CN1956994B - 上皮系细胞增殖促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供可以比较简单地制备，不仅具有育毛作用，还在具有如皮肤再生样的上皮系细胞增殖促进作用的基础上，可以容易地通过角质层达到期望的靶细胞而发挥效果的新型寡肽为目的，涉及所述寡肽及其水溶性盐，所述寡肽是含有脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基单元或异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸单元的3-7个氨基酸水溶性寡肽。

Description

上皮系细胞增殖促进剂
技术领域
本发明关于具有育毛促进效果、皮肤再生促进效果、皮肤溃疡治疗效果、粘膜损伤治疗效果等的上皮系细胞增殖促进效果的新型水溶性寡肽，更具体地是关于含有特定氨基酸序列的由3-7个氨基酸单元形成的水溶性寡肽、其水溶性盐以及以它们作为有效成分的上皮系细胞增殖促进剂。 
背景技术
最近，随着发毛、脱毛的控制机理的明确，社会对育毛剂的关心越来越强，提出了具有育毛作用的新型化合物、基于基因研究的成分、中药组合等各种各样的新育毛剂。 
图1是显示反复发毛、脱毛的毛发的毛周期的图，通常的毛发在其本体1的毛根部2有毛***3，其上部具有毛母细胞4，成长后毛发本体1进入退缩期(catagen)，约2-3周时间成长停止，之后2-3个月时间进入休止期(telogen)。期间毛根部2继续活动，发生新的毛发本体1’。该新的毛发本体1’进入继续成长期(Anagen)，使得旧的毛发本体1脱毛，进一步维持成长，用约5-6年再生原来的毛发。 
育毛剂在这样的毛周期的各个时期具有促进毛母细胞的增殖，在休止期诱导成长期，延长成长期，延迟向退缩期的移动的作用，进行发毛的促进或者脱毛的抑制。 
作为这样的育毛剂，目前提出的有例如以6-(1-哌啶基)-2，4-嘧啶二胺-3-氧化物(米诺地尔)作为有效成分的育毛剂(参考美国专利第4139619号说明书)；含有米诺地尔1-6质量％和多元醇、乙醇、盐酸吡多醇以及水而形成的育毛组合物(参考特开2002-326913号公报)；含有纤维芽细胞增殖因子-10(FGF-10)作为有效成分的育毛剂(参考特开平10-279501号公报)；以特定的脂肪酸酯、醚、甘油酯硫酸酯盐或单烷基甘油基醚硫酸酯盐作为有效成分 的养毛剂(参考特开平11-246359号公报)；以CRF1受体拮抗剂作为有效成分的育毛剂(参考国际公开第02/019975号小册子)；以具有血行促进效果的生药提取物和维生素或其衍生物作为有效成分，含有配合有水溶性高分子并凝胶化的气雾剂用组合物和喷射剂的育毛用气雾剂制剂(参考特开平7-101834号公报)等。 
此外，作为特殊的，以式R1-Met-Ile-XR2(式中，X是Trp、Phe、Trp-Leu、Phe-Leu、Tyr-Leu、Ile-Leu或Leu-Leu，R1是氢、氨基的保护基，R2是羟基或羧基的保护基)表示的肽或药理上可接受的盐作为有效成分的口服育毛剂是已知的(参考国际公开第00/29425号小册子)。 
另外，最新近的报纸报道了6-苄基氨基嘌呤(サィトプリン)和十五烷组合的育毛剂的发售(参考日经产业新闻，平成16年3月2日号)。 
这些育毛剂各有所长，尽管承认它们具有相当的效果，但不是对所有症状可以完全对应，而且原料的取得也很困难，不能说一定能满足供给实用。为此，在该领域中，需要出现发挥更优异效果的新型育毛剂。 
其他方面，作为以寡肽或其聚合物作为有效成分的生理活性物质，已知有：通过胶原或明胶的胶原酶而分解的分解物中的1个甘氨酸残基与其他的2个氨基酸残基构成三肽，该三肽的具有平均分子量280-20000的聚合物形成防止老化用的皮肤外用剂(参考特开2000-309521号公报)；以(Gly-Ala-Arg)、(Gly-Ala-Hyp)、(Gly-Ala-Lys)、(Gly-Pro-Ala)、(Gly-Pro-Arg)、(Gly-Pro-Hyp)以及(Gly-Pro-Ser)的三肽混合物作为有效成分的胶原产生促进剂(参考特开2003-137807号公报)等，但以三肽作为有效成分的上皮系细胞增殖促进剂到目前还没有。 
发明内容
本发明以提供可以比较简单地制备，不仅具有育毛作用，还在具有如皮肤再生这样的上皮系细胞增殖促进作用的基础上，可以容易地通过角质层达到期望的靶细胞而发挥效果的新型寡肽为目的。 
发明人为了开发作为育毛剂有用的化学物质，锐意研究得出结果，发现杆菌属(Bacillus)细菌的培养上清的提取物中，存在显示出优异育毛效果的活性物质，以及育毛作用是该活性物质中的特定寡肽结构引起的，并且具有该寡肽结构的特定多肽，每种不仅具有所期望的育毛效果，还显示出在皮膜移植、皮肤溃疡或老化皮肤复原时期的细胞再生促进效果。而且，发现具有特定氨基酸单元的水溶性寡肽显示出优异的上皮系细胞增殖促进作用，以此发现为基础完成了本发明。
