JP4221292B2 - C型肝炎治療薬 - Google Patents
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Description
本発明は、C型肝炎ウィルス(以下「HCV」ということもある)のエンベロープ糖蛋白に結合する抗体、並びに該抗体と該糖蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法に関する。より詳細には、本発明は、HCVのエンベロープ糖蛋白と結合することによりHCVの感染阻止作用などの抗ウィルス効果を有する抗体、並びに該抗体のスクリーニング方法に関する。
背景技術
1989年米国カイロン社によって、従来非A非B型肝炎ウィルスと呼ばれていたヒト肝炎ウィルスの遺伝子断片がクローニングされ、HCVと命名された(SCIENCE,Vol.244,359−362,1989)。HCVは一本鎖+鎖RNAをゲノムとするウィルスである。その後カイロン社の他、国立癌センターの下遠野ら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.87,9524−9528,1990)、大阪大・微研の高見沢ら(J.Virol,Vol.65,No.3,1105−1113,1990)によって、C型肝炎ウィルスの全遺伝子の配列が発表されている。その後HCVにはコア、エンベロープ1(以下「E1」または「E1蛋白」ということもある)、エンベロープ2(以下「E2/NS1」または「E2/NS1蛋白」ということもある)の3種類の構造蛋白質と6種類の非構造蛋白質が存在することが分かった。
HCVが発症すると高い確率で急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変を発症させ、最終的には肝癌へと移行し患者を死亡させる。従来は治療には抗ウィルス薬であるインターフェロンが代表的に使われているが、治療効果は患者ごとにばらつきがある点、発熱等の副作用がある点が問題となっている(J.Med.Virol.,Vol.42,299−305,1994)(日消会誌,Vol.91,995−1002,1994)。
またリバビリン等、他の抗ウィルス薬による治療も検討されているがこれも十分な効果は得られておらず(Lancet,Vol.337,1058−1061,1991)、新たな抗HCV薬の開発が待たれているのが現状であった。
一方、HCVの遺伝子は非常に変異がしやすいと考えられていて、HCVはその高変異性ゆえに患者の体内の免疫から逃れているものと考えられていた。特にHCVのE2/NS1のN末端には25個から30個のアミノ酸からなるhyper variable region(超可変領域)と呼ばれる変異に富む領域があるとされており、ヒトの免疫系のエピトープはhyper variable regionなのではないかと加藤らにより予測されている(J.Virol.,Vol.67,No.7,3923−3930,1993)(J.Virol.,Vol.68,No.8,4776−4784,1994)。すなわち、ヒトの免疫系、例えば中和抗体の認識する領域はhyper variable region内にあるので中和抗体が感染患者生体内でできてもhyper variable regionがすぐに変異してウィルスが抗体からエスケープしてしまうのではないかと考えられている。しかし、石井らの報告でE2/NS1とヒトT細胞Molt−4の結合を阻害する抗体が、HCVから自然治癒した患者の血中にのみ高活性で見られ、HCVの高変異性にも関わらずHCVの治癒に液性免疫が関与していることが示唆された(Hepatology,Vol.28,No.4,1117−1120,1998)。
ところで、1999年米国カイロン社によりE2/NS1が結合する細胞表面の蛋白としてCD81が単離された(SCIENCE,Vol.282,938−941,1999)。大腸菌で発現したCD81とE2/NS1は石井らの報告と同様に結合し、またHCV自然治癒患者の血清はこの結合を阻害した。この結果よりCD81はHCVのレセプターであることが示唆された。
以上よりHCVの細胞への感染に深く関与していると思われるエンベロープ蛋白に結合し、かつ、HCVの感染性のあるヒト細胞への結合を阻止する、例えば、抗体のような物質を薬剤として利用すると、血中のHCVが新たに肝臓等の感染対象臓器に感染することを阻止することが可能となり、HCV患者を治癒へと導くことが可能であると考えられた。しかしながら、HCVに起因する疾患に対する感染阻止物質については、まだ十分な検討が行われていなかったのが現状であった。
発明の開示
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、HCVの細胞への感染に深く関与していると思われるエンベロープ蛋白に結合し、かつ、HCVの感染性のあるヒト細胞への結合を阻止することができる抗体、並びに当該抗体を用いた医薬を提供することを解決すべき課題とした。
HCVはRNAウィルスであるため非常に変異しやすいことが知られている。この変異によりHCVの構造蛋白、非構造蛋白ともに様々な箇所が変異をする。この変異のためHCVの感染を阻止する物質、例えばある特定の蛋白配列を認識する抗体等を開発することは困難であると考えられていた。しかし、本発明者らは、石井らの報告にある中和抗体は、治癒患者ごとに感染しているウィルスの配列が異なるにもかかわらず、ただ一種類のE2/NS1への結合を阻止しているという点に着目した。すなわち、抗原の特定の領域あるいは構造を認識する物質ならば、ウィルスの配列の多様性にも関わらず、E2/NS1とHCVの感染性のあるヒト細胞、CD81発現細胞またはCD81との結合を阻止し、感染阻止が可能であると考えた。
本発明では、C型肝炎患者の症状を改善する薬剤開発のため、E2/NS1とHCV感染性のある細胞、CD81発現細胞またはCD81の結合を阻害する物質の探索を重ねた結果、HCVのHCV感染性細胞への結合および感染阻止が期待される物質を取得することに成功した。さらに、取得した物質とE2/NS1との結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、HCVのHCV感染性細胞への結合および感染阻止が期待されるさらに異なる別の物質を取得できることを確認した。
即ち、本発明によれば、(1)被験物質の存在下および非存在下において、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と、下記の(a)、(b)又は(c)の何れかの抗体を接触させる工程;
(a)重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号:9に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体;
(b)軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号:1〜4又は75に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号:1〜4又は75に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体;
(c)配列表の配列番号34〜37、67〜70又は71〜74の何れかに記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号34〜37、67〜70又は71〜74の何れかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する一本鎖抗体;並びに、
(2)被験物質の存在下および非存在下におけるC型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と、上記抗体との結合を比較する工程を含む、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と上記抗体との結合を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、抗体は、該抗体を検出可能な物質で標識した抗体であり、さらに好ましくは、蛍光法または発色法により該抗体を検出することができる物質で標識した抗体である。好ましくは、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白は、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白にタグをつけた蛋白であり、さらに好ましくは、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白のC末端にタグをつけた蛋白である。本発明のスクリーニング方法で用いる被験物質は、好ましくは、蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物である。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のスクリーニング方法により得られる、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白とC型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体との結合を阻害する物質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体が提供される。
好ましくは、本発明の抗体は、重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号9に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含む。
本発明の別の側面によれば、上記の抗体をコードする核酸が提供される。
好ましくは、本発明の核酸は、配列表の配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8のいずれかに記載の塩基配列を含有する。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の核酸を用いた抗体の生産方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記の方法によって得ることができ、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する組換え抗体が提供される。
好ましくは、本発明の組み換え抗体のFc領域はヒト型である。好ましくは、本発明の組み換え抗体は、1本鎖抗体である。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を有効成分として含有する医薬、並びに、上記した本発明の組換え抗体を有効成分として含有する医薬が提供される。本発明の医薬は、C型肝炎の治療および/または予防のために使用でき、あるいはC型肝炎の診断のために使用できる。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を有効成分として含有する抗HCV剤、並びに、上記した本発明の組換え抗体を有効成分として含有する抗HCV剤が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下本発明に関して詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法は、(1)被験物質の存在下および非存在下において、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と、下記の(a)、(b)又は(c)の何れかの抗体を接触させる工程;
(a)重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号:9に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号:9に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体;
(b)軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号:1〜4又は75に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号:1〜4又は75に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体;
(c)配列表の配列番号34〜37、67〜70又は71〜74の何れかに記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号34〜37、67〜70又は71〜74の何れかに記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する一本鎖抗体;並びに、
(2)被験物質の存在下および非存在下におけるC型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と、上記抗体との結合を比較する工程を含むことを特徴とするものであり、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と上記抗体との結合を阻害する物質をスクリーニングするための方法である。
上記(a)、(b)又は(c)に記載の抗体は、国際出願番号PCT/JP01/00967(国際公開WO01/58459)に記載の抗体である。これらの抗体は何れもC型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有することを特徴とする。これらの抗体の重鎖のアミノ酸配列の一例である本出願の配列表の配列番号:9に記載のアミノ酸配列は、国際出願番号PCT/JP01/00967(国際公開WO01/58459)の配列表の配列番号40に記載のアミノ酸配列に対応し、これらの抗体の軽鎖のアミノ酸配列の一例である本出願の配列表の配列番号:75に記載のアミノ酸配列は、国際出願番号PCT/JP01/00967(国際公開WO01/58459)の配列表の配列番号41に記載のアミノ酸配列に対応する。
