JP2003532384A

JP2003532384A - 非デンドロアスピンのビヒクルとしてのデンドロアスピンの用途

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Publication number: JP2003532384A
Application number: JP2001558024A
Authority: JP
Inventors: シンジー・ル; ビジェイ・バー・カッカー
Original assignee: Trigen Ltd
Current assignee: Trigen Ltd
Priority date: 2000-02-05
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2003-11-05
Also published as: EP1252313A2; WO2001057210A2; WO2001057210A3; AU2001228714A1; US20020120102A1; GB0002625D0

Abstract

(57)【要約】１つ又はそれ以上の非野生型デンドロアスピンドメインに対する骨格としてのデンドロアスピンの用途に関し、当該デンドロアスピン骨格は、天然のＲＧＤモチーフを除去したりこれを（ｉ）インテグリン結合活性のないアミノ酸配列、又は（ii）アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を含有するＲＧＤ以外のインテグリン結合アミノ酸配列により置き換えたりして修飾されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（本発明の分野）本発明は、修飾デンドロアスピン骨格からなる分子に関し、特には非デンドロ
アスピンドメインに対するビヒクルとしての修飾デンドロアスピンの用途に関す
る。

【０００２】（本発明の背景）血液凝固の役割は、止血栓（血栓）の強化と安定化のために不溶性のフィブリ
ンマトリックスを提供することである。架橋結合したフィブリン血栓の形成は、
血漿蛋白まで含む一連の生化学的相互作用に起因する。心筋梗塞、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血症、及び末梢動脈塞栓症といった急
性の管疾患は、血栓により血管の一部又は全部のいずれかが閉塞することにより
引き起こされる。

【０００３】血管内での血栓の形成は、血栓症と称され、血小板凝集に依存するものである
。血管損傷（例えば外科的方法において起こり得る）との関連においては、血小
板と損傷した血管内皮表面、及び他の血小板との相互作用が、血塊又は血栓成長
過程における主要因子である。血小板凝集は、フィブリノーゲンと他の血清蛋白の血小板形質膜上の糖蛋白レ
セプターIIｂ/IIIａ複合体への結合に依存する。糖蛋白ＧＰIIｂ/IIIａは、イン
テグリンとして周知の細胞接着レセプターの大ファミリーの一要素であり、イン
テグリンの多くは、Arg-Gly-Asp（ＲＳＤ）トリペプチド認識配列を認識するこ
とが知られている。

【０００４】インテグリンは、細胞の相互の接着又は細胞外マトリックス基質への接着を仲
介する細胞表面レセプターのファミリーである（1-５）。それらは、ヘテロ二量
化して２０のレセプターを生成する（６）１６α及び８βサブユニットの中から
選ばれる非共有結合性α及びβ膜貫通サブユニットから構成される。インテグリ
ンのうち、血小板膜α_IIbβ₃インテグリンが最も特徴的である（３、５）。細胞
活性化により、α_IIbβ₃インテグリンは、数種の糖蛋白と、主としてフィブリノ
ーゲン（９）、フィブロネクチン（１０）、フォンウィルブランド因子（１１）
、ビトロネクチン（１２）、及びトロンボスポンジン（１３）に存在するArg-Gl
y-Asp（ＲＳＤ）トリペプチド配列（６−８）を通じて結合する。これら糖蛋白
のリガンドとそのインテグリンレセプターとの間の相互作用の特質は、当該レセ
プター（１４）とリガンド（１５）との双方で起こる構造変化を伴なう複雑なも
のと知られている。

【０００５】当該相互作用の実際的な効果は、アテローム性動脈硬化症より引き起こされる
動脈の限局性狭窄の処置を考慮することにより説明可能である。これは、通常バ
ルーン血管形成術により外科的に処置可能な状態である。この方法は浸潤性であ
り、時に動脈壁に組織障害がおこり、血栓を形成することになり得る。動脈壁中
のフィブロネクチンのような細胞外蛋白は、動脈血に暴露されるようになる。血
小板がインテグリンレセプターを介してフィブロネクチンのＲＧＤモチーフに結
合することで、血小板凝集が引き起こされ、凝血反応カスケードが開始される。
損傷部位での血小板凝集を特異的に阻害し、当該部位での凝結もまた阻害する薬
剤が必要とされている。当該薬剤は、非毒性で、全身出血の危険性のような望ま
しくない副作用がないものでなければならない。

【０００６】アスピリン、ジピリダモール、及びフィロピジンといった血栓形成を防止する
様々な薬剤が今や利用可能である。これらの製品は、一般的には血小板の活性化
及び凝集を阻害したり、あるいは血液凝固過程を遅延させるが、持続性出血を引
き起こすという潜在的な副作用を有している。更には、新しい血小板の形成ある
いは供給だけでもって当該製品の作用効果が覆されてしまう可能性がある。

【０００７】従って、特定の細胞接着を目的としたアンタゴニストの開発は、血栓症及びア
テローム性動脈硬化症の処置において臨床上非常に有意義なものであろう。多く
のインテグリン−リガンド相互作用に共通した主要な細胞接着メカニズムは、Ｒ
ＧＤ、ＫＧＤ、ＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶを含む抑制性合成ペプチド類似物を用いて
同定したアスパラギン酸(Ｄ)含有配列又はモチーフの認識を伴なうものである。
しかしながら、これらのペプチドは、有効性及び特異性が低いという点で限界が
ある。このことについては、ディスインテグリンと称する蛇毒由来のＲＧＤ含有
小蛋白ファミリーの発見により大きな進展を遂げた。 Scarboroughら（１７）は、ＧＰIIｂ−IIIａ特異的インテグリンアンタゴニス
ト活性を示す蛇毒（barbourin）と称するSistrurus M. Barubouriの毒液から単
離した自然界に存在するＫＧＤ含有蛇蛋白を報告している。

