ES2253523T3

ES2253523T3 - Un metodo para preparar una esponja de colageno, un dispositivo para extraer una parte de una espuma de colageno, y una esponja de colageno alargada.

Info

Publication number: ES2253523T3
Application number: ES02718481T
Authority: ES
Inventors: Alfred Schaufler
Original assignee: Nycomed Pharma AS
Current assignee: Takeda AS
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2022-01-25
Also published as: NO332462B1; AU2002249528B2; HK1058371A1; NO20033297L; DE60203364D1; EE05587B1; BG66439B1; IL157096A0; EA200300823A1; BRPI0206705B8; SI1343542T1; PL206194B1; PL206197B1; ME00587B; MXPA03006687A; PL363274A1; ATE310044T1; HUP0303893A2; DE60207389T2; AR032517A1

Abstract

Un método para preparar una esponja de colágeno, el cual comprende las etapas de: - preparar un gel de colágeno. - mezclar aire en el gel de colágeno de modo que se obtenga una espuma de colágeno, - secar la espuma de colágeno de modo que se obtenga un bloque seco de la esponja de colágeno que tiene una estructura tridimensional con cámaras apiladas que están separadas y encerradas sustancial y totalmente por paredes de material colágeno; y - aislar, del bloque de esponja de colágeno, partes de la esponja con un diámetro de cámara superior a 0, 75 mm y menores que 4 mm, o partes con un diámetro medio de cámara de cómo máximo 3 mm.

Description

Un método para preparar una esponja de colágeno, un dispositivo para extraer una parte de una espuma de colágeno, y una esponja de colágeno alargada.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para preparar una esponja de colágeno. La esponja de colágeno producida de acuerdo con la invención es de particular utilidad en cirugía, principalmente para detener hemorragias capilares. La esponja de colágeno también se puede usar como un portador que ha de ser revestido con una preparación de adhesivo de fibrina. La invención también se refiere a un dispositivo para extraer una parte de espuma de colágeno. Asimismo, la invención se refiere a una esponja de colágeno alargada, principalmente para uso gastrointestinal.

Antecedentes de la invención

El colágeno se ha empleado como un agente un hemoestíptico desde fines de los años sesenta del pasado siglo. El colágeno es la proteína estructural más frecuente en todos los mamíferos. La proteína monoméra de aproximadamente 300 kDa (tropocolágeno) está covalentemente reticulada en sitios específicos. Por lo tanto, la proteína madura es insoluble y forma fibrillas características con alta resistencia a la tracción. Se han descrito numerosas sub-clases de colágeno, siendo la más común de las cuales el colágeno del tipo I, que es el tipo de colágeno principal que se encuentra en la piel, los tendones, los huesos y la córnea. El colágeno es una proteína fibrosa que consiste sustancialmente en una triple hélice de una longitud de aproximadamente 290 nm. Cinco de estas triples hélices (moléculas de tropocolágeno) se presentan colocadas al tresbolillo formando una microfibrilla con un diámetro de aproximadamente 3,6 nm. Estas microfibrillas tienen segmentos polares y no polares que son fácilmente accesibles para las interacciones inter- e intrafibrilares específicas. Las microfibrillas se empaquetan en un retículo tetragonal formando sub-fibrillas con un diámetro de aproximadamente 30 nm. Luego estas sub-fibrillas se ensamblan en la fibrilla de colágeno, la unidad básica del tejido conjuntivo, que tiene un diámetro de varías centenas de nm y, por lo tanto, es visible en un microscópico óptico como una línea delgada, véase la referencia 1. El gel de colágeno y la esponja de colágeno, tal como se producen por el proceso de fabricación, comprenden estas fibrillas como las unidades más pequeñas, tal como se demuestra por microscopía.

El colágeno se puede usar como un material para sellar heridas, posiblemente, con un revestimiento que comprende un adhesivo de fibrina. Los adhesivos de fibrinas, es decir, la combinación de fibrinógeno, trombina y aprotinina se han usado terapéuticamente con éxito durante varios años para pegar tejidos y nervios y para sellar superficies cuando la hemorragia no es importante. Una desventaja del adhesivo de fibrinas es que en el caso de una hemorragia importante, el adhesivo por lo general es eliminado por lavado antes que haya tenido lugar una polimerización suficiente de la fibrina. Para superar este problema, los cirujanos han aplicado de forma manual adhesivo de fibrina líquido a portadores absorbibles, tales como vellón de colágeno.

A pesar del impresionante éxito de estas aplicaciones combinadas, este método no se ha aplicado a gran escala, debido a ciertas desventajas. La preparación es relativamente engorrosa, el método requiere experiencia y personal idóneo; por otra parte, la preparación no está fácilmente disponible en casos de emergencia; el tiempo para la preparación varía en el intervalo de 10 a 15 minutos. Estos factores estimularon el desarrollo de un producto mejorado que dio como resultado la creación de una combinación fija de un portador de colágeno cubierto con un revestimiento de fibrinógeno sólido, trombina sólida y aprotinina sólida, tal como se describe en la patente europea EP-0059265. El producto que se describe en EP 0059265 el cual se ha comercializado bajo la marca TachoComb® se puede aplicar directamente a la herida. Cuando el revestimiento entra en contacto con los fluidos acuosos como la sangre, otros fluidos corporales o solución salina, los componentes se disuelven y se forma la fibrina. El producto se aplica a la herida ejerciendo una leve presión y el colágeno queda firmemente unido (pegado) a la superficie lesionada. Se logra la hemostasis y la herida queda sellada.

Además de cierta actividad estimulante de la coagulación de la sangre, la función del colágeno en TachoComb® es principalmente la de un portador que adsorbe y confiere estabilidad mecánica a la preparación coagulante con la que se reviste. Otras ventajas del colágeno, en particular, en forma de una esponja son: su biodegradabilidad, su resistencia a la tracción relativamente elevada, incluso cuando en estado húmedo, su resistencia a la penetración de líquidos y aire y su alta flexibilidad en estado húmedo.

