CN116120438B - 靶向新型冠状病毒rbd结构域的纳米抗体及其衍生蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)受体结合结构域(RBD)的新型纳米抗体及其衍生蛋白。具体而言,本发明公开了靶向新型冠状病毒RBD结构域的若干纳米抗体以及编码纳米抗体的序列、纳米抗体衍生蛋白的构建方法、纳米抗体和纳米抗体衍生蛋白的表达体系,验证了它们对新型冠状病毒RBD野生株和突变株的中和活性以及它们对新型冠状病毒假病毒和活病毒的中和活性。靶向RBD结构域的新型纳米抗体及其衍生蛋白可用于治疗或诊断新型冠状病毒野生株和突变株。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,涉及一种靶向新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD结构域的纳米抗体及其衍生蛋白。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的一种严重呼吸道疾病,是继SARS-CoV和MERS-CoV之后又一大规模流行病病毒。SARS-CoV-2可以通过咳嗽、打喷嚏以及唾液飞沫等方式将呼吸道分泌物释放到空气中形成气溶胶进行传播或者直接近距离吸入进行直接传播,还可以通过接触物品表面的病毒进行接触传播,对人类的健康产生了极大的威胁。
SARS-CoV-2是一种具有正向单链RNA的包膜病毒,在结构上它具有一个包含S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的双层脂质包膜,其中S蛋白以三聚体的形式病毒表面的刺突糖蛋白。SARS-CoV-2主要是通过上呼吸道或面部粘膜表面进入细胞的,其表面的S蛋白上S1亚基的受体结合结构域(RBD)与血管紧张素转化酶2(ACE2)上的受体结合基序(RBM)结合,S蛋白的S2亚基则介导病毒与细胞膜的融合,通过内吞作用使SARS-CoV-2进入宿主细胞。
因此,本领域急切需要一种能够阻断RBD与ACE2结合的高亲和力抗RBD中和抗体以抑制新型冠状病毒疫情,尤其是与单克隆抗体相比具有分子量小、稳定性高、组织渗透性强、溶解度高和容易制备等优势的纳米抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够阻断RBD与ACE2结合的高亲和力纳米抗体。
本发明的第一方面,提供了一种靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体VHH链,所述的纳米抗体VHH链包括CDR区,所述CDR区包含选自下组的CDR1、CDR2和CDR3:
(1)如SEQ ID NO:1所示的CDR1,SEQ ID NO:2所示的CDR2,和SEQ ID NO:3所示的CDR3;或
(2)由SEQ ID NO:4所示的CDR1,SEQ ID NO:5所示的CDR2,和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
在另一优选例中,所述的纳米抗体VHH链还包括框架区FR,所述的FR区序列选自下组:
(1)如SEQ ID NO:7所示的FR1,SEQ ID NO:8所示的FR2,SEQ ID NO:9所示的FR3,和SEQ ID NO:10所示的FR4;或
(2)如SEQ ID NO:11所示的FR1,SEQ ID NO:12所示的FR2,SEQ ID NO:13所示的FR3,和SEQ ID NO:14所示的FR4。
在另一优选例中,所述的CDR1、CDR2和CDR3由VHH链的框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中,所述的纳米抗体VHH链的CDR区包含与SEQ ID NO:1-6中任一具有至少80%、优选地至少90%、更优选地至少95%、甚至更优选地至少99%的序列相似性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述的纳米抗体VHH链CDR区的氨基酸序列与SEQ ID NO:1-6中任一相比包含一个或多个氨基酸取代,优选保守氨基酸取代。
在另一优选例中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个,较佳地1-2个,更佳地1个)氨基酸并能保留与新型冠状病毒RBD特异性结合能力的衍生序列。
本发明的第二方面,提供了一种靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体,所述纳米抗体特异性结合新型冠状病毒RBD蛋白,具有如SEQ ID NO:15或16所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明的第三方面,提供了一种多核苷酸,所述的多核苷酸编码如本发明第一方面所述的纳米抗体VHH链,或如本发明第二方面所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
在另一优选例中,所述的多核苷酸包括DNA、cDNA或RNA。
本发明的第四方面,提供了一种表达载体,所述表达的载体含有本发明第一方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述表达载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中,所述的宿主细胞选自下组:大肠杆菌、酵母细胞、或哺乳动物细胞。
本发明的第六方面,提供了一种靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体的制备方法,包括步骤:(i)在适合产生纳米抗体的条件下,培养本发明第五方面所述的宿主细胞,从而获得含有所述靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体的培养物;
(ii)从所述培养物中分离纯化或回收得到所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
在另一优选例中,所述纳米抗体具有如SEQ ID NO:15或16所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明的第七方面,提供了一种免疫偶联物,所述免疫偶联物包含:
(a)如本发明第一方面所述的纳米抗体VHH链、或如本发明第二方面所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体;和(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中,所述偶联部分为药物或毒素。
在另一优选例中,所述偶联部分为可检测标记物。
在另一优选例中,所述偶联物选自:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中,所述免疫偶联物含有:多价(如二价)的如本发明第一方面所述的纳米抗体VHH链、或如本发明第二方面所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
在另一优选例中,所述多价是指,在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的纳米抗体VHH链、如本发明第二方面所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
在另一优选例中,所述免疫偶联物为二价抗体,所述二价抗体包含两条如本发明第一方面所述的纳米抗体VHH链。
在另一优选例中,所述二价抗体包含两条具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的VHH链。
在另一优选例中,所述二价抗体包含两条具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VHH链。
在另一优选例中,所述二价抗体包含一条具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的VHH链,和一条具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VHH链。
在另一优选例中,所述免疫偶联物为多价抗体,其包含如SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16所示的氨基酸序列的VHH链。
本发明的第八方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含:(a)如本发明第一方面所述的纳米抗体VHH链、如本发明第二方面所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体,或如本发明第七方面所述的免疫偶联物;和(b)药学上可接受的载体。
本发明的第九方面,提供了一种如本发明第二方面所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体、如本发明第三方面所述的多核苷酸、如本发明第四方面所述的表达载体、如本发明第五方面所述的宿主细胞、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途,用于制备治疗和/或诊断由新型冠状病毒感染引起的疾病的药物或试剂。
在另一优选例中,所述新型冠状病毒包括野生株和突变株。
在另一优选例中,所述新型冠状病毒突变株选自下组:B.1.617(L452R,E484Q)、P.1(K417T,E484Q,N501Y)、或其组合。
在另一优选例中,所述疾病为新型冠状病毒肺炎。
本发明的第十方面,提供了一种体外检测样品中新型冠状病毒的方法,包括步骤:
(1)将样品与本发明第二方面所述的纳米抗体或本发明第七方面的免疫偶联物接触;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在新型冠状病毒。
在另一优选例中,所述新型冠状病毒包括野生株和突变株。
在另一优选例中,所述新型冠状病毒突变株选自下组:B.1.617(L452R,E484Q)、P.1(K417T,E484Q,N501Y)、或其组合。
在另一优选例中,所述方法为非诊断和非治疗性的。
本发明的第十一方面,提供了一种治疗新型冠状病毒感染的方法,所述方法包括向需要的对象施用如本发明第二方面所述的纳米抗体,本发明第七方面的免疫偶联物,或如本发明第八方面所述的药物组合物。
在另一优选例中,所述新型冠状病毒包括野生株和突变株。
在另一优选例中,所述新型冠状病毒突变株选自下组:B.1.617(L452R,E484Q)、P.1(K417T,E484Q,N501Y)、或其组合。
在另一优选例中,所述对象包括人或非人类哺乳动物。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了NB1A7和NB1B11与RBD的结合表位分类。
图2显示了NB1A7与RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的结合亲和力。
图3显示了NB1B11与RBD(WT)的结合亲和力。
图4显示了Format I与RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的结合亲和力。
图5显示了Format II与RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的结合亲和力。
图6显示了NB1A7对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的抑制活性。
图7显示了Format I对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的抑制活性。
图8显示了Format I I对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的抑制活性。
图9显示了NB1B11对RBD野生株与ACE2-Fc相互作用的抑制活性。
图10显示了示出纳米抗体对SARS-CoV-2假病毒的中和活性。
图11显示了纳米抗体血小板减少中和实验原始数据。