【０００８】最近、種々の蛇毒から多くの蛋白が、血小板凝集及びインテグリン依存細胞接
着の強力な阻害剤として同定されてきている。ディスインテグリンファミリーに
属するこれらの蛋白の大半は、高度な配列相同性を共有しており、小さく（４−
８ｋＤａ）て、システインリッチであり、そしてＲＧＤ（１６）又はＫＧＤ（１
７）配列を含有する。ディスインテグリンファミリーに加えて、同様の阻害強度
で、高度にジスルフィド結合し、そして小さいサイズの非ディスインテグリンＲ
ＧＤ蛋白が幾つか、ヘビのElapidaeファミリーの毒液（１８、１９）とヒルのホ
モジネート（２０）との双方から単離されている。これらの蛋白は全て、単純な
直鎖状ＲＧＤペプチド−蛋白骨格内に保持されたＲＧＤモチーフの最適構造の要
因となる特徴−に比べておよそ１０００倍強力な糖蛋白リガンドとインテグリン
レセプターとの相互作用の阻害剤である。キストリン（２１−２３）、フラボリ
ジン（２４）、エキスタチン（２５−２８）、アルボラブリン（２９）、デコル
シン（３０）、及びデンドロアスピン（３１、３２）を含む数種の阻害剤のＮＭ
Ｒ構造が報告され、現段階で解明されている共通の構造的特徴は溶媒暴露型ルー
プの末端にＲＧＤモチーフが位置しているということのみであり、これが阻害作
用に対して最も重要な特徴である。

【０００９】かくして、デンドロアスピンは短い神経毒ファミリーの自然変異種であるが、
接着性トリペプチドArg-Gly-Asp（ＲＳＤ）を含有し、インテグリンを介した細
胞接着性相互作用の強力なアンタゴニストとして機能する。デンドロアスピンは
、もともとは血小板凝集及びインテグリンを介した血小板接着の強力な阻害剤と
してコブラ科 Dendroaspis Jamesonii（Jameson's mamba）の毒液から単離され
た。デンドロアスピンの活性は、溶媒暴露ループ内に含有されるＲＧＤモチーフ
に起因する。国際特許出願ＷＯ98/42834は、他の事項に加えて、デンドロアスピ
ン骨格に基づいた二又は多機能性分子について記述しており、インテグリン結合
機能に加えて第２の機能が、デンドロアスピン骨格に他の蛋白ドメインを加える
ことにより達成されている。この国際特許ＷＯ98/42834及びその全体の内容を出
典明示により本明細書の一部とする。

【００１０】国際特許ＷＯ98/42834に示されるように、デンドロアスピン分子は５９のアミ
ノ酸残基を有し、３つのループを含んでなる。ループＩは４〜１６番目、ループ
IIは２３〜３６番目、そしてループIIIは４０〜５０番目のアミノ酸残基からな
り；野生型デンドロアスピンにおいてＲＧＤモチーフを包含するのはループIII
である。ＲＧＤドメインは、４３〜４５番目の残基で形成されている。

【００１１】 (発明の概要）以下に示す略語が、本明細書において使用される：疎水性アミノ酸Ａ＝Ａｌａ＝アラニンＶ＝Ｖａｌ＝バリンＩ＝Ｉｌｅ＝イソロイシンＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシンＭ＝Ｍｅｔ＝メチオニンＦ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニンＰ＝Ｐｒｏ＝プロリンＷ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン極性（非電荷）アミノ酸Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギンＣ＝Ｃｙｓ＝システインＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミンＧ＝Ｇｌｙ＝グリシンＳ＝Ｓｅｒ＝セリンＴ＝Ｔｈｒ＝スレオニンＹ＝Ｔｙｒ＝チロシン正電荷アミノ酸Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニンＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジンＫ＝Ｌｙｓ＝リジン負電荷アミノ酸Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸

【００１２】本発明は、修飾デンドロアスピン骨格からなる生成物に関する。デンドロアス
ピン骨格は、非デンドロアスピン部分のための安定なビヒクルを形成し、且つ修
飾骨格がＲＧＤ配列を保持しているか否かに関わらず、言い換えればインテグリ
ン結合活性を保持しているか否かに関わらず本目的に有益であることが見出ださ
れるに至った。ＲＧＤモチーフが他のインテグリン結合モチーフに置き換えられ
ているが他の機能性配列は付け加えられていないデンドロアスピン骨格からなる
分子は、ＲＧＤモチーフが除去されたりこれが非インテグリン結合モチーフで置
き換えられたりしたデンドロアスピン骨格からなるポリペプチドと同様に、例え
ばレセプター相互作用の研究にとって有益な化学的手段である。

【００１３】（本発明の詳細な説明）本発明は、好ましくは１つ又はそれ以上の非野生型デンドロアスピンドメイン
に対するビヒクルとしてのデンドロアスピン骨格の用途に関し、当該デンドロア
スピン骨格は、野生型デンドロアスピンと比較して、天然のＲＧＤモチーフを除
去したりこれを（ｉ）インテグリン結合活性のないアミノ酸配列又は（ii）アス
パラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を含有するＲＧＤ以外のインテグリン
結合アミノ酸配列、例えばＫＧＤにより置き換えたりして修飾されている。この
デンドロアスピン骨格は、以下でより詳細に示されるように更に修飾されてもよ
い。