La presente invención se refiere básicamente a la producción de una esponja de colágeno que se puede usar como un portador para el fibrinógeno, la trombina y/o la aprotinina, por ejemplo, en TachoComb®. La esponja de colágeno también se puede aplicar como un vendaje, directamente, es decir, sin un revestimiento, como vendaje sobre lesiones tópicas, para soportar la hemostasis, como por ejemplo, para la prevención de nuevas hemorragias, para una hemorragia débil y difusa de los órganos parenquimaticos, para la aplicación sobre quemaduras, injertos de piel, defectos de la piel por decúbito, o como un vendaje tópico para lesiones

En la técnica anterior, se sugirió una serie de métodos para la preparación de un portador de colágeno. La solicitud de patente WO 86/05811 describe una microesponja con carga para inmovilizar materiales bioactivos en los sistemas de biorreactores motrices, donde la microesponja comprende una matriz de colágeno altamente reticulada. La matriz de colágeno altamente reticulada se prepara mediante la trituración de una fuente del tipo I, II ó III de colágeno, para obtener fibras cuyo diámetro sea en el orden de 1 a 50 \mum y una longitud no mayor que 200 \mum. El colágeno triturado forma un colágeno soluble disuelto en un disolvente, o un colágeno insoluble disperso en un disolvente por mezcla con un disolvente, como por ejemplo, ácido acético, ácido láctico, ácido propiónico o ácido butírico. En el caso de una dispersión de colágeno, la mezcla se logra con un alto nivel de agitación, usando un mezclador, para obtener microfibras de colágeno. Luego se incorpora un aditivo de lastre o carga en la mezcla de colágeno-líquido y con la mezcla compuesta se forman gotas pequeñas, que se solidifican por congelación. Se describen varías técnicas para obtener partículas pequeñas. El material compuesto congelado se sea por congelación a vacío; la combinación de congelación y secado recibe el nombre de liofilización. La matriz de colágeno liofilizada se trata de tal manera que se reticule el colágeno. El colágeno se puede reticular usando agentes de reticulación químicos, mediante deshidratación intensa a una temperatura elevada o por una combinación. El propósito es que la matriz de colágeno sea resistente a la colagenasa y a otra degradación enzimática, haciendo de este modo estos materiales resultan particularmente adecuados para el cultivo de organismos. Después de lavar la matriz de colágeno reticulada, las microesponjas se pueden esterilizar y envasar asépticamente. En la microesponja con carga, la matriz de colágeno tiene una estructura porosa abierta en la superficie, con un tamaño medio de poros que varía desde alrededor de 1 hasta aproximadamente 150 \mum, ocupando los poros de la matriz entre aproximadamente 70 y alrededor de 98% en volumen de la microesponja. La microesponja tiene además un tamaño medio de partículas que fluctúa entre aproximadamente de 100 y aproximadamente 1000 \mum y una densidad relativa de más de aproximadamente 1,05. El material con carga puede ser metálico o aleaciones de metal, óxidos metálicos y cerámicas

La patente de EE.UU. 5.660.857 describe un proceso para la preparación de un material compuesto que comprende una matriz de proteína insoluble y un material oleaginoso, que resulta de utilidad como material para apósitos quirúrgicos e implantes biomédicos y como un material cosmético para la aplicación a la piel. El proceso de la patente de EE.UU. 5.660.857 comprende las etapas de mezclar una proteína, el material oleaginoso y agua para formar una emulsión del material oleaginoso en una dispersión acuosa de la proteína y, posteriormente, secar o liofilizar la emulsión para formar una película o una esponja. La proteína fibrosa insoluble comprende en forma predominante el colágeno insoluble, que puede obtenerse ventajosamente de la piel de ganado bovino. En una realización, el colágeno se puede expandir en un ácido láctico antes de usarlo.

La solicitud de patente WO 99/13902 describe un método para la producción de una matriz de crecimiento de los tejidos meníngeos, que comprende la etapa de preparar colágeno fisiológicamente compatible, que esta sustancialmente libre de priones y virus activos. El colágeno forma una película, una esponja, un colágeno no tejido o un fieltro. El colágeno se obtiene mediante un proceso que comprende la eliminación de la grasa de la piel, tendones, ligamentos o huesos. El material se somete luego a un tratamiento enzimático, por el que se hincha el material de colágeno. El material de colágeno se hincha aun más con una solución ácida. La mezcla de colágeno se homogeneiza posteriormente. El producto obtenido puede ser una matriz que proporcionada en forma de una esponja de colágeno, una matriz no tejida, un fieltro o película, o un material compuesto de dos o más de las formal anteriores. Se puede proporcionar una esponja de colágeno mediante la adaptación de los métodos para formar esponjas de colágeno que se describen en la patente de EE.UU. 5.019.087. La esponja se puede preparar por liofilización de una dispersión de colágeno preparada de acuerdo con la solicitud de patente WO 99/13902. Se dice que la densidad de la esponja lograda es entre aproximadamente 0,1 mg/cm^{3} y aproximadamente 120 mg/cm^{3}. De acuerdo con la descripción de la solicitud de patente WO 99/13902, el tamaño de los poros fluctúa entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 \mum. Se mencionan un estratificado de esponja de colágeno y una película de
colágeno.

La patente de EE.UU. 5.618.551 se refiere a un polvo de gelatina o colágeno tratado con pepsina no reticulado y potencialmente reticulable, modificado por escisión oxidante en una solución acuosa, que es soluble a un pH ácido y estable durante la conservación a una temperatura inferior a 0ºC, durante al menos un mes. La patente se refiere, asimismo, a un proceso para preparar el polvo, que comprende: preparar una solución ácida del colágeno tratado con pepsina; someter la solución acuosa ácida a temperatura ambiente hasta lograr una oxidación controlada; precipitar el colágeno tratado con pepsina oxidado y no reticulado a un pH ácido; y aislar, concentrar y deshidratar el colágeno tratado con pepsina oxidado y no reticulado para obtenerlo en forma de un polvo ácido reactivo; y congelar y conservar el polvo ácido reactivo a una temperatura menor que 0ºC.

