ES2334727T3 - Proteina receptora cd81 de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Un fragmento EC2 de la proteína CD81, que consta de los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humano enumerado en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680), o que tiene, al menos, una homología del 80% con los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humana, en la que la homología se define usando el paquete de software de análisis de secuencia Pileup (Wisconsin, 1996), para usar en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

Description

Proteína receptora CD81 de la hepatitis C.

La presente invención se refiere al uso de un fragmento EC2 de la proteína CD81 y el ácido nucleico que codifica esta proteína en el tratamiento y diagnóstico de la hepatitis C y a composiciones farmacéuticas, modelos animales y kit diagnósticos para dichos usos.

El VHC (anteriormente conocido como hepatitis NoANoB, VNANB, es un virus de ARN de sentido positivo de aproximadamente 10.000 nucleótidos con un único marco de lectura abierto que codifica una poliproteína de aproximadamente 3.000 aminoácidos. Aunque la estructura del virus se ha aclarado mediante técnicas de ADN recombinante (solicitud de patente europea EP-A-0318216 y solicitud de patente europea EP-A-0388232), todavía no se ha aislado el propio virus y las funciones de las diversas proteínas víricas producidas por proteólisis de la poliproteína únicamente se han deducido mediante analogía con otros virus similares de organización genómica similar (Choo y col. PNAS USA (1991) 88 2451-2455).

Todas las proteínas víricas están disponibles en forma recombinante, expresadas en diversas células y tipos celulares, incluidos levaduras, bacterias, insectos, plantas y células de mamífero (Chien, D.Y. y col. PNAS USA (1992) 89 10011-10015 y Spaete, R.R. y col Virology (1992) 188 819-830).

Se ha sugerido que dos proteínas, denominadas E1 y E2 (correspondientes a los aminoácidos 192-383 y 384-750 de la poliproteína del VHC respectivamente) son proteínas externas de la cubierta vírica que son responsables de la unión del virus a las células diana.

La investigación sobre el VHC se ha retrasado muy considerablemente por el limitado abanico de huéspedes para los virus. El único modelo animal fiable para la infección por el VHC es el chimpancé y el VHC no se propaga con facilidad en los cultivos tisulares.

En nuestra solicitud de patente internacional pendiente de tramitación PCT/IB95/00692 (documento WO 96/
05513), los inventores describen un procedimiento que emplea citometría de flujo para identificar células portadoras del receptor del VHC. Los inventores han mostrado que, marcando células con proteína de la cubierta E2 recombinante, es posible clasificar las células usando citometría de flujo, aislando las células capaces de unirse de forma específica a E2 y, por tanto, potencialmente portadoras de un receptor del VHC.

En la solicitud de patente internacional en tramitación PCT/IB96/00943 (documento WO 97/09343), los inventores han identificado una proteína capaz de unirse a la proteína de la cubierta E2 del VHC.

En la actualidad, los inventores han tenido éxito, con algunas dificultades, en la clonación del ADN que codifica el receptor del VHC y han descubierto, sorprendentemente, que el ADN codifica una proteína celular conocida como CD81. Los inventores no conocen ninguna asociación en la bibliografía entre el CD81 y el VHC. El CD81 se identificó primero con anticuerpos monoclonales como la diana de un anticuerpo antiproliferación (TAPA-1) que inhibía la proliferación celular in vitro. Armados con esta nueva información y dado el conocimiento de la secuencia del CD81 en las bases de datos públicas, ahora es posible diseñar y producir un armamento de reactivos terapéuticos y diagnósticos contra el VHC.

De acuerdo con la invención, se proporciona un fragmento EC2 de la proteína CD81, que consta de los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humano enumerado en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680), o que tiene, al menos, una homología del 80% con los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humana, en la que la homología se define usando el paquete de software de análisis de secuencia Pileup (Wisconsin, 1996), para usar en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

El término "proteína CD81" o un equivalente funcional de la misma, como se usa en la presente memoria descriptiva, quiere decir la proteína CD81 definida por la secuencia proteica enumerada en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o en la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680) o un equivalente funcional de la misma. Un equivalente funcional de CD81 es un compuesto que es capaz de unirse al VHC, preferentemente a la proteína E2 del VHC. Preferentemente, el equivalente funcional es un péptido o proteína. El término "equivalente funcional" incluye un análogo de CD81, un fragmento de CD81 y mutantes y muteínas de CD81.

Una región de la proteína CD81 humana que en la presente memoria descriptiva se muestra que participa en la unión a la proteína E2 del VHC es la región "EC2", que comprende los aminoácidos 113-201 de toda la longitud de la secuencia humana que se muestra en la figura 1. La invención describe proteínas y fragmentos de proteínas que contienen esta región de CD81 humana o que contienen equivalentes funcionales de esta región, tales como, por ejemplo, la secuencia de chimpancé identificada en la figura 1. Preferentemente, el equivalente funcional tiene una homología de al menos un 80% con la secuencia de CD81 humana en la región EC2 de la proteína, preferentemente de al menos un 90% de homología evaluada mediante cualquier algoritmo de análisis convencional, tal como, por ejemplo, el software de análisis de secuencia Pileup (Manual de programa para el paquete Wisconsin, 1996).

La expresión "un fragmento funcionalmente equivalente", como se usa en la presente memoria descriptiva, quiere decir cualquier fragmento o ensamblaje de fragmento de la proteína completa que se une al VHC, preferentemente que se une a la proteína E2 del VHC. La proteína completa puede estar fragmentada en uno o ambos extremos o se pueden eliminar dominios internamente siempre que la proteína conserve la función definida. Por ejemplo, pueden eliminarse una o más regiones de la proteína responsable de la unión a la membrana (TM1 a TM4 en la figura 1) para convertir a la proteína en soluble cuando se produce mediante un proceso recombinante. El fragmento de elección comprende el bucle extracelular 2 (EC2 en la figura 1) de la proteína CD81 (aminoácidos 113-201).

En caso de proteináceos, fragmentos o análogos funcionalmente equivalentes pueden pertenecer a la misma familia de proteínas que la proteína CD81 humana identificada en la presente memoria descriptiva. Por "familia de proteínas" se quiere decir un grupo de proteínas que comparten una función común y exhiben una homología de secuencia común, Por homología de secuencia se quiere decir que las secuencias de proteínas están relacionadas por divergencia a partir de un ascendente común, como es el caso entre el ser humano y el chimpancé. Por tanto, la CD81 de chimpancé es un ejemplo de proteína funcionalmente equivalente que se une al VHC.

La homología entre secuencias proteicas funcionalmente equivalentes es de al menos un 80% en toda la secuencia de aminoácidos de la proteína completa o del fragmento EC2 completo (aminoácidos 113-201).

La expresión "un análogo funcionalmente equivalente" se usa para describir los compuestos que poseen una función análoga a una actividad de la proteína CD81 y puede, por ejemplo, comprender un péptido, péptido cíclico, polipéptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Estos compuestos pueden ser proteínas o pueden ser agentes sintéticos diseñados de modo que imiten ciertas estructuras o epítopos sobre la proteína inhibidora. Preferentemente, el compuesto es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

La expresión "análogo funcionalmente equivalente" también incluye cualquier análogo de CD81 obtenido mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos mediante, por ejemplo, una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos, de modo que el análogo de la proteína conserva la capacidad para unirse al VHC, preferentemente a la proteína E2 del VHC. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse mediante, por ejemplo, mutación puntual del ADN que codifica la secuencia de aminoácidos.

El equivalente funcional de CD81 puede ser un análogo o fragmento de CD81. La CD81 o equivalente funcional pueden modificarse químicamente a condición de que conserve su capacidad para unirse al VHC, preferentemente la proteína E2 del VHC.