本出願の配列表の配列番号34〜37に記載の配列は、ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のアミノ酸配列と塩基配列を示し、国際出願番号PCT/JP01/00967(国際公開WO01/58459)の配列表の配列番号62〜65に対応する。
本出願の配列表の配列番号67〜70に記載の配列は、ScFv1−1、ScFv1−2、ScFv1−3、及びScFv1−4のアミノ酸配列と塩基配列を示し、国際出願番号PCT/JP01/00967(国際公開WO01/58459)の配列表の配列番号26〜29に対応する。
本出願の配列表の配列番号71〜74に記載の配列は、ScFv2−1、ScFv2−2、ScFv2−3、及びScFv2−4のアミノ酸配列と塩基配列を示し、国際出願番号PCT/JP01/00967(国際公開WO01/58459)の配列表の配列番号36〜39に対応する。
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、抗体は、該抗体を検出可能な物質で標識した抗体であり、さらに好ましくは、蛍光法または発色法により該抗体を検出することができる物質で標識した抗体である。具体的には、ビオチン、フルオレセイン、DIG、FITC、アルカリフォスファターゼまたはHRP等の、蛍光を発するか、その物質とある物質、例えば酵素の基質を混合した際に発色をする物質で標識した抗体を使用することができる。
本発明のスクリーニング方法では、好ましくは、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白は、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白にタグをつけた蛋白である。具体的には、HCVゲノム上の384番目から711番目までのアミノ酸からなる蛋白質のC末端に、それ自体公知であるEtag(ファルマシア社)、Histag、myctag、FLAGtag、HA tag、GST、IgG Fc領域等の5個以上のアミノ酸からなる、特異的抗体に認識されうる配列を付加した蛋白質を使用することができるが、これには限定されない。さらに言えば、先に論じたとおりHCVのE2/NS1のN末端にはhyper variable regionという免疫系のエピトープが存在すると考えられている。ゆえに、E2/NS1にタグを結合させて発現させる場合、C末端にタグを結合させたものを使用することが望ましい。またこのようにして得られた蛋白は、可溶性である。この可溶性のE2/NS1は384番目のアミノ酸から746番目のアミノ酸までの間のE2/NS1の膜外ドメインを発現させたものであれば特に制限なく使用可能である。タグのついた可溶化蛋白E2/NS1は、動物細胞、昆虫細胞、酵母等蛋白に糖鎖を付加することが可能な細胞に発現させることができる。
本発明のスクリーニング方法で用いる被験物質は、好ましくは、蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物である。
本発明で用いる被験物質としては、抗体のほか、抗体以外の蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物などを使用することができる。
抗体以外の蛋白質としては、ラクトフェリン等が挙げられる。硫酸化多糖類としては、例えば分子量が平均分子量5000Daから1000000Daの範囲のヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸1およびケラタン硫酸2等のいわゆるグリコサミノグリカン類およびデキストラン硫酸等のことを言うが、好ましくは5000Daから30000Da程度の大きさのヘパリンがよい。低分子化合物としては、suramin等であるが、HCVのE2/NS1とHCVの感染を阻止する物質であればこれに限らない。
この低分子化合物の結合部位はさまざまな箇所が考えられるが、上記ヘパリンが結合する箇所に結合する物質であるならば、硫酸基が付加している化合物が好ましい。
上記した本発明のスクリーニング方法により得られる、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白とC型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体との結合を阻害する物質も本発明の範囲内のものである。
さらに本発明によれば、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体、並びに、重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号9に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体が提供される。
本発明の抗体は、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体であり、好ましくは、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白と、C型肝炎ウイルスの感染性のある細胞(以下「HCV感染性細胞」ということもある)、CD81を発現する細胞(以下「CD81発現細胞」ということもある)またはCD81との結合を阻害する抗体である。
上述のような抗体を選び出し、それぞれの抗体がE2/NS1と、HCV感染性細胞、CD81発現細胞またはCD81との結合を阻害することが可能であるかを以下に示す。
前述のとおりHCVのエンベロープ蛋白にはE1とE2/NS1がある。そのうちE2/NS1のhyper variable regionと呼ばれる変異に富む領域がヒトの免疫系のエピトープではないかと予測されている。すなわち、ウィルスの感染の第一段階である細胞との結合にはE2/NS1が深く関与していることが予想されるので、本発明ではE2/NS1とHCV感染性細胞、CD81発現細胞またはCD81との結合を阻止する物質をHCVの細胞への結合または感染阻止物質として開発に至った。
E2/NS1はHCVのゲノムから発現される蛋白の384番目のアミノ酸から746番目のアミノ酸までである。本発明においては、E2/NS1のHCV感染細胞への結合は、例えば、HCV遺伝子のE2/NS1のC末端にタグをつけた蛋白を可溶化した形で発現させ、HCV感染性細胞またはCD81発現細胞に結合させ、そのタグに対する抗体を使い、発光法または発色法にてE2/NS1の上記細胞への結合を確認した。結合を阻害する物質は、結合を確認する系にて可溶化E2/NS1と前述の細胞を結合させる前にE2/NS1と結合阻害を確認したい物質を混合し、その後該細胞を混合して発光または発色の変化を測定することにより確認した。結合を阻害する物質は、詳しくは後述するが、例えばH鎖に配列番号10から12に記載のアミノ酸配列があり、L鎖に配列番号13から15に記載のアミノ酸配列がある抗体等が挙げられるが、E2/NS1とHCV感染性細胞またはCD81発現細胞との結合を阻害する物質であればこれに限らない。また、可溶化CD81とE2が結合することも報告されている(SCIENCE,Vol.282,938−941)ので、上記物質を用いても可溶化CD81とE2の結合を阻害することが可能であることは容易に類推される。
本発明でいう抗体とは、通常生体内に存在する形の抗体の他に、抗体のH鎖もしくはL鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも1つ含むペプチド、1組のH鎖断片とL鎖断片からなるFab、2組のH鎖断片とL鎖断片からなるF(ab’)2、H鎖断片とL鎖断片が同一ペプチドに直列に結合した一本鎖抗体(以下「scFv」ということもある)なども含まれる。
本発明では、whole抗体が最も好ましい。whole抗体は全長抗体とも称し、全長H鎖と全長L鎖の2対の組み合わせから構成される、通常生体内に存在する形の抗体である。
なお、本発明におけるF(ab’)2及びFabとは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、IgG1をパパインで処理すると、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてVL(L鎖可変領域)とCL(L鎖定常領域)からなるL鎖、及びVH(H鎖可変領域)とCHγ1(H鎖定常領域中のγ1領域)とからなるH鎖フラグメントがC末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な2つの抗体フラグメントを製造することができる。これら2つの相同な抗体フラグメントを各々Fab’という。またIgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記2つのFab’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab’)2という。
本発明においては、モノクローナル抗体の作製は、C型肝炎治癒患者のB細胞より抗体の遺伝子を取得することにより行った。ヒト由来の複数のB細胞より目的とする抗体の遺伝子のみを単離する方法として、EBVを患者のB細胞にtransformしてB細胞を不死化してから目的の抗体を生産する細胞のみクローニングする等の手法が従来あるが、本発明者は鋭意検討の結果ファージディスプレイ法によりscFvを取得するに至った。
ファージディスプレイ法による抗体の取得の一例を挙げれば、C型肝炎治癒患者からヘパリン採血を行い、Ficoll法にて末梢血単核球を取得し、抗CD19抗体単体を利用してB細胞のみを精製した。この後、ヒトIL−2、ヒトIL−10、E2/NS1抗原1ng/ml、抗ヒトCD40抗体1μg/mlを用いてB細胞に抗体遺伝子のmRNAへの転写を刺激した。このB細胞の精製は、B細胞を特異的に分離できるものであれば特に制限されない。また、B細胞の刺激についても、前述以外の方法を用いてもよいし、適宜省略した方法を用いても問題ない。その後、B細胞より抗体mRNA、さらに抗体cDNAを取得した。さらに、scFv発現プラスミドにH鎖とL鎖可変領域の遺伝子を組み込める一本鎖抗体の遺伝子の枠組みを作製し、さらにその下流にM13ファージのgene3遺伝子を結合した。そのH鎖およびL鎖の可変領域を組み込む場所に上記取得cDNAからPCR法にてランダムに取得したH鎖およびL鎖を組み込んだ。このプラスミドを用いてM13ファージの先端にgene3蛋白と融合蛋白の形で組み込んだ一本鎖抗体を発現させ、そのうちE2/NS1に結合するもののみ選択することにより、H鎖の可変領域のCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列表の配列番号10、11および12に記載のアミノ酸配列であり、L鎖の可変領域のCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列表の配列番号13、14および15に記載のアミノ酸配列である一本鎖抗体scFv2−1及び該scFv2−1を発現するファージを取得した。そして、scFv2−1及び該scFv2−1を発現するファージが、特にE2/NS1に対して親和性が強く、E2/NS1とHCV感染性細胞、CD81発現細胞またはCD81の結合を強く阻害することを見いだした。
なお、上記では、M13ファージのシステムを用いて一本鎖抗体をスクリーニングする手法を挙げたが、本発明においては、「抗体」とファージの表面に提示される蛋白が、融合蛋白の形で発現させる手法であれば特に制限されない。
本発明でいうC型肝炎治癒患者とは、血液中にHCVのmRNAが検出され肝機能を測定する値、例えばALT等の値に異常が見られる、いわゆるC型肝炎の状態であった患者の血液中のHCVのmRNAが検出限界以下になり、ALT等の肝機能測定値が正常化した状態が6ヶ月以上続いた状態の患者のことを指す。
上記で本発明の抗体の代表例として例示したscFv2−1は、BIACORE(BIACORE社)を用いてE2/NS1との結合定数Kaを測定すると、4.5×108(M)、解離定数Kdは2.2×10−9(1/M)であった。また、本発明者らは、scFv2−1と同じ可変領域のH鎖を持ちL鎖の可変領域が異なる一本鎖抗体も複数取得しそれぞれの一本鎖抗体の結合能力とE2/NS1とHCV感染性細胞ならびにヒトCD81発現細胞との結合を阻害する能力を比較したところ、それぞれの結合能力とE2/NS1と細胞の結合阻止能力には相関が見られた。
その中で結合定数が108(M)以上、解離定数が10−8(1/M)以下である一本鎖抗体scFv2−1が、その阻害活性から鑑みるに医薬品としての能力が十分であると判断できる。すなわち、E2/NS1への結合定数がBIACOREで測定して108(M)以上、解離定数が10−8(1/M)以下である抗体が、HCV感染性細胞へ感染することを阻止する医薬品としてはより好ましい。抗体の能力をさらに上げるためには、結合定数が109(M)以上、解離定数が10−9(1/M)以下の抗体がさらに好ましいものとして挙げられる。
通常の抗体は大小二種類のポリペプチドからなり、大きい方のサブユニットを「H鎖」、小さい方のサブユニットを「L鎖」という。また、それぞれのペプチドはN末端側に存在して抗原結合部位を形成する「可変領域」と抗体のクラス別に一定の「定常領域」からなっている。可変領域はさらに特に抗原結合部位の形成に密接に関与している相補性決定領域「CDR」とその間に存在する「フレームワーク」に分けられる。CDRにはH鎖とL鎖のそれぞれについてN末端側から「CDR1」、「CDR2」、「CDR3」と呼ばれる3つの領域があることが知られている。