La patente GB 1.292.326 describe un método y aparato para preparar dispersiones de colágeno con vistas a sus aplicaciones, donde se prepara una suspensión de fibras de colágeno y posteriormente, se la introduce en una cámara de tratamiento can medios de agitación. Existe una presión subatmosférica en la cámara de tratamiento, donde la suspensión se transforma en una dispersión por agitación y acidificación controlada, por medio de un ácido orgánico o mineral. De acuerdo con la descripción de la patente GB 1.292.326, la preparación de artículos de colágeno esponjosos puede efectuarse a partir de una dispersión o geles de colágeno. En este contexto, el documento se refiere a la liofilización y a la dispersión de geles que son muy ricos en burbujas de aire. La patente GB 1.292.326 menciona asimismo, un problema referido al control de la introducción o la eliminación de burbujas de aire en forma satisfactoria. El documento hace referencia, en dos ejemplos, a una dispersión de colágeno que carece de burbujas de aire, can un contenido de colágeno del 2,5% y una dispersión aireada de colágeno con una concentración de colágeno de 2,5%, respectivamente.

Chemical Abstracts, Columbus Ohio, US, Vol. 98, del 13 de junio de 1983 No. 24, menciona un colágeno obtenido de tejidos animales, tales como piel, tendón o hueso sometido a un tratamiento con ácidos. El colágeno se reagrega por diálisis, proceso durante el cual se forma una red de fibras cristalinas altamente birrefringentes. El colágeno puede conformarse en láminas de 0,5 mm - 2 cm o mezclarse con aire, para formar las esponjas o se puede dispersar como una crema.

Descripción de la invención

Se ha descubierto que el revestimiento satisfactorio de una esponja de colágeno con una preparación adhesiva de fibrina depende de la textura de la esponja de colágeno. Por lo tanto, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método para producir una esponja de colágeno con una cierta textura, en particular, con el fin de hacer que la esponja de colágeno sea adecuada para el revestimiento con una preparación adhesiva de fibrina, para obtener un material para cicatrizar y sellar heridas. Es otro objeto de la invención proporcionar un método para producir una esponja de colágeno que tenga características físicas mejoradas, con relación a las esponjas de la técnica anterior, en el sentido de mejores humedad, elasticidad, densidad y módulo de elasticidad. Otro objeto de la invención es proporcionar un método para preparar una esponja de colágeno, que es estanca al aire y a los líquidos, en el sentido que, una vez que la esponja de colágeno se aplica a una herida, no permitirá que el líquido o aire empape a través de la esponja de colágeno. Es otro objeto más de la invención proporcionar un material para cerrar heridas que se pueda usar en tractos gastrointestinales o en la tráquea.

Así, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para preparar una esponja de colágeno, la cual comprende las etapas de:

-: preparar un gel de colágeno.

-: mezclar aire en el gel de colágeno de modo que se obtenga una espuma de colágeno,

-: secar la espuma de colágeno de modo que se obtenga un bloque seco de la esponja de colágeno que tiene cámaras en su interior, y

-: aislar, del bloque de esponja de colágeno, partes de la esponja con un diámetro de cámara superior a 0,75 mm y menores que 4 mm, o que tengan un diámetro medio de cámara de cómo máximo 3 mm.

En el presente contexto, la expresión "diámetro de cámara" debe interpretarse como la mayor distancia en línea recta de pared a pared en una cámara, es decir, la mayor distancia diagonal en línea recta de una cámara. Las cámaras pueden adoptar una forma poligonal, tal como una forma octogonal.

Se ha encontrado que un diámetro de cámara superior a 0,75 mm y menor que 4 mm, o un diámetro de cámara de como máximo 3 mm, brinda una esponja de colágeno particularmente útil, para ser revestida con una preparación adhesiva de fibrina. Preferiblemente, el gel de colágeno tiene una masa seca que varía en el intervalo de 2-20 mg de masa seca por cada 1 g de gel, tal como 4-18 mg, tal como 5-13 mg, tal como 6-11 mg por cada 1 g de gel. La viscosidad dinámica del gel de colágeno es preferiblemente de 2-20 Ncm, tal como 4-10 Ncm, tal como 6-8 Ncm. La esponja de colágeno preferentemente tiene un contenido de agua no superior a 20%, tal como 10-15%, tal como aproximadamente 18%. El modulo de elasticidad de la esponja de colágeno preferentemente varía en el intervalo de 5-100 N/cm^{2}, tal como 10-50 N/cm^{2} y la densidad de la esponja es preferentemente de 1-10 mg/cm^{3}, tal como 2-7 mg/cm^{3}.

Se ha observado que una esponja de colágeno preparada de acuerdo con el método de la invención es estanca al aire y a los líquidos, en el sentido de que, una vez que la esponja de colágeno se aplica a una herida, impide el paso del líquido o del aire a través de la esponja de colágeno. Los líquidos se absorben en la esponja. Este efecto se debe básicamente al hecho que la etapa de mezclar aire con el gel de colágeno proporciona una esponja de colágeno que tiene una estructura tridimensional con cámaras apiladas, separadas y sustancialmente rodeadas por completo por paredes de material colágeno, en contraposición con las esponjas de colágeno conocidas que tienen una estructura de fibras.

El gel de colágeno puede comprender material de diferentes tipos, tal como tipo I, II y III de mamíferos o de origen transgénico o recombinante, pero se pueden usar todos los otros tipos de colágeno. El colágeno puede comprender material de tendones seleccionados del grupo que consiste en tendones equinos, tendones humanos y tendones bovinos. El gel de colágeno, en forma alternativa o adicional, puede contener material de colágeno recombinante.