Se ha previsto que dichas moléculas sean extremadamente útiles en el tratamiento preventivo de la infección por VHC, porque estas moléculas se unirán específicamente al virus y, por tanto, se evitará la internalización del virus en las células. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "unión específica" significa que el análogo funcionalmente equivalente tiene una afinidad elevada por la proteína E2 del virus del VHC y no se une a ninguna otra proteína con una afinidad elevada similar. La unión específica se puede medir mediante una serie de técnicas tales como transferencia de tipo western, análisis FACS o inmunoprecipitación. Preferentemente, el análogo funcionalmente equivalente se une a la proteína E2 con una afinidad de al menos 10^{-8}, preferentemente de al menos 10^{-9} y más preferentemente superior a 10^{-10}.

El fragmento de proteína CD81, o su equivalente funcional, se puede producir mediante cualquier medio adecuado, como será evidente para los expertos en la técnica. Con el fin de producir cantidades suficientes de proteína CD81, o sus equivalentes funcionales, para usar de acuerdo con la presente invención, la expresión puede alcanzarse de forma conveniente mediante cultivo en las condiciones adecuadas de células huésped recombinantes que contienen la proteína CD81, o su equivalente funcional.

Se conocen bien sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped.

Dos procedimientos preferidos para la construcción de proteínas transportadoras de cuerdo con la invención son la síntesis química directa y la producción de proteína recombinante. Preferentemente, la proteína CD81 se produce por medios recombinantes, mediante la expresión a partir de una molécula de ácido nucleico codificadora. La expresión recombinante tiene la ventaja de que la producción de la proteína es barata, segura, fácil y no implica el uso de compuestos tóxicos que pueden requerir la posterior eliminación.

Cuando se expresan en forma recombinante, el fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional se genera, preferentemente, mediante la expresión a partir de un ácido nucleico codificador en una célula huésped. Se puede usar cualquier célula huésped, en función de los requisitos individuales de un sistema concreto. Entre células huésped adecuadas se incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, levaduras y sistemas de baculovirus. Entre las líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo se incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de hámster recién nacido y muchas otras. Preferentemente se usan huéspedes bacterianos para la producción de proteína recombinante, debido a la facilidad con la que las bacterias se pueden manipular y cultivar. Un huésped bacteriano común preferido es E. coli.

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Preferentemente, si se produce de forma recombinante, el fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional se expresa a partir de un plásmido que contiene un inserto de ácido nucleico sintético. El sitio de la inserción en el plásmido de expresión en el que el ácido nucleico codificador de la proteína CD81 o su equivalente funcional se clona puede permitir la unión de la proteína a un marcador, tal como el péptido "bandera" o polihistidina. Esta organización facilita la posterior purificación de la proteína recombinante.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, también se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica el fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional, para usar en tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC. Preferentemente, el ácido nucleico codifica la proteína CD81 humana. Como será evidente para un experto en la técnica, tal molécula de ácido nucleico se diseñará usando el código genético de modo que se codifique la proteína o péptido que se desea. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede comprender ADN, ARN o ADNc y, adicionalmente, puede comprender análogos nucleotídicos en la secuencia de codificación. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico comprenderá ADN.

Las secuencias nucleotídicas incluidas dentro del ámbito de esta forma de realización de la invención son aquéllas que hibridan con el ácido nucleico que codifica el fragmento de proteína CD81 en condiciones estándar. Como se usa en la presente memoria descriptiva, condiciones estándar significa condiciones de mayor rigurosidad, por ejemplo 2 x ssc, 65ºC (donde ssc= NaCl 0,15M, citrato sódico 0,015M, pH 7,2).

Preferentemente, estas moléculas de ácido nucleico conservarán la capacidad de hibridar específicamente con ácido nucleico que codifica el fragmento de proteína CD81.

El ácido nucleico que codifica el fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional puede clonarse bajo el control de un promotor inducible, de modo que permite la regulación precisa de la expresión proteica. Sistemas inducibles adecuados serán bien conocidos para los expertos en la técnica.

Vectores adecuados para la expresión del fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional pueden seleccionarse a partir de fuentes comerciales o construidas con el fin de adaptarse a un sistema de expresión concreto. Dichos vectores contendrán secuencias reguladoras adecuadas, tales como secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadotas y genes marcadores. Los vectores pueden ser plásmidos o basados en virus. Para detalles adicionales véase Molecular Cloning: a laboratory manual (Sambrook y col., 1989). Muchas técnicas y protocolos conocidas para la manipulación de ácidos nucleicos y el análisis de proteínas se describen con detalle en "Short protocols in molecular biology", segunda edición, Ausubel y col. (John Wiley & Sons 1992).

Procedimientos para el aislamiento y la purificación de proteínas recombinantes serán bien conocidos para los expertos en la técnica y se resumen en, por ejemplo, Sambrook y col (1989). Particularmente, en bacterias tales como E. coli, la proteína recombinante formará cuerpos de inclusión dentro de la células bacteriana, lo que facilita su preparación. Si se producen en los cuerpos de inclusión, la proteína transportadora puede necesitar volverse a plegar hasta su conformación natural.

Adicionalmente, con el fin de ajustar con precisión las propiedades exactas del fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional, el experto en la técnica apreciará que se pueden realizar cambios a nivel nucleotídico a partir de las secuencias de CD81 conocidas, mediante adición, sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos. El procedimiento de preferencia usado para generar proteínas mutadas de acuerdo con la presente invención es la mutagénesis dirigida a sitio (MDS). En la actualidad, el experto en la técnica conoce muchas técnicas de MDS, incluida la mutagénesis dirigida a oligonucleótido usando PCR tal como han expuesto, por ejemplo, Sambrook et al., (1989), o usando kit comercialmente disponibles.

Se pueden escoger o construir vectores adecuados que contengan las secuencias reguladoras adecuadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras o genes marcadores y otras secuencias, según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo fagos, o fagemidos, según sea adecuado. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. En Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1992 se describen con detalle muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de constructos de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas. Las divulgaciones de Sambrook y col. y Ausubel y col. Se incorporan en la presente memoria descriptiva por referencia.

La invención también describe el tratamiento de una infección de VHC que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína CD81, o su equivalente funcional, eficaz para reducir la capacidad de infección del virus.

Dado que el mecanismo de infección del VHC parece depender, en parte, de la disponibilidad de un receptor de superficie celular, que hace disponible una forma soluble de la proteína CD81, o su equivalente funcional, actuará como antagonista de la unión del VHC al receptor celular, lo que reduce o previene el proceso de infección y, de este modo, se trata la enfermedad.

Una forma soluble adecuada de la proteína CD81, o su equivalente funcional, podría comprender, por ejemplo, una forma escindida de la proteína a partir de la cual se han eliminado uno o más de los dominios o dominio transmembrana TM1-TM4 bien mediante una etapa de escisión proteica o, por diseño, en una síntesis de ADN química o recombinante. La forma soluble preferida de la proteína comprende el dominio EC2 (residuos 113-201, como se identifica en la figura 1). El dominio EC1 puede actuar para incrementar la afinidad o especificidad de la proteína por el VHC.

Como alternativa, se podría usar una partícula híbrida que comprenda al menos una proteína formadora de partículas, tales como el antígeno de superficie de la hepatitis B, o un fragmento de la misma formador de partículas, en combinación con la proteína CD81 o su equivalente funcional, como antagonista de la unión del VHC al receptor celular.

La invención también describe un procedimiento para tratar una infección del VHC, que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que se une específicamente a la proteína CD81, tal como un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD81. El fundamento subyacente a esta estrategia terapéutica es que la unión del receptor de superficie celular a otro compuesto evitará la unión del VHC al receptor, lo que evita el proceso de infección y de este modo se trata la enfermedad.

La invención también describe una composición farmacéutica, que comprende una proteína CD81 o su equivalente funcional, opcionalmente en forma de sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también describe una composición farmacéutica, que comprende un compuesto que se une específicamente a la proteína CD81, opcionalmente en forma de sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada para administrar, incluidas las composiciones orales, parenterales y transdérmicas. La composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultánea o secuencialmente, dependiendo de la afección que se va a tratar.