图12显示了纳米抗体对SARS-CoV-2活病毒的中和活性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地研发了一种能够阻断RBD与ACE2结合的高亲和力纳米抗体。本发明人构建了新型冠状病毒RBD结构域的质粒,经表达纯化后得到高纯度的RBD蛋白用于免疫骆驼。随后,建立噬菌体展示纳米抗体库,并基于该抗体库对靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体进行筛选。最终得到若干靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体,并基于得到的纳米抗体构建了两种不同模式的多价纳米抗体,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)鉴定了抗RBD纳米抗体、多价纳米抗体对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的中和活性,并通过SARS-CoV-2假病毒和活病毒实验鉴定了抗RBD纳米抗体、多价纳米抗体对SARS-CoV-2假病毒和活病毒的中和活性。因而本发明在检测、治疗或诊断新型冠状病毒等方面有潜在的应用前景。
在此基础上完成了本发明。
如本文所用,术语“本发明纳米抗体”、“本发明的靶向新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(RBD)的新型纳米抗体”、“本发明的抗RBD纳米抗体”可互换使用,均指特异性识别和结合于新型冠状病毒受体结合结构域的纳米抗体。特别优选的是VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15-16所示的纳米抗体。
如本文所用,术语“抗体”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“纳米抗体”(nanobody)指克隆抗体重链的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体,它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后,再克隆抗体重链的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。
纳米抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段,由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。Nanobody(Nb)具有优良的生物学特性,分子量12-15kDa,是完整抗体的十分之一,具有很好的组织穿透性,特异性高,水溶性好。因其特殊的结构性质,兼具了传统抗体与小分子药物的优势,几乎完美克服了传统抗体的开发周期长,稳定性较低,保存条件苛刻等缺陷,逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量,在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣,因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此,本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子,只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的衍生物。
如本文所用,术语“片段”、“衍生物”、“类似物”和“衍生蛋白”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(i i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些衍生蛋白属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有RBD结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽,如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中,“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficol l,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用,也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素;2.生物毒;3.细胞因子等;4.金纳米颗粒/纳米棒;5.病毒颗粒;6.脂质体;7.纳米磁粒;8.药激活酶;9.疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接靶向新型冠状病毒RBD,抑制新型冠状病毒野生株和突变株RBD与ACE2的结合,因而可用于治疗由新型冠状病毒野生株和/或突变株引起的疾病,如新型冠状病毒肺炎。此外,还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
检测方法
本发明还涉及检测新型冠状病毒的方法,所述新型冠状病毒包括野生株和突变株(尤其是B.1.617(L452R,E484Q)、P.1(K417T,E484Q,N501Y))。该方法步骤大致如下:获得细胞和/或组织样本;将样本溶解在介质中;检测在所述溶解的样本中新型冠状病毒的水平。
应用
如上所述,本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值,其应用涉及到与新型冠状病毒感染相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对新型冠状病毒感染的治疗。
本发明提供了抗CaSR纳米抗体在诊断和治疗新型冠状病毒感染相关疾病中的应用,包括由新型冠状病毒野生株和/或突变株引起的疾病,例如新型冠状病毒病毒肺炎。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明获取了高亲和力的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体,并在此基础上构建了两种模式的多价纳米抗体,极大地提高了纳米抗体与RBD的结合亲和力;
