CN1210306C - 平颏海蛇短链神经毒素以及编码该毒素的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明通过构建平颏海蛇(Lapemis hardwicki)毒腺cDNA文库和DNA测序，得到三个编码短链神经毒素的基因，分别称为sn12、sn36和sn160。采用PCR方法改造并扩增该三个cDNA，克隆到表达载体PETTRX上，以BL21-DE3为表达宿主，经IPTG诱导，三种神经毒素基因在大肠杆菌中都得到高效的可溶性融合表达。短链神经毒素镇痛作用实验表明，sn12、sn36和sn160均能明显提高小鼠的痛阈值。

Description

平颏海蛇短链神经毒素以及编码该毒素的基因
技术领域
本发明涉及平颏海蛇短链神经毒素以及编码该毒素的基因。
背景技术
蛇神经毒素广泛存在于眼镜蛇科和海蛇科，是蛇毒蛋白的重要组成成分。根据其作用靶位点不同，蛇神经毒素可被分为两大类型，即突触前神经毒素和突出触后神经毒素(Singh，B.R.，Tu，A.T.Overview of snakevenom，In：Natural Toxin 2：Structure，Mechemism of Action andDetection.New York：Plenum Press，1996，391：37-62)。突触前神经毒素抑制乙酰胆碱从突触前运动神经末梢的释放，而突触后神经毒素特异性地结合于脊椎动动物肌肉突触后膜运动终板或鱼类发电器官中的烟碱胺型乙酰胆碱受体而阻断神经传导，影响肌肉细胞运动终板与烟酰胺型乙酰胆碱结合有关的生理过程(Toru，T.，Satoshi，O.，Eisaku，N.，et al.Complete nucleotide sequences of cDNAs encoding long chain α-neurotoxins from sea krait，Laticauda semifasciata.Toxicon.1999，37：181-185；覃公平主编，中国毒蛇学，第2版，1998，广西，广西科学技术出版社，372-385)。突触后神经毒素根据分子量大小和二硫键数目可以分为短链神经毒素和长链神经毒素两种类型。短链神经毒素有60-62个氨基酸残基构成，含4对链内二硫键；长链神经毒素则由66-79个氨基酸残基构成，含五对链内二硫键，两类神经毒素都具有一个共同的三指环结构(Louis，W.C.，Robert，S.D.，Handbook ofNeurotoxicolohy，New York：Marcel Dekker Inc，1995，637-665.)。
突触后神经毒素所引起的神经毒症状的主要临床特点是——动物在1小时或更短的时间内产生松弛性的肌肉麻痹，四肢行动缓慢，接着是呼吸困难，最后经过窒息性惊厥死亡。通过人工呼吸可以延迟动物的死亡，有些甚至能因此而得救。
突触后神经毒素在生物学和医学领域中应用广泛，特别是在分子生物学分子药理学中尤为重要。蛇神经毒素可以制成镇痛剂，用于风湿性关节痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、晚期癌肿痛和麻风神经痛等，止痛作用快，效果好，连续用药不会产生耐药性，无成瘾性，用药剂量少，一般没有严重的毒副作用。其中，对晚期癌肿痛治疗的研究有着很重要的意义(陈汝筑，等眼镜蛇神经毒素的镇痛作用，中国药理学通报，1998，4(2)：113-117；郝文学，陈远聪主编，蛇毒的生化、毒理和应用，北京：科学出版社，1980，109-115)。此外突触后神经毒素因为能与烟酰胺型乙酰胆碱受体结合，亲和力高，且有特异性，故可用于研究神经受体。具体表现在：作为检测烟酰胺型乙酰胆碱受体的标记物；用于烟酰胺乙酰胆碱受体的纯化；作为研究药物与受体相互作用的工具；作为研究烟酰胺乙酰胆碱受体结构与性质的工具。另外，在重症肌无力疾病研究中，突触后神经毒素也有相当大的作用。重症肌无力的临床特征主要是横纹肌稍有活动即容易疲乏无力，是自体免疫破坏烟酰胺乙酰胆碱受体引起的。目前，有人用放射性碘标记神经毒素和烟酰胺乙酰胆碱受体的方法来测病人血清中的乙酰胆碱受体的抗体含量，从而对重症肌无力进行诊断。也有人用短链神经毒素分离提纯出烟酰胺乙酰胆碱受体亚单位，制备抗受体亚单位的单克隆抗体，进一步研究重症肌无力的发病机制。并着手于动物试用单克隆抗体来中和乙酰胆碱受体的抗体，以探讨新的治疗途径(覃公平主编，中国毒蛇学，第2版，1998，广西，广西科学技术出版社，495-497)。