También se describe un procedimiento para prepara la composición farmacéutica, en la que una proteína de la presente invención se asocia con un transportador farmacéuticamente aceptable.

La invención también describe el uso de una proteína CD81 o su equivalente funcional, o un compuesto que se une específicamente a la proteína CD81 para usar como producto farmacéutico. La invención también describe el uso de una proteína CD81 o su equivalente funcional, o un compuesto que se une específicamente a la proteína CD81 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VHC.

La capacidad de una proteína CD81 o su equivalente funcional para unirse al VHC permite el uso de la proteína como diagnóstico de la infección por VHC, por ejemplo en un ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima) o RIA (radioinmunoensayo).

Una forma soluble de la proteína podría usarse en, por ejemplo, una forma de ensayo ELISA para medir los anticuerpos neutralizantes en suero. Más preferentemente, los anticuerpos frente a CD81 serán adecuados para usar en este contexto, ya que estas moléculas serán anticuerpos anti-idiotípicos para el propio VHC.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un ensayo para anticuerpos frente al VHC en una muestra de suero, que comprende la etapa de permitir la unión competitiva entre los anticuerpos en la muestra, una cantidad conocida de una proteína del VHC y una cantidad conocida de un fragmento de una proteína CD81 o su equivalente funcional, tal como se ha descrito en la presente memoria descriptiva y medir la cantidad de la proteína conocida del VHC que se une al fragmento de proteína CD81.

Preferentemente, el fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional se inmoviliza sobre un soporte sólido y la proteína del VHC, que puede ser, adecuadamente, la proteína de la cubierta del VHC E2, opcionalmente proteína E2 recombinante, se marca. El marcador puede ser un marcador radioactivo, un péptido, un epítopo, una enzima, o cualquier otro compuesto bioactivo. Preferentemente, el marcador comprende una enzima.

En un ensayo de esta forma, la unión competitiva entre los anticuerpos y la proteína del VHC para la unión al fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional tiene como resultado que la proteína del VHC unida es una medida de anticuerpos en la muestra de suero, más particularmente, los anticuerpos neutralizantes de VHC en la muestra de suero.

Una ventaja significativa del ensayo es que se realiza la medición directa de la neutralización de los anticuerpos de unión (es decir, los anticuerpos que interfieren en la unión de la proteína de la cubierta del VHC al receptor celular). Tal ensayo, particularmente en forma de un ensayo ELISA, tiene considerables aplicaciones en el entorno clínico y en los análisis de sangre de rutina.

Asimismo, dado que el ensayo mide la neutralización del título de anticuerpos de unión, el ensayo forma una medida fácil de la posible eficacia de la vacuna, ya que la neutralización del título de anticuerpos de unión se correlaciona con la protección del huésped.

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En otro aspecto de la invención se proporciona un kit diagnóstico que comprende el fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Preferentemente, el kit también contiene al menos una proteína del VHC marcada, opcionalmente una enzima marcada. El kit también contiene otros componentes necesarios para el análisis de la presencia de VHC o anticuerpos anti-VHC en suero. Dichos componentes serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

La proteína CD81 o su equivalente funcional pueden usarse para detectar compuestos químicos que imitan la estructura de la superficie del VHC responsable de la unión al receptor del VHC.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la detección selectiva de compuestos químicos por su capacidad de unirse a la región del VHC responsable de la unión a una célula huésped, que comprende medir la unión de un compuesto químico que se va a someter a detección selectiva a un fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional tal como se describe en la presente memoria descriptiva. La célula huésped puede ser cualquier célula de mamífero, preferentemente una célula huésped humana.

Este aspecto de la invención abarca los productos del procedimiento de detección selectiva, solos o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con uno o más compuestos activos y/o en combinación con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. También se proporcionan procedimientos para preparar una composición farmacéutica en la que un compuesto químico identificado mediante el procedimiento de la invención se asocia con un transportador farmacéuticamente aceptable.

El compuesto químico puede ser una sustancia química orgánica y puede contener aminoácidos o análogos de aminoácidos. No obstante, preferentemente, el compuesto químico es un péptido, polipéptido o un polipéptido que se ha modificado químicamente para alterar sus propiedades específicas, tal como la afinidad de unión a la proteína CD81 o su equivalente funcional o su estabilidad in vivo.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un ácido nucleico que codifica un fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional tal como se describe en la presente memoria descriptiva para usar en el diagnóstico o tratamiento del VHC.

Se pueden efectuar cambios en el ácido nucleico a nivel nucleotídico mediante adición, sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos, en el que los cambios pueden o no reflejarse a nivel aminoacídico, en función de la degeneración del código genético.

El ácido nucleico puede incluirse en un vector, opcionalmente un vector de expresión que permite la expresión de un ácido nucleico en un huésped adecuado para producir la proteína CD81 o su equivalente funcional.

La identificación del ADN que codifica el receptor del VHC, a saber la CD81, pone a disposición todo el poder de la biología molecular para el análisis molecular del VHC y, en particular, su mecanismo infeccioso, lo que ofrece por primera vez la posibilidad de diseñar procedimientos para tratar el virus. Se pueden usar procedimientos de PCR para identificar las células que portan el receptor y las moléculas de ADN pueden diseñarse para que actúen como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a este respecto. Aunque la CD81 está muy extendida y está asociada con la función humana normal, la presente invención también describe moléculas antisentido que inhiben la producción de CD81 para usar en el tratamiento del VHC y en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infección por VHC.

Puede encontrarse que la identificación de polimorfismos en la proteína CD81 está asociada con la susceptibilidad a la infección por VHC y un pronóstico probable. En consecuencia, la identificación del gen que codifica el receptor del VHC permite la evaluación de polimorfismos presentes en la población humana.

La invención también describe un anticuerpo frente a la proteína CD81 o su equivalente funcional para usar en el tratamiento de una infección por VHC y en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección por VHC. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Tal anticuerpo se puede usar para bloquear temporalmente el receptor de CD81, lo que previene la infección por el VHC, por ejemplo, inmediatamente después de una infección accidental con sangre infectada por VHC.

En la actualidad, el único modelo animal disponible de infección por VHC es el chimpancé, que es una especie protegida. Los experimentos con estos animales implican una serie de dificultades que, juntas, tienen como resultado un gasto muy considerable (un experimento de un año con un chimpancé puede costar 70.000 \textdollar). En comparación, un modelo con ratones sería mucho más aceptable. Por desgracia, como se describe más adelante, el receptor del VHC, aunque ubicuo en seres humanos y encontrado en los chimpancés, está ausente en otros mamíferos. Un mamífero transgénico, por ejemplo un ratón, portador del receptor del VHC sobre la superficie celular, quizá expresado en cantidades mayores o menores de lo normal, sería muy beneficioso para la investigación del VHC y el desarrollo de vacunas. La expresión de proteínas CD81 mutantes sobre la superficie de las células también sería una útil herramienta de investigación.

De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un ratón transgénico portador de un transgen que codifica un fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

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El ratón transgénico puede portar uno o más transgenes para ayudar a mantener una infección por VHC.

También se proporciona un procedimiento para producir un animal transgénico que comprende la etapa de introducir en el interior del embrión de un ratón un ADN que codifica un fragmento de proteína CD81 o su equivalente funcional tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Preferentemente, la proteína CD81 o su equivalente funcional es una proteína CD81 humana.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una proteína proteína CD81 o su equivalente funcional para usar como inmunógeno protector en el control del VHC.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una alineación de secuencia que muestra la homología entre las secuencias Génicas de CD81 del ser humano, el chimpancé, el mono verde, el hámster, la rata y el ratón.

La figura 1A es una descripción esquemática de los ciclos primarios, secundarios y terciarios de detección selectiva.

La figura 1B es una descripción esquemática del último ciclo de detección selectiva.

La figura 2 es un análisis FACS de las células unidas a E2.

La figura 3 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión anti-CD81 a las células B mediante E2 recombinante. Los datos se expresan en forma de % de inhibición de la intensidad media de fluorescencia.

