ES2223533T3 - Promotor que permite la expresion de transgenes en toda la planta excepto en la semilla. - Google Patents
Promotor que permite la expresion de transgenes en toda la planta excepto en la semilla.Info
- Publication number
- ES2223533T3 ES2223533T3 ES00940461T ES00940461T ES2223533T3 ES 2223533 T3 ES2223533 T3 ES 2223533T3 ES 00940461 T ES00940461 T ES 00940461T ES 00940461 T ES00940461 T ES 00940461T ES 2223533 T3 ES2223533 T3 ES 2223533T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sequence
- plant
- gene
- protein
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Hydroponics (AREA)
Abstract
Secuencia promotora que permite la expresión de un gen de interés en los tejidos de un planta, excepto en la semilla en maduración y en la semilla seca, caracterizada porque comprende una secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad con la secuencia SEC ID Nº 1 del promotor del gen de la FAH de Arabidopsis.
Description
Promotor que permite la expresión de transgenes
en toda la planta excepto en la semilla.
La presente invención se refiere al aislamiento y
la caracterización de un promotor que permite la expresión de
transgenes en la planta adulta, con el fin de mejorar el desarrollo
de la planta, sin que el producto de dicho transgen esté presente
en la semilla madura y seca. La invención se refiere asimismo a las
plantas transgénicas que presentan un gen de interés fusionado con
dicha secuencia promotora.
Las técnicas de biología molecular permiten
actualmente modificar el patrimonio genético de los vegetales para
cambiar sus componentes que controlan la producción, la calidad o
la salud. La especificidad de expresión de los transgenes
introducidos reside esencialmente en la utilización de unas
secuencias promotoras de plantas o de microorganismos. La búsqueda
de promotores específicos resulta por lo tanto de una importancia
capital para las biotecnologías vegetales. Las semillas constituyen
un componente importante de la agricultura, en tanto que simiente,
pero asimismo en la alimentación o la industria de transformación.
A este respecto, la presencia de proteínas y productos nuevos en la
semilla puede causar problemas. Por lo tanto parece, interesante
poder disponer de un promotor activo en todos los tejidos
vegetativos, pero inoperante en las semillas.
Las características de una semilla dependerán de
las interacciones entre la maduración, bajo el control de un
programa genético específico, y unas condiciones del entorno que
condicionan en gran medida la producción posterior. Sin embargo,
los mecanismos reguladores de dichos fenómenos permanecen
ampliamente incomprendidos. Existe por lo tanto un interés real en
mantener una buena calidad de los lotes de siembras. Ahora bien, el
desarrollo de las plantas transgénicas presenta nuevos problemas,
principalmente ligados a la expresión de genes heterólogos en las
semillas de dichas plantas. En efecto, la presencia de proteínas o
polipéptidos en las semillas puede tener unas consecuencias nefastas
sobre su capacidad para germinar o sobre su calidad. Además, si la
población se familiariza cada vez más con la idea de que las
plantas comestibles se pueden modificar genéticamente, unas
semillas comestibles que contienen el producto de transgenes
podrían no ser aceptadas fácilmente.
Así, el objetivo básico de la presente invención
es identificar un promotor que permitiría una expresión fuerte de
un transgen en todos los tejidos de las plantas excepto en la
semilla.
Con dicho fin, se ha empleado la captura del
promotor ("promoter trapping"), una herramienta potente para
disecar unos procesos de desarrollo (Topping and Lindsey 1995 para
revista). Dicha estrategia se basa en la utilización de un vector
de transformación de las plantas que presentan, en uno de sus
extremos, un gen marcador (GUS o GFP más frecuentemente) sin
promotor. Si la inserción se lleva a cabo en una región codificante
y si la secuencia del gen marcador está en fase, se producirá una
fusión traduccional entre la proteína endógena y la proteína del
gen marcador. Las estrategias de captura del gen presentan una
ventaja mayor en relación con la mutagénesis de inserción clásica
porque el fenotipo (expresión del gen marcador GUS) es dominante.
Dicha dominancia del fenotipo (GUS) permite seguir los alelos
mutados en el estado heterocigoto. Esto es muy interesante para el
estudio de mutaciones que son letales en el estado heterocigoto.
Dicho enfoque permite caracterizar asimismo un gen mediante su
expresión.
Se ha descubierto durante la gestación de la
presente invención, que una inserción de un gen marcador en el gen
codificante para una proteína de tipo "fatty acid hydroxylase"
(FAH) de Arabidopsis conduce a una expresión en todos los
tejidos de la planta excepto en la semilla. Dicho tipo de promotor
presenta un gran interés para unas aplicaciones biotecnológicas.
Permite hacer expresar una proteína de interés a partir de la
impregnación de todos los tejidos de la planta, con un nivel de
expresión elevado, excepto en la semilla. Se puede por lo tanto,
por ejemplo, proteger una planta contra numerosos estreses bióticos
o abióticos sin modificar el contenido de su semilla. Asimismo se
puede hacer expresar una secuencia anti-sentido
dirigida contra un gen diana en todos los tejidos excepto en la
semilla.
