KR20020091093A - 씨형간염 치료제 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 의하면, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질이 제공된다. 본 발명에 의하면, HCV의 감염저지작용 등의 항바이러스효과를 가지는 신규한 의약품이 제공가능하다.
Description
1989년 미국 카이론사에 의해, 종래 비 A 비 B형 간염 바이러스로 불려진 사람간염 바이러스의 유전자단편이 클로닝되어, HCV로 명명되었다(참조: Science, Vol.244, 359-362, 1989). HCV는 단쇄 + 쇄 RNA를 게놈이라 하는 바이러스이다. 그 후 카이론사 등, 국립암센터의 시모토오 등(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 87, 9524-9528, 1990), 오사카대/미생물 연구의 타카미 등(참조: J. Virol., Vol. 65, No. 3, 1105-1113, 1990)에 의해, C형간염 바이러스의 전유전자의 서열이 발표되어 있다. 그 후, HCV에는 코어, 외피 1(이하, 「E1」 또는 「E1 단백질」라고도 함), 외피 2(이하, 「E2/NS1」 또는 「E2/NS1 단백질」라고도 함)의 3종류의 구조 단백질과 6종류의 비구조 단백질이 존재하는 것을 알았다.
HCV가 발증하면 높은 확률로 급성간염, 만성간염, 간경변을 발병시켜 최종적으로는 간암으로 이행하여 환자를 사망시킨다. 종래치료에는 항바이러스제인 인터페론이 대표적으로 사용되었으나, 치료효과는 환자마다 다르다는 점, 발열 등의 부작용이 있는 점이 문제가 되고 있다(참조: J. Med. Virol., Vol.42, 299-305, 1994)(참조: 일소회지, Vol.91, 995-1002, 1994).
또한, 리바비린(ribavirin) 등, 다른 항바이러스제에 의한 치료도 검토되고 있으나 이것도 충분한 효과를 거두지 못하고(참조: Lancet, Vol. 337, 1058-1061, 1991), 새로운 항HCV 제의 개발을 기다렸던 것이 현실이였다.
한편, HCV의 유전자는 상당히 변이하기 쉽다고 생각되어져, HCV는 그 고변이성때문에 환자의 체내의 면역에서 피하는 것이라고 생각되었다. 특히, HCV의 E2/NS1의 N말단에는 25개 내지 30개의 아미노산으로 이루어진 초가변영역(초가변영역)로 불리는 변이에 풍부한 영역이 있다고 되어있으며, 사람의 면역계의 에피톱은 초가변영역이지 않을까 하는 카또우 등에 의해 예측되고 있다(참조: J. Virol., Vol.67, No.7, 3923-3930, 1993)(참조: J. Virol., Vol.68, No.8, 4776-4784, 1994). 즉, 사람의 면역계, 예를 들면 중화항체가 인식하는 영역은, 초가변영역 내에 있기 때문에 중화항체가 감염환자 생체내에서 생겨도 초가변영역이 바로 변이하여 바이러스가 항체로부터 달아나게 되는 것은 아닌가라고 여겨지고 있다. 그러나, 이시이 외의 보고에서 E2/NS1과 사람 T 세포 Molt-4의 결합을 저해하는 항체가, HCV에서 자연치유한 환자의 혈중에만 고활성으로 보여지며, HCV의 고변이성에도 관계없이 HCV의 치유에 액성면역이 관여하고 있는 것이 시사되었다(참조: Hepatology, Vol.28, No.4, 1117-1120, 1998).
그런데, 1999년 미국 카이론사에 의해 E2/NS1가 결합하는 세포표면의 단백질로서 CD81이 단리되었다(참조: Science, Vol. 282, 938-941, 1999). 대장균에서 발현한 CD81과 E2/NS1은 이시이 등의 보고와 동일하게 결합하며, 또한 HCV 자연치유환자의 혈청은 이 결합을 저해하였다. 이 결과에 의해 CD81은 HCV의 수용체인 것이 시사되었다
이상에서 HCV의 세포로의 감염에 깊이 관여하고 있다고 생각되는 외피 단백질에 결합하며, 또한, HCV의 감염성이 있는 사람세포로의 결합을 저지하는, 예를 들면, 항체와 같은 물질을 약제로서 이용하면, 혈중의 HCV가 새롭게 간장 등의 감염대상 장기에 감염하는 것을 저지하는 것이 가능하게 되며, HCV 환자를 치유할 수 있다고 생각된다. 그렇지만, HCV에 기인하는 질환에 대한 감염저지물질에 대해서는, 아직 충분한 검토가 시행되지 않은 점이 현실이였다.
본 발명은, C형간염 바이러스(이하 「HCV」라고도 함)의 외피(envelope) 당단백질에 결합하는 각종 물질에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 HCV의 외피당 단백질과 결합하는 것에 의해 HCV의 감염저지작용 등의 항바이러스 효과를 가지는, 항체 등의 단백질, 황산화다당류, 저분자화합물에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 항체 ScFv-1, 및 scFc1-4의 중화활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 헤파린의 중화활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 스라민의 중화활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 개변 ScFv의 NOB 활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 전체항체의 NOB 활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 전체항체의 세포융합 저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 발현 플라스미드(plasmid) pEX gamma l loxP-HygHCVI의 구축을 나타내는 그림이다.
도 8은 발현 플라스미드 pEX kappa km HCVI의 구축을 나타내는 그림이다.
도 9는 발현 플라스미드 pEX loxp-Hyg HCV1 W의 구축을 나타내는 그림이다.
발명을 실시하기 위한 최적의 형태
이하에서는, 본 발명에 관하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 물질은 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포(이하, 「HCV 감염성세포」라고도 함), CD81을 발현하는 세포(이하 「CD81 발현세포」라고도 함)또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질이다.
상기 서술한 바와 같이 물질을 선택하여, 각각의 물질이 E2/NS1과 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 것이 가능한가를 입증하는 방법을 하기에서 나타낸다.
전술한 바와 같이 HCV의 외피 단백질에는 E2/SL1이 있다. 그 중 E2/SL1의 초가변영역으로 불려지는 변이가 많은 영역이 사람의 면역계의 에피톱이 아닌가라고 예측되고 있다. 즉, 바이러스의 감염의 제 1단계인 세포와의 결합에는 E2/NS1가 깊이 관여 하고 있는 것이 예측되기 때문에, 본 발명에서는 E2/NS1과 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저지하는 물질을 HCV의 세포로의 결합 또는 감염저지물질로서 개발하기에 이르렀다.
E2/NS1은 HCV의 게놈에서 발현되는 단백질의 384번째의 아미노산에서 746번째의 아미노산까지이다. 본 발명에 있어서는, E2/NS1의 HCV 감염세포로의 결합은, 예를 들면, HCV 유전자의 E2/NS1의 C말단에 표지자를 붙인 단백질을 가용화한 형태로 발현시켜, HCV 감염성세포 또는 CD81 발현세포에 결합시켜, 그 표지자에 대한 항체를 사용하여, 발광법 또는 발색법으로 EW/NS1의 상기 세포로의 결합을 확인하였다. 결합을 저해하는 물질은, 결합을 확인하는 시스템으로 가용화 E2/NS1과 전술한 세포를 결합시키기 전에 E2/NS1과 결합저해를 확인하고 싶은 물질을 혼합하고, 그 다음 전기 세포를 혼합하여 발광 또는 발색의 변화를 측정하는 것으로 확인하였다. 결합을 저해하는 물질은, 구체적으로는 예를 들면, H쇄에 서열번호 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열 및 L쇄에 서열번호 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항체, 헤파린, 스라민(suramin) 등을 들 수 있으나, E2/NS1과 HCV 감염성세포 또는 CD81 발현세포와의 결합을 저해하는 물질이면 이것에 한정하지 않는다. 또한, 가용화 CD81과 E2가 결합하는 것도 보고되어 있기 때문에(참조: Science, Vol.282, 938-941), 상기 물질을 이용하여도 가용화 CD81과 E2의 결합을 저해하는 것이 가능하다는 것은 용이하게 유추된다.
여기서 헤파린 등의 황산화다당류는 음전하가 강하다는 것이 알려져 있으며, 안티트롬빈III이나 섬유아세포 성장인자 등의 단백질에 있어서 양전하가 강한 영역에 결합하는 것이 알려져 있다(참조: FEBS Lett., Vol.69, 51-54, 1976)(참조: Cell, Vol.64, 841-848, 1991). 또한, 후술의 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명에 있어서, E2/NS1은 헤파린에 결합하는 것이 발견되었다. 즉, 실시예에 나타난물질 중, 헤파린은 E2/NS1의 양전하의 강한 장소에 결합함에 따라, E2/NS1와 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81의 결합을 하는 것을 저해하고 있는 것과 용이하게 유추할 수 있다. 즉, E2/NS1의 양전하를 가지는 영역에 결합하는 물질이면, E2/NS1과 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 것이 가능하다.
또한, 헤파린 등의 황산화다당류가 당단백질에 결합하였을 때에 그 단백질의 표면 전하에 영향을 주어, 구조적인 변화를 주는 경우도 있기 때문에 본 발명에서 황산화다당류와 E2/NS1의 결합을 확인한 바, E2/NS1와 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81의 결합에 상기와 같은 구조변화가 관여하고 있는 것도 유추된다.
여기서 음전하와 양전하라 함은, 단백질 또는 그것에 결합하고 있는 당쇄상에 존재하는 전하가 있는 개소를 의미한다. 본 발명에서는 E2/NS1가 Heparin Sepharose CL-6B(파마시아사)에 결합하고, 0.15M의 NaCl을 포함하는 10mM 인산 완충제에 의해 용출되지 않을 때에 컬럼과 결합하고 있는 도메인으로 한다.
본 발명에 있어서, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질을 인식가능한 물질로는, 이하에서 서술하는 바와 같이 표시자를 붙인 단백질이나, 합텐(hapten) 등의 항체에 의해 전기 E2/NS1 단백질을 검출가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 표지자를 붙인 단백질은, 예를 들면 HCV 게놈에서 384번째 내지 711번째의 아미노산으로 이루어진 단백질의 C말단에 그 자체공지인 E 표지자(파마시아사), His 표지자, myc 표지자, FLAG 표지자, HA 표지자, GST, IgG Fc영역 등의 5개 이상의 아미노산으로 이루어진, 특이적항체로 인식될 수 있는 서열을 부가한 것이면 특별히 한정되지 않는다. 다시 설명하면, 앞서 논의한 바와 같이 HCV의 E2/NS1의 N말단에는 초가변영역라는 면역계의 에피톱이 존재한다고 생각되고 있다. 따라서, E2/NS1에 표지자를 결합시켜 발현시키는 경우, C말단에 표지자를 결합시킨 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 이와 같이하여 수득된 단백질은 가용성이다. 이 가용성의 E2/NS1은 384번째의 아미노산에서 746번째의 아미노산까지의 사이에 E2/NS1의 막외 도메인을 발현시키는 것이면 특별히 제한하지 않고 사용가능하다. 표지자가 붙은 가용화단백질 E2/NS1는, 동물세포, 곤충세포, 효모 등 단백질에 당쇄를 부첨가하는 것이 가능한 세포에 발현시킬 수 있다.
아울러, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 합텐 등의 항체 등에 의해 검출가능한 물질을 첨가한 단백질로는, 예를 들면 E2/NS1는 384번째의 아미노산 내지 746번째의 아미노산까지의 사이에 E2/NS1의 막외 도메인을 발현시킨 것에 비오틴, 플루오레세인, DIG 등의 항체 등으로 인식할 수 있는 저분자를 결합시킨 물질을 의미한다. 여기서, 저분자를 인식하는 물질은 예를 들면, 예시한 비오틴의 경우는 항체 이외에도 아비딘, 스트렙트아비딘 등의 단백질에도 인식할 수 있기 때문에, 그 물질을 인식하는 것이면 특히 항체 및 단백질일 필요는 없다.
아울러, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 형광법, 발색법에 의해 검출가능한 물질을 첨가한 단백질로는, 예를 들면 E2/NS1는 384번째의 아미노산에서 746번째의 아미노산까지의 사이에 E2/NS1의 막외 도메인을 발현시킨 것에 FITC, 알칼리포스파타제, HRP 등의 형광을 발사하거나, 그 물질이 있는 물질, 예를 들면 효소의 기질을 혼합하였을 시에 발색하는 물질을 결합시킨 물질을 의미하나, 특별히 그들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 HCV의 감염성이 있는 세포라 함은, HCV가 증식 또는 감염될 수 있는 세포로서 Huh7, HepG2, WRL68 등의 사람 간세포나, Molt-4, MT-2, Daudi 등의 임파구계통의 세포를, HCV의 감염성이 인정되는 세포이면 여기에 기재한 세포가 아니어도 무방하다.
CD81을 발현하는 세포라 함은, 하나의 예를 나타내면, 사람의 CD81 유전자(참조: GenBank 등록번호 M33680)를 인비트로젠사의 pCDNA3.1(+)의 멀티클로닝사이트에 삽입한 벡터를 NIH3T3 세포에 리포펙틴(GIBCO BRL)을 이용하여 도입한 것을 들 수 있으나, 유전자 재조합의 정법으로 구축된 세포로 사람 CD81의 발현이 웨스턴블로팅, 항CD81 항체에 따른 형광검출법, 노던블로팅 등의 단백질 또는 mRNA를 검출가능한 방법에서 확인되는 한, 본 발명에 있어서는 CD81 발현준비 벡터, 발현세포, 유전자 도입법은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, E2/NS1와 CD81과의 결합을 저해하는 물질을 선택하는 경우, 어기서 서술한 CD81은 가용화 사람 CD81도 이용할 수 있다. 가용화 사람 CD81은, CD81의 막외 도메인을 발현시키는 것이면 특별히 제한없이 사용가능하다. 가용화 CD81은, 동물세포, 곤충세포, 효모 및 대장균 등을 이용하여 유전자 재조합의 정법을 이용하여 발현시키는 것이 가능하다. 아울러, 가용화 CD81은 막외 도메인만을 발현시킨 것일 필요도 없으며, 예를 들면 정제나 검출의 목적을 위하여 표지자를 붙인 것이나 수식한 것이어도 문제없다.