El contenido de colágeno de las partes aisladas de la esponja es preferiblemente de 50% - 100%, con relación a la masa seca de la esponja, tal como 75% - 100%, tal como 80% - 100%, tal como 85% - 100%, tal como 90% - 100%, tal como 92 - 100%, tal como 92 - 98%, tal como 93 - 97%, tal como 94% - 96%.

La etapa de preparar el gel de colágeno comprende preferiblemente comprende a su vez las etapas de:

-: conservar los tendones a una temperatura entre -10ºC y -30ºC, y pelar los tendones,

-: eliminar las proteínas extrañas de los tendones,

-: reducir el contenido de gérmenes en los tendones,

-: hinchar los tendones, y

-: homogeneizar los tendones hinchados.

Las etapas de conservación, pelado, eliminación de proteínas, reducción del contenido de gérmenes e hinchamiento cumplen el fin de purificar la materia prima, mientras que la etapa de homogeneización pretende obtener el colágeno en forma de un gel.

La etapa de reducir el contenido de gérmenes comprende preferiblemente añadir un ácido, tal como un ácido orgánico, tal como ácido láctico a los tendones. Asimismo, se añade preferiblemente a los tendones un disolvente orgánico, tal como un alcohol, tal como etanol. Además, la etapa de hinchar los tendones comprende preferiblemente añadir ácido láctico a los tendones. El ácido láctico usado puede ser un ácido láctico al 0,40 - 0,50%, tal como un ácido láctico al 0,45%.

La etapa de hinchar los tendones puede comprender conservar los tendones a una temperatura de 4ºC a 25ºC, tal como una temperatura de 10ºC a 20ºC, durante un periodo de 48 a 200 horas, tal como un periodo de 100 a 200 horas.

La etapa de homogenizar los tendones hinchados se lleva a cabo preferiblemente para obtener un tamaño de partículas de fragmentos de gel de colágeno, es decir, bolas de fibras, con un diámetro de 0,8 - 1,2 cm, tal como aproximadamente 1 cm. Por otro lado, las características físicas del gel de colágeno preferiblemente son tales como se indicaron anteriormente. Las características apropiadas se pueden lograr, por ejemplo, realizando la etapa de homogenización de los tendones hinchados por medio de una molienda con disco dentado o un equipo de homogeneización
adecuado.

La etapa de mezclar aire en el gel de colágeno comprende preferiblemente las etapas de:

-: mezclar aire del ambiente en el gel por medio de un mezclador para generar una espuma de colágeno,

-: alimentar la espuma de gel mixta en un canal de fraccionamiento, y

-: separar el gel de colágeno de la espuma de colágeno contenida en el canal de fraccionamiento.

Al menos parte del gel de colágeno separado de la espuma de colágeno en el canal de fraccionamiento puede volver a introducirse en el mezclador. En ese caso, la relación entre la cantidad de gel de colágeno que vuelve a introducirse en el mezclador desde el canal de fraccionamiento y la cantidad de gel de colágeno de nueva aportación que se lleva al mezclador varía preferiblemente entre 0,1 y 0,5. La etapa de separación del gel del colágeno de la espuma de colágeno comprende preferiblemente las etapas de:

-: separar una parte seleccionada de la espuma de colágeno contenida en el canal de fraccionamiento, y

-: conducir la parte seleccionada de la espuma de colágeno fuera del canal de fraccionamiento para su correspondiente secado.

En una realización preferida del método se mantiene una temperatura de 15ºC a 40ºC, como por ejemplo, de 20ºC a 25ºC en el canal de fraccionamiento.

Después de mezclar aire en el gel de colágeno, la espuma de colágeno se puede homogeneizar durante un periodo de 2 a 4 minutos,

Antes de la etapa de secado de la espuma de colágeno y después de la etapa de introducir mezclar aire en el gel de colágeno, se puede añadir un agente neutralizante a la espuma de colágeno, y la espuma de colágeno preferiblemente neutralizada para tener un valor de pH que normalmente varía entre 2,5 y 3,5 a un valor de pH en la espuma de colágeno entre 6,5 y 8,5. Se puede usar un agente neutralizante que comprende una solución de amoniaco y la espuma de colágeno se neutraliza preferiblemente durante un periodo de 5-30 horas, tal como 10-20 horas, tal como aproximadamente 24 horas.

Antes de la etapa de secado de la espuma de colágeno, la espuma de colágeno se llena preferiblemente en un recipiente de secado de manera que sustancialmente no haya arrastre de aire en la espuma durante el llenado.

Preferiblemente la etapa de secado comprende secar a una temperatura de entre 15ºC y 60ºC, tal como entre 20ºC y 40ºC, durante un periodo de 50-200 horas, tal como 100-150 horas, para obtener una esponja de colágeno seca. El secado se puede realizar a una presión levemente inferior a la presión atmosférica, tal como una presión entre 700 y 900 milibares, tal como aproximadamente 800 milibares.

La esponja de colágeno producida a través del método anterior satisface preferiblemente por lo menos uno de los siguientes criterios:

\newpage

-: valor de pH entre 5,0 y 6,0,

-: contenido de ácido láctico como máximo 5%,

-: contenido de amonio como máximo 0,5%,

-: contenido de proteínas solubles, calculado como contenido de albúmina, como máximo 0,5%,

-: contenido de cenizas de sulfato como máximo 1,0%,

-: contenido de metales pesados como máximo 20 ppm,

-: pureza microbiológica como máximo, 10^{3} UFC/g,

-: contenido de colágeno de 75% a 100%,

-: densidad de 1-10 mg/cm^{3}, tal como 2-7 mg/cm^{3}.

-: módulo de elasticidad de 5-100 N/cm^{2}, tal como 10-50 N/cm^{2}.