【００１４】更に本発明は、１つの態様において、ＲＧＤモチーフが除去されたり置換アミ
ノ酸配列で置き換えられたデンドロアスピン骨格からなる生成物を提供する。生
成物の一群においては、当該置換アミノ酸配列は、インテグリン結合活性のない
アミノ酸配列である。生成物の別の群においては、当該置換アミノ酸配列はイン
テグリン結合アミノ酸配列であり、Ｇ又は疎水性アミノ酸に隣接するＤ又はＥを
含有するＲＧＤ以外のトリペプチド配列からなる。本明細書の詳細な説明及び請求項を通じて、「からなる（comprise)」及び「c
omprising」及び「comprises」といったこの単語の派生語は、「含むがこれに限
定されるものではない」ことを意味し、その他の要素や、完全体や、添加や、工
程を排除することを意図するものではない。

【００１５】本発明は、デンドロアスピン骨格からなり、１つのドメインにアスパラギン酸
（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）を含有し(そして前段落に定義するようなもので
あるのが好ましい）ＲＧＤ以外のインテグリン結合アミノ酸配列とハイブリッド
のポリペプチドと、別のドメイン上に第２の機能を与える非デンドロアスピン種
を有する生成物又はハイブリッドポリペプチドを包含する。非デンドロアスピン
アミノ酸配列は、骨格のループ中、あるいはループの外側に全体的に又は部分的
に構成されてもよい。該ポリペプチドは、デンドロアスピン骨格の非ループ領域
の残基が、非デンドロアスピンアミノ酸配列により、例えば非デンドロアスピン
アミノ酸配列をデンドロアスピン骨格の末端配列へ直接又はリンカーを通じてラ
イゲーションすることにより増大されているものであってもよい。当該リンカー
は、ペプチド構造であっても非ペプチド構造であってもよく；非デンドロアスピ
ン種は、デンドロアスピンにおいては見られない部分であり、典型的にはデンド
ロアスピンにおいては見られないアミノ酸配列である。

【００１６】好ましい生成物において、トリペプチド配列は以下の式からなる：Ｂ−Ｊ−Ｚ式中、（Ｉ）Ｊ−ＺはＧＤ又はＧＢであり、Ｂは、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ａ
、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、又はＷであるが、Ｊ−ＺがＧＤであるときはＲでは
ない；（II）Ｂ−ＪはＤＧ又はＥＧであり、Ｚは任意のアミノ酸である；又は（III）ＪはＤ又はＥで、Ｂ及びＺはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、又はＷの中
からそれぞれ独立して選ばれる。好ましくはＪ−ＺはＧＤであり、Ｊ−ＺがＧＤ
又はＧＥである生成物において、ＢはＲ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｈ、又はＮであり、更に
好ましくはＲ、Ｋ、Ｑ、又はＡ（但しＪ−ＺがＧＤのときはＲではない）である
。

【００１７】生成物（Ｉ）の好ましい類は、Ｂ−Ｊ−ＺがＣ末端部でＭ、Ｗ、Ｎ、又はＶに
結合している生成物である。好ましくはＭ、Ｗ、Ｎ、又はＶ残基の後が野生型デ
ンドロアスピンの４７位にあるＰ、あるいはＰが置換されたＡ残基である。生成物（Ｉ）の別の好ましい類は、インテグリン結合アミノ酸配列の前が野生
型デンドロアスピンの４７位にあるＰ、あるいはＰが置換されたＡ残基である生
成物である。好ましい生成物（Ｉ）の中でも、Ｊ−ＺがＧＤであり、ＢがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、
Ｆ、Ｐ、Ｗ、より好ましくはＬ又はＶである生成物が特に好ましい。この種の最
も好ましいものは、ＢがＬで、Ｂの前がＭである生成物である。

【００１８】好ましい生成物（II）は、Ｂ−ＪがＤＧ及び／又はＺがＥ、Ｒ、又はＰである
生成物を含み、特にはＺの後が野生型デンドロアスピンの４７位にあるＰ、ある
いは野生型の４７位のＰの前に挿入されたＡである生成物である。生成物（III）の好ましい類は、ＪがＤであり、特にはＢ−Ｊ−ＺがＬＤＶで
ある生成物からなる。好ましくは、Ｂ−Ｊ−Ｚの前にＩ残基がある。

【００１９】ＲＧＤモチーフが、非インテグリン結合配列によって置き換えられるならば、
その置換配列は、原則としてデンドロアスピン様配置を維持できる任意の配列で
あってもよく、例えば本明細書で以降に詳細に示されるような非デンドロアスピ
ンドメインであってもよい。勿論、本発明の修飾デンドロアスピンは野生型のデ
ンドロアスピンと幾分異なる配置であることは大いにあるが、通常、３つのルー
プ構造を有する。ループIIIがポケット結合配列にとって好ましく；当該配列は
、トロンビン結合配列（ＧＰＲＰはトロンビン結合配列である）及びコラーゲン
α_２β_１−結合配列ＤＧＥを含むことから、ＲＧＤ置換はレセプターポケット又
は別のポケットと関連しているのが好ましい。

