 "편평한 카펫"과 같이 놓인다. 이것이 오히려 건조 피복된 담체의 유연하지 못한 구조를 초래한다. 구부리거나 마는 것이 종종 피복을 그 자체 내에서 파열되게 한다.

피복된 담체를 내시경 장치의 관 내로 삽입한 후 시료를 펼친 후에, 니코메드의 콜라겐 스펀지 이외의 모든 담체는 실로 많은 피복을 소실하여 넓은 면적이 피복 재료 없이 남게 된다.

니코메드 콜라겐 스펀지의 구조 및 질감은 건조 혹은 습윤 상태에서 타코콤S의 높은 유연성을 기초로 한다. 니코메트 콜라겐 스펀지는 발포되어 내부에 다각형 챔버를 갖는다. 표면 상에서 이들 챔버는 공동으로 절단된다. 상기 공동은 피복 표면을 확장시킨다. 피복 도중 피복 현탁액은 구조화된 표면 상에 고르게 분포된다. 건조하는 도중 피브리노겐 및 트롬빈을 모두 함유하는 용액은 상기 공동 내에 고체로서 고정된다. 따라서 타코콤 S는 원하는 크기로 절단될 수 있고 피복 재료의 소량 만을 소실하거나 전혀 소실함이 없이 내시경 장치 내에 삽입될 수 있다.

건조 타코콤 S의 높은 유연성이 다른 모든 연구된 피복 담체에 비하여 큰 장점이다.

실시예 3

활성 성분의 투여량-찾기 시험

활성 성분의 투여량은 접착 강도를 측정한 두 가지 상이한 실험 방법에 의하여 발견되었다: 쥐 간에서의 인장 강도, 쥐 신장에서 높은 조직 압력에 대한 접착 강도.

A. 쥐 간에서의 인장 강도

마취된 쥐 간의 좌엽 상에 1 x 1 cm 및 약 1 mm 깊이의 상처를 내어 새어나오는 출혈을 형성하였다. 상처를 스프링 저울에 연결된 타코콤 S의 1 x 1 cm 조각으로 봉합하였다. 타코콤 S가 파열될 때의 인장을 측정하였다.

B. 쥐 신장에서 높은 조직 압력에 대한 접착 강도

마취된 쥐의 왼쪽 신장을 그 질량의 약 4분의 1을 절단하여 매끈한 표면의 강하게 출혈하는 상처를 생성하였다. 상처를 타코콤 S 시험 시트로 봉합하였다.정맥의 출구를 닫고 등장의 시트레이트 염 용액(pH 7.2)을 신장 내에 펌핑하여 조직 압력을 상승시켰다. 타코콤 S가 분리되기 시작하는 압력을 측정하였다.

상이한 양의 피브리노겐을 함유하는 타코콤 S의 접착 강도

층의 조성	접착 강도 (평균 ± SD)
피브리노겐,mg/cm²	트롬빈,IU/cm²	쥐 간 상에서의 인장 강도, N/cm²n = 5	쥐 신장에서의 상승된 조직 압력에 대한 접착 강도, mbarn = 5
0	0	0.20 ±0.02	47 ± 9
0	2.40	0.20 ±0.03	63 ± 16
1.30	1.73	0.30 ±0.06	81 ± 12
2.92	1.85	0.39 ±0.05	101 ± 13
5.10	1.87	0.39 ±0.03	110 ± 13
7.22	1.82	0.38 ±0.02	97 ± 13
10.02	1.75	0.40 ±0.07	87 ± 10

상이한 양의 트롬빈을 함유하는 타코콤 S의 접착 강도

층의 조성	접착 강도 (평균 ± SD)
피브리노겐,mg/cm²	트롬빈,IU/cm²	쥐 간 상에서의 인장 강도, N/cm²n = 5	쥐 신장에서의 상승된 조직 압력에 대한 접착 강도, mbarn = 5
0	0	0.20 ±0.02	47 ± 9
6.15	0	0.27 ±0.01	57 ± 10
4.72	0.92	0.39 ±0.02	84 ± 9
5.10	1.87	0.39 ±0.03	110 ± 13
4.78	4.95	0.35 ±0.02	97 ± 9
4.70	9.63	0.30 ±0.02	109 ± 13
4.75	19.83	0.27 ±0.03	91 ± 20