La figura 4 es una inmunotransferencia que muestra el reconocimiento de la fracción de proteína de membrana inmunoprecipitada por anticuerpos anti-CD81. Calle 2: E2 recombinante precipitada con antisuero de chimpancé frente a E2; calle 3, E2 recombinante precipitada con suero pre-inmune de chimpancé; calle 4: 20 \mug de AcMo anti-CD81 (clon JS81 Pharmingen) precipitado con IgG de cabra anti-ratón, calle 5: control (20 \mug de un anticuerpo monoclonal irrelevante, CD9 anti-humano, ATCC) precipitado con IgG anti-ratón de cabra unida a proteína A-sefarosa. Calle 1: control positivo, preparación de proteínas de membrana.

La figura 5 muestra las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del fragmento de EC2 clonado en in pTio-His C y la secuencia plasmídica en dirección 5' que codifican el extremo carboxilo de la tioredoxina y el sitio de escisión de la enteroquinasa.

La figura 6 muestra la aparición de una banda proteica de la masa molecular prevista para la tioredoxina-EC2 en el extracto de la muestra inducida.

La figura 7 es un gel teñido con azul de Coomassie que muestra la purificación de la tioredoxina-EC2.

La figura 8 representa la secuencia nucleotídica y aminoacídica deducida del fragmento EC2-His_{6} clonado en pGEX-KG, así como la secuencia plasmídica en dirección 5' que codifica el extremo carboxilo de GST, el sitio de escisión de la trombina y un pequeño espaciador de glicina.

La figura 9 representa un SDS-PAGE de proteínas totales del clon T0P10 de E. Coli que expresa GST-EC2-(His)_{6}.

La figura 10 es un SDS-PAGE teñido con azul de cómase, que muestra la escisión de trombina de GST-EC2-(His)_{6}
tras la purificación de la proteína en una columna de glutatión sefarosa.

La figura 11 muestra la inhibición dependiente de la dosis de la unión de E2 a células de hepatocarcinoma mediante molécula recombinante que expresa el bucle extracelular más importante (EC2) de la CD81 humana.

La figura 12 muestra la unión del VHC a la CD81.

Las figuras 13-17 muestran la construcción de vectores de ácido nucleico para usar en la generación de ratones transgénicos para el gen de la CD81 humana.

Descripción detallada de la invención Ejemplo 1 E2 recombinante, líneas celulares, ADN vector y anticuerpos usados en el presente estudio

La E2 recombinante usada en esta detección selectiva se produjo en células CHO (E2-CHO) (documento WO 97/09349). E2-CHO se une a la línea celular de linfoma de células T humanas Molt-4. Se identificó una sublínea de Molt-4 (denominada A2A6) expandiendo las colonias individuales de células Molt-4 y analizando la cantidad de E2-CHO que se ha unido a la superficie celular. Se descubrió que la sublínea A2A6 se unía más a la molécula E2-CHO sobre su superficie que su línea parental y, por tanto, se escogió como fuente de ARN, esperando que esta sublínea pueda tener una mayor representación del tránscrito que codifica la molécula de unión a E2. Estas células se escogieron usando un ensayo mediante el cual las células de linfoma de células B y T humanas y las líneas celulares de hepatocarcinoma se incubaron con E2 recombinante expresada en células de mamífero (CHO) tal como describen D. Rosa y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1759 (1996) y se tiñeron con anticuerpos anti-E2 marcados con biotina tal y como describen Rosa y col. (1996).Las células con la mayor capacidad de unión a E1 se clasificaron usando un FacsVantage (Becton Dickinson) y se subclonaron mediante dilución límite. Los clones en crecimiento se sometieron a detección selectiva para detectar la unión de E2 en el Facs y los clones con la mayor intensidad media de fluorescencia se expandieron todavía más.

WOP es una célula derivada de a N1H3T3 que expresa el antígeno T del polioma (L. Dallev y C. Basilico. J. Virol. 54, 739 (1985). En esta línea celular, los plásmidos que contienen el origen de replicación del polioma se pueden amplificar de forma episomal. El ADN recombinante construido con pCDM8 (Invitrogen) se puede recuperar de transfectantes seleccionados, que contienen el origen de replicación del polioma y está diseñado para la manipulación de bibliotecas de expresión en células eucarióticas.

Para la detección de E2-CHO unido en la superficie celular de los transfectantes se usó un anticuerpo anti-E2 monoclonal de ratón (291A2). Este anticuerpo se obtuvo del siguiente modo: Ratones BALB-c fueron inmunizados tres veces con E2 recombinante (10 \mug) en adyuvante completo de Freund. Las fusiones celulares entre células de bazo y células de mieloma no productor se realizaron de acuerdo con técnicas estándar. El sobrenadante de las fusiones se sometió a detección selectiva para detectar la unión a la E2 unida a las células Molt-4 con el fin de identificar anticuerpos monoclonales que se habían unido a un sitio expuesto sobre la molécula de E2. El anticuerpo más adecuado identificado de este modo se denominó 291A2.

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Ejemplo 2 Construcción de la biblioteca de ADNc

El ARN total se extrajo de la línea celular A2A6 de acuerdo con el procedimiento descrito por Chomczinsky y Sacchi (Chomezinsky, P. y Sacchi. N. (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159). Poli(A)+ se enriqueció dos veces usando oligo(dT)celulosa. Comenzando a partir de 2 \mug de este ARN como molde, El ADN complementario de doble cadena se sintetizó usando un kit de síntesis de ADNc Superscript II (Life Technologies) en presencia de cebadores oligo(dT) (100 ng) y hexámeros aleatorios (1100 ng). Los extremos del ADNc se convirtieron en romos con la ADN polimerasa T4 y se ligaron con un ligador BstXI, que permite la inserción del fragmento en el mismo sitio de restricción en la región de clonación múltiple del vector de expresión pCDM8. El ADNc ligado con un ligador se extrajo con fenol y se precipitó con etanol usando sulfato de amonio para eliminar los mononucleótidos libres, seguido por cromatografía en Sephacryl 500 (Lifetechnologies) para fraccionar por tamaño el ADNc. El fragmento de ADNc purificado sobre 500 pb se combinó y ligó con pCDM8 digerido con BstXI en una proporción molecular de aproximadamente 1:1. Esta reacción de ligación final se usó a partir de la transformación de E. coli MC1061/P3 mediante electroporación usando Gene-Pulser (BIORAD). Un total de 2x10^{6} ufc se amplificó y combinó en cultivos bacterianos líquidos en forma de una biblioteca de ADNc.

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Ejemplo 3 Detección selectiva de la biblioteca

El procedimiento de detección selectiva se basó en gran medida en el procedimiento descrito por Campbell y col. (Campbell, I. G., Jones, T.A., Foulkes, W. D. y Trowsdaie, J. Cancer Res. 51: 5329-5338, 1991). El enriquecimiento se llevó a cabo usando perlas magnéticas (del primero al tercer ciclo) (Figura 1A) y técnicas de barrido (el cuarto ciclo). (Figura 1B).