目前蛇神经毒素主要采取生化提取方法从蛇毒中获得，成本高、纯度低，所以利用基因工程方法生产蛇神经毒素具有明显发展优势。从1995年非洲眼镜蛇(Dendroaspis angusticeps)毒素基因的克隆与表达开始(Leonard，A.S.，Mark，A.O.，Pierre，J.L.，et al.Cloning and expression of mambatoxins.Toxicon，1995，33(4)：439-474)，关于用生物工程方法生产蛇神经毒素和其它毒素多肽的报道不断出现(Fatemeh，A.，Arunmozhiarasi，A.，Nget，H.T.，et al.Four new postsynaptic neurotoxins fromNaja Naja Sputatrix venom：cDNA cloning，protein expression，andphylogenetic analysis.Toxincon.1998，36(12)：1871-1885；Nanling，G.，Arunmozhiarasi，A.and Kandiah，J.Postsynaptic short-chain neurotions fromPseudomaja textilis cDNA cloning，expression and proteincharacterization.Eur.J.Biochem.1999，265：982-989)。
海蛇广泛地分布于印度洋和太平洋的较温暖流域，其中大部分生存在南亚及东印度洋海岸。它们可通过平的、桨状的尾部得以辨认。海蛇中除了Emydocephalus annulatus外，均有很高的毒性，且比陆地蛇毒性高得多。但在毒素组成上，海蛇又比陆地蛇简单很多(ChikahisaTakasaki，1998，The Toxinology of Sea Snake Venoms，J.Toxicol.-ToxinReviews，17(3)，361-372；)。蛇毒神经毒素是海蛇毒液中毒性最强的成分，它使动物产生弛缓性麻痹和呼吸衰竭，从而导致动物死亡。国内外对海蛇毒素的研究报道要比陆地蛇少得多，而且大多只停留在蛋白质水平，从事海蛇毒素基因的研究报道并不多。到目前为止Genbank中发表的海蛇毒素氨基酸序列约有100余种，而海蛇毒素编码基因序列发表还不到50个。
由于海蛇毒的毒性强烈，排毒量甚微，难以采集到足够的毒液量，因此，给分离提纯海蛇毒的组分，研究毒素和酶分子的特性和结构，以及在科学研究和实际应用等各方面带来一定的困难(宋杰军，毛庆武主编，海洋生物毒素学，北京，北京科学技术出版社，1996，337-354)。
随着天然毒素研究的迅速发展，利用天然毒素具有高度专一生物活性而进行的临床应用已十分广泛，蛇毒在毒素应用的领域占有显著地位。科学家们将天然生物活性物质作为寻找新药的重要向导，蛇毒的利用已引起了药理、药物、生化及医学工作者们的重视，在其临床应用研究方面也得到了迅速发展。神经毒素主要存在于海蛇科和眼镜蛇科，蛇神经毒素镇痛的研究已有很长的历史，最早发表的这类论文的是Macht(1936)。Steinbrocker1940年用眼镜蛇毒素治疗65例关节炎和神经痛病人，其有效率为59％。Hynson、Westco和Dunning公司用蛇毒制成两种镇痛药Cobroxin和Nyloxin。前者是神经毒素，每安瓿为1.0ml，含量50×106IU，用于治疗各种顽固性疼痛和恶性肿瘤疼痛；后者为含有神经毒素3.3×106IU，加入1.5ml硅酸和3.3ml甲酸的生理盐水溶液，专门用于治疗关节痛。这两种药物已列入美国药物局方中。1975年中国科学院昆明动物研究所等单位，利用眼镜蛇毒素研制成功眼镜蛇神经毒素注射液，此药现已由广西梧州市制药厂批量生产，商品名称为“克痛宁注射液”。该注射液是一种新型的镇痛剂，止痛作用快，效果好，连续用药不会产生耐药性，也不会成瘾，用药剂量小，一般没有严重的副作用，可用于风湿关节痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、晚期癌肿痛和麻风神经痛等。但该药仅供肌注，且注射部位起硬结，给药3天至5天后才起作用。中国人民解放军蛇毒临床应用研究中心用近代技术将眼镜蛇毒神经毒素分离纯化制备新型镇痛针剂“新克痛宁”，静脉给药或肌注立即其作用。国内外应用眼镜蛇神经毒素缓解恶性肿瘤疼痛、各种神经痛、关节痛已有60多年的历史(中国药理学通报1988年第4卷第2期眼镜蛇神经毒素的镇痛作用，陈汝筑  吴秀荣)，国内众多的医院采用肌注、静脉注射等给药方式将其用于临床治疗，给药剂量为小鼠半致死量的1/2500，{每日给药一次，每次1--2支，个别每日两次，每次一支。