以下、抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4について説明する。抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4の配列は配列表の配列番号10から37に記載される。
抗体の可変領域を構成するアミノ酸は抗体により異なることが多い。ScFv3−1のH鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号25に示した。ここで、配列番号25には、scFvを大腸菌に発現させるための配列、すなわちscFv3−1のH鎖のN末端に2アミノ酸を付加した配列のものを示した。ゆえに抗体としてのフレームワークとして考えると配列番号25のアミノ酸の3位から32位はフレームワーク1、33位から37位までは「CDR1」、38位から51位まではフレームワーク2、52位から68位までは「CDR2」、69位から100位まではフレームワーク3、101位から117位までは「CDR3」、118位から128位まではフレームワーク4を示す。ScFv3−1のL鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号26に示した。配列番号26のアミノ酸の1位から23位まではフレームワーク1、24位から34位までは「CDR1」、35位から49位まではフレームワーク2、50位から56位までは「CDR2」、57位から88位まではフレームワーク3、89位から97位までは「CDR3」、98位から111位まではフレームワーク4を示す。ScFv3−2および3−3および3−4のH鎖のアミノ酸配列はすべて配列番号25に示したものである。
L鎖については、それぞれ下記の通りである。ScFv3−2のL鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号27に示した。配列番号27のアミノ酸の1位から23位まではフレームワーク1、24位から34位までは「CDR1」、35位から49位まではフレームワーク2、50位から56位までは「CDR2」、57位から88位まではフレームワーク3、89位から98位までは「CDR3」、99位から112位まではフレームワーク4を示す。ScFv3−3のL鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号28に示した。配列番号28のアミノ酸の1位から23位まではフレームワーク1、24位から34位までは「CDR1」、35位から49位まではフレームワーク2、50位から56位までは「CDR2」、57位から88位まではフレームワーク3、89位から97位までは「CDR3」、98位から111位まではフレームワーク4を示す。ScFv3−4のL鎖の部分のアミノ酸配列は配列番号29に示した。配列番号29のアミノ酸の1位から23位まではフレームワーク1、24位から34位までは「CDR1」、34位から49位まではフレームワーク2、50位から56位までは「CDR2」、57位から88位まではフレームワーク3、89位から97位までは「CDR3」、98位から111位まではフレームワーク4を示す。これらのフレームワークとCDRの境目はKabatらの「免疫学的に有利な蛋白の配列」(National Institutes of Health,Bethesda,MD(1987)および(1991))を参考にして決定された。
ScFvの調製にはRecombinant Phage Antibody System(ファルマシア社)などを利用することが可能であるが、生産宿主となる大腸菌にとって該一本鎖抗体が毒性を持ち、大腸菌の死滅、該一本鎖抗体の分解を起こすような場合には、キットを有効に利用できず多くの工夫を要する。一本鎖抗体は、pSE380プラスミド(インビトロジェン社)やpET24d(+)プラスミド(ノバジェン社)などの誘導性のベクターと宿主となる菌体を検討することにより調製しうる。また、生産においては、上述の方法の他、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、酵母細胞発現系も有効に利用しうる。H鎖およびL鎖を結合するリンカーは実施例では(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)×3回繰り返しの15残基のアミノ酸を利用したが、本発明においては、本配列に限定されずに利用することが可能である。
配列表の配列番号30から33には、抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のL鎖の塩基配列を示した。なお、これらの塩基配列においても、本願で述べているような効果を呈する限り、1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むものも本発明の範囲に含まれる。
抗体の抗原特異性と抗原への結合の強さが、主にCDRのアミノ酸配列によって決定されることはマウスの抗体のヒト化で示されている(Methods in Enzymology,203,99−121,1991)。
さらに、scFvから通常生体内にある形の抗体を作製することが可能である。一例を挙げると、E2/NS1に結合するscFvのプラスミドからH鎖およびL鎖の可変領域部分のみをPCR法にて増幅する。それぞれの断片は、例えば、ヒトの抗体のH鎖遺伝子及び/またはL鎖遺伝子を有するプラスミドに組み換えて、上記scFv上にある可変領域を持つ通常生体内にある形の抗体にすることが可能である。具体的には、例えば、プラスミドからH鎖およびL鎖の可変領域を増幅するとき得られる遺伝子断片の両端に、適当な制限酵素切断部位を入れておいて、ヒト抗体のH鎖及び/またはL鎖を有するプラスミド上の適当な制限酵素切断部位と組み合わせて、フレームシフトが起こらないように可変領域の遺伝子を入れ替える。このような方法によりプラスミド上にあった可変領域の配列をそのまま持つ通常生体内にある形の抗体を作ることは可能である。この抗体からさらに、抗体のH鎖もしくはL鎖の可変領域もしくはその組み合わせで形成される抗原結合部位を少なくとも1つ含むペプチド、1組のH鎖断片とL鎖断片からなるFab、2組のH鎖断片とL鎖断片からなる(Fab’2)を作ることも可能である。
さらに、本発明に示したH鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表の配列番号10、11および12に記載のアミノ酸配列であり、L鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表配列番号13、14および15に記載のアミノ酸配列である抗体、またはH鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表配列番号10、11および12に記載のアミノ酸配列であり、L鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表の配列番号16、17および18に記載のアミノ酸配列である抗体、またはH鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表の配列番号10、11、および12に記載のアミノ酸配列であり、L鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表の配列番号19、20および21に記載のアミノ酸配列である抗体、またはH鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表の配列番号10、11および12に記載のアミノ酸配列であり、L鎖の可変領域のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3がそれぞれ配列表の配列番号22、23および24に記載のアミノ酸配列である抗体の配列を置換することによりE2/NSTへの結合力ならびに中和活性を高めることは可能である。例えば、CDR3の配列をランダムに置換して抗体を取り直すことも可能であり、H鎖およびL鎖のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列および遺伝子の配列を置換することにより高活性の抗体を取得することも可能である。この際、アミノ酸配列を変換した抗体については、中和活性を失わない限り問題ない。すなわち、本発明においては、E2/NS1と、HCV感染性細胞、CD81発現細胞またはCD81との結合を阻害する能力を有する限り、上記アミノ酸配列において、置換、欠失、挿入等の修飾を加えたものについても、本発明の範囲に含まれる。
本発明でいう抗体の発現には、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を用いることができるが、人に医薬品として投与することを考えた場合、糖鎖修飾のされ方がよりヒト型に近い動物細胞を用いるのが好ましい。一例を挙げると、COS細胞やCHO細胞にて抗体を発現させるときにはpCDNA3.1(+)やpMAMneo(CLONETECH社)等を使用することが可能である。例えば、上記の手法で取得した抗体のH鎖の遺伝子をpCDNA3.1(+)のマルチクローニングサイトに、L鎖の遺伝子をpMAMneoにそれぞれ組み込む。その上でH鎖の組み込まれたベクターの適当なサイトにプロモーターとpolyAの間にL鎖の遺伝子がある発現ユニットを組み込む。このベクターをCOS細胞やCHO−K1、またはCHO DG44に遺伝子工学の定法にて導入することにより目的の抗体の生産が行える。さらに、上記作製したベクターに例えばpSV2/DHFR(Nature,1981.Vol.294,Lee F.et al.,)からDHFR遺伝子の発現ユニットを切り出し、H鎖とL鎖を発現するベクターに組み込む。このベクターをCHODG44に遺伝子工学の定法にて遺伝子導入する。これにより選択した細胞はMTXを用いたDHFR遺伝子増幅系を使用することにより抗体の生産性を大幅に上昇させることが可能である。COS細胞では一過性の抗体の発現のみしか行えないが、CHO細胞では抗体の遺伝子が染色体の組み込まれた形で発現することが可能である。また、先に論じたDHFR遺伝子増幅系を用いることにより抗体を高発現させることも可能であり、無血清培地で抗体生産を行うことができるので工業生産はCHO細胞を用いるのがより好ましい。
COS細胞は、通常10%ウシ胎児血清(FBS)を加えたDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)を用い、5%CO2存在下37℃で培養する。COS細胞への遺伝子導入後の細胞の育種生産法は、「バイオマニュアルシリーズ4 遺伝子導入と発現・解析法;横田崇、新井賢一」(羊土社、1994)等の実験書に記載されている。COS細胞への遺伝子導入法は電気穿孔法の他、DEAEデキストラン法、lipofectin等のトランスフェクション試薬を用いた方法であってもよい。
CHO K−1細胞、CHO−DG44細胞は、DMEMに10%FBSを加えた培地の他、例えばCHOS SFM2(GIBCO社)等の市販されている無血清培地を用いて5%CO2存在下37℃で培養することも可能である。CHO細胞への遺伝子導入もCOS細胞と同様に電気穿孔法の他、DEAEデキストラン法、lipofectin等のトランスフェクション試薬を用いた方法を用いることが可能である。特にCHO DG44ではヒポキサンチン、チミジンのない培地で培養し、DHFRの阻害剤であるMTXを培地に加えることにより遺伝子増幅による抗体の生産性の上昇が可能である。
本発明での抗体の生産時には、血清由来のウシ抗体の混入を避けるために、無血清の培地にて培養することが望ましい。無血清培地に馴化していないCOSおよびCHOの血清培地で培養している細胞については、血清を入れていないDMEMによって培養することが望ましい。こうして培養上清中に得られた本発明の抗体は、例えばプロテインAカラムやプロテインGカラムを用いる一般的なIgG抗体の精製法によって容易に精製することが可能である。
本発明で生産した抗体はHCVの治療に利用可能である。抗体の形状としては、生産抗体分子をそのまま利用することも可能であるが、各種プロテアーゼ処理により得られる抗原結合部位を含む断片であるFab、F(ab’)2、Fv、あるいはFdなども適用することができるが、whole抗体が最も好ましい。これらの断片については「抗体工学入門」(地人書館)に詳細な説明がなされている。断片ペプチドの場合は抗体分子の酵素処理により得ることができるが、遺伝子工学的な手法により細菌、酵母などに生産させることも可能である。これらの方法により得たモノクローナル抗体、モノクローナル抗体由来抗体断片、ペプチド等を組み合わせることにより、より強固な結合性を生じる。
本発明で生産した抗体を利用し、HCV感染患者の血液中のHCV粒子を減少しうる。例えば、HCVのmRNAまたは、市販のHCV診断薬により抗HCV抗体が血液中に観察される患者に本発明で生産した抗体を投与することにより血液中のHCV粒子の量を減少させることによりHCVの再感染を防ぎ、HCVの治癒へと患者を導くことが可能である。さらに、本抗体はHCV患者に投与されるとHCV患者の体内でHCVが感染している細胞のうち特に細胞表面にE2/NS1が提示されている細胞にも結合しうる。この結合と生体内の補体等の免疫系の活性化によりHCVの感染している細胞に対する障害能力をも期待できる。また、他の抗体由来の可変領域の遺伝子を組み合わせることにより、バイスペシフィック抗体、マルチスペシフィック抗体の生産も可能となる。マルチスペシフィック抗体とは、異なる抗原もしくは同じ抗原の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を少なくとも2種類以上保有する抗体を言う。中でもバイスペシフィック抗体とは、異なる抗原もしくはエピトープを認識する抗原結合部位を2種類以上有する抗体を言う。例えば、通常の抗体の一方の抗原結合部位ともう一方の抗原結合部位が異なるバイスペシフィック抗体は通常の抗体よりも抗原と強くまた、幅広い配列のHCVと結合可能であると考えられる。さらにIgMとしてより多価に抗原を認識する抗体の作成も可能である。こうした生産時にバイスペシフィック化する以外に、モノクローナル抗体を生産、精製し、その後に抗体同士を結合させバイスペシフィック化、マルチスペシフィック化することができる。このバイスペシフィック化は同一抗原のみでなく他の抗原に対する組み合わせも可能である。例えば、HCV粒子に表出していると言われているE1に対する抗体を利用してバイスペシフィック抗体、およびマルチスペシフィック抗体を作製することも可能である。