【００２０】除去されたり置き換えられたＲＧＤモチーフ有するのに加えて、本発明で示さ
れる生成物又はポリペプチドは、通常少なくとも１つの非野生型デンドロアスピ
ンドメインを本来のＲＧＤ部位とは別の部位に含む。その少なくとも１つの非野
生型デンドロアスピンドメインは、通常ポリペプチド上に機能性を与える全体的
に又は部分的に非デンドロアスピン配列を少なくとも１つ含む。

【００２１】一群の生成物は、インテグリン結合活性を有し、生成物の分子がインビボで投
与されると、血小板に分子が結合し、それにより損傷部位での血小板の凝集を阻
害する。これらの生成物において、ＲＧＤモチーフは、別の血小板結合配列、特
にはＫＧＤにより置き換えられている。インテグリン結合ドメインを含有するの
に加えて、この類の生成物は、好ましくは別の非野生型デンドロアスピンドメイ
ンを含有し、これは場合によって第２の、更なる機能性、例えば抗血栓活性、細
胞遊走及び／又は増殖の抑制、又はシグナル伝達の制御を提供する。かくして本
発明に示すこの類の分子は、二又は多機能的に作用し、好ましくは血液凝固、特
には損傷部位での血栓形成と動脈／静脈壁の肥厚に対して二又は多機能的に作用
する。本発明に示す生成物は、白血球の補充、免疫系の活性化、組織線維症、又
は腫瘍形成に対抗する活性を有してもよい。当業者は、セリンプロテアーゼのペ
プチド及び擬ペプチド阻害剤（例えば、エラスターゼ、カテプシンＧ、ウロキナ
ーゼ(ｕＰＡとも呼ばれる)、第II、IX、Ｘ、VII、及びXII因子、トロンビン、カ
リクレイン、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン）に精通しており、
この非野生型ドメインがこのような阻害剤からなるものであってもよい。生成物は、少なくとも２つの非野生型デンドロアスピンドメインを含むもので
あってもよく、当該ドメインは場合によって同じ配列を有するものであってもよ
い。

【００２２】場合によって、本発明に示す分子は、デンドロアスピンの少なくとも１つのア
ミノ酸残基により分離された２つ又はそれ以上のアミノ酸配列部分からなる非野
生型デンドロアスピンドメインを含有するデンドロアスピン骨格を含む。その２
つ又はそれ以上の配列部分は、相互に、及び天然の非デンドロアスピンアミノ酸
配列中の直鎖のアミノ酸順序に関して転置されてもよい。言い換えると、（少な
くとも配列の一部分は修飾されてもよいけれども）各部分の実際の配列を必ずし
も改変することなく２つ又はそれ以上のアミノ酸配列部分の本来の順序を改変し
てもよい。

【００２３】本発明に示すほとんどの生成物は、野生型デンドロアスピンでは見られないド
メイン、すなわち非野生型デンドロアスピンドメインを含む。科学的な研究目的
で調製された分子の場合には、ドメインは、たいていは機能性を与えないけれど
も、非野生型ドメインは、通常分子に機能性を与える。非野生型デンドロアスピ
ンドメインにより与えられた機能性は本発明には重要でなく、原則として例えば
、デンドロアスピン骨格中へ挿入、あるいはそのＮ又はＣ末端のいずれかへのラ
イゲーションによりデンドロアスピン骨格中に導入可能なアミノ酸配列により与
えることができる機能のいずれであってもよい。例えば、そして特にはＲＧＤモ
チーフが血小板結合活性を与えるＤ又はＥ含有モチーフにより置き換えられた場
合には、その生成物は血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）活性、糖蛋白ＩＢ_α活性
、ヒルジン活性、トロンボモジュリン活性、血管上皮成長因子活性、トランスフ
ォーミング成長因子β_１活性、塩基性繊維芽細胞成長因子活性、アンギオテンシ
ンII活性、第VIII因子活性、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）、フォンウィル
ブランド因子活性、ダニ抗凝固蛋白（ＴＡＰ）因子活性、又は線虫抗凝固蛋白（
ＮＡＰ）因子活性を与える配列からなる非野生型デンドロアスピンドメインを含
み得る。その非野生型デンドロアスピンドメインは、通常血小板成長因子（ＰＤ
ＧＦ）、糖蛋白ＩＢ_α、ヒルジン、トロンボモジュリン、血管上皮成長因子、ト
ランスフォーミング成長因子β_１、塩基性繊維芽細胞成長因子、アンギオテンシ
ンII、第VIII因子、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）、フォンウィルブランド
因子、ＴＡＰ、又はＮＡＰ（例えばＭＡＰ５）に由来する配列、又は当該配列の
少なくとも一部分と相同する機能性配列からなる。当該機能性配列は、デンドロ
アスピンと約５０％、好ましくは約６５％、より好ましくは約７５％、そして更
に好ましくは８５％のアミノ酸配列相同性を有していてもよい。

【００２４】このようにして、本発明に示す分子は、例えば血小板凝集、及び血栓形成カス
ケードにおける別の成分（例えば、トロンビンであるセリンプロテアーゼ凝固酵
素）又は細胞内シグナルカスケードにおける別の成分（例えば成長因子）に対抗
して活性となるように多機能性とされてもよい。本発明に示す二又は多機能性生
成物は、インテグリン結合ＲＧＤ置換体（Ｘ−Ｙ−Ｚ）に加えて前述のインテグ
リン結合活性を有する非野生型ドメインを包含するように設計されてもよく、そ
れにより増幅されたインテグリン活性を有するデンドロアスピンベースの分子が
提供される。本発明は、勿論インテグリン結合機能をもたないデンドロアスピン
ベースの分子、及び抗凝固機能のない分子を含む。

