CN114246974B - 一种止血贴的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种止血贴的制备方法，依次包括制作胶原载体、配制止血组合物的混悬液、在胶原载体表面喷涂混悬液以形成药液层、冻干药液层与胶原载体形成止血贴等步骤；所述混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为33‑50μm(优选37‑42μm)，5分钟沉淀体积占比均值>90％(优选≥95％)。该方法制备得到的止血贴的止血效果好、具有良好的生物相容性，在体内能完全降解，无需二次清创，避免了对伤员造成的二次伤害，可应用于各种突发事件、自然灾害(特别是强烈地震)等情况的伤员止血(特别是内脏出血的止血)，具有良好的商用价值和广阔的应用前景。

Description

一种止血贴的制备方法
技术领域
本发明涉及医用止血产品的制备技术领域，特别是涉及一种止血贴的制备方法。
背景技术
出血是外科手术和外伤中最常见、最难控制的问题之一，特别是重要脏器的出血，如肝脏、脾脏、肾脏破裂出血常常直接威胁生命。传统的止血方式(如结扎、压迫止血法)仅适用于大血管出血的止血，对弥漫性出血和内脏出血的止血效果有限。创伤出血也是一大致死因素，伤后快速有效止血是挽救伤病员生命的最重要手段。
然而当机体遭受重创时，自体凝血不足以迅速凝血，因此需要在创伤处外加止血材料控制出血。理想的止血材料在性能上有以下要求：(1)止血迅速(即凝固时间短)；(2)具有良好的生物相容性，无短期或长期的不良影响；(3)无需二次清创，不会对伤员造成二次伤害；(4)应用方便，即使非专业人员也易于使用；(5)在各种环境条件下稳定，保质期长。
目前，可用于外科手术和创伤救治的止血材料种类繁多，如纤维蛋白类、壳聚糖类天然生物止血材料，沸石、高岭土和蒙脱土类等矿物质止血材料，明胶-间苯二酚-甲醛类或氰化丙烯类等人工合成止血材料，其止血机制各不相同。这些止血材料存在着各自的缺点，如常用的壳聚糖类止血材料在创伤处的粘附性差，容易被血液冲走，大大降低了其止血效果；矿物质类止血材料不可吸收、需要二次清创，用于内脏出血的止血会对伤员造成二次伤害，而且安全性差；人工合成止血材料的生物相容性和降解性都较差，安全隐患多。
综上，纤维蛋白类止血材料制成的止血贴产品与以上这些材料相比，具有粘附性强、不需二次清创、不会造成二次伤害、可降解、低免疫原性和使用方便等优点，可用于轻中度和无固定出血点的出血，特别适用于内脏出血的止血。
公开号为CN1507358A的中国专利申请中公开了一种具有固体纤维蛋白原和固体凝血酶的载体，载体上均匀分散并固定有固体纤维蛋白原和固体凝血酶。该产品在制备时，先将胶原蛋白冻干(温度为2-10℃，压力低于1000mbar)，冻干的过程中凝胶状的胶原蛋白变成海绵状，用作载体；再在海绵状的胶原载体上涂敷含有固体纤维蛋白原和固体凝血酶的药液，最后真空干燥药液，得到上述载体。由于载体是海绵状，涂敷药液时药液会渗入载体的海绵结构中，冻干药液的过程中液体挥发，固体纤维蛋白原和固体凝血酶以粉末形式留在海绵结构中。使用时，药物粉末容易从胶原载体上脱落，无法保证其止血效果。
公开号为CN1487843A的中国专利申请中公开了一种含有纤维蛋白原、凝血酶和醇的悬浮液以及用其涂敷载体的方法，悬浮液中纤维蛋白原和凝血酶的颗粒的平均直径为25-100μm，颗粒平均直径跨度较大，使得悬浮液中颗粒的分布不均匀，导致喷涂在载体表面时颗粒大小不均匀；悬浮液的5min沉淀体积比＞85％，即颗粒沉降快，涂敷时颗粒容易沉积管路中，导致大颗粒药物的浪费以及喷涂在载体表面时颗粒大小不均匀，止血成分在载体上分布的均匀性差，进而降低产品的止血性能。此外，该方法中涂敷采用的是喷淋的方式，即在管路末端的侧面和底部均设有若干小孔，悬浮液通过小孔以喷淋的方式涂敷在载体上。为了保证载体边缘也涂敷有悬浮液，会有一些悬浮液喷淋在载体外，造成悬浮液的浪费。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种止血贴的制备方法，该方法能使止血组合物均匀喷涂在载体上，依次包括用胶原蛋白制作胶原载体、配制止血组合物的混悬液、在胶原载体表面喷涂混悬液以形成药液层、冻干药液层与胶原载体形成止血贴等步骤；所述混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为33-50μm(优选37-42μm)，和/或所述混悬液的5分钟沉淀体积占比均值>90％(优选≥95％)。