또한, 표지자에 대한 항체를 사용한 E2/NS1와 HCV 감염성세포 또는 CD81 발현세포 또는 CD81의 결합의 검출법에서 예를 든 발광법, 발색법은 바람직하게는 유세포 분석법(flow cytometry), cell ELISA법, ELISA법 등을 들 수 있다. 단, E2/NS1와 CD81 발현세포 또는 CD81의 결합을 검출하는 것이 가능한 방법이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에서 항체라 함은, 통상 생체내에서 존재하는 형태의 항체 외에, 항체의 H쇄 또는 L쇄의 가변영역 또는 그의 조합으로 형성된 항원결합부위를 적어도 하나 포함하는 펩티드, 1그룹의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 Fab, 2그룹의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 F(ab')2, H쇄 단편과 L쇄 단편이 동일 펩티드에 직열하게 결합한 단쇄항체(이하, 「ScFv」라고도 함) 등도 포함된다. 본 발명에서는, 전체 항체가 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 단클론성 항체는, C형간염 치유환자의 B세포에서 항체의 유전자를 취득하는 것에 의해 작제하였다. 사람 유래의 복수의 B세포에서 목적으로 하는 항체의 유전자만을 단리하는 방법으로서, EBV를 환자의 B세포에 형질전환하여 B세포를 불사화한 다음 목적의 항체를 생산하는 세포만 클로닝하는 등의 수법이 종래에 있으나, 본 발명자는 예의검토 결과 파지디스플레이(phage display)에 의해 ScFv를 취득하기에 이르렀다.
파지디스플레이법에 의한 항체의 취득의 하나의 예로 들면, C형간염 치유환자로 부터 헤파린 채혈을 행하고, Ficoll법으로 말초혈 단핵구를 취득하고, 항CD19 항체단위를 이용하여 B세포만을 정제하였다. 다음으로, 사람 IL-2, 사람 IL-10,E2/NS1 항원 1ng/㎖, 항 사람 CD40 항체 1㎍/㎖을 이용하여 B세포에 항체유전자의 mRNA로의 전사를 자극하였다. 이 B세포의 정제는, B세포를 특이적으로 분리할 수 있는 것이면 특별히 제한하지 않는다. 또한, B세포의 자극에 대해서도 전술 이외의 방법을 이용하여도 무방하며, 적절하게 생략한 방법을 이용하여도 무방하다. 그런 다음, B세포로부터 항체 mRNA, 아울러 cDNA를 취득하였다. 더 한층 ScFv 발현 플라스미드에 H쇄와 L쇄 가변영역의 유전자를 편입가능한 단쇄항체의 유전자의 틀을 작제하고, 아울러 그 하류에 M13 파지의 gene3 유전자를 결합하였다. 그의 H쇄 및 L쇄의 가변영역을 편입하는 장소에 상기 취득한 cDNA에서 PCR법으로 임의로 취득한 H쇄 및 L쇄를 편입하였다. 이 플라스미드를 이용하여 M13 파지의 선단으로 gene3 단백질과 융합단백질의 형태로 편입한 단쇄항체를 발현시켜, 그 중 E2/NS1에 결합하는 것만 선택시켜, H쇄의 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3이 각각 서열목록의 서열번호 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열이며, L쇄의 가변영역의 CDR1, CDR2, CDR3이 각각 서열목록의 서열번호 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열인 단쇄항체 ScFv1-1 및 전기 ScFv1-1를 발현하는 파지를 취득하였다. 그리고, ScFv1-1 및 전기 ScFv1-1를 발현하는 파지가 특히 E2/NS1에 대하여 친화성이 강하고, E2/NS1와 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81의 결합을 강하게 저해하는 것을 알아내었다.
또한, 상기에서는 M13 파지의 시스템을 이용하여 단쇄항체를 스크리닝하는 수법을 들었으나, 본 발명에 있어서는, 「항체」와 파지의 표면에 제시되는 단백질이 융합 단백질의 형태로 발현시키는 수법이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 C형간염 치유환자는, 혈액 중에 HCV의 mRNA가 검출되는 간기능을 측정하는 값, 예를 들면 ATL 등의 값에 이상이 보여지고, 말하자면 C형간염의 상태이었던 환자의 혈액에서 HCV의 mRNA이 검출한계 이하가 되며, ATL 등의 간기능 측정치가 정상화되는 상태가 6개월이상 지속되는 상태의 환자를 의미한다.
상기에서 본 발명의 항체의 대표예로서 예시한 ScFv1-1는, BIACORE(BIACORE사)를 이용하여 E2/NS1와의 결합상수 Ka를 측정하면 4.5 ×108(M), 해리상수 Kd는 2.2 ×10-9(1/M)이었다. 또한, 본 발명자들은 ScFv1-1과 동일한 가변영역의 H쇄를 가지며 L쇄의 가변영역이 다른 단쇄항체도 복수취득하며 각각의 단쇄항체의 결합능력과 E2/NS1와 HCV 감염성세포 및 사람 CD81 발현세포와의 결합을 저해하는 능력을 비교한 바, 각각의 결합능력과 E2/NS1와 세포의 결합저지능력에는 관련이 보였다. 그 중에서 결합상수가 108(M) 이상, 해리상수가 10-8(1/M) 이하인 단쇄항체 ScFv1-1가 그 저해활성에서 감안하여 의약품으로서의 능력이 충분하다고 판단할 수 있다. 즉, E2/NS1로의 결합상수가 BIACORE로 측정하여 108(M) 이상, 해리상수가 10-8(1/M) 이하인 항체가, HCV 감염성세포에 감염하는 것을 저지하는 의약품으로는 보다 바람직하다. 항체의 능력을 높이기 위해서는 결합상수가 109(M) 이상, 해리상수가 10-9(1/M) 이하의 항체가 보다 바람직한 것으로 들 수 있다.
통상의 항체는 대소 두종류의 폴리펩티드로 이루어지며, 큰 쪽인 서브유니트를 「H쇄」, 작은 쪽의 서브유니트를 「L쇄」라 한다. 또한, 각각의 펩티드는 N말단측에 존재하여 항원결합부위를 형성하는 「가변영역」과 항체의 클라스별로 일정의 「정상영역」으로 이루어지고 있다. 가변영역은 특히 항원결합부위의 형성에 밀접하게 관여하고 있는 상보성 결정영역 「CDR」과 그 사이에 존재하는 「프레임워크」로 나눌 수 있다. CDR에는 H쇄와 L쇄의 각각에 대하여 N말단측에서 「CDR1」, 「CDR2」, 「CDR3」로 불리어지는 세 개의 영역이 있다는 것이 알려져 있다.
이하, 본 발명의 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3 및 ScFv1-4를 예로 들면서 설명한다. 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3 및 ScFv1-4의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1 내지 20에 기재되고, DNA 서열은 서열번호 21 내지 25에 기재된다.
항체의 가변영역을 구성하는 아미노산은 항체에 의해 달라지는 경우가 많다. ScFv1-1의 H쇄의 부분의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 나타내었다. 여기서, 서열번호: 16에는, ScFv를 대장균에 발현시키기 위한 서열, 즉 ScFv1-1의 H쇄의 N말단에 2개의 아미노산을 부가한 서열인 것을 나타내었다. 그러므로, 항체로서의 프레임워크로서 생각하면 서열번호 16의 아미노산의 3번째 위치 내지 32번째 위치는 프레임워크 1, 33번째 위치에서 37번째 위치까지는 「CDR1」, 38번째 위치에서 51번째 위치까지는 프레임워크 2, 52번째 위치에서 68번째 위치까지는 「CDR2」, 69번째 위치에서 100번째 위치까지는 프레임워크 3, 101번째 위치에서 117번째 위치까지는 「CDR3」, 118번째 위치에서 128번째 위치까지는 프레임워크 4를 나타낸다. ScFv1-1의 L쇄의 부분 아미노산 서열은 서열번호 17로 나타내었다. 서열번호17의 아미노산의 1번째 위치에서 23번째 위치까지는 프레임워크 1, 24번째 위치에서 34번째 위치까지는 「CDR1」, 35번째 위치에서 49번째 위치까지는 프레임워크 2, 50번째 위치에서 56번째 위치까지는 「CDR2」, 57번째 위치에서 88번째 위치까지는 프레임워크 3, 89번째 위치에서 97번째 위치까지는 「CDR3」, 98번째 위치에서 111번째 위치까지는 프레임워크 4를 나타낸다. ScFv1-2 및 1-3 및 1-4의 H쇄의 아미노산 서열은 모두 서열번호 16으로 나타낸다. L쇄에 대해서는, 각각 다음과 같다. ScFv1-2의 L쇄의 부분 아미노산 서열은 서열번호 18로 나타내었다. 서열번호 18의 아미노산의 1번째 위치에서 23번째 위치까지는 프레임워크 1, 24번째 위치에서 34번째 위치까지는 「CDR1」, 35번째 위치에서 49번째 위치까지는 프레임워크 2, 50번째 위치에서 56번째 위치까지는 「CDR2」, 57번째 위치에서 88번째 위치까지는 프레임워크 3, 89번째 위치에서 97번째 위치까지는 「CDR3」, 98번째 위치에서 111번째 위치까지는 프레임워크 4를 나타낸다. ScFv1-3의 L쇄의 부분 아미노산 서열은 서열번호 19로 나타내었다. 서열번호 19의 아미노산의 1번째 위치에서 23번째 위치까지는 프레임워크 1, 24번째 위치에서 34번째 위치까지는 「CDR1」, 35번째 위치에서 49번째 위치까지는 프레임워크 2, 50번째 위치에서 56번째 위치까지는 「CDR2」, 57번째 위치에서 88번째 위치까지는 프레임워크 3, 89번째 위치에서 97번째 위치까지는 「CDR3」, 98번째 위치에서 111번째 위치까지는 프레임워크 4를 나타낸다. ScFv1-4의 L쇄의 부분 아미노산 서열은 서열번호 20로 나타내었다. 서열번호 20의 아미노산의 1번째 위치에서 22번째 위치까지는 프레임워크 1, 23번째 위치에서 36번째 위치까지는 「CDR1」, 37번째 위치에서 51번째 위치까지는 프레임워크 2, 52번째 위치에서 58번째 위치까지는 「CDR2」, 59번째 위치에서 90번째 위치까지는 프레임워크 3, 91번째 위치에서 102번째 위치까지는 「CDR3」, 103번째 위치에서 116번째 위치까지는 프레임워크 4를 나타낸다. 이들의 프레임워크와 CDR의 경계는 캐밧(Kabat) 등 「면역학적으로 유리한 단백질의 서열」(National Institutes of Health, Bethesda, MD(1987) 및 (1991))을 참고로 하여 결정되었다.
ScFv의 조제에는 Recombinant Phage Antibody System(파마시아사) 등을 이용하는 것이 가능하나, 생산숙주가 되는 대장균에는 전기 단쇄항체가 독성을 가지며, 대장균의 사멸, 전기 단쇄항체의 분해를 일으키는 경우에는, 킷트를 유효로 이용할 수 없으며 많은 고안이 필요하다. 단쇄항체는, pSE380 플라스미드(인비트로젠사)나 pET24d(+) 플라스미드(노바젠사) 등의 유도성의 벡터와 숙주가 되는 균체를 검토하여 조제할 수 있다. 또한, 생산에 있어서는 전술의 방법 외에 동물세포 발현계, 곤충세포 발현계, 효모세포 발현계도 유효하게 이용할 수 있다. H쇄 및 L쇄를 결합하는 링커는 실시예에서는(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) ×3회 반복의 15잔기의 아미노산을 이용하였으나, 본 발명에 있어서는 본 서열에 한정되지 않고 이용하는 것이 가능하다.
서열목록의 서열번호 21에는, 서열번호 16의 아미노산의 1위에서 128위에 상당하는 핵산의 염기서열을 나타내었다. 서열목록의 서열번호 22에는, 서열목록의 서열번호 17의 아미노산의 1위에서 111위에 상당하는 핵산의 염기서열을 나타내었다. 서열목록의 서열번호 23에는, 서열목록의 서열번호 18의 아미노산의 1위에서 111위에 상당하는 핵산의 염기서열을 나타내었다. 서열목록의 서열번호 24에는,서열목록의 서열번호 19의 아미노산의 1위에서 111위에 상당하는 핵산의 염기서열을 나타내었다. 서열목록의 서열번호 25에는, 서열목록의 서열번호 20의 아미노산의 1위에서 116위에 상당하는 핵산의 염기서열을 나타내었다. 또한, 이들의 염기서열에 있어서도 본원에서 서술하는 바와 같은 효과를 나타내는 한, 1 또는 다수의 염기가 결실, 치환 또는 부가되는 염기서열을 포함하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
항체의 항원 특이성과 항원으로의 결합의 강함이, 주로 CDR의 아미노산 서열에 의해 결정되는 것은 마우스의 항체의 사람화에 의하여 입증된다(참조: Methods in Enzymology, 203, 99-121, 1991).
아울러, ScFv에서 통상 생체내에 있는 형태의 항체를 작제하는 것이 가능하다. 하나의 예를 들면, E2/NS1에 결합하는 ScFv의 플라스미드에서 H쇄 및 L쇄의 가변영역부분만을 PCR법으로 증폭한다. 각각의 단편은, 예를 들면 사람의 항체의 H쇄 유전자 및/또는 L쇄 유전자를 가지는 플라스미드로 재조합하여, 상기 ScFv에 있는 가변영역을 가지는 통상 생체내에 있는 형태의 항체로 하는 것이 가능하다. 구체적으로는 예를 들면, 플라스미드에서 H쇄 및 L쇄의 가변영역을 증폭할 경우 수득되는 유전자단편의 양단에, 적당한 제한효소 절단부위를 삽입하고 있으며, 사람 항체의 H쇄 및/또는 L쇄를 가지는 플라스미드의 적당한 제한효소 절단부위와 삽입시켜, 프레임시프트가 일어나지 않도록 가변영역의 유전자를 교체한다. 이와 같은 방법에 의해 플라스미드상에 있었던 가변영역의 서열을 그대로 가지는 통상 생체내에 있는 형태의 항체를 만드는 것은 가능하다. 이 항체에서 한층 항체의 H쇄 또는L쇄의 가변영역 또는 그 삽입으로 형성된 항원 결합부위를 적어도 하나를 포함한 펩티드, 1 그룹의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 Fab, 2그룹의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진(Fab' 2)를 만드는 것도 가능하다.