【００２５】本発明に示す生成物は、好ましくは図１に示されるようなアミノ酸配列からな
る。前述の更なるアミノ酸配列を除くと、本発明に示す生成物は、約５０％又は
それ以上のアミノ酸配列相同性を有する野生型デンドロアスピンと相同するデン
ドロスピン骨格からなるポリペプチドを含み、好ましくは約６５％又はそれ以上
、より好ましくは約７５％又はそれ以上、そして更により好ましくは約８５％又
はそれ以上デンドロアスピンと相同性がある。

【００２６】本発明に示すポリペプチドは、デンドロアスピンの５９個のアミノ酸よりも多
い、又は少ない数のアミノ酸残基からなるものであってもよい。例えば、本発明
に示す分子は、４５〜１５９個、好ましくは約４９〜８９個、より好ましくは約
５３〜６９個、更に好ましくは約５７〜６１個の範囲のアミノ酸残基からなるも
のであってもよい。しかしながら、本発明は、天然の配列と同じ長さで置き換え
る導入外来配列を含有するポリペプチドを含む。すなわち、１つ又はそれ以上の
非野生型ドメインが、置き換える野生型のドメインと同じサイズであり；ＲＧＤ
モチーフがトリペプチド配列（例えばＫＧＤ）で置き換えられる場合は、当該ポ
リペプチドは、当然５９個のアミノ酸残基を有することになる。好ましいポリペプチドは、図１に示されるようなアミノ酸配列からなる。

【００２７】本発明は、外来配列がデンドロアスピン骨格の内部全体に（すなわち、１〜５
９の残基に包括的に）含有され、例えば枝繋ぎされた（grafted）ループとなっ
ている種を含む。かくして、生成物の一群においては、前述の非野生型ドメイン
(ドメイン群）が、デンドロアスピン骨格の（ａ）ループＩ及び／又はループII
；（ｂ）ループＩ及び／又はループIII；（ｃ）ループII及び／又はループIII；
又はループＩ、ループII、及びループIIIに導入されている。ポリペプチドが、
ループに導入された非野生型ドメインからなっている場合、幾つかのポリペプチ
ドにあってはその非野生型ドメインは、ループIIIは変わらないままで、ループ
Ｉ又はループIIのいずれかに導入されている。

【００２８】一方、他の群においては、ループ中に延びる、あるいはループの外で領域を置
換する非野生型ドメイン、すなわち、非ループ領域の残基を増大したり挿入され
た更なるアミノ酸配列（非野生型ドメイン）の残基と置換したりするような残基
１−３、１７−２２、３７−３９からなるポリペプチドを含み；例えば、１つの
挿入配列（又は複数の挿入配列の１つ又はそれ以上）が、直接又はリンカーを介
してデンドロアスピン骨格のＣ又はＮ末端非ループ領域にライゲーションされて
もよい。かくして本発明は、デンドロアスピン部分にＲＧＤの代わりに血小板結
合活性を与える第１のアミノ酸配列と、別の活性（例えば、抗血栓活性）を与え
る更なるアミノ酸配列からなるハイブリッドデンドロアスピンベースのポリペプ
チドを提供し、当該第１の配列は、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ
）を含有するＲＧＤ以外の配列であり、非デンドロアスピンアミノ酸配列は、ル
ープの外にあって、例えばデンドロアスピン部分(デンドロアスピン由来成分）
の末端部分へのライゲーションによりデンドロアスピン部分の非ループ領域の残
基が増大されている。

【００２９】外来の非野生型配列の好ましい位置の１つは、アミノ酸残基４−１６、１８−
２１、又は２３−２６の間のデンドロアスピン骨格中の部位、あるいはポリペプ
チドのＮ又はＣ末端を形成する部位である。かくして、非野生型配列は、残基４
の前に（例えば残基１の前に）、又は残基５０の後に、例えば残基５２−５９の
いずれか１つの後に、形成されてもいてよい。該外来アミノ酸配列を、野生型デ
ンドロアスピンのＮ又はＣ末端に、直接又はリンカーを通じてのいずれかで結合
していてもよく、リンカーはポリペプチドリンカーが好ましいが必ずしもそうで
なくてもよい。いずれのリンカーも、場合によって外来配列の機能ドメインとデ
ンドロアスピン骨格との間の干渉のみならず、デンドロアスピン骨格中の任意の
機能ドメインと外来配列との間の干渉をも阻止したり減少させたりする立体構造
をとるようにデザインされていてもよい。末端部を形成する外来配列は、ループ
中に延びていてもよく、例えばＣ末端を形成する外来配列は、残基５０の後に完
全な形で挿入されいてもよいけれども、あるいはループIII中又はその前、例え
ば残基３７、３８、３９、４０、４１又はそれ以降（例えば残基４７）から開始
してもよい。

【００３０】各挿入非野生型ドメイン又は非野生型ドメイン部分は、好ましくは１００を越
えないアミノ酸残基、例えば３−４０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列で
ある。特にデンドロアスピン骨格内部全体に挿入配列が含有される場合、非野生
型ドメインは、より好ましくは３−１６個、更に好ましくは３−１４個のアミノ
酸残基を有する。挿入された更なるアミノ酸配列（非野生型ドメイン）の開始は
、デンドロアスピン分子のアミノ酸残基１の前であってもよいし、あるいは、デ
ンドロアスピン骨格のアミノ酸残基１−５７の任意の１つの位置にあってもよい
。当該挿入アミノ酸配列の末端部は、デンドロアスピン骨格のアミノ酸残基３−
５９の任意の１つの位置にあってもよく、挿入配列が残基５９の位置までの延び
ていてもよい。