即，本发明提供含脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基单元或异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酰基单元的具有3-7个氨基酸单元的水溶性寡肽及其水溶性盐，和以选自该水溶性寡肽及其水溶性盐中的至少1种作为有效成分的上皮系细胞增殖促进剂。 
本发明的上皮系细胞增殖促进剂中的水溶性寡肽的作用，不只是所述寡肽本身发挥作用，在具有以该寡肽单位作为分子构成单位的多肽中也发挥作用，但分子量在500以上时，由于成为水难溶性的而不好作为育毛剂。 
在这样的水溶性寡肽中，作为三肽是异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸、脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸。此外，作为四肽，可以列举例如在上述三肽的前后结合如下氨基酸残基：甘氨酰基、丙氨酰基、精氨酰基、天冬氨酰基、赖氨酰基、丝氨酰基、缬氨酰基或谷氨酰基等，优选甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸(序列表序列号1)以及脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号2)。 
作为五肽，可以列举例如在甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基(序列表序列号1)的前后结合丝氨酰基或苏氨酰基等的氨基酸残基的物质，优选甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号3)以及甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基苏氨酸(序列表序列号4)。 
此外，六肽或七肽是在羧基末端具有上述五肽单元的物质，例如丙氨酰基甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号5)，丝氨酰基甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号6)，优选甘氨酰基丝氨酰基甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号7)等。 
本发明的水溶性寡肽，可以是游离形的，也可以是水溶性盐。作为该水溶性盐有例如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐等。 
本发明的寡肽可以通过多肽合成时形成肽键的惯用方法制备，例如缩合剂法、活性酯法、叠氮法、混合酸酐法等，通过将α-氨基被保护的原料氨基酸和羧基被保护的氨基酸进行反应形成肽，然后反复进行脱保护基来制备。 
该缩合剂法是最一般的肽键形成方法，作为此处的缩合剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPC)、N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺(WSCI)及其盐酸盐(WSCI.HCl)、苯并***-1-基-三(二甲基氨基)磷鎓六氟化物盐(フルオロリ化物盐)(BOP)、二苯基磷酰基二酰胺(DPPA)等，单独使用，或与N-羟基琥珀酰亚胺(HONSu)、1-羟基苯并***(HOBt)、或3-羟基-4-氧代-3，4-二氢-1，2，3-苯并三嗪(HOObt)组合使用。 
作为活性酯法中的活性酯，例如使用对-硝基苯酯(ONp)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(ONSu)、五氟苯酯(OPfp)。 
此外，叠氮法是氨基酸或肽与无水肼反应形成对应的酰肼的方法，是作为外消旋较少的链段缩合法而已知的。 
此外，混合酸酐法是用异丁基氧基羰基氯化物、氯化二乙酰基、氯化三甲基乙酰基等，形成氨基酸的羧基的混合无水物的方法，由于可以在低温下强力活化羧基，因此是有利的。 
此外，作为氨基酸的保护基，可以使用通过酸处理或加水分解或接触还原容易地脱离的基团。这样的保护基中，作为α-氨基的保护基有苄基氧基羰基、叔丁氧羰基、9-芴基甲氧基羰基、3-硝基-2-吡啶磺化苯基(スルフエニル)、甲氧基苄氧基羰基等。此外，羧基的保护可以通过甲基或乙基酯、苄基酯、叔丁基酯、苯甲酰甲基酯等来进行。 
此外，在侧链上具有羟基的α-氨基酸的情况下，有必要对该羟基进行保护，但作为该保护基，优选是通过铂黑催化剂的接触还原或强酸处理而容易地脱离的苄基，或者是通过弱酸处理而容易地脱离的叔丁基。 