본 발명에서 나타낸 H쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열이며, L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열인 항체, 또는 H쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열이며, L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열인 항체, 또는 H쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열이며, L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 10, 11 및 12에 기재된 아미노산 서열인 항체, 또는 H쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열이며, L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열인 항체의 서열을 치환함에 따라 E2/NS1으로의 결합력 및 중화활성을 높이는 것은 가능하다. 예를 들면, CDR3의 서열을 임의로 치환하여 항체를 새로 고치는 것도 가능하며, H쇄 및 L쇄의 CDR1, CDR2, CDR3의 아미노산 서열 및 유전자의 서열을 치환함에 따라 고활성의 항체를 취득하는 것도 가능하다. 이때, 아미노산 서열을 변환한 항체에 대해서는, 중화활성을 잃지 않는 한 문제없다. 즉, 본 발명에 있어서는 E2/NS1와 HCV 감염성세포,CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 능력을 가지는 한, 상기 아미노산 서열에 있어서, 치환, 결실, 삽입 등의 수식을 첨가하는 것에 대해서도, 본 발명의 범위에 포함된다.
또한, 본 발명의 항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및 ScFv2-4는, 상기 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 H쇄 중에 아미노산 치환을 가지는 항체이다. 항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및 ScFv2-4는 H쇄의 아미노산 서열과 DNA 서열을 서열목록의 서열번호 34 및 35에 기재한다.
아울러, 본 발명의 항체 ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4는의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 서열목록의 서열번호 42 내지 65에 기재한다.
항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, ScFv2-4, ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3 및 ScFv3-4에 대한 설명은, 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 설명과 동일하다.
또한, 본 발명에서는 전체 길이 항체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 말하는 항체의 발현에는, 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등을 이용할 수 있으나, 사람에게 의약품으로서 투여하는 것을 생각하였을 경우, 당쇄수식되는 쪽이 보다 사람형에 근접한 동물세포를 이용하는 것이 바람직하다. 하나의 예를 들면, COS 세포나 CHO 세포로 항체를 발현시키는 경우에는 pCDNA3.1(+)이나 pMAMneo(CLONETECH사) 등을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 상기의 수법으로 취득한 항체의 H쇄의 유전자를 pCDNA3.1(+)의 멀티클로닝사이트에, L쇄의 유전자를 pMAMneo에 각각 삽입한다. 다음으로 H쇄의 삽입된 벡터의 적당한 사이트에 프로모터와 polyA 사이에 L쇄의 유전자가 있는 발현 유니트를 삽입한다. 이 벡터를 COS 세포나 CHO-K1, 또는 CHO DG44에 유전자공학의 정법으로 도입한 것에 따라 목적의 항체 생산을 수행할 수 있다. 아울러, 상기 작제한 벡터에 예를 들면 pSV2/DHFR(참조: Nature, 1981.Vol.294, Lee F. et al.,)에서 DHFR유전자의 발현 유니트를 잘라내어, H쇄와 L쇄를 발현하는 벡터로 삽입한다. 이 벡터를 CHO DG44에 유전자공학의 정법으로 유전자도입을 한다. 이것에 의해 선택된 세포는 MTX를 이용한 DHFR유전자증폭계를 사용함에 따라 항체의 생산성을 대폭으로 상승시킬 수 있다. COS 세포에서는 일과성의 항체 발현만 수행할 수 있으나, CHO 세포에서는 항체의 유전자가 염색체에 삽입된 형태로 발현할 수 있다.
또한, 앞서 논한 DHFR 유전자증폭계를 이용하는 것에 의해 항체를 고발현시키는 것도 가능하며, 무혈청배지에서 항체생산을 수행할 수 있기 때문에 공업생산은 CHO 세포를 이용하는 것이 보다 바람직하다.
COS 세포는, 통상 10% 소태아혈청(FBS)을 첨가한 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)를 이용하며, 5% CO2존재하에서 37℃로 배양한다. COS 세포로의 유전자도입 후의 세포의 육종생산법은, 「참조: 바이오 메뉴얼 시리즈 4 유전자도입과 발현·해석법; 요코다, 아라이」(양토사, 1994) 등의 실험서에 기재되어 있다. COS 세포에의 유전자도입법은 전기 충격요법 외, DEAE 덱스트란(dextran)법, 리포펙틴(lipofectin) 등의 트랜스펙션시약을 이용한 방법이여도 무방하다.
CHO K-1세포, CHO-DG44세포는, DMEM에 10% FBS를 첨가한 배지 외에, 예를 들면 CHOS SFM2(GIBCO사) 등의 시판되어 있는 무혈청배지를 이용하여 5% CO2 존재하 37℃에서 배양하는 것도 가능하다. CHO 세포로의 유전자도입도 COS 세포와 동일하게 전기 충격요법 외, DEAE 덱스트란법, 리포펙틴 등의 트랜스펙션시약을 이용한 방법을 이용하는 것이 가능하다. 특히 CHO DG44에서는 히폭산틴, 티미딘이 없는 배지에서 배양하고, DHFR의 저해제인 MTX를 배지에 첨가하는 것에 의해 유전자증폭에 따른 항체의 생산성의 상승이 가능하다.
본 발명에서의 항체 생산시에는, 혈청유래의 소항체의 혼입을 피하기 위하여, 무혈청의 배지로 배양하는 것이 바람직하다. 무혈청배지에 순화하지 않는 COS 및 CHO의 혈청배지에서 배양하고 있는 세포에 대해서는, 혈청을 삽입하지 않는 DMEM에 따라 배양하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 배양상층액에서 수득된 본 발명의 항체는, 예를 들면 프로테인 A컬럼이나 프로테인 G컬럼을 이용하는 일반적인 IgG항체의 정제법에 따라 용이하게 정제하는 것이 가능하다.
본 발명에서 생산한 항체는 HCV의 치료에 이용가능하다. 항체의 형상으로는, 생산된 항체분자를 그대로 이용하는 것도 가능하나, 각종 프로테아제처리에 의해 수득된 항원결합부위를 포함하는 단편인 Fab, F(ab')2, Fv, 또는 Fd 등도 적용할 수 있으나, 전체항체가 가장 바람직하다. 이들의 단편에 대해서는 「항체공학입문」(지인서관)에 상세하게 설명되어 있다. 단편 펩티드의 경우는, 항체분자의 효소처리에 의해 수득할 수 있으나, 유전자공학적인 수법에 의해 세균, 효모 등에 서 생산하는 것도 가능하다. 이들의 방법에 의해 수득한 단클론성 항체, 단클론성 항체 유래 항체 단편, 펩티드 등을 조합시킴에 따라 보다 강고한 결합성을 일으킨다.
본 발명에서 생산한 항체를 이용하여 HCV 감염환자의 혈액중의 HCV 입자가 감소할 수 있다. 예를 들면, HCV의 mRNA 또는, 시판의 HCV 진단약에 의해 항 HCV 항체가 혈액중에 관찰되는 환자에게 본 발명에서 생산한 항체를 투여함에 따라 혈액중의 HCV 입자의 양을 감소시킴으로서 HCV의 재감염을 방지하고, HCV 환자를 치료할 수 있도록 한다. 아울러, 본 항체는 HCV 환자에게 투여하면 HCV 환자의 체내에서 HCV이 감염하고 있는 세포 중에 특히 세포표면에, E2/NS1이 제시되어 있는 세포에도 결합할 수 있다. 이 결합과 생체내의 보체 등의 면역계의 활성화에 의해 HCV감염을 하고 있는 세포에 대한 사멸능력을 기대할 수 있다. 또한, 다른 항체유래의 가변영역의 유전자를 조합함에 따라, 양특이성 항체, 다중특성 항체의 생산도 가능하게 된다. 다중특성 항체는, 다른 항원 또는 동일한 항원의 다른 에피톱을 인식하는 항원결합부위를 적어도 2종류이상 보유하는 항체를 말한다. 그 중에서도 양특이성 항체라 함은, 다른 항원 또는 에피톱을 인식하는 항원결합부위를 2종류 이상 가지는 항체를 말한다. 예를 들면, 통상의 항체의 한편의 항원결합부위와 다른 한편의 항원결합부위가 다른 양특이성항체는 통상의 항체보다도 항원을 강하게 또는, 폭넓은 서열의 HCV와 결합가능하다고 생각된다. 아울러, IgM을 사용하여 다가로 항원을 인식하는 항체 작성도 가능하다. 이러한 생산시에 양특이성화하는 이외에, 단클론성 항체를 생산, 정제하고, 그 다음으로 항체끼리를 결합시켜 양특이성화, 다중특성화 할 수 있다. 이 양특이성화는 동일 항원뿐만 아니라 다른 항원에 대한 조합도 가능하다. 예를 들면, HCV 입자에 표출하고 있다고 말하여지는 E1에 대한 항체를 이용하여 양특이성 항체, 및 다중특성 항체를 제작하는 것도 가능하다.
단쇄항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29로 나타내었다. 또한 그것을 양호화하는 핵산서열의 예를 아미노산 서열과 함께 나타내었다. 서열번호 26의 아미노산 서열의 1위에서 22위는 대장균으로 부터의 분비용 시그널을 포함한 서열, 23위에서 148위는 H쇄의 가변영역, 149위에서 165위는 링커, 166위에서 276위는 L쇄의 가변영역, 277위에서 299위는 표지자를 포함한 서열을 나타낸다. 서열번호 27의 아미노산 서열의 1위에서 22위는 대장균으로 부터의 분비용 시그널을 포함한 서열, 23위에서 148위는 H쇄의 가변영역, 149위에서 165위는 링커, 166위에서 276위는 L쇄의 가변영역, 277위에서 299위는 표지자를 포함한 서열을 나타낸다. 서열번호 29의 아미노산 서열의 1위 내지 22위는 대장균으로부터의 분비용 시그널을 포함하는 배열, 23위 내지 148위는 H쇄의 가변영역, 149위 내지 165위는 링커, 166위 내지 281위는 L쇄의 가변영역, 282위 내지 304위는 표지자를 포함하는 서열을 나타낸다.
서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 1위에서 22위를 결실시켜 대장균 균체내에 단쇄항체를 발현하는 것도 가능하다. 또한, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28에 기재된 아미노산의 277위에서 299위까지는 단쇄항체의 검출, 및 정제를 위한 서열이며, 결실 또한 어떠한 서열에도 치환할 수 있다. 또한, 서열번호 29에 기재된 아미노산의 282위에서 304위까지도 동일하게 단쇄항체의 검출, 및 정제를 위한 서열이며, 결실 또는 어떠한 서열에도 치환할 수 있다. 대장균으로 부터의 분비 시그널 및 정제를 위한 서열을 포함한 벡터의 작제는 실시예에 나타난 대로이다. 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28 및 서열번호 29에 기재된 아미노산 서열의 149위에서 165위의 링커 서열은 H쇄 및 L쇄의 가변영역의 입체구조를 실질적으로 ScFv1-1과 동일하게 유지할 수 있으면 어떠한 서열에도 치환할 수 있다. 단쇄항체는 동물세포, 곤충세포, 효모세포 외에 대장균에서도 생산가능하다.
또한, 단쇄항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및 ScFv2-4의 아미노산 서열은, 서열목록의 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38 및 서열번호 39로 나타내고, 그것을 암호화하는 핵산서열의 예를 아미노산 서열과 함께 나타내었다.
아울러, 단쇄항체 ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64 및 서열번호 65로 나타내었다. 또한, 그것을 암호화하는 핵산서열의 예를 아미노산 서열과 함께 나타내었다.
단쇄항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, ScFv2-4, ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4에 대한 설명은, ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4에 대하여 상술한 바와 같다.
단쇄에서도 항체 양특이성화 및 다중특성화가 가능하다. 예를 들면, 한 펩티드내에서 복수의 항원인식부위의 조합 H쇄와 L쇄를 반복하여 나열하는 것에 의해 생산시킬 수 있다. 또한, 생산, 정제 후에 연결하는 것도 가능하다. H쇄 및 L쇄의 조합에 따르지 않고, H쇄만 또한 L쇄만이라도 이용은 가능하다. 이러한 항체종의 선택은 이용용도에 따라 수행하는 것이 가능하며, 결합강도, 항원결합부위 등에 의해 선택할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기의 항체를 비롯하여, 그것과 동일한 기능을 가지는 말하자면 본 발명에서 규정한 E2/NS1과 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질을 유효성분으로서 함유하는 의약, 예를 들면 상기 물질과 약학적으로 허용할 수 있는 담체로 이루어진 의약조성물을 제공한다. 특히, 본 발명에 있어서 항 E2/NS1 항체유전자는, 효율적으로 항 E2/NS1 항체를 생산하는 것이 가능하며, 여러가지의 형태의 치료용제제를 제공한다. 이렇게 하여 생산되는 재조합 항체는, 예를 들면 약학적으로 허용할 수 있는 성분조성의 담체나 안정화제 등의 인체에 투여한 경우, 전기 항체의 활성을 유지시키기 위해 사용되는 물질과 함께 의약용조성물 중에 포함되어도 무방하다. 이와 같은 담체나 안정화제로서는 사람 혈청 알부민, 제라틴 등을 예시할 수 있다. 의약적으로 허용할 수 있다 함은, 매스꺼움, 현기증, 구토증 등 투여에 따른 바람직하지 않은 부작용, 매회 투여시의 제제에 대한 면역응답 등 발생하지 않는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 항체에 예를 들면, 독소 등의 물질을 결합시킨 항체도 의약품으로서 사용가능하다. 또한, 의약적으로 허용할 수 있는 적당한 용제나 희석제, 안정화제와 함께 허용된 액상의 의약용 조성물이어도 무방하다. 아울러, 상기의 의약조성물에 첨가하는 생체내에서 농도조절을 목적으로 하는 마이크로스피어, 리포솜에 있어서 비결구(주사)하는 경우는, 항체 및 단쇄항체에서 1㎍~50㎎/체중 kg이 적당하나 이 범위에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서는 항체를 대표예로서 서술하였으나, 본 발명에 있어서 E2/NS1와 HCV 감염성세포, CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질로서는, 항체 이외의 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물도 본 발명의 활성을 손상하지 않는 한 사용가능하다.