急性疼痛病例、疼痛消失即停药，慢性痛则再巩固用药3--5次，20d为一疗程，必要时重复(克痛宁用药，每支2ml，含神经毒素70ug))，安全可靠(蛇志1999年第11卷第1期新克痛宁术后镇痛效果观察王兴业/吉林省四平市207医院王凤学/***总医院；蛇志1998年第10卷第3期克痛宁配合中药治疗坐骨神经痛182例分析高忠恩/江苏省苏州市中医院；生化药物新技术应用研讨会论文集1996中国生化药物杂志克痛宁及其复方临床镇痛效果比较观察  曹宜生  程宝全  赵光怀等/***后勤部军事医学研究所/广州市第六人民医院)。蛇神经毒素因其性质也可用于戒毒，临床上用口服方式达到了良好的治疗效果(戒断医学  蛇毒胶囊治疗***成瘾临床疗效观察  昆明医学院药物依赖性研究治疗中心  扬良  李红吴亚维等)。
蛇神经毒素之间氨基酸的同源性很高。目前应用的神经毒素的来源都是从蛇毒中进行生化提取，在纯度和成本方面都存在着较大的缺陷，纯度不够会导致医疗事故，采用基因工程技术生产的蛇神经毒素不但解决目前存在的问题，而且与天然蛇神经毒素具有相同的药效，有着更大的发展潜力。
发明内容
本发明的目的就是通过构建平颏海蛇毒素cDNA文库，从中筛选得到编码海蛇神经毒素的cDNA克隆，进而利用高效大肠杆菌表达***表达出具有生物活性的分离的海蛇神经毒素蛋白，用于进一步的功能研究和药物开发。
本发明所选择的海蛇是属于海蛇科平颏海蛇属的平颏海蛇(Hydrophiinae，Lapemis hardwickii Gray)，采自广西省北海市。平颏海蛇毒素cDNA文库的构建首先解剖得到海蛇的毒囊组织，提取总RNA，然后分离出mRNA进行逆转录，获得cDNA，最后将cDNA连接到质粒载体pcDNA3.0上并转化E.coli.从而构建成平颏海蛇毒素cDNA文库。
本发明通过对平颏海蛇毒素cDNA文库克隆的大规模序列测定，从中得到了三个编码平颏海蛇短链神经毒素的cDNA克隆，分别称为sn12、sn36和sn160。这三个cDNA都编码81个氨基酸，等电点约为8.7，分子量约为9,000道尔顿，包括21个氨基酸的信号肽和60个氨基酸的成熟肽，具有典型的短链神经毒素一级结构的特征，三个蛋白之间只有一个氨基酸残基的差异，位于成熟肽的第46位，分别为Pro46、His46和Arg46。他们的核苷酸及氨基酸序列如图1所示。
本发明通过设计了一对通用引物，将三个编码平颏海蛇短链神经毒素成熟肽的基因用PCR方法扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒pETTRXsn12、pETTRXsn36和pETTRX sn160。经过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，SN12、SN36和SN160融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的17％以上，并且基本上处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了SN12、SN36和SN160融合蛋白的纯化条件，采用超声裂解液经Ni2+螯合型琼脂糖填料(Chelating Sepharose)亲和色谱层析和Sephacryl S-100HR凝胶色谱层析两步纯化，重组神经毒素纯度可高达98％。
本发明的神经毒素可采用肌注、静脉注射等给药方式将其用于临床治疗，给药剂量为小鼠半致死量的1/2500，{每日给药一次，每次1--2支，个别每日两次，每次一支。急性疼痛病例、疼痛消失即停药，慢性痛则再巩固用药3--5次，20d为一疗程，必要时重复。
本发明获得的重组平颏海蛇短链神经毒素蛋白是有生物活性的。将经凝胶过滤色谱层析纯化的三种重组神经毒素分别腹腔注射NIH小白鼠，小鼠都表现出明显的神经中毒现象。SN12、SN36和SN160融合蛋白的半致死浓度分别为1.734mg/Kg、2.544mg/Kg和6.557mg/Kg。根据Fox，J.W.1977年的研究报道(Fox，J.W.，Elzinga，M.and Tu，A.T.Amino acidsequence of a snake neurotoxin from the venom of Lapemis hardwickii andthe detection of a sulfhydryl group by laser Raman spectroscopy.FEBS Lett.1977，80(1)：217-220)，SN12的天然蛋白的LD50是0.2mg/kg，我们的重组蛋白的神经毒活性只约为天然蛋白的1/12。