【００３１】２つの非野生型ドメインがデンドロアスピン骨格に導入されている場合、この
２つのドメインの直線距離は、好ましくは１〜３５アミノ酸からなるものであり
、より好ましくは１〜１４アミノ酸からなるものである。２つ以上の非野生型ド
メインが導入されている場合、各アミノ酸配列を分離する野生型デンドロアスピ
ンアミノ酸残基が少なくとも１つあるのが好ましい。

【００３２】ループIIIは、１つ又はそれ以上の任意のアミノ酸残基の挿入、除去、置換に
より修飾され、好ましくは最大８個又は最小１個のアミノ酸、例えば１、２、３
、又は４個が、デンドロアスピンのループIII内で修飾可能である。挿入結合配列（例えば、ＫＧＤ又はＲＧＤモチーフ）が、デンドロアスピン骨
格中の野生型ＲＧＤドメイン以外の位置、好ましくはループＩ又はループII中に
導入されていてもよい。

【００３３】ＲＧＤが置き換えられた本発明に示す分子は、野生型デンドロアスピン中にフ
ランキングＲＧＤから修飾された、例えば国際特許ＷＯ98/42834の図３Ｂに示さ
れるように修飾されたＲＧＤ部位に隣接するアミノ酸配列を有するループIIIか
らなるものであってもよい。当該フランキング領域を修飾する利点は、Ｂ−Ｊ−
Ｚ配列の活性（例えばインテグリン結合活性）が、特定の糖蛋白リガンドに対し
て、増強されたり、より特異的になり得ることである。また、もしデンドロアス
ピン骨格中に枝繋ぎされた「外来の」更なるアミノ酸配列の１つ又はそれ以上が
ＲＧＤの置換アミノ酸配列に対して立体効果を及ぼすとすれば、ＲＧＤドメイン
の周囲の（Ｂ−Ｊ−Ｚで占められた）ループIIIは、あらゆる立体障害を克服す
るように修飾可能であり、それによりＲＧＤドメインでの機能性を回復させるこ
とができ、またおそらく増強させることもできる。

【００３４】特には、その置換アミノ酸配列が３個以上の残基を有する場合は、ＲＧＤ部位
に隣接するアミノ酸は、例えば、ループIII中のアミノ酸残基の数を１３に維持
するように除去されてもよい。ループＩ又はループIIが、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、除去、置
換により修飾されてもよい。デンドロアスピン骨格中にある１つ又はそれ以上の
部位での導入には１４〜３６個の残基数が好ましいけれども、任意の適切な数の
アミノ酸（例えば最大１００まで又はそれ以上）を、例えば所望の二又は多機能
性を与えるためにデンドロアスピン骨格中に導入することが可能である。

【００３５】もし、デンドロアスピン骨格に導入された「外来の」更なるアミノ酸配列が別
の導入したドメイン又はループIIIのいずれかに立体障害効果を及ぼすならば、
デンドロアスピンループの修飾が必要となり得る。Insight II software（Molec
ular Simulaions Inc.）を用いるコンピューター補助分子モデリングが、本発明
に示す「ループ枝繋ぎ」されたデンドロアスピンの骨格を予測するのに利用され
てもよい。ループ間の立体効果により機能性の損失が引き起こされるような場合
には、適当な方法でデンドロアスピン分子の適当な部分を修飾することによりこ
の立体効果を「デザインしないようにする」ことが可能である。時にはこのこと
が、１つ又はそれ以上のループ構造を伸ばすために幾つかの適当なアミノ酸残基
を導入することを含んでもよい。

【００３６】好ましい修飾としては、ループを延ばすためのデンドロアスピン骨格のループ
又はループ群中へのポリグリシンの導入が挙げられる。その他アミノ酸残基の繰
り返し単位又はいくつかの残基からなる修飾が利用可能である。コンピューター
モデリング研究は、デンドロアスピンのループを延ばすために必要とされるルー
プ修飾をデザインするのに利用可能である。非野生型ドメインがデンドロアスピ
ン骨格上に配置された別のドメインの機能を確実に阻害しないようにするために
更なる修飾が必要となることもある。

【００３７】本発明に従って二機能性又は多機能性分子をデザインするにあたって、活性、
安定性、又は他の所望の生物学的若しくは生化学的特性の「微調整」は、置換又
は除去により個々に選ばれたアミノ酸残基を改変することにより達成され得る。
選ばれた位置でのアミノ酸残基又は残基群の挿入による修飾も、本発明に示すこ
の「微調整」の態様の範囲内である。分子中の特定の部位でアミノ酸配列を改変
するのに利用可能な部位特異的突然変異誘発法は、当業者には周知であろう。

【００３８】調製本発明に示す生成物は、適当な発現ベクターの構築により作成され得るポリペ
プチド、例えばプロモーターに効果的に結合したコード配列からなるポリペプチ
ドからなるポリヌクレオチドから構成され、好ましくは当該ポリペプチドである
。