所述止血组合物包括16-46份(优选16-20份)纤维蛋白原、38-42份凝血酶和100-121份氯化钙，其中，纤维蛋白原以mg计为一份，凝血酶以IU计为一份，氯化钙以μg计为一份；优选的，止血组合物包括16-19份纤维蛋白原、39-41份凝血酶和103-118份氯化钙；更优选的，止血组合物包括17份纤维蛋白原、40份凝血酶、115份氯化钙(CaCl2)。
所述止血组合物遇水后形成的纤维蛋白多聚体的黏弹特性值tanδ<1，优选为0.13-0.31。
配制止血组合物的混悬液具体为：先将止血组合物分散于乙醇中形成药液，然后将药液置于分散机中均质，得到混悬液；优选的，药液置于分散机中均质具体为：搅拌药液5-10次，每次搅拌2min，搅拌速度(10-20)×103rpm，搅拌时间共计10-20min。
制作胶原载体具体为：取胶原蛋白于模具中，用刮板刮平形成厚度为0.3-0.5cm的胶原蛋白层，在19-23h内自20℃降至-50℃冷冻，得到表面光滑、内部结构致密的玻璃体状的胶原载体。
每平方厘米止血贴中含有纤维蛋白原16-46mg，凝血酶38-42IU，氯化钙100-121μg，胶原蛋白＞0.5mg。
用蠕动泵在胶原载体表面喷涂混悬液，蠕动泵的流速为50-80ml/min，喷液管摆动1-6次，喷涂的混悬液量为0.049-0.563ml/cm2。
使用带有试剂料盘平移机构和喷嘴横移机构的自动喷涂装置喷涂混悬液，喷嘴横移机构在竖直方向的单次移动距离3000-4500cmm，试剂料盘平移机构在水平方向的总移动距离3000-4500cmm。
每平方厘米所述胶原载体表面药液层的厚度为0.049-0.247mm。
冻干药液层与胶原载体形成止血贴具体为：将表面喷涂有药液层的胶原载体用冻干机于-50℃冷冻干燥49h40min-63h，至含水率小于10％，即得到止血贴。
本发明提供的止血贴的制备方法在喷涂前对药液进行均质处理，并通过调整均质过程的参数，使得止血组合物与乙醇形成均匀稳定的混悬液；混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为33-50μm(优选37-42μm)，直径跨度小，使得颗粒在混悬液中分布均匀，混悬液的5min沉淀体积比＞90％(优选＞95％)，即颗粒沉降较慢，在后续喷涂的过程中颗粒不容易沉积在喷嘴和管路中，不会堵塞喷嘴和管路，使得喷涂更均匀，止血组合物也得以在载体上均匀分布，进而提高止血贴产品的止血性能。本发明方法采用冷冻方式(而不是冻干)制作胶原载体，使得止血成分经冻干后可粘接在胶原载体上并形成不易脱落的药液层。
此外，本发明在喷涂时使用单个喷嘴对准单个胶原载体进行喷涂，相比常用的喷淋方式，可减少药液的损失；相比常用的手动喷涂方式，可在胶原载体的每一区域快速和均匀喷涂，实现了药液喷涂的自动化控制。
本发明方法制备出的止血贴中止血组合物分布均匀，凝固时间缩短，止血效果提高。该止血贴可用于内脏出血时的止血，使用时直接将其贴在内脏上的无固定出血点即可，操作简单、粘附性强、止血效果好、具有良好的生物相容性，在体内能完全降解，无需二次清创，避免对伤员造成二次伤害。该止血贴性能稳定、药液层不易脱落，可应用于各种突发事件、自然灾害(如强烈地震)等情况的伤员止血(特别是内脏出血的止血)，具有良好的商用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1所示为实施例2-1的止血组合物用实施例1-4的方法制备得到的止血贴的侧视图；
图2所示为图1止血贴的俯视图；
图3所示为比较例1-5方法制备得到的止血贴的俯视图；
图4是自动喷涂装置的立体结构示意图；
图5是喷液机构5的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供的一种止血贴的制备方法，包括以下步骤：
(1)、取少量牛胶原蛋白于模具中，用胶原刮板刮平，使胶原蛋白在模具上形成厚度为0.3-0.5cm的胶原蛋白层；除去多余的牛胶原蛋白后，再将压膜片贴在刮平的胶原蛋白层表面，贴的过程中要避免压膜片与胶原蛋白层之间出现大的气泡，最后在20～-50℃下梯度冷冻19-23h，揭去压膜片，冷冻的胶原蛋白层作为止血贴的固体载体，也叫胶原载体。