这样的α-氨基酸酯、氨基或羟基被保护基了的原料氨基酸，可以作为市售品容易地得到。 
本发明的寡肽的制备可以以将原料氨基酸或其衍生物均一地溶解于溶剂中而反应的液相法、在不溶性树脂上伸长肽链的固相法中的任何方法进行，但使用自动固相合成装置进行是有利的。如果使用该方法，可以短时间 并且高纯度地得到所期望的寡肽。 
本发明的新型寡肽或其水溶性盐，可以作为外消旋体得到，如果期望，可以通过惯用的方法进行光学拆分，得到具有光学活性的物质。该光学拆分可以使用如下方法等：将外消旋体的氨基酸与适当的光学活性物质形成二非对映异构体，将其分别结晶的方法；使用酶的方法或通过使用手性载体的高效液相色谱法(HPLC)的方法等来进行。 
本发明的寡肽可溶于水或醇类。可以通过质量分析、红外吸收光谱或高效液相色谱法进行鉴定。 
本发明的寡肽除了具有直接增殖促进毛包上皮细胞尤其是毛母细胞的作用即具有育毛作用外，还具有直接增殖促进表皮细胞的作用即对培养皮肤移植或皮肤溃疡以及皮肤损伤的治疗有用，因此可以作为上皮系细胞增殖促进剂使用。 
本发明的上皮系细胞增殖促进剂的制剂，可以通过将作为有效成分的前述寡肽以0.0001-5质量％的浓度溶解在水性介质中而得到。作为此时使用的水性介质，优选是水与水溶性有机溶剂的混合溶剂。 
作为水溶性有机溶剂，可以使用例如乙醇这样的醇类，如乙二醇、二乙二醇、二丙二醇、甘油、1，3-丁二醇这样的多元醇类，如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜这样的极性有机溶剂等。这些可以单独使用，也可以2种以上组合使用。优选的水性溶剂是水与丙二醇和乙醇的混合溶剂。 
本发明的上皮系细胞增殖促进剂中，根据期望，可以含有具有其他育毛作用的化合物，例如米诺地尔、卡普氯铵、十五烷酸甘油酯、醋酸生育酚、ピロクトンォラミン、甘草甜味素酸、异丙基甲基酚、桧醇、当药提取液、红辣椒酊剂(トゥガラシチンキ)或维生素类，例如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素F、维生素H、维生素K、维生素P、维生素U、泛酰醇(パントテニルアルコ一ル)、カルチニン、阿魏酸、γ-谷维醇、硫辛酸、乳清酸或这些的衍生物。这些化合物在本发明的上皮系细胞增殖促进剂中以0.005-10质量％优选0.01-2.0质量％范围的量配制。 
在本发明的上皮系细胞增殖促进剂中，还根据期望可以添加香料、着色剂、pH调整剂、杀菌剂、表面活性剂、喷射剂等通常外用液体制剂惯用的添加剂。作为这些添加剂的量为0.001-5质量％，优选0.01-2.0质量％的范 围。 
本发明的上皮系细胞增殖促进剂在头部或患部以1日1-5次的程度反复涂布使用。 
本发明的上皮系细胞增殖促进剂从对毛包上皮细胞的增殖呈用量依赖性的促进来看，可以确认作为其中有效成分的寡肽具有上皮系细胞增殖促进效果。 
此外，本发明的寡肽由于对上皮细胞显示选择性增殖作用，因此没有增殖其他细胞例如癌细胞的担心，是有利的。 
附图的简单说明 
图1是显示头发的发毛与脱毛的周期的说明图。 
图2显示实施例1得到的三肽的质谱图。 
图3显示参考例1得到的三肽的质谱图。 
图4显示实施例2得到的四肽的质谱图。 
图5显示参考例2得到的四肽的质谱图。 
图6显示实施例3得到的五肽的质谱图。 
图7是显示实施例5中得到的关于IGS的毛包上皮细胞增殖率的棒图。 
图8是显示实施例5中得到的关于PIG的毛包上皮细胞增殖率的棒图。 
图9是显示实施例5中得到的关于PIGS的毛包上皮细胞增殖率的棒图。 
图10是显示实施例5中得到的关于GPIG的毛包上皮细胞增殖率的棒图。 
图11是将涂布有实施例6中得到的上皮细胞促进剂的组(B)以及对照组(A)的第14天的剃毛部位以数码相机拍照得的照片图像输入计算机，使用图像解析软件以百分率计算出再生毛面积比的图。 
图12是显示实施例7中得到的毛包上皮细胞的细胞增殖率的棒图。 
图13是显示实施例7中得到的表皮细胞的细胞增殖率的棒图。 
图14是显示实施例7中得到的真皮纤维芽细胞的细胞增殖率的棒图。 
图15是显示实施例7中得到的毛***细胞的细胞增殖率的棒图。 
发明的最佳实施方式 
以下以实施例来说明实施本发明的最佳实施方式，但本发明不以任何方式限于此。 
实施例1 
使用自动固相合成装置(マルチシンテック社制，制品名“Syro2000”)，并且分别作为溶剂使用四氢呋喃，作为缩合剂使用二环己基碳二亚胺，在三乙胺的存在下，将羟基被叔丁基保护的丝氨酸的苄基酯、α-氨基被9-芴基甲氧基羰基(以下简略为Fmoc基)保护的甘氨酸、α-氨基被Fmoc基保护的异亮氨酸按照顺序反应，制备N-Fmoc-异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸的苄基酯。 