De este modo, la presente invención se refiere a
una secuencia promotora que permite la expresión de un gen de
interés en los tejidos de una planta excepto en la semilla en
maduración y en la semilla seca, comprendiendo dicha secuencia una
secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad con la
secuencia o una porción de la secuencia del promotor del gen de la
FAH de Arabidopsis.
Preferentemente, dicha secuencia comprende una
secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad con la
secuencia o una porción la secuencia SEC ID Nº 1.
Se entiende por "% de identidad" el
porcentaje de nucleótidos idénticos que se pueden calcular
fácilmente por el experto en la materia utilizando un programa
informático de comparación de secuencias tal como el programa DNASIS
(Versión 2.5 para Windows; Hitachi Software Engineering Co., Ltd,
South San Francisco, CA) utilizando los parámetros estándar
descritos en el manual del fabricante, incorporado en la
descripción a título de referencia.
Asimismo, en dicho contexto, las secuencias y los
porcentajes de identidad se pueden obtener utilizando los recursos
informáticos de internet. Se puede citar el programa Blast
(www.ncbi.nlm.nih.gov) y el programa FastDB con los parámetros
siguientes "Mismatch penalty 1,00; Gap Penalty 1,00; Gap Size
Penalty 0,33; joining penalty 30,0". Dichos algoritmos se
presentan en el Current Methods in Sequencing and synthesis Methods
and Applications, páginas 127-149, 1988, Ala R.
Liss, Inc, incorporado en la descripción a título de referencia.
Asimismo se pueden definir las secuencias que
presentan el 80% de identidad por ser unas secuencias que se
hibridan con la secuencia SEC ID Nº 1 en unas condiciones de
astringencia fuertes. Dichas condiciones se presenta en Sambrook
et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring
Harbor Press, 1989) en los párrafos 11.1 a 11.61, incorporados en
la descripción a título de referencia.
Ventajosamente, la secuencia según la invención
presenta la secuencia o una porción de la secuencia SEC ID Nº 1
siguiente:
La invención se refiere asimismo a la utilización
de una porción de la secuencia SEC ID Nº 1 para la identificación
de fragmentos capaces de promover la expresión de un gen de interés
en una planta excepto en la semilla. De este modo, es posible
definir la región mínima de la secuencia del promotor del gen de la
FAH para asegurar una expresión eficaz. En dicho sentido, el
promotor se puede modificar mediante la adición de secuencias tales
como unos enhancers, mediante deleción de regiones no esenciales
y/o no deseadas. El promotor puede comprender unas secuencias
sintéticas y/o naturales.
La invención se refiere a un procedimiento que
permite el aislamiento y la caracterización del promotor del gen de
la FAH en las plantas que comprende las etapas siguientes:
- a)
- Utilización de un cebador que comprende una secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad con una secuencia que presenta por lo menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID Nº 5 o una secuencia complementaria, un cebador que se hibrida en unas condiciones astringentes fuertes a cualquier secuencia codificante para la SEC ID Nº 4 o una secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad con una secuencia que presenta 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia genómica del gen de la FAH de Arabidopsis accesible bajo el número AC003096 o una secuencia complementaria, para el aislamiento y/o la amplificación de la secuencia anterior al extremo 5' del gen de la FAH,
- b)
- clonación y secuenciación de la secuencia obtenida en la etapa a).
La SEC ID Nº 5 corresponde a la secuencia
codificante del gen de la FAH de Arabidopsis:
DEFINICIÓN: ADNc completo de "Arabidopsis
thaliana fatty acid hydroxylase FahIp" (FAH 1)
ACCESO : AF021804
ORGANISMO: Arabidopsis thaliana;
Eukaryota, Viridiplantae, Streptophyta, Embryophyta,
Tracheophyta, Euphyllophytes, Spermatophyta, Magnoliophyta,
Eudicotyledons, Rosidae; Brassicales; Brassicaceae.
Referencia: Mitchell, A.G and Martin, C.E,
(1997). Fah 1 p, a saccharomyces cerevisiae cytochrome b5
fusion protein, and its Arabidopsis thaliana homolog that
lacks the cytochrome b5 domain both function in the
alpha-hydroxylation of
sphingolipid-associated very long chain fatty acids;
J. Biol. Chem. 272 (45), 28281-28288
MEDLINE 98019193
Asimismo, resulta posible utilizar un cebador que
comprende una secuencia que presenta por lo menos el 80% de
identidad con una secuencia que presenta por lo menos 10
nucleótidos consecutivos de la secuencia genómica del gen de la FAH
de Arabidposis (intrones y exones) accesible por el experto en la
materia bajo el número AC003096 o un cebador que se hibrida en unas
condiciones astringentes fuertes con toda la secuencia codificante
para la SEC ID Nº 4 (Arabidopsis thaliana, fatty acid
hydroxylase Fah1p) siguiente:
De este modo, la secuencia promotora que permite
la expresión de un gen de interés en los tejidos de una planta,
excepto en la semilla en maduración y en la semilla seca, se puede
caracterizar asimismo porque comprende una secuencia que presenta
por lo menos el 80% de identidad con la secuencia o una porción de
la secuencia del promotor del gen de la FAH susceptible de ser
obtenido a partir del procedimiento descrito anteriormente.