수득된 결과는 몇 가지 변형 사이에 현저한 차이를 나타내었다. 인간 트롬빈의 적정 범위는 약 5 mg/cm²의 일정한 인간 피브리노겐 함량과 함께 0.9 내지 10I.U./cm²이었다. 인간 피브리노겐의 적정 범위는 약 2 I.U./cm²의 일정한 인간 트롬빈 함량과 함께 2.9 내지 7.2 mg/cm²이었다.

상기의 생체내 시험은 다른 타코콤 제제(타코콤^(R)및 타코콤 H)에서 사용된 피브리노겐의 농도(4.3 내지 6.7 mg/cm²) 및 트롬빈의 농도(1.5 내지 2.5 IU/cm²)가 모두 타코콤 S에 대하여 최대 접착 강도의 결과를 나타낸 것을 확인하였다.

실시예 4

개의 지라 및 간 손상 봉합에 있어서 타코콤 S의 효능

본 발명의 목적은 개의 지라 및 간 손상 모델에서 타코콤 H(아프로티닌 함유)의 지혈 효능을 타코콤 S(아프로티닌 미함유)와 비교하는 것이었다. 새는 정도의 출혈을 모방하기 위해 지라의 절개 및 천공(0.5 cm 깊이)을 선택하였다. 심하게 출혈하는 표면 상처(2 내지 3 cm²)를 모방하기 위해 두개(cranial) 간엽의 끝을 절개하였다. 타코콤 H 및 타코콤 S 패치가 상처의 유일한 지혈 수단으로 적용되었다(같은 배치가 같은 개의 지라 및 간 손상에 사용됨). 수술 48 시간 후에 부검을 실시하였는데, 이 때가 임상적 실제에서 재출혈의 위험이 가장 높은 시기이기 때문이다.

두 제품 모두에서 완전한 지혈이 이루어졌다. 48시간 후의 부검 시에 거시적인 관찰 또는 조직 검사 모두에서 2차적 출혈이 관찰되지 않았다.

또한 각각의 패치로 덮은 지라 및 간 손상을 상처의 지혈 및 치유에 관하여평가할 때 타코콤 H 또는 타코콤 S를 적용한 개 사이에 조직학적으로 차이가 없었다. 수술후 2차적 출혈은 관찰되지 않았다.

혈액 계수의 데이터는 두 처리군이 모두 수술 후 48 시간에 백혈구 계수에서 약간의 상승을 보이는 유사한 결과를 나타내었다. 다른 평가된 변수의 어느 것에 관련해서도 시험군 사이 또는 시간 사이에 차이가 없었다. 또한 응집 시험은 아프로티닌의 존재 또는 부재와 관련해서 아무 차이도 나타내지 않았다. 혈액 피브리노겐 함량의 증가는 수술 48 시간 후에 양 처리군 모두에서 명백하였다. 백혈구 계수 및 혈액 피브리노겐 함량의 상승은 외과적 외상에 대한 면역 반응의 탓일 수 있으나 타코콤 H 또는 S의 독성 부작용으로 생각되지는 않는다.

개의 새는 정도의 및 심한 출혈성 연조직 상처의 치료에 있어서 타코콤 S (아프로티닌 미함유)는 타코콤 H(아프로티닌 함유)과 동일한 효능을 갖는 것으로 결론지어졌다. 선택된 조건 하에서 응혈의 안정성은 아프로티닌의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않는다.