La etapa de aislar las partes de la esponja de colágeno puede comprender dividir la esponja de colágeno en una pluralidad de partes por corte. Las partes obtenidas pueden ser de cualquier forma deseada, tal como cónica, cilíndrica, incluso cilíndrica con un corte transversal anular, rectangular, poligonal, cúbica y de láminas planas o puede convertirse en un granulado mediante el método de granulación apropiado etc.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una esponja de colágeno, que comprende las etapas de:

-: preparar un gel de colágeno,

-: mezclar aire en el gel de colágeno para obtener una espuma de colágeno,

-: secar la espuma de colágeno para obtener un bloque seco de la esponja de colágeno que tiene cámaras en su interior, y

-: aislar del bloque de esponja de colágeno partes de la esponja, que tengan las siguientes propiedades:

-: módulo de elasticidad dentro del intervalo de 5 a 10 N/cm,

-: densidad dentro del intervalo de 1 a 10 mg/cm^{3}, y

-: diámetro de cámara superior a 0,75 mm y menor que 4 mm, o un diámetro medio de cámara de como máximo 3 mm.

Debe entenderse que cualquiera de las etapas del método de acuerdo con el primer aspecto de la invención también se puede realizar con el método de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. Por otro lado, cualquiera de las características y funciones de la esponja de colágeno producida por el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención se puede lograr por el método de acuerdo con el segundo método de la invención.

De acuerdo con la presente invención puede usarse un dispositivo para extraer una parte de una espuma de colágeno y para degenerar otra parte de la espuma de colágeno en un gel de colágeno, el cual comprende:

-: un canal de fraccionamiento que comprende una entrada para recibir un flujo de espuma de colágeno, una salida para una parte del flujo de la espuma de colágeno y una porción de fondo que está inclinada hacia abajo, en la dirección del flujo de espuma de colágeno, y

-: al menos una salida para el gel de colágeno en la porción de fondo del canal de fraccionamiento, donde la posición de la salida es movible en una dirección vertical en un extremo del canal de fraccionamiento,

El método de la presente invención puede proporcionar una esponja de colágeno alargada, que tiene una perforación u orificio pasante y una pared flexible. En una realización preferida, dicha esponja de colágeno puede usarse para cerrar heridas o restablecer las paredes del tracto gastrointestinal y de la tráquea en mamíferos. Así, la esponja de colágeno puede tener una sección transversal circular o elíptica. La esponja de colágeno se puede aplicar tanto como un relleno, como en un tracto gastrointestinal, o como un manguito de salida a una superficie externa de un tracto gastrointestinal. El diámetro interno de la perforación u orificio pasante para su aplicación en diversos tractos gastrointestinales humanos y la tráquea, puede ser, por ejemplo, como sigue:

\newpage

Intestinos	0,5 - 6 cm
Recto	1 - 4 cm
Intestino grueso	2 - 6 cm
Intestino delgado	0,5 - 3 cm
Esófago	0,5 - 2 cm
Tráquea	1 - 4 cm

La esponja de colágeno se puede usar, por ejemplo, para cerrar heridas después de la extirpación quirúrgica de formaciones externas tipo bolsas sobre las paredes del tracto gastrointestinal, tal como después de la cirugía rectal, a saber, después de la extirpación quirúrgica de las hemorroides. Ejemplos de indicaciones que se hacen posibles gracias a la esponja de colágeno de acuerdo con la invención son:

-: vendajes para heridas,

-: soporte de hemostasis, tal como,

-: hemorragia débil, difusa de los órganos parenquimáticos,

-: procedimientos quirúrgicos en sitios de operación donde se haya llevado a cabo electrocirugía o ligadura antes de la aplicación de la esponja de colágeno,

-: prevención de nuevas hemorragias (fijación de suturas)

-: aplicación sobre quemaduras, y

-: vendajes en lesiones tópicas,

-: administración de fármacos, tal como suministro de antibióticos.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 y 2 contienen un diagrama de flujo que ilustra las etapas de una realización preferida del método de acuerdo con la invención.

La Figura 3 es una fotografía de la superficie de una esponja de colágeno producida por un método de acuerdo con la invención (cortesía del Prof. Dr. Román Carbon, Chirurgische Univ. Klinik Erlangen, Alemania), y

La Fig. 4 describe un dispositivo de agitación para obtener una medida de la viscosidad de un gel de colágeno.

Descripción de los dibujos

En una realización preferida, la invención comprende las siguientes etapas, conforme se ilustra en las Figuras 1 y 2.

Etapa 1

Provisión de tendones de altamente congelados (criotratados)

Los tendones de caballo se disponen y conservan a una temperatura de -18ºC a -25ºC.

Etapa 2

Pelado de los tendones de caballo

En un estado a medio congelar, se retira la piel delgada de los tendones de forma manual o mecánica, con un cuchillo. Los tendones se vuelven a congelar a bajas temperaturas (criotratamiento) de -18ºC a -25ºC.

Etapa 3

Corte mecánico en forma de rebanadas de los tendones equinos pelados

De forma opcional, los tendones congelados pelados se desinfectan durante 30 minutos en etanol al 70% y se trasladan a las salas de producción bajo etanol. Luego, los tendones se lavan y después de lavarlos, se compactan en bloques y congelan a temperaturas entre -18ºC y -25ºC. Los bloques de tendones congelados se cortan en rebanadas con un cortador de cuchilla giratoria, para obtener así rebanadas de un espesor aproximado de 1 mm.

Etapa 4

Lavado y desinfección de las rebanadas de tendones

Para eliminar las proteínas solubles, las rebanadas de tendones se sumergen primero en agua para inyección, durante 3 - 6 horas, luego se lavan con agua para inyección o agua desmineralizada o soluciones salinas que contengan iones Ca^{2+} y/o Mg^{2+} en un intervalo de 1-10 mM, hasta que ya no haya hemoglobina en el sobrenadante. Las rebanadas de tendones se desinfectan en etanol al 70%, durante 15 minutos y se lavan dos veces en ácido láctico al 0,45% en agua potable (estéril, filtrada y despirogenizada) para eliminar el etanol.