(2)、将纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙和低温无水乙醇(-20℃预冷)混合在一起形成药液，置于分散机(IKA，T 25 easy clean)中进行均质搅拌，均质过程中的搅拌速度为(10-20)×103rpm，搅拌药液的次数为5-10次，搅拌时间共计10-20min。均质后，即得到含止血组合物的混悬液，置于低温环境(-50℃～-20℃)中备用。
(3)、设置自动喷涂装置(自动喷涂装置的结构记载于授权公告号为CN214021579U的专利中)的参数：蠕动泵流速为50-80ml/min，喷液管摆动1-6次，喷涂的药液量为0.049-0.563ml/cm2，Y轴单次移动距离3000-4500cmm(1cmm(忽米)＝1×10-5m)；X轴总移动距离3000-4500cmm。
(4)、步骤(3)的参数设置完成后，将泵管(19#，硅胶制，内径2.4mm，外径5.6mm，购自保定兰格恒流泵有限公司)进口放入步骤(2)得到的混悬液中，利用自动喷涂装置将混悬液均匀地喷涂在冷冻后的胶原载体表面，混悬液在胶原载体表面形成一层药液层，每平方厘米胶原载体上药液层的厚度为0.049-0.247mm。
(5)、喷涂完成后将不锈钢药液盘放进提前预冷至-50℃的冻干机(CHRIST，Epsilon 2-4 LSC plus)中，冷冻干燥49h40min-63h(冻干时间过短，胶原载体和药液层内的水分含量过高，无法形成片状的贴剂产品；冻干时间过长，胶原载体和药液层内的水分含量过低，药液层会因过于干燥开裂，不仅影响产品外观，还会影响止血效果)，药液层在冷冻干燥的过程中会粘附在胶原载体表面，并与胶原载体粘合成一体的止血贴，至药液层的含水率不高于10％，停止冻干，取出、包装并灭菌，得到止血贴产品。
该方法中，与现有技术不同的是，步骤(1)胶原蛋白经冷冻(而不是冻干)形成胶原载体，这使得形成的胶原载体中没有海绵状结构，而是表面光滑、内部致密的玻璃状固体。再进行步骤(4)的混悬液喷涂时，混悬液不会渗入胶原载体内部，而是粘附在胶原载体光滑的表面上。最后进行步骤(5)的冻干时，胶原载体内部的水分和药液层中的溶剂共同挥发，在此过程中胶原载体和药液层中留下的物质相互渗透，使得两者紧密粘接在一起，使得药液层不易从胶原载体上脱落下来。
本发明方法中使用的止血组合物为纤维蛋白类，包括16-46份(优选16-20份)纤维蛋白原(来自人、哺乳动物或重组纤维蛋白原)、38-42份凝血酶(来自人、哺乳动物或重组凝血酶)和100-121份氯化钙，其中，纤维蛋白原以mg计为一份，凝血酶以IU计为一份，氯化钙以μg计为一份；优选的，包括17份纤维蛋白原、40份凝血酶、115份氯化钙(CaCl2)。其中，
纤维蛋白原(Fibrinogen)，即凝血因子Ⅰ，是一种含2964个氨基酸的大分子糖蛋白，相对分子质量为340KDa，由两个亚基(纤维蛋白肽A和B)组成，呈两侧对称性排列，每个亚基含有α、β、γ三条肽链，中间由29个二硫键连接构成(AαBβγ)2。纤维蛋白原是纤维蛋白的前体，足够的纤维蛋白原水平是形成有效凝血的基本要求。本发明的止血组合物含有足量的纤维蛋白原，能向失血处补充额外的纤维蛋白原，纤维蛋白原经凝血酶酶解成纤维蛋白，纤维蛋白在凝血酶、血液中的凝血因子XIII和XIIIa的共同作用下聚合形成呈坚实血凝块状的纤维蛋白多聚体，堵塞出血血管或创伤表面，阻止出血血管或创伤继续出血，达到止血的目的。本发明可使用人纤维蛋白原，也可使用哺乳动物纤维蛋白原和重组的纤维蛋白原，可购自华兰生物工程股份有限公司、上海源叶科技有限公司、南京赛泓瑞生物科技有限公司；人纤维蛋白原为白色、灰白色或淡黄色疏松体，可粉碎成粉末状。
凝血酶(Thrombin)是一种丝氨酸蛋白酶，主要功能在于将可溶于水的纤维蛋白原水解成不溶于水的纤维蛋白，因此在止血和凝血、组织修复和创伤愈合等方面有重要作用。凝血酶是由凝血酶原(凝血因子Ⅱ)激活产生，主要转换成具有活化形式的α-凝血酶(在凝血酶中含量＞97％，余量是少量的β-和γ-凝血酶)。本发明可使用人凝血酶，也可使用哺乳动物凝血酶和重组的凝血酶，可购自华兰生物工程股份有限公司、上海源叶科技有限公司、南京赛泓瑞生物科技有限公司，为白色、灰白色或淡黄色疏松体，可粉碎成粉末状。