실시예 5

흡수가능한 타코콤 S 및 타코콤 H의 지혈, 상처 봉합 효과 및 내성의 비교: 돼지에 있어서의 실험적 연구

연구의 목적

시험은 돼지에서 유도된 지라 손상에 대하여 지혈 조각(fleece)의 즉각적 효능 및 단기적 내성을 평가하기 위해 고안되었다.

재료 및 방법

24 마리의 암컷 돼지를 연구에 사용하였다. 2 군의 지혈 조각이 랜덤하게 시험되었다. 아프로티닌을 함유하는 타코콤 H 및 아프로티닌을 함유하지 않는 타코콤 S.

수술 당일에 동물은 지라의 배 부분에 외과적으로 만든 표준화된 2 x 3 cm 손상을 직접 막은 조각을 부여받았다.

물집의 숫자를 계수하고 출혈을 그치게 하는데 필요한 시간을 측정함으로써 조각의 즉각적인 지혈 효과를 평가하였다. 타코콤 H와 타코콤 S의 접착을 기록하였다.

72 시간 후, 지라 내 압력을 증가시켜(정맥관을 클램프로 막음) 두 물질의 단기 특성과 내성을 조사하였다.

압력이 거의 일정한 상태에 도달하였을 때, 아드레날린 IV 환약(0.02 mg 또는 0.04 mg)을 투여하여 도부타민 클로르히드레이트 주입과 함께 또는 이에 의하지 않고 동맥압을 증가시켰다.

상기 약리학적 물질을 이용하여 타코콤 H 및 S 보수된 손상의 출혈 압력의 파열을 각 동물에 대하여 기록하였다.

결과

지라 손상 수술 시에 지혈 효과에 대한 치료 사이에 차이점이 발견되지 않았다.

72 시간 후 두번째 관찰 시에, 두 조각의 거시적 외관은 동일하였다.

파열에 이르기까지의 급성 압력 측정 및 내성은 두 실험 군 사이에 실질적으로 다르지 않았다.

재료의 파열은 일어나지 않았다. 손상부위의 출혈이 타코콤 S를 사용한 4 마리의 동물에서 관찰되었고 타코콤 H를 사용한 2 마리의 동물(4 군에서 추가적인 물집을 가진 1 마리와 함께)에서 관찰되었다.

조직 검사는 아프로티닌이 조각 구조 상에 보호 작용을 갖는 것을 암시하였고, 아프로티닌이 조각의 분해를 감소시킴으로써 현미경적 패턴을 개선하는 것으로 보였다. 특이적인 세포 패턴은 관찰되지 않았다.

결론

24 마리의 돼지에 있어서 표준화된 지라 손상 모델에서 타코콤 S 및 H 두 조성물의 즉각적인 지혈 작용을 연구하였다.

두 물질 모두 효능, 손상에 대한 접착 및 연조직에의 순응에 있어서 유사한 특성을 가졌다. 효능은 만족스러웠다.

그들의 생분해 및 단백질 분해에 대한 내성을, 지라 내 압력(기계적 및 생리적 방법에 의해)을 높이고 타코콤 H 및 S 조각의 국소적 내성을 기록함으로써 수술 후 72 시간에 조사하였다. 두 물질의 내성에 실질적인 차이가 확인되지 않았다.

그러나 조직학적 발견에 따르면 타코콤 S의 단백질 분해적 붕해가 타코콤 H보다 약간 더 두드러진 것으로 나타났다.

타코콤 S 또는 타코콤 H는 돼지의 심하게 출혈하는 지라 손상(표면 손상 2 cm x 3 cm, 깊이 3-5 mm; 각 군 n=12)을 봉합하는 지혈의 유일한 수단으로 사용되었다. 72 시간 후 지라 정맥을 결찰하여 지라내 압력을 증가시켰다. 다음, 아드레날린을 주사하여 지라내 압력을 추가로 증가시켰다. 돼지들은 패치 밑에서 혈액의 물집이 나타나거나 재출혈의 징후를 나타내었다. 부검 후 시료(타코콤 H 및 S로 봉합된 손상 부위)의 조직 병리학을 수행하였다.