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3.1 El primer ciclo de detección selectiva

Se preparó un total de 375 \mug de ADN amplificado que representa 2x10^{6} de clones de ADNc independientes. En cada transfección se mezclaron 25 \mug de ADN con 10^{7} células WOP usando el electroporador Gene-Pulser (BIORAD) en las condiciones de 300V/500 \muF. Se realizaron quince grupos de transfecciones. Tras la transfección, Las células se incubaron a 37ºC durante 2 días y, después, las células se soltaron mediante tripsinización y se lavaron con PBS suplementado con 5% de FCS y EDTA 0,5 mM dos veces mediante centrifugación a 360 x g durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento celular se resuspendió en PBS suplementado con 5% de FCS y EDTA 0,5 mM (10^{7} células/ml) y, después, se añadió E2-CHO a la suspensión celular a una concentración de 10 \mug/ml. Las células se incubaron en hielo durante 60 minutos. Tras lavar dos veces con PBS suplementado con 5% de FCS y EDTA 0,5 mM, la suspensión celular se incubó con el anticuerpo 291A2 en hielo durante 30 minutos. Después de lavar dos veces con PBS suplementado con 5% de FCS y EDTA 0,5 mM, a la suspensión celular se añadieron 10 \mul de Dynabeads (DYNAL) acopladas con IG De cabra anti-ratón. La mezcla se agitó suavemente usando un mezclador Coulter (Coulter) durante 60 minutos a 4ºC. Las células unidas se separaron de las no ligadas usando un Concentrador Magnetic Particle Concentrator (DYNAL) siguiendo las instrucciones del fabricante, de este modo se enriquecen los transfectantes de unión a E2. El ADN plasmídico se recuperó de las células transfeccionadas unidas usando el protocolo descrito por Campbell y col. (Campbell, I. G., Jones, T.A., Foulkes. W. D. y Trowsdale, J. Cancer Res. 51: 5329-5338, 1991). E. coli MC1061/P3 se transformó con este plásmido mediante electroporación. A esta mezcla de ADN se hace referencia como la primera mezcla enriquecida (1º EP).

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3.2 El segundo ciclo de detección selectiva

Se preparó un total de 150 \mug de ADN amplificado derivado de la 1ª EP y se realizaron 6 grupos de transfección y los transfectantes se enriquecieron usando la misma condición que en la primera detección selectiva. A esta mezcla de ADN se hace referencia como la 2ª EP.

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3.3 El tercer ciclo de detección selectiva

Se preparó un total de 25 \mug de ADN amplificado derivado de la 2ª EP y se realizó un conjunto de la transfección. Los transfectantes se enriquecieron usando la misma condición que en la primera detección selectiva. Durante esta etapa de separación, los transfectantes formaron agregados, que podrían estar producidos por la expresión de moléculas de adhesión irrelevantes. Esto podría disminuir la eficiencia del enriquecimiento porque estos agregados contenían perlas magnéticas no específicas. Para superar este posible problema, los transfectantes, después de la segunda separación mediante Magnetic Particle Concentrator, se diluyeron y sembraron en placas Terasaki. Se mezclaron aproximadamente 100 de las células sencillas identificadas bajo el microscopio y se extrajo el ADN plasmídico de ellas. La mezcla de ADN preparada mediante esta etapa se denomina 3ª EP.

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3.4 El cuarto ciclo de detección selectiva

El anticuerpo monoclonal 291A1 se incubó en una placa de petri (90 mm) a una concentración de 10 \mug/ml durante la noche a 4ºC.

Se preparó un total de 25 \mug de ADN amplificado derivado de la 3ª EP y se realizó un conjunto de transfecciones. Las células transfeccionadas se incubaron con E2-CHO tal como se ha descrito en lo que antecede y se colocaron sobre las placas revestidas con 291A2 durante 60 minutos a 4ºC. Después de aclarar con un gran exceso de PBS suplementado con 5% de FCS y EDTA 0,5 mM dos veces, las células unidas se trataron directamente con la solución de lisado
y los plásmidos se extrajeron tal como se ha descrito en lo que antecede. Esta mezcla de ADN se denomina 4ª EP.

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3.4 Identificación de ADNc que codifica una molécula de unión a la E2 recombinante

Se aisló el ADN de colonias sencillas derivadas de la 4ª EP. Para cada preparación de plásmido se realizó una transfección sencilla usando las mimas condiciones que se usaron para las etapas anteriores de detección selectiva. La unión a E2 de los transformantes se detectó usando un fragmento de Fab monoclonal de IG anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina en lugar de las Dynabeads acopladas al anticuerpo. Los transfectantes de la 3ª y la 4ª EP también se analizaron del mismo modo. Las células unidas a E2 se detectaron con FACScan (Becton Dickinson) y se analizaron con el programa LYSIS II (Becton Dickinson) (Figura 2). La E2-CHO se une de forma creciente a medida que la etapa de purificación avanza. Un único clon P3 mostró una fuerte unión a E2.

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Ejemplo 4 Determinación y análisis de la secuenciación del ADN

P3 contiene un inserto de aproximadamente 1 kb. La secuencia de ADN del inserto del clon de ADNc que confiere unión a E2 a WOP tras la transfección se determinó mediante un sistema de secuenciación automática usando el cebador T7, cuya secuencia se localiza adyacente al sitio de clonación de pCDM8. La secuencia se sometió a detección selectiva en las bases de datos de GenBank usando los programas GCG en un ordenador UNIX. Este análisis reveló que la parte 5' del inserto P3 es idéntica a la CD81 humana (TAPA-1).

El análisis de restricción de P3 usando tres enzimas (BstXI), HincII y NcoI) también coincidió con el mapa de restricción del ADN c de la CD81 humana.

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Ejemplo 5 Unión de CD81 a la E2 recombinante

Se usaron anticuerpos anti-CD81 para evaluar la interacción entre E2 y CD81. Las células EBV-B se incubaron con concentraciones crecientes de E2 recombinante durante 1 hora a 4ºC y, después, se tiñeron con un anticuerpo monoclonal anti-CD81 (clon JS-81. Pharmingen). Como se muestra en la figura 3, se encontró que la E2 recombinante inhibía de forma competitiva la unión de anticuerpos anti-CD81 a las líneas de células B transformadas con EBV (células EBV-B). Los datos se expresan en forma de % de inhibición de la intensidad media de fluorescencia Rosa y col., 1996).

Además, la E2 reacciona en la transferencia de tipo western con material precipitado anti-CD81 (Figura 4). Esta figura muestra el reconocimiento de ''e de la fracción de la proteína de membrana inmunoprecipitada mediante anticuerpo anti-CD81. Aproximadamente 300 \mug del extracto de proteína de membrana preparados a partir de la línea celular A2A6 se solubilizaron en CHAPS 8 mM en PBS a pH 7,4, se incubaron con 10 \mug de E2 recombinante (calles 2 y 3), con 20 \mug con AcMo anti-CD81 (clon JS81; Pharmingen) (calle 4), o como control, con 20 \mug de un anticuerpo monoclonal irrelevante (CD9 antihumano, ATCC) (calle 5) durante 2 horas a 4ºC y, por último se precipitaron con antisuero de chimpancé frente a E2 (calle 2), suero de chimpancé pre-inmune (Calle 3) o IgG anti-ratón de cabra (calles 4 y 5) unida a la proteína A sefarosa (CL-4B. Pharmacia). El sedimento se disolvió en tampón Laemmli y se sometió a SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Tras electrotransferencia, la membrana de PVDF (Millipore) se incubó durante la noche con 1 \mug/ml de E2 recombinante a temperatura ambiente y durante 2 horas con anticuerpo monoclonal anti-E2 291A2. La unión de E2 a las proteínas inmunoprecipitadas se detectó con un anticuerpo policlonal conjugado con peroxidasa IgG anti-ratón (Amersham). Como control positivo, las proteínas de membrana también se cargaron en los geles (calle 1). La movilidad de los patrones de peso molecular está indicada en la izquierda en kilodalton.

La CD81 también se expresa con linfocitos y hepatocitos frescos, tal como se demuestra mediante tinción inmunohistoquímica con E2 marcada con biotina o anti-CD81 (datos no mostrados).

Para evaluar si la CD81 podría mediar en la internalización de ligandos, los inventores han explotado el hecho de que la CD81 forma un complejo con CD19 y CD21 sobre la superficie de los linfocitos B (D. T. Fearon y R. H. Carter, 1995, Annu. Rev. Immunol. 13, 127). Las células B se incubaron con E2 a 37ºC a tiempos diferentes, tras lo cual se midieron los niveles de CD19 o CD21 sobre la superficie celular mediante inmunofluorescencia. La incubación de las células con E2 tuvo como resultado la regulación por disminución tanto de CD19 como de CD21 (datos no mostrados). Por tanto, parece que la CD81 es capaz de mediar en la internalización de estos dos ligandos.