一本鎖抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のアミノ酸配列は配列表の配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37に示した。また、それをコードする核酸配列の例をアミノ酸配列とともに示した。配列番号34のアミノ酸配列の1位から22位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、23位から148位はH鎖の可変領域、149位から165位はリンカー、166位から276位はL鎖の可変領域、277位から299位はtagを含む配列を示す。配列番号35のアミノ酸配列の1位から22位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、23位から148位はH鎖の可変領域、149位から165位はリンカー、166位から277位はL鎖の可変領域、278位から300位はtagを含む配列を示す。配列番号36のアミノ酸配列の1位から22位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、23位から148位はH鎖の可変領域、149位から165位はリンカー、166位から276位はL鎖の可変領域、277位から299位はtagを含む配列を示す。配列番号37のアミノ酸配列の1位から22位は大腸菌からの分泌用シグナルを含む配列、23位から148位はH鎖の可変領域、149位から165位はリンカー、166位から276位はL鎖の可変領域、277位から299位はtagを含む配列を示す。
配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37に記載のアミノ酸配列の1位から22位を欠失させ大腸菌菌体内に一本鎖抗体を発現することも可能である。また、配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37に記載のアミノ酸の277位から299(又は300)位までは一本鎖抗体の検出、ならびに精製のための配列であり、欠失あるいは如何なる配列にも置換しうる。
大腸菌からの分泌シグナルおよび精製のための配列を含むベクターの作製は実施例に示したとおりである。配列番号34、配列番号35、配列番号36および配列番号37に記載のアミノ酸配列の149位から165位のリンカー配列はH鎖およびL鎖の可変領域の立体構造を実質的にscFv3−1と同様に保持できるものであれば如何なる配列にも置換しうる。一本鎖抗体は動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞の他大腸菌でも生産可能である。
一本鎖抗体でもバイスペシフィック化およびマルチスペシフィック化が可能である。例えば、1ペプチド内に複数の抗原認識部位の組み合わせのH鎖とL鎖を繰り返して並べることにより生産させることができる。また、生産、精製後に連結することも可能である。H鎖およびL鎖の組み合わせによらず、H鎖のみもしくはL鎖のみでも利用は可能である。こうした抗体種の選択は利用用途により行うことが可能であり、結合強度、抗原結合部位等により選択しうる。
本発明の抗体は、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むか、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する抗体である。本発明の抗体は、好ましくは、重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むか、配列番号9に記載のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むものである。
さらに本発明は、上記の抗体を有効成分として含有する医薬、例えば上記抗体と薬学的に許容しうる担体とからなる医薬組成物を提供する。特に、本発明における抗E2/NS1抗体遺伝子は、効率的に抗E2/NS1抗体を生産することを可能とし、種々の形態の治療用製剤を提供する。こうして生産された組換え抗体は、例えば薬学的に許容される成分組成の担体や安定化剤などの人体への投与に際し、該抗体の活性を保持させるために使用される物質とともに医薬用組成物中に含まれていてもよい。
本発明における医薬組成物は、本発明の抗体又は組み換え抗体を有効成分として、薬学的に許容され得る担体、即ち、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等の一つ以上とともに医薬組成物とし、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、注射剤、液剤、カプセル剤、トロー剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態により経口あるいは非経口的に投与することができる。薬学的に許容され得る担体の具体例としては、ヒト血清アルブミン、ゼラチン等を例示することができる。薬学的に許容されるとは、悪心、目眩、吐き気等投与に伴う望ましくない副作用、頻回投与時の製剤に対する免疫応答などがおきないことを意味する。さらに、本発明の抗体に例えば毒素等の物質を結合させた抗体も医薬品として使用可能である。
本発明の医薬組成物としては、例えば、薬学的に許容される適当な溶剤や希釈剤、安定化剤とともに溶解された液状の医薬用組成物でもよい。とりわけ注射剤の場合には、例えば生理食塩水あるいは市販の注射用蒸留水等の非毒性の薬学的に許容される担体中に0.1μg抗体/ml担体〜10mg抗体/ml担体の濃度となるように溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された注射剤は、処置を必要とするヒト患者に対し、1回の投与において1kg体重あたり、1μg〜100mgの割合で、好ましくは10μg〜50mgの割合で、1日あたり1回〜数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射のような医療上適当な投与形態が例示できる。好ましくは静脈内注射である。
さらに上記の医薬組成物に加えて生体内における濃度調節を目的とするミクロスフィアー、リポソームにおいて非経口(注射)する場合は、抗体および一本鎖抗体で1μg〜50mg/体重kgが適当であるがこの範囲に限らない。
なお、上記一本鎖抗体の場合には、C型肝炎ウイルスの診断用途として好適に用いることができる。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例
1.E2の発現
(E2tag発現ベクターの構築)
HCV J1クローンの遺伝子(Genbank登録番号:D89815)の内E2/NS1のHCVゲノムにおける384番目のアミノ酸より711アミノ酸からなる部分100ngを用い、PCR増幅用プライマーとして動物細胞での分泌を促すシグナルペプチド配列を有するPCRプライマー(5’CCC AAG CTT ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG GCT AGC CAT ACC CGC GTG ACG GGG GGG GTG CAA GG 3’;配列番号38)遺伝子を5’側に用い、E−tagの配列を有するPCRプライマー(5’CCC CCT CGA GTC TAG ATT AAC GCG GTT CCA GCG GAT CCG GAT ACG GCA CCG GCG CAC CGG AGA CGA CCG CCG ACC CTA TAC C 3’;配列番号39)を遺伝子3’側に用い、PCR反応によりDNA(tPAシグナル+E2(384−711)+tag)断片を増幅した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片1μgを1ユニットのHIndIIIとXbaIを用いて50μLの系M(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,2mM MgCl2)で37℃で2時間反応させて切断し、70℃10分の熱処理により酵素を失活させた。これと、動物細胞用発現ベクターpCDNA3.1(+)(Invitrogen社より購入)1μgを1ユニットのHindIIIとXbaIを用いて50μLの系M(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,2mM MgCl2)で37℃で2時間反応させて切断し70℃10分の熱処理により酵素を失活させたものをともに、フェノールとクロロホルムとイソアミルアルコールを25:24:1で混合した溶液を酵素液と等量添加し混合し遠心を行い水層のみを回収した(今後この操作をフェノールクロロホルム抽出と呼ぶ)。さらに回収した水層に10分の1容の3M酢酸ナトリウムと2.5倍容のエタノールを混合し−20℃で一晩、もしくは−80℃で15分静置し、遠心してDNA断片を回収した。さらに70%のエタノールを加えてからデカンテーションを行い、真空乾燥を行った(今後このエタノールを加えてDNA断片を回収する一連の操作をエタノール沈殿と呼ぶ)後、5μLの滅菌水に回収したDNA断片を溶かした。この精製DNA断片どうしをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望のE2tag発現プラスミドpE2tagを得た。
(E2tagの動物細胞での発現)
プラスミドpE2tagを保有する大腸菌を50mLバッフルフラスコで一晩培養した。菌体を8,000rpmで10分遠心により回収しQIAGEN Plasmid Midi kit(QIAGEN社より購入)を用いて説明書に従いプラスミドを精製した。
さらに精製したプラスミドをlipofectin(LIFETECH社より購入)を用いて説明書に従い5%FBSを添加したEX−CELL302(JRHより購入)で培養したCHO DG44株にトランスフェクションした。CHO DG44は5%CO2中37℃にて培養した。トランスフェクション2日後、細胞を0.25%トリプシンではがした後、G418を400μg/mL添加したEX−CELL302に細胞を播種した。2週間程度G418添加培地を用いて培地の交換を行い、コロニーが立ち上がってくるのを確認した。
得られた細胞のE2tagの発現の確認は細胞の上清をウェスタンブロッティングする事により確認した。ウェスタンブロッティングはファルマシア社より購入したAnti−E Tag Antibodyの説明書に従い行った。検出抗体にはHRP結合ヤギ抗マウスIgG抗体を用いた。発光反応はECL Western blotting detection reagents(アマシャムファルマシアバイオテクより購入)を用いて説明書に従いX線フィルムに感光させることにより行った。複数得られたクローンのうち発現がもっとも高い細胞を以後の実験に用いた。
(E2tagの精製)
上記の方法で得たE2tag発現株をEX−CELL302にて必要量の上清が得られるよう培養した。細胞の対数増殖期が終了した時点で細胞を遠心にて除き上清を回収した。上清はさらに0.45μmのフィルターを用いて混入物を除いた。そのようにして得られた上清はRPAS Purification Module(ファルマシア社より購入)を用いてアフィニティー精製を行った。精製はRPAS Purification Moduleに添付の説明書に従い行った。E2tagはRPAS Purification Moduleに添付のElution buffer中に得られるのでPBSへ置換した。具体的には、セントリコン30(アミコン社より購入)のフィルター上部に上記E2tagが含まれるElution各分を添加し中に含まれるbuffer量が100μL以下になるまで5000rpmで遠心を行った。さらに、そこへPBSを2mL程度添加し同様の遠心操作を行った。この操作を4回以上繰り返すことによりPBS中に溶解しているE2tagを回収した。
2.NOB assay系構築
(CD81発現ベクターの構築)
ヒトCD81遺伝子(Genbank登録番号M33680)の全長DNAを取得するため、Hela細胞から精製したmRNA1μgから、RT−PCR kit ver2.1(TAKARA社)を用いて、添付資料に従いランダムプライマーを用いcDNAを合成した。次にこのkitの添付資料に従い、PCR増幅用プライマーとして5’側をGCGCCGCCATGGGAGTGGAGGGCTGC(配列番号40)に設定し、3’側をCTCAGTACACGGAGCTGTTCCGGA(配列番号41)に設定してPCR反応を行った。PCR産物は0.8%アガロースゲル電気泳動し、目的のバンドをQIAEXII Gel Extraction Kit(QIAGEN社より購入)を用いて添付の説明書に従い精製した。さらに、TOPO TA Cloning KIT with TOP10F’ Cells(インビトロゲン社より購入)を用いて、添付の説明書に従いpCR2.1−TOPOと上記目的CD81のフラグメントを結合および大腸菌へのトランスフォーメーションを行い、目的とするpCRhCD81を得た。さらに、pCRhCD81 1μgを1ユニットのEcoRIを用いて50μLの系H(10mM Tris−HCl,100mM NaCl,2mM MgCl2)で37℃2時間反応させて切断し、70℃10分の熱処理により酵素を失活させた後QIAEXI I Gel Extraction Kit(QIAGEN社より購入)を用いて添付の説明書に従いCD81遺伝子を含むフラグメントを精製した。pCDNA3.1(+)も別途同様の系にてEcoRI処理し酵素を失活させた後、バクテリアルアルカリフォスファターゼ(TOYOBO社より購入)を1μL加え65℃で1時間インキュベートした。その後、フェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿で精製後、5μLの滅菌水にそれぞれ回収したDNA断片を溶かした。その上、両断片をリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望のCD81発現プラスミドpCDNA3.1(+)/CD81を得た。