反应结束后，将生成的中间体通过在甲醇和二噁烷的混合溶剂(体积比3∶1)中用氟化氢处理，色谱法精制而进行脱离保护基，以及进行酯的加水分解，然后得到外消旋型异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸。此时的收率为约46％。 
然后，将该三肽通过C18柱[ヒュ一レットパッカ一ド社制，制品名“HP1100”(3.0×250mm)](以下实施例2-4的纯度解析中使用该柱。)，用含0.1％三氟醋酸的乙腈的溶液，按照浓度0-30％的范围，流速0.4ml/分，将吸着成分洗脱20分钟。其结果是，三肽在保留时间11.671分钟被洗脱，纯度为95.87％。 
此外，该三肽的质量用MALDI-MS质量计(テルモバィォアナリシス社制，制品名“Dynamo”(以下实施例2-4的质量分析中使用本质量计。)进行分析的结果，质量(m/z，MH+)为m/z 275.339。该质量分析的结果显示在图2中。 
参考例1 
使用甘氨酸的苄基酯、α-氨基被Fmoc基保护的异亮氨酸和α-氨基被Fmoc基保护的脯氨酸，进行与实施例1完全相同的操作，制备外消旋型脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸。此时的收率是约40％。 
然后，将该三肽通过C18柱，用含0.1％三氟醋酸的乙腈的溶液，按照浓度0-30％的范围，流速0.4ml/分，将吸着成分洗脱20分钟。其结果是，三肽在保留时间14.052分钟被洗脱，纯度为95.93％。 
此外，该三肽的质量分析的结果，质量(m/z，MH+)为m/z 285.102。该 质量分析的结果显示在图3中。 
实施例2 
使用羟基被叔丁基保护的丝氨酸的苄基酯、α-氨基被Fmoc基保护的甘氨酸、α-氨基被Fmoc基保护的异亮氨酸、和α-氨基被Fmoc基保护的脯氨酸，进行与实施例1完全相同的操作，得到外消旋型脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号2)。此时的收率是约54％。 
然后，将该四肽通过C18柱，用含0.1％三氟醋酸的乙腈的溶液，按照浓度0-40％的范围，流速0.4ml/分，将吸着成分洗脱20分钟。其结果是，四肽在保留时间12.313分钟被洗脱，纯度为95.11％。 
此外，该四肽的质量分析的结果，质量(m/z，MH+)为m/z 373.963。该质量分析的结果显示在图4中。 
参考例2 
使用甘氨酸的苄基酯、α-氨基被Fmoc基保护的异亮氨酸、α-氨基被Fmoc基保护的脯氨酸、和α-氨基被Fmoc基保护的甘氨酸进行与实施例1完全相同的操作，得到外消旋型甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸(序列表序列号1)。此时的收率是约48％。 
然后，将该四肽通过C18柱，用含0.1％三氟醋酸的乙腈的溶液，按照浓度5-40％的范围，流速0.4ml/分，将吸着成分洗脱20分钟。其结果是，四肽在保留时间11.648分钟被洗脱，纯度为99.60％。 
此外，该四肽的质量分析的结果，质量(m/z，MH+)为m/z 343.986。该质量分析的结果显示在图5中。 
实施例3 
使用自动固相合成装置(マルチシンテック社制，制品名“Syro2000”)，并且分别使用四氢呋喃作为溶剂，使用二环己基碳二亚胺作为缩合剂，在三乙胺的存在下，将羟基被叔丁基保护的丝氨酸的苄基酯、α-氨基被Fmoc基保护的甘氨酸、α-氨基被Fmoc基保护的异亮氨酸、α-氨基被Fmoc基保护的脯氨酸、α-氨基被Fmoc基保护的甘氨酸按照顺序反应，制备N-Fmoc-甘氨 酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号3)的苄基酯。 
反应结束后，将生成的中间体通过在甲醇和二噁烷的混合溶剂(体积比3∶1)中用氟化氢处理，色谱法精制而进行脱离保护基以及进行酯的加水分解，然后得到外消旋型甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸。此时的收率为约40％。 
然后，将该五肽通过C18柱[スペルコ社制，制品名“Discovery C18”(4.6×250mm)]，用含0.1％三氟醋酸的乙腈的溶液，按照浓度2-22％的范围，流速1.5ml/分，将吸着成分洗脱20分钟。其结果是，五肽在保留时间9.761分钟被洗脱，纯度为96.9％。 
此外，该五肽的质量用使用电喷雾法的正离子测定的LC-MS质量计(LC部，アジレント社制，制品名“Agilentl 100系列”；MS部，サ一モェレクトロン社制，制品名“Thermofinnigan LCQadvantage(软件Xcalibur)”进行分析的结果，质量(m/z，MH+)为m/z 430.1。该质量分析的结果显示在图6中。 
实施例4 
