KR20010005529A

KR20010005529A - 덴드로아스핀 스캐폴드에 기초한 이 또는 다기능성 분자

Info

Publication number: KR20010005529A
Application number: KR1019997008588A
Authority: KR
Inventors: 루신지에; 스컬리마이클핀바아; 카케어비제이비어; 아우시칼반트싱
Original assignee: 카카 산자이 케이; 트라이젠 리미티드
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-20
Publication date: 2001-01-15
Also published as: JP2001518801A; NZ337639A; AU6511798A; AU735427B2; WO1998042834A1; GB9705787D0; US6451976B1; EP0972034A1; CN1251133A; BR9808376A; CA2284095A1

Abstract

본 발명은 폴리펩타이드 뉴로톡신 유사물질인 덴드로아스핀을 재조합 DNA 방법, 특히 "루프 이식"에 의해 변형시킨 변형된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 변형된 폴리펩타이드는 피브리노겐에 혈소판 유착과 같은 덴드로아스핀 활성을 보유하도록, 또한 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF) 활성 또는 히루딘 활성과 같은 덴드로아스핀 본래의 활성이 아닌 생물학적 또는 생화학적 활성을 하나 이상 더 갖도록 제조된다.

Description

덴드로아스핀 스캐폴드에 기초한 이 또는 다기능성 분자{Bi- or multifunctional molecules based on a dendroaspin scaffold}

혈액 응고의 역할은 지혈작용이 있는 플러그의 고형화 및 안정화를 위한 비용해성 피브린 매트릭스를 제공하는 것이다. 일정 범위의 혈장 단백질이 관련되어 있는 일련의 생화학적 상호작용에 의해 교차 결합된 피브린 덩어리가 형성된다.

심근경색(myocardial infarction), 뇌졸중(stroke), 폐의 색전증(pulmonary embolism), 심 정맥 혈전증(deep vein thrombosis) 및 말초 동맥 폐색(peripheral arterial occlusion)과 같은 급성 혈관 질환은 혈전에 의해 혈관의 일부 또는 전체가 폐색되어 발생된다.

혈관 내에 혈전의 형성은 혈전증이라 불리워지며, 혈소판의 응집에 의존한다. 혈관 손상과 관련해서(외과적 시술에서 발생하는 것과 같은), 손상된 혈관의 내피 조직(endothelial)의 표면과 혈액 혈소판의 상호작용 및 다른 혈소판과 혈액 혈소판의 상호작용은 혈전 또는 혈병 형성 과정의 중요한 인자이다.

현재 아스피린, 디피리다몰 및 필로디핀과 같은 다양한 혈전 형성 방지제가 사용되고 있다. 일반적으로 이러한 혈전 형성 방지제는 혈소판의 활성 및 응집을 억제하거나 혈액 응고 과정을 늦추거나 하지만, 이것들은 출혈 시간을 연장시키는 잠재적인 부작용이 있다. 더더욱 이러한 혈전 형성 방지제의 효과는 단지 혈소판이 새롭게 형성되거나 제공됨에 의해 역전될 수 있다.

혈소판 응집은 혈소판 혈장 막 상의 당단백질(glycoprotein) 수용체인 IIb/IIIa 복합체에 피브리노겐과 다른 혈청 단백질이 결합하는 것에 의존한다. GP IIb/IIIa는 인테그린으로 알려진 세포 유착 수용체 군의 하나인데, 이들의 대부분은 Arg-Gly-Asp(RGD) 트리펩타이드 인식 서열을 인식하는 것으로 알려져 있다.

헤파린과 저분자량의 헤파린들은, 예를 들어 정맥 혈전색전증(venous thromboembolism)과 같은 혈전의 형성과 팽창을 일으키는 트롬빈 활성화 상태를 치료하는데 널리 사용되고 있다. 헤파린은 효과적이지만, 출혈과 혈소판 감소증을 포함하여 바람직하지 않은 많은 부작용을 일으킨다. 그러므로, 더욱 특이적이고 부작용이 덜한 항응고제의 개발이 요구된다.

트롬빈을 직접 억제하는 제제가 이용될 수 있는데, 그 예로는 히루딘, 히루겐, 히루로그(히루겐과 히루로그는 합성 히루딘 유도체임), PPACK(합성 트리펩타이드) 및 아르가트로반(아르기닌 유도체)를 들 수 있다. 이러한 억제제의 작용에 대해서는 문헌(Lefkovits J ＆ Topol E J(1994), Culation 90:1522-1536)에 기재되어 있다. 이론적인 것에 불과하지만, 그들의 단-표적 특이성(mono-target specifity), 혈소판에 미치는 직접적 영향의 부재 및 짧은 반감기 때문에, 트롬빈을 적접 억제하는 제제는 다른 트롬빈 억제제에 비해 출혈 위험은 적으나 여전히 출혈은 가장 걱정되는 부작용으로 남아 있다. 개발된 다른 트롬빈 억제제(상기 문헌의 테이블 1에 목록화되어 있음)가 있으나 ,독성이 강해 임상에 적용할 수 없는 것으로 판명되었다.

일반적으로 동맥 경화증에 의해 발생되는 동맥이 부분적으로 좁아지는 경우에는 풍선 혈관 성형술(ballon angioplasty)에 의해 외과적으로 치료할 수 있다. 이러한 방법은 침습적이며 동맥 벽의 조직에 손상을 주어 혈전을 형성시킬 수 있다. 동맥 벽의 피브로넥틴과 같은 세포외 단백질이 동맥의 혈액 내로 노출되게 된다. 혈소판은 인테그린 수용체를 통해 피브로넥틴의 RGD 모티프에 결합하게 되는데, 이에 의해 순차적으로 혈소판의 응집이 일어나고 단계적인 혈전형성 기전이 시작되게 된다. 손상 부위에서의 혈소판 응집과 혈전 형성을 특이적으로 억제하는 제제가 요구된다. 이러한 억제제는 무독성이고, 일반화된 출혈의 위험과 같은 바람직하지 않은 부작용이 없어야 한다.

인테그린은 서로 다른 세포 또는 세포외 매트릭스에 세포의 유착을 매개하는 세포 표면 수용체 집단이다(Kieffer N ＆ Phillps D R (1990) Annu Rev Cell Biol 6: 329-357; Hynes R O (1992) Cell 69: 11-25; McEver R P (1992) Curr Opin Cell Biol 4: 840-849; Smyth S S et al (1993) Blood 81: 2827-2843; Gioncotti F G ＆ Mainiero F (1994) Biochim Biophys Acta 1198: 47-64). 인테그린은 비공유적으로 결합된 α와 β 막통과(transmembrane) 서브유니트로 구성되어 있다. 16개의 다른 α와 8개의 다른 β 서브유니트가 헤테로다이머화(heterodimerise)되어 약 20개의 다른 종류의 수용체가 생성된다(Clark E A ＆ Brugge J S (1995) Science 268: 233-239). 혈소판 막 인테그린 α_IIbβ₃은 가장 특징적인 인테그린의 하나이다. 세포 활성화 과정에서, α_IIbβ₃인테그린은 주로 피브리노겐(Nachman R N ＆ Nachman L L K (1992) J Clin Invest 69: 263-269), 피보로넥틴(Gardner J M ＆ Hynes R O (1985) Cell 42: 439-448), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) (Ruggeri Z et al (1983) J clin Invest 72: 1-12), 비트로넥틴(Pytela R M et al (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 5766-5770) 및 트롬보스포딘(Karczewski J et al (1989) J Biol Chem 264: 2132-21326)에 존재하는 Arg-Gly-Asp (RGD) 트리펩타이드 서열(Pierschbacher M D ＆ Rouslati E (1984) supra; Plow E F et al (1987) Blood 70: 110-115: Pytela R et al (1986) Science 231: 1559-1562)을 통해 몇개의 당단백질과 결합한다. 이러한 당단백질 리간드와 그것들의 인테그린 수용체 사이의 상호작용의 특성은 복잡한 것으로 알려져 있고, 구조적 변화는 수용체(Sims P J et al (1991) J Biol Chem 266: 7345-7352)와 리간드(Ugrova T et al (1995) Tromb Haemotsasis 74: 253-257) 둘다에서 일어나는 것으로 알려져 있다.

최근, 다양한 뱀독으로부터의 많은 단백질이 혈소판 응집과 인테그린-의존 세포 유착에 대한 효과적인 억제제인 것으로 확인되었다. 높은 서열 상동성을 갖는 소위 "디스인테그린(disintegrin)"이라 불리우는 집단에 속하는 이러한 단백질 중의 대다수는 작고(4-8 KDa), 시스테인이 풍부하고, RGD 서열(Gould R J et al (1990) Proc Soc Exp Biol Med 195: 168-171) 또는 KGD 서열(Scarborough R M et al (1990) J Biol Chem 266: 9359-9362)을 포함한다. 디스인테그린 집단뿐만 아니라, 유사한 억제 효능, 높은 수준의 디설파이드 결합 및 작은 크기를 가진 다수의 비-디스인테그린 RGD 단백질이 코브라과(Elapidae)의 뱀독(McDowell R S et al (1992) Biochemistry 31: 4766-4772; Williams J A et al (1992) Biochem Soc Trans 21: 73s)과 거머리의 뱀독 유사물질(Knapp A et al (1992) J Biol Chem 267: 24230-24234)로부터 분리되었다. 이러한 단백질 모두는 단순한 선형의 RGD 펩타이드를 가진 억제제보다 당단백질 리간드와 인테그린 수용체의 상호작용에 대해 약 1000배 이상의 억제 효능을 가진다; 이러한 양상은 단백질 스캐폴드 내에 위치하는 RGD 모티프의 최적의 바람직한 구조에 기인한다. 키스트린(Alder M et al (1991) Science 253: 445-448; Alder M ＆ Wagner G (1992) Biochemistry 31: 1031-1039; Alder M et al (1993) Biochemistry 32: 282-289), 플라보리딘(Senn H ＆ Klaus W (1993) J Mol Biol 234: 907-925), 에치스타틴(Saudek V et al (1991) Biochemistry 30: 7369-7372; Saudek V et al (1991) Eur J Biochem 202: 329-328; Cooke R M et al (1991) Eur J Biochem 202: 323-328; Cooke R M et al (1992) Protein Eng 5: 473-477), 알볼라브린(Jaseja M et al (1993) Eur J Biochem 218: 853-860), 데코르신(Krezel A M et al (1994) Science 264: 1944-1947) 및 덴드로아스핀(Jaseja M et al (1994) Eur J Biochem 226: 861-868; Stucliffe M J et al (1994) Nature Struct Biol 1: 802-807)을 포함하는 몇 종의 억제제의 NMR 구조는 보고되어 있고, 지금까지 명료하게 밝혀진 일반적 구조는 억제 작용을 보이는데 가장 중요한 특징인 용매에 노출된 루프의 말단에 RGD 모티프가 위치한다는 것이다.