Otro aspecto de la invención conduce a un casete
de expresión que presenta una secuencia de interés fusionada con
una secuencia que comprende una secuencia promotora tal como se ha
definido anteriormente. Dicha secuencia de interés puede codificar
para un ARN, una proteína o un polipéptido que protege la planta
contra un estrés biótico o abiótico.
El casete puede permitir la
co-supresión de la expresión de un gen caracterizado
porque dicha secuencia de interés codifica para una proteína o un
polipéptido capaz de sustituirse en la función de una proteína o de
un polipéptido endógeno. La secuencia de interés puede asimismo
codificar para una secuencia antisentido dirigida contra un gen
diana. Lo que permite, acoplando con la sobrexpresión ectópica de
un gen de interés en las semillas, impedir cualquier expresión de
dicho gen en otros tejidos, no siendo expresado el gen antisentido.
Esto se ha revelado de gran utilidad en el caso en el que se desee
sobreexpresar una proteína en las semillas sin perturbar el
desarrollo de otros tejidos de la planta.
El casete según la invención puede comprender
además un gen marcador de selección, una secuencia líder que
controla el tránsito, la secreción o el marcaje del producto de
expresión en diferentes orgánulos, una secuencia señal de la
terminación de la transcripción y la traducción.
Se entiende por "gen de interés" o
"transgen" en el marco de la invención, un gen principalmente
seleccionado de entre los genes que codifican para una proteína o
un polipéptido que protege la planta contra un estrés biótico o
abiótico, los genes perturbadores que codifican para un producto
capaz de sustituirse y/o de inhibir la función o la expresión de un
ARNm, de una proteína o de un polipéptido endógeno. Se pueden citar
por ejemplo los genes que codifican para unos ribozomas contra unos
ARNm endógenos, unos genes cuyo producto de la transcripción es por
lo menos complementario en parte con un ARNm endógeno diana
(documento EP 240 208 incorporado en la descripción como
referencia). Se pueden asimismo citar unos genes, cuyo producto de
la transcripción es idéntico o similar a los transcritos de genes
endógenos, que son capaces de inhibir por
co-supresión la expresión de dichos genes endógenos
(Napoli C. et al., 1990, The Plant Cell, 2,
279-289, citado en la descripción como referencia).
Es decir, el gen según la invención puede codificar para una enzima
implicada en el metabolismo de manera que produce o favorece la
biosíntesis de metabolitos, principalmente de metabolitos útiles
para la alimentación humana o animal o pudiendo afectar el
desarrollo. La secuencia promotora según la invención puede inducir
la expresión de un gen extraño y ser utilizada en diferentes tipos
de plantas. El término "gen extraño" o "transgen" está
asimismo comprendido como definición de cualquier región de ADN
codificante o no (proteína, polipéptido, antisentido, ARN
catalítico, vírico, etc...). Una proteína de interés para el
desarrollo y la producción de la planta se puede producir de forma
constitutiva en todos los órganos de la planta utilizando dicho
promotor sin que la composición de la semilla se vea afectada. Las
proteínas de interés son, de forma no exhaustiva, las que permiten
una mejor protección de la planta frente a:
- un estrés biótico: protección contra los
patógenos, bacterias, hongos, insectos, nemátodos, parásitos o
depredadores, protección contra los virus y patógenos
intracelulares, en particular los que no se transmiten mediante las
semillas.
- un estrés abiótico: protección contra el calor
y el frío, el hielo, el estrés hídrico tal como la sequía o, a la
inversa, la anoxia, la polución (ozono, SO2), la fotoinhibición y
el estrés luminoso, la lluvia en exceso, la fitorremediación, o el
estrés nutricional ocasionado por una carencia o un exceso de un
elemento nutritivo (en particular un estrés salino).
Cualquier gen de interés puede ser colocado por
lo tanto bajo el control de la secuencia promotora aislada. Para la
expresión en las plantas, dicho gen puede presentar asimismo unas
secuencias 3' no transcritas que presentan unas señales de
poliadenilación activas en las plantas. Dichas secuencias pueden
ser, por ejemplo, las que codifican para la parte 3' transcrita no
traducida del gen, el ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor
(35S CaMV) o la región 3' no traducida del gen que codifica la
síntesis de la nopalina (NOS) del plásmido Ti de Agrobacterium
tumefaciens.
El gen de interés según la invención puede ser
asimismo un gen que controla el desarrollo tal como, por ejemplo,
un gen implicado en el metabolismo de las hormonas, en la
transducción de señales, o en el control del ciclo celular.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
vector, principalmente un vector plasmídico, que comprende un
casete de expresión tal como se ha definido anteriormente.
La invención tiene asimismo como objeto una
célula de planta transformada con el casete o con un vector que
comprende dicho casete y un conjunto de transformación de planta
que comprende dicho casete o dicho vector.
La preparación de los plásmidos, la construcción
de los genes quiméricos y de los casetes de expresión, las
restricciones del ADN mediante unas endonucleasas, la
transformación y la confirmación de las transformaciones se llevan a
cabo según los protocolos estándar (Sambrook et al., 1989
Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory,
incorporados en la descripción como referencia).