(CD81発現細胞構築)
プラスミドpCDNA3.1(+)/CD81を保有する大腸菌を50mLバッフルフラスコで一晩培養した。菌体を8000rpmの遠心によりQIAGEN Plasmid Midi kit(QIAGEN社より購入)を用いて説明書に従いプラスミドを精製した。
さらに精製したプラスミドをlipofectin(LIFETECH社より購入)を用いて説明書に従い10%FBSを添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)で培養しておいたNIH3T3株にトランスフェクションした。NIH3T3は以下すべて5%CO2中37℃にて培養した。トランスフェクション2日後、細胞を0.25%トリプシンではがし、10%FBSとG418を800μg/mL添加したDMEMに細胞を播種した。2週間程度G418添加培地を用いて培地の交換を行い、コロニーが立ち上がってくるのを確認した。
得られた細胞株におけるCD81発現の確認は下記の操作により行った。得られた細胞株を選択培地中で6well plateにてコンフルエントになるまで培養した。細胞をPBS/0.05%EDTAで一度洗った後、PBS/0.05%EDTAを用いてはがした後0.1%BSAと0.1%アサイドを含むPBS(以下FACS bufferと呼ぶ)20μLに懸濁し、抗CD81抗体(ファーミンジェン社より購入)の終濃度が0.025mg/mLとなるように加え混合後、氷上で1時間インキュベートした。FACS bufferを200μL加えた後3000rpmで遠心して細胞を回収する操作を2回繰り返した。回収した細胞を30μLのFACSbufferに懸濁し、FITC標識ウサギ抗マウスIgs抗体(カペル社より購入)を終濃度が0.05mg/mLとなるように加え混合後、遮光して氷上で1時間インキュベートした。FACS bufferを200μL加えた後3000rpmで遠心して細胞を回収する操作を2回繰り返した後、200μLのFACS bufferに細胞を懸濁してFACScan(ベクトンディッキンソン社)により細胞の蛍光量を測定しもっとも蛍光量の大きい細胞を選択しNIH3T3/CD81と命名した。
(E2tagとMolt−4またはNIH3T3/CD81との結合確認)
Molt−4(理研RCB No.0206)またはNIH3T3/CD81を終濃度5×106cell/mLとし、E2tagが最終濃度50μg/mL以下となるように濃度をふって混合し1%のFBSを含むRPMI 1640中にて20μLの系で氷上で1時間インキュベートした。5%FBSを含むPBSを200μL加え、3000rpmで遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。1%のFBSを含むRPMI 1640にて抗Etag抗体を10μg/mLに希釈し各サンプルに10μL加え混合後1時間氷上にてインキュベートした。5%FBSを含むPBSを200μL加え、3000rpmで遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。5%FBSを含むPBSにてFITC標識ウサギ抗マウスIgs(カペル社より購入)を終濃度25μg/mLとなるように希釈した溶液10μLを各サンプルに加え混合後1時間氷上にてインキュベートした。5%FBSを含むPBSを200μL加え、3000rpmで遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。サンプルを5%FBSを含むPBSを200μLに懸濁後FACScan(ベクトンディッキンソン社)により細胞の蛍光量の変化を測定し、E2tagがMolt−4またはNIH3T3/CD81と結合していることを確認した。
(取得whole抗体によるE2tagとMolt−4またはNIH3T3/CD81との結合阻止の確認)
本実施例以下に説明する手法で取得したwhole抗体を用いて、E2tagとMolt−4またはNIH3T3/CD81との結合阻止を確認した。
E2tagの最終濃度25μg/mLとなるように1%のFBSを含むRPMI 1640で希釈した溶液と、1%のFBSを含むRPMI1640でwhole Ab 3−1、whole Ab 3−2、whole Ab 3−3、whole Ab 3−4をそれぞれ0μg/mL〜15μg/mLの範囲で希釈した溶液をそれぞれ5μLづつ混合し、37℃で30分インキュベートした。1×107cell/mLの濃度にMolt−4またはNIH3T3/CD81を1%のFBSを含むRPMI 1640中に懸濁した溶液10μLを混合し1時間氷上にてインキュベートした。5%FBSを含むPBSを200μL加え、3000回転で遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。1%のFBSを含むRPMI 1640にて抗Etag抗体を10μg/mLに希釈し各サンプルに10μL加え混合後1時間氷上にてインキュベートした。5%FBSを含むPBSを200μL加え、3000回転で遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。5%FBSを含むPBSにてbiotin化抗マウス抗体を10μg/mLに希釈し各サンプルに10μL加え混合後1時間氷上にてインキュベートした。PBSを200μL加え、3000回転で遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。PBSにてFITC標識アビジン(ピアス社より購入)を1/200に希釈し各サンプルに10μL加え混合後1時間氷上にてインキュベートしたPBSを200μL加え、3000回転で遠心し細胞を回収する操作を2回繰り返した。サンプルをPBS200μLに懸濁後フローサイトメーターBD−LSR(ベクトンディッキンソン社)により細胞の蛍光量の変化を測定し、E2tagとMolt−4またはNIH3T3/CD81の結合が添加した患者血清または抗体で阻止されていることを確認した。
結果を図1に示す。図1は、全長抗体1−1、3−1、3−2、3−3、及び3−4の中和活性を示す。
各取得抗体の結合阻止活性(中和活性)は以下の通りであった。
Whole Ab 3−1 3μg/mL
Whole Ab 3−2 2μg/mL
Whole Ab 3−3 1μg/mL
Whole Ab 3−4 1μg/mL
本発明の組み換えwhole抗体をWhole Ab 3−1、Whole Ab 3−2、Whole Ab 3−3、及びWhole Ab 3−4と称し、それらのL鎖全長アミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号1〜4に記載し、それらのH鎖全長アミノ酸配列及び塩基配列を配列表の配列番号9に記載する。
また、全長抗体1−1(Whole Ab 1−1)のH鎖全長のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号9に記載し、L鎖全長のアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号66に記載する。
3.抗体ライブラリーの作製
(HCV治癒患者からのmRNAの精製)
採血した血清にE2tagとMolt−4およびNIH3T3/CD81発現細胞との結合を阻止する能力のある抗体を有するHCV治癒患者から40mLヘパリン採血を行い、血液を取得した。末梢血リンパ球を分離する為、比重遠心法(Ficoll−Paque:ファルマシア)を行い、4×107のリンパ球細胞を得た。MACS(第一化学薬品,Miltenyi Biotec GmbH社製)を用いて抗CD19抗体を利用したB細胞精製と行い、2.8×106の細胞を得た。精製した細胞のうちのB細胞の純度を確認するため、抗CD19抗体で精製した細胞を染色しフローサイトメトリー解析法にて95%以上の精製度であることを確認した。この精製B細胞を用いて、ヒトIL−2(ジェンザイム)200unit/mL、ヒトIL−10(ジェンザイム)10ng/mL、E2/NS1抗原1ng/mL、抗ヒトCD40抗体(ジェンザイム)1μg/mLの刺激の元、5×105B細胞/ml 10%FCS RPMIの条件で72時間培養した。B細胞の活性化を顕微鏡にて確認し,PBSで2回洗浄し、RNAlater(Ambion社)を用いて説明書に従って操作してB細胞よりmRNAを取得、精製した。
(抗体ライブラリー1の作製)
抗体ライブラリー作製はBy−Passing Immunization Human Antibodies from V−gene Libraries Displayed on Phage(Journal of Molecular Biology 1991 222582−597)の記載方法に従い行った。精製したmRNA1μgから、RT−PCR kit ver2.1(TAKARA社)を用いて、添付資料に従いランダムプライマーを用いcDNAを合成した。次にこのkitの添付資料に従い、このcDNAを鋳型にし、抗体のH鎖、L鎖(λ鎖、κ鎖)をそれぞれPCRで増幅した。抗体遺伝子クローニング用のプライマー及びリンカーは、上記論文の記載に従い作製した物を用いた。PCR産物は1%アガロースゲルで電気泳動を行い、抗体のH鎖、L鎖のバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルからQIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN社)を用いてDNAを抽出した。次に抽出したH鎖、L鎖、リンカーを同モルになるようにして混合し、連結用プライマーを用いてPCRを行った。PCRは50μLの系で、Taq polymerase(PerkinElmer社)1単位を用い、94℃で5分加熱した後、94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒を30サイクル、その後72℃で5分間加熱し完了した。PCR産物は1%アガロースゲルで電気泳動を行い、H鎖、L鎖、リンカーが一本に連結したバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルからQIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN社)を用いてDNAを抽出した。次に制限酵素SfiIと50マイクロリットルの系M(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,2mM MgCl2)で55℃2時間反応させて切断し、70℃10分の熱処理により酵素を失活させた。さらに制限酵素NotIを加え50マイクロリットルの系M(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,2mM MgCl2)で37℃2時間反応させて切断し、70℃10分の熱処理により酵素を失活させた。DNAをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を順次行い精製し50μLの滅菌水に溶解した。このDNA断片100ngと、50ngのpCantab5MycHis(pCantab5E(アマシャムファルマシア)のEtag配列をMyc−Histagに入れ換えたベクター)とを、TAKARA社のリガーゼキットを用いて説明書に従い結合させた。ライゲーションサンプルをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿で順次精製し10μLの滅菌水に溶解した。この半量を用いてMolecular Cloning(1982)p249、Cold Spring Harbor Labs.に従い形質転換した。こうして1×106のコロニーを得た。これを一本鎖抗体ライブラリー(抗体ライブラリー1)として以後用いた。
(抗体ライブラリー2の作製)
抗体ライブラリー作製はBy−Passing Immunization Human Antibodies from V−gene Libraries Displayed on Phage(Journal of Molecular Biology 1991 222582−597)の記載方法に従い行った。
まず、PCantab5scFv3−1MycHis(PCantab5MycHisのSfiI siteとNotI siteの間に実施例に示したscFv2−1遺伝子が挿入されておりL鎖の5’末にAlw44I、3’末にNotIのサイトが配してある)のL鎖部分をHCV抗原に反応性のないL鎖に入れ替えたベクターを作製した。これをPcantab5scFv3−1/L−/MycHisと呼ぶ。
精製したmRNA1μgから、RT−PCR kit ver2.1(TAKARA社)を用いて、添付資料に従いランダムプライマーを用いcDNAを合成した。次にこのkitの添付資料に従い、このcDNAを鋳型にし、抗体のL鎖(λ鎖、κ鎖)をそれぞれPCRで増幅した。抗体遺伝子クローニング用のプライマーは、上記論文の記載に従い作製した物を用いた。PCR産物は1%アガロースゲルで電気泳動を行い、抗体のH鎖、L鎖のバンドを切り出した。切り出したアガロースゲルからQIAEX II Gel extraction kit(QIAGEN社)を用いてDNAを抽出した。