최근에는 뱀독의 단백질에 의해 나타나는 리간드 결합 특이성을 조절함에 있어서 RGD 트리펩타이드 주변의 아미노산의 역할에 대해 연구되고 있다. 문헌(Scarborough R M et al (1993) J Biol Chem 268: 1058-1065)에서는 일정 범위의 디스인테그린을 실험하여, RGDW를 함유하는 디스인테그린이 정제된 α_IIbβ₃과 피브리노겐 사이의 상호작용은 효과적으로 억제하나 각각 정제된 α_vβ₃및α₅β₁과 비트로넥틴 및 피브로넥틴의 상호작용은 억제하지 못하는 것으로 관찰되었고, 반면에 서열 RGDNP을 함유하는 디스인테그린의 경우에는 상기와 반대로 관찰되었다. 아미노산 서열의 디버전스(divergence) 부위도 기여할 수 있다(Scarborough et al (1993) supra).

RGD 서열을 함유하는 단쇄의 뉴로톡신 유사물질인 덴드로아스핀 및 전체적 서열 상동성은 거의 나타내지 않으나 RGD 서열의 옆에 있는 아미노산(PRGDMP)이 유사한 디스인테그린 키스트린은 피브리노겐에 혈소판이 응집하는 것에 대해서는 효과적으로 억제하나, 부동성 피브로넥틴에 혈소판이 결합하는 것에 대한 길항제로서는 효과가 좋지않다(Lu X et al (1994) Biochem J 304: 929-936). 반면에 키스트린과 65%의 서열 상동성을 가지나 RGD 주변의 아미노산(ARGDNP)은 현저히 다른 엘레간틴(elegantin)은 피브리노겐에 대해서는 억제할 수 없으나, 피브로넥틴에 혈소판이 유착하는 것은 바람직하게 억제할 수 있고, α_IIbβ₃복합체 상의 다른 부위에 알로스테릭하게 결합한다.

문헌(Smith J W et al (1995) Journal of Biological Chemistry 270: 30486-30490)에는 혈소판 인테그린 α_IIbβ₃과 결합하는 다양한 조직-타입 플리스미노겐 활성화제(t-PA) 변이체를 제조하기 위하여 실시한 단백질 "루프 이식" 실험에 대해 기재되어 있다. t-PA의 상피 성장 인자(EGF) 도메인의 표면 루프에 존재하는 아미노산은 점착성 인테그린 수용체 α_IIbβ₃에 대해 반응하는 모노클로날 항체의 상보성-결정 영역(CDR) 하나를 형성하는 CDR에서 유래된 잔기로 대체되었다. 그 결과 생성되는 다양한 t-PA(루프-이식-t-PA)는 나노몰(nanomol) 정도의 농도에서도 친화성을 보이며 α_IIbβ₃과 결합했고, 합성 및 천연 기질 모두에 대해 충분한 활성을 가졌다. 루프 이식의 효과와 적용가능성은 비예측적이며 불확실하다.

본 발명은 항응고성, 항혈소판성 및 다른 활성을 가진 덴드로아스핀에 기초된 키메릭 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 키메릭 덴드로아스핀 분자를 암호하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 크로닝 및 발현 벡터 그리고 재조합 키메릭 다기능성 덴드로아스핀을 제공하도록 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈전 형성 또는 혈소판 응집에 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 키메릭 덴드로아스핀을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈소판의 인테그린(integrin) 결합 활성에 대한 억제 기능 및 항응고 작용 또는 항트롬보 작용과 같은 부가적 기능이 더해진 키메릭 덴드로아스핀 유도체의 고안 및 제조에 있어서 덴드로아스핀 스캐폴드의 용도에 관한 것이다.

도 1은 덴드로아스핀의 기본적인 3차원 구조를 도시한 것이다. N은 NH 말단을 나타내고, -C는 -COOH 말단을 의미한다. 아미노산 잔기는 번호가 붙여져 있다.

도 2a는 뉴클레오타이드와 그에 상응하는 덴드로아스핀의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 개개의 합성 올리고뉴클레오타이드는 번호 1-10으로 표시되어 있다.

도 2b는 플라스미드 pGEX-DEG의 제한효소 지도의 일부를 도시한 것이다.

도 3a는 삽입된 아미노산 서열이 덴드로아스핀의 아미노산 서열 아래 쪽에 나열하요 변형된 덴드로아스핀의 배열을 도시한 것이다.

도 3b는 도 3a와 유사하게 다양한 변형된 덴드로아스핀의 아미노산 서열(한글자 코드)의 부가 배열을 도시한 것이다.

도 3c는 도 3a와 유사하게 본 발명의 변형된 분자를 도시한 것이다.

도 3d는 본 발명의 변형된 분자의 다양한 활성을 나타낸 표이다.

도 4는 변형된 덴드로아스핀 융합 단백질의 발현 및 클로닝에 사용하기 위한 발현 플라스미드 pGEX-3X를 도시한 것이다.

도 5a는 변형된 덴드로아스핀 유전자을 전달하는 재조합 플라스미드 pGEX-DEG로 형질전환한 유도 박테리아(라인 1) 또는 비유도 박테리아(라인 2)의 총 세포 용균물을 비교하는 12.5% SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다.

도 5b는 pGEX-DEG로 형질전환한 유도 박테리아의 총 세포 용균물(라인 1) 및 이러한 용균물의 친화성 정제 추출물(라인 2)을 비교하는 10% SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다.

도 5c는 친화성 정제되고 Xa 인자로 디이제스트된 GST-변형 덴드로아스핀 융합 단백질의 20% SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 라인 1은 덴드로아스핀이고, 라인 2는 GST-Den이며, 라인 3은 Xa 인자 분해된 GST-Den이다.

도 6a는 이동상으로 아세토나트릴을 사용하여 비닥(Vydac) C₁₈컬럼에서 전개하여 정제된 재조합 덴드로아스핀의 역상 HPLC 용출 프로파일을 도시한 것이다(44분에서 재조합 덴드로아스핀의 보유 시간을 화살표로 나타냈다).

도 6b는 유사한 조건 하에서 실시된 도 6a에서의 44분에서 용출되는 피크 분획의 역상 HPLC의 용출 프로파일을 도시한 것이다.

도 7은 루프 1에 반응하는 항체 R38과 R65 및 루프 1과 루프 3 모두에 반응하는 항체 R51를 사용하여 PDGF 루프 1을 함유하는 덴드로아스핀의 면역침강을 도시한 것이다. GST-돌연변이 덴드로아스핀에 상응하는 32KDa 단백질이 관찰되었다. 라인 1은 R38로 탐침된, 라인 2는 R65로 탐침된, 라인 3은 R51로 탐침된 DEN-PDGF이다.

도 8은 인간의 피브로블라스트 세포의 증식을 유도하는 PDGF를 억제하기 위해 PDGF-덴드로아스핀을 사용하여 실험한 결과를 나타내는 막대 그래프를 도시한 것이다. "펩타이드 1"은 PDGF 루프 1의 선형의 아미노산 서열 상응한다.

본 발명자는 덴드로아스핀 스캐폴드 그 자체를 변형시키는 것을 발견하였다. 덴드로아스핀(RGD 모티프를 포함하는)에 단계적 혈액응고 기전의 인자들에 대한 작동제, 길항제 또는 억제제의 모티프 또는 활성 부분과 같은 기능성 아미노산 서열을 더 통합시켜 변형시켰는데, 그 결과 생성된 분자는 항응고제로서 매우 유용하며, 종래의 항응고제와 관련된 부작용은 나타나지 않는다.

본 발명의 첫 번째 측면은 RGD 모티프를 함유하며 덴드로아스핀 활성을 부여하는 1차 아미노산 서열 및 덴드로아스핀 활성외에 다른 활성을 부여하는 부가 아미노산 서열을 포함하는 혼성 폴리펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 덴드로아스핀 스캐폴드 및 바람직하게는 다른 활성을 가진 비-덴드로아스핀 부가 아미노산 서열을 포함하는 인테그린 결합 활성을 가진 혼성 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 분자는, 생체 내(in vivo)에 투여되었을 때 손상 부위에서 혈소판에 결합하여 혈소판의 응집을 억제하는 인테그린 결합 활성을 가지는 것이 바람직하다. 더우기, 비-야생형의 덴드로아스핀 도메인은, 예를 들어 항트롬빈 작용, 세포의 이동과 증식을 억제하는 작용 및 시그날 형질도입을 조절하는 작용과 같은 2차적이고 임의적인 부가 기능성을 제공한다. 그러므로, 본 발명에 따른 분자는, 손상 부위에서의 혈액 응고, 특히 혈전 형성 작용과 동맥/정맥의 벽을 두텁게하는 활성에 있어서 이- 또는 다기능성이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 백혈구 보충, 면역 시스템 활성화, 조직 섬유증 및 종양 형성에 대한 활성을 가질 수도 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 두개의 상기 부가 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 두개의 상기 부가 아미노산 서열이 서로 같은 것이다.

부가 아미노산 서열은 하나 이상의 덴드로아스핀의 아미노산 잔기에 의해 분리되는 두개 이상의 아미노산 서열 부분을 포함할 수 있다. 상기 두개 이상의 아미노산 서열 부분은 서로의 위치가 변경되고, 원래의 부가 아미노산 서열에서 아미노산의 선형 순서(linear order)가 위치가 변경된다. 달리 말하면, 각각의 부분의 실질적 서열은 반드시 변화되지는 않을지라도, 상기 두개 이상의 아미노산 서열 부분의 원래의 순서는 변경되는 것이다.

상기 부가 서열은, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 당단백질(GP), IBα, 히루딘, 트롬빈, 트롬보모듈린(특히 그것의 제5 EGF 유사 도메인), 혈관 상피 성장 인자(VEGF), 형질전환 성장 인자-β1(TGFβ1), 염기성 피브로블라스트 성장 인자(bFGF), 안지오텐신 II(Ang II), 제8 인자 및 폰 빌레브란트 인자(vWF)로부터 선택될 수 있다.