La construcción de los vectores utilizables para
los experimentos de transformación forma parte de las técnicas de
biología molecular conocidas y practicadas de forma rutinaria en
dicho campo de aplicaciones.
Un aspecto suplementario de la invención se
refiere a un procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas en las que un gen de interés se expresa en todos los
tejidos excepto en la semilla en maduración y en la semilla seca,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- transferencia de un casete o de un vector según la invención en unas células de plantas,
- b)
- cultivo de las células transformadas obtenidas en la etapa a) de forma que se obtienen dichas plantas transgénicas.
La transferencia del ADN en el interior de las
células de la planta, principalmente de las células de albumen o de
las células pluripotentes derivadas de embriones inmaduros, se
puede llevar a cabo mediante las técnicas estándar (Plant Cell
Report, 10, 595, 1992), en particular mediante transferencia vía
Agrobacterium (Plant J., 1994 6, 271), mediante
electroporación (Nature, 1987, 327, 70), la serporación (Barley
Genetics, 1991 VI, 231), mediante polietilenglicol o mediante le
método biolístico denominado "gun particule" (Nature, 1987,
327,10). De forma general, para los vectores de transformación vía
Agrobacterium (infiltración in planta, Bechtold et
al, 1993), los vectores de la transformación presentan unos
marcadores de selección, unos extremos de ADN-T,
unos sitios de clonaje, unas funciones de replicación, así como
otros elementos tan necesarios para una buena transferencia de los
transgenes (Bouchez et al., 1993). Las publicaciones
mencionadas anteriormente se incorporan en la descripción como
referencia.
La presente invención se refiere asimismo a una
planta transgénica susceptible de ser obtenida utilizando el
procedimiento mencionado anteriormente.
Por "planta susceptible de ser obtenida", se
entiende cualquier planta que expresa un transgen en sus tejidos
excepto en las semillas maduras y secas, presentando dicha planta
un promotor según la invención. Las plantas obtenidas por cualquier
procedimiento equivalente que conduce al mismo resultado son
asimismo el objeto de la invención. La lista de las plantas en las
que dicha secuencia promotora se puede utilizar, incluye más
particularmente las plantas que son útiles para cualquier
industria. Se puede citar por ejemplo la colza, las crucíferas, el
maíz, la soja, el trigo, el girasol, el guisante, las plantas
ornamentales, y los árboles.
De este modo, la invención se refiere a una
planta, tal como se ha definido anteriormente, que expresa en sus
tejidos, excepto en las semillas, un gen cuyo producto (ARN o
proteína) protege a la planta contra un estrés biótico o abiótico,
una secuencia antisentido dirigida contra un gen diana, una proteína
o un polipéptido capaz de ser sustituido en la función de una
proteína o de un polipéptido endógeno o una secuencia codificante
para una proteína implicada en la biosíntesis de metabolitos o un
gen que controla el desarrollo tal como por ejemplo un gen
implicado en el metabolismo de las hormonas, en la transducción de
las señales, o en el control del ciclo celular. La planta según la
invención puede expresar asimismo una proteína de interés bajo el
control de un promotor diferente del promotor del gen de la FAH y
una secuencia antisentido capaz de inhibir la expresión de dicha
proteína de interés bajo el control del promotor del gen de la FAH,
de tal modo que el gen de interés sólo se expresa en las
semillas.
Las semillas obtenidas a partir de una planta
transgénica según la invención, que no contienen por lo tanto el
producto de expresión del transgen, están previstos en la presente
invención, así como su utilización en cualquier industria.
En lo sucesivo, se hará referencia a las
siguientes leyendas de las figuras.
Figura
1
Los rectángulos con las rayas representan los
intrones.
La escala está presente en la figura.
T29F13 es un bac y TA1234 un ADNc.
Figura
2
PFAH upper y A1 representan los cebadores
utilizados para secuenciar el promotor.
Los rectángulos con las rayas representan la
parte 5' transcrita no traducida. La escala está presente en la
figura.
Figura
3
Napa del plásmido pBI101 conteniendo el promotor
pFAH utilizado.
El método utilizado para la extracción del ADN
genómico de Arabidopsis se inspira en la descrita por Doyle y
Doyle (1990). El principio radica en las propiedades detergentes
del bromuro de cetiltrimetiletilamonio (CTAB: Sigma Chemical Co.,
USA) que permite la desnaturalización específica de las
macromoléculas protéicas y polisacarídicas. Se trituran finamente
aproximadamente 2 g de material vegetal (plántulas cultivadas in
vitro, de 1 a 2 semanas de edad) en el nitrógeno líquido y se
transfieren a un tubo de 50 ml de tipo FALCON (Costar, USA) que
contiene 7,5 ml de tampón de extracción precalentado a una
temperatura de 65ºC. La extracción se lleva a cabo a una
temperatura de 65ºC durante 30 minutos, bajo una agitación
constante. Las proteínas desnaturalizadas por el
\beta-mercaptoetanol y el CTAB del tampón se
extraen a continuación en un volumen de cloroformo y posteriormente
se eliminan después de la centrifugación (4430 g, 10 min). Los
ácidos nucleicos del sobrenadante se precipitan en un volumen de
isopropanol en presencia de acetato sódico 3M (1/10, v/v), se
centrifugan (7900 g, 10 min) y posteriormente se enjuagan con el
etanol al 70%. El depósito se recupera en un tubo Eppendorf en 100
\mul de agua y los ácidos ribonucleicos se eliminan mediante la
adición de 3 \mul de RNasa A a 10 mg/ml (Sigma Chemical Co.,
USA). El ADN se desproteiniza y a continuación se precipita de
nuevo en el etanol absoluto. Después de la centrifugación en tubo
Eppendorf, el depósito se lava, se seca, se recupera en 50 a 100
\mul de agua y se conserva a una temperatura de -20ºC antes de
los análisis.