本发明的重组平颏海蛇短链神经毒素蛋白具有明显的镇痛作用。注射了重组平颏海蛇短链神经毒素蛋白的小鼠痛阈值有了明显的提高，其中SN160效果最好，痛阈值提高了63.1％。本发明的重组平颏海蛇短链神经毒素蛋白可应用于新型镇静药的研制，用于镇痛、麻醉和戒毒，或临床上诊断重症肌无力等等。
由该表达质粒载体经Kpn I和NotI酶切，可得到220bp的片段，即为编码6His与平颏海蛇短链神经毒素成熟肽融合蛋白序列的序列，另外的约5.9kb的条带为pETTRX载体质粒。
本发明的表达质粒载体的复制方法：参照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，减法提取质粒。
以下通过实施例和附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1海蛇毒腺总RNA和mRNA电泳结果。
图2海蛇毒腺cDNA电泳结果。
图3海蛇毒素cDNA文库总质粒ECORI/NotI双酶切和PCR检测电泳结果。
图4sn12、sn36和sn160的核苷酸序列及由核苷酸序列推测的氨基酸序列。
图5含有sn36基因的重组质粒pBSK-sn36的构建图。
图6含基因sn36的重组质粒pPETTrx-sn36的构建图。
图7可融性融合表达载体PETTrx的物理图谱。
图8平颏海蛇短链神经毒素基因sn36的PCR产物电泳检测。M：100bpDNA ladder 1：sn36 PCR扩增产物；2：PCR反应阴性对照。
图9pB SK-sn36重组质粒酶切鉴定电泳分析。M1：100bp DNAladder；M2：1kb DNA ladder。1：重组质粒双酶切产物/Kpn I+BamH I；2：载体pBluscript M13(+)双酶切产物/KpnI+BamH I
图10pETTrx-sn36重组质粒酶切鉴定电泳分析。M1：100bp DNAladder；M2：1kb DNA ladder。1：重组质粒双酶切产物/Kpn I+Not I，2：载体pETTrx双酶切产物/Kpn I+Not I。
图11平颏海蛇重组神经毒素SN12的SDS-PAGE分析。1.BL21(pET22b)的总蛋白质；2.BL21(pETTRXsn12)的总蛋白质；3.BL21(pETTRXsn12)的总可溶性蛋白质；4.融合神经毒素SN12，通过Ni2+螯合型琼脂糖填料纯化；5-6.融合神经毒素SN12，通过SephacrylS-100HR纯化；M.Protein marker。
图12平颏海蛇重组神经毒素SN36的SDS-PAGE分析。1.BL21(pET22b)的总蛋白；2.BL21(pETTRXsn36)的总蛋白；3.BL21(pETTRXsn36)的总可溶性蛋白；4.融合神经毒素SN36，通过Ni2+螯合型琼脂糖填料纯化；5.融合神经毒素SN36，通过Sephacryl S-100HR纯化；M.Protein marker。
图13平颏海蛇重组神经毒素SN160的SDS-PAGE分析。1.BL21(pETTRXsn160)的总蛋白；2.BL21(pET22b)的总蛋白；3.BL21(pETTRXsn160)的总蛋白；4.融合神经毒素SN160，通过Ni2+螯合型琼脂糖填料纯化；5.融合神经毒素SN160，通过Sephacryl S-100HR纯化；M.Protein marker
图14重组神经毒素的Ni2+螯合型琼脂糖填料亲和色谱层析图
图15重组神经毒素的Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析图
具体实施方式
实施例一平颏海蛇毒素cDNA文库的构建
平颏海蛇毒囊总RNA的提取参考《现代分子生物学实验技术》[11]的一步快速热酚抽提法进行；mRNA的提取按Amersham Pharmacia公司的mRNA Purification Kit说明书操作；cDNA的合成按AmershamPharmacia公司的TimeSaverTM cDNA Synthesis Kit说明书操作。