(b)本发明通过筛选获取的抗RBD纳米抗体以及构建的两种模式的多价纳米抗体均可以有效抑制新型冠状病毒野生株和突变株RBD与ACE2的结合;
(c)本发明通过筛选获取的抗RBD纳米抗体以及构建的两种模式的多价纳米抗体均可以有效抑制新型冠状病毒假病毒和活病毒与宿主细胞ACE2的结合。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:针对RBD的纳米抗体筛选
1.1RBD的表达和纯化
构建CMV-RBD质粒,经去内毒素处理后,将RBD与PEI按照质量比为1:3的比例瞬转转入密度为2.4×106cell/mL的HEK293F细胞中,在37℃,8%CO2,135rpm条件下培养12h后加入终浓度为10mM的正丁酸钠,在30℃,8%CO2,135rpm条件下继续培养72h并收集细胞上清。通过M2 column纯化后经SuperdexTM 75Increase 10/300GL分离性质稳定、峰形较好的RBD蛋白。
1.2免疫骆驼
选取成年双峰驼,将纯化后的RBD与佐剂按照体积比为1:1的比例混合后,对双峰驼进行动物免疫,每周免疫一次,共免疫七次。最后一次免疫骆驼两天后抽取骆驼外周血,从外周血中分离淋巴细胞,从淋巴细胞中提取RNA,将RNA逆转录合成cDNA,用于噬菌体展示纳米抗体库的构建。
1.3噬菌体展示纳米抗体库的构建
以合成的cDNA为模板,使用特异性引物CALL-F primer和CALL-R primer对编码抗体重链的核酸片段进行第一轮扩增,PCR产物用2%琼脂糖凝胶在100V条件下电泳1h,确定目标条带后将其切下进行凝胶回收。然后以第一轮PCR产物为模板,使用VHH-F primer和VHH-R primer从重链片段上扩增出编码纳米抗体(VHHs)的核酸片段,通过琼脂糖凝胶电泳验证后进行凝胶回收,将VHHs片段用PstI和BstEII进行双酶切后连接至pMECS载体中,通过电转将其转入TG1电感受态细胞中,从而构建了一个包含抗RBD纳米抗体在内的噬菌体展示纳米抗体库,经鉴定该抗体库的库容为1.33×108CFU/mL。
CALL-F primer:
5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’(SEQ ID NO:17)
CALL-R primer:
5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID NO:18)
VHH-F primer:
5’-CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT-3’(SEQ ID NO:19)
VHH-R primer:
5’-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3’(SEQ ID NO:20)
1.4抗RBD纳米抗体的免疫淘选
在96孔板上选取不相邻的8个孔,分别为4个实验孔和4个对照孔,向每孔加入100μL 5μg/mL NeutrAvidin,于4℃条件下过夜孵育。弃去孔中的NeutrAvidin,每孔用200μLPBST清洗3次后加入250μL 2%封闭液,700rpm振荡封闭2h,每孔用200μL PBST清洗5次,向实验孔中每孔加入100μL 15μg/mL的生物素化的RBD,向对照孔中每孔加入100μL 1×PBS,700rpm振荡孵育1h,每孔用200μL PBST清洗5次,向实验孔和对照孔各加入100μL终浓度为1×1013cfu/mL的噬菌体,700rpm振荡孵育1h,弃去孔内的噬菌体,用200μL PBST清洗10次、PBS清洗5次后每孔加入100μL终浓度为0.25mg/mL的胰酶对结合在96孔板表面的噬菌体进行消化,700rpm振荡孵育45min,分别将实验孔和对照孔中的洗脱噬菌体吸出,向实验组和对照组洗脱噬菌体中各加入20μL4mg/mL的AEBSF终止胰酶对噬菌体的消化。将洗脱的噬菌体感染TG1感受态细胞,以便第二轮panning使用。经两轮淘选后,展示了抗RBD纳米抗体的噬菌体富集度达到了116.7。
1.5ELISA鉴定阳性克隆
经两轮淘选后,将第二轮洗脱噬菌体梯度稀释并侵染TG1,涂布在平板上。挑取95个单克隆接种到每孔100μL培养基的96孔板中静置过夜作为母板。
另外,向96孔深孔板的每个孔中加入1mL培养基,每孔对应接种10μL母板中的菌液后在37℃,250rpm培养5h,向每孔中加入100μL浓度为10mM的IPTG,28℃,220rpm过夜诱导表达纳米抗体,反复冻融破碎细胞,对纳米抗体进行粗纯。纳米抗体制备完成后,通过ELISA鉴定与RBD特异性结合的纳米抗体。向96孔酶标板的每孔中加入100μL 5μg/mL的NeutrAvidin,在4℃条件下过夜孵育。弃去孔内的NeutrAvidin,用200μL PBST清洗5次,每孔加入250μL 2%封闭液,700rpm振荡封闭2h,弃去孔内的封闭液,用200μL PBST清洗5次,向每孔加入100μL 10μg/mL生物素化的RBD以700rpm孵育1h后用PBST清洗5次,洗去多余的、未与NeutrAvidin结合的RBD,每孔加入100μL用0.2%封闭液稀释2.5倍的纳米抗体,700rpm振荡孵育1h,用PBST清洗5次洗去多余的、未与RBD结合的纳米抗体,向每孔加入100μL用0.2%封闭液稀释2000倍的小鼠抗HA-Tag抗体后700rpm振荡孵育1h,用PBST清洗5次洗去多余的小鼠抗HA-Tag抗体,每孔加入100μL用0.2%封闭液稀释2500倍的经HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体,以700rpm振荡孵育1h后用PBST清洗5次洗去多余的经HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体,每孔加入100μL等体积混合的TMB和H2O2混合液,避光显色10min后向其中加入100μL 2M H2SO4终止显色,通过酶标仪检测每个孔在450nm处的吸光值。选取实验组读数为对照组读数两倍以上的孔作为阳性孔,从其对应的母板中吸取10μL菌液扩增后提取质粒进行测序。最终得到了两个抗RBD纳米抗体NB1A7和NB1B11。
实施例2:抗RBD纳米抗体的表达和纯化