除了用羟基被叔丁基保护的苏氨酸的苄基酯代替羟基被叔丁基保护的丝氨酸的苄基酯以外，其余按照与实施例1完全相同的操作进行，制备外消旋型甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基苏氨酸(序列表序列号4)。该物质的质量(m/z，MH+)为m/z 444.3。 
实施例5 
对实施例1、2以及参考例1、2的上皮系细胞增殖促进剂进行用小鼠毛包上皮细胞的细胞增殖试验。并且，作为培养培养基、试验培养基，使用以下物质。 
(a)培养培养基 
DMEM(シグマ社制，制品记号“D-5523”) 
FBS(カンセラ·ィンタ一ナショナル·ィンコ一ポレ一テッド社制，制品记号“10100756”)10％ 
青霉素/链霉素(ギブコ社制，制品记号“15140-122”)1％ 
(b)试验培养基 
MCDB153(シグマ社制，制品记号“M7403”) 
胰岛素(シグマ社制，来自于牛，制品记号“16634”)5μg/ml 
アポ一トランスフェリン(シグマ社制，来自于人，制品记号“T1147”)10μg/ml 
EGF(アップステ一ト·バィォテクノロジ一社制，来自于小鼠，制品记号“01-101”)5ng/ml 
BPE(ギプコ社制，牛下垂体提取物，制品记号“13028-014”)35μg/ml 
水溶性氢化可的松(ナカラィ社制，制品记号“174-00”)0.5μg/ml 
乙醇胺(和光社制，制品记号“012-12455”)100μM 
邻磷酰基乙醇胺(シグマ社制，制品记号“P0503”)100μM 
(1)毛包上皮细胞的分离以及培养 
使用手术刀从新生小鼠(出生后5天龄)的皮肤上切出大约2mm宽的短册状皮肤片，浸渍于含有5％浓度的FBS(カンセラ·ィンタ一ナショナル·ィンコ一ポレ一テッド社制，制品记号“10100756”)的DMEM(シグマ社制，制品记号“D-5523”)并以500U/ml的比例浸渍在溶解有分散酶(ディスパ一ゼ)(合同酒精社制，批号0101)的溶液中，于4℃静置16小时。然后，使用小镊子从皮肤片上剥离除去表皮，只采集真皮组织，将这样得到的真皮组织浸渍于PBS(-)(シグマ社制，制品记号“P-4417”)中，使用眼科剪刀(眼科バサミ)细切。将这样得到的剥离片浸渍于在含有5％浓度FBS的DMEM中以0.2％浓度溶解有胶原酶(新田社制，批号001014W)的溶液中，于37℃消化1小时之后，以1000rpm离心分离5分钟，除去上清，向残留物中加入PBS(-)，通过缓慢地吹吸(ピペッティング)，制备真皮悬浊液。 
然后，为了从该真皮悬浊液中分离真皮纤维芽细胞和毛球，使其静置15分钟，只沉淀毛球。该“静置→沉淀”操作进行3次，将得到的毛球浸渍于在2.65mM EDTA水溶液中溶有0.25％浓度的胰蛋白酶的溶液中，通过在37℃处理5分钟，配制毛包上皮细胞的分散溶液。 
然后，将该分散液以1000rpm离心分离5分钟，除去离心分离后的上清。将得到的毛包上皮细胞分散在培养培养基中，播种到用胶原涂布的96孔微 孔板上，在5％CO2的气氛围中于37℃进行培养。 
(2)细胞增殖试验 
(i)样品的配制 
分别将实施例1、2以及参考例1、2中得到的异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(以下简称为IGS)、脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸(以下简称为PIG)、脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸(序列表序列号2)(以下简称为PIGS)以及甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸(序列表序列号1)(以下简称为GPIG)溶解在试验培养基中，每种配制0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM以及100μM的6种浓度的样品。此外，作为对照，只使用试验培养基。 
(ii)毛包上皮细胞增殖试验 
细胞播种后24小后，除去培养液，用MCDB153溶液洗净培养细胞。向该培养细胞中每孔各加入100μl的上述样品，在含有5％CO2的气氛围中，于37℃培养。 
4天后，向各孔中各加入10μl的アラマ一·ブル一试剂(登录商标名，バィォソ一ス社制，目录号DAL1100、批号AB083002)，再在5％CO2气氛围中于37℃继续培养。培养2小时后，用微型板导线(マィクロプレ一トリ一ダ一)(ラボシステムズ社制，制品名“フルォロスキャン アセントF L”)测定荧光强度(激发波长：544nm，测定波长：590nm)，评价细胞数。 