이러한 방식에 있어서, 본 발명의 분자는 혈소판 응집 이상의 다른 활성, 예를 들어 단계적인 혈액 응고 기전의 다른 성분(예를 들어 트롬빈 활성 성분) 또는 단계적인 기전을 신호하는 세포외 성분(예를 들어 성장 인자)에 대한 활성을 가진 다가능성일 수 있다. 증대된 인테그린 결합 활성을 가진 덴드로아스핀에 기초한 분자를 제공하기 위하여, 본 발명의 변형된 덴드로아스핀은 부가 아미노산 서열이 인테그린 결합 활성을 가지도록 제조될 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드는 도 3에서 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 상기 부가 아미노산 서열의 삽입에 선행하여, 본 발명의 덴드로아스핀 스캐폴드는 덴드로아스핀과 약 50%의 아미노산 서열 상동성, 바람직하게는 약 65%, 더욱 바람직하게는 약 75%, 더 더욱 바람직하게는 약 85%의 상동성을 가지는 동종성 분자를 포함한다.

상기 부가 아미노산 서열을 암호하는 핵산 서열을 제외하고, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 서열은 덴드로핀아스핀 뉴클레오타이드 서열과 뉴클레오타이드 서열 상동성이 약 50%, 바람직하게는 약 65%, 더욱 바람직하게는 약 75%, 더 더욱 바람직하게는 약 85%이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 덴드로아스핀의 59개의 아미노산과 비교하여 더 많은 또는 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 분자는 45 내지 159개, 바람직하게는 49 내지 89개, 더욱 바람직하게는 53 내지 69개, 더 더욱 바람직하게는 57 내지 61개의 범위의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

부가 아미노산 서열은 덴드로아스핀의 스캐폴드의 (a) 루프 I 및/또는 루프 II; (b) 루프 I 및/또는 루프 III; (c) 루프 II 및/또는 루프 III; (d) 루프 I, 루프 II 및 루프III내로 통합되는 것이 바람직하다. 루프 I은 4-16번 아미노산 잔기를 포함하며, 루프 II는 23-26번 아미노산 잔기를 포함하고, 루프 III은 40-50번 아미노산 잔기를 포함한다. 그러나, 통합되는 부가 아미노산은, 비루프 구역의 잔기가 부가 아미노산 서열 또는 삽입되는 서열의 잔기로 증대되거나 대체되도록 루프에서 외부영역, 즉 잔기 1-3, 17-22 및 37-39로 연장되거나 치환될 수 있다.

부가 아미노산 잔기는 루프 I 또는 루프 II 내로 통합되는 것이 바람직하다. 이러한 방법에 있어서, RGD 함유 루프 III은 덴드로아스핀의 인테그린 결합 기능을 보유할 수 있도록 변형되지 않는다.

부가 RGD 모티프는 덴드로아스핀 스캐폴드내로, 바람직하게는 루프I 또는 루프 II내로 도입되어 덴드로아스핀의 활성을 증가시킬 수 있다.

부기 서열의 바람직한 삽입 위치는 덴드로아스핀 스캐폴드 내의 아미노산 잔기: 4-16, 18-21, 23-36 또는 52-59 사이의 부위이다.

각각의 삽입되는 부가 아미노산 서열 또는 부가 아미노산 서열 부분은 바람직하게는 아미노산 잔기 3-40개, 더욱 바람직하게는 3-16개, 더 더욱 바람직하게는 3-14개의 길이의 아미노산 서열이다. 삽입되는 부가 아미노산 서열의 시작은 덴드로아스핀 스캐폴드의 아미노산 잔기 1-57 중의 임의의 하나이다, 삽입되는 부가 아미노산 서열의 끝은 덴드로아스핀 스캐폴드의 아미노산 잔기 3-59 중의 임의의 하나이다.

두개의 부가 아미노산 서열이 덴드로아스핀 스캐폴드 내로 삽입될 때, 이들 사이의 직선 상의 거리는 바람직하게는 1-35 아미노산 범위 내, 더욱 바람직하게는 1-14 아미노산 범위 내이다. 두개 이상의 부기 아미노산 서열이 삽입될 때, 각각의 부가 아미노산 서열을 분리하는 적어도 하나의 고유의 덴드로아스핀의 아미노산이 있는 것이 바람직하다.

RGD-함유 루프는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있으며, 바람직하게는 최대 8개 또는 최소 1개의 아미노산이 덴드로아스핀의 루프 III 내에서 변형될 수 있다.

바람직하게는, RGD 루프는 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. RGD 루프 영역을 변형시키는 것의 장점은 인테그린 결합 활성의 증진 및 특정 당단백질 리간드에 대한 특이성의 향상에 있다. 또한, 덴드로아스핀 스캐폴드 내로 이식되는 하나 이상의 "외래" 부가 아미노산 서열이 RGD 모티프에 대해 입체적 효과(steric effect)를 가지며, RGD 부위 주변의 루프 III이 입체적 장애를 극복할 수 있도록 변형된다면, 그것에 의해 RGD 기능성은 복원되거나, 아마 향상될 것이다.

루프 I 및/또는 루프 II는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 적절한 수의 아미노산 잔기가 덴드로아스핀 스캐폴드 내로 삽입되어 원하는 이- 또는 다-기능적 활성을 부여할 수 있으며, 바람직하게는 14 내지 36개 범위의 다수의 아미노산 잔기가 덴드로아스핀 스캐폴드 내의 하나 이상의 부위에 삽입되는 것이다.

덴드로아스핀 스캐폴드 내로 이식되는 "외래" 부가 아미노산 서열이 이식된 다른 도메인 또는 RGD-함유 루프에 대해 입체적 장애 효과가 있다면, 루프의 변형은 필요할 수 있다. 인사이트 II 소프트웨어(Molecular Simulation Inc)를 사용하여 분자 모델링을 보조하는 컴퓨터를 통해 본 발명의 "루프 이식된" 덴드로아스핀의 구조를 예측할 수 있다. 루프들 사이의 입체적 효과가 기능성에 손실을 주는 경우에는 이러한 효과는 적절한 방법으로 덴드로아스핀 분자의 적절한 부위를 변형시켜 "제거"할 수 있다. 때때로 이러한 방법에 하나 이상의 루프 구조로 확장되도록 적절한 수의 아미노산 잔기를 삽입하는 것이 포함될 수 있다.

바람직한 변형에는 덴드로아스핀의 루프 또는 루프들이 확장되도록 그것들 내로 폴리글라이신의 삽입이 포함된다. 하나의 아미노산 잔기 또는 다수의 아미노산 잔기의 반복 단위를 포함하는 변형을 사용할 수도 있다. 컴퓨터를 통한 모델링 연구가 덴드로아스핀의 루프가 확장되게 하기 위해 필요한 루프 변형을 고안하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 이기능성 또는 다기능성 분자의 고안에 있어서, 활성, 안정성 또는 다른 바람직한 생물학적 또는 생화학적 특성의 "명확한 판명"은 치환 또는 결실의 방법으로 선택된 아미노산 잔기를 개별적으로 교체시켜 보는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 선택된 부위에 아미노산 잔기 또는 잔기들을 삽입시켜 이루어지는 변형 또한 상기 "명확한 판명"을 위한 방법의 범주에 든다. 분자내의 특정 부위에 아미노산 서열을 변화시키기 위해 이용가능한 부위-직접 돌연변이 방법은 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 널리 알려져 있다.

본 발명의 두 번째 측면은 상술한 바와 같은 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

핵산은 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있으며, 융합 생성물을 암호하도록 이종성 단백질 또는 펩타이드를 암호하는 핵산 서열에 선택적으로 연결될 수 있다. 프로모터는 유도가능한 β-D-이소프로필-티오갈락토피라노사이드(ITPG)가 바람직하며, 이종성 단백질 또는 펩타이드는 글루타치온 S-전이효소(GST)일 수 있다.

또한, 이러한 본 발명의 측면은 상술한 바와 같은 핵산을 포함하는 플라스미드을 포함한다. 이 플라스미드는 pGEX-3X가 바람직하다.

본 발명의 세 번째 측면은 상술한 바와 같은 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이며, 바람직한 숙주 세포는 대장균(E, Coli)이다.

그러므로, 본 발명은 상술한 바와 같은 형질전환된 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물 역시 제공한다.

본 발명의 네 번째 측면은 상술한 바와 같은 폴리펩타이드가 발현되도록 상술한 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계, 배양물로부터 폴리펩타이드를 추출하는 단계 및 이것을 정제하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다섯 번째 측면은,

a) 동시-발현하는 이종 단백질을 암호하는 핵산에 선택적으로 연결되고, 프로모터에 작동적으로 연결된 덴드로아스핀 스캐폴드를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

b) 덴드로아스핀 활성를 보이는 아미노산 서열과는 다른 기능을 보이는 부가 아미노산 서열을 포함하는 덴드로아스핀 스캐폴드가 발현되도록, 핵산 잔기들의 삽입, 결실 또는 치환을 하나 이상 이용하여, RGD 모티프를 제외하고 덴드로아스핀 스캐폴드를 암호하는 벡터의 핵산 서열의 적어도 일부를 변형시키는 단계; 및

c) 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 변형된 덴드로아스핀 핵산 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 다가능성 항응고제의 제조방법을 제공한다.

상기 다기능성 항응고제의 제조방법은,

d) 숙주 세포 배양물로부터 변형된 덴드로아스핀을 추출하는 단계; 및

e) 상기 추출물로부터 덴드로아스핀을 정제하는 단계와 선택적으로 동시-발현된 이종 단백질로부터 덴드로아스핀을 분리하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

상기 이종 단백질은 GST인 것이 바람직하고, 상기 정제단계는 GST 정제 모듈에 포함된 글루타치온 세파로오스 4B를 이용하는 친화성 크로마토그래피를 실시하고, 이어서 GST로부터 변형된 덴드로아스핀을 Xa 인자-매개 분리로 분리하는 단계를 실시하는 것이 바람직하다.

그러므로, 본 발명은 상술한 바와 같은 다가능성 항응고제의 제조방법에 의해 수득가능한 상술한 바와 같은 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 여섯 번째 측면은 상술한 바와 같은 폴리펩타이드를 치료적으로 유효한 양을 포함하며, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 선택적으로 더 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 원하는 치료 목적을 달성하도록, 서로 다른 기능을 가진 다수의 본 발명의 폴리펩타이드는 약학적으로 허용가능한 형태로 함께 조합될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 다른 방법, 예를 들어 피하 또는 근육주사에 의해서도 투여될 수 있지만, 정맥 주사 또는 정맥 주입을 통해 투여되도록 제형화되는 것이 바람직한데, 이것은 환자의 순환계로 서서히 방출되므로 바람직하다. 또한, 성장 호르몬을 투여하기 위해 사용되는 것과 같은 방출 조절 장치에 주입하여 사용할 수 있도록 상기 폴리펩타이드를 제형화하는 것도 가능하다.