将阳性克隆的基因转化至Top10F’感受态细胞中,涂布在含有100μg/mL氨苄的LB平板上,37℃静置过夜培养。挑取单克隆至8mL培养基中,小量扩增后转至800mL培养基中,37℃,220rpm培养至OD值为0.6-0.8,加入终浓度为1mM的IPTG在28℃,220rpm条件下过夜诱导。第二天,4℃,4500rpm离心25min收集细菌,将细菌重悬后进行超声破碎,4℃,40000rpm超速离心45min,将上清通过镍离子亲和层析柱纯化后经SuperdexTM 75Increase 10/300GL分离性质稳定、峰形较好的纳米抗体。
实施例3:抗RBD纳米抗体与RBD结合表位的鉴定
通过空间排阻色谱柱HPLC对NB1A7和NB1B11与RBD的结合表位进行鉴定。将RBD、RBD-NB1B11混合物(摩尔比为1:1)和RBD-NB1B11-NB1A7混合物(摩尔比为1:1:1)分别通过SuperdexTM 200Increase 5/150GL进行检测,对比3种蛋白在色谱图上的出峰位置,结果如附图1所示,色谱图上三种蛋白的出峰位置从前到后依次为RBD-NB1B11-NB1A7混合物、RBD-NB1B11混合物和RBD,说明NB1A7与NB1B11同时存在的情况下,NB1A7与RBD的结合不受NB1B11的影响,即两种纳米抗体结合在RBD的不同表位。
实施例4:抗RBD纳米抗体与RBD野生株和突变株结合亲和力的测定
采用生物层干涉技术(BLI)测定NB1A7与RBD野生株和突变株的结合亲和力以及NB1B11与RBD野生株的结合亲和力,其中RBD突变株选取B.1.617(L452R,E484Q)和P.1(K417T,E484Q,N501Y)两种突变株。将生物素化的RBD(WT)或RBD(B.1.617)或RBD(B.1.617)固定在活化后的Streptavidin生物探针上,在动力学缓冲液(PBS缓冲液和0.02%Tween20)中平衡基线,将传感器暴露于从100nM到3.125nM两倍系列稀释的纳米抗体中300s,然后在动力学缓冲液中监测600s的解离。利用ForteBio数据分析软件1:1拟合模型对数据进行拟合,并计算KD值。
NB1A7与RBD野生株和突变株的结合亲和力如附图2所示,NB1A7与RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的结合亲和力分别为0.74nM,3.09nM和5.12nM,这表明B.1.617和P.1这两种突变株的突变位点不影响其与NB1A7的结合;NB1B11与RBD野生株的结合亲和力如附图3所示,其亲和力为6.76nM。
实施例5:多价纳米抗体的构建和表达
5.1多价纳米抗体的构建
本发明构建了两种多价纳米抗体—Format I和Format I I。对于Format I,将编码NB1A7和NB1B11的基因分别克隆到pFUSE-mlgG2B-Fc2载体中,该模式下的两种纳米抗体基因共同转染至HEK293F细胞后,存在NB1A7-Fc+NB1A7-Fc、NB1B11-Fc+NB1B11-Fc和NB1A7-Fc+NB1B11-Fc三种状态的双价纳米抗体;对于Format II,编码NB1A7基因的C端通过20个氨基酸(GGGGS)4与编码NB1B11基因的N端连接,将该基因克隆到pFUSE-mlgG2B-Fc2载体中,该模式的基因转染至HEK293F细胞后,形成一种多价纳米抗体。
5.2多价纳米抗体的表达和纯化
对于Format I,将两种纳米抗体基因分别与PEI按照质量比为1:1.5的比例混合后共同转染至密度为2.4×106cell/mL的HEK293F细胞中;对于Format I I,将其基因与PEI按照质量比为1:3的比例混合后转染至密度为2.4×106cell/mL的HEK293F细胞中。在37℃,8%CO2,135rpm条件下培养12h后加入终浓度为10mM的正丁酸钠,在30℃,8%CO2,135rpm条件下继续培养72h并收集细胞上清。通过rProtein A Beads纯化后经SuperdexTM200Increase 10/300GL分离得到性质稳定、峰形较好的蛋白。
实施例6:多价纳米抗体与RBD野生株和突变株结合亲和力的测定
采用生物层干涉技术(BLI)测定Format I和Format II与RBD野生株和突变株的结合亲和力,其中RBD突变株选取B.1.617(L452R,E484Q)和P.1(K417T,E484Q,N501Y)两种突变株。将生物素化的RBD(WT)或RBD(B.1.617)或RBD(P.1)固定在活化后的Streptavidin生物探针上,在动力学缓冲液(PBS缓冲液和0.02%Tween 20)中平衡基线,将传感器暴露于从100nM到3.125nM两倍系列稀释的多价纳米抗体中300s,然后在动力学缓冲液中监测600s的解离。利用ForteBio数据分析软件1:1拟合模型对数据进行拟合,并计算KD值。
Format I与RBD野生株和突变株的结合亲和力如附图4所示,Format I与RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的结合亲和力分别为0.19nM,0.85nM和1.18nM;Format II与RBD野生株和突变株的结合亲和力如附图5所示,Format II与RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的结合亲和力均小于1pM。Format I和Format I I与RBD野生株和突变株都具有较高的结合亲和力。而针对RBD野生株,与NB1A7和NB1B11相比,两种模式的多价纳米抗体的亲和力都得到了极大的提高。
实施例7:纳米抗体对RBD野生株和突变株的中和实验
通过酶联免疫吸附实验(ELISA)鉴定NB1A7、Format I和Format II对RBD野生株和突变株与ACE2结合的抑制活性以及NB1B11对RBD野生株与ACE2结合的抑制活性。用5μg/mLNeutrAvidin溶液包被96孔板(100μL/孔),4℃过夜孵育,第二天用PBST洗涤NeutrAvidin包被的孔5次(200μL/孔),每孔加入250μL 2%BSA,700rpm封闭2h,用PBST洗涤5次(200μL/孔),每孔加入100μL生物素化的RBD(WT)或RBD(B.1.617)或RBD(P.1)蛋白,700rpm孵育1h后用PBST洗涤5次(200μL/孔),每孔加入100μL不同浓度纳米抗体和0.1μg/mL ACE2-Fc的混合物,700rpm孵育1h,用PBST洗涤5次(200μL/孔),每孔加入100μL HRP标记的山羊抗人IgG-Fc单克隆抗体,700rpm孵育1h,用PBST洗涤5次(200μL/孔),通过TMB显色试剂盒显色十分钟后,在450nm处检测吸收值。