Se amplifica la secuencia promotora utilizando la
tecnología de PCR que es una técnica conocida (Sambrook et
al. 1989). Se han derivado unos cebadores correspondientes a la
parte 5'(upper) y la 3'(lower) de la secuencia promotora de la
secuencia genómica del BAC T29F13 (AC003096) (ver figura 1). Se ha
utilizado un ADN genómico de una línea de tipo salvaje (Ler) como
matriz para la amplificación de la parte promotora. Las reacciones
de amplificación se han realizado en un termociclador (MJ Research
PTC100 - 96), en unos tubos de 0,2 ml (Prolabo) que contienen la
mezcla siguiente:
1 \mul (10 ng) ADN, 2 \mul Tampón 10 x (BRL),
2 \mul MgCl2 25 mM, 0,8 \mul dNTP 5 mM, 1 \mul Cebador 1 (10
pmol/\mul), 1 \mul Cebador 2 (10 pmol/\mul), 0,5 \mul (1U)
Taq ADN polimerasa (5U/\mul), H2O csp 20 \mul
upper (5' - 3') : TTCATGTTACTCTCTGCTTC (SEC ID Nº
2)
lower (3' - 5') : GGAAAGGAAACAAATACGGATTC (SEC ID
Nº 3)
Los genotipos de las bacterias utilizadas para la
realización de los experimentos son:
E.coli cepa DH12S (\phi80 dlacZ
\DeltaM15 mcrA
\Delta(mrr-hsdRMS-mcrBC)
araD139 \Delta(ara,leu)7697 \DeltalacX74 galU
galK rpsL deoR nupG recA1/F' proAB + lacIq Z\DeltaM15).
La transformación de las bacterias (E.
coli cepa DH12S) mediante un plásmido recombinado se lleva a
cabo por electroporación (Potter, 1993). En una cubeta de
electroporación (1 ml, longitud 0,1 cm), se mezclan 2 \mul de la
reacción de ligación con 50 \mul de las bacterias descongeladas y
mantenidas en hielo. La cubeta se coloca a continuación en un
electroporador (Gene Pulser II System: BIO-RAD,
FRANCIA) y se aplica una tensión de 1,25 kV durante un tiempo que
depende de la resistencia (200 \Omega) y de la capacidad del
circuito (25 \muF). Se añade un ml de medio SOC para favorecer el
crecimiento de las bacterias y se incuba el conjunto en un tubo de
10 ml durante 2 horas a una temperatura de 37ºC bajo una agitación
rotativa (220 rpm). Las bacterias transformadas se extienden
posteriormente sobre unas placas que contienen medio LB sólido
suplementado con el antibiótico adecuado y se incuban a una
temperatura de 37ºC durante toda una noche. La selección de las
bacterias transformadas mediante el plásmido pMeca recombinado se
lleva a cabo mediante 0,04 mg/ml de ampicilina en presencia de 0,2
mg/ml de X-Gal y de 0,05 mg/ml de IPTG. Para los
otros plásmidos recombinados, la selección de las bacterias se
lleva a cabo sobre un medio de LB con el antibiótico adecuado a una
concentración final de 0,04 mg/ml.
Para las semillas, se realiza un semillero sobre
dos espesores de papel Whatman 1M de 4,7 cm (Maindstone,
Inglaterra) impregnado con 2 ml de agua estéril. Después de 48
horas de impregnación en una placa saturada de agua, se raspan las
semillas y se colocan en un tubo Eppendorf en el que se añaden 100
\mul de tampón de infiltración (100 mM de Tampón fosfato pH 7,2,
10 mM EDTA, Tritón X100 0,1 v/v) suplementado con
X-Gluc (ácido
5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-\beta-D-Glucurónico.
El X-Gluc se disuelve en DMF (dimetilformamida) a
una concentración Stock : 100 \mu (100 mg/100 \mul). El tampón
de infiltración se suplementa al 1/100 de forma extemporánea con el
stock de X-Gluc. Para el resto de tejidos, las
muestras se colocan directamente en el tampón de infiltración y se
lleva a cabo a continuación la coloración según el mismo
protocolo.
La infiltración se lleva a cabo al vacío (en una
campana al vacío):
- -
- se interrumpe el vacío 2 veces.