钙离子(Ca2+)，即凝血因子Ⅳ。一般用氯化钙提供Ca2+，Ca2+在各个凝血途径中均不可或缺。如在内源性凝血途径中，Ca2+可以协助激活凝血因子Ⅺ(存在于血液中)，凝血因子Ⅺ会参与其他凝血途径进而发挥凝血作用；而且在Ca2+和血小板磷脂存在的条件下，凝血因子Ⅹ(存在于血液中)也会被激活，进而在共同凝血途径中发挥作用。在外源性凝血途径中，Ca2+、凝血因子Ⅲ(存在于血液中)和凝血因子Ⅶ(存在于血液中)可一同激活凝血因子Ⅹ，进而在共同凝血途径中发挥作用。在共同凝血途径中，Ca2+结合凝血酶、凝血因子Ⅴ(存在于血液中)和激活的凝血因子Ⅹ(内、外源性凝血途径中激活的)能将纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，发挥止血和凝血作用。另外，Ca2+还可以协助激活凝血因子XIII(存在于血液中)，进而激活凝血因子XIIIa(存在于血液中)，凝血因子XIIIa再作用于纤维蛋白单体，将其变成稳定的纤维蛋白多聚体血凝块。本发明使用的氯化钙购自北京红星化工厂，呈白色颗粒状。
该止血组合物以纤维蛋白原、凝血酶和钙离子为主要止血成分，止血原理是模拟生物凝血级联反应的最后阶段，即：止血组合物与出血部位接触时，纤维蛋白原在凝血酶及Ca2+的作用下，形成纤维蛋白单体；然后在凝血因子XIIIa的作用下纤维蛋白单体进一步聚合形成纤维蛋白多聚体，多聚体以血凝块形式存在，作为障碍物堵塞住出血血管或创伤表面，可有效地阻止出血血管或创伤表面继续出血。同时，凝血酶能促进血小板的粘附、活化和聚集，聚集活化的血小板进一步释放凝血活性物质，如二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、血栓素A2、五羟色胺等；同时Ca2+能激活某些凝血因子，这些凝血活性物质和凝血因子可以增加凝血酶的生成，进而增加且加快纤维蛋白及多聚体的形成，如此良性循环，正向地加速凝血和止血。
在此基础上，本发明还提供了一种止血贴，包括上述止血组合物和固体载体。固体载体需要具有可降解性，常用的可降解固体载体材料有氧化再生纤维素、聚乳酸蛋白和胶原蛋白等。本发明使用胶原蛋白作为止血贴的固体载体，这是因为胶原蛋白(Collagen)具有发达的四级结构，能够形成支架状结构，可用作载体。此外，胶原蛋白还可通过促进血小板聚集发挥止血作用，能够促进血管的形成和生长，对局部组织具有修复功能。常用的胶原蛋白有牛胶原蛋白、猪胶原蛋白、马胶原蛋白等，这些胶原蛋白均来源于哺乳动物，具有低免疫原性。本发明的具体实施例中使用牛胶原蛋白作为止血贴的固体载体，因此也称该固体载体为胶原载体。牛胶原蛋白液购自天津世纪康泰生物医学工程有限公司，呈透明凝胶状。该止血贴的原料包括：16-46mg/cm2的纤维蛋白原，38-42IU/cm2的凝血酶，100-121μg/cm2的氯化钙，≥0.5mg/cm2的胶原蛋白。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
实施例1
本发明提供的止血贴的制备方法，包括以下步骤：
(1)、将方形模具(医用级PVC制成，尺寸4.9cm×4.9cm×1cm)放进316不锈钢药液盘中，取少量牛胶原蛋白(透明凝胶状，购买后不作处理，直接使用)于模具中，用胶原刮板(316不锈钢制成)刮平，使胶原蛋白在模具上形成厚度为0.3-0.5cm的胶原蛋白层；除去多余的牛胶原蛋白后，再将压膜片(医用级PVC制成)贴在刮平的胶原蛋白层表面，贴的过程中要避免压膜片与胶原蛋白层之间出现大的气泡，最后在20～-50℃下梯度(即：温度从20℃梯度降至-50℃)冷冻19-23h，揭去压膜片，冷冻的胶原蛋白层作为止血贴的固体载体，也叫胶原载体。
梯度冷冻具体可以为：1h内温度从20℃降至0℃，再在18-22h内降温至-50℃，并维持该温度2h。
(2)、将纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙和低温无水乙醇(-20℃预冷)混合在一起形成药液，置于分散机(IKA，T 25 easy clean)中进行均质搅拌，均质过程中的搅拌速度为15×103rpm，搅拌药液的次数为5-10次，搅拌时间共计10-20min。均质后，即得到含止血组合物的混悬液，置于低温环境(-50℃～-20℃)中备用。
(3)、设置自动喷涂装置(自动喷涂装置的结构记载于授权公告号为CN214021579U的专利中)的参数：蠕动泵流速为50-80ml/min，喷液管摆动1-6次，喷涂的药液量为0.049-0.563ml/cm2，Y轴单次移动距离3000-4500cmm(1cmm(忽米)＝1×10-5m)；X轴总移动距离3000-4500cmm。
(4)、步骤(3)的参数设置完成后，将泵管(19#，硅胶制，内径2.4mm，外径5.6mm，购自保定兰格恒流泵有限公司)进口放入步骤(2)得到的混悬液中，利用自动喷涂装置将混悬液均匀地喷涂在冷冻后的胶原载体表面，混悬液在胶原载体表面形成一层厚度为1-5mm的药液层。