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Ejemplo 6 El mayor bucle extracelular de CD81 se une a la E2 recombinante y las partículas virales

Para mapear el dominio de CD81 que se une a la proteína E2, los esfuerzos de los inventores se centraron en el bucle extracelular hidrófilo EC2 de la proteína. Este fragmento se expresó en E. coli en forma de una proteína de fusión de tioredoxina-EC2 que tiene un lado enteroquinasa entre la tioredoxina y EC2 y como una proteína de fusión GST-EC2 que tiene un sitio de trombina entre GST y EC2 y una marca de hexa-histidina añadida al extremo carboxilo de la proteína. Los inventores muestran que ambas proteínas se expresan y son capaces de unirse a la E2 del VHC. En experimentos de competencia, los inventores también han mostrado que las proteínas de fusión purificadas y el fragmento EC2-His escindido de GST-trombina-EC2-(His)_{6} son capaces de inhibir la unión de E2 sobre la superficie de las células que expresan CD81.

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6.1 Clonación de EC2 en p-tio-His

La figura 5 muestra las secuencias nucleotídicas y aminoacídicas deducidas del fragmento de EC2 clonado en in pThio-His C y la secuencia plasmídica en dirección 5' que codifican el extremo carboxilo de la tioredoxina y el sitio de escisión de la enteroquinasa. Como se ha mostrado, EC2 está condensada en el marco con la tioredoxina a través del sitio de la enteroquinasa, que se puede explotar para eliminar la tioredoxina de la proteína de fusión.

El fragmento que codifica EC2 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pCDM8/P3 usando los oligodesoxinucleótidos siguientes:

1

Usando las técnicas de clonación estándar (Sambrook y col., 1989), el producto de la PCR se sometió a digestión doble con XhoI y HindIII, se ligó a p-tio-His C (Invitrogen) digerida con las mismas enzimas de restricción y se transformó en las células Top10 E. coli. Tras la selección de los transformantes mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación de ADN de los plásmidos, se identificó un constructo correcto que codifica la proteína de fusión
EC2-sitio de tioredoxinenteroquinasa prevista. Los lotes de glicerol de clones seleccionados se almacenaron a -80ºC.

Los extractos de proteína total del clon que expresa tioredoxina-EC2 antes y después de la adición de IPTG se sometieron a SDS-PAGE para analizar la expresión de proteínas. La figura 6 muestra claramente la aparición de una banda proteica de la masa molecular (23,4 kDa) prevista en el extracto de la muestra inducida. La figura también muestra la reactividad de la proteína de fusión con E2. Se indujeron un clon de TOP10 E. coli que contiene el plásmido pTio-hisC-EC2 y un clon TOP10 que contiene el plásmido pTio-HisC desprovisto del inserto, se prepararon extractos de proteína soluble a partir de ambos clones y se sometieron a transferencia de tipo Far Western con la proteína E2. Para esta transferencia, las muestras de proteína se llevaron a un tampón de muestra de carga 1x (LSB) (5% p/v SDS, 10% v/v de glicerol, Tris-HCl 62,5 mM, azul bromofenol 0,05%) usando una solución 3x LBS. Las muestras se pasaron a un gel de poliacrilamida al 15% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). La membrana se incubó durante 30 minutos en solución de bloqueo (PBS al 10%, p/v leche desecada sin grasa, 0,05% v/v de Tween 20). Tras una incubación de 15 horas a 4ºC con solución de bloqueo que contiene 1 \mug/ml de CHO-E2, las membranas se incubaron durante 2 horas con el anticuerpo monoclonal anti-E2 291A2 diluido a 1:250 y durante 1 hora con un anticuerpo Ig anti-ratón de cabra peroxidado (Sigma) diluido a 1:2000. Se realizaron tres etapas de lavado entre todas las etapas de incubación usando solución de bloqueo, que también se uso para diluir los anticuerpos. Tras un lavado final con PBS, las membranas se incubaron durante 1 minuto con luminol (ECL, Amersham) y se expusieron en Hyper-film (Amersham).

Como se puede apreciar a partir de estas figuras, una banda correspondiente al peso molecular de tioredoxina-EC2 fue visible en la calle en la que se cargaron las proteínas solubles del ptio-HisC-EC2. Tal banda estaba ausente en la calle en la que se cargaron las proteínas solubles del clon ptio-HisC.

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6.2 Purificación de tioredoxina-EC2

Para la purificación de la tioredoxina-EC2 se desarrolló el siguiente procedimiento:

1) shock osmótico de las células. 2) precipitación de proteínas con 30% de saturación con sulfato amónico; y 3) IMAC. Tras el shock osmótico, aproximadamente el 50% de la proteína de fusión se liberó de las células junto con las proteínas contaminantes. La precipitación son sulfato amónico tuvo como resultado un sedimento que contenía tioredoxina-EC2 desprovista del grueso de las proteínas contaminantes. El IMAC del precipitado resuspendido tuvo como resultado una proteína de fusión con una pureza de aproximadamente un 85% evaluada mediante SDS-PAGE. Con este procedimiento, los inventores purificaron 5 mg de tioredoxina-EC2 a partir de un litro de cultivo. Este procedimiento se indica con detalle más adelante.

El clon de E. coli que expresa tioredoxina-EC2 se inoculó en 500 ml de medio LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. A una DO^{600}= 0,5, al cultivo se añadió IPTG 0,5 mM y el crecimiento continuó a 37ºC durante 3,5 horas adicionales. Después, el cultivo se centrifugó a 4000 x g durante 10 minutos a 4ºC, el sedimento celular se resuspendió con 50 ml de solución hipertónica en hielo frío (Tris-HCl 20 mM, EDTA 2,5 mM, sacarosa al 20%, pH 8) y se dejó en hielo durante 10 minutos. Las células resuspendidas se centrifugaron de nuevo como se ha indicado en lo que antecede y el sedimento se resuspendió en tampón hipotónico (Tris-HCl 20 mM, EDTA 2,5 mM, pH 8) para producir un shock osmótico en las células. Tras 20 minutos a 0ºC, la suspensión se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4ºC, el sobrenadante se llevó a 30% de NH_{2}(SO_{4})_{2} usando una solución saturada a temperatura ambiente de la sal. La suspensión se incubó durante la noche a 4ºC y después se centrifugó a 10.000 x g durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió usando 15 ml de tampón fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, a pH 6, se aclaró mediante centrifugación y se cargó en una columna 2 mi de columna de sefarosa quelante activada con níquel de flujo rápido (Pharmacia) equilibrada en el mismo tampón.

Tras la adsorción, la columna se lavó con 10 ml del tampón de equilibrio (caudal 0,5 ml/min) y después la tioredoxina-EC2 se eluyó usando un gradiente de 30 ml de imidazol 0-50 mM en tampón fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, a pH 6, seguido por una elución isocrática con 10 ml de imidazol 400 mM. Se recogieron fracciones de 2,4 ml. Las fracciones que contenían la proteína recombinante se mezclaron, dializaron frente a PBS y almacenaron a -20ºC. Las proteínas se analizaron por medio de SDS-PAGE y el contenido proteico se analizó mediante el método de Bradford usando BSA como patrón proteico.

La tioredoxina-EC2 purificada se muestra en la figura 7.

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6.3 Clonación de EC2-(His)_{6} in pGEX-KG

La figura 8 representa la secuencia nucleotídica y aminoacídica deducida del fragmento EC2-(His)_{6} clonado en pGEX-KG, así como la secuencia plasmídica en dirección 5' que codifica el extremo carboxilo de GST, el sitio de escisión de la trombina y un pequeño espaciador de glicina. Como se ha mostrado, EC2 está condensada en el marco con GST a través del sitio de la trombina, que se puede explotar para eliminar la GST de la proteína de fusión. El espaciador rico en glicina, localizado entre el sitio de trombina y EC2, facilita la escisión de la proteína de fusión mediante trombina (Guan, K.L., y Dixon, J.E. (1991) Anal. Biochem. 192, 262-267).