采用异硫氰酸胍一步法提取的毒腺总RNA经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的28S、18S和5.8S三条rRNA条带，和数条特异RNA条带(见图1)，表明总RNA完整性良好，而且表现出平颏海蛇毒腺的高分化特点。采用mRNA Purification Kit提取mRNA，电泳结果呈现均匀的smear(见图1)，表明mRNA的完整性良好。取约5μg mRNA进行逆转录，合成双链cDNA，电泳结果显示cDNA呈现smear状，大小在200bp到8kb的范围内，主要是在2kb以下的区域，在500bp附近更为集中(见图2)，表明所合成的cDNA编码的蛋白分子量大部分较小，这与海蛇蛇毒中富含小分子多肽的事实相吻合[14]。将cDNA***质粒载体pcDNA3上构建成cDNA表达文库，文库克隆数为9.96×105。提取总文库质粒进行酶切和PCR分析，结果表明cDNA***片段大小落在500bp-8k的范围内，而在在500bp和1kb处出现较亮的泳带(见图3)，在其它区域还存在数条弱带，挑取172个克隆提取质粒，酶切鉴定表明超过95％的克隆为重组子，表明该cDNA表达文库具有较好的质量。
实施例二  平颏海蛇短链神经毒素克隆序列的测定和分析
随机挑选500个cDNA克隆PEG纯化法[13]提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由大连宝生物工程有限公司提供)，正反向进行序列测定。结果表明平颏海蛇毒腺cDNA表达文库中毒素基因的丰度很高。其中，有三个编码短链神经毒素的基因，分别称为sn12、sn36和sn160，它们编码的蛋白长81个氨基酸，其中信号肽有21个氨基酸残基，成熟肽有60个氨基酸残基，具有典型的短链神经毒素一级结构的特征，三个蛋白之间只有一个氨基酸残基的差异，位于成熟肽的第46位，分别为Pro46、His46和Arg46。
将推测的氨基酸序列通过因特网进行BLAST序列相似性查询，程序为BLASTTP，结果表明sn12编码的短链神经毒素的成熟肽基酸序列与Tu等从平颏海蛇毒素中分离提纯的短链神经毒素完全一致[1]，而sn36和sn160编码的蛋白则是新的短链神经毒素。另外，在GENEBANK中暂时找不到相同的核苷酸序列。
sn12、sn36和sn160的核苷酸序列及由核苷酸序列推测的氨基酸序列见图-4，三个基因的序列皆分别由三个以上不同的cDNA克隆通过序列测定而得出，排除了可能由cDNA合成和序列测定带来的误差。从图可看出sn12、sn36和sn160三个基因在非编码区的核苷酸序列同源性也很高，这与Tamiya等(1999)报道的类似[3]。
实施例三  重组平颏海蛇短链神经毒素表达质粒的构建
根据sn12、sn36和sn160基因编码的成熟肽两端序列，合成一对引物，序列如下：
上游引物，5’CGG  GGT ACC  GAC GAC GAC GAT AAA ATG ACA TGTTGC AAC CAA CAG TC 3’
                  KpnI      肠激酶位点
下游引物，5’CGC  GGA TCC TTA ATT GTT GCA TTC GTT TGT ATG GC3’
                BamHI
PCR扩增、基因克隆皆按常规方法进行[13]。构建的详细过程见图5，图6。
克隆到本实验室构建的原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒pETTRXsn12、pETTRXsn36和pETTRX sn160。PCR产物约220bp(见图7)，编码60个氨基酸残基。克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定正确。
载体pETTRX以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×HIS结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有肠激酶位点，以便外源蛋白单体的获得。载体pETTRX结构简图见图8。
实施例四  重组平颏海蛇短链神经毒素融合蛋白的表达
将pETTRXsn12、pETTRXsn36和pETTRX sn160转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解物经SDS-PAGE电泳分析表明基因工程菌经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量于用软件PROTEINANALYSIS预测的理论值22.1kD相符。