타코콤 S 및 타코콤 H는 유사한 효능, 손상에 대한 접착 및 연조직에 대한 순응을 나타내었다.

실시예 6

흡수가능한 타코콤 S 및 타코콤 H의 지혈 상처 봉합 효과 및 내성 비교: 급성 췌장염의 모델로서 돼지에 대한 실험적 연구

연구의 목적

시험은 급성 췌장염의 모델로서 돼지에서 유도된 지라 손상에 대하여 지혈 조각(fleece)의 즉각적 효능 및 단기적 내성을 평가하기 위해 고안되었다.

재료 및 방법

20 마리의 암컷 돼지를 연구에 사용하였다. 2 군의 지혈 조각이 랜덤하게 시험되었다: 아프로티닌을 함유하는 타코콤 H 및 아프로티닌을 함유하지 않는 타코콤 S.

다음, 멸균된 주사를 이용하여 담낭을 천공하여 담즙을 수집하고, 담즙 10 ml를 비르중 관(Wirsung's duct)을 통해 주사하여 췌장염을 유발하였다. 수술 전 및 수술 후 매일 혈액 효소 수준(리파아제 및 아밀라아제 수준)을 모니터링하였다.

타코콤 H 및 S의 작은 조각을 췌장 연조직 위, 그 소화관 연결부에 부착하였다.

72 시간 후, 지라 내 압력을 증가시켜(정맥관을 클램프로 막고 약리학적 방법으로) 타코콤 H 및 S의 효소 분해에 대한 내성 및 단기 특성을 조사하였다.

압력이 거의 일정한 상태에 도달하였을 때, 0.02 내지 0.04 mg/분의 노르아드레날린 주입에 이어 아드레날린 IV 환약(0.02 mg 또는 0.04 mg)을 투여하여 0.3 내지 0.6 mg/분의 도부타민 클로르히드레이트 주입과 함께 또는 이에 의하지 않고 동맥압을 증가시킨다.

결과

지라 상에서, 두 물질 모두 즉각적인 지형 효능, 손상에 대한 부착 및 연조직에 대한 순응에서 유사하게 작용하였다. 그들의 효능은 매우 고무적이었다.

효소 조건은, 특히 2 일째에는 혈액에서, 4 일째에도 복막액 중에서 매우 가혹하였지만, 두 조각 모두 3일째에 거시적 관찰에 의하면 변화가 없었다.

72 시간 후, 지라의 압력을 증가시킨 후, 두 재료 모두에서 실질적인 내성의 차이가 확인되지 않았다.

타코콤 S 군에서 하나의 재료 파열이 일어났다. 타코콤 S를 갖는 1 마리의 동물 및 타코콤 H를 갖는 2 마리의 동물(타코콤 H 군에서 물집을 갖는 1 마리와 함께)에서 손상부의 출혈이 관찰되었다.

조직 병리학적 발견에 의하면 타코콤 H에 비하여 타코콤 S의 분해에서 실질적인 차이가 나타나지 않았다. 특이적인 세포 패턴이 지라에서 관찰되지 않았다. 췌장 시료의 경우에서조차, 고농도의 췌장 효소와 긴밀하게 접촉하고 있던 타코콤 H 및 S의 조각들이 어떠한 실질적인 변화를 나타내지 않았다.

결론

결론적으로 증가된 췌장 효소 환경의 조건에서 파열에 대한 내성에 관하여 타코콤 S 및 타코콤 H 사이에 명백한 차이가 나타나지 않았다.

타코콤 H 및 S 조각의 개선에 대한 특정 거시적 또는 현미경적 증거가 검출되지 않았다.