(5)、喷涂完成后将不锈钢药液盘放进提前预冷至-50℃的冻干机(CHRIST，Epsilon 2-4 LSC plus)中，冷冻干燥49h40min-63h(冻干时间过短，胶原载体和药液层内的水分含量过高，无法形成片状的贴剂产品；冻干时间过长，胶原载体和药液层内的水分含量过低，药液层会因过于干燥开裂，不仅影响产品外观，还会影响止血效果)，药液层在冷冻干燥的过程中会粘附在胶原载体表面，并与胶原载体粘合成一体的止血贴，其含水率不高于10％，停止冻干，取出、包装并灭菌，得到止血贴产品。
该方法中使用的自动喷涂装置用于向316不锈钢药液盘中的方形模具的每一区域喷涂止血组合物以制成止血贴。图4为该自动喷涂装置的结构示例。该自动喷涂装置包括试剂料盘平移机构3、喷液机构5和喷嘴横移机构6，试剂料盘平移机构3设有用于驱动设置在试剂料盘平移机构3上的试剂料盘平移往复运动(即左右水平移动，X轴)的平移驱动电机，喷嘴横移机构6设有用于驱动设置在喷嘴横移机构6的喷嘴65横移往复移动(即前后水平移动，Y轴)的横移驱动电机，喷嘴位于试剂料盘4的上方，喷液机构5设有用于将药液通过一喷管52推进至喷嘴65中的蠕动泵51(参见图5)，使药液定量喷涂在布设有底板的试剂料盘的每一区域。其中，平移驱动电机能够正反转动，使安装在试剂料盘平移机构3上的试剂料盘4平移往复运动，横移驱动电机能够正反转动，使安装在喷嘴横移机构6上的喷嘴65沿与试剂料盘4平移方向相垂直的方向作线性往复运动；喷液机构5的蠕动泵针对试剂料盘4的每一区域抽取预定量的药液，从而实现向试剂料盘4的每一区域内按预定路线快速、均匀的喷涂药液，保持了药物活性，减少了药液损失，保证喷涂的均匀性。
按上述方法制备得到一系列止血贴实施例(止血贴中用到的止血组合物为实施例2-1)，仅是制备步骤中的操作和/或参数不同，具体见下表1。
表1止血贴实施例的制备方法中各步骤的参数
以表1中实施例1-4方法制备得到的止血贴为例，其俯视图和侧视图见图1和图2，侧视图中半透明状态的是胶原载体，白色的为药液层；该止血贴中的药液层完整且牢固地粘接在胶原载体上，抖动和振动都不易脱落。
与此同时，还按上述方法制备得到一系列止血贴比较例，仅是制备步骤中的操作和/或参数不在本发明方法的范围内，具体见下表2。
表2止血贴比较例的制备方法中各步骤的参数
在喷涂的过程中发现，当表2中比较例1-1～1-4喷涂药液的参数不在本发明方法的范围内时，或者喷在胶原载体外(实施例1-1、1-3)，造成药液的浪费；或者药液不能完全覆盖胶原载体(实施例1-4)，或者止血组合物颗粒因喷涂过程不好控制而导致喷涂不均匀(实施例1-2)。因此这几个比较例没有进行后续的冻干步骤。本实施例还做了比较例1-5，制备过程与实施例1-4相同，仅是在步骤(1)中对胶原蛋白采用冻干的方式(而不是冷冻的方式)，冻干温度也是20～-50℃下梯度降温，冻干压力为不超过1000mbar，冻干时间为52h40min，将胶原蛋白制成胶原海绵，将其作为载体并在其上喷涂药液，再一起冻干。结果发现得到的样品(见图3)药液层成粉末状，抖动会掉落，且药液层出现开裂，表明药液层易脱落，用于止血时会因为止血成分的掉落而降低止血效果。
实施例2
本发明还配制了以下止血组合物实施例，并通过实验验证止血组合物实施例中各物质的含量对止血贴的影响。
实施例2-1
本实施例的止血组合物由17mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、115μg氯化钙(CaCl2)组成。
实施例2-2
本实施例的止血组合物由16mg纤维蛋白原、38IU凝血酶、100μg氯化钙(CaCl2)组成。
实施例2-3
本实施例的止血组合物由20mg纤维蛋白原、42IU凝血酶、121μg氯化钙(CaCl2)组成。
实施例2-4
本实施例的止血组合物由18mg纤维蛋白原、39IU凝血酶、110μg氯化钙(CaCl2)组成。
实施例2-5
本实施例的止血组合物由17mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、103μg氯化钙(CaCl2)组成。
实施例2-6
本实施例的止血组合物由46mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、115μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-1