Etapa 5

Producción del gel de colágeno

Las rebanadas de tendones lavados se sumergen (remojan) en ácido láctico al 0,45%, durante 2-5 días, preferiblemente, 4 días, y luego se homogeneizan en un gel de colágeno. La exposición al ácido láctico al 0,45% se considera una las etapas de capital importancia en la inactivación de los virus.

Etapa 6

Formación de la espuma

Mediante unos agitadores-disolvedores se introduce por batido aire estéril filtrado en el gel de colágeno. La espuma que va surgiendo se fracciona y se recoge la fracción que tiene un tamaño de burbuja comprendido entre 1 - 3 mm. La espuma se vierte desde el recipiente de acero en un recipiente cilíndrico que se hace girar lentamente, durante aproximadamente 3 minutos, para obtener una espuma homogénea. Con esta espuma se llenan los recipientes de secado. La base del recipiente consiste en un tejido textil que es permeable a los fluidos, para permitir el drenaje de la espuma. Después de 5 - 24 horas, preferiblemente, 18-24 horas, la espuma drenada se expone a amoniaco gaseoso, por ejemplo, generado por una solución de amoniaco al 26% de calidad DAB. Durante este proceso, el excedente de amoniaco cambia el pH de la espuma a la región alcalina. El amoniaco se elimina durante el proceso posterior de secado, lo cual da como resultado un producto neutro.

Etapa 7

Secado de la espuma

La espuma se seca con aire tibio, en una cámara de secado de acero de alta calidad, durante 48 - 150 horas, preferiblemente, 120 - 150 horas. El resultado es la esponja de colágeno que tiene forma de bloques.

Etapa 8

Corte de los bloques de colágeno

Los bloques de colágeno, también denominados láminas, se pueden usar, por ejemplo, como portadores para un revestimiento. El corte se realiza con una máquina de corte vertical. Primeramente se recortan los lados del bloque, para obtener un bloque con lados verticales cuya longitud lateral sea 50 cm. Después, este bloque se corta verticalmente en 4 barras, con un ancho de 11 cm. Las barras se vuelven a recortar en su lado superior e inferior y luego se cortan en tiras, con dimensiones de 50 x 11 x 0,4 - 0,7 cm. El peso de las tiras de la esponja de colágeno preferiblemente tiene en cuenta cualquier especificación de colágeno del producto final a lograr, tal como TachoComb® H, TachoComb® y Tachotop®.

Etapa 9

Selección de las tiras de la esponja de colágeno

Las tiras de la esponja de colágeno se someten luego a un control visual. Se descartan aquellas tiras que presenten uno o más de los siguientes defectos:

-: tiras con un diámetro medio de cámara menor que 1 mm o mayor que 3 mm,

-: tiras con una estructura de cámara no homogénea,

-: tiras agujereadas (cámaras individuales con una profundidad mayor que el espesor de la esponja).

Las tiras seleccionadas se conservan como máximo durante un año, en recipientes metálicos ligeros y desinfectados, a una temperatura de 15 - 25ºC.

\newpage

La Figura 3 es una fotografía de la superficie de una esponja de colágeno producida por un método de acuerdo con la invención, la fotografía se tomó con un factor de ampliación de aproximadamente 20.000 (cortesía del Prof. Dr. Román Carbon, Chirurgische Univ. Klinik Erlangen, Alemania). La superficie que se muestra en la fotografía de la Figura 3 es una superficie de un corte transversal en una esponja de colágeno, preparada por un método de acuerdo con la presente invención. Las áreas oscuras de la fotografía representan las cámaras, mientras que las áreas claras de la fotografía representan el material de colágeno, que incluye las paredes de material de colágeno que separan las cámaras.

La Figura 4 muestra un dispositivo de agitación para obtener una medida de la viscosidad de un líquido, que comprende un recipiente adaptado para alojar un líquido y medios de agitación para dicho líquido. El medio de agitación comprende una varilla unida a un elemento con forma de horquilla. El líquido del recipiente se agita aplicando una fuerza de torsión a la varilla, lo cual da como resultado un movimiento giratorio del elemento con forma de horquilla. El elemento con forma de horquilla comprende una parte principal 41 a la que está conectada la varilla y una primera y una segunda partes secundarias 42. Las partes secundarias están conectadas con los extremos de la parte principal. A medida que gira el elemento con forma de horquilla las superficies mueven el líquido y, de esta manera, lo agitan.

En una forma de realización, el dispositivo tiene las siguientes dimensiones. El recipiente posee una altura de 110 mm y un ancho de 146 mm. La altura de la varilla es 220 mm y su diámetro 10 mm. La parte principal 41 de la horquilla es una longitud de 90 mm y de una altura de 30 mm. Las partes secundarias 42 tienen una altura de 90 mm y una anchura de 30 mm. La distancia desde el borde externo de las partes secundarias 42 hasta una superficie interior del recipiente es 28 mm.

Ejemplo I

La Tabla I presentada a continuación muestra los valores de los parámetros de tres ciclos diferentes del método de acuerdo con la invención.

TABLA I

	Ciclo 1	Ciclo 2	Ciclo 3
Pelado de los tendones: (%) de desechos	24	40	38
Biocargaprevia al pelado UFC/g de tendón	7x10^{4}	2,4x10^{5}	5x10^{5}
Biocarga posterior al pelado (UFC/g de tendón)	-	2x10^{3}	5x10^{3}
Peso del tendón por lote	12,00 kg	10,5 kg	10,5 kg
Lavado de tendones pelados con agua	30 min	30 min	30 min
desmineralizada
\begin{minipage}[t]{70mm} Eliminación de la proteína soluble: lavado de los tendones rebanados con agua desmineralizada hasta que la solución queda libre de hemoglobina \end{minipage}	5h	5h	1,5h
Desinfección con etanol al 70%	15 min	15 min	15 min
Lavado en ácido láctico al 0,45%	21 min	21 min	21 min
Inmersión (remojo) en ácido láctico al 0,45%	144 h	120 h	120 h
Homogenización	Molienda suave	Molienda suave	Molienda suave
	en Condux	en Condux	en Condux
Viscosidad del gel (par de torsión)	6,9-7,8 Ncm	6,9-7,8 Ncm	7,1-9,5 Ncm
Masa seca de gel de colágeno	6,3-8,3 mg/g	8,9-9,4 mg/g	7,1-9,5 mg/g
Tiempo de espumación por bloque	37-47 min	51-58 min	54-62 min
Biocarga (UFC/ml de espuma húmeda)	-	2	1
Periodo de drenaje	18,5h	22h	18h
Periodo de neutralización	24h	24h	24,5h