항체 이외의 단백질로서는, 락토페린 등을 들 수 있으며, 의약조성물로서의 조제나 투여법으로서는 전술의 항체의 경우에 준하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에서 말하는 황산화다당류라 함은, 예를 들면 분자량이 평균분자량 5000Da 내지 1000000Da의 범위의 헤파린, 헤파란 황산, 콘드로이틴 황산A, 콘드로이틴 황산 C, 델마탄 황산, 케라탄 황산 1 및 케라탄 황산 2 등, 즉 글리코사미노글리칸류 및 덱스트란 황산 등을 말하나, 바람직하게는 5000Da 내지 30000Da 정도의 크기의 헤파린이 무방하다. 투여방법은 예를 들면 10000 내지 30000단위를 5% 포도당액, 생리식염수, 링겔액으로 희석한 정맥주사법, 1회 5000 내지 10000단위를 4애서 8시간마다 주사개시 3시간에서 2 내지 4시간마다 수행하는 간혈적 정맥주사법, 농축액을 초회 15000 내지 20000단위, 이어서 유지량 1회 10000 내지 15000단위를 1일 2회 투여하는 피하/근육주사를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 말하는 저분자화합물이라 함은, 후술의 실시예에서 서술한 바와 같이 스라민 등이 있으나, HCV의 E2/NS1와 HCV의 감염을 저지하는 물질이면 이에 한정하지 않는다.
이 저분자화합물의 결합부위는 여러 개소를 생각할 수 있으나, 상기 헤파린이 결합하는 부위에 결합하는 물질이면 황산기가 첨가된 화합물이 바람직하다.
여기서 예를 든 항체 등의 단백질, 황산화다당류, 저분자화합물을 의약품으로서 사용하였을 경우에는 단독으로 사용할 필요는 없으며, 각각의 물질에 대해서 본 명세서에 명기한 범위내의 양으로 복수의 물질을 투여하는 것도 가능하다.
또한, 상기 단쇄항체의 경우에는, C형간염 바이러스의 진단용도로서 적당히 이용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 피험물질의 존재하 및 비존재하에서, HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 결합을 측정하고, 피험물질의 비존재하에서의 결합과 비교하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법으로 수득된 C형간염 바이러스의 생활주기를 저해하는 물질, 및 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 결합한 다음, 피험물질과 HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 융합을 측정하고, 피험물질의 비존재하에서의 융합과 비교하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법으로 수득된 C형간염 바이러스의 생활주기를 저해하는 물질에 관한다. 여기서, C형간염 바이러스의 생활주기의 예로서는, C형간염 바이러스의 간염이나 증식 등이 있다.
타키카와(Takikawa 등의 문헌(참조: Takikawa et al., J. Virol., 74, 5066-5074, 2000)에는, HCV에 감염성이 있는 세포(HepG2)와 HCV 단백질을 발현하고 있는 CHO 세포의 결합 및 융합을 측정하는 것이 가능한 분석계와 그것을 이용하는 HCV 감염기구에 대하여 기재되어 있다.
본 발명에서 수득된 항체는 그 분석계를 경쟁적으로 중화하는 것이 가능한 새로운 물질이다.
세포융합 분석계는, HTLV-1 등에서 바이러스의 세포융합활성의 측정으로 이용되고 있는 장치이다. 본 발명의 분석계는 HCV의 세포융합을 의사적으로 나타낸 장치이므로, 본 분석계를 저해하는 물질에는 HCV의 간염을 저지, 특히 세포에의 결합 및 탈핵을 저해하는 효과가 기대된다.
HCV는 RNA 바이러스이기 때문에 상당히 변이하기 쉬운 점이 알려져 있다. 이 변이에 의해 HCV의 구조 단백질, 비구조 단백질과 함께 여러가지의 개소가 변이를 한다. 이 변이때문에 HCV의 감염을 저지하는 물질, 예를 들면 어느 특정의 단백질 서열을 인식하는 항체 등을 개발하는 것은 곤란하다고 여겨지고 있다. 그러나, 본원 발명자들은, 이시이 등의 보고에 있는 중화항체는, 치유질환마다 감염되어 있는 바이러스의 서열이 다른데도 불구하고, 단지 한 종류의 E2/NS1으로의 결합을 저지하고 있는 점에 착안하였다. 즉, 항원의 특정 영역 또는 구조를 인식하는 물질이면, 바이러스의 서열의 다양성에 관계없이, E2/NS1과 HCV 감염성이 있는 사람세포, CD81 발현세포 또는 CD81과의 결합을 저지하여, 감염저지가 가능하다고 사료되었다.
본 발명에서는, C형간염 환자의 증상을 개선하는 약제 개발을 위해, E2/NS1과 HCV 감염성이 있는 세포, CD81 발현세포 또는 CD81의 결합을 저해하는 물질의 검색을 반복한 결과, HCV의 HCV 감염성 세포로의 결합 및 감염저지가 기대되는 물질을 취득하기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 의하면, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질이 제공되었다.
본 발명의 바람직한 실시 태양에 의하면, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질의 양전하를 가지는 영역에 결합함에 따라, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 물질; C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 전기 E2/NS1 단백질을 인식가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 물질; C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 형광법 또는 발색법에 의해 전기 E2/NS1 단백질을 검출가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 물질; C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 표지자(tag)를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 물질; C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질의 C말단에 표지자를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는물질; CD81을 발현하는 세포가, 사람 CD81을 발현하는 세포인 것을 특징으로 하는 물질; CD81이, 가용화 발현된 사람 CD81인 것을 특징으로 하는 물질; C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과의 결합상수가 108이상이거나 해리상수가 10-8이하인 것을 특징으로 하는 물질; 결합상수가 109이상이거나, 또는 해리상수가 10-9이하인 것을 특징으로 하는 물질; 물질이 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물인 것을 특징으로 하는 물질; 단백질이 항체인 것을 특징으로 하는 물질; 항체가 C형간염 치유환자의 B세포 유래인 것을 특징으로 하는 물질; 항체가 C형간염 치유환자의 B세포의 유전자 유래인 것을 특징으로 하는 물질; 또한, C형간염 치유환자가 자연치유환자이며, B세포가 말초혈 단핵구세포인 것을 특징으로 하는 물질이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면,
H쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체; 서열목록의 서열번호: 16 또는 34에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 16 또는 34에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 17에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체; 서열목록의 서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 10, 11 및 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 10, 11 및 12에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 19에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 20에 기재된 아미노산 서열을 포함함거나, 서열번호: 20에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 42, 43 및 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 42, 43 및 44에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 54에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 54에 기재된 아미노산에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 45, 46 및 47에 기재된아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 55에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 55에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 56에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 56에 기재된 아미노산에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 51, 52 및 53에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 51, 52 및 53에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
서열목록의 서열번호: 57에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호:57에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 항체;
가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, H쇄의 아미노산 서열로서, 서열목록의 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
L쇄의 아미노산 서열로서, 서열목록의 서열번호: 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 41에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체;
가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열목록의 서열번호: 26, 27, 28 또는 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 26, 27, 28 또는 29에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 단쇄항체가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열목록의 서열번호: 36, 37, 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 36, 37, 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 단쇄항체가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 서열목록의 서열번호: 62, 63, 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 62, 63, 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 단쇄항체가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산이 제공된다. 바람직하게는, 서열목록의 서열번호: 21, 22, 23, 24, 25, 35, 58, 59, 60, 61 중 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는, 상기 핵산; 서열목록의 서열번호: 40 또는 41에 기재된 염기배열을 포함하는 상기 핵산; 서열목록의 서열번호: 26, 27, 28, 29 중 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 상기 핵산; 서열목록의 서열번호: 36, 37, 38, 39 중 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 상기 핵산; 서열목록의 서열번호: 62, 63, 64, 65 중 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 상기 핵산이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 어느 핵산 중, 이용한 항체의 생산방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 방법에 따라 수득할 수 있고, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 재조합 항체가 제공된다. 바람직하게는, 항체의 Fc영역이 사람형인 재조합 항체, 항체가 단쇄항체인 재조합 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 본 발명의 물질을 유효성분으로서 함유하는 의약, 상기 본 발명의 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약, 상기 본 발명의 재조합 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약이 제공된다. 바람직하게는, C형간염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 및 C형간염의 진단을 위한 의약이 제공된다. 또한, 본 발명에 의하면, 상기 본 발명의 물질을 유효성분으로서 함유하는 항HCV제, 상기 본 발명의 항체를 유효성분으로서 함유하는 항HCV제, 상기 본 발명의 재조합 항체를 유효성분으로서 함유하는 항HCV제가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, C형간염 치유환자의 B세포를 자극하고, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대한 항체의 mRNA를 발현시킨 상태에서, 전기 B세포에서 항체 mRNA 및 항체 cDNA를 취득하고, 전기 E2/NS1에 결합하는 항체의 가변영역의 서열을 취득하는 방법이 제공되며, 바람직하게는, C형간염 치유환자가 자연치유환자이며, B세포가 말초혈 단핵구세포인 것을 특징으로 하는, 항체의 가변영역의 서열을 취득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 방법에서 취득된 가변영역의 서열을 가지는 항체가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81을 접촉시키는 단계; 및 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서의 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 비교하는 단계를 포함하는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법이 제공된다. 바람직하게는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 전기 E2/NS1 단백질을 인식가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 형광법 또는 발색법에 의해 전기 E2/NS1 단백질을 검출가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 표지자를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질의 C말단에 표지자를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법, CD81을 발현하는 세포가, 사람 CD81을 발현하는 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법, CD81이 가용화 발현된 사람 CD81인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법, 피험물질이, 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기의 스크리닝 방법에서 수득된 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 결합을 측정하며, 피험물질의 비존재하의 결합과 비교하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법에서 수득되는 C형간염 바이러스의 생활주기를 저해하는 물질, 및 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포가 결합한 다음, 피험물질과 HCV에 감염성이 있는 세포 또는 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 융합을 측정하며, 피험물질의 비존재하에서의 융합과 비교하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법에서 수득되는 C형간염 바이러스의 생활주기를 저해하는 물질이 제공된다. 바람직하게는, 피험물질은 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 물질을 유효성분으로서 포함하는, 항HCV제; 상기 물질을 이용하여, 항HCV제를 제제화하는 것을 포함하는 항HCV제의 제조방법이 제공되며, 전기 제조방법은, 바람직하게는, 상기 스크리닝 방법을 이용하여 C형간염 바이러스의 증식을 저해하는 것을 확인하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. E2의 발현
(E2 표지자 발현 벡터의 구축)
HCV J1 클론의 유전자(참조: GenBank 등록번호: D89815) 내의 E2/NS1의 HCV게놈에 있어서의 384번째의 아미노산에서 711번째 아미노산에 해당하는 100ng을 이용하고, PCR 증폭용 프라이머(primer)로서 동물세포에서의 분비를 촉진하는 시그널펩티드 서열을 가지는 PCR 프라이머(5' CCC AAG CTT ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG GCT AGC CAT ACC CGC GTG ACG GGG GGG GTG CAA GG 3'; 서열번호 30) 를 5' 측에 이용하고, E-표지자의 서열을 가지는 PCR 프라이머(5' CCC CCT CGA GTC 표지자 ATT AAC GCG GTT CCAGCG GAT CCG GAT ACG GCA CCG GCG CAC CGG AGA CGA CCG CCG ACC CTA TAC C 3'; 서열번호 31)를 유전자의 3' 측에 이용하고, PCR 반응에 의해 DNA(tPA시그널 + E2(384-711) + 표지자) 단편을 증폭하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하고, 폴리머라제로 KOD(동양방사로부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 다음으로 원하는 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하여 [Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor]에 기재된 방법에 따라 정제하였다. 정제 DNA 단편 1㎍를 1유니트의 HIndIII와 XbaI을 이용하여 50㎕의 시스템 M(10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM MgC12)에서 37℃로 2시간 반응시켜 절단하고, 70℃ 10분의 열처리에 의해 효소를 불활성시켰다. 이것과 동물세포용 발현벡터 pCDNA 3.1(+)(Invitrogen사로부터 구입) 1㎍을 1유니트의 HIndIII와 XbaI을 이용하여 50㎕의 시스템 M(10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM MgC12)에서 37℃로 2시간 반응시켜 절단하고, 70℃ 10분의 열처리에 의해 효소를 불활성시킴과 함께, 페놀과 클로로포름과 이소아밀알콜을 25:24:1로 혼합한 용액을 효소액과 등량첨가하고 혼합하며 원심을 수행하여 수층만을 회수하였다(향후에 이 조작을 페놀클로로포름 추출이라고 칭함). 아울러, 회수한 수층에 10분의 1의 3M 초산나트륨과 2.5배의 에탄올을 혼합하고 -20℃에서 하룻 밤, 또는 -80℃에서 15분 정치하고, 원심하여 DNA 단편을 회수하였다. 아울러 70%의 에탄올을 첨가한 다음 경사법을 수행하고, 진공건조를 수행한(향후에 이 에탄올을 첨가하여 DNA 단편을 회수하는 일련의 조작을 에탄올 침전이라고 칭함)다음, 5㎕의 멸균수에 회수한 DNA 단편을 용해하였다.
이 정제 DNA 단편끼리를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)에 형질전환하여 원하는 E2 표지자 발현 플라스미드 pE2 표지자를 수득하였다.
(E2 표지자의 동물세포에서의 발현)
플라스미드 pE2 표지자를 보유하는 대장균을 50ml 배플 플라스크에서 하룻 밤 배양하였다. 균체를 8,000rpm에서 10분 원심에 의해 회수하고 QIAGEN Plasmid Midi kit(QIAGEN사로부터 구입)을 이용하여 설명서에 따라 플라스미드를 정제하였다.