实验表明，尽管高温诱导的重组蛋白表达量很高，而低温诱导的则相对低，但是低温诱导的重组蛋白折叠比较充分，可以提高重组蛋白的可溶性，相对而言，重组蛋白的生物活性会高些。经过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索，基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6，加入100mMIPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2％，26℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。薄层扫描分析表明，在此条件下SN12、SN36和SN160融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的17％以上，基本上处于可溶状态。
实施例五  重组平颏海蛇短链神经毒素融合蛋白的纯化
因为三种重组神经毒素的氨基酸序列非常相象，彼此之间只有一个氨基酸残基的差异，所以采用完全相同的纯化方案。
超声裂解液经Ni2+螯合型琼脂糖填料亲和色谱层析和SephacrylS-100HR凝胶色谱层析两步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明重组神经毒素纯度分别达到70％和98％(图9；图10；图11)。以2L基因工程菌培养物为材料，最终获得约100mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们并没有采用严格的洗脱条件。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件：50mMPBS，500mMNaCl，pH7.8(A液)；50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPBS，
500mMNaCl，pH6.0(C液)；400mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重组神经蛋白在D液被洗脱下来(图12)。将经Ni2+亲和柱初步纯化的重组蛋白直接上样Sephacryl S-100HR凝胶色谱层析，用生理盐水洗脱，根据洗脱峰(图13)分段收集洗脱液，从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。凝胶过滤色谱在此起到了很好的脱盐和进一步纯化的作用，用生理盐水洗脱可以让纯化的蛋白直接进行生物活性测定实验，避免透析。
实施例六  重组平颏海蛇短链神经毒素融合蛋白的神经毒性鉴定
将100只19g-21g NIH小鼠(雌雄各半)分成5组，每组20只，分别以五种适当的浓度腹腔注射经过滤除菌的重组短链神经毒素，以相同条件下表达和纯化的pETTrx表达载体表达的分子伴侣TRX蛋白为阴性对照。观察小鼠的反应并记录每组小鼠的死亡数目，采用Microsoft Excel的线性回归软件，根据对数剂量与经验概率单位绘制直线，计算LD50。
将经凝胶过滤色谱层析纯化的三种重组神经毒素分别腹腔注射NIH小白鼠，小鼠都表现出明显的神经中毒现象，如竖毛，呆滞，颤抖，翻正反射消失，呼吸困难，******失控等，最后强烈抽搐，窒息死亡，死亡后十几分钟内心跳仍未停止。同时，作为阴性对照的生理盐水和融合伴体TRX却无任何神经中毒症状。可见三种重组神经毒素在融合状态下都具有神经毒活性。尽管三种重组神经毒素表只有一个氨基酸残基的不同，但是它们表现出的神经毒活性却有强弱差异，从强到弱的次序为：SN160，SN12，SN36。
我们在确定了重组神经毒素具有神经毒活性后，以LD50为指标对毒性的大小进行定量描述。先进行数组预实验，以确定三种毒素求取半致死浓度的五组注射剂量。每种重组神经毒素注将射100只19g-21g的NIH小白鼠。将100只小白鼠随机分成五组，每组20只，雌雄各半，分别腹腔注射不同浓度的重组神经毒素0.5ml，以注射剂量对数为横坐标，经验概率单位为纵坐标作图，求得对应于概率单位5的剂量对数算出LD50。实验具体数据见表1。
    表1重组神经毒素SN12、SN36和SN160对NIH小白鼠LD50的测定
Figure C0012483100161
实施例七重组平颏海蛇短链神经毒素融合蛋白的镇痛作用