本比较例的止血组合物由10.3mg纤维蛋白原、28.6IU凝血酶、2500μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-2
本比较例的止血组合物由15mg纤维蛋白原、37.5IU凝血酶、117μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-3
本比较例的止血组合物由13mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、115μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-4
本比较例的止血组合物由47mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、115μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-5
本比较例的止血组合物由17mg纤维蛋白原、45IU凝血酶、115μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-6
本比较例的止血组合物由17mg纤维蛋白原、30IU凝血酶、115μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-7
本比较例的止血组合物由17mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、80μg氯化钙(CaCl2)组成。
比较例2-8
本比较例的止血组合物由17mg纤维蛋白原、40IU凝血酶、130μg氯化钙(CaCl2)组成。
实验一、平均粒径和沉淀体积占比的测定
本发明发现制备止血贴方法的步骤(2)中，得到的混悬液中颗粒的平均直径和5min沉淀体积占比(混悬液制备完成后静置5min，测量静置前混悬液中颗粒的整体初始高度(记为H0)和静置后混悬液中颗粒的高度(记为H)，5min沉淀体积占比＝H/H0)会影响后续喷涂的均匀效果：颗粒直径大时，混悬液中颗粒的沉降速度快，容易沉积堵住泵管，导致混悬液无法喷出或者喷涂不均匀。因此本实验通过调整制备方法中步骤(2)的参数以得到粒径和5min沉淀体积占比不同的含止血组合物的混悬液。步骤(2)的药液用分散机均质后，温度会发生变化，温度过高会对纤维蛋白原和凝血酶的蛋白活性产生影响，因此本实验还检测了均质前后混悬液的温度。
本实验的具体过程为：将实施例2-1～2-6的止血组合物分别加入预先冷却至-20℃的无水乙醇，搅拌制成药液，药液中各物质的终浓度为纤维蛋白原140.5mg/ml、凝血酶330.6IU/ml、氯化钙950.5μg/ml。然后用分散机(IKA，T 25easy clean)对药液进行均质搅拌处理，搅拌速度为15×103rpm，搅拌5-10次，单次搅拌时间为2min(搅拌时间为30s时，后续喷涂会堵塞泵管)，均质过程的时间共计10-20min。每一次均质后取三个样品，并记录样品均质前和均质停止时的温度，以及5min沉淀体积占比。以实施例2-1的止血组合物为例，进行了两组实验，两组实验(实验A和实验B)的不同之处，仅在于搅拌次数不同。实验A中搅拌次数为5次，结果见表3；实验B中搅拌次数为10次，结果见表4。
表3实验A均质前后的温度、平均直径和5min沉淀体积占比
由表3的结果显示，混悬液在步骤(2)的均质前后温度差不超过1.5℃，不会影响蛋白的活性；均质后混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为37.78μm，每次均质后的5min沉淀体积占比均高于90％，均质结束后得到的混悬液的5min沉淀体积占比能达到95％，表明该均质过程得到的混悬液可达到更高的5min沉淀体积占比。
表4实验B均质前后的温度、平均直径和凝固时间
表4的结果显示，均质后混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为41.63μm，每次均质后的5min沉淀体积占比平均值高于90％(表中未示出)，表明该均质过程得到的混悬液可达到更高的5min沉淀体积占比。混悬液在步骤(2)的均质前后温度差不超过2.5℃，温度变化＜10℃不会影响蛋白的活性。
此外，本实验还用凝固时间表征均质过程对蛋白活性的影响，以纤维蛋白原的凝固时间为例，结果见表4。表4的结果显示，每次均质后纤维蛋白原的凝固时间均不超过22s，符合《中国药典》(2020版)对人纤维蛋白原活性标准中凝固时间﹤60s的规定。