아울러, 정제한 플라스미드를 lipofectin(LIFETECH사로부터 구입)을 이용하여 설명서에 따라 5% FBS를 첨가한 EX-CELL302(JRH로부터 구입)에서 배양한 CHO DG44주에 트랜스펙션하였다. CHO DG44는 5% CO2중 37℃로 배양하였다. 트랜스펙션 2일 후, 세포를 0.25% 트립신으로 분리한 후, G418을 400㎍/ml 첨가한 EX-CELL302에 세포를 접종하였다. 2주간 정도 G418 첨가배지를 이용하여 배지의 교환을 수행하고, 콜로니가 떠오르는 것을 확인하였다.
수득된 세포의 E2 표지자의 발현 확인은 세포의 상층액을 웨스턴블로팅함으로서 확인하였다. 웨스턴블로팅은 파마시아사로부터 구입한 Anti-E 표지자Antibody의 설명서에 따라 수행하였다. 검출항체에는 HRP 결합 양 항 마우스 IgG항체를 이용하였다. 발광반응은 ECL Western blotting detection reagents(Amersham Pharmacia Biotech로부터 구입)을 이용하여 설명서에 따라 X선 필름에 감광시켜 수행하였다. 복수 수득된 클론 중 발현이 가장 높은 세포를 다음 실험에 이용하였다.
(E2 표지자의 정제)
상기의 방법으로 수득한 E2 표지자 발현주를 EX-CELL302로 필요량의 상층액이 수득되도록 배양하였다. 세포의 대수증식기가 종료한 시점에서 세포를 원심으로 제거한 상층액을 회수하였다. 상층액은 아울러 0.45㎛의 필터를 이용하여 오염물질을 제거하였다. 그와 같이하여 수득된 상층액은 RPAS Purification Module(파마시아사로부터 구입)을 이용하여 어피니티정제를 수행하였다. 정제는 RPAS Purification Module에 첨부 설명서에 따라 수행하였다. E2 표지자는 RPAS Purification Module에 첨부된 Elution 완충용액에서 수득되기 때문에 PBS로 치환하였다. 구체적으로는, 센트리콘 30(아미콘사로부터 구입)의 필터 상부에 E2 표지자가 포함되는 Elution 각 분을 첨가하고 안에 포함하는 완충용액이 100㎕ 이하로 되기까지 5000rpm에서 원심을 수행하였다. PBS를 2ml 정도 첨가하고 동일한 원심조작을 수행하였다. 이 조작을 4회 이상 반복함에 따라 PBS에서 용해하고 있는 E2 표지자를 회수하였다.
2. NOB 분석계 구축
(CD81 발현벡터의 구축)
사람 CD81 유전자(참조: GenBank 등록번호 M33680)의 전체길이 DNA를 취득하기 위해, Hela 세포로 부터 정제한 mRNA 1㎍에서, RT-PCR 킷트 ver2.1(TAKARA사)를 이용하여, 첨부자료에 따라 랜덤 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 다음으로 이 킷트의 첨부자료에 따라, PCR증폭용 프라이머로서 5'측을 GCGCCGCCATGGGAGTGGAGGGCTGC(서열번호 32)로 설정하고, 3'측을 CTCAGTACACGGAGCTGTTCCGGA(서열번호 33)으로 설정하고 PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물은 0.8% 아가로스겔 전기영동하고, 목적의 밴드를 QIAEXII Gel Extraction kit(QIAGEN사로부터 구입)을 이용하여 첨부설명서에 따라 정제하였다. 아울러, TOPO TA Cloning kit with TOP10F' Cells(인비트로젠사로부터 구입)을 이용하여, 첨부설명서에 따라 pCR2.1-TOPO와 상기 목적 CD81의 단편의 결합 및 대장균의 형질전환을 수행하여 목적으로 하는 pCRhCD81을 수득하였다. 아울러, pCRhCD81 1㎍을 1유니트의 EcoRI를 이용하여 50㎕의 시스템 H(10mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 2mM MgC12)에서 37℃로 2시간 반응시켜 절단하고, 70℃로 10분의 열처리에 의해 효소를 불활성시킨 다음 QIAEXII Gel Extraction kit(QIAGEN사로부터 구입)을 이용하여 첨부설명서에 따라서 CD81 유전자를 포함하는 단편을 정제하였다. pCDNA3.1(+)도 별도 동일한 시스템으로 EcoRI 처리하고 효소를 불활성시킨 다음 박테리아 알칼리포스파타제(TOYOBO사로부터 구입)를 1㎕ 첨가하고 65℃에서 1시간 배양하였다. 그다음, 페놀클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 정제한 후, 5㎕의 멸균수에 각각 회수한 DNA 단편을 용해하였다. 또한, 양 단편을 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)에 형질전환하여 원하는 CD81 발현 플라스미드 pCDNA3.1(+)/CD81을 수득하였다.
(CD81 발현세포구축)
플라스미드 pCDNA3.1(+)/CD81를 보유하는 대장균을 50ml 배플 플라스크에서 하룻 밤 배양하였다. 균체를 8000rpm의 원심분리한 후 QIAGEN Plasmid Midi kit(QIAGEN사로부터 구입)을 이용하여 설명서에 따라 플라스미드를 정제하였다.
아울러, 정제한 플라스미드를 lipofectin(LIFETECH사로부터 구입)를 이용하여 설명서에 따라서 10% FBS를 첨가한 둘베코의 변형된 이글배지(DMEM)에서 배양하고 있었던 NIH3T3주에 트랜스펙션하였다. NIH3T3은 이하 모든 5% CO2에서 37℃로 배양하였다. 트랜스펙션 2일 후, 세포를 0.25% 트립신으로 분리하고, 10% FBS와 G418을 800㎍/ml 첨가한 DMEM에 세포를 접종하였다. 2주간 정도 G418 첨가배지를 이용하여 배지의 교환을 수행하여, 콜로니가 떠오르는 것을 확인하였다.
수득된 세포주에 있어서 CD81 발현의 확인은 하기의 조작에 의해 수행하였다. 수득된 세포주를 선택배지에서 6 well plate로 융합되기까지 배양하였다. 세포를 PBS/0.05% EDTA에서 한번 세정한 다음, PBS/0.05% EDTA를 이용하여 분리한 다음 0.1% BSA와 0.1% 아지드를 포함하는 PBS(이하 FACS 완충용액으로 칭함) 20㎕에 현탁하고, 항 CD81 항체(파민젠사로부터 구입)의 최종 농도가 0.025㎎/ml이 되도록 첨가하여 혼합한 다음, 빙상에서 1시간 배양하였다. FACS 완충제를 200㎕을 첨가한 다음 3000rpm에서 원심하여 세포를 회수하는 조작을 2회 반복하였다. 회수한 세포를 30㎕의 FACS 완충용액에 현탁하고, FITC 표식 토끼 항 마우스 Igs 항체(카펠사로부터 구입)를 최종농도 0.05㎎/ml가 되도록 첨가하여 혼합한 다음, 차광하여 빙상에서 1시간 배양하였다. FACS 완충용액 200㎕를 첨가한 후 3000rpm에서 원심하여 세포를 회수하는 조작을 2회 반복한 다음, 200㎕의 FACS 완충용액에 세포를 현탁하여 FACScan(벡톤딕킨손사)에 의해 세포의 형광량을 측정하고 가장 형광량이 큰 세포를 선택하여 NIH3T3/CD81로 명명하였다.
(E2 표지자와 Molt-4 또는 NIH3T3/CD81과의 결합확인)
Molt-4(참조: 리켄 RCB NO.0206) 또는 NIH3T3/CD81을 최종 농도 5 ×106cell/ml로 하고, E2 표지자가 최종 농도 50㎍/ml 이하가 되도록 농도를 낮추어 혼합하고 1%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640로 20㎕의 부피로 빙상으로 1시간 배양하였다. 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕를 첨가하고, 3000rpm에서 원심분리하여 세포를 회수하는 조작을 2회 반복하였다. 1%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640으로 항 E 표지자 항체를 10㎕/ml로 희석하고 각 샘플에 10㎕ 첨가하여 혼합한 다음 1시간 빙상으로 배양하였다. 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕ 첨가하고, 3000rpm에서 원심하여 세포를 회수하는 조작을 2회 반복하였다. 5% FBS를 포함하는 PBS로 FITC 표식 토끼 항 마우스 Igs(카벨사로부터 구입)을 최종 농도 25㎍/ml가 되도록 희석한 용액 10㎕을 각 견본에 첨가하여 혼합한 다음 1시간 빙상으로 방치하였다. 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕ 첨가하고, 3000rpm에서 원심하여 세포를 회수하는 조작을 2회 반복하였다. 견본을 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕로 현탁한 다음 FACScan(백톤딕킨손사)에 의해 세포의 형광량의 변화를 측정하고, E2 표지자가 Molt-4 또한 NIH3T3/CD81와 결합하고 있는 것을 확인하였다.
(E2 표지자와 Molt-4 또는 NIH3T3/CD81과의 결합저지물질의 확인)
E2 표지자의 최종 농도 50㎍/ml가 되도록 1%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640에 희석한 용액과, 1% FBS를 포함하는 RPMI 1640에서 ScFv(본 명세서 중에서 하기에 기재하는 스크리닝 방법으로 취득된 항체)를 0.125㎍/ml 내지 12.5㎍/ml, 헤파린(시그마사 제품, H3393)을 4㎍/ml 내지 400㎍/ml, 스라민(시그마사 제품 S2671)을 50㎍/ml 내지 5000㎍/ml의 범위에서 희석한 용액을 각각 10㎕씩 혼합하고, 37℃에서 30분간 방치하였다. 1 ×107cell/ml의 농도에 Molt-4 또는 NIH3T3/CD81을 1%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640에서 현탁한 용액 10㎕을 혼합하고 1시간 빙상으로 배양하였다. 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕을 첨가하고, 3000rpm으로 원심분리하고 세포를 회수하는 조작을 2회 반복하였다. 1%의 FBS를 포함하는 RPMI 1640으로 항 E 표지자 항체를 10㎍/ml로 희석하고 각 견본에 10㎕ 첨가하고 혼합한 후 1시간 빙상으로 방치하였다. 최종 농도 5% FBS를 포함하는 PBS로 FITC표식 항 마우스 Igs(카벨사로 부터 구입)을 최종 농도 25㎍/ml가 되도록 희석한 용액 10㎕을 각 견본에 첨가하고 혼합한 후 1시간 빙상에서 배양하였다. 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕를 첨가하고, 3000rpm으로 원심분리하고 세포를 회수하는 조작을 2회 반복하였다. 견본을 5% FBS를 포함하는 PBS를 200㎕에 현탁한 후 FACScan(벡톤딕킨손사)에 의해 세포를 형광량의 변화를 측정하고, E2 표지자와 Molt-4 또는 NIH3T3/CD81의 결합이 첨가된 환자혈청 또는 항체에서 저지되는 것을 확인하였다.
결과를 도 1 내지 3으로 나타낸다. 도 1은 전술의 아미노산 서열에서 나타낸 항체의 중화활성을 나타낸다. 도 1 중, ScFv1-1 및 ScFv1-4는 전술의 아미노산 서열에서 나타난 항체를 나타내고, 대조군은, VLA4 인식하는 단쇄항체를 나타낸다. 도 2는 헤파린을 이용한 경우의 중화활성을, 도 3은 스라민을 이용한 경우의 중화활성을 나타낸 도이다.
3. 항체 라이브러리의 작제
(HCV 치유환자로부터의 mRNA의 정제)
채혈한 혈청에 E2 표지자와 Molt-4 및 NIH3T3/CD81 발현세포와의 결합을 저지하는 능력이 있는 항체를 가지는 HCV 치유환자로부터 40ml 헤파린 채혈을 수행하고, 혈액을 취득하였다. 말초혈임파구를 분리하기 위해 비중원심법(Ficoll-Paque: 파마시아)를 수행하고, 4 ×107의 임파구 세포를 수득하였다. MACS(제일화학약품,Miltenyi Biotec GmbH사 제품)을 이용하고 항 CD19 항체를 이용한 B세포 정제를 수행하고, 2.8 ×106의 세포를 수득하였다. 정제한 세포 중에 B세포의 순도를 확인하기 위해, 항 CD19 항체를 이용하여 정제한 세포를 염색하고 유세포 분석법(folw cytometry)로 95% 이상의 정제도인 것을 확인하였다. 이 정제 B세포를 이용하고, 사람 IL-2(겐자임)200unit/ml, 사람 IL-10(겐자임)10ng/ml, E2/NS1 항원 1ng/ml, 항 사람 CD40 항체(겐자임) 1㎍/ml의 자극하고, 5 ×105B세포/ml 10% FCS RPMI의 조건으로 72시간 배양하였다. B세포의 활성화를 현미경으로 확인하고, PBS로 2회 세정하고, RNAlater(Amnion사)를 이용하여 설명서에 따라 조작하고 B세포로부터 mRNA를 취득, 정제하였다.
(항체 라이브러리의 작제)
항체 라이브러리 작제는 By-Passing Immunization Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage(Journal of Molecular Biology 1991 222 582-597)의 기재방법에 따라 수행하였다. 정제한 mRNA 1㎍에서, RT-PCR 킷트 ver 2.1(TAKARA사)를 이용하여, 첨부자료에 따라 랜덤 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 다음으로 이 킷트의 첨부자료에 따라, 이 cDNA를 주형으로 하고, 항체의 H쇄, L쇄(λ쇄, κ쇄)를 각각 PCR로 증폭하였다. 항체유전자 클로닝준비 프라이머 및 링커는, 상기 논문의 기재에 따라 작제한 것을 이용하였다. PCR 산물은 1% 아가로우스겔로 전기영동을 수행하고, 항체의 H쇄, L쇄의 밴드를 절단하였다.절단한 아가로우스겔로부터 QIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN사)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 다음으로 추출한 H쇄, L쇄, 링커를 동일 몰이 되도록 하고 혼합하며, 연결용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 50㎕의 부피로, Taq polymerase(PerkinElmer사) 1유니트를 이용하고, 94℃에서 5분간 가열하고 완료하였다. PCR산물은 1% 아가로우스겔로 전기영동을 수행하고, H쇄, L쇄, 링커가 하나에 연결된 밴드를 절단하였다. 절단한 아가로우스겔로부터 QIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN사)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 다음으로 제한효소 Sfi I와 50 ㎕의 시스템 M(10mM Tris-HCI, 50mM NaCl, 2mM MgCl2)로 55℃ 2시간 반응시켜 절단하고, 70℃ 10분의 열처리로부터 효소를 불활성시켰다. DNA를 페놀클로로포름 추출과 에탄올 침전을 순차적으로 수행하고 50㎕의 멸균수에 용해하였다. 이 DNA 단편 100ng과, 50ng의 pCantab5MycHis(pCantab5E(아마샘파마시아)의 E 표지자 서열을 Myc-His 표지자로 교체한 벡터)를 TAKARA사의 리가아제 킷트를 이용하여 설명서에 따라 결합시켰다. 결찰 견본(ligation sample)을 페놀클로로포름 추출과 에탄올 침전에서 순차정제하고 10㎕의 멸균수로 용해하였다. 이 반량을 이용하여 Molecular Cloning(1982) p249, Cold Spring Harbor Labs.에 따라 형질전환하였다. 이렇게 하여 1 ×106의 콜로니를 수득하였다. 이것을 단쇄항체 라이브러리로서 이후에 이용하였다.