상기 제형 중에 1nM-60μM 범위의 농도에서 본 발명의 폴리펩타이드와 혈관외로 추출된 혈액을 조합한 제형을 포함할 수 있다. 이러한 혈액은 제형화 후 바로 사용될 수 있도록 저장될 수 있으며, 외과적 치료가 실시되는 경우나 그 직전과 같이 혈전 형성을 반드시 피해야 되는 경우에는 수혈을 통해 즉각적이고 편리하게 공급될 수 있다.

본 발명의 일곱 번째 측면은 약학적인 사용을 위한 상술한 바와 같은 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 여덟 번째 측면은 혈전증과 관련된 질환, 특히 혈전증, 심근 경색, 망막의 신혈관 신생, 내피세포층의 손상, 조절불능의 아팝토시스(apoptosis), 비정상적 세포 이동, 백혈구 보충, 면역 시스템 활성화, 조직 섬유증 및 종양 형성과 같은 질환의 치료용 의약품의 제조를 위한 상술한 바와 같은 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈전증과 관련된 질환, 특히 혈전증, 심근 경색, 망막의 신혈관 신생, 내피세포층의 손상, 조절불능의 세포소멸, 비정상적 세포 이동, 백혈구 보충, 면역 시스템 활성화, 조직 섬유증 및 종양 형성과 같은 질환의 치료방법을 제공한다. 이러한 방법은 상술한 바와 같은 폴리펩타이드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예를 다음의 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 설명하기로 한다.

덴드로아스핀은 코브라과의 뱀독으로부터의 단쇄 뉴로톡신 동종물질로서 뉴로톡신성은 없다. 뉴로톡신과는 달리, 덴드로아스핀은 Arg-Gly-Asp-(RGD)-모티프를 함유하며, 살모사과(Vipeidae) 뱀독으로부터의 디스인테그린의 효능과 비교하면 혈소판 응집과 혈소판 유착의 억제제로서 작용한다. 용액에서의 덴드로아스핀의 구조는 NMR 분광기를 사용하여 결정되어 있다(Stucliffe M J et al (1994) nature struct biol 1: 802-807). 그 구조는 단쇄 뉴로톡신의 코아(core)와 유사한 코아를 함유하나, 신규한 루프의 배열 및 용매 노출된 RGD 모티프를 가지고 있다. 그러므로 덴드로아스핀은 디스인테그린과는 구별되는 뉴로톡신 스캐폴드에 기초된 매우 명확한 겹(fold)을 가진 인테그린 길항제이다.

덴드로아스핀의 구조는 코아영역과 이로부터 바깥쪽으로 뻗은 I(잔기 4-16), II(잔기 23-36), III(잔기 40-50)로 표시된 3개의 루프로 이루어져 있다(도 1). 코아는, 각각 공간적으로 근접해 있으며, 함께 루프들을 지지하는 4개의 디설파이드 결합을 포함한다. 덴드로아스핀의 아미노산 서열은 도 2에 도시되어 있다.

다음의 실시예에서 사용된 물질은 제한 효소, T4 폴리뉴클레오타이드 키나제, T4 DNA 라가아제, IPTG(이소프로필-β-D-티오-칼락토피라노사이드) 및 라이프 테크놀로지 사(영국) 또는 프로메가 사(영극, 사우뜨햄프톤)로부터 구입가능한 DH5α 컴피턴트 세포을 포함한다. 벤트(엑소-) DNA 중합효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩 사(영국, 히친)로부터 공급되었다. 올리고뉴클레오타이드는 메디슨 ＆ 덴티스리트 킹'스 칼리지 스쿨(영국, 런던) 또는 크루아켐 사(영극, 글라스고우)에서 제조되었으며, 15% 아크릴아마이드/8M 유레아 겔 상에서 변성 PAGE로 정제하였다. 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(ddNTP's), 및 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와 글루타치온-세파로오스 CL-4B에 연결된 혼성 단백질로서 클론된 유전자을 발현하는 벡터인 플라스미드 pGEX-3X는 파마시아 비오텍 사(영국, 수레이)로부터 입수하였다. "진크린(geneclean)" 키트 및 플라스미드 맥시(maxi) 키트는 각각 바이오 101(미국, 캘리포니아 라 졸라) 및 퀴아겐(영국, 수레이)로부터 구입하였다. 시퀀싱 시퀀에이즈 2.0(sequencing sequenase 2.0)은 캠브리지 바이오사이언스(영국, 캠브리지)로부터 구입하였다. [³⁵S]dATP[αS] 및¹²⁵I(15.3mCi/mg iodine)은 각각 NEN 듀퐁(영국, 헤르츠) 및 아머샴 인터내쇼날 Plc(영국, 벅스, 아머샴)으로부터 공급받았다.

실시예 1-덴드로아스핀의 변이체를 암호하는 발현 벡터의 제조

야생형 덴드로아스핀 유전자는 플라스미드 pGEX-3X 내로 성공적으로 삽입되었고(도 2), 문헌(Lu et al (1996) J Biol Chem 271: 289-295)에 개시된 방법에 따라 발현되었다. 야생형의 덴드로아스핀 유전자로부터 시작하여, 덴드로아스핀 유전자의 변이체를 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조하였다. 비-덴드로아스핀 또는 이종성 아미노산을 암호하는 올리고뉴클레오타이드를 적절한 제한효소에 의해 절단된 야생형 덴드로아스핀 유전자 내로 단순하게 직접 삽입하였고, 다음으로 연결시켜 더 길어진 삽입 변형체를 제조하였다. 클론텍크 레버라토리로부터 구입한 부위-직접 돌연변이 키트(상표명 Transformer)을 제조자에 의해 작성된 사용지침서에 따라 사용하여 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 적은 수의 아미노산 잔기의 변형과 같은 미세한 변화를 주었다.

도 2a는 합성된 덴드로아스핀(Den) 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다. 상기 유전자는 알려져 있는 아미노산 서열을 기초로 하여 디자인 되었고(Williams T A et al ((1992)) Biochem Soc Trans 21: 73S), 각각의 아미노산에 대한 코돈은 대장균에서 고도로 발현되는 것들로부터 채용되었다(Fiers W ((1982)) Gene 18: 199-209). 10개의 합성 올리고뉴클레오타이드는 블래킷(모난 괄호)에 나타냈으며, 코딩 스트랜드의 위 또는 비-코팅 스트랜드의 아래에 개별적으로 1에서 10까지 번호를 붙였다. 별표(*)로 표시된 것이 중지 코돈이다. 3글자로 된 아미노산 약자를 사용하였으며, 덴드로아스핀의 총 59개의 아미노산에 대해서는 N-말단 잔기 아르기닌을 1로, C-말단 잔기 류신을 59로 번호를 붙였다.

도 2b는 pGEX-DEG의 제한효소 지도의 일부를 도시한 것이다. 덴드로아스핀 유전자와 그것의 관련 상류 영역을 도시한 것이다.

도 3a는 아래에서 더욱 상세히 설명되어질 다양한 변형된 덴드로아스핀 분자의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 각각 변형에 따라, 삽입 잔기를 덴드로아스핀의 아미노산 서열 아래쪽에 제시하였다.

실시예 2- 혈소판-유도 성장 인자(PDGF) 도메인을 함유하는 변형된 덴드로아스핀

혈소판-유도 성장 인자(PDGF)는 30KDa 폴리펩타이드이며, 주요한 혈청 분열유발인자(mitogen)이고, 간엽 세포(mesenchymal cell)의 화학주성 인자 (chemostatidc factor)이다.

처음에는 PGDF는 인간의 혈소판으로부터 정제되어졌는데, 나중에 평활근 세포, 태반 세포영양막 세포(placental cytotrophoblast cell), 피브로블라스트 및 결합 조직과 같은 다른 형태의 세포로부터 생산된다는 것을 알게 되었다. PGDF는 세포 이동과 증식을 촉진시키고, 이것들은 배아발생 (embryogenesis) 및 상처 치료와 같은 자연적 과정에 있어서 주요한 과정이다. 또한, PDGF는 동맥 경화증, 섬유증 및 류마티스 관절염과 같은 다수의 병리상태에도 연관되어 있다.(Heldin C H and Westermark B (1990) Cell Regul 1: 555-556 and Engstrom U et al (1991) J Biol Chem 267: 16581-16587). PDGF는 A- 및 B 쇄로 칭해지는 두개의 유사한 쇄의 다이머(dimer)이다.

덴드로아스핀의 RGD 서열의 유착하는 특성은 유지하면서, 도 3a와 3c에서 도시된 바와 같이 PDGF B 쇄로부터 유도된 아미노산 서열을 덴드로아스핀의 루프 II내로 삽입하였다. 그리고 나서 변형된 덴드로아스핀은, 평활근 세포와 피브로블라스트 세포 증식 및 인테그린 길항제로서 활성을 분석하여 PDGF의 활성의 경쟁적 억제에 대해 실험되었다. 도 3d는 도 3c에 제시된 실시예로 얻어지는 결과를 요약한 것이다. 변형된 덴드로아스핀 분자는 ADP에 의해 유도되는 혈소판 응집과 PDGF에 의해 유도되는 피브로블라스트 세포의 증식을 억제한다.

PDGF 루프 I을 함유하는 덴드로아스핀의 유전자의 조합과 클로닝:

PDGF 루프 I을 함유하는 덴드로아스핀의 유전자는, 야생형의 유전자를 Bam HI, EcoR I, Hinf I와 Hpa II으로 절단 후의 단편(77mer, 76mer, 42mer 및 44mer)과 한 쌍의 상보적 인산화 돌연변이 올리고(81mer 및 80mer)로부터 조합되었다. 총 6개의 단편들의 혼합물을 5분 동안 85℃로 가열한 후 실온(RT)까지 천천히 냉각하여 어닐링하였다. 각각의 단편 약 1nM, 트리스-염산(pH7.6) 50mM, MgCl₂10mM, DTT 1mM, ATP 1mM, PEG 8000 5% 및 T4 리가아제 5유니트를 함유하는 총 용량 50㎕ 내에서 단편들을 연결시켰다, 연결시킨 후에 PCR을 위해, 주형으로서 상기 연결 혼합물의 1㎕, 프라이머로서 두개의 5'-돌출하는(overhaning) 올리고뉴클레오타이드 및 벤트 중합효소 2유니트를 사용하였다. 수득된 단일 생성물은 2% 아가로스 겔로 확인하였는데 예견된 크기였다. 그리고 나서, 혼성 유전자를 벡터 pGEX-3X 내로 클로닝하여 PGDF-변형된 덴드로아스핀 유전자를 포함하는 플라스미드 pGEX-3X를 생산하였다.