TABLA I (continuación)

	Ciclo 1	Ciclo 2	Ciclo 3
Periodo de secado	147 h	148,5h	144,5 h
Peso por bloque	200-256 g	195-228 g	177-257 g
Biocarga de las tiras de esponja de colágeno	14-1000	<18-124	<11-33
Rendimiento de las tiras de la esponja de	405	379	433
colágeno:
\hskip0.3cm Longitud: 110 mm
\hskip0.3cm Ancho: 500 mm
\hskip0.3cm Altura: 4-7mm
\hskip0.3cm Peso: 770-1500 mg/ tira

La Tabla II presentada a continuación muestra los valores de parámetros de tres esponjas de colágeno diferentes obtenidas por el método de acuerdo con la invención.

TABLA II

	Esponja I	Esponja II	Esponja III
Valor de pH (espec: 4-6)	5,4	5,1	5,4
Contenido de ácido láctico	2,6%	2,8%	2%
Contenido de amonio	0,2%	0,2%	0,1%
Contenido de proteína soluble	0,1%	0,05%	0,08%
Contenido de cenizas de sulfato	0,4%	0,3%	0,3%
Pureza microbiológica (UFC/g)	14-1000	<18-124	<11-33
Contenido de colágeno relacionado con la masa seca	95%	95%	98%
Contenido de agua	14%	15%	16%
Módulo de elasticidad	10-45 N/cm^{2}	15-50 N/cm^{2}	12,3-41,0 N/cm^{2}
Tamaño de la cámara (Diámetro: valor medio)	2,3 mm	2,1 mm	2,9 mm
Densidad	2,5-6,1 mg/cm^{3}	2,9-5,9 mg/cm^{3}	2,4-5,0 mg/cm^{3}
	Esponja IV	Esponja V
Valor de pH	5,3	5,7
Contenido de ácido láctico	2,3%	1,1%
Contenido de amonio	0,1%	1,1%
Contenido de proteína soluble	0,04%	0,11%
Contenido de cenizas de sulfato	0,3%	0,2%
Contenido de metales pesados	<20 ppm	<20 ppm
Pureza microbiológica	<12-345 UFC/g	<15-48 UFC/g
Contenido de colágeno con relación a la masa seca	95%	96%

TABLA II (continuación)

	Esponja IV	Esponja V
Contenido de agua	14%	12%
Módulo de elasticidad	10,4-42,1 N/cm	20-47 N/cm
Tamaño de la cámara (Diámetro: valor medio)	2,99 mm	2,5mm
Densidad	2,9 - 5,3 mg/cm^{3}	2 - 6,8 mg/cm^{3}

Ejemplo II

Este ejemplo se refiere a la medición indirecta de la viscosidad del gel de colágeno, por medición del par de torsión.

El equipo usado para la medición del par de torsión es:

-: Máquina de agitación: EUROSTAR POWER con control de viscosidad.

-: Programa que se ejecuta en Windows: IKASOFT dc.

-: Indicador de par de torsión: VISCOKLICK VK 1.

-: Datalogger DC 2.

-: Construcción especial de agitador ("horquilla") con dimensiones definidas, véase también Fig. 4.

-: Embudo con diámetro interno de 14,6 cm y una altura de 20,5 cm.

-: Termómetro.

-: Balanza

Con una cantidad de 1500 g de gel de colágeno se llena el embudo. La temperatura de la muestra es 23ºC. El agitador con forma de horquilla está fijado en el centro del embudo. Comienza la medición. El indicador de par de torsión transforma la resistencia del agitador en un valor (Ncm) que representa la viscosidad dinámica del gel.

Para verificar la medida del par de torsión, se prepara una solución estándar de polietilenglicol al 59%. La viscosidad de esta solución se mide con un viscosímetro Haake RV 20 Rotovisko. La viscosidad dinámica \eta de esta solución está en el intervalo de \eta = 925 \pm 25 mPa a 23ºC. La viscosidad de esta solución se mide con el equipo de medición de gel mencionado anteriormente y, por lo tanto, el valor del par de torsión medido debe estar en el intervalo de 3,66 Ncm \pm 5% a 23ºC.

Referencias

1. Baer, E. Gathercole, L. J. and Keller, A., Structure hierarchies in tendon collagen: an interim summary, [Jerarquías estructurales en el colágeno de los tendones: resumen provisional]. Proc. Colston Conf., 1974, 189; Hiltner, A. Cassidy, J. J. and Baer, E., Mechanical properties of biological polymers, [Propiedades mecánicas de los polímeros biológicos]. Ann. Rev. Mater. Sci., 15, 455, 1985).

Claims

1. Un método para preparar una esponja de colágeno, el cual comprende las etapas de:

-: preparar un gel de colágeno.