【００３９】当業者は、機能性核酸を含有する種々のクローンを容易に構築可能である。こ
れらの目的を達成するためのクローニングする方法論、及び核酸の配列を検証す
るための配列決定法は、当該分野では周知である。適切なクローニング及び配列
決定技術の例や、多くのクローニングの経験を通じて当業者を指示するのに十分
な使用法は、Sambrook et al, Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版
, 1-3巻, Cold Spring Harbor Laboratory(1989))、Methods in Enzymology, 15
2巻：Guide to Molecular Cloning techniques (Berger and Kimmel(eds.), San
Diego: Academic Press, Inc.(1987))、又はCurrent Protocols in Molecular
Biology (Ausubel, et al.(eds.), Greene Publishing and Wiley-Interscience
, New York(1987)において見いだされる。

【００４０】生物学的試薬の製造業者からの製品情報及び実験装置もまた、既知の生物学的
方法において有益な情報を提供する。当該製造業者としては、SIGMA chemical c
ompany (Saint Louis, MO)、R&D systems (Minneapolis, MN)、Pharmacia LKB B
iotechnology (Piscataway, NJ)、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, C
A)、Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI)、Glen Res
earch, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Gaithersberg, MD)、Fluka
Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland)、Invi
trogen, San Diego, CA、及びApplied Biosystems (Foster City, CA)等が挙げ
られ、更にその他多数の当業者には既知の商業ソースが挙げられる。

【００４１】所望の遺伝子を含有するポリヌクレオチドは、例えば上述のような適当な配列
のクローニングと制限を含む任意の適切な方法により、あるいはNarang et al.
Meth. Enzymol. 68:90-99(1979)のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth.
Enzymol. 68:109-151(1979)のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra.
Lett., 22:1859-1862(1981)のジエチルホスホラミダイト法；Beaucage and Caru
thers(1981), Tetrahedron Letts., 22(20):1859-1862に記載の、例えば自動合
成機を用いる、例えばNeedham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res.
, 12:6159-6168に記載のような固相ホスホラミダイトトリエステル法；及び米国
特許第4,458,066号に示す固体支持法といった方法による直接的な化学合成によ
り調製可能である。化学合成により一本鎖のオリゴヌクレオチドを生成する。こ
れは、相補的な配列を用いてハイブリダイゼーションにより、又はテンプレート
としてその一本鎖を用いてＤＮＡポリメラーゼによる重合により２本鎖ＤＮＡに
変換され得る。当業者には周知のとおり、ＤＮＡの化学合成が約１００塩基の配
列に制限される一方で、より長い配列が短い配列のライゲーションにより取得で
きる。

【００４２】核酸は、当業者には周知のように、部位特異的突然変異誘発により修飾され得
る。天然核酸及びその他の核酸は、インビトロの方法により増幅可能である。増
幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）
、転写に基づいた増幅システム（ＴＡＳ）、自律的配列複製システム（ＳＳＲ）
が挙げられる。広範なクローニング法、宿主細胞、及びインビトロ増幅の方法論
が当業者には周知である。

【００４３】国際特許ＷＯ98/42834号に示されるように、野生型デンドロアスピン遺伝子を
プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ（国際特許ＷＯ98/42834号の図２）中に上手く挿入し
、Lu et al. (1996)J Biol Chem 271:289-295に示す方法により発現してもよい
。デンドロアスピンの野生型遺伝子から開始し、次に本発明に示すポリペプチド
を発現するためにそのデンドロアスピン遺伝子の変種を組換えＤＮＡ技術を用い
て加工してもよい。挿入種が長いものについては、非デンドロアスピン又は異種
アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを単に適切に制限消化した野生型デン
ドロアスピン遺伝子中に直接挿入し、ライゲーションしてもよい。挿入、置換、
又は除去を含む数個のアミノ酸残基の修飾のような小さな変化については、例え
ば製造業者の取扱説明書に従ってClontech Laboratoriesにより提供されるTrans
former(登録商標) Site-Directed Mutagenesis kitを用いて、部位特異的突然変
異誘発を利用してもよい。

【００４４】発現ベクターに挿入後、野生型遺伝子を修飾する代替法としては、プラスミド
ｐＧＥＸ−３Ｘに関して上述のように、本発明に示すポリペプチドをコードする
遺伝子を、オリゴヌクレオチドのライゲーションに続いて任意に修飾、特には部
位特異的突然変異誘発による非野生型遺伝子を含有するベクターの構築からなる
方法により作成しもよい。

【００４５】国際特許ＷＯ98/42834号の図２Ａは、合成デンドロアスピン(Den)遺伝子のヌ
クレオチド配列を示している。当該遺伝子は、既知のアミノ酸配列を基本にデザ
インし（Williams J A et al.((1992))Biochem Soc Trans 21: 73S）、各アミノ
酸に対するコドンは、大腸菌中で高度に発現させたものから採用した（Fiers W
((1982))Gene 18: 199-209）。１０の合成オリゴヌクレオチドがひとまとめで示
され、コード鎖の上と非コード鎖の下のいずれかに１〜１０まで個々に数字を付
している。停止コドンは、アスタリスクで示している。３文字のアミノ酸コード
が使用され、全部で５９のＤｅｎのアミノ酸には、Ｎ末端残基のアルギニンに１
とＣ末端のロイシンに５９のみ数字を付している。

【００４６】かくして、追加の態様において、本発明は、本発明に示すポリペプチドをコー
ドする核酸分子に関する。当該核酸は、有効にプロモーター、そして場合により
異種の蛋白又はペプチドをコードする核酸配列に結合し、それにより融合生成物
をコードすることになる。適切には該プロモーターはＩＰＴＧ誘発性であり、異
種の蛋白又はペプチドはグルタチオンＳトランスフェラーゼである場合もある。