NB1A7对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的抑制曲线如附图6所示,NB1A7中和RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的IC50值分别为808.1nM,664nM和1291nM。Format I对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的抑制曲线如附图7所示,Format I中和RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的IC50值分别为47.5nM,141.0nM和142.5nM。Format II对RBD野生株和突变株与ACE2-Fc相互作用的抑制曲线如附图8所示,Format II中和RBD(WT),RBD(B.1.617)和RBD(P.1)的IC50值分别为37.5nM,58.8nM和54.2nM。这表明NB1A7、Format I和Format II可以有效地抵抗新型冠状病毒的逃逸变异。
NB1B11对RBD野生株与ACE2-Fc相互作用的抑制曲线如附图9所示,其IC50值为709.4nM。
实施例8:纳米抗体对SARS-CoV-2假病毒和活病毒的中和实验
8.1SARS-CoV-2假病毒中和实验
新型冠状病毒假病毒是一个将新型冠状病毒的遗传物质用荧光素酶基因所代替的病毒,利用该假病毒侵染293T-ACE2细胞后,荧光素酶的基因在细胞中表达,从而可以与底物反应产生荧光。如果纳米抗体可以抑制假病毒与293T-ACE2细胞的结合,荧光值则会降低。将293T-ACE2细胞按照3×104cell/孔铺至96孔板中,在37℃,5%CO2条件下培养。将NB1A7、NB1B11、Format I以及Format II的纳米抗体分别从浓度为100μg/mL按照5倍梯度稀释,稀释至0.0000512μg/mL,每个稀释度的纳米抗体与新型冠状病毒假病毒等体积混合后于37℃孵育1h,将其转入293T-ACE2细胞中。同时设置一组阳性对照组和阴性对照组,其中阳性对照组为DMEM培养基与假病毒等体积混合孵育后加入293T-ACE2细胞中;阴性对照组为将DMEM培养基37℃孵育1h后加入293T-ACE2细胞中。
经检测后,结果如附图10所示,NB1A7、NB1B11、Format I和Format II中和SARS-CoV-2假病毒的IC50值分别为131.3nM、303.9nM、2.8nM和3.1nM,多价纳米抗体Format I和Format II显著增加了其对SARS-CoV-2假病毒的中和活性。
8.2SARS-CoV-2活病毒中和实验
采用血小板减少中和实验(PRNT)检测NB1A7、NB1B11、Format I和Format II对SARS-CoV-2活病毒的中和活性。将Vero E6细胞以1.5×106cell/孔的密度接种到24孔培养板中。第二天,将NB1A7、NB1B11、Format I和Format II连续稀释,与含200TCID50 DMEM、2%FBS的SARS-CoV-2悬液混合,37℃孵育1小时后,加入Vero E6细胞中。37℃孵育1小时后将混合物除去,用含有DMEM、2%FBS和0.9%羧甲基纤维素(Promega)的培养基取代。在37℃,5%CO2条件下孵育3天后,用0.5%结晶紫染色斑块。计数斑块,计算50%中和剂量(ND50)。
经检测后,结果如附图11和附图12所示,NB1A7、NB1B11、Format I和Format II中和SARS-CoV-2活病毒的ND50值分别为59.3nM、36.5nM、1.0nM和0.6nM。其中,多价纳米抗体Format I和Format II显著增加了其对SARS-CoV-2活病毒的中和活性。
讨论
新型冠状病毒S蛋白在病毒传染过程中发挥了关键的作用,针对新冠病毒RBD结构域的研究和抗体、药物研发,无疑为疾病的治疗提供了机制层面的支持,为新冠肺炎进一步的治疗奠定了基础。
本发明公开了靶向新型冠状病毒RBD结构域的若干纳米抗体以及编码纳米抗体的序列、纳米抗体衍生蛋白的构建方法、纳米抗体和纳米抗体衍生蛋白的表达体系,并验证了它们对新型冠状病毒RBD野生株和突变株的中和活性以及对新型冠状病毒假病毒和活病毒的中和活性。
本发明的靶向新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域RBD的新型纳米抗体及其衍生蛋白,可后续用于检测、诊断新型冠状病毒以及开发治疗药物。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列
>SEQ ID NO:1抗体株NB1A7 CDR1
GYTFSSYC
>SEQ ID NO:2抗体株NB1A7 CDR2
IDSDGST
>SEQ ID NO:3抗体株NB1A7 CDR3
AAEGGPSLSYCTGGYGFLLSGLMYNS
>SEQ ID NO:4抗体株NB1B11 CDR1
GYTVSVGC
>SEQ ID NO:5抗体株NB1B11 CDR2
IDASGIT
>SEQ ID NO:6抗体株NB1B11 CDR3
AAGLVRGSCTDVLDHPSYLGV
>SEQ ID NO:7抗体株NB1A7框架区FR1
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAS
>SEQ ID NO:8抗体株NB1A7框架区FR2
LGWFRQAPGKEREGVAA
>SEQ ID NO:9抗体株NB1A7框架区FR3
SYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC
>SEQ ID NO:10抗体株NB1A7框架区FR4
WGQGTQVTVSS
>SEQ ID NO:11抗体株NB1B11框架区FR1
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAS
>SEQ ID NO:12抗体株NB1B11框架区FR2
MAWFRQAPGKEREGVAG
>SEQ ID NO:13抗体株NB1B11框架区FR3
KYSDSVKGRFTISKDNAKNALDLQMNGLKPEDTAMYHC
>SEQ ID NO:14抗体株NB1B11框架区FR4
WGQGTQVTVSS
>SEQ ID NO:15抗体株NB1A7的VHH链序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTFSSYCLGWFRQAPGKEREGVAAIDSDGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAAEGGPSLSYCTGGYGFLLSGLMYNSWGQGTQVTVSS
>SEQ ID NO:16抗体株NB1B11的VHH链序列
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTVSVGCMAWFRQAPGKEREGVAGIDASGITKYSDSVKGRFTISKDNAKNALDLQMNGLKPEDTAMYHCAAGLVRGSCTDVLDHPSYLGVWGQGTQVTVSS。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
<120> 靶向新型冠状病毒RBD结构域的纳米抗体及其衍生蛋白
<130> P2021-2379
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Cys
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 2
Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 3
Ala Ala Glu Gly Gly Pro Ser Leu Ser Tyr Cys Thr Gly Gly Tyr Gly
1 5 10 15
Phe Leu Leu Ser Gly Leu Met Tyr Asn Ser
20 25
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 4
Gly Tyr Thr Val Ser Val Gly Cys
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 5
Ile Asp Ala Ser Gly Ile Thr
1 5
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 6
Ala Ala Gly Leu Val Arg Gly Ser Cys Thr Asp Val Leu Asp His Pro
1 5 10 15
Ser Tyr Leu Gly Val
20
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 8
Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 9
<211> 38
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 9
Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 10
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 25
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 12
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 38
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 13
Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ala Leu Asp Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr His Cys
35
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 14
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 132
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asp Ser Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Gly Gly Pro Ser Leu Ser Tyr Cys Thr Gly Gly Tyr Gly Phe
100 105 110
Leu Leu Ser Gly Leu Met Tyr Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 16
<211> 127
<212> PRT
<213> 双峰驼(Camelus bactrianus)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Val Ser Val Gly
20 25 30
Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Ala Ser Gly Ile Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Asp Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Ala
85 90 95
Ala Gly Leu Val Arg Gly Ser Cys Thr Asp Val Leu Asp His Pro Ser
100 105 110
Tyr Leu Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
ctagtgcggc cgctgaggag acggtgacct gggt 34