-: secar la espuma de colágeno de modo que se obtenga un bloque seco de la esponja de colágeno que tiene una estructura tridimensional con cámaras apiladas que están separadas y encerradas sustancial y totalmente por paredes de material colágeno; y

-: aislar, del bloque de esponja de colágeno, partes de la esponja con un diámetro de cámara superior a 0,75 mm y menores que 4 mm, o partes con un diámetro medio de cámara de cómo máximo 3 mm.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el contenido de colágeno de las partes aisladas de la esponja es de 50 a 100%.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el gel de colágeno comprende material de colágeno de diferentes tipos, seleccionados entre al menos uno de las siguientes fuentes: mamíferos, fuentes transgénicas y recombinantes.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el colágeno comprende material obtenido de tendones seleccionados del grupo que consiste en: tendones equinos, tendones bovinos y tendones humanos.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en donde la etapa de preparar el gel de colágeno comprende las etapas de:

-: eliminar las proteínas extrañas de los tendones,

-: reducir el contenido de gérmenes en los tendones,

-: hinchar los tendones, y

-: homogeneizar los tendones hinchados.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la etapa de reducir el contenido de gérmenes comprende la adición de un ácido y un disolvente orgánico a los tendones.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el ácido es un ácido orgánico, tal como ácido láctico.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en donde el disolvente orgánico es un alcohol, tal como etanol.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en donde la etapa de hinchar los tendones comprende la adición de ácido láctico a los tendones.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde el ácido tiene un valor de pH comprendido en el intervalo de 1 a 4, tal como 1,5 a 3,5, tal como 2,5 a 3,0.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde el ácido láctico es un ácido láctico al 0,45%.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en donde la etapa de hinchar los tendones comprende la conservación de los tendones a una temperatura de 4ºC a 25ºC durante periodo de 48 a 200 horas.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde los tendones se conservan durante un periodo de 100 a 120 horas.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-13, en donde la etapa de homogeneizar los tendones hinchados comprende la obtención de una sustancia que contiene partículas de tendones, teniendo las partículas una longitud o diámetro de 0,8 a 1,2 cm.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-14, en donde la etapa de homogeneizar los tendones hinchados comprende la obtención de una sustancia cuya viscosidad es de 2 a 20 Ncm.

16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-15, en donde la etapa de homogeneizar los tendones hinchados se lleva a cabo por medio de una molienda con discos dentados o un equipo comparable.

17. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el gel de colágeno tiene una viscosidad dinámica de 2-20 Ncm.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa de mezclar aire en el gel de colágeno comprende las etapas de:

-: mezclar aire del ambiente en el gel por medio de un mezclador de modo que se genere una espuma de colágeno,

-: alimentar la espuma de gel mixta a un canal de fraccionamiento, y

-: separar el gel de colágeno y la espuma de colágeno contenidos en el canal de fraccionamiento.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde al menos una parte del gel de colágeno separada de la espuma de colágeno en el canal de fraccionamiento se devuelve de nuevo en el mezclador.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la relación entre la cantidad de gel de colágeno que se devuelve al mezclador, desde el canal de fraccionamiento, y la cantidad de gel de colágeno de nueva aportación que entra en el mezclador varía entre 0,1 y 0,5.

21. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en donde la etapa de separar el gel de colágeno y la espuma de colágeno comprende las etapas de:

-: conducir la parte seleccionada de la espuma de colágeno fuera del canal de fraccionamiento para su secado.

22. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, que comprende además mantener una temperatura entre 15ºC y 40ºC en el canal de fraccionamiento.

23. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además, después de mezclar aire en el gel de colágeno, homogeneizar la espuma de colágeno durante un periodo de 2 a 4 minutos.

24. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, el cual comprende además, antes de la etapa de secar la espuma de colágeno y después de la etapa de mezclar aire en el gel de colágeno, añadir un agente neutralizante a la espuma de colágeno y neutralizar la espuma de colágeno para alcanzar un valor de pH en la espuma de colágeno entre 6,5 y 8,5.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el agente neutralizante comprende una solución de amoniaco.

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 24 ó 25, en donde la espuma de colágeno se neutraliza durante un periodo de 5-30 horas.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la espuma de colágeno se neutraliza durante un periodo de 20-30 horas.

28. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa de secado comprende secar a una temperatura entre 15ºC y 60ºC durante un periodo de 48-200 horas, de modo que se obtenga una esponja de colágeno seca.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la etapa de secado se lleva a cabo a una presión de entre 700 y 900 milibares.

30. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa de secado comprende secar a una temperatura entre 15ºC y 40ºC durante un periodo de 100-200 horas.

31. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la esponja de colágeno satisface al menos uno de los siguientes criterios:

-: valor de pH entre 5,0 y 6,0,

-: contenido de ácido láctico como máximo 5%,

-: contenido de amonio como máximo 0,5%,

-: contenido de cenizas de sulfato como máximo 1,0%,

-: contenido de metales pesados como máximo 20 ppm,

-: pureza microbiológica como máximo 10^{3} UFC/g,

-: contenido de colágeno de 75% a 100%,

-: densidad 1-10 mg/cm^{3}, tal como 2-7 mg/cm^{3}_{,}

-: módulo de elasticidad en el intervalo de 5-100 N/cm^{2}.

32. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la esponja de colágeno tiene un contenido de agua que no es mayor que 20%.

33. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la etapa de aislar las partes de la esponja de colágeno comprende dividir la esponja de colágeno en una pluralidad de partes por corte.

34. Un método para preparar una esponja de colágeno, que comprende las etapas de:

-: preparar un gel de colágeno,

-: mezclar aire en el gel de colágeno, de modo que se obtenga una espuma de colágeno,

-: secar la espuma de colágeno, de modo que se obtenga un bloque seco de la esponja de colágeno que tiene una estructura tridimensional con cámaras apiladas que están separadas y rodeadas sustancial y totalmente por paredes de material colágeno, y

-: aislar, del bloque de esponja de colágeno, partes de la esponja, que tengan las siguientes propiedades:

-: módulo de elasticidad dentro del intervalo de 5 a 100 N/cm^{2},

-: densidad en el intervalo de 1 a 10 mg/cm^{3}, y

-: diámetro de cámara mayor que 0,75 mm y menor que 4 mm, o un diámetro medio de cámara de como máximo 3 mm.

35. Un método de acuerdo con la reivindicación 34, que comprende las etapas de cualquiera de las reivindicaciones 1-33.