- -
- El vacío se mantiene durante 1 hora, después las muestras se colocan a una temperatura de 37ºC durante la noche.
Unos análisis preliminares han indicado que una
enzima implicada en el metabolismo de los lípidos (la "Fatty Acid
Hydroxilase" : FAH) podría presentar una expresión
correspondiente al tipo de promotor que presenta las
características buscadas.
La secuencia del gen en cuestión se ha obtenido
gracias a las secuencias procedentes de la secuenciación
sistemática del genoma de Arabidopsis thaliana y se localiza
sobre el BACT29F13. Se ha identificado una secuencia expresada (EST
TAI234) en las bases de datos y parece corresponder a una secuencia
a lo largo de la longitud del ARNm de la FAH. Esto ha permitido la
identificación de la secuencia 5' transcrita no traducida y del
emplazamiento previsto de la secuencia promotora. La estructura
intrón/exón se ha deducido, a nivel de la parte transcrita no
traducida, del alineamiento del BAC con el EST TAI234 (figura
1).
El promotor se ha amplificado mediante PCR a
partir del cebador pFAH/upper y el cebador A1, colocado en la parte
5' transcrita no traducida (figura 2). Un estudio de la secuencia
ha mostrado que la secuencia amplificada presenta una caja TATA
putativa a -100 pb del sitio de iniciación presumida de la
transcripción (a partir del ADNc longitud total) y una caja CCAAT a
-190 pb de dicho mismo inicio de transcripación. El fragmento de
PCR amplificado (932 pb) se ha clonado en un vector
pGEM-T (PROMEGA), secuenciado, posteriormente
introducido en un vector binario (pBI101, Clontech) que contiene un
gen marcador GUS sin promotor (figura 3). Dicha construcción se ha
introducido a continuación mediante transformación en planta,
mediante Agrobacterium, en unas plantas de tipo salvaje (ecotipo
Ws). Se han obtenido trece transformantes primarios, que se han
ensayado para su actividad GUS durante su desarrollo.
La expresión resulta muy marcada a partir de las
20 horas después del inicio de la impregnación del embrión. Durante
el desarrollo, la expresión resulta muy fuerte en todos los
tejidos, con cierta preferencia por los tejidos vasculares.
Dichos resultados demuestran que la secuencia
promotora aislada confiere adecuadamente un perfil de expresión muy
específico al gen marcador utilizado (GUS), el promotor es activo a
lo largo del desarrollo de la planta, en todos los tejidos
ensayados (hojas, flores, tallos, raíces, etc..) excepto en la
semilla a lo largo del proceso de maduración (ver tabla I a
continuación).
La expresión del marcador confirma la
funcionalidad del promotor y su especificidad. Dicho tipo de
promotor es por lo tanto de gran interés para unas aplicaciones
biotecnológicas, tales como la expresión de una toxina
anti-insecto (tipo Bt) en las plantas y la
expresión de cualquier transgen que permite mejorar, de forma
cuantitativa o cualitativa, el desarrollo y el crecimiento de la
planta sin que la proteína codificada por el transgen esté presente
en la semilla.
Bechtold, N., Ellis J. y
Pelletier G. (1993). In planta Agrobacterium
mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis
thaliana plants. C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la
vie; 316: 1194-9.
Bouchez D., Camilleri C.
Caboche M. (1993) A binary vector based on Basta
resistance for in planta transformation of Arabidopsis
thaliana C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie: 316,
1188-1193.
Doyle J.J y Doyle J.L.
(1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue.
Focus; 12: 13-15.
Sambrook J,, Fritsch E.F. y
Maniatis T. (1989)., Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor N.Y.
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE
AGRONOMIQUE - INRA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROMOTOR QUE PERMITE LA EXPRESIÓN DE
TRANSGENES EN TODA LA PLANTA EXCEPTO EN LA SEMILLA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FAH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 932
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> promotor de la FAH en Arabidopsis
thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador upper
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcatgttac tctctgcttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador lower
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaaggaaa caaatacgga ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fatty acid hydroxylase Fah 1p
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 714
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que codifica para la fatty
acid hydroxylase Fah 1p
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (23)
1. Secuencia promotora que permite la expresión
de un gen de interés en los tejidos de un planta, excepto en la
semilla en maduración y en la semilla seca, caracterizada
porque comprende una secuencia que presenta por lo menos el 80% de
identidad con la secuencia SEC ID Nº 1 del promotor del gen de la
FAH de Arabidopsis.
2. Secuencia según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende una secuencia que se hibrida
en unas condiciones de astringencia fuertes con la secuencia SEC ID
Nº 1.
3. Secuencia según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende la secuencia SEC ID Nº 1.
4. Procedimiento que permite el aislamiento y la
caracterización del promotor del gen de la FAH en las
plantas, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- Utilización de un cebador que comprende una secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad con una secuencia que presenta por lo menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID Nº 5 o una secuencia complementario, un cebador que se hibrida en unas condiciones astringentes fuertes con cualquier secuencia codificante para la SEC ID Nº 4 o una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con una secuencia que posee por lo menos 10 nucleótidos consecutivos de la secuencia genómica del gen de la FAH de Arabidopsis accesible bajo el número AC003096 o una secuencia complementaria, para el aislamiento y/o la amplificación de la secuencia anterior al extremo 5' del gen de la FAH,
- b)
- clonación y secuenciación de la secuencia obtenida en la etapa a).