형질전환 및 플리스미드 DNA 분리:

PGDF-변형된 덴드로아스핀 유전자를 포함하는 pGEX-3X 벡터(약 5ng)을 사용하여 대장균 균주 DH5α 50㎕를 형질전환시켰다. 단지 컴피턴트 세포만을 함유하는 바이알, 라이게이션되지 않은 플라스미드 DNA를 함유하는 바이알 및 야생형 플라스미드 DNA를 함유하는 바이알을 대조표본으로 하였다. 박테리아를 배양하기 위한 배지로 SOC 배지(박토-트립톤 20g/l, 박토-이스트 추출물 5g/l, KCl 2.5mM, MgCl₂20μM 및 글루코스 20mM)를 사용했다. 형질전환 단계 후에 1시간 동안 암피실린없이 박테리아를 배양하는 회복 기간을 두었다. 형질전환 후에 각각의 박테리아 배양물의 충분한 양을 배양 플레이트로부터 분리하였다. 암피실린을 함유하는 SOC 아가 배지로 박테리아를 배양하였다. pGEX-3X의 암피실린 선택 표지에 의해 암피실린 저항성이 부여된 형질전환된 박테리아는, 형질전환되지 않은 박테리아가 제거되는 동안에도 성장하였다. 대조표본 플레이트는 하루 밤 동안 배양한 결과 맑게 되었다.

변형된 덴트로아스핀 유전자가 발현된 콜로니들을 플레이트로부터 개별적으로 추출하였다. 이것들을 몇시간 동안 암피실린을 함유하고 있는 SOC 배지에서 배양하였다. 각각에서 적은 양을 추출하여 암피실린을 함유하고 있는 새로운 SOC 배지에서 배양하였다. 본래의 박테리아 배양물에 멸균된 글리세롤을 부가하여 약 -70℃에서 저장하여 스톡공급용으로 비축하였다. 나머지 배양물은 하루 밤 동안 배양하였다. 형질전환된 박테리아 배양물로부터 플라스미드 DNA의 분리는 제조자(QIAGEN)가 작성된 지침에 따라 플라스미드 미니 프렙(plasmid mini prep)(빠른 시험을 위해) 또는 맥시-프렙(maxi-prep)(DNA 시퀀싱을 위해)에 의해 수행되었다. 각각에 대해 플라스미드 미니-프렙을 한번 더 실시하여 플라스미드 DNA를 분리하였는데, 함유되어 있는 것 중 대부분이 변형된 덴드로아스핀 유전자였다. 플라스미드 중 덴드로아스핀 유전자 단편을 함유하고 있는 영역에 대해 DNA 시퀀싱을 실시하여 변형이 존재하는가 및 변형이 정확한가에 대해 확인하였다. 삽입된 단편의 컴플린트 DNA 시퀀싱은 문헌(Sanger et al (1977) Proc Natl Acad Sci 74: 5463-5467)에 기재되어 있는 디데옥시 쇄-절단 방법(dideoxy chain-termination method)을 이용하여 실시하였다.

단백질 발현:

문헌(Sambrook et al (1989) Molecula cloning: A Laboratory Manual, cold spring harbor Laboratory press, NY)에 기재되어 있는 것과 같은 표준 방법을 이용하여 변형된 플라스미드 pGEX-3X로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 단백질 발현을 위해 형질전환된 배양물을 이용하였다. 배지에 오버나이트 시드 배양물(overnight seed culture)(1%, v/v)을 접종하고, LB/암피실린 배지(100㎍/ml)에서 성장시켜, A₆₀₀이 0.7이 될 때까지 37℃에서 흔들었다. 그리고 나서 유도(induction)을 위해 최종 농도 0.1mM이 될 때까지 IPTG를 부가하였다. 30℃의 저온에서 4시간 동안 더 세포를 성장시킨 후 원심분리에 의해 수득하였다.

융합 단백질의 정제:

트리톤 X-100 1%, 프로페아제 억제제, 페닐메틸술포닐 플루오라이드(1mM), 펩스타틴 (1μM) 및 아프로티닌(2μg/ml), 대두유로부터 얻은 트립신 억제제 (1μg/ml) 및 EDTA 1mM를 함유하는 인산 완충된 살린(PBS) 완충액(pH 7.4)에서 세포 펠릿을 현탁시키고 얼음 위에서 초음파로 분해시켜 재조합 덴드로아스핀을 정제하였다. 초음파로 분해된 혼합물을 7800 x g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 세포 파편과 불용성 물질을 펠릿으로 만들었다. 상등액으로부터 NaCl 150mM을 함유하는 PBS에서의 흡착 및 환원된 글루타치온 10mM (pH 8.0)을 함유하는 트리스-염산 50mM로의 용출에 의한 글루타치온-세파로오스 CL-4B 컬럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해 재조합 GST-덴드로아스핀과 GST-변형된 덴드로아스핀을 정제하였다. 글루타치온(pH 8.0)으로 흡착 물질을 용출시킨 결과 폴리아크릴아마이드 겔에서 32KDa(GST-덴드로아스핀 융합 단백질)으로 주요한 밴드 이동의 모습이 나타났다(도 5a 및 5b). 다음으로, Nacl 150mM, CaCl₂1mM 및 Xa 인자의 존재 하에 4℃에서 24시간 동안 32KDa-혼성 단백질를 포함하는 적절한 단편을 다이제스쳔하였다. SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한 결과, Xa 인자로 정제된 GST-단백질을 처리하여 덴드로아스핀의 크기와 유사한 7-KDa 밴드로 이동하는 재조합 단백질을 분리하였고, 프리 GST는 28-KDa 밴드에서 강하게 나타났다(도 5c). 분해된 혼합물을 비닥 C₁₈역상 HPLC 분석 컬럼(TP104)에 적재한 후 이동상으로 0.1% 트리플루오르아세틱산을 함유하는 0-26% 아세토니트릴(1.78%/min), 다음으로 0.1% 트리플루오르아세틱산을 함유하는 26-36% 아세토니트릴(0.25%/min)로 용출하였다. 필요하다면, 동일한 조건 하에서 분석 컬럼으로 더 분석을 실시할 수 있다. 도 6a와 6b는 역상 HPLC의 용출 프로파일을 도시한 것이다.

웨스턴 블랏팅:

융합 단백질(10㎍)을 SDS-PAGE(12%) 겔로 전기영동하였고, 전류 밀도 0.8mA/cm²을 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 세미-드라이 블로팅에 의해 이동시켰다. 니트로셀룰로오스 멤브레인은 TBS/트윈 완충액(트리스 20mM, NaCl 500mM, 트윈 1%)에서 건조 우유 5%로 실온에서 2시간 동안 차단시켰고, 그것들은 상응 1차 항체 오버나이트, 다음으로 호스라디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase)에 연결된 항-래비트 또는 항-마우스 2차 항체로 2시간 동안 탐침시켰다. 그리고 나서 아미노에틸렌카바졸로 블랏을 실시하였다.(도 7)

R51 항체의 제조:

펩타이드 1(PDGF 루프의 선형 아미노산 서열)은 각각 헤테로-이기능성 가교제인 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (Sulpho-SMCC) 및 γ-말레이미도부티레이트 숙신이미드(GMBS)를 사용하여 래비트 혈청 알부민 (RSA) 및 티올기를 통해 보바인 티로글로빈(Tg)에 컨쥬게이트되었다. 제조자의 고유의 절차를 통해 실시하였다. 컨쥬게이트는 PBS에서 1mg/ml로 제조되었고, -20℃에서 저장되었다. Tg-펩타이드 1로 뉴질랜드 화이트 래비트에 면역성을 부여하였다(각각 래비트 당 PBS:프라운드의 컴플리트 보조제가 1:1의 비율인 1ml 용액에서 Tg-펩타이드 1 100㎍을 피하주사함). 래비트에게 단지 프라운드의 컴플리트 보조제에서 동일한 약용량으로 6주 후 및 12 후에 접종하여 약효를 높였다. 마지막 접종은 약효를 높이기 위한 마지막 주사 10일 후에 하였다. 항혈청을 동량으로 분주하여 -20℃에서 저장하였다.

R38과 R65 항체의 생산:

제조자에 의한 사용지침에 따라 단백질-G 친화성 크로마토그라피(스웨덴, 옵살라, 파마시아사, 하이-트랩 프로테인G)를 이용하여 상술한 항혈청으로부터 IgG(R38 및 R65)를 정제하였다. 순도는 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. PBS에 IgG를 녹인 용액을 필터를 사용하여 멸균하였으며, 알리퀴오트하여 -20℃에서 저장하였다.

실시예 3- RGD 기능(덴드로아스핀 활성)의 확인

혈소판 응집:

혈소판 응집을 문헌(Lu et al (1994) Biochem J 304: 929-936)에 기재된 것과 같이 빛 전달량의 증가 여부에 의해 측정하여 RGD 기능을 확인하는데 이용하였다. 간략하게 설명하면, 건강한 사람으로부터의 시트릭산 처리된 혈액 200g을 15분 동안 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 제조하였다. PRP 1500g를 15분 동안 원심분리하여 혈소판을 제조하였다. 펠릿을 세척하고 유착/응집 완충액(NaCl 145mM, KCL 5mM, MgCl₂1mM, CaCl₂2mM, 글루코스 10mM, BSA 3.5mg/ml 및 HEPES 10mM, pH 7.35)에 재현탁하여 혈소판의 수를 3 x 10⁸/ml이 되게 조절하였다. 피브리노겐 1.67mg/ml 존재 하에 ADP 10μM로 혈소판 응집을 유도하여 차트 기록계와 연결된 페이톤 듀얼-응집측정계(Payton Dual-Aggregometer)를 사용하여 측정하였다.