El fragmento que codifica EC2 se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pCDM8/P3 usando los oligodesoxinucleótidos siguientes:

2

El producto de la PCR se digirió con XhoI y HindIII, se ligó en pGEX-KG (Guan. K. L. y Dixon. J. E. (1991) Anal. Biochem. 192, 262-267) digerido con las mismas enzimas de restricción y se transformó en células TOP10 E. coli.

Tras la selección de los transformantes mediante análisis con enzimas de restricción y secuenciación de los nucleótidos de los plásmidos, se encontró que un plásmido con el tamaño previsto del inserto tenía también la secuencia de EC2-(His)_{6} correcta en el marco con la secuencia codificadora en dirección 5' de trombina y GST. El plásmido preparado a partir del clon TOP10 seleccionado se transformó después en células BL21. Los lotes de glicerol de clones seleccionados se almacenaron a -80ºC.

La figura 9 representa un SDS-PAGE de proteínas totales del clon TOP10 E. coli que expresa GST-EC2-(His)_{6}.
Este análisis muestra claramente que en el extracto de la muestra inducida había una banda de proteína con la masa molecular prevista (39 kDa). La correspondiente transferencia de tipo Far Western muestra claramente que E2 reacciona específicamente con la proteína de fusión.

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6.4 Purificación de GST-EC2-(His)_{6}

La proteína de fusión GST-EC2-(His)_{6} se purificó en una columna de glutatión sefarosa y se digirió con trombina (Figura 10). Tras la digestión, el resto EC2-(His)_{6} se purificó adicionalmente mediante dos etapas cromatográficas adicionales consistentes en una columna de glutatión sefarosa para eliminar el fragmento GST y cromatografía MAC. Este procedimiento se detalla más adelante.

Una única colonia de un clon de E. coli que expresa la proteína de fusión GST-EC2 se inoculó en 10 ml de LB, 100 \mug/ml de Amp y las células se cultivaron durante la noche a 37ºC. Después, el cultivo se inoculó en 500 ml de medio y cuando se alcanzó una DO_{600}= 0,5, se añadió IPTG 0,5 mM. Tras 3,5 horas, las células se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron con 9 ml de PBS y se rompieron en dos pases a 124,1 MPa usando una prensa francesa (SLM Aminco). El lisado se centrifugó a 30.000 x g y el sobrenadante se cargó en una columna de 1 ml de glutatión sefarosa 4B (Pharmacia) equilibrada en PBS.

La columna se lavó con 10 ml de PBS y se eluyó con 4 ml de Tris-HCl 50 mM, glutatión reducido 10 mM a pH 8. Las proteínas eluidas se dializaron frente a PBS y se almacenaron a -20ºC.

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6.5 Digestión de GST-EC2-(His)_{6} con trombina y purificación de EC2-(His)_{6}

9,6 mg de proteína recuperada de la columna de glutatión sefarosa se digirieron con 22 unidades de trombina (Pharmacia) durante 8 horas a temperatura ambiente, después, la enzima se inactivó usando PMSF 0,13 mM (Sigma). A continuación, la mezcla de reacción se dializó frente a PBS y se cargó en 0,5 ml de columna de GST-sefarosa equilibrada en PBS. La columna se lavó con 1 ml de PBS. El caudal y el lavado se mezclaron y cargaron en 0,250 ml de columna de sefarosa quelante activada con níquel. EC2-(His)_{6} se recuperó de la columna eluyendo con 1 ml de tampón fosfato 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 400 mM a pH 7,8. Después, se realizó una diálisis frente a PBS.

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Ejemplo 7 Unión del fragmento de CD81 al virus

Las proteínas que contienen el bucle EC2 de CD81 humano pero no el de ratón, se unieron a E2 en la transferencia de tipo western (datos no mostrados) e inhibieron la unión de E2 a las células humanas (Figura 11). Las proteínas quiméricas recubrieron perlas de poliestireno y se incubaron con un plasma infeccioso que contenía cantidades conocidas de moléculas de ARN viral. Después de lavar, el virus asociado con las perlas se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa para la cantidad de ARN del VHC unida. Este experimento se realizó tal como se expone a continuación.

Las perlas de poliestireno (diámetro de 0,63 cm) (Pierce) fueron recubiertas durante la noche con proteína recombinante EC2 purificada en tampón citrato a pH 4 a temperatura ambiente. Tras la saturación durante una hora con BSA al 2% en TrisHCl 50 mM, a pH 8, EDTA 1 mM, tampón NaCl 100 mM (TEN), cada perla se incubó a 37ºC durante 2 horas en 200 \mul de plasma infeccioso de chimpancé diluido con TEN que contenía 5 x 10^{5} moléculas de ARN del VHC.

Para los experimentos de inhibición, las perlas de poliestireno recubiertas con EC2 se incubaron con 10 \mug/ml de anticuerpos monoclonales purificados durante una hora a temperatura ambiente antes de la incubación con el virus. Cada perla se lavó 5 veces con 15 ml de tampón TEN en un lavador automático (Abbot) y el ARN viral se extrajo usando el kit de extracción viral (Qiagen). El ARN (8 ml) se sometió a transcripción inversa a 42ºC durante 90 minutos en 20 ml de tampón A (Perkin Elmer Taq Man) que contenía 100 pmol del cebador antisentido del VHC CGGTTCCG
CAGACCACTATG, 40 U de ARNsin (Promega), 5 nmol de dNTP, 110 nmol de MgCl_{2}, 104 M-MuRT ((Boheringer), el ADNc (20 ml) se amplificó usando un sistema de detección de secuencia Perkin-Elmer ABI 7700 (45 ciclos) en 50 ml de tampón A que contiene 100 pmol del cebador sentido del VHC TCTTCACGCAGAAAGCGTCTA, 5 pmol de la sonda de detección fluorescente 5'(FAM)TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGA (TAMRA) (amablemente proporcionada por David Slade Pharmacia and Upjohn)., 15 nmol de dNTP, MgCl_{2} y 1,25 U de Taq Gold (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Todas las reacciones se cuantificaron usando plasma infectado por VHC (genotipo 1a) (título de ADNb de 30 mEq/ml) para generar una curva estándar. El software para detección de secuencia de Perkin-Elmer se ha descrito previamente (U. E. Gibson, C. A. Heid y P. M. Williams, Genome Res. 6. 995 (1996)).

Como se muestra en la figura 12, las moléculas que contienen el bucle extracelular de CD81 humana se unieron al VHC de un modo dependiente de la concentración y la pre-incubación de las proteínas quiméricas con anticuerpos anti-CD81 inhibió la unión al virus. Además, el suero de chimpancés que estaban protegidos de la exposición homóloga por vacunación con el heterodímero recombinante de la cubierta E1/E2 (Q.-L. Choo y col. Proc. Natl. Acad. Set. USA 91, 1294 (1994)) inhibió completamente la unión del VHC a las perlas recubiertas con CD81, mientras que el suero de animales vacunados y no protegidos no lo hizo (datos no mostrados).

Estos datos demuestran que la expresión de CD81 humana, y en particular de su bucle extracelular más grande, basta para unirse no sólo a E2 sino también a las partículas de VHC. Dada la amplia distribución de la CD81 (S. Levy. S. C. Todd y H. T. Maecker, Annu. Rev. Immunol. 16, 89 (1998), estos resultados implican que el VHC se une y puede pasar al interior a través de varias células distintas a los hepatocitos. De hecho, el ARN del VHC se ha encontrado en los linfocitos T y B y en los monocitos (K. Blight, R. R. Lesniewski, J. T. LaBrooy y E. J. Gowans. Hepatology 20, 553 (1994); P. Bouffard y col., J. Infect. Dis. 166, 1276 (1992); Zignego y col., J. Hepatol. 15, 382 (1992)). Si a la unión del virus le sigue la entrada e infección en todos los tipos de células no está claro debido a la falta de un eficiente sistema de cultivo del VHC in vitro. Podría ser que el CD81 fuera un receptor de unión al VHC y que sean necesarios factores adicionales para la fusión viral o la infectividad del virus.