此外，以相对于对照的细胞增殖度的比率(百分率)来计算实施例1、2以及参考例1、2中得到的肽的细胞增殖度，表示为细胞增殖比的平均值±标准偏差(n＝5)，以此进行评价。有意义的检验是根据ダネット的多重比较检验(アバカスコンセプッ社制、软件“ス一パ一ア一ヴァ V.1.11”)来进行，在临界系数不到5％(p＜0.05)的情况下，认为是有意义的差别。将这样得到的IGS的结果在图7中、PIG的结果在图8中、PIGS的结果在图9中、GPIG的结果在图10中分别以棒图显示。 
(iii)结果 
根据图7，关于IGS，0.3、1、3、10、30以及100μM的细胞增殖率与对照组比较，分别是98、103、106、124、134以及133％，可知10μM以上 的浓度显示有意义的差(所有都是p＜0.01)。 
根据图8，关于PIG，0.3、1、3、10、30以及100μM的细胞增殖率与对照组比较，分别是101、103、113、132、131以及134％，可知1μM以上的浓度显示有意义的差(3μM：p＜0.05；10、30以及100μM：p＜0.01)。 
根据图9，关于PIGS，0.3、1、3、10、30以及100μM的细胞增殖率与对照组比较，分别是104、103、108、110、127以及133％，可知3μM以上的浓度显示有意义的差(3和10μM：p＜0.05；30以及100μM：p＜0.01)。 
根据图10，关于GPIG，0.3、1、3、10、30以及100μM的细胞增殖率与对照组比较，分别是105、108、118、133、134以及138％，可知0.3μM以上的浓度显示有意义的差(0.3μM：p＜0.05；1、3、10、30以及100μM：p＜0.01)。 
而且，进行对表皮细胞、真皮纤维芽细胞以及毛***细胞的试验时，可知本发明的上皮系细胞增殖促进剂对表皮细胞显示与对毛包上皮细胞同样的细胞增殖作用，但是对真皮纤维芽细胞以及毛***细胞没有影响。 
实施例6 
将实施例3中得到的五肽1mg溶解在注射用水(大冢制药社制，制品记号“057-00456”)300μl中，加入丙二醇(和光社制，制品记号“161-05006”)200μl以及乙醇(和光社制，制品记号“057-00456”)500μl，混合，制剂成浓度1mg/ml得上皮系细胞增殖促进剂。 
另外将7周龄的C3H/He系雌小鼠10只饲养1周，驯化后，使用电理发推子以及电动刮刀，将处于毛周期的休止期的小鼠的背部毛进行剃毛，用作实验用动物。 
然后，将该实验用动物分成两组每组5只，从剃毛后的第3天起，第1组每天1次在剃毛部位上涂布100μl/只的上皮系细胞促进剂，第2组只涂布作为对照用的注射用水与丙二醇和乙醇的混合物(体积比3∶2∶5)。在涂布后的第14天，用数码相机拍照剃毛部位后，确认涂布了本发明的上皮系细胞增殖促进剂的组(B)相比于对照组(A)具有明显的发毛促进作用。 
然后，将该图像输入到计算机中，使用图像解析软件，以百分率计算出再生毛面积比(再生毛部位的ピクセル数/剃毛部位的ピクセル数)。有意义的差的检验是通过Student’s的t检验(アバカスコンセプツ社制软件“スタツトビユ一J-4.02”)进行，在临界系数不到5％(p＜0.05)的情况下，认为是有意义的差别。 
其结果显示在图11中。在该图中，白色部分是毛没有生长的部分，黑色部分是毛生长的部分。根据该结果，与对照组(A)的再生毛面积比是36.9％±5.7％相对应的，涂布了本发明的上皮系细胞增殖促进剂的组(B)的再生毛面积比是66.6±3.5％，可知有意义地(p＜0.01)促进毛的再生。 
实施例7 
为了确认实施例3中得到的寡肽作为上皮系细胞增殖促进剂的细胞选择性，如下进行了对皮肤组织中存在的细胞，也就是毛包上皮细胞、表皮细胞、真皮纤维芽细胞以及毛***细胞的细胞增殖作用的有无的调查。此外，作为培养培养基、试验培养基，使用与实施例7相同的物质。 
(1)毛包上皮细胞、表皮细胞、真皮纤维芽细胞以及毛***细胞的配制 
无菌地采集生后5天龄的C3H/HeN系新生小鼠的皮肤，使用手术刀切出大约2mm宽的短册状的皮肤片作为样品。配制在含有5质量％FBS(カンセラ·インタ一ナシヨナル·インコ一ポレ一テツド社制，批号1010)的DMEM(シグマ社制，制品记号“D-5523”)中以500U/ml的比例溶解有分散酶(合同酒精社制，批号0101)的溶液，将上述样品浸于该溶液中，于4℃静置16小时，然后，使用小镊子从皮肤片上剥离表皮组织，与真皮组织分离。将得到表皮组织用于表皮细胞的分离，此外，真皮组织用于毛包上皮细胞以及真皮纤维芽细胞的分离。 
将这样得到的真皮组织浸渍于PBS(-)(シグマ社制，制品记号“P-4417”)中，使用眼科剪刀细切，浸渍在于含有5质量％FBS的DMEM中以0.2质量％溶解有胶原酶(新田社制，批号001014W)的溶液中，于37℃消化1小时。将这样得到的真皮消化液以1000rpm离心分离5分钟，除去上清后，向残留物中加入PBS(-)，通过缓慢地吹吸，制备真皮悬浊液。 