4. 라이브러리 파지의 스크리닝
(파지의 조제)
플레이트상에 돋아나 있는 대장균을 2ml의 2xTY 액체배지로 회수하고, 그 중 20㎕를 20ml의 2xTY 액체배지(100㎍/L 앰피실린과 2% 글루코스를 포함한다)에 첨가하였다. 37℃에서 200rpm으로 진탕하면서, 흡광도 600nm의 값이 1.0이 되기까지 배양하였다. 이 배양액에 1 ×1011pfu/ml의 헬퍼파지 M13K07을 첨가하고, 37℃로 30분 정치하였다. 계속해서 37℃ 200rpm에서 진탕하였다. 30분 후, 용액을 3000rpm에서 10분간 원심분리하여, 대장균을 회수하였다. 상층액을 폐기하고, 20ml의 2xTY 액체배지(100㎍/L 앰피실린과 50㎍/L 카나마이신을 포함한다)로 현탁하고, 37℃에서 200rpm에서 진탕이면서, 하룻 밤 배양하였다. 다음 날, 배양액을 15000rpm에서 원심분리하고, 대장균을 침전시켜, 상처을 회수하였다. 이 상층액을 파지용액으로서 이용하였다.
(스크리닝 조작)
50mM NaHCO3(pH 9.6)용액에 용해한, 10㎍/ml의 E2 항원 1ml을 플라스틱 튜브(Nunc MaxisorpTube)에 첨가하고, 4℃로 하룻 밤 방치하였다. 다음 날, 항원용액을 폐기하고, 다음으로 PBS 용액 5ml로 그 튜브를 세정하고, 이것을 3회 반복하였다. 그 후 5ml의 5% BSA를 첨가하고, 37℃로 방치하였다. 2시간 후, BSA 용액을 폐기하고, 5ml의 PBS 용액으로 튜브를 세정하였다. 다음으로 준비한 파지용액 250㎕과 5% BSA 용액 750㎕을 혼합하고 이것을 튜브에 첨가하여 37℃로 방치하였다. 이것을 20회 반복하였다. 다음으로 PBS 용액 5ml로 튜브를 세정하였다. 이것을 20회 반복하였다. 이 튜브에 1ml의 100mM 트리에틸아민을 첨가하고, 실온으로 10분간 방치하였다. 그 다음, 트리에틸아민 용액을 회수하고, 이것에 500㎕의 1M Tris-HCl(pH 7.5)를 첨가하고, 잘 혼합하였다. 이 용액 750㎕을 흡광도 600nm의 값이 0.6이 되기까지 배양한 10ml의 대장균 TG-1에 첨가하고, 37℃로 30분간 방치하였다. 이어서, 37℃에서 200rpm로 진탕하였다. 30분 후, 용액을 3000rpm로 10분간 원심하여 대장균을 회수하였다. 이 대장균을 2 ×TY 플레이트 배지(100㎍/L 앰피실린과 2% 글루코스를 포함한다)로 뿌리고, 37℃로 하룻 밤 방치하였다. 다음 날, 플레이트에 돋아 있는 대장균으로 부터, (파지의 조제)에 기재한 조작으로 파지를 회수하고, (스크리닝 조작)에 기재한 조작을 반복하였다. 이 스크리닝 조작을 3회 반복하였다.
그 결과, 서열목록의 서열번호 1 내지 29에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4가 수득된다.
서열목록의 서열번호 1 내지 3은, 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 H쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 4 내지 6은, 항체 ScFv1-1의 L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 7 내지 9는, 항체 ScFv1-2, L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 10 내지 12는, 항체 ScFv1-3, L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 13 내지 15는, 항체 ScFv1-4, L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 16은, 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 17 내지 20은, 각각 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 L쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 21은, 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 H쇄의 염기서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 22 내지 25는, 각각 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 L쇄의 염기서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 26 내지 29는, 각각 항체 ScFv1-1, ScFv1-2, ScFv1-3, 및 ScFv1-4의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
또한 H쇄의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 34에 기재된 아미노산 서열인 항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및 ScFv2-4도 수득된다
서열목록의 서열번호 34는, 항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및 ScFv2-4의 H쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 35는, 항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및 ScFv2-4의 H쇄의 염기서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 36 내지 39는, 항체 ScFv2-1, ScFv2-2, ScFv2-3, 및ScFv2-4의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
5. ScFv 개변에 대하여
(항체 라이브러리의 작제)
항체 라이브러리의 작제는 상기한 항체 라이브러리 작제의 경우와 동일한 수법을 이용하여 수행하였다.
우선, PCantab5ScFv3-1MycHis(PCantab5MycHis의 Sfi I site와 Not I site사이에 실시예에 나타난 ScFv1-1유전자가 삽입되어 있고 L쇄의 5' 끝에 Alw44 I, 3' 끝에 Not I의 사이트가 서열되어 있다)의 L쇄 부분을 HCV 항원에 반응성이 없는 L쇄에 교체한 벡터를 작제하였다. 이것을 Pcantab5ScFv3-1/L-/MycHis로 불린다.
정제한 mRNA 1㎍에서, RT-PCR 킷트 ver 2.1(TAKARA사)를 이용하고, 첨부자료에 따라 랜덤 프라이머를 이용하고 cDNA를 합성하였다. 다음으로 이 킷트의 첨부자료에 따라, 이 cDNA를 주형으로 하고, 항체의 L쇄(λ쇄, κ쇄)를 각각 PCR로 증폭하였다. 항체유전자 클로닝준비 프라이머는, 상기 논문의 기재에 따라 작제한 것을 이용하였다. PCR 산물은 1% 아가로우스겔로 전기영동을 수행하고, 항체의 H쇄, L쇄의 밴드를 절단하였다. 절단한 아가로우스겔로부터 QIAEX II Gel extraction kit QIAGEN사)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
다음으로 제한효소 Alw44 I과 50 ㎕의 시스템 M(10mM Tris-HCl, 50mM Nacl, 2mM MgCl2)으로 37℃에서 2시간 반응시켜 절단하고, 70℃ 10분의 열처리에 의해 효소를 불활성시켰다. 아울러 제한효소 Not I를 첨가하고 100㎕의 시스템 H(10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 2mM MgCl2)로 37℃ 2시간 반응시켜 절단하고, 70℃ 10분의 열처리에 의해 효소를 불활성시켰다. DNA를 페놀클로로포름 추출과 에탄올 침전을 순차수행하고 정제하며 50㎕의 멸균수로 용해하였다. 이 DNA 단편 100ng와, 동일하게 Alw44 I와 Not I에서 처리한 50ng의 pCantab5ScFv3-1/L-/MycHis를 TAKARA사의 리가아제 킷트를 이용하여 설명서에 따라 결합시켰다. 결찰견본을 페놀클로로포름 추출과 에탄올 침전에서 순차정제하고 10㎕의 멸균수에 용해하였다. 이 반량을 이용하여 [Molecular Cloning(1982) p249, Cold Spring Harbor Labs.]에 따라 형질전화하였다. 이렇게 하여 1 ×106의 콜로니를 수득하였다. 이것을 단쇄항체 라이브러리로서 하기에서 이용하였다.
(라이브러리 파지의 스크리닝)
파지의 제작, 스크리닝 조작은 모든 상기와 동일한 조작에 의해 수행하였다. 그 결과, 서열목록의 서열번호 42 내지 65에 기재된 아미노산 서열을 가지는 항체 ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4이 수득되었다.
서열목록의 서열번호 42 내지 44는, ScFv3-1의 L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 45 내지 47은, ScFv3-2의 L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 48 내지 50은, ScFv3-3의 L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 51 내지 53은, ScFv3-4의 L쇄의 CDR-1, CDR-2, 및 CDR-3의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 54 내지 57은 각각 항체 ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4의 L쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 58 내지 61은 각각 항체 ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4의 L쇄의 염기서열을 나타낸다.
서열목록의 서열번호 62 내지 65은 각각 항체 ScFv3-1, ScFv3-2, ScFv3-3, 및 ScFv3-4의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
6. 스크리닝한 파지로부터의 ScFv의 조제
100ml의 2 ×TY 액체배지(100㎍/L 앰피실린과 2% 글루코스를 포함한다)에 후보 콜로니를 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 하룻 밤 배양하였다. 다음 날, 900ml의 2 ×TY 액체배지(100㎍/L 앰피실린과 0.1% 글루코스를 포함한다)에 상기 배양액을 첨가하고, 1시간 30℃, 200rpm으로 배양하였다. 1ml의 1M IPTC(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)를 첨가하고 아울러, 동일조건으로 5시간 배양하였다. 배양액을 8000rpm에서 10분간 원심분리하고, 균을 침전시켰다. 상층액을 폐기하고, 50ml의 50mM Tris-HCI(pH 8), 20% Sucrose, 1mM EDTA 용액에서 침전을 현탁시킨 다음, 빙상에서 15분간 방치하였다. 이어서 10000rpm으로 15분간 현탁액을 원심분리하고, 상층액을 회수하고, MgCl2를 1mM이 되도록 첨가하였다.
7. ScFv의 정제
상기 대장균으로 부터 취득한 ScFv는 Ni-NTA agarose(QIAGEN사로부터 구입)을 이용하여 설명서에 따라 정제하였다. 1mL의 Ni-NTA agarose를 30ml의 A용액(50mM Na-phosphate, 300mM NaCl, pH 7.4)를 첨가하고 세정하여 교반 후 1000rpm으로 2시간 원심분리하고, 상층액을 페기하였다. 이 Ni-NTA agarose를 결합시켰다. 그 다음 1000rpm으로 2시간 원심분리하고, 상층액을 폐기하였다. 30ml의 A용액을 첨가하고 Ni-NTA agarose를 세정하고, 1000rpm에서 2시간 원심분리하고, 상층액을 폐기하였다. 아울러 B용액(A용액 + 10mM Imidazole) 30ml에서 동일한 조작으로 세정하였다. 다음으로 B용액 10ml로 현탁하고, poly-prep 컬럼 (Bio-Red사)에 첨가하였다.
아울러 10ml의 B용액을 첨가하고 Ni-NTA agarose를 세정하였다. 완전히 세정액이 컬럼에서 없어진 후에, 2ml의 C용액(A용액 + 250mM Imidazole)로 Ni-NTA agarose에 결합한 ScFv를 용출하였다. 다음으로, 25ml의 PBS(10mM phosphate pH 7.4, 150mM NaCl)로 세정한 PD10 컬럼(안마샘파마시아사)에 용출액을 첨가하고, PBS 용액으로 용출하고, 완충제를 교환하였다. 각 용출회분의 280nm의 흡광도를 측정하고, ScFv 용출회분을 하나로 하여 다음의 실험에 이용하였다.
8. ScFv의 E2 결합능의 확인
50mM NaHCO3(pH 9.6)용액에 용해하였다. 1㎍/ml의 E2 표지자 1ml을 FALCON의 96well plate에 50㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 이 때 블랑크의 well로서 동일한 수의 E2 표지자를 첨가하지 않고 완충제만을 첨가한 것도 준비하였다. 각 well의 용액을 경사법으로 폐기한 후 0.1%의 Tween 20을 첨가한 PBS를 각 well에 200의 용액을 경사법으로 폐기하는 조작을 5회 반복하였다. 각 well의 수분을 절단 한 다음, 5% BSA를 포함하는 PBS 용액을 각 well에 200㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 각 well의 용액을 경사법으로 페기 후, 0.1%의 Tween 20을 첨가한 PBS를 각 well에 200㎕ 첨가하고 경사법으로 폐기하는 조작을 5회 반복하였다. E2 표지자를 첨가한 well과 첨가하지 않는 well 각각에 취득한 ScFv를 10㎍/ml이하의 농도가 되도록 1%의 BSA를 포함하는 PBS로 희석하고 각 well에 50㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 각 well의 용액을 경사법으로 페기한 후 0.1%의 Tween 20을 첨가한 PBS를 각 well에 200㎕ 첨가한 경사법으로 폐기하는 조작을 5회 반복하였다. 각 well의 수분을 절단한 다음, 항 myc-표지자항체(산타클루즈 바이오테크놀로지사로부터 구입)을 최최종 농도가 10㎍/ml이 되도록 1%의 BSA를 포함하는 PBS로 희석하고, 각 well에 50㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 배양하였다. 각 well의 용액을 경사법으로 폐기 후 0.1%의 Tween 20을 첨가한 PBS를 각 well에 200㎕ 첨가하는 경사법으로 폐기하는 조작을 5회 반복하였다. HRP 표식 항 마우스 Igs를 최종 농도가 1㎍/ml가 되도록 1% BSA를 포함하는 PBS로 희석하고, 각well에 50㎕씩 첨가하고 실온에서 1시간 배양하였다. 각 well의 용액을 경사법으로 페기 후 0.1%의 Tween 20을 첨가한 PBS를 각 well에 200㎕을 첨가하고 경사법으로 폐기하는 조작을 5회 반복하였다. OPD 완충제 25ml에 올트페닐렌디아민 10mg, 30% 과산화수소수 12.5㎕을 첨가하는 용액을 각 well에 100㎕씩 첨가하고 충분히 발색하기까지 실온에서 배양하고 4N 황산을 100㎕ 첨가하고 반응을 정지하고 490nm에 있어서 흡광도를 측정하는 것에 의해 ScFv가 E2 표지자에 결합하고 있는가를 확인하였다.