镇痛作用研究采用小白鼠热板法(参照药理学实验方法)，把小白鼠放在预先加热到55℃的金属板上，以添后足维常用痛反应指标。实验前将反应迟钝或过敏反应的小鼠筛除。
雌性小白鼠150只，体重18～22.5g，随机分为对照组和不同剂量(1/8LD50、1/4LD50、1/2LD50)给药组，给药方式采用腹腔注射，对照组注射生理盐水0.2mL。
统计结果见表2，镇痛效果随着剂量的加大而增强，三种短链神经毒素作用有所区别，SN160作用最强、SN12次之、SN36较弱。
               表2平颏海蛇短链神经毒素的镇痛作用(小鼠热板法)
批次 剂量  例数           潜伏期(X±SD秒)   痛阈提高百分率(％)
    给药前              给药后
    1  1/2LD50 SN12  20     17.1±5.7     25.9±5.4   51.3
 1/2LD50 SN36  20     16.5±3.5     23.9±6.3   44.8
 1/2LD50 SN160  20     17.6±4.4     28.7±3.5   63.1
2  1/4LD50 SN12  20     18.6±5.4     27.1±5.9   45.7
1/4LD50 SN36 20 17.2±4.1 23.6±3.5 37.2
 1/4LD50 SN160  20     17.5±4.4     27.5±7.5   57.1
    3  1/8LD50 SN12  20     18.0±3.8     24.6±3.5   36.7
 1/8LD50 SN36  20     16.6±4.8     20.0±3.5   20.5
 1/8LD50 SN160  20     17.2±4.1     24.9±3.5   44.7
    4  对照组  20     18.1±4.0     19.4±4.6   7.1

Claims (9)

1.一种平颏海蛇短链神经毒素基因，其选自sn12、sn36和sn160，来源于平颏海蛇(Lapemis Hardwickii)毒腺cDNA文库，核苷酸序列如下，其中，″-″表示与sn160的序列相同：
sn12  T-GAATTCGGC-CGAGG-------------------------------------------
sn36           ---------------------------------------------------
sn160 GGCTCCAGAGAAGATCACAAGATGAAAACTCTGCTGCTGACCTTGGTGGTGGTGACAATC 60
sn12  ------------------------------------------------------------
sn36  ------------------------------------------------------------
sn160 GTGTGCCTGGACTTAGGATACACCATGACATGTTGCAACCAACAGTCATCGCAACCTAAA 120
sn12  ------------------------------------------------------------
sn36  ------------------------------------------------------------
sn160 ACCACTACAAATTGTGCAGAGAGCTCTTGCTATAAAAAGACTTGGAGCGATCACCGTGGA 180
sn12  ---------------------------------------CCC------------------
sn36  ---------------------------------------CAC------------------
sn160 ACTAGAATTGAAAGGGGATGTGGTTGCCCTCAGGTGAAGCGCGGTATTAAACTTGAATGT 240
sn12  ------------------------------------------------------------
sn36  ------------------------------------------------------------