次に制限酵素Alw44Iと50マイクロリットルの系M(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,2mM MgCl2)で37℃2時間反応させて切断し、70℃10分の熱処理により酵素を失活させた。さらに制限酵素NotIを加え100マイクロリットルの系H(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,2mM MgCl2)で37℃2時間反応させて切断し、70℃10分の熱処理により酵素を失活させた。DNAをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を順次行い精製し50μLの滅菌水に溶解した。このDNA断片100ngと、同様にAlw44IとNotIで処理した50ngのpCantab5scFv3−1/L−/MycHisとを、TAKARA社のリガーゼキットを用いて説明書に従い結合させた。ライゲーションサンプルをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿で順次精製し10μLの滅菌水に溶解した。この半量を用いてMolecular Cloning(1982)p249、Cold Spring Harbor Labs.に従い形質転換した。こうして1×106のコロニーを得た。これを一本鎖抗体ライブラリー(抗体ライブラリー2)として以後用いた。
4.ライブラリーのスクリーニング
(ファージの調製)
プレート上に生えている大腸菌を2mlの2xTY液体培地で回収し、そのうち20μlを20mlの2xTY液体培地(100μg/Lアンピシリンと2%グルコースを含む)に加えた。37℃で200rpmで振とうしながら、吸光度600nmの値が1.0になるまで培養した。この培養液に1×1011pfu/mLのヘルパーファージM13KO7を加え、37℃に30分静置した。続いて、37℃200rpmで振とうした。30分後、溶液を3000rpmで10分間遠心して、大腸菌を回収した。上清を廃棄し、20mlの2xTY液体培地(100μg/Lアンピシリンと50μg/Lカナマイシンを含む)に懸濁し、37℃で200rpmで振とうしながら、一晩培養した。翌日、培養液を15000rpmで遠心し、大腸菌を沈殿させ、上清を回収した。この上清をファージ溶液として用いた。
(スクリーニング操作)
50mM NaHCO3(pH9.6)溶液に溶解した、10μg/mlのE2抗原1mlをプラスチックチューブ(Nunc MaxisorpTube)に加え、4℃に一晩おいた。翌日、抗原溶液を廃棄し、次にPBS溶液5mLでそのチューブを洗い、これを3回繰り返した。その後5mlの5%BSAを加え、37℃に置いた。2時間後、BSA溶液を廃棄し、5mlのPBS溶液でチューブを洗った。次に、用意したファージ溶液250μLと5%BSA溶液750μLを混合し、これをチューブに加え37℃に置いた。1時間後、加えた溶液を廃棄し、PBST(0.1%)溶液5mlでチューブを洗った。これを20回繰り返した。次にPBS溶液5mLでチューブを洗った。これを20回繰り返した。このチューブに1mLの100mMトリエチルアミンを加え、室温に10分間置いた。その後、トリエチルアミン溶液を回収し、これに500μLの1MTris−HCl(pH7.5)を加え、よく混合した。この溶液750μLを吸光度600nmの値が0.6になるまで培養した10mLの大腸菌TG−1に加え、37℃に30分置いた。続いて、37℃で200rpmで振とうした。30分後、溶液を3000rpmで10分間遠心して、大腸菌を回収した。この大腸菌を2×TYプレート培地(100μg/Lアンピシリンと2%グルコースを含む)に撒き、37℃で一晩置いた。翌日、プレート上に生えている大腸菌から、(ファージの調製)に記した操作でファージを回収し、(スクリーニング操作)に記した操作を繰り返した。このスクリーニング操作を3回繰り返した。
抗体ライブラリー1を用いたスクリーニングの結果、抗体ScFv1−1、及び抗体ScFv2−1を取得した。
抗体ScFv1−1のアミノ酸配列と塩基配列を配列番号67に示し、抗体ScFv2−1のアミノ酸配列と塩基配列を配列番号71に示す。
抗体ライブラリー2を用いたスクリーニングの結果、配列表の配列番号10〜37に記載のアミノ酸配列を有する抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3(及びScFv3−4が得られた。
配列表の配列番号10〜12は、抗体抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のH鎖のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号13〜15は、抗体ScFv3−1のL鎖のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号16〜18は、抗体ScFv3−2のL鎖のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号19〜21は、抗体ScFv3−3のL鎖のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号22〜24は、抗体ScFv3−4のL鎖のCDR−1、CDR−2、およびCDR−3のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号25は、抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のH鎖の部分アミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号26〜29はそれぞれ、抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のL鎖のアミノ酸配列を示す。
配列表の配列番号30〜33はそれぞれ、抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4のL鎖の塩基配列を示す。
配列表の配列番号34〜37はそれぞれ、抗体ScFv3−1、ScFv3−2、ScFv3−3、及びScFv3−4の塩基配列とアミノ酸配列を示す。
5.抗体発現ベクター構築
PCR法によりpRC/CMV(Invitrogen社より購入)のCMVプロモーターを含む領域、マルチクロニーングサイト、poly Aシグナル配列領域(同社遺伝子マップ209−1250塩基領域を増幅する。使用したプライマーの配列は、5’側は5’CCC TGA TCA GAA TTC GCA GGA TCC CTC GAG ACT AGT GAT GAT CGG GCC AGA TAT ACG CG 3’(配列番号42)、3’側は5’CCC TGA TCA AGA TCT GCT AGC GTC GAC TCC CCA GCA TGC CTG CTG CTA TTG 3’(配列番号43)であり、Applied Biosystems Model 394用い合成後、定法にて調製した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望の約1.0 Kbp DNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのBclI用いて50マイクロリットルの系Hで37℃2時間反応させて切断する。別にppUC119(宝酒造社より購入)DNA1マイクログラムを1ユニットのBamHIを用いて50マイクロリットルの系Hで37℃2時間反応させて切断する。切断したDNA断片と切断したプラスミドをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpKS1を得た。
上記で得たpKS1(1マイクログラム)をSpeI1ユニットを用い50マイクロの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen社より購入)を用い、PCRによりloxP−Hygromicin融合遺伝子を増幅する。使用したプライマーの配列は、5’側はHyg−stop:ccccagatctctattcctttgccctcggacgag(配列番号44)3’側はHy−atg:ccccaagcttatgaaaaagcctgaactcaccgcg3’(配列番号45)であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのNheI及びNaeIを用いて50マイクロリットルの系Mで37℃、2時間反応させて切断する。
pNeoβgal(Stratagene社より購入)を用い、PCRによりTK(A)nを含むDNAを増幅する。使用したプライマーの配列は、5’側はcccgccggctgggtgtggcggaccgc3’(配列番号46)、3’側は5’cccctctagaaagtataggaacttcaagc3’(配列番号47)であり、Applied Biosystems Model 394用い合成後、定法にて調製した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのXbaI及びNaeIを用いて50マイクロリットルの系Mで37℃、2時間反応させて切断する。
切断したプラスミドと切断したloxP−hygromycinDNA断片とTk(A)nDNA断片とをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpEX loxP−Hygを得た。
pEX1−3−1WをWO01/94571に記載の方法に従い調製した。先ず、特開平5−304987(EP520499B1)に記載の1−3−1抗体遺伝子の内、H鎖がγ1、L鎖がラムダのサブタイプのものを用いPCR法により両鎖の5’側にHindIII、3’側にSpeI切断部位を付加した。使用したプライマーの配列は、H鎖5’側は5’CCC AAG CTT CAC CAT GGC CTG GAT TCC TCT ACT TCT CCC CC 3’(配列番号48)、3’側は5’CCC ACT AGT CTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TGT CTT C 3’(配列番号49)、L鎖5’側は5’CCC AAG CTT CAC CAT GAA GCA CCT GTG GTT CTT CCT CCT GC 3’(配列番号50)、3’側は5’CCC ACT AGT TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG GC 3’(配列番号51)であり、Applied Biosystems Model 394を用いて合成後、定法にて調製した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48、Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのHindIII及びSpeIを用いて50μlの系Mで37℃で2時間反応させて切断する。別に上記pKS1 DNA1μgを1ユニットのHindIII及びXbaIを用いて50μlの系Mで37℃で2時間反応させて切断する。切断したプラスミドを切断したH鎖DNA断片とL鎖DNA断片を別々にリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望のH鎖発現プラスミドpEX1−3−1H及びL鎖発現プラスミドpEX1−3−1Lを得た。
上記pEX1−3−1L DNA1μgを1ユニットのSpeI及びNheIを用いて50μlの系Mで37℃2時間反応させて切断する。その後、約1.0kbpの抗体L鎖発現DNA断片を5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48、Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。別に上記pEX1−3−1H DNA1μgを1ユニットのNheIを用いて50μlの系Mで37℃で2時間反応させて切断する。切断したH鎖発現プラスミドとL鎖発現プラスミドをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の1−3−1抗体発現プラスミドpEX1−3−1Wを得た。
上記したpEX1−3−1W(WO01/94571)を用い、PCRにより重鎖定常域をを含むDNA断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、5’側は5’ccccaagcttctcgagactagtaccaagggcccatcggtcttccc3’(配列番号52)、3’側は5’ccccgggccctctagtagctttcatttacccggagacaggg3’(配列番号53)であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのHindIII及びApaIを用いて50マイクロリットルの系Mで37℃、2時間反応させて切断する。
pEX loxP−Hyg DNA1マイクログラムをHindIII,ApaI1ユニットを用い50マイクロの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した重鎖定常域を含むDNA断片とをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpEX gamma1 loxP−Hygを得た。
ScFv1−1を用い、PCRにより重鎖可変域を含むDNA断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、HB1−N5’cccaagcttcaccATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCtggtgcagtctg3’(配列番号54),HB1−C5’cccgctagcACTCGAGACGGTGACCAGGGTGCC3’(配列番号55)であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのHindIII及びNheIを用いて50マイクロリットルの系Mで37℃、2時間反応させ切断する。