【００４７】前述の更なる非野生型ドメインをコードする核酸配列を除くと、本発明に示す
ポリペプチドをコードする核酸配列は、デンドロアスピンのヌクレオチド配列と
５０％のヌクレオチド配列相同性を有し、好ましくは約６５％、より好ましくは
約７５％、及び更に好ましくは約８５％デンドロアスピンヌクレオチド配列と相
同性を有し得る。

【００４８】本発明は、本発明に示す核酸からなるプラスミド、例えば本発明に示す核酸か
らなるプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘのみならず、当該プラスミドを用いて形質転換
した宿主細胞も含む。適切な宿主細胞は大腸菌である。該宿主細胞は細胞培養体
として提供されてもよい。

【００４９】本発明の別の態様は、前述のポリペプチドを発現するよう本発明に示す培養宿
主細胞を培養し、培養体から当該ポリペプチドを抽出し、そして精製することか
らなるポリペプチド生成法に関する、

【００５０】更に本発明は、デンドロアスピン骨格からなるポリペプチドを生成する方法を
含み、その方法は：ａ）有効にプロモーターと結合し、場合によりそれと共に共発現するために異
種の蛋白をコードする核酸配列と結合した本発明に示すデンドロアスピン骨格を
コードする核酸配列からなる発現ベクターを調製し；そしてｂ）当該ベクターと一緒に宿主細胞を形質転換し、宿主細胞に修飾デンドロア
スピン核酸配列を発現させることを含む。

【００５１】これらの方法のいくつかはａ）（ｉ）オーバーラップするオリゴヌクレオチドからＲＧＤモチーフを含有
するデンドロアスピン骨格のコード配列を構築し、その結果生成するｃＤＮＡを
有効にプロモーターに連結し、当該プロモーターを融合蛋白を発現するために異
種の蛋白をコードする核酸配列にも連結し；そしてａ）（ii）ＲＧＤが除去されているか又は本明細書中に定義されるような置換
アミノ酸配列により置き換えられたデンドロアスピン骨格をコードするように発
現ベクターのＲＧＤコードドメインを修飾することを含む。

【００５２】当該方法において、段階（ａ）（ii）は、前述の修飾の前か後に、デンドロア
スピン骨格をコードするベクターの核酸配列の他のドメインの少なくとも１つを
１つ又はそれ以上の核酸残基の挿入、除去、又は置換により修飾することを含み
、これにより発現によってデンドロアスピン骨格が非野生型デンドロアスピン配
列に相当するドメインを含むようにした。

【００５３】他の方法は、ＲＧＤをコードするドメインが除去されているか又はこれが本明
細書中に定義されるような置換アミノ酸配列により除去又は置換されたデンドロ
アスピン配列をコード核酸配列からなる発現ベクターをオリゴヌクレオチドから
構築し、更に発現よってデンドロアスピン骨格をコードするベクターの核酸配列
の他のドメインの少なくとも１つを１つ又はそれ以上の核酸残基の挿入、除去、
又は置換により修飾し、これによりデンドロアスピン骨格が非野生型デンドロア
スピン配列に相当するドメインを含むようにすることを含む。

【００５４】該方法は：ａ）宿主細胞培養体から修飾デンドロアスピンを抽出し、ｂ）当該細胞培養体抽出物から修飾デンドロアスピンを精製し、そしてその修
飾デンドロアスピンが融合蛋白であれば、当該融合蛋白の異種部分からデンドロ
アスピン部分を切断することからなる段階を含んでいてもよい。

【００５５】該異種蛋白は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が適切であり、
その精製は、ＧＳＴアフィニティークロマトグラフィーに続いてＧＳＴから修飾
デンドロアスピンの切断を含むのが適切である。本発明に示す生成物のいくつかは、上述のようなＲＧＤなしのデンドロアスピ
ンを生成し、非デンドロアスピン種をそれに化学的にライゲーションすることに
より作成される。

【００５６】用途本発明に示すペプチドは、科学的な検証に使用してもよいし、また薬理学的に
活性であれば、医薬品として利用してもよい。我々は、デンドロアスピン分子が、「外来」配列を運び、そして潜在的なター
ゲットにそれらを提示するための優れた骨格を提供することと見出した。この点
で、デンドロアスピンは小型で形態的に安定であるため実験的用途のみならず医
薬品用途の良好なモデルとなる。更には、デンドロアスピンの配列と立体構造が
既知であることによりアミノ酸配列を暴露されると予想される位置に挿入可能と
なる。

【００５７】デンドロアスピンの利点は特には、ＲＧＤ部位が直鎖のペプチドと比較して、
ターゲット構造中にポケットを有するＲＧＤドメイン（もちろん野生型デンドロ
アスピン中のＲＧＤ）での配列の会合を改善するように思われる立体構造環境に
あることである。かくして、デンドロアスピン中のＲＧＤの血小板結合（ＧＰII
ｂ／IIIａレセプター結合）活性は、ＲＧＤの直鎖のペプチドの活性よりも約１,
０００倍高い。かくして本発明に示す分子は、レセプター及びポケットを有する
他の構造にアミノ酸配列を提示するのに特に有益である。

【００５８】かくして、本発明に示す好ましいポリペプチドは、ＲＧＤドメインにレセプタ
ー結合活性を有する置換アミノ酸配列を有する。ある群のポリペプチドはそのＲ
ＧＤドメインに天然のポリペプチド中でポケットに入り込んで機能をもたらすア
ミノ酸配列を有する。

【００５９】デンドロアスピンのフレームワークは