sn160 TGCCATACAAACGAATGCAACAATTAGCTCTACGAATGGCTAAATTCCTTGAGCTTTGCT 300
sn12  -------------------------------A-------------------C--------
sn36  ------------------------------------------------------------
sn160 CTCATCCATCAAGGACCATCCTTGAAAATTTGTGCTTCTGGCCTTTACCACTACATGGTC 360
sn12  ----------------------------G-------------------------------
sn36  ------------------------------------------------------------
sn160 CATCATCCCCCTCTCCCCTGCTGTCTTTAACACCTCAACATCTTTCCCTTTTCTCTTGTT 420
sn12  -----C------------------------------------------------------
sn36  ------------------------------------------------------------
sn160 CTGTAAGTTTCCTTCTGCTAGTTCTGTAGTTTGAGAATCAAATAAACCTCAGCATCCAAA 480
sn12  ------------------------
sn36  ----------------------------------------GCATCTTAGAG
sn160 AAAAAAAAAAAAAAAAAAATTCCTGCGGCCGCTCGAGCAT                     520。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于编码81个氨基酸，等电点为8.7，包括21个氨基酸的信号肽，60个氨基酸的成熟肽，成熟肽氨基酸序列如下：
m  t  c  c  n  q  q  s  s  q  p  k  t  t  t  n  c  a  e  s  s  c  yk  k  t  w  s  d  h  r  g  t  r  i  e  r  g  c  g  c  p  q  v  k(p/h/r)g  i  k  l  e  c  c  h  t  n  e  c  n  n。
3.一对引物，用于PCR方法扩增权利要求1所述基因的编码成熟肽的部分，核苷酸序列如下：
上游引物：5′CGG GGT ACC CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC ATG ACA TGTTGC AAC CAA CAG TC 3′
下游引物：5′CGC GGA TCC TTA ATT GTT GCA TTC GTT TGT ATG GC 3′。
4.一种重组质粒载体，其特征在于含有权利要求1所述的基因sn12、sn36或sn160。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于载体分别为pTRX-SN12、pTRX-SN36和pTRX-SN160，是以硫氧还蛋白为担体蛋白，具有6个组氨酸亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点。
6.如权利要求4和5中任一所述的载体，其特征在于载体转化的是能表达平颏海蛇短链神经毒素融合蛋白的大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于大肠杆菌表达平颏海蛇短链神经毒素基因sn12、sn36和sn160，基因在大肠杆菌内以胞内可溶的融合蛋白形式高效表达。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于表达产物的超声裂解液经Ni2+螯合型琼脂糖填料亲和色谱层析、蛋白酶3C切割、离子交换层析、和凝胶过滤层析纯化后，得到纯度为95％以上的融合蛋白，得率高于15mg/L菌液。
9.权利要求1的平颏海蛇短链神经毒素基因所编码的神经毒素在制备镇痛药物和治疗神经***疾病的药物中的应用。
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