혈소판 유착:

RGD의 다른 기능을 확인하기 위해 상기 문헌(Lu et al (1994) supra)에 기재된 바에 따라 혈소판 유착을 측정하였다. 간단하게 설명하면, 96 웰 플레이트를 PBS(pH 7.4)에서 재구성된 인간 피브리노겐 또는 피브로넥틴으로 적절한 농도(2-10μg/ml, 용량 100㎕)로 4℃에서 밤 새 코팅하였다. 혈소판을 적절한 농도에서 5분 동안 길항제로 처리한 다음, 최종 농도가 50μM이 되도록 500μM ADP의 10㎕가 미리부가된 미세적정(microtitre) 플레이트에 상기 혼합물을 90㎕ 부가하였고, 유착된 혈소판의 수는 웰당 디벨로핑 완충액(소듐 아세테이트, ρ-니트로페닐 포스페이트 10mM, 트리톤 X-100 0.1%, pH 5.5) 100㎕를 사용하여 내인성 산 포스파타제를 측정하여 결정하였고, 자동 플레이트 해독기로 410/630nm에서 해독하였다.

리간드의 요오드화 연구 및 리간드 결합 분석:

제조자의 지침에 따라 효소비드 방사성요오도화 시약(Enzymobead Radioiodination reagent)(바이오래드 래버라토리)을 사용하여 덴드로아스핀의 모든 변형물을 요오드화시켰다. 세척된 혈소판에¹²⁵I-라벨링된 디스인테그린, 덴드로아스핀 및 변형된 덴드로아스핀의 결합은 전술한 문헌(Lu et al (1994) supra)에 기재된 바와 같이 필수적으로 평형상태 하에서 수행하였다. 세척된 혈소판(3 x 10⁸/ml) 300㎕, 작동제 10㎕(최종 농도 50μM가 되도록 1.75mM ADP),¹²⁵I-라벨링된 단백질 샘플 및 현탁 완충액 5-20㎕를 함유하는 배양 혼합물을 최종 용량 350㎕되게 만들었다. 항체 저해 연구에 있어서, 혈소판 현탁액을 30분 동안 항체로 처리한 후 ADP에 노출시킨 다음¹²⁵I-단백질 샘플을 가하였고, 혼합물은 실온에서 60분 동안 더 배양되었다. 자당 25%(W/V)에 혼합물을 부가한 후 배양을 종결하고, 1% BSA로 완충하고 10분 동안 12,000g로 원심분리하였다. 혈소판 펠릿과 상등액 모두에서 결합 리간드 및 프리 리간드의 농도를 측정하여 수를 세었다. 50배 과량의 냉각된 단백질 샘플, 디스인테그린 또는 10mM EDTA가 존재하는 상태에서 배그라운드 결합 정도를 측정하였다.

이식된 루프의 확인:

이식된 루프의 기능의 확인은 이식된 루프의 모단백질(parent protein)의 기능에 의존한다.

실시예 4-덴드로아스핀에서 PDGF 루프 1의 효과에 대한 분석

경합 엘리사(CELIA):

Den-PDGF 또는 경합자로서 PDGF의 적절한 양을 동시에 래비트 항-PDGF 항-혈청에 부가한 후 2시간 동안 배양하였다. 적절한 RSA-펩타이드 결합물에 대해 분석할 때, 기질로 30분 동안 배양 후, 각각의 적절하게 희석된 래비트 항-혈청은 표준 직접 엘리자 커브의 선형 부분 내에서 오도록 희석하여 405nm에서 1.2 내지 1.5의 OD를 갖도록사용되었다.

세포 배양 및 [³H]-티미딘 통합 분석:

인간의 피부 포피(foreskin) 피브로블라스트(계대 수 7-10 사이에 사용되는)는 10% FBS를 함유하는 컴플리트 DMEM 내에서 유지되었다. 용량 75cm³의 조직 배양 플라스크로부터 회수한 서브-컨플루언트 단층을 트립신화했고, 수를 세고, 24 웰(코스타르) 또는 48 웰(팔콘) 플랫 바닥 조직 배양 플레이트 내로 웰당 10,000 세포의 세포 밀도가 되도록 접종하였고, 컨플루언트가 약 65%가 될 때까지(2 일) 발육시켰다. 0.2% 또는 0.5% FBS를 함유하는 컴플리트 DMEM으로 배지를 교체하여 48-72시간 동안 세포를 무활동 상태로 만들었다. 공기 중에 8%의 이산화탄소를 함유하는 습한 대기에서 약 37℃로 모든 세포를 배양하였다.

제로 타임에서 배지를 Den-PDGF 및 펩타이드 1(PDGF 도메인의 선형 서열)을 각각 다양한 농도로 포함하는 컴플리트 DMEM으로 대체하여 성장 인자에 의해 유도되는 세포 증식을 억제하였다. 유도를 위한 PDGF의 농도는 10-20ng/ml의 범위에서 사용되었다.

20-22 시간 후에 [³H]-티미딘(0.3mci/100㎕/웰)을 가하고 27.5-28시간까지 배양하였다. 배지에서 흡기한 후 냉각된 PBS로 세포를 두 번 세척하고 10% TCA 500㎕를 부가하여 고정시키고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 50% 에탄올 0.5ml로 한 번 세척하고 -20℃에서 보관하였다. 그리고 나서, 실온에서 30분 동안 각각의 웰에 0.1N NaOH 500㎕를 부가하여 세포를 가용화하였다. 각각의 웰에서 400㎕의 샘플을 취하여 신틸레이션 카운팅(scintillation counting) 방법으로 [³H]-티미딘 통합된 세포의 양을 측정하였다. 세포 증식 억제율은 아래와 같이 계산하였다;

(PDGF로 통합된 [³H]-티미딘)-(PDGF+M^*또는 P1으로 통합된 [³H]-티미딘)X 100

(PDGF로 통합된 [³H]-티미딘)-(0.2% FCS로 통합된[³H]-티미딘)

M^*는 변형된 덴드로아스핀임.

도 8은 6.5-60μM에서 10-30%로 PDGF-유도 증식에 대한 PDGF-덴드로아스핀의 억제 시험의 결과를 도시한 것이다(대조표본으로서 야생형 덴드로아스핀을 사용하였을 때에는 억제 효과가 없는 것으로 나타남).

실시예 5-트롬보모듈린의 제5 EGF-유사 도메인으로부터 유래한 서열을 포함하는 변형된 덴드로아스핀

트롬보모듈린은 트롬빈 수용체로서 작용한다. 트롬빈은 울혈과 혈전증에서 중심적 역할을 수행하는 트립신-유사 혈청 단백분해효소이다. 단계적 혈액응고기전에 있어서, 트롬빈은 피브리노겐을 효소적으로 분해하여 피브리노펩타이드 A와 B를 방출하고, 중합되어 지혈 플러그를 형성하는 피브리 모노머를 발생시키는 최종적인 중요 효소이다. 피브리노겐 분해뿐만 아니라, 트롬빈은 트롬빈 활성화의 공인자로 작용하는 응집 인자 Va 및 VIIIa를 발생시켜 자신을 생산하는 양성 피드백 역활을 한다. 제 8 인자 역시 트롬빈에 의해 활성화되며, 피브린 폴리머와 교차결합되어 안정화시킨다. 천연 항응고제의 작용은 세르핀과 항트롬빈 II에 의한 억제 및 트롬빈/트롬보모듈린 복합체에 의한 단백질 c의 활성화를 통해 제한받는다. 트롬보모듈린은 상피세포의 표면에 위치한 세포 수용체이며, 트롬빈에 결합하여 트롬빈이 효능 단백질 c 활성화제로 전환되는 동안에 혈전 형성을 촉매하는 능력을 감소시켜 트롬빈의 분자 특이성을 변화시킨다. 활성화된 단백질 c는 단계적 혈전형성 기전을 종결시키는 Va와 VIIIa 인자를 파괴한다. 그러므로, 응고 기전과 항 응고 기전 사이의 균형은 정상 생리상태에서는 유지되며, 체계적 또는 잠재적인 위험한 질병으로 전환되는 것을 방지하는 한 트롬빈의 국소적 발생은 가능하다. 또한 트롬빈 역시 혈소판과 내피 세포를 활성화한다. 트롬빈에 의해 혈소판이 활성화되면, 혈소판은 모양이 변화고, 응집하게 되며, 저장하고 있는 과립 성분(예를 들어, 혈소판 인자-4, ADP, 5-하이드록트립타민)을 방출한다. 또한, 트롬빈은 트롬복산 A₂와 혈소판 활성 인자의 합성과 분비를 증가시킨다. 또한 내피세포와 트롬빈의 상호작용에 의해 단백질 C 항응고 경로를 개시시키는 트롬보모듈린에 결합하는 단백질 C 활성화가 촉진될뿐만 아니라 다양한 성분(예를 들어, 플라스미노겐 활성제, PDGF, 엔도텔린)이 분비된다.

실시예에서와 같이 , 트롬보모듈린의 제5 상피 성장 인자(EFG) 유사 도메인으로부터 유래한 서열은 덴드로아스핀 내로 이식되었다. 신규한 단백질의 트롬빈 결합 친화성은 피보리노겐에 의한 혈전 형성의 억제를 기초로 하여 측정되었다.

적절한 플라스미드 발현 벡터는 덴드로아스핀의 루프 III 내로 이식되는 서열을 나타내는 도 3a에 도시된 바와 같이 트롬보모듈린 도메인이 덴드로아스핀 내로 삽입되는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 과정으로 제조하였다.

TM-변형된 덴도로아스핀의 발현, 분리 및 정제 역시 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 변형된 단백질의 RGD 기능은 실시예 2에 기재된 바와 같이 시험하였다.

인간의 트롬보모듈린은 약 100KDa의 Mr을 가지며, C-타입 렉틴과 상동성인 N-말단, 6개가 직렬로 반복되는 상피 성장 인자(EGF)-유사 도메인, Ser/Ter 풍부 도메인, 막통과 도메인 및 짧은 세포질 꼬리로 구성되어 있다. 특히, 도 3c에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서는 트롬보모듈린의 제5 EGF-유사 도메인으로부터 유래한 서열을 덴드로아스핀 내로 삽입시켰으며, 생물학적 기능의 손실을 일으키는 입체 장애를 막도록 덴드로아스핀의 적절한 부분을 부가적으로 변형시켰다.

도 3d로 나타낸 바와 같이, 변형된 덴드로아스핀 분자는 ADP 또는 트롬빈 유도 혈소판 응집 활성을 가지며, 트롬빈 응고 시간을 연장시킨다.