9. 항체발현 벡터 구축
PCR법에 의해 pRC/CMV(In vitrogen사로부터 구입)의 CMV 프로모터를 포함하는 영역, 멀티클로닝사이트, poly A시그널 서열 영역(참조: 동일 회사 유전자 맵 209-1250)을 포함하는 염기영역을 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은 5'측은 5'CCC TGA TCA GAA TTC GCA GGA TCC CTC GAG ACT AGT GAT GAT CGG GCC AGA TAT ACG GG 3'(서열번호 66), 3'측은 5'CCC TGA TCA AGA TCT GCT AGC GTC GAC TCC CCA GCA TGC CTG CTG CTA TTG 3'(서열번호 67)이며, Applied Biosystems Model 394를 이용하여 합성한 후, 당업계에서 통상적인 방법으로 조제하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler을 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방사로 부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 후, 소망의 약 1.0Kbp DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하여 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편약 1㎍을 1유니트의 Bc1 I 이용하고 50 ㎕의 시스템 H로 37℃ 2시간 반응시켜 절단한다. 다른 ppUC110(옥주조사로부터 구입)DNA 1㎍을 1유니트의 BamHI를 이용하여 50㎕의 시스템 H에서 37℃ 2시간 반응시켜 절단한다. 절단한 DNA 단편과 절단한 플라스미드를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하여 연결하고, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pKS1을 수득하였다.
상기에서 수득한 pKS1(1㎍)을 SpeI 1유니트를 이용하고 50 마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응 시켜 절단한다.
pcDNA 3.1/Hygro(+)(Invitrogen사로부터 구입)을 이용하고, PCR에 의해 loxP-Hygromicin 융합유전자를 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은 5'측은 hyg-stop: ccccagatctctattcctttgccctcggacgag(서열번호 68) 3'측은 Hy-atg: ccccaagcttatgaaaaagcctgaactcaccgcg 3'(서열번호 69)이며, 싸이미디어사에 합성을 의뢰하고 구입하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방사로부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 후, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편 약 1㎍을 1유니트의 NheI 및 NaeI를 이용하여 50㎕의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
pNeo·gal(Stratagene사로부터 구입)을 이용하고, PCR에 의해 TK(A)n을 포함하는 DNA를 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은, 5'측은cccgccggctgggtgtggcggaccgc3'(서열번호 70), 3'측은 5'cccctctagaaagtataggaacttcaagc 3'(서열번호 71)이며, Applied Biosystems Model 394를 이용하고 합성한 후, 당업계에서 통상적인 방법으로 조제하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler을 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방사로부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 후, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편 약 1㎍을 1유니트의 XbaI 및 NaeI을 이용하고 50 ㎕의 시스템 M에서 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드와 절단한 loxP-hygromycinDNA 단편과 Tk(A)nDNA 단편과를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 연결하며, 대장균 JM 109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX loxP-Hyg를 수득하였다.
pEX1-3-1W(참조: 특허출원 2000-172684)를 이용하고, PCR에 의해 H쇄정상역을 포함하는 DNA 단편을 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은, 5'측은 5'ccccaagcttctcgagactagtaccaagggcccatcggtcttccc3'(서열번호 72), 3'측은 5'ccccgggccctctagtagctttcatttacccggagacaggg3'(서열번호 73)이며, 싸이미디어사에 합성을 의뢰하고 구입하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler을 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방사로부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 후, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편 약 1㎍을 1유니트의 HindIII 및 Apal을 이용하여 50 ㎕의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단하였다.
pEX loxP-Hyg DNA 1㎍을 HindIII, ApaI 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드와 절단한 H쇄정상역을 포함하는 DNA 단편과를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 결합하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX gammal lox-P Hyg를 수득하였다.
ScFv-1-를 이용하고 PCR에 의해 H쇄가변역을 포함하는 DNA 단편을 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은, HB1-N5' cccaagcttcaccATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCtggtgcagtctg3'(서열번호 74), HB1-C5'cccgctagcACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC3'(서열번호 75)이며, 싸이미디어사에 합성을 의뢰하고 구입하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방사로부터 구입, 반응조건의 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 후, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor 기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편 약 1㎍을 1유니트의 HindIII 및 Apal을 이용하여 50 ㎕의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단하였다.
pEX gammal loxP-Hyg DNA 1㎍을 HindIII, SpeI 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드와 절단한 H쇄정상역을 포함하는 DNA 단편과를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX gammal lox-P Hyg를 수득하였다.(도 7)
pEGFPN2(클론테크사로부터 구입)을 이용하고, PCR에 의해 가나마이신내성유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은, H쇄 5'측은 5'ccccagagctagtcctgcaggcggggaaatgtgcgcggaacccct3'(서열번호 76), 3'측은 5'ccccgctagcctgcaagtcatttcgaaccccagcgtccc3'(서열번호 77)이며, 싸이미디어사에 합성을 의뢰하고 구입하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler을 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방사로부터 구입, 반응조건의 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 후, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편 약 1㎍을 1유니트의 SpeI 및 NheI을 이용하여 50 ㎕의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단하였다.
pKS1 DNA 1㎍을 NheI 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드와 절단한 가나마이신 내성유전자를 포함하는 DNA 단편과를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX-1 Km, Amp를 수득하였다.
pEX-1 Km, Amp 1 DNA 1㎍을 DraI, ScaI 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 H으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX-1 Km을 수득하였다.
pCZOk(참조: T, Shibui 등 Appl Microbiol Biotechnol(1993) 38, 770-775 기재)를 이용하고, PCR에 의해 결쇄정상역을 포함하는 DNA 단편을 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은, H쇄 5'측은 5'ccccaagcttctagagtcgacggtaccgtggaaatcaaacgaactgtgg3'(서열번호 78), 3'측은 5'ccccgggccctctagcggccgcctaacactctcccctgttgaagc3'(서열번호 79)이며, 싸이미디어사에 합성을 의뢰하고 구입하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방상로부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 다음, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편약 1 ㎍을 1 유니트의 HindIII 및 Apal을 이용하고 50 ㎕의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
pEX-1 Km 1 DNA 1㎍을 , HindIII, Apal 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드와 절단한 L쇄정상역을 포함하는 DNA 단편과를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEXkappa Km을 수득하였다.
ScFv1-1을 이용하고, PCR에 의해 L쇄가변역을 포함하는 DNA 단편을 증폭한다. 사용한 프라이머의 서열은, LK1-N 5'cccaagcttcaccATGGCGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGgacatccagatgacccagtctcc3'(서열번호 80), LK1-C 5'CcccgtacgTTTGATTTCCACCTTGGTCCCCCCG3'(서열번호 81)이며, 싸이미디어사에 합성을 의뢰하고 구입하였다. PCR 반응은, Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler를 이용하고, 폴리머라제에 KOD(동양방상로부터 구입, 반응조건은 설명서에 따랐다)를 이용하여 수행하였다. 그 다음, 소망의 DNA 단편은, 5% 아크릴아미드 전기영동법을 이용하고 Molecular Cloning 섹션 6.46-6.48, Cold Spring Harvor기재의 방법에 의해 정제하였다. 정제 DNA 단편 약 1 ㎍을 1 유니트의 HindIII 및 BsiWI을 이용하고 50 ㎕의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시킨 후, 50℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
pEX Kappa Km DNA 1㎍을 , HindIII 및 Asp187 I 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드와 절단한 H쇄정상역을 포함하는 DNA 단편과를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하고 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX kappa Km HCVI를 수득하였다.(도 8)
pEX Kappa Km HCV 1 DNA 1 ㎍을 SpeI, NheI 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
pEX gammal loxP-Hyg HCVI DNA 1 ㎍을 NheI 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
상기 절단한 플라스미드와 절단한 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하여 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX loxP-Hyg HCV1 W Km을 수득하였다.
pEX loxP-Hyg HCV 1 W Km 1 DNA 1 ㎍을 Sse8387 1유니트를 이용하고 50마이크로의 시스템 M으로 37℃, 2시간 반응시켜 절단한다.
절단한 플라스미드를 리가아제 킷트(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 이용하여 연결하며, 대장균 JM109주(옥주조로부터 구입, 반응은 설명서에 따라 수행하였다)를 형질전환하고, 소망의 발현 플라스미드 pEX loxP-Hyg HCV1 W을 수득하였다.(도 9)
10. 고발현부위 검색주로의 항체유전자의 부위특이적도입
MKamp 1주(참조: 특허출원 2000-172684 기재의 주)를 이용하여 설명서에 따라 pBS185(부위특이적 재조합 효소발현 플라스미드, Lifetech사로부터 구입), pEX loxp-Hyg HCV 1 W를 트랜스펙트하였다.(각각 200만개의 세포에 대하여 1.0 ㎍의 DNA를 이용하였다). 5% FBS(소태아혈청: lifetech사로부터 구입)을 포함하는 CHO-S-SFM-II 지(Lifetech사로부터 구입)으로 37℃, 5% CO2조건하에서, 48시간 배양 후, 200mg/l의 하이그로마이신(SIGMA사로부터 구입)을 첨가한 동일배지로 부터 37℃, 5% CO2조건하에서 25일간 선택배양하고, 하이크로마이신 내성 콜로니를 선택하였다(Mkamp HCV 1주).
11. ELISA 분석을 이용한 항체생산량의 측정
항 사람 면역 글로블린 염소항체(Zymed사로부터 구입) 용액 (용액 1에서 10㎕/ml로 희석)을 50㎕/well로 96well플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 처리하였다. 이어서, well의 용액을 버리고, 각well에 250㎕의 용액 2를 첨가하여 4℃에서 16시간이상 보온하였다. 용액제거 후, 용액 3에서 well을 5회씩 세정하고, 용액 4에서 희석한 항체(스탠다드) 또는 시료용액(배양상층액을 용액 4에서 임의로 희석한 것)을 50㎕/well로 첨가하고, 37℃에서 2시간 보온하였다. 용액제거, 용액 3에서 5회 세정 후, 용액 5를 50㎕/well로 첨가하고, 20℃에서 40분간 보온하였다. 액을 제거, PBS로 5회 세정한 다음, 용액 9를 100㎕/well로 가하여 실온에서 차광하여 약 5분간 반응시켰다. 등량의 10%황산을 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 이무노리더(Inter Med사 제품, Immuno Reader NJ-2000)을 이용하여 각 well의 11=490nm 및 12=650nm에 있어서 흡광도 A1 및 A2를 측정하고, (A1-A2)을 구하였다. 희석표준 용액을 이용하여 검량선을 작제하고, 견본에서 1-3-1 항체(스탠다드로서 이용하였다)의 농도를 측정하였다.
각 용액의 조성은 다음과 같다.
용액 1: 0.1% Sodium Azide를 포함하는 PBS
용액 2: 1% BSA, 0.1% Sodium Azide를 포함하는 PBS
용액 3: 0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS
용액 4: 1% BSA를 포함하는 PBS
용액 5: HRP 표지 항 사람 면역 글로블린 염소 항체(Zymed사로부터 구입)원액 2㎕을 10ml의 용액 4에 용해한 것(사용시조제)
용액 6: 인산-수소나트륨 14.2g를 취하고, 물을 가하여 500ml으로 한다
용액 7: 구연산 1수화물 10.5g를 취하고, 물을 가하여 500ml으로 한다
용액 8: 용액 5 257ml에 용액 6을 243ml 가하고 물을 가하여 1000ml로 한다
용액 9: 0-페니렌디아민(화광순약로부터 구입) 4.0mg를 취하고, 용액 7을 10ml 및 30% (v/v)과산화수소 용액 5 ㎕을 가하여 용해한다(조제후 10분이내에 이용하였다)
12. MKamp주에 항체발현 유전자를 부위특이적으로 도입한 주의 항체생산성
상기 ELISA법에 의해 이하의 생산량이 인정되었다.
| 신주명 | 항체유전자 도입주 | ||
| 형광 | 하이그로마이신내성 | 항체생산성 | |
| MKamp 1 | 없음 | 내성 | 10mg/1 |
13. 재조합 전체항체의 성격첨부
단쇄항체의 항원에 대한 친화성, 중화활성을 측정하였을 때와 동일한 방법으로 취득정제한 재조합 전체항체에 대한 값을 측정한다.
Kd=2 ×10-9중화활성 IC50= 25mg/1
수득된 재조합 전체항체를 전체항체 1-1이라고 칭하고, 그 H쇄와 L쇄의 아미노산 서열 및 염기서열을 각각 서열목록의 서열번호 40 및 41에 기재한다.
14. 세포융합 분석
세포융합 분석은 Takikawa 등, 방법에 따라 수행하였다(참조: Takikawa et al., J. Virol., 74, 5066-5074, 2000). 재조합 E1 및 E2 단백질을 세포표면에 발현하는 CHO 세포(참조: Matsuura et al., unpublished)를 콜라겐 암호화한 96 well plate의 각 well에 2만개씩 접종하고 5% CO2존재하에서 37℃로 배양힌다. 세포를 준비할 경우에는, 트립신을 사용하지 않으며 10mM EDTA 첨가인산 완충식염수(PBS)에 5분간 가라앉힌 다음, 될 수 있는 한 세포가 분산하도록 플라스크를 진탕하고, 천천히 피페팅그하면서 분리한다. 24시간 배양한 다음, 세포를 200㎕의 Opti-MEM(Gibco BRL)로 2회 세정하고, T7 프로모터의 하류에 반디불의 루시페라제 유전자를 삽입한 리포터 플라스미드 pT7EMCLuc(참조: Aoki et al., Virology, 250,140-150, 1998)과 유전자도입효율의 표준화를 위하여 CMV 프로모터의 하류에 씨팬지의 루시페라제 유전자를 삽입한 pRL-CMV(Promega)를 Trans IT-LTI(Mirus)를 이용하여 세포에 도입한다. 1plate당 이하의 조성으로 준비하고, 15분간 정치한 후, 1 well당 30㎕씩 첨가한다. 2시간 후 10% 혈청첨가 D-MEM(Gibco)를 150㎕씩 첨가하고 배양을 계속한다.