然后，为了从该真皮悬浊液中分离真皮纤维芽细胞和毛球，使其静置15分钟，只沉淀毛球。该“静置→沉淀”操作进行3次，将得到的毛球浸渍于在2.65mM EDTA水溶液中溶有0.25质量％的胰蛋白酶的溶液中，通过在37℃处理5分钟，配制毛包上皮细胞的分散溶液。 
然后，将该分散液以1000rpm离心分离5分钟，除去离心分离后的上清。将得到的毛包上皮细胞分散在培养培养基中，播种到用胶原涂布的96孔微孔板上，在5％CO2的气氛围中于37℃进行培养。 
另外，回收第一次“静置→沉淀”操作的在上清中浮游的真皮纤维芽细胞，以1000rpm离心分离5分钟，除去离心分离后的上清。将得到的真皮纤维芽细胞分散在培养培养基中，播种在96孔的微孔板上，在含有5％CO2的气氛围中，于37℃进行培养。 
将上述的表皮组织浸渍于在2.65mM EDTA水溶液中溶有0.25质量％的胰蛋白酶的溶液中，通过在37℃处理5分钟，配制表皮细胞分散溶液。 
然后，将该分散液以1000rpm离心分离5分钟，除去上清。将得到的表皮细胞分散在培养培养基中，播种到用胶原涂布的96孔微孔板上，在5％CO2的气氛围中于37℃进行培养。 
此外，将人毛***细胞(ト一ョ一ボ一社制，制品记号“602-05”)分散在培养培养基中，播种到用胶原涂布的96孔微孔板上，在5％CO2的气氛围中于37℃进行培养。 
(2)细胞增殖试验 
(i)样品的配制 
通过将实施例3中得到的五肽1mg加入到试验培养基232.8μl中搅拌溶解，配制10mM溶液。然后，将该10mM溶液逐级稀释，配制100μM(1号)、30μM(2号)、10μM(3号)、3μM(4号)、1μM(5号)、以及0.3μM(6号)的6种浓度的样品，此外，作为对照，只使用试验培养基。 
(ii)毛包上皮细胞以及表皮细胞增殖试验 
细胞播种后24小后，除去培养液，用MCDB153溶液洗净培养细胞。向该培养细胞中加入100μl/孔的上述样品，在含有5％CO2的气氛围中，于37℃培养。4天后，向各孔中各加入10μl的アラマ一·ブル一试剂(登录商标名，バィォソ一ス社制，目录号DAL1100、批号AB083002)，再在5％CO2气氛围中于37℃继续培养。培养2小时后，用微型板导线(ラボシステムズ社制，制品名“フルォロスキャンアセントF L”)测定荧光强度(激发波长： 544nm，测定波长：590nm)，评价细胞数。有意义的检验是根据ダネツト的多重比较检验(アバカスコンセプツ社制、软件“ス一パ一アノ一ヴアV.1.11”)来进行，在临界系数不到5％(p＜0.05)的情况下，认为是有意义的差别。 
将这样得到的毛包上皮细胞增殖试验结果在图12中、此外表皮细胞增殖试验的结果在图13中分别以棒图显示。 
(iii)真皮纤维芽细胞以及毛***细胞增殖试验 
细胞播种后24小后，除去培养液，用DMEM溶液洗净培养细胞。向该培养细胞中加入100μl/孔的上述样品，在含有5％CO2的气氛围中，于37℃培养。另外此时作为对照，使用培养培养基进行同样地培养。3天后，向各孔中各加入10μl的アラマ一·ブル一试剂(バイオソ一ス社制，制品记号“341-077612”)，再在含有5％CO2的气氛围中于37℃培养。2小时后，用微量反应板导线(ラボシステムズ社制，制品名“フルオロスキヤンアセントF L”)测定荧光强度(激发波长：544nm，测定波长：590nm)，评价细胞数。 
将这样得到的真皮纤维芽细胞试验结果在图14中、毛***细胞试验的结果在图15中分别以棒图显示。 
(iv)结果 
根据图12，在毛包上皮细胞中，各样品的细胞增殖率与对照比较，分别是101％(6号)、111％(5号)、124％(4号)、141％(3号)、142％(2号)以及141％(1号)，可知1μM以上的浓度显示有意义的差(p＜0.01)。 
由此可知，实施例3的上皮细胞增殖促进剂从1μM起显示用量依赖性毛包上皮细胞增殖促进作用。 
根据图13，在表皮细胞中，各样品的细胞增殖率与对照比较，分别是102％(6号)、110％(5号)、118％(4号)、124％(3号)、127％(2号)以及127％(1号)，可知1μM以上的浓度显示有意义的差(1μM的情况：p＜0.05；3μM以上的浓度的情况：p＜0.01)。 
由此可知，实施例3的上皮细胞增殖促进剂不只对毛包上皮细胞，并且对表皮细胞也从1μM起显示用量依赖性细胞增殖促进作用。 
另一方面，由图14和图15可知，对真皮纤维芽细胞以及毛***细胞没有影响。 
根据这些事实，可知实施例3的上皮系细胞增殖促进剂对分类于上皮系细胞的毛包上皮细胞以及表皮细胞显示选择性的细胞增殖作用。 
这样，本发明的上皮系细胞增殖促进剂由于对分类于上皮系细胞的毛包上皮细胞以及表皮细胞显示选择性的细胞增殖作用，在作为涂布剂例如洗剂使用的情况下，对构成皮肤组织的上皮系细胞以外的细胞不会带来恶劣影响。 
产业上的利用可能性 