5. Utilización de una secuencia según las
reivindicaciones 1 a 3 para la identificación de los fragmentos de
la secuencia SEC ID Nº 1, que permite la expresión de un gen de
interés en los tejidos de una planta, excepto en la semilla en
maduración o en la semilla seca.
6. Casete de expresión, caracterizado
porque presenta una secuencia de interés fusionada con una
secuencia que comprende una secuencia promotora según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3.
7. Casete de expresión según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicha secuencia de interés codifica
para un ARN, una proteína o un polipéptido que protege a la planta
contra un estrés biótico o abiótico, o que está implicado en el
desarrollo, principalmente en el metabolismo de las hormonas, en la
transducción de las señales, o en el control del ciclo celular.
8. Casete de expresión según la reivindicación 6
que permite la co-supresión de un gen,
caracterizado porque dicha secuencia de interés codifica para
una proteína o un polipéptido capaz de sustituirse en la función de
una proteína o de un polipéptido endógeno.
9. Casete de expresión según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicha secuencia de interés codifica para
una secuencia antisentido dirigida contra un gen diana.
10. Casete de expresión según la reivindicación
6, caracterizado porque dicha secuencia de interés codifica
para una enzima implicada en la producción de metabolitos por una
planta.
11. Vector que comprende un casete de expresión
según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
12. Célula de planta transformada con un casete
según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o un vector según la
reivindicación 11.
13. Conjunto de transformación de la planta que
comprende un casete según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o
un vector según la reivindicación 11.
14. Procedimiento para la preparación de plantas
transgénicas en las que un gen de interés se expresa en todos los
tejidos excepto en la semilla en maduración y en la semilla seca,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- a)
- la transferencia de un casete o de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o de un vector según la reivindicación 11 en unas células de plantas,
- b)
- el cultivo de las células transformadas obtenidas en la etapa a) de forma que se obtienen dichas plantas transgénicas.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque las células se seleccionan de entre las
células embrionarias procedentes de un embrión inmaduro.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 14 y 15, caracterizado porque la
transferencia se lleva a cabo utilizando Agrobacterium,
preferentemente Agrobacterium tumefaciens.
17. Planta transgénica, caracterizada
porque comprende un casete según las reivindicaciones 6 a 10.
18. Planta según la reivindicación 17,
caracterizada porque se expresa en sus tejidos, excepto en
las semillas maduras y secas, un ARN, una secuencia antisentido
dirigida contra un gen diana.
19. Planta según la reivindicación 17,
caracterizada porque se expresa en sus tejidos, excepto en
las semillas maduras y secas, un ARN, una proteína o un polipéptido
capaz de sustituirse en la función de una proteína o de un
polipéptido endógeno.
20. Planta según la reivindicación 17,
caracterizada porque expresa una proteína de interés bajo el
control de un promotor diferente del promotor del gen de la FAH y
una secuencia antisentido capaz de inhibir la expresión de dicha
proteína de interés bajo el control del promotor del gen de la FAH,
de tal modo que la proteína de interés sólo se expresa en las
semillas.
21. Planta según la reivindicación 17,
caracterizada porque expresa en sus tejidos, excepto en las
semillas maduras y secas, una secuencia que codifica para una
proteína implicada en la biosíntesis de metabolitos, para una
proteína o un polipéptido que protege a la planta contra un estrés
biótico o abiótico, una proteína que controla el desarrollo
principalmente en el metabolismo de las hormonas, en la
transducción de las señales, o en el control del ciclo celular.
22. Planta según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 21, caracterizada porque se selecciona
de entre la colza, las crucíferas, el maíz, la soja, el trigo, el
girasol, el guisante, las plantas ornamentales, y los árboles.