CD81 participa en diferentes complejos moleculares sobre diferentes tipos celulares, un hecho que puede influir sobre su capacidad para servir como receptor para la infección del VHC o emitir señales reguladoras hacia las células diana. Por ejemplo, se asocia con las integrinas sobre las células epiteliales o hematopoyéticas (F. Berditchevski, M. Zutter y M. E. Hemler. Mol. Biol. Cell 7, 193 (1996); B. A. Mannion. F. Berditchevski, S.-K. Kraeft, L. B. Chen y M. E. Hemler, J. Immunol. 157, 2039 (1996)), mientras forma parte de un complejo de señalización que contiene CD21, CD19 y Leu13 sobre las células B (L. E. Bradbury, G. S. Kansas. S. Levy, R. L. Evans y T. F. Tedder J. Immunol. 149, 2841 (1991)). Se ha demostrado que este complejo facilita la estimulación antigénica específica mediante la disminución del umbral de activación de las células B (D. T. Fearon y R. H. Carter. Annu. Rev. Immunol. 13, 127 (1995)). Cabe observar que parece que el VHC usa una molécula que es parte del mismo complejo que contiene el receptor del EBV (CD21) (N. R. Cooper. M. D. Moore y G. R. Nemerow. Annu. Rev. Immunol. 6, 85 (1988)), y la capacidad del EBV para activar e inmortalizar los linfocitos B está bien documentada.

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Ejemplo 8 Construcción de transgenes

Los siguientes constructos se diseñaron y fabricaron con el fin de generar ratonas transgénicos para el CD81 humano.

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1. Adición de señales de corte y empalme y de poliadenilación del gen de la beta-globina de conejo al fragmento de ADNc del CD81 humano

El fragmento del ADNc del CD81 humano del clon pCDM8/P3 se transfirió a un vector pBluescript KS II(+) (Stratagene) y después se insertó en el plásmido pSPP (derivado del vector de expresión BMGSC, cedido amablemente por el Dr. Karasuyama, Basel Institute for Immunology) entre dos fragmentos, uno que contiene el segundo intrón y el otro que contiene la señal de poliadenilación del gen de la beta-globina de conejo (posición 902-1547 y 1543-2081), respectivamente, nº de registro en GenBank M12603) (pSR1P en la figura 11). El fragmento de ADN recombinante resultante se escindió del vector pBluescript KSH(+) (Stratagene) mediante SalI (en el extremo 5') y BamHI (en el extremo 3').

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2. Creación de un transgen para la expresión ubicua del CD81 humano

El fragmento SalI-BamHI del inserto pSRI P se insertó en los sitios de restricción compatibles de pCAGmcs, un plásmido modificado de pCAGGS (cedido amablemente por el Dr. Miyazaki de la Osaka University, Japón, con autorización restringida), que contiene el promotor de pollo de la beta-actina y el potenciador del citomegalovirus humano ((Niwa, H. y col., Gene 108, pág. 193 (1991). (pCAGSR1Pp en la figura 12). El fragmento de 3,8 kb EcoRI-BamHI se sometió a inyección del cigoto.

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3. Creación de un transgen para la expresión específica en hígado del CD81 humano

El sitio SalI de pSRIP se convirtió en un sitio BamHI mediante ligación con ligante BamHI tras la formación de extremos romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli. Este fragmento BamHI se insertó en el sitio BumHI del plásmido ALB e/p, que porta el promotor y el potenciador de la albúmina de ratón (Pinkert. C.A. y col., Genes Dev. 1, pág. 268 (1987) (recibido del Dr. F. Chisari, Scripps Research Institute. La Jolla, San Diego). (pAIbSR1P en la figura 13). El fragmento NotI-EcoRV de 4,5 kb se sometió a inyección en el cigoto.

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4. Creación de un transgen para la expresión específica en los linfocitos B del CD81 humano

El fragmento BamHI de 700 pb del potenciador de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón (cedido amablemente por el Dr. A. Kudo, Basel Institute for Immunology) y el fragmento XbaI-SacI de 2,3 kb del promotor de la cadena ligera kappa de ratón se subclonaron en un vector pBluescript KSH(+). El sitio SacI se convirtió en un sitio HindIII mediante ligación con ligante HindIII descrita en lo que antecede. El sitio BamHI de pCAGSR1P se convirtió primero en un sitio NotI. Después, la región promotora del constructo pCAGSR1P modificado se eliminó mediante digestión con enzimas de restricción EcoRI-HindIII y se sustituyó con el fragmento promotor-potenciador de la inmunoglobulina. (pEhKpSR1P en la figura 15). El fragmento de 5,2 kb EcoRI-BamHI se sometió a inyección del cigoto.

En conjunto, nuestros datos indican que el CD81 es un receptor de unión para el VHC y puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la patogenia de la infección por VHC. Dado que el CD81 se asocia con un complejo de activación sobre la superficie de las células B, el presente hallazgo puede explicar la patogenia de la crioglobulinemia asociada con el VHC, aunque no haya replicación viral en las células B. Además, la identificación de la interacción entre el VHC y el CD81 puede ayudar a mapear epítopos neutralizantes conservados sobre la cubierta del virus que deberían ser importantes para desarrollar vacunas eficaces y proporcionar un receptor señuelo para la neutralización viral.

Claims (17)

1. Un fragmento EC2 de la proteína CD81, que consta de los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humano enumerado en la base de datos SWISSPROT (nº de registro P18582) o la base de datos EMBL/GENBANK (nº de registro M33680), o que tiene, al menos, una homología del 80% con los aminoácidos 113-201 de la secuencia de CD81 humana, en la que la homología se define usando el paquete de software de análisis de secuencia Pileup (Wisconsin, 1996), para usar en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

2. Un fragmento de acuerdo con la reivindicación 1, que es un análogo funcionalmente equivalente de CD81 obtenido mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos mediante deleciones, sustituciones o adiciones de uno o más aminoácidos, de modo que el análogo de la proteína conserva la capacidad para unirse a la proteína E2 del VHC, para su uso en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

3. Una composición farmacéutica que comprende un fragmento de una proteína CD81 de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

4. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica según se define en la reivindicación 3, en la que un fragmento de una proteína CD81 se pone en asociación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

5. Uso de un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o diagnóstico de una infección por VHC.

6. Un ensayo para anticuerpos del VHC presentes en una muestra de suero, que comprende la etapa de permitir la unión competitiva entre los anticuerpos en la muestra, una cantidad conocida de proteína del VHC y una cantidad conocida de un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y medir la cantidad de la proteína conocida del VHC que se une al fragmento de la proteína CD81.

7. Un ensayo para el VHC en una muestra de suero, que comprende la etapa de permitir la unión competitiva entre los anticuerpos en la muestra y una cantidad conocida de un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y medir la cantidad de la proteína CD81 unida conocida.

8. Un kit diagnóstico que comprende un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, opcionalmente marcado.

9. Un kit diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el marcador comprende un marcador radioactivo, un péptido, un epítopo, una enzima u otro compuesto bioactivo.

10. Un procedimiento para la detección selectiva de compuestos químicos según su capacidad para unirse a la región del VHC responsable de la unión a una célula huésped, que comprende medir la unión de un compuesto químico que se va a someter a detección selectiva a un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

11. Un ratón transgénico, que porta un transgen que codifica un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

12. Un procedimiento para producir un ratón transgénico, que comprende la etapa de introducir en el embrión de un ratón un ADN que codifica un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

13. Una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

14. Una molécula de ácido nucleico que hibrida con una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 13 en condiciones restrictivas elevadas (2 x ssc, 65ºC) para su uso en el tratamiento o diagnóstico de la infección por VHC.

15. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, que comprende ADN.

16. Un fragmento de una proteína CD81 según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para su uso como inmunógeno protector en el control de infección por VHC.

17. Una proteína de fusión que comprende un fragmento de una proteína CD81, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento o diagnóstico de infección por VHC.