비르중 관에 담즙을 역행 주입하고 이어서 췌장관을 결찰함으로써 유발된 급성 췌장염을 가진 돼지에서 표준화된 지라 손상 모델(표면 손상 2 cm x 3 cm, 깊이 약 3 mm; n=10/군)에서 타코콤 S 및 타코콤 H의 지혈 효능을 연구하였다. 타코콤 H 및 S의 작은 조각들을 췌장관 결찰 부위에서 췌장에 적용하였다. 수술 72 시간 후, 지라 정맥을 결찰하고 아드레날린을 정맥내 주사하여 지라내 압력을 증가시켰다.

췌장 효소 수준의 현저한 증가(기초 수준에 비하여 혈액 중 아밀라아제 및 리파아제의 20 내지 100 배 증가 및 복막액 중 췌장 효소의 10 내지 100 배 증가)에도 불구하고, 즉각적 지혈 효능, 손상에 대한 접착 및 증가된 지라내 압력에 대한 내성에 있어서 지라 상의 타코콤 S 및 타코콤 H는 유사하게 작용하였다. 조직 병리학적 발견에 의하면 타코콤 S 및 타코콤 H의 분해에서 실질적인 차이가 나타나지 않았다. 특이적인 세포 패턴이 지라에서 관찰되지 않았다. 타코콤 H 및 S가 고농도의 췌장 효소와 긴밀하게 접촉하게 된 췌장 시료의 경우에서조차, 타코콤 H 및 S의 부착 및 조직병리학이 어떠한 실질적인 변화를 나타내지 않았다.

즉, 상기와 같은 돼지의 고도로 스트레스가 많은 급성 췌장염 모델에서 타코콤 S 및 타코콤 H 사이에 특정 거시적 또는 현미경적 차이가 없었다.

실시예 7

재흡수성 타코콤 H 및 타코콤 S의 뇌 조직 반응 및 효율 비교: 정상 응집 및 국소적 과피브린분해 하의 토끼 모델에서의 실험적 연구

본 연구의 목적은 신경외과적 적용에 뒤따르는 타코콤 S 및 타코콤 H의 효능을 비교하기 위한 것이다. 정상 응집 조건(뇌조직 반응 = BTR, n=12 토끼, 적합 n=10) 및 국소적 r-tPA 적용의 과피브린분해 조건(HF)(n=10 토끼)에서 토끼에 뇌 손상을 유발하였다. 대뇌 반구 당 3 개의 피질 손상을 만들었다(동물 당 총 6 개의 손상; 3 mm 깊이 및 4 mm 직경의 드릴을 이용한 뇌 손상).

BTR 시리즈

반구 당 세군데의 손상 중 두 곳을 타코콤 H 또는 타코콤 S로 각각 처리하고, 반구 당 하나의 손상부는 대조로서 비어 둔다. 타코콤 H 또는 S로 손상을 봉합한 후, 연속적인 낮은 유속의 염수를 관주하면서 높은 확대도 하에 출혈 시간을측정하였다. 모든 손상부에서 지혈이 된 후, 아드레날린 정맥내 주사(0.01 mg/kg 아드레날린)로 동맥 고혈압을 유발하여 평균 동맥압(MAP)을 120 mmHg 이상으로 증가시켰다. 상기 과정의 도중에도 재출혈에 대한 관찰을 계속하였다. MAP를 정상치까지 다시 낮추고 피부를 접합하였다. 부검까지의 시간은 3일 및 7일(각 n=5 토끼)로 하였다. 3일째에 부검하기 전, 3 마리의 동물에서 자기 공명 촬영을 수행하였다. 부검시 손상 부위의 거시적 관찰을 수행하고 조직 병리학적 시료를 채취하였다.

HF 시리즈

BTR 시리즈에서 기재한 바와 같이 손상을 고정시킨 후, 모든 손상부를 선택적으로 타코콤 S 또는 타코콤 H로 봉합하기에 앞서 r-tPA를 손상부 상에 적하하였다(손상부 당 0.5 ml 염수 중 0.3 mg r-tPA). 높은 확대 및 염수의 연속적인 낮은 관주 하에 출혈 시간을 측정하였다. 1일째(n=7) 및 3일째(n=3)에 거시적 관찰로써 부검을 실시하였다. 비교를 위해 3일째에 채취한 시료에 대하여 조직병리학을 수행하였다.