23. Semillas obtenidas a partir de una planta
transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22,
caracterizadas porque no contienen el producto de expresión
del transgen, comprendiendo dichas semillas un casete según
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o un vector según la
reivindicación 11.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9907362 | 1999-06-10 | ||
| FR9907362A FR2794772B1 (fr) | 1999-06-10 | 1999-06-10 | Promoteur permettant l'expression de transgenes dans toute la plante hormis dans la graine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2223533T3 true ES2223533T3 (es) | 2005-03-01 |
Family
ID=9546638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00940461T Expired - Lifetime ES2223533T3 (es) | 1999-06-10 | 2000-06-08 | Promotor que permite la expresion de transgenes en toda la planta excepto en la semilla. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1185669B1 (es) |
| AT (1) | ATE274062T1 (es) |
| AU (1) | AU5539500A (es) |
| CA (1) | CA2376878A1 (es) |
| DE (1) | DE60013123T2 (es) |
| ES (1) | ES2223533T3 (es) |
| FR (1) | FR2794772B1 (es) |
| PT (1) | PT1185669E (es) |
| WO (1) | WO2000077223A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2275015T3 (es) * | 2001-07-13 | 2007-06-01 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Promotores especificos de tejido vascular. |
| FR2828210B1 (fr) * | 2001-08-01 | 2004-08-06 | Agronomique Inst Nat Rech | Acide nucleique regulateur permettant l'expression d'un polynucleotide d'interet specifiquement dans l'endothelium d'une graine de plante, et ses applications |
| EP2166097B1 (en) * | 2004-10-05 | 2014-08-06 | SunGene GmbH | Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression |
| US9085774B2 (en) | 2005-04-19 | 2015-07-21 | Basf Plant Science Gmbh | Methods controlling gene expression |
| WO2006131490A1 (en) * | 2005-06-09 | 2006-12-14 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| CN110072384B (zh) | 2016-10-11 | 2024-03-12 | 科迪华农业科技有限责任公司 | 植物中转基因表达的调节 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6310194B1 (en) * | 1994-09-26 | 2001-10-30 | Carnegie Institution Of Washington | Plant fatty acid hydroxylases |
| GB9706381D0 (en) * | 1997-03-27 | 1997-05-14 | Cambridge Advanced Tech | Improvements relating to the specificity of gene expression |
-
1999
- 1999-06-10 FR FR9907362A patent/FR2794772B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-06-08 CA CA002376878A patent/CA2376878A1/fr not_active Abandoned
- 2000-06-08 WO PCT/FR2000/001574 patent/WO2000077223A1/fr active IP Right Grant
- 2000-06-08 ES ES00940461T patent/ES2223533T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-08 EP EP00940461A patent/EP1185669B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-08 AT AT00940461T patent/ATE274062T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-08 AU AU55395/00A patent/AU5539500A/en not_active Abandoned
- 2000-06-08 PT PT00940461T patent/PT1185669E/pt unknown
- 2000-06-08 DE DE60013123T patent/DE60013123T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT1185669E (pt) | 2004-12-31 |
| AU5539500A (en) | 2001-01-02 |
| EP1185669A1 (fr) | 2002-03-13 |
| EP1185669B1 (fr) | 2004-08-18 |
| FR2794772A1 (fr) | 2000-12-15 |
| CA2376878A1 (fr) | 2000-12-21 |
| FR2794772B1 (fr) | 2001-09-21 |
| DE60013123T2 (de) | 2005-08-11 |
| WO2000077223A1 (fr) | 2000-12-21 |
| DE60013123D1 (de) | 2004-09-23 |
| ATE274062T1 (de) | 2004-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2270227T3 (es) | Promotor met-1 del maiz. | |
| Warner et al. | Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound‐responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco | |
| Gittins et al. | Transgene expression driven by heterologous ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small-subunit gene promoters in the vegetative tissues of apple (Malus pumila Mill.) | |
| EP1904639B1 (en) | Dehydrin genes and promoters from coffee | |
| WO2002014472A2 (en) | Improved methods of gene silencing using inverted repeat sequences | |
| KR20090119910A (ko) | 외떡잎 식물에서 배-특이적 발현의 조절을 위한 핵산 서열 | |
| BRPI0619837A2 (pt) | método para aumentar o tamanho de semente de uma planta e/ou para aumentar o número de sementes obtenìveis de uma planta, construção genética e métodos para a produção de uma planta transgênica | |
| US8829170B2 (en) | Construct capable of release in closed circular form from a larger nucleotide sequence permitting site specific expression and/or developmentally regulated expression of selected genetic sequences | |
| CN111433363A (zh) | 非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多聚核苷酸及方法 | |
| BR112012012563A2 (pt) | Expressao de gene em plantas | |
| EP0698098B1 (en) | Method for obtaining male-sterile plants | |
| ES2223533T3 (es) | Promotor que permite la expresion de transgenes en toda la planta excepto en la semilla. | |
| AU2001236326B2 (en) | Isolation and characterisation of an anther-specific promoter (COFS) in cotton | |
| AU2001236326A1 (en) | Isolation and characterisation of an anther-specific promoter (COFS) in cotton | |
| US20040088760A1 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
| US7388091B2 (en) | Harvest-inducible genes from alfalfa (Medicago sativa) and methods of use thereof | |
| CN113773375B (zh) | 大豆核因子蛋白GmNF307在植物耐盐调控中的应用 | |
| KR102081963B1 (ko) | 식물 성숙 종자에서 특이적 유전자 발현을 유도하는 프로모터 및 이의 용도 | |
| EP1203086B1 (en) | Mites-like element and transcriptional activation element | |
| US6372962B1 (en) | Pathogen resistance in plants using CDNA-N/intron constructs | |
| ES2332690B1 (es) | Promotor constitutivo de solanum lycopersicum. | |
| AU2001243939B2 (en) | A construct capable of release in closed circular form from a larger nucleotide sequence permitting site specific expression and/or developmentally regulated expression of selected genetic sequences | |
| CN107513532A (zh) | 一个梨组成型表达启动子PbTMT4P及其应用 | |
| Chaidamsari et al. | Characterization of a cocoa pod wall-specific gene, TcLea5, a comparison with its tomato homologue and characterization of its promoter in heterologous systems | |
| Meyer | Meyer, Peter; et al. |