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
Claims (18)
1.一种靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体VHH链,其特征在于,所述的纳米抗体VHH链包括CDR区,所述CDR区由选自下组的CDR1、CDR2和CDR3组成:
(1) 如SEQ ID NO:1所示的CDR1,SEQ ID NO:2所示的CDR2,和SEQ ID NO:3所示的CDR3;或
(2) 由SEQ ID NO:4所示的CDR1,SEQ ID NO:5所示的CDR2,和SEQ ID NO:6所示的CDR3。
2. 如权利要求1所述的纳米抗体VHH链,其特征在于,所述的纳米抗体VHH链还包括框架区FR,所述的FR区序列选自下组:
(1) 如SEQ ID NO:7所示的FR1,SEQ ID NO:8所示的FR2,SEQ ID NO:9所示的FR3,和SEQ ID NO:10所示的FR4;或
(2) 如SEQ ID NO:11所示的FR1,SEQ ID NO:12所示的FR2,SEQ ID NO:13所示的FR3,和SEQ ID NO:14所示的FR4。
3. 一种靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体特异性结合新型冠状病毒RBD蛋白,其VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或16所示。
4.一种多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸编码如权利要求1所述的纳米抗体VHH链,或如权利要求3所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
5.一种表达载体,其特征在于,所述表达的载体含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞含有权利要求5所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体的制备方法,其特征在于,包括步骤:(i)在适合产生纳米抗体的条件下,培养权利要求6所述的宿主细胞,从而获得含有所述靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体的培养物;
(ii)从所述培养物中分离纯化或回收得到所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
8.一种免疫偶联物,其特征在于,所述免疫偶联物包含:
(a)如权利要求1所述的纳米抗体VHH链、或如权利要求3所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体;和(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
9.一种多价抗体,其特征在于,所述多价抗体包含多个重复的如权利要求1所述的纳米抗体VHH链,或如权利要求3所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体。
10.如权利要求9所述的多价抗体,其特征在于,所述多价抗体包含:
包含两条如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的VHH链的二价抗体,包含两条如SEQ IDNO: 16所示的氨基酸序列的VHH链的二价抗体,和/或包含一条如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的VHH链,和一条如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的VHH链的二价抗体。
11. 如权利要求9所述的多价抗体,其特征在于,所述多价抗体为二价抗体,其包含一条如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的VHH链,和一条如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的VHH链。
12. 如权利要求11所述的多价抗体,其特征在于,所述如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的VHH链和如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的VHH链通过(GGGGS)4序列连接。
13. 一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含:(a) 如权利要求1所述的纳米抗体VHH链、如权利要求3所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体,如权利要求8所述的免疫偶联物或如权利要求9所述的多价抗体;和(b)药学上可接受的载体。
14.一种如权利要求1所述的靶向新型冠状病毒RBD的纳米抗体、如权利要求4所述的多核苷酸、如权利要求5所述的表达载体、如权利要求6所述的宿主细胞、如权利要求8所述的免疫偶联物或如权利要求9所述的多价抗体的用途,其特征在于,用于制备治疗和/或诊断由新型冠状病毒感染引起的疾病的药物或试剂。
15.如权利要求14所述的用途,其特征在于,所述新型冠状病毒包括野生株和突变株。
16.如权利要求15所述的用途,其特征在于,所述新型冠状病毒突变株选自下组:B.1.617(L452R,E484Q)、P.1(K417T,E484Q,N501Y)、或其组合。
17.如权利要求14所述的用途,其特征在于,所述疾病为新型冠状病毒肺炎。
18.一种体外非诊断和非治疗性的检测样品中新型冠状病毒的方法,包括步骤:
(1) 将样品与如权利要求3所述的纳米抗体或如权利要求8的免疫偶联物接触;
(2) 检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在 新型冠状病毒。
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