Opti-MEM 3ml
Trans IT-LT 1 50㎕
pT7EMCLuc 9㎍
pRL-CMV 0.6㎍
세포융합 반응의 수용세포로서는, 사람 간세포암 유래의 HepG2 세포를 이용한다. HepG2 세포를 6 well plate의 각 well에 8.0 ×105개씩 접종하고, 5% CO2존재하에서 37℃로 배양한다. 24시간 배양 후에, T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 플라스미드 pCAGT7pol(참조: Ishii et al., unpublished)를 각 well당, 이하의 조성으로 세포에 도입하고, 2시간 후에 10% 혈청첨가 D-MEM를 0.5ml 첨가한다. 24 내지 36시간 배양 후, 세포를 트립신으로 분리하고, 25 내지 30ml의 10% 혈청첨가 D-MEM에 부유한 후, 50ml의 원심관으로 이동하고, 5% CO2존재하에서 37℃로, 진탕기에서 하룻 밤 부유배양한다.
Opti-MEM 100㎕
Trans IT-LT1 5㎕
pCAGT7p01 1㎍
96 well plate에 준비한 리포터 플라스미드를 도입한 HCV 외피 단백을 발현하는 CHO 세포(트랜스펙트 48시간 후)에서, T7RNA 폴리메타제를 발현하는 플라스미드를 도입하여 하룻 밤 부유배양하였다. HepG2 세포를, 2 ×104/100㎕씩 각 well에 첨가한다. 5시간 배양 후, 배양액을 버리고, 100㎕의 pH 5.0의 PBS에 2분간 가라앉힌 다음, 바로 그 액을 버리고, 10% 혈청첨가 D-MEM을 200㎕씩 각 well에 첨가하여 배양을 계속한다. 배양 5시간 후에 세포를 dual-luciferaze reporter assay system(Promega)를 이용하고, 첨부 프로토콜에 따라 루시페라제 활성을 측정하고, 세포융합 활성을 평가하였다.
15. 세포융합저지 분석
항체에 의한 세포융합저지 활성을 조사하는 경우는, 상기의 세포융합저 분석과 기본적으로는 동일하나, CHO 세포에 HepG2 세포를 첨가하기 전에, Opti-MEM에서 HepG2 세포를 2회 세정한 후, Opti-MEM으로 단계희석한 피험항체(전체 항체1-1)과 60분 반응시킨 다음 공배양을 수행하였다. 다음으로 동일하게 루시페라제 활성을 측정하고, 세포융합 저지활성을 평가하였다. 그 결과, NOB 활성을 나타낸 단쇄항체를 기초로 작제한 완전항체 중에서, HCV의 외피 단백질에 의한 세포융합을 특이적으로 저지활하는 것이 인정되었다.
16. BIACORE X에 의한 결합상수의 측정
BIACORE X에 의한 취득 ScFv의 결합상수의 측정은 첨부설명서에 따라 수행하였다.
E2 표지자를 센트리콘 30을 이용하여 10mM 초산 완충제(pH= 5.0)로 치환하였다. 이 E2 표지자(100㎍/ml, 20㎕)을 센서팁 CM5(비어코어사로부터 구입)의 각각 다른 레인에 5㎕/min으로 주입함에 따라 아미노커플링법으로 고정화하고, E2 표지자 고정화 센서팁을 수득하였다. ScFv1-1을 센트리콘 30을 이용하여 HBS 완충제(10mM HEPES(pH 7.4), 0.15M NaCl, 3.4mM EDTA, 0.005% Tween 20)로 치환하였다. BIACORE X(비아코아사)를 이용하여 먼저 작제한 E2 표지자 센서팁에서, 이 ScFv1-1용액을 5㎕/min으로 주입하고 결합시의 센서그램을 수득하였다. 그 다음 HBS 완충제만을 5㎕/min으로 센서팁에 주입하고 해리시의 센서그램을 수득하였다. 이들의 센서그램의 해석에 의해 E2 표지자와 ScFv1-1의 결합상수 4.5 ×108(M), 해리상수 2.2 ×10-9(M)을 수득하였다.
17. E2 표지자와 헤파린의 결합확인
E2 표지자에 황산화다당류와 결합하는 개소가 있는 것을 확인하는 방법으로서 헤파린이 공유결합되고 있는 컬럼 Heparin-Sepharose CL-6B(파마시아사로부터 구입)에 E2 표지자가 결합하는 것을 확인하였다. Heparin-Sepharose CL-6B은 0.15M NaCL, 10mM 인산 완충제(pH 7.0)을 이용하여 평균화하였다.
50㎕의 시스템으로 PBS에 용해하고 있는 E2 표지자 2㎍와 고분자량 헤파린(SIGMA사로부터 구입)300㎍, 또는 Heparin(SIGMA사로부터 구입)300㎍을 혼합하고 37℃에서 1시간 교반하면서 배양하였다. 그 때 대조군으로서 E2 표지자만으로 배양하는 견본도 준비하였다. 10,000rpm에서 5분간 원심하여 상층액만을 다른 용기에 분주하였다. 100㎕의 0.15M NaCl, 10mM인산 완충제(pH 7.0)을 50㎕ 첨가하고 실온에서 5분 교반한 후, 원심분리하고 상층액을 다른 용기로 이동하였다. 견본 완충제를 50㎕ 첨가하고 100℃에서 5분 배양한 다음 원심분리하고 상층액을 다른 용기로 이동하였다.
다른 용기에 이동한 용출 견본을 10% 폴리아크릴아미드겔 전기영동하고, E2 표지자 발현주 구축하였을 때와 동일한 방법으로 웨스턴블로팅을 수행하고 어느 용출 각 분에 E2 표지자가 존재하는가를 확인한 결과, E2 표지자만을 Heparin-Sepharose CL-6B와 혼합하였을 시는 E2 표지자가 모든 컬럼에 결합하고 있는 것을 알 수 있으며, Heparin-Sepharose CL-6B와 혼합하기 전에 고분자량 헤파린 또는 헤파린과 배양하였을 시는 E2 표지자의 컬럼으로의 결합이 저해되는 것이 확인되었다. 이 결과는 E2 표지자 및 E2에 헤파린과 강하게 결합하는 개소가 있다는 것을 나타내고 있다.
본 발명에 의하면, HCV의 감염저지작용 등의 항바이러스효과를 가지는 신규한 의약품이 제공가능하다.
Claims (74)
- C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질.
- 제 1항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질의 양전하를 가지는 영역에 결합함에 따라, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 전기 E2/NS1 단백질을 인식가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 형광법 또는 발색법에 의해 전기 E2/NS1 단백질을 검출가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 표지자(표지자)를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 5항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질의 C말단에 표지자를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,CD81을 발현하는 세포가, 사람 CD81을 발현하는 세포인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,CD81은 가용화 발현되는 사람 CD81인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과의 결합상수가 108이상이거나 해리상수가 10-8이하인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 9항에 있어서,결합상수가 109이상이거나 또는 해리상수가 10-9이하인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,물질이 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 11항에 있어서,단백질이 항체인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 12항에 있어서,항체가 C형간염 치유환자의 B세포 유래인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 13항에 있어서,항체가 C형간염 치유환자의 B세포의 유전자 유래인 것을 특징으로 하는 물질.
- 제 13항 또는 14에 있어서,C형간염 치유환자가 자연치유환자이며, B세포가 말초혈 단핵구세포인 것을 특징으로 하는 물질.
- H쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 1, 2 및 3에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 16항에 있어서,서열목록의 서열번호: 16 또는 34에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 16 또는 34에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 4, 5 및 6에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 18항에 있어서,서열목록의 서열번호: 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 17에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 7, 8 및 9에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 20항에 있어서,서열목록의 서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 10, 11 및 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 10, 11 및 12에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 22항에 있어서,서열목록의 서열번호: 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 19에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 13, 14및 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 13, 14 및 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 24항에 있어서,서열목록의 서열번호: 20에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 20에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 42,43 및 44에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 42, 43 및 44에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 26항에 있어서,서열목록의 서열번호: 54에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 54에 기재된 아미노산에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 28항에 있어서,서열목록의 서열번호: 55에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 55에 기재된 아미노산에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 30항에 있어서,서열목록의 서열번호: 56에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 56에 기재된 아미노산에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- L쇄의 가변영역의 CDR-1, CDR-2 및 CDR-3이 각각 서열목록의 서열번호: 51, 52 및 53에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 51, 52 및 53에 기재된 아미노산 열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 제 32항에 있어서,서열목록의 서열번호: 57에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호:57에 기재된 아미노산에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
- H쇄의 아미노산 서열로서, 서열목록의 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 40에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- L쇄의 아미노산 서열로서, 서열목록의 서열번호: 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 41에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 항체.
- 서열목록의 서열번호: 26, 27, 28 또는 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 26, 27, 28 또는 29에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 단쇄항체.
- 서열목록의 서열번호: 36, 37, 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 36, 37, 38 또는 39에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하며, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 단쇄항체.
- 서열목록의 서열번호: 62, 63, 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호: 62, 63, 64 또는 65에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 다수의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 단쇄항체.
- 제 16항 내지 38항의 어느 한 항에 기재된 항체를 암호화하는 핵산.
- 제 39항에 있어서,서열목록의 서열번호: 21, 22, 23, 24, 25, 35, 58, 59, 60, 61의 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 핵산.
- 제 39항에 있어서,서열목록의 서열번호: 40 또는 41에 기재된 염기서열을 함유하는 핵산.
- 제 39항에 있어서,서열번호: 26, 27, 28 또는 29의 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 핵산.
- 제 39항에 있어서,서열목록의 서열번호: 36, 37, 38, 39의 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 핵산.
- 제 39항에 있어서,서열목록의 서열번호: 62, 63, 64, 65의 어느 것에 기재된 염기서열을 함유하는 핵산.
- 제 39항 내지 제 44항의 어느 한 항에 기재된 핵산을 이용한 항체의 생산방법.
- 제 45항의 방법에 의해 수득할 수 있으며, C형간염 바이러스의 ES/NS1 단백질에 대하여 친화성을 가지는 재조합 항체.
- 제 46항에 있어서,항체의 Fc영역이 사람형인 재조합 항체.
- 제 46항 또는 제 47항의 어느 한 항에 있어서,항체가 단쇄항체인 재조합 항체.
- 제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항에 기재된 물질을 유효성분으로서 함유하는 의약.
- 제 16항 내지 제 38항의 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약.
- 제 46항 내지 제 48항의 어느 한 항에 기재된 재조합 항체를 유효성분으로서 함유하는 의약.
- 제 49항 내지 제 51항의 어느 한 항에 있어서,C형간염의 치료 및/또는 예방을 위한 의약.
- 제 49항 내지 제 51항의 어느 한 항에 있어서,C형간염의 진단을 위한 의약.
- 제 1항 내지 제 15항의 어느 한 항에 기재된 물질을 유효성분으로서 함유하는 항HCV제.
- 제 16항 내지 제 38항의 어느 한 항에 기재된 항체를 유효성분으로서 함유하는 항HCV제.
- 제 46항 내지 제 48항의 어느 한 항에 기재된 재조합 항체를 유효성분으로서 함유하는 항HCV제.
- C형간염 치유환자의 B세포를 자극하고, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 대한 항체의 mRNA를 발현시켜 전기 B세포로부터 항체 mRNA 및 항체 cDNA를 취득하고, 전기 E2/NS1에 결합하는 항체의 가변영역의 서열을 취득하는 방법.
- 제 57항에 있어서,C형간염 치유환자가 자연 치유환자이며, B세포가 말초혈 단핵구세포인 것을 특징으로 하는 항체의 가변영역의 서열을 취득하는 방법.
- 제 57항 또는 제 58에 기재된 방법으로 취득되는 가변영역의 서열을 가지는 항체.
- 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 간염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81을 접촉시키는 단계; 및 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서의 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 간염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 비교하는 단계를 포함하는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과, C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질의 스크리닝 방법.
- 제 60항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 전기 E2/NS1 단백질을 인식가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 60항 또는 제 61항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 형광법 또는 발색법에 의해 전기 E2/NS1 단백질을 검출가능한 물질을 첨가한 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 60항 내지 제 62항의 어느 한 항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질에 표지자를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 63항에 있어서,C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질이 C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질의 C말단에 표지자를 붙인 단백질인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 60항 내지 제 63항의 어느 한 항에 있어서,CD81을 발현하는 세포가 사람 CD81을 발현하는 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 60항 내지 제 63항의 어느 한 항에 있어서,CD81이 가용화 발현되는 사람 CD81인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 60항 내지 제 66항의 어느 한 항에 있어서,피험물질이 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
- 제 60항 내지 제 67항의 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 수득되는, C형간염 바이러스의 E2/NS1 단백질과 C형간염 바이러스의 감염성이 있는 세포, CD81을 발현하는 세포 또는 CD81과의 결합을 저해하는 물질.
- 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 결합을 측정하며, 피험물질의 비존재하의 결합과 비교하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법에서 수득되는 C형간염 바이러스의 생활주기을 저해하는 물질.
- 피험물질의 존재하 및 비존재하에 있어서, HCV에 감염성이 있는 세포와 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포가 결합한 다음, 피험물질과 HCV에 감염성이 있는 세포 또는 HCV 단백질을 발현하고 있는 세포와의 융합을 측정하며, 피험물질의 비존재하의 융합과 비교하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법에서 수득되는 C형간염 바이러스의 생활주기을 저해하는 물질.
- 제 69항 내지 제 70항에 있어서,피험물질이 단백질, 황산화다당류 또는 저분자화합물인 C형간염 바이러스의 생활주기을 저해하는 물질.
- 제 68항 내지 제 71항의 어느 한 항에 기재된 물질을 유효성분으로서 포함하는, 항HCV제.
- 제 68항 내지 제 71항의 어느 한 항에 기재된 물질을 이용하여, 항HCV제를 제제화하는 것을 포함하는 항HCV제의 제조방법.
- 제 73항에 있어서,제 68항 내지 제 71항의 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법을 이용하여 C형간염 바이러스의 증식을 저해하는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 항HCV제의 제조방법.
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