本发明的化合物可以作为上皮系细胞增殖促进剂利用于育毛、皮肤再生。此外，根据本发明，提供了优良的新型上皮系细胞增殖促进剂，其不仅具有育毛效果，还产生皮肤再生效果、特异性皮炎治疗效果。 
序列表
<110>独立行政法人产业技术总合研究所(NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL
     SCIENCE AND TECHNOLOGY PATENT TECHNOLOGY DEVELOPMENT INC.)
     Syuichi，OKA
     Akinori，TSURUDA
     Yasuhiro，KAWANO
     Mitsuo，SUZUKI
     Satoshi，NAKAZATO
<120>表皮细胞生长促进剂
<130>05-103 NIT
<150>JP2004-108449
<151>2004-03-31
<150>JP2004-200862
<151>2004-07-07
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<223>GPIGS肽的部分结构
<400>1
Gly Pro Ile Gly
1
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<223>GPIGS肽的部分结构
<400>2
Pro Ile Gly Ser
1
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(5)
<223>
<400>3
Gly Pro Ile Gly Ser
1               5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(1)..(4)
<223>GPIGS中的C-端Ser残基被Thr替代。
<400>4
Gly Pro Ile Gly Thr
1               5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(2)..(6)
<223>其中N-端Gly残基用Ala修饰的GPIGS肽衍生物。
<400>5
Ala Gly Pro Ile Gly Ser
1               5
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(2)..(6)
<223>其中N-端Gly残基用Ser修饰的GPIGS肽的衍生物。
<400>6
Ser Gly Pro Ile Gly Ser
1               5
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的寡肽
<220>
<221>肽
<222>(3)..(7)
<223>其中N-端Gly残基用GlySer修饰的GPIGS肽的衍生物。
<400>7
Gly Ser Gly Pro Ile Gly Ser
1               5

Claims (7)

1.含有脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基单元的水溶性寡肽及其水溶性盐在制备上皮系细胞增殖促进剂中的用途，其中所述水溶性寡肽选自脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸、甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸、脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸、甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸中的至少一种。
2.权利要求1所述的用途，其中该水溶性寡肽是脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸。
3.权利要求1所述的用途，其中该水溶性寡肽是甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酸。
4.权利要求1所述的用途，其中该水溶性寡肽是脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸。
5.权利要求1所述的用途，其中该水溶性寡肽是甘氨酰基脯氨酰基异亮氨酰基甘氨酰基丝氨酸。
6.权利要求1-5任一项所述的用途，其中所述上皮系细胞增殖促进剂用于育毛。
7.权利要求6所述的用途，其中所述上皮系细胞增殖促进剂用于作用于毛发休止期的育毛。
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