pEX gamma1 loxP−Hyg DNA1マイクログラムをHindIII,SpeI 1ユニットを用い50マイクロの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した重鎖可変域を含むDNA断片とをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpEX gamma1 loxP−Hyg HCVIを得た(図2)。
pEGFPN2(クローンテック社より購入)を用い、PCRによりカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、H鎖5’側は5’ccccagagctagtcctgcaggcggggaaatgtgcgcggaacccct3’(配列番号56)、3’側は5’ccccgctagcctgcaagtcatttcgaaccccagcgtccc3’(配列番号57)であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのSpeI及びNheIを用いて50マイクロリットルの系Mで37℃、2時間反応させた後、37℃、2時間反応させ切断する。
pKS1 DNA1マイクログラムをNheI1ユニットを用い50マイクロの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断したカナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片とをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpEX−1Km、Ampを得た。
pEX−1 Km,Amp 1 DNA1マイクログラムをDraI,ScaI1ユニットを用い50マイクロの系Hにて37℃、2時間反応させ切断する。
切断したプラスミドをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpEX−1Kmを得た。
pCZOk(T,ShibuiらAppl Microbiol Biotechnol(1993)38,770−775記載)を用い、PCRにより軽鎖定常域を含むDNA断片を増幅する。使用したプライマーの配列は、H鎖5’側は5’ccccaagcttctagagtcgacggtaccgtggaaatcaaacgaactgtgg3’(配列番号58)、3’側は5’ccccgggccctctagcggccgcctaacactctcccctgttgaagc3’(配列番号59)であり、サイメディア社に合成を依頼し購入した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1マイクログラムを1ユニットのHindIII及びApaIを用いて50マイクロリットルの系Mで37℃、2時間反応させ切断する。
pEX−1 Km DNA1マイクログラムをHindIII,ApaI 1ユニットを用い50マイクロの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した軽鎖定常域を含むDNA断片とをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミドpEXkappa Kmを得た。
4種のscFv発現vector、ScFv3−1、scFv3−2、scFv3−3、scFv3−4を用い、PCRにより軽鎖可変域を含むDNA断片をそれぞれ増幅する。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
ScFv3−1 N末端側 配列番号60
ScFv3−1 C末端側 配列番号61
ScFv3−2 N末端側 配列番号62
ScFv3−2 C末端側 配列番号63
ScFv3−3 N末端側 配列番号62
ScFv3−3 C末端側 配列番号61
ScFv3−4 N末端側 配列番号64
ScFv3−4 C末端側 配列番号65
それぞれサイメディア社に合成を依頼し購入した。PCR反応は、Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用い、ポリメラーゼにKOD(東洋紡社より購入、反応条件は説明書に従った)を用いて行った。その後、所望のDNA断片は、5%アクリルアミド電気泳動法を用いMolecular Cloningセクション6.46−6.48,Cold Spring Harvor記載の方法により精製した。精製DNA断片約1μgを1ユニットのHindIII及びBsiWIを用いて50μlの系Mで37℃、2時間反応させた後、50℃、2時間反応させ切断する。
pEX kappa Km DNA1μgをHindIII,Asp187 I1ユニットを用い50μlの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
切断したプラスミドと切断した重鎖可変域を含むDNA断片とをリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望の発現プラスミド4つを取得した(図3)。
ScFv3−1 → pEXkappa Km HCV3−1
ScFv3−2 → pEXkappa Km HCV3−2
ScFv3−3 → pEXkappa Km HCV3−3
ScFv3−4 → pEXkappa Km HCV3−4
pEX kappa Km 3−1、pEX kappa Km 3−2、pEX kappa Km 3−3、pEX kappa Km 3−4のDNA1μgをSpeI,NheI 1ユニットを用い50μlの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
pEX gamma1 loxP−Hyg HCVI DNA1μgをNheI 1ユニットを用い50μlの系Mにて37℃、2時間反応させ切断する。
上記切断したプラスミドををリガーゼキット(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を用い連結し、大腸菌JM109株(宝酒造より購入、反応は説明書に従い行った)を形質転換し、所望のプラスミドを得た(図4)。
ScFv発現vectorとの対応は以下の通りである。
ScFv3−1 → pEX loxp−Hyg HCV3−1 W Km
ScFv3−2 → pEX loxp−Hyg HCV3−2 W Km
ScFv3−3 → pEX loxp−Hyg HCV3−3 W Km
ScFv3−4 → pEX loxp−Hyg HCV3−4 W Km
6.CHO細胞への抗体遺伝子の導入
(1)MKamp1株の調製
MKamp1株はWO01/94571に記載の通り調製した。
5%FBS(牛胎児血清;Lifetech社より購入)を含むCHO−S−SFM−II培地(Lifetech社より購入)で培養した対数増殖期のCHODG44株(コロンビア大学、Chaisn教授より入手)を用い、導入前日に培地を交換しトランスフェクションに用いた。
導入するベクターpMLGFP Zeoは、ベクター内の構造遺伝子に無関係なところで一ヶ所切れる制限酵素Eco0109I(宝酒造)で切断し一本鎖とした。pMLGFP Zeo DNA40μgを40ユニットのEco0109Iを用いて500μlの系Mで37℃で2時間反応させて切断する。切断後、0.8%アガロースゲル電気泳動し、完全に一本鎖となっていることを確認した。その後、反応液を同量のフェノール/クロロホルム溶液により抽出処理し、水層に2倍量のエタノールを加え、−80℃にて1時間置いた後、毎分15000回転の遠心により沈殿を集め、沈殿を70%エタノールでリンスし真空乾燥した後、100μlの無菌水にとかした。
細胞への遺伝子の導入はエレクトロポレーション法にて行った。
対数増殖期の細胞1×107個を0.8mlのPBSに懸濁し、用意したベクター溶液100μlと共にキュベットに入れ穏やかに混合した。
キュベットは、5分間氷冷し、Gene Pulser(BIORAD社製)を用いて電気パルスを印加した。印加条件は、1500(V)、25μF、1回印加とした。電気パルス印加後、さらに5分間キュベットは氷冷した。
エレクトロポレーションを行った細胞を上記培地に懸濁し、96well plateに各wellに1×105(cell/mL)から4×103(cell/mL)の細胞濃度で50μLづつ播種した。
96wellに細胞播種2日後、上記培地に200mg/lのゼオシン(Invitrogen社より購入)を加えた培地に交換し、その後3日に一度の頻度で100μLづつ培地交換を細胞が立ち上がってくるまで(約3週間)行った。
細胞集落約300個の発する蛍光はまず蛍光顕微鏡で視覚的に観察した。
その中から蛍光の強いもの(MKamp候補株)を16株選択した。
細胞総蛍光量の測定にはFACScan(BECTON DICKINSON)を用いた(空冷アルゴンレーザー、励起波長=488nm)。測定条件をあわせるため、測定はすべて同一条件の感度を用いて行った(PARAMETER:FSC=7.77;DETECTOR:FSC=E−1,FL1=400V)。この結果、Mkamp候補株16株はいずれも平均値約100〜370の相対蛍光強度を示していた。
Mkamp候補株を上記培地にて培養し、対数増殖期の細胞を10nMのMTX(メトトレキセート;シグマ社より購入)を含む5%FBS(牛胎児血清;Lifetech社より購入)CHO−S−SFM−II培地(Lifetech社より購入)に細胞を懸濁し、ウエル当たり2×105個の細胞数になるように6穴プレートに捲く。その後、3日毎に半量の培地を交換し、生育したコロニーの蛍光強度をFACSにて測定した。測定の結果、元株の蛍光強度が259であり、5nMMTX耐性コロニーの蛍光強度が407である株を遺伝子増幅可能株として選択し、これをMkamp1株と称する。
(2)CHO細胞への抗体遺伝子の導入
上記のMKamp1株にLipofectin(lifetech社より購入)を用いてpEX loxp−Hyg HCV3−1 W Km、pEX loxp−Hyg HCV3−2 W Km、pEX loxp−Hyg HCV3−3 W Km、pEX loxp−Hyg HCV3−4 W Km、をそれぞれトランスフェクトした(それぞれ200万個の細胞対し1.0マイクログラムのDNAを用いた)。5%FBS(牛胎児血清:Lifetech社より購入)を含むCHO−S−SFM−II地(Lifetech社より購入)にて37℃、5%CO2条件下で、48時間培養後、400mg/lのG418(Lifetech社より購入)を加えた同培地により、37℃、5%CO2条件下で、25日間選択培養し、G418耐性コロニーをそれぞれ選択した。
7.ELISA assayを用いた抗体生産量の測定
抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体(Zymed社より購入)溶液(溶液1で10μg/mlに希釈)を50μl/wellで96wellプレートに加え、37℃で2時間処理した。その後、wellの溶液をすて、各wellに250μlの溶液2を加え、4℃で16時間以上保温した。溶液除去後、溶液3で各wellを5回ずつ洗浄し、溶液4で希釈した抗体(スタンダード)もしくは試料溶液(培養上清を溶液4で任意に希釈したもの)を50μl/wellで加えて、37℃で2時間保温した。溶液除去、溶液3で5回洗浄後、溶液5を50μl/wellで加え、20℃で40分間保温した。液除去、PBSで5回洗浄後、溶液9を100μl/wellで加えて室温で遮光して約5分間反応させた。等量の10%硫酸を加えて反応を停止させた後、イムノリーダー(Inter Med社製、Immuno Reader NJ−2000)を用いて各wellのl1=490nm及びl2=650nmにおける吸光度A1及びA2を測定し、(A1−A2)を求めた。希釈標準溶液を用いて検量線を作製し、サンプル中の1−3−1抗体(スタンダードとして用いた)の濃度を測定した。
各溶液の組成は以下の通りである。
溶液1:0.1% Sodium Azideを含むPBS
溶液2:1% BSA、0.1% Sodium Azideを含むPBS
溶液3:0.05%のTween20を含むPBS
溶液4:1% BSAを含むPBS
溶液5:HRP標識抗ヒト免疫グロブリンヤギ抗体(Zymed社より購入)原液2μlを10mlの溶液4に溶かしたもの(用時調製)
溶液6:リン酸−水素ナトリウム14.2gを取り、水を加えて500mlとする
溶液7:クエン酸1水和物10.5gを取り水を加えて500mlとする
溶液8:溶液5 257mlに溶液6を243ml加え、水を加えて1000mlとする
溶液9:O−フェニレンジアミン(和光純薬より購入)4.0mgを取り、溶液7を10ml及び30%(v/v)過酸化水素溶液5マイクロリットルを加えて溶かす(調製後10分以内に用いた)
8.遺伝子導入株の抗体生産性の確認
上記ELISA法により以下の生産量が認められた。
9.細胞融合アッセイ
細胞融合アッセイはTakikawaらの方法に従った(Takikawa et al.,J.Virol.,74,5066−5074,2000)。組換えE1およびE2蛋白を細胞表面に発現するCHO細胞(Matsuura et al.,unpublished)をコラーゲンコートした96well plateの各ウエルに2万個ずつ接種し5% CO2存在下37Cで培養する。細胞を準備する際には、トリプシンを使用せず10mM EDTA添加リン酸緩衝食塩水(PBS)に5分間浸してから、できるだけ細胞が分散するようにフラスコを震盪し、ゆっくりとピペッティングしながら剥がす。24時間培養後、細胞を200μLのOpti−MEM(Gibco BRL)で2回洗い、T7プロモーターの下流にホタルのルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだリポータープラスミドpT7EMCLuc(Aoki et al.,Virology,250,140−150,1998)と遺伝子導入効率の標準化のためにCMVプロモーターの下流に海椎茸のルシフェラーゼ遺伝子を組み込んだpRL−CMV(Promega)をTrans IT−LT1(Mirus)を用いて細胞へ導入する。1plateあたり以下の組成で用意し、15分間静置後、1wellあたり30μLずつ添加する。2時間後10%血清添加D−MEM(Gibco)を150μLずつ添加し培養を継続する。