실시예 6- 덴드로아스핀에서 트롬보모듈린 도메인의 효과 분석

트롬빈-유도 피브리노겐 응고 시간:

다음과 같은 아메렁(Amelung) Kc-10 장치을 사용하여 트롬빈-유도 피브리노겐 응고 시간을 측정하였다. NaCl 150mM과 CaCl₂5mM을 포함하는 pH 7.5인 트리스-염산 50mM 내의 트롬빈 50㎕를 변형된(Den-RM) 덴드로아스핀과 야생형 덴드로아스핀(비교를 위한 대조표본으로서) 모두를 다양한 농도로 함유하는 10㎕와 혼합하였다. 37℃에서 2분 배양한 후, 동일한 완충액 내의 피브리노겐(160㎍/ml) 100㎕를 부가하여 응고 시간을 측정하였다.

단백질 C 활성화:

Den-TM이 단백질 C의 활성화에 대해 영향을 미치는가의 여부를 확인하기 위해, 문헌(Tsiang et al (1990) Biochemistry 29: 10602-10612)에 기재된 바와 같은 두 단계 분석방법을 사용하였다. 첫번째 단계에서는 100㎕의 반응 용량 내에서 적절한 최종 농도를 갖도록 트롬빈과 단백질 C를 야생형 또는 돌연변이 덴드로아스핀과 함께, 또는 야생형 또는 돌연변이 덴드로아스핀없이 CaCl₂2mM 또는 Na₂EDTA 1mM에 부가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 배양한 후, 항트롬빈 III과 헤파린을 부가하고 배양을 중지하였다. 셍성된 단백질 C를 기질 S-2366으로 가수분해하여 분석하였다.

트롬빈-유도 혈소판 응집:

작동제로서 트롬빈을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3에서 기재한 바와 같이 야생형 및 돌연변이 덴드로아스핀에 대한 세척된 혈소판에서의 트롬빈-유도 혈소판 응집을 측정하였다.

트롬보모듈린 결합:

문헌(Tsiang et al (1990) supra)에 기재된 바에 따라 트롬보모듈린 결합을 실시하였다.

실시예 7- 당단백질(GP) IB로부터 유래한 서열을 포함하는 변형된 덴드로아스핀

당단백질(GP) IBα는 혈소판 상의 고 친화성 α-트롬빈 결합 부위의 발현을 위해 필요하다(Marco et al (1994) J Biol Chem 296: 3478-6484). 이 기능은 지혈과 혈전증의 개시에 있어서 매우 중요하며, 병리적 혈관 폐색을 진행시키는 역할을 할 것이다. 변형된 덴드로아스핀은, 트롬빈과 인테그린 길항제 활성을 갖도록 GP IB로부터 유래한 서열을 포함하도록 만들었다.

적절한 플라스미드 발현 벡터는 이식된 도메인의 아미노산 잔기를 덴드로아스핀의 전체 아미노산 서열과 함께 배열시킨 도 3a와 3c에 도시된 바와 같이 당단백질 IBα 도메인을 덴드로아스핀 분자의 루프 I에 삽입한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 제조하였다.

요약된 도 3d에서와 같이, 변형된 덴드로아스핀 분자는 트롬빈 활성과 혈소판 응집을 억제한다.

당단백질 IB(CP IB) 도메인를 함유하는 덴드로아스핀 유전자의 조합 및 클로닝:

CP IB 도메인을 포함하는 덴드로아스핀의 유전자는 Bam HI, Ecor I, Hinf I 및 Hpa II로 분해한 후의 야생형 유전자의 단편(81mer, 82mer, 42mer 및 44mer) 및 한 쌍의 인산화 돌연변이원 올리고(83mer과 82mer)로부터 조합되었다. 어닐링, 연결, PCR 및 조합의 실험 과정은 전술한 Den-PDGF의 실험과정과 유사하다.

GP IBα-변형된 덴드로아스핀의 발현, 분리 및 정제 과정은 실시예 1에서 기재한 바와 같이 실시하였으며, 상기 분자의 RGD 기능에 대해서는 실시예 3에 따라 분석하였다.

실시예 8- 덴드로아스핀에서 GP IB 도메인의 효과에 대한 분석

혈소판에 결합하는 트롬빈의 측정:

세척된 혈소판에 결합하는 트롬빈은 칼슘없는 응집/유착 완충액에서 측정하였다(실시예 3의 혈소판 응집 참조). 세척된 혈소판은, 분석하기 전에 37℃에서 10분 동안 평형화하고, 그리고 나서 25℃에서 10분¹²⁵I-α-트롬빈과 함께 배양하였다. 리간드 농도의 기능으로서 결합은, 농도가 증가되는(1과 200nM 사이에서) 라벨링되지 않은 α-트롬빈과 혼합된 일정한 농도(0.1nM)의¹²⁵I-α-트롬빈으로 측정하였다. 상기 트롬빈 혼합물에 혈소판을 부가하여 결합은 개시되었다. 배양 10분 후, 4분 동안 12000g에서 자당 20%의 막을 통해 원심분리하여 혈소판 및 결합된 트롬빈을 결합되지 않은 트롬빈과 분리하였다(Lu et al (1994) supra).

혈소판에 결합하는 트롬빈에 대한 GP IB 도메인을 포함하는 덴드로아스핀의 효과는 세척된 혈소판에 상기 돌연변이체를 다양한 농도로 혼합하고 일정 농도의¹²⁵I-α-트롬빈을 부가하여 측정하였다. 그 결과는 전술한 문헌(Lu et al (1996) supra)에서 처럼 분석되었다.

혈소판의 응집 및 분비 측정:

혈소판의 밀집 과립으로부터의 ATP의 방출은 루시페린-루시페라제 분석 방법으로 측정하였다. 세척된 혈소판을 2.5 x 10⁸/ml의 수가 함유되도록 칼슘없는 응집/유착 완충액에 재현탁시키고, 알리퀴오트 0.4ml를 발광응집측정계 (Lumiaggregomrter)(크로노-로그 사)를 사용하여 측정하였다. 루시페린-루시페라제 시약 50㎕를 부가한 다음 0.26nM의 최종 농도가 되도록 α-트롬빈을 부가하였고; 계속되는 ATP의 방출은 발광응집측정계를 이용하여 발광의 변화를 기록하여 측정하였다. 혈소판 응집은 상술한 실시예 3에서와 같이 측정하였다. ATP 방출 및 혈소판 응집에 대한 GP IB 도메인을 함유하는 돌연변이 덴드로아스핀의 억제 효과의 시험하기 위하여, 돌연변이 단백질을 부가하고 5분 동안 37℃에서 혈소판과 혼합한 후 루시페린/루시페라제 및 트롬빈을 부가하였다.

트롬빈의 아미노산 가수분해 활성 및 피브리노겐의 응고:

트롬빈의 아미노산 가수분해 활성 및 피브리노겐의 혈전 형성에 대해서는 아래의 실시예 10에서 상술한 바와 같이 측정하였다.

실시예 9- 히루딘 도메인을 함유하는 변형된 덴드로아스핀

흡혈(bloosucking) 거머리인 히루도 메디시날리스(Hirudo Medicinalis)의 효능있는 트롬빈 억제제인 히루딘은 65개의 아미노산 잔기를 함유하는 단일 폴리펩타이드 쇄 단백질이다(Maraganore et al (1989) J Biol Chem 264: 8692-8698). 히루딘의 아미노산 잔기 Asn⁵²-Leu⁶⁴또는 Phe⁴⁵-Gln⁶⁵를 포함하는 변형된 덴드로아스핀을 제조하였다. 이 새로운 구조체는 항-트롬빈 결합 도메인 및 혈소판 항-유착 도메인 모두를 함유한다.

플라스미드 발현 벡터는 부가 돌연변이 부위가 덴드로아스핀의 루프 III의 아미노산 잔기 PRP에 상응하는 미세한 변화를 갖도록 만들어진 것을 제외하고는 실시예 7에서 상술한 바와 같이 만들었다.

미세한 변화를 위하여, 클론데크 레이보레이토리사로부터 입수한 트랜스포머^TM부위-직접 돌연변이원 키트를 사용하였다. 히루딘 도메인을 덴드로아스핀의 루프 I과 II 내로 이식한 것을 제외하고는 제조자의 조작지침에 따라 실험을 실시하였다. 변형된 분자는 도 3a와 3c에 도시하였는데, 이 도면들에는 히루딘에서 유래 아미노산 잔기가 본래의 덴드로아스핀 서열과 함께 배열되어 있다. 도 3d는 도 3c의 분자가 어떻게 토롬빈 응고 시간을 연장하는가 및 ADP 또는 트롬빈으로부터 유래된 혈소판 응집을 억제하는가를 나타낸다.

Den-HR의 발현, 분리 및 정제는 실시예 1에서 설명한 바와 같은 방법으로 실시하였다. 상기 분자의 RGD 기능에 대해서는 실시예 3의 분석 방법에 따라 실시하였다.

실시예 10- 덴드로아스핀에서의 히루딘 도메인의 역할에 대한 분석

트롬빈의 아미노산 가수분해 활성 및 피브리노겐의 응고:

α-트롬빈의 아미노산 가수분해 활성에 대해서는 염색체유전자 기질 S-2238(크로모제닉스) 및 최종 농도가 0.06 유니트/ml이 되도록 한 α-트롬빈를 사용하여 측정하였다. 트롬빈은 기질로 부터 ρ-니트로아닐린을 방출시키고, 이 반응의 속도는 자동화된 스펙트로포토미터(오토리더 III, 오르토 진단 시스템)를 사용하여 405nM로 미세적정 플레이트에서 모니터링하였다. 염색체유전자 기질의 트롬빈 분해에 대한 Den-HR의 억제 효과에 대해서는 최종 농도가 nM 내지 mM 사이가 되도록하여 측정하였다. 먼저 트롬빈과 Den-HR을 혼합하고 다음으로 기질을 부가하여 반응을 개시시켰다. 피브리노겐 응고 활성을 측정하기 위하여, pH 6.5인 나트륨 포스페이트 0.05M(BSA, 최종 농도 1%)에서 α-트롬빈(최종 농도 1nM) 200㎕를 5분 동안 실온에서 배양한 후에 항응고제로서 트리소듐 시트레이트를 함유하는 정상 혈장 200㎕를 부가하였다. 피브리노겐 응고의 시작이 관찰되는 시간(트롬빈 시간)에 대해서는 자동화된 응고측정기(coagulometer)를 사용하여 37℃에서 측정하였다. α-트롬빈에 의한 피브리노겐 응고에 대한 돌연변이체의 효과는 일정 범위를 농도에서 첫번째 혼합물 내의 HEPES 완충액을 돌연변이체로 대체하는 것에 의해 측정하였다.