전체적인 연구의 과정에서 타코콤 S 및 타코콤 H 사이에 봉합 효능, 증가된 MAP의 내성 및 출혈 시간 뿐만 아니라 조직 병리학적 측면에서도 차이가 확인되지 않았다. 손상 부위에서 뿐만 아니라 전체 얼굴의 피부 밑에서 HF 시리즈의 모든 동물에서 심한 출혈이 명백하였다. 이러한 가혹한 조건에도 불구하고 타코콤 S는 타코콤 H에 비하여 유사한 효능을 발휘하였다.

실시예 8

타코콤 H 및 타코콤 S의 신경외과적 적용: 뇌 조직 반응 및 지혈 효과

신경외과술에서는 지혈을 위해 유체 피브린 봉합물질을 대량으로 사용한다. 타코콤^(R)의 뇌 조직 반응에 대하여는 총괄적인 간행된 데이터가 없으며, 항섬유소용해제(예, 아프로티닌)의 사용에 관하여는 아직도 논란의 여지가 있다.

목적

본 연구의 디자인은 두 가지 주된 쟁점에 초점을 맞추었다: 조직병리학적 방법 및 현대식 촬영 기술을 이용하여, 타코콤 H(TCH) 및 타코콤 S(TCS)의 피질 손상에 대한 적용 후의, 공시험인 대조 손상(CL)에 비교한, 단기 국소적 뇌 조직 반응의 평가.

두번째 목적은 정상 응집(BTR 군) 및 국소적으로 유발된 심각한 과피브린분해(HF 군) 후 타코콤 H 및 S 제품의 지혈 효능을 연구하고, 지혈 특성 및 제제의 접착력에 아프로티닌이 어떤 영향을 주는지 여부를 평가하기 위한 것이다.

재료 및 방법

일련의 22 마리의 어린 토끼에서, 각 반구 상에 세 개의 피질 손상을 만들었다. 12 마리의 동물은 뇌 조직 반응(BTR) 군으로 하고 10 마리는 과피브린분해(HF) 군으로 하였다.

BTR 동물에서 두 개의 손상부는 타코콤 H 및 타코콤 S 로 각각 채웠고, 세번째 것은 대조로서 비워 두었다. 출혈 시간을 측정하고, 유발된 동맥 고혈압으로 인한 재출혈의 발생을 모니터링하였다. 수술 후 3일째 및 7일째에 동물을 죽이고조직 검사를 수행하였다. 세 마리의 BTR 동물에서 뇌 부종 평가를 위한 자기 공명 촬영을 3일째 안락사 직전에 수행하였다.

재조합 조직-플라스미노겐 활성화제(rt-PA)로 심한 국소적 과피브린분해 상태를 미리 유발한 HF 동물에서, 한 반구의 모든 세 부위의 손상은 타코콤 H로, 다른 반구의 것은 타코콤 S로 처치하였다. 출혈 시간을 측정하고, 세 마리의 동물에서 조직 검사를 3일째에 수행하였다.

결과

정상 응집(BTR 동물)하에서, TCH 및 TCS로의 지혈은 지혈제를 사용하지 않은 경우보다 유의하게 빨랐다(p<0.001). 양 제품의 출혈 시간 사이에는 차이가 없는 것으로 나타났으나(p=0.294), 상기 시간은 대조 공시험 손상의 출혈 시간보다 일관되게 짧았다(p<0.001).

동맥 고혈압이 유발된 동안 24 개 TCH 손상의 하나에서, 24 개 TCS 중 3 개에서, 24 개의 대조 손상 중 19 개에서 재출혈이 발생하였다. 지혈제의 존재는 심하게 증가된 동맥압(Chi 제곱=16.3; p>0.001)의 동안에 일관되게 재출혈을 방지하였다. 다시 동맥압이 증가하는 동안 TCH 또는 TCS가 없는 경우에는 80%의 재출혈 발생 위험이 나타났다.