Opti−MEM 3ml
Trans IT−LT1 50μL
pT7EMCLuc 9μg
pRL−CMV 0.6μg
細胞融合反応の受容細胞としては、ヒト肝細胞癌由来のHepG2細胞を用いる。HepG2細胞を6well plateの各ウエルに8.0×105個ずつ接種し、5% CO2存在下37℃で培養する。24時間培養後に、T7 RNAポリメラーゼを発現するプラスミドpCAGT7pol(Ishii et al.,unpublished)を各ウエルあたり、以下の組成で細胞に導入し、2時間後に10%血清添加D−MEMを1.5ml添加する。24〜36時間培養後、細胞をトリプシンで剥がし、25〜30mlの10%血清添加D−MEMに浮遊後、50mlの遠心管に移し、5%CO2存在下37℃で、震盪機の上で一晩浮遊培養する。
Opti−MEM 100μL
Trans IT−LT11 5μL
pCAGT7pol 1μg
96well plateに用意したリポータープラスミドを導入したHCVエンベロープ蛋白を発現するCHO細胞(トランスフェクト48時間後)の上に、T7RNAポリメラーゼを発現するプラスミドを導入して一晩浮遊培養したHepG2細胞を、2×104/100μLずつ各ウエルに加える。5時間培養後、メディウムを捨て、100μLのpH5.0のPBSに2分間浸した後、直ちにその液を捨て、10%血清添加D−MEMを200μLずつ各ウエルに加え培養を継続する。培養5時間後に細胞をdual−luciferaze reporter assay sytem(Promega)を用いて、添付プロトコールに従いルシフェラーゼ活性を測定し、細胞融合活性を評価した。
10.細胞融合阻止アッセイ
抗体による細胞融合阻止活性を調べる場合は、上記の細胞融合阻アッセイと基本的には同じであるが、CHO細胞にHepG2細胞を加える前に、Opti−MEMでHepG2細胞を2回洗浄後、Opti−MEMで段階希釈した被検抗体(whole抗体3−1、3−2、3−3、及び3−4)と60分反応させてから共培養を行った。その後同様にルシフェラーゼ活性を測定し、細胞融合阻止活性を評価した。その結果、NOB活性を示した単鎖抗体を基に作製した完全抗体の中に、HCVのエンベロープ蛋白による細胞融合を特異的に阻止するものが認められた。
11.BIACOREによるアフィニティー測定
BIACOREによる取得whole抗体のアフィニティー測定は添付の説明書に従い行った。
E2tagを透析によりPBSに置換した。このE2tag(100μg/mL、20μL)をセンサーチップCM5(ビアコア社より購入)のそれぞれ異なるレーンに5μL/minで送液することによりアミノカップリング法にて固定化し、E2tag固定化センサーチップを得た。whole Ab 3−1、whole Ab 3−2、whole Ab 3−3、whole Ab 3−4を透析によりHBS buffer(10mM HEPES(pH7.4),0.15M NaCl,3.4mM EDTA,0.005% Tween20)に置換した。BIACOREX(ビアコア社)を用いて、先に作製したE2tagセンサーチップ上に、この各whole抗体溶液を5μL/minにて送液し結合時のセンサグラムを得た。その後、HBS bufferのみを5μL/minにてセンサーチップに送液し解離時のセンサグラムを得た。これらのセンサグラムの解析により以下のE2tagとwhole抗体の解離定数を得た。
Whole Ab 3−2 25.3(nM)
Whole Ab 3−3 9.26(nM)
Whole Ab 3−4 16.8(nM)
12.スクリーニング例(競合アッセイ)1
(1)抗体のビオチン化
抗体のビオチン化はアマシャムファルマシア社のProtein Biotinylation Moduleを用いてプロトコールに従い行った。ビオチン化した抗体はアマシャルムファルマシア社のPD−10を用いて定法に従いPBSにbuffer置換し、以下の操作に使用した。
(2)whole Ab 1−1によるE2/NS1とwhole Ab 3−3の結合阻止試験
50mM NaHCO3(pH9.6)溶液に溶解した、30μg/mlのE2tag 1mlをFALCONの96well plateに50μLづつ加え37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。各wellの水分を切った後、アマシャムファルマシア社のProtein Biotinylation Moduleに添付されていたmembrane blocking agent 5%と0.1%のTween20を含むPBS溶液(以下、blocking bufferと呼ぶ)を各wellに200μLづつ加え37℃で1時間、または4℃で一晩キンキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。Whole Ab1−1およびcontrol抗体をblocking bufferにて0〜1600ng/mLになるように希釈し各wellに50μLづつ加え37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。各wellの水分を切った後、ビオチン化したwhole Ab 3−3を最終濃度が100ng/mLになるようにblocking bufferにて希釈し、各wellに50μLづつ加え37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。HRP標識streptavidinをPBSにて1500倍希釈し、各wellに50μLづつ加え室温で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。OPD buffer 25mLにオルトフェニレンジアミン10mg、30%過酸化水素水12.5μLを加えた溶液を各wellに100μLづつ加え十分に発色するまで室温でインキュベートし、4N硫酸を100μL加えて反応を停止し、490nmにおける吸光度を測定することにより、whole Ab 3−3のE2tagに対する結合がwhole Ab1−1およびcontrol抗体により阻害されているか確認した。結果を図5に示す。
12.スクリーニング例(競合アッセイ)2
50mM NaHCO3(pH9.6)溶液に溶解した、30μg/mlのE2tag 1mLをFALCONの96well plateに50μLづつ加え37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。各wellの水分を切った後、blocking bufferを各wellに200μLづつ加え、37℃で1時間、または4℃で一晩インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。Whole Ab3−3およびcontrol抗体をblocking bufferにて0〜1600ng/mLになるように希釈し各wellに50μLづつ加え37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。各wellの水分を切った後、ビオチン化whole Ab 1−1を最終濃度が100ng/mLになるようにblocking bufferにて希釈し、各wellに50μLづつ加え37℃で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後、0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。HRP標識streptavidinをPBSにて1500倍希釈し、各wellに50μLづつ加え室温で1時間インキュベートした。各wellの溶液をデカンテーションで廃棄後0.1%のTween20を加えたPBSを各wellに200μL加えデカンテーションで廃棄する操作を5回繰り返した。OPD buffer 25mLにオルトフェニレンジアミン10mg、30%過酸化水素水12.5μLを加えた溶液を各wellに100μLづつ加え十分に発色するまで室温でインキュベートし、4N硫酸を100μL加えて反応を停止し、490nmにおける吸光度を測定することによりwhole Ab 1−1のE2tagに対する結合がwhole Ab 3−3およびcontrol抗体により阻害されているか確認した。結果を図6に示す。
産業上の利用の可能性
本発明によると、HCVの感染阻止作用などの抗ウイルス効果を有する新規な医薬品が提供可能である。
なお、本出願は日本国特許出願番号:特願2001−243947に基づく優先権を主張して出願されたものであり、特願2001−243947の明細書に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本明細書中に引用されるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明の抗体のNOB活性を示す図である。
図2は、発現プラスミドpEX gammal 1W loxp−Hyg HCVIの構築を示す図である。
図3は、発現プラスミドpEX kappa Km HCV3−1〜3−4の構築を示す図である。
図4は、発現プラスミドpEX loxp−Hyg HCV3−1W〜3−4W Kmの構築を示す図である。
図5は、Whole Ab 1−1とwhole Ab 3−3の競合アッセイの結果を示す図である。
図6は、Whole Ab 1−1とwhole Ab 3−3の競合アッセイの結果を示す図である。
Claims (20)
- (1)被験物質の存在下および非存在下において、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と、下記の(a)、(b)又は(c)の何れかの抗体を接触させる工程;
(a)重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号:9に記載のアミノ酸配列を含む抗体;
(b)軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号:1〜4又は75に記載のアミノ酸配列を含む抗体;
(c)配列表の配列番号34〜37、67〜70又は71〜74の何れかに記載のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体;並びに、
(2)被験物質の存在下および非存在下におけるC型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と、上記抗体との結合を比較する工程を含む、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白と上記抗体との結合を阻害する物質のスクリーニング方法。 - 抗体が、該抗体を検出可能な物質で標識した抗体である、請求項1に記載のスクリーニング方法。
- 抗体が、蛍光法または発色法により該抗体を検出することができる物質で標識した抗体である、請求項1又は2に記載のスクリーニング方法。
- C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白が、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白にタグをつけた蛋白である、請求項1から3のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白が、C型肝炎ウィルスのE2/NS1蛋白のC末端にタグをつけた蛋白である、請求項1から4のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 被験物質が、蛋白質、硫酸化多糖類または低分子化合物である、請求項1から5のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- 軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む抗体。
- 重鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号9に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む抗体。
- 請求項7又は8に記載の抗体をコードする核酸。
- 配列表の配列番号5、配列番号6、配列番号7又は配列番号8のいずれかに記載の塩基配列を含有する、請求項9に記載の核酸。
- 請求項9又は10に記載の核酸を用いた抗体の生産方法。
- 請求項11に記載の方法によって得ることができ、C型肝炎ウイルスのE2/NS1蛋白に対して親和性を有する組換え抗体。
- 抗体のFc領域がヒト型である、請求項12に記載の組換え抗体。
- 抗体が1本鎖抗体である請求項13に記載の組換え抗体。
- 請求項7又は8に記載の抗体を有効成分として含有する医薬。
- 請求項12から14のいずれかに記載の組換え抗体を有効成分として含有する医薬。
- C型肝炎の治療および/または予防のための請求項15又は16に記載の医薬。
- C型肝炎の診断のための請求項15又は16に記載の医薬。
- 請求項7又は8に記載の抗体を有効成分として含有する抗HCV剤。
- 請求項12から14のいずれかに記載の組換え抗体を有効成分として含有する抗HCV剤。
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