表3和表4的结果显示，制备止血贴方法的步骤(2)得到的混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为37.78-41.63μm，5min沉淀体积占比均高于90％，表明得到的混悬液颗粒粒径较集中，跨度小，颗粒的沉降速度慢，不容易沉积堵住泵管，在后续的喷涂中能达到喷涂均匀的效果。混悬液均质处理前后的温度差＜10℃，均质后纤维蛋白原凝固时间＜60s，符合《中国药典》(2020版)的要求，均表明均质过程不会对纤维蛋白原和凝血酶的蛋白活性产生影响。
由于原料中各物质的含量与均质的效果无关，因此本实验中用实施例2-1的结果就可表明其他实施例具有与实施例2-1相同的结果，在此不一一赘述。
实验二、力学性能的检测
本实验旨在模拟止血组合物与血液接触后形成纤维蛋白多聚体血凝块，再检测其力学性能。以力学性能指标：储能模量(G＇)、损耗模量(G")和黏弹特性值tanδ(G"/G＇)为检测指标。
1.样品的制备
取实施例2-1～2-6止血组合物中的纤维蛋白原溶于1ml水中制成水溶液A，再取实施例2-1～2-6止血组合物中的凝血酶和氯化钙溶于1ml水中制成水溶液B，最后将水溶液A和水溶液B混合，形成凝块样品，检测其力学性能指标。该过程中加入的水用来模拟血液，形成的凝块用来模拟形成的纤维蛋白多聚体血凝块。
2.力学性能指标的检测
在流变仪(安东帕，MCR302)的测试板上放置凝块样品，加热到37℃，测试转子的直径为12mm，测试转子与测试板之间的距离为1mm。采用小振幅(1％)的动态方法，即：在频率为0.1～10Hz的小振幅振荡下剪切凝块样品，然后用频率扫描测量样品的储能模量(G＇)和损耗模量(G")，并计算得出黏弹特性值tanδ(G"/G＇)；tanδ＜1，说明样品趋向于凝胶体，不易发生形变，即：止血组合物在使用时不易被血液冲破，可维持其原本的形态；tanδ＞1，说明样品趋向于流体，容易发生形变，即：止血组合物在使用时容易被血液冲破，无法维持其原本的形态。以实施例2-1和实施例2-5为例，结果见表5。
表5实施例2-1和2-5止血组合物的力学性能测试结果
实施例 储能模量G＇ 损耗模量G" 黏弹特性值tanδ
实施例2-1 180.85-285.5 46.781-77.814 0.1396-0.3091
实施例2-5 353.32-418.99 55.866-90.722 0.1581-0.2265
表5的结果表明，实施例2-1和实施例2-5止血组合物形成的凝块样品的tanδ＜1，说明形成的凝块样品趋向于凝胶体，不易发生形变，即：本发明的止血组合物在使用时不易被血液冲破，可维持其原本的形态。
实验三、凝固时间的测定
样品：
对照样品1：按照公开号为CN1507358A的中国专利申请中公开的内容制备得到，其止血成分由纤维蛋白原5.5mg/cm2和凝血酶2.0IU/cm2组成。
对照样品2：止血成分由纤维蛋白原15mg/cm2，凝血酶37.5IU/cm2和氯化钙117μg/cm2组成。
实验样品：实施例2-1～2-6的止血组合物。
比较样品：比较例2-1、2-3～2-8的止血组合物。
本实验将单位平方厘米中含有的止血组合物/止血成分加入水中，用来模拟在血液中的凝固情况。根据文献报道，单位面积对照样品1和2的吸血量不超过4ml。因此本实验利用磁珠法，将单位平方厘米含有的止血组合物/止血成分中的纤维蛋白原加入5ml水中形成溶液A，再把剩余止血成分(凝血酶或凝血酶和氯化钙)加入5ml水中形成溶液B，取100μl溶液A和100μl溶液B等体积加样于血凝仪的反应杯中，血凝仪自动检测出溶液A和溶液B反应生成纤维蛋白多聚体凝块的时间，记作凝固时间。以实施例2-1、2-2、2-5和2-6为例，结果见表6。
表6样品的凝固时间
表6的结果显示，同等稀释比例下，实施例2-1、2-2、2-5和2-6的止血组合物在凝固时间上均优于对照样品1和2，且差异显著；表明本发明的止血组合物在止血效果上显著优异于对照样品1和2。另外，实施例2-1、2-2、2-5和2-6的止血组合物在凝固时间上也均优于比较例2-1、2-3～2-8，且差异显著；表明本发明的止血组合物在止血效果上显著优异于比较例2-1、2-3～2-8；特别是比较例2-4，仅是纤维蛋白原的含量略高于实施例2-6，在凝固时间上有显著提高，表明本发明提供的止血组合物中通过调整纤维蛋白原、凝血酶和氯化钙的含量，可使三者协同发挥更优异的止血效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (8)