과피브린분해 군(HF 동물)에서 출혈 시간의 통계적 분석은 두 제품에 대한 출혈 시간 사이에 차이를 나타내지 않았다(표시된 순위(signed-rank) 시험: p=0.927 및 T 테스트: p=0.4102).

최종적으로, 99.73%의 안전 간격 내에서(D<3sdD=ns) 두가지 응집 상황 하에서 같은 제품의 지혈 효능 사이에는 실질적인 차이가 배제되었다.

결론

타코콤 H 및 타코콤 S는 뇌 조직에서 어떠한 특이적 조직학적 변화를 유도하지 않았다. 양 제품 모두, 손상 이외 더 이상의 조직 반응을 유발하지 않았으므로 양호한 뇌 연조직의 생물학적 친화성을 가진다. 조합 제품에 관련하여 역효과가 없었다는 것이 형태학적으로 명백하다. 조직 검사는 정상 응집 뿐만 아니라 심하게 방해된 응집 하에서도 양 제품 간의 차이를 나타내지 않았다. 타코콤 H 및 타코콤 S는 정상 응집 및 과피브린분해 조건 하에 동일한 지혈 효과 및 접착 강도를 갖는다. 아프로티닌은 심하게 방해된 응집 하에서조차 지혈 특성 및 접착력에 영향을 주지 않는다는 강력한 증거가 있다.

문헌과 비교할 때, 타코콤 H 및 S는 산화 셀룰로오스 및 콜라겐 조각에 비하여 훨씬 신속한 지혈을 수행한다.

Claims

a) 다음 물리적 성질:

5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 담체, 및

상기 담체 상에 균일하게 분포되고 고정된,

b) 고형 피브리노겐, 및

c) 트롬빈을 주성분으로 하는 고체 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 담체가 폴리히알루론산, 폴리히드록시산, 예를 들면 젖산, 글루콜산, 히드록시부탄산, 셀룰로오스, 젤라틴, 또는 콜라겐 I형 섬유로 주로 구성된 콜라겐 스펀지와 같은 콜라겐 스펀지 등의 콜라겐과 같은 생분해성 중합체인 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 담체가 포유동물, 형질전환 (transgenic) 또는 재조합 공급원으로부터의 콜라겐 I형 재료를 포함하는 콜라겐 스펀지인 담체.
제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 담체는 피브리노겐이 2 내지 10 mg/cm², 예를 들면 4.3 내지 6.7 mg/cm², 바람직하게는 약 5.5 mg/cm²의 양으로 존재하고, 트롬빈이 1.5 내지 5.5 IU/cm², 바람직하게는 약 2.0 IU/cm²의 양으로 존재하는 하나 이상의 활성 측면을 갖는 것인 조성물.
제 1 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 천연 공급원으로부터 정제된 인간의 것이거나 형질전환 또는 재조합 인간 피브리노겐인 조성물.
제 1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 천연 공급원으로부터 정제된 것인 조성물.
제 1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 형질전환 또는 재조합의 것인 조성물.
제 1 내지 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 천연 공급원으로부터 정제된 인간의 것이거나 형질전환 또는 재조합 인간 트롬빈인 조성물.
제 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 천연 공급원으로부터 정제된 것인 조성물.
제 1 내지 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 형질전환 또는 재조합의 것인 조성물.
다음 물성:

5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 유연성 담체를 포함하며,

고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈을 더 포함하고,

아프로티닌, ε-아미노카프로산 또는 α2-안티플라스민 등의 항섬유소용해제를 포함하지 않으며,

상기 고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈은, 피복된 재료의 시료가 약 1000 rpm의 진동수에서 2 분 동안 Vibrofix 진탕기 상에서 흔들었을 때 1.0 mg/cm²미만의 마모를 갖도록 담체에 고정되어 있으며,