실시예 11- 트롬빈의 혈액응고 촉진활성을 차단하는 트롬빈에 기초된 펩타이드를 함유하는 변형된 덴드로아스핀

인간 트롬빈 내의 트롬보모듈린에 대한 결합 부위는 트롬빈의 B-쇄 영역에 위치하고 있다. 그것의 서열을 도 3b에 도시된 바와 같이 덴드로아스핀 내로 도입시켜 트롬빈 혈액응고 촉진활성을 차단하는 기능 및 ADP/토롬빈에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제하는 기능을 갖는 이기능성 분자를 제조하였다. 이 돌연변이체의 기능상의 특징을 측정하는 것에는 실시예 6에서 설명하는 바와 같은 트롬빈에의해 유도되는 피브리노겐 응고 시간의 측정 및 실시예 3과 6에서 설명하는 바와 같은 ADP/트롬빈에 의해 유도되는 혈소판 응집의 측정을 포함한다. 트롬빈 시간을 연장시키고, ADP 또는 트롬빈에 의해 유도되는 혈소판 응집을 억제시키는 것이 가능한 상기 이기능성 분자의 특성에 대해서는 도 3d에 요약하였다.

도 3c에 도시된 분자의 경우에 있어서는 "외래" 서열의 도입에 의하여 야기되는 입체 장애, 예를 들어, PDGF로부터 유도된 서열이 덴드로아스핀 내로 유입될 때, 항-PDGF 활성은 발생하나 항-혈소판 활성은 상실하는 것과 같은 입체 장애 때문에 루프의 변형이 필요하다.

이 입체 장애는 루프 I 내로 덴드로아스핀의 루프 III과 같은 유사 RGD-루프를 도입함으로써 배제시킬 수 있다. 가공된 분자의 서열은 덴드로아스핀 스캐폴드에 기초되어 있으며, 이들의 기능은 각각 다음의 표 1과 도 1에 요약하였다.

실시예 12- 변형된 덴드로아스핀의 부위 직접 돌연변이 발생

앞서 설명한 각각의 변형된 덴드로아스핀은 RGP 루프 주변 또는 부위 직접 돌연변이 발생 방법의 의해 원하는 분자의 다른 위치에 변형이 일어날 수 있다. 문헌(Lu et al (1996) supra)에 개시되어 있는 것과 같은 방법으로 실험하였다. 실현가능한 RGD 옆면 변형은 덴드로아스핀의 활성에 대한 분석 결과와 함께 도 3b에 도시되어 있다. 변형 중 일부는 활성을 증기시키는 반면에 나머지 변형은 활성을 감소시킨다.

실시예 13- 기니아 피그의 동맥 혈전증 모델에서의 변형된 덴드로아스핀의 항트롬빈 활성

문헌(Carteaux J P et al (1996) Circulation 93: 1568-1574)에 상세히 설명되어 있는 것과 같은 동맥 혈전증을 갖고 있는 기니아 피그를 모델로 하여 상술한 실시예에서 제조된 4개의 변형된 덴드로아스핀의 항트롬빈 활성에 대해 생체 내 방법으로 시험하였다. 약용량의 범위가 체중 1Kg 당 0.1mg 내지 1mg이 되도록 각각의 변형된 덴드로아스핀을 따로따로 동물에 정맥 주입하였다. 헤파린 50-150IU/Kg의 대조표본과 플라시보에 대해서는 병행하여 실시하였다.

실시예 14-래비트 동맥경화 모델에서에 있어서 동맥 손상에 뒤따르는 세포 증식에 대한 변형된 덴드로아스핀의 활성

Den-PDGF, Den-TM, Den-GP 및 Den-HR로 문헌(Ragosla M et al (1996) Circulation 93: 1194-1200)에 기재된 바와 같은 생체 내 모델 시스템으로 래비트에 대해 시험하였다. 래비트에 동맥경화증을 발생시킨 다음, 상기와 같은 변형된 덴드로아스핀을 0.1mg-0.5mg/Kg의 약용량으로 래비트의 정맥 내로 주입하였다. 첫 번째 대조표본 동물에 대해서는 헤파린(150IU/Kg)을 알약 하나로 하여 동맥 내로 투여하였다. 두 번째 대조표본 동물에 대해서는 변형된 덴드로아스핀 대신에 살린이 투여되도록 하였다. 다음으로 시험용 동물과 대조표준 동물에 대해 풍선 혈관 성혈술을 실시한 후에 정량적 혈관 성형술을 실시하였으며, 활성화된 국부 트롬모플라스틴 시간(aPTT)을 측정하였고, 손상된 동맥 내로³H-티미딘의 통합을 실시하여 발광에 의한 혈관의 좁아짐에 대한 연구를 수행하였다.

실시예 15- 생체 내 피그 모델 시스템에서 시험되는 덴드로아스핀의 트롬빈 가수분해 활성

문헌(Murk J S et al (1995) Circulation 93: 792-799)에 기재된 모델 시스템을 사용하였다. 폐색성 혈전증을 가진 피그에 상기 실시예 12에서 언급한 변형된 덴드로아스핀을 0.1mg-1mg/Kg의 약용량으로 정맥 내로 투여하였다. 대조표본 동물에 대해서는 헤파린 또는 히루딘을 약용량으로 (100IU/Kg의 알약으로 20IU/Kg가 주입되는) 투여하였다. 단지 살린만이 투여된 동물을 대조표본으로 사용하였다.

Claims

RGD 모티프를 함유하며, 덴드로아스핀 활성을 부여하는 1차 아미노산 서열 및 덴드로아스핀 활성과는 다른 활성을 부여하는 부가 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼성 폴리펩타이드.
덴드로아스핀 스캐폴드와 부가 비-덴드로아스핀 아미노산 서열을 포함하며, 인테그린 결합 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 혼성 폴리펩타이드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 부가 아미노산 서열을 2개 이상 포함하며, 선택적으로 상기 부가 서열이 동일한 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 부가 아미노산 서열이 하나 이상의 덴드로아스핀의 아미노산 잔기에 의해 분리된 아미노산 서열 부분을 2개 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
상기 제 1 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서, 상기 부가 서열이 혈소판 유도 성장 인자(PDGF), 당단백질 IBα, 히루딘, 트롬보모둘린, 혈관 상피 성장 인자, 형질전환 성장 인자β₁, 기초 피브로블라스트 성장 인자, 안지오텐신 II, 제8 인자 및 폰 빌레브란트 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서, 도 3a, 3b 또는 3c에서 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 부가 서열이 덴드로아스핀 스캐폴드의 (a) 루프 I 및/또는 루프 II; (b) 루프 I 및/또는 루프 III; (c) 루프 II 및/또는 루프 III; 또는 (d) 루프 I, 루프 II 및 루프 III 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 7항에 있어서, 상기 부가 서열이 루프 I 또는 루프 II 내로 삽입되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서, RGD-함유 루프가 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형된 것이며, 바람직하게는 최대 8, 최소 1의 아미노산이 덴드로아스핀의 루프 III 내에서 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 9항에 있어서, 상기 RGD 루프가 표 1에서 나타내는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서, 상기 루프 I 및/또는 II가 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 14 내지 36 개의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변형되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1 내지 제 11항의 어느 한 항에 있어서, 상기 부가 서열이 덴드로아스핀 스캐폴드 내의 2-16, 21-36, 21-31, 28-32, 9-13, 21-23에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기 사이에 혹은 잔기 50 후의 덴드로아스핀 스캐폴드의 말단에 삽입되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
제 1항 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호하는 핵산 분자.
제 13항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고, 선택적으로 이종성 단백질 또는 펩타이드를 암호하는 핵산 서열에 연결되어 융합 산물을 암호하게 되는 것을 특징으로 하는 핵산.
제 14항에 있어서, 상기 프로모터가 유도가능한 IPTG이고, 선택적으로 이종성 단백질 또는 펩타이드가 글루타치온 S-전이효소인 것을 특징으로 하는 핵산.
제 13항 내지 15항 중의 어느 한 항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
제 13항의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pGEX-3X.
제 16항 또는 17항의 플라스미드에 의해 형질전환된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 18항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제 18항 또는 19항의 숙주 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
제 1항 또는 12항 중 어느 한 항에 의해 정의되는 폴리펩타이드를 발현하도록 제 18항 또는 제 19항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 추출하는 단계 및 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항 또는 12항 중 어느 한 항에 의해 정의되는 폴리펩타이드의 제조방법.
a) 동시-발현하는 이종 단백질을 암호하는 핵산에 선택적으로 연결되고, 프로모터에 작동적으로 연결된 덴드로아스핀 스캐폴드를 암호하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

b) 덴드로아스핀 활성를 보이는 아미노산 서열과는 다른 기능을 보이는 부가 아미노산 서열을 포함하는 덴드로아스핀 스캐폴드가 발현되도록, 핵산 잔기들의 삽입, 결실 또는 치환을 하나 이상 이용하여, RGD 모티프를 제외하고 덴드로아스핀 스캐폴드를 암호하는 벡터의 핵산 서열의 적어도 일부를 변형시키는 단계; 및

c) 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 변형된 덴드로아스핀 핵산 서열을 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다가능성 항응고제의 제조방법.
제 22항에 있어서,

d) 숙주 세포 배양물로부터 변형된 덴드로아스핀을 추출하는 단계; 및

e) 상기 추출물로부터 덴드로아스핀을 정제하는 단계와 선택적으로 동시-발현된 이종 단백질로부터 덴드로아스핀을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 23항에 있어서, 이종성 단백질이 글루타치온 S-전이효소(GST)이며, 정제 단계는 GST 친화성 크로마토그래피와 그 후의 변형된 덴드로아스핀을 GST로부터 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 21항 내지 24항의 제조방법에 의해 수득가능한 제 1 내지 12항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드.
제 1항 내지 12항 또는 25항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 치료적으로 유효량 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 26항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
약학적 용도을 위한 제 1항 내지 12항 또는 25항 중의 어느 한 항의 폴리펩타이드.
혈전증과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 의약품을 제조하기 위한 제 1항 내지 12항 또는 25항 중의 어느 한 항의 폴리펩타이드의 용도.
제 29항에 있어서, 상기 질병이 혈전증, 심근 경색, 망막의 신혈관 신생, 내피세포층의 손상, 조절불능의 아팝토시스, 비정상적 세포 이동, 백혈구 보충, 면역 시스템 활성화, 조직 섬유증 및 종양 형성 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 용도.