1.一种止血贴的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取少量牛胶原蛋白于模具中，用胶原刮板刮平，使胶原蛋白在模具上形成厚度为0.3~0.5cm的胶原蛋白层；除去多余的牛胶原蛋白后，再将压膜片贴在刮平的胶原蛋白层表面，贴的过程中要避免压膜片与胶原蛋白层之间出现大的气泡，最后在20～-50℃下梯度冷冻19~23h，揭去压膜片，冷冻的胶原蛋白层作为止血贴的固体载体，也叫胶原载体，所述胶原载体是表面光滑、内部致密的玻璃状固体；
所述在20～-50℃下梯度冷冻19~23h，冷冻梯度为1h内温度从20℃降低至0℃，再在18~22h内降温至-50℃，并在-50℃维持2h；
步骤2：将纤维蛋白原、凝血酶、氯化钙和-20℃预冷的无水乙醇混合在一起形成药液，置于分散机中进行均质搅拌，均质过程中的搅拌速度为(10~20)×103rpm，搅拌药液的次数为5~10次，搅拌时间共计10~20min，均质后，即得到含止血组合物的混悬液，置于-50℃～-20℃环境中备用；
步骤3：设置自动喷涂装置的参数：蠕动泵流速为50~80ml/min，喷液管摆动1~6次，喷涂的药液量为0.049~0.563ml/cm2，Y轴单次移动距离3000~4500cmm；X轴总移动距离3000~4500cmm；
所述自动喷涂装置包括试剂料盘平移机构、喷液机构和喷嘴横移机构，试剂料盘平移机构设有用于驱动设置在试剂料盘平移机构上的试剂料盘平移往复运动的平移驱动电机，喷嘴横移机构设有用于驱动设置在喷嘴横移机构的喷嘴横移往复移动的横移驱动电机，喷嘴位于试剂料盘的上方，喷液机构设有用于将药液通过一喷管推进至喷嘴中的蠕动泵，使药液定量喷涂在布设有底板的试剂料盘的每一区域；
步骤4：步骤3的参数设置完成后，将泵管进口放入步骤2得到的混悬液中，利用自动喷涂装置将混悬液均匀地喷涂在冷冻后的胶原载体表面，混悬液在胶原载体表面形成一层药液层，每平方厘米胶原载体上药液层的厚度为0 .049~0.247mm；
步骤5：喷涂完成后将不锈钢药液盘放进提前预冷至-50℃的冻干机中，冷冻干燥49h40min~63h，药液层在冷冻干燥的过程中会粘附在胶原载体表面，并与胶原载体粘合成一体的止血贴，至药液层含水率不高于10％，停止冻干，取出、包装并灭菌，得到止血贴产品；
其中，所述混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为33-50μm，和/或所述混悬液的5分钟沉淀体积占比均值>90%；每平方厘米止血贴中含有纤维蛋白原16~46mg，凝血酶38~42IU，氯化钙100~121μg，胶原蛋白＞0.5mg。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混悬液中止血组合物颗粒的平均直径为37~42μm。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述混悬液的5分钟沉淀体积占比均值≥95%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述止血组合物包括16~20份纤维蛋白原、38~42份凝血酶和100~121份氯化钙，其中，纤维蛋白原以mg计为一份，凝血酶以IU计为一份，氯化钙以μg计为一份。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述止血组合物包括16~19份纤维蛋白原、39~41份凝血酶和103~118份氯化钙，其中，纤维蛋白原以mg计为一份，凝血酶以IU计为一份，氯化钙以μg计为一份。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述止血组合物包括17份纤维蛋白原、40份凝血酶和115份氯化钙，其中，纤维蛋白原以mg计为一份，凝血酶以IU计为一份，氯化钙以μg计为一份。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述止血组合物遇水后形成的纤维蛋白多聚体的黏弹特性值tanδ<1。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，tanδ为0.13-0.31。
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