피복된 담체 재료가 내시경 장치 내로 삽입된 후 제거될 경우에, 상기 재료가 실질적으로 변화하지 않으며, 담체의 유연성 및 고형 피브리노겐 및 고형 트롬빈의 견고한 접착의 표시로서 피복 재료의 벗겨짐이 20% 미만이며,

상기 재료는 실질적으로 기밀 및 액체밀폐되어, 피복된 담체를 라텍스 시트에 고정시키고, 압력에 의해 라텍스를 세번 팽창시키며, 세번째에 라텍스 시트 팽창의 최고점에서의 피복된 담체의 면적을 측정하고, 피복된 담체의 팽창된 면적을 피복된 영역의 초기 면적과 비교하는 것을 포함하는 시험에 의해 결정된 1.25 이상의 탄성 역가를 갖는,

지혈, 조직 봉합 및 조직 접합용 재료.
다음 물성:

5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 담체,

및 충분한 양의 피브리노겐 및 충분한 양의 트롬빈의, 조직 봉합용 제품의 제조를 위한 용도.
다음 물성:

5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 담체,

및 충분한 양의 피브리노겐 및 충분한 양의 트롬빈의, 지혈용 제품의 제조를 위한 용도.
다음 물성:

5 내지 100 N/cm 범위의 탄성 모듈,

1 내지 10 mg/cm³의 밀도,

0.75 mm 초과 내지 4 mm 미만의 챔버 직경 및/또는 3 mm 미만의 챔버 평균 직경 중 적어도 하나를 갖는 담체,

및 충분한 양의 피브리노겐 및 충분한 양의 트롬빈의, 조직 봉합용 제품의 제조를 위한 용도.
제 12 내지 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 식도, 위, 소장, 대장, 직장과 같은 위장 계에서, 간, 지라, 췌장, 신장, 폐, 부신, 갑상선 및 림프 절과 같은 연조직 기관 상에서의 외과적 삽입술, 심혈관계 외과수술, 기관, 기관지 및 폐 수술을 포함하는 흉부 외과수술, 치과 수술을 포함하는 이비인후(ENT) 영역, 부인과, 비뇨기과, 혈관, 골격(예, 스폰지오사(sponsiosa) 절제) 및 응급 외과, 신경외과, 임파선, 답즙 및 뇌척수(CSF) 관에서의 외과적 삽입술, 및 흉부 및 폐부 외과 수술 도중의 공기 누수를 위한 용도.
제 12 내지 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체가 폴리히알루론산, 폴리히드록시산, 예를 들면 젖산, 글루콜산, 히드록시부탄산, 셀룰로오스, 젤라틴, 또는 콜라겐 I형 섬유로 주로 구성된 콜라겐 스펀지와 같은 콜라겐 스펀지 등의 콜라겐과 같은 생분해성 중합체인 용도.
제 12 내지 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체가 피브리노겐이 2 내지 10 mg/cm², 예를 들면 4.3 내지 6.7 mg/cm², 바람직하게는 약 5.5 mg/cm²의 양으로 존재하고, 트롬빈이 1.5 내지 2.5 IU/cm², 바람직하게는 2.0 IU/cm²의 양으로 존재하는 하나 이상의 활성 측면을 갖는 것인 용도.
제 12 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 인간의, 천연 공급원으로부터 정제된 것, 또는 형질전환 또는 재조합 인간 피브리노겐인 용도.
제 12 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 천연 공급원으로부터 정제된 것인 용도.
제 12 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐이 형질전환 또는 재조합의 것인 용도.
제 12 내지 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 천연 공급원으로부터 정제된 인간의 것이거나 형질전환 또는 재조합 인간 트롬빈인 용도.
제 12 내지 21항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 천연 공급원으로부터 정제된 것인 용도.
제 12 내지 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 트롬빈이 형질전환 또는 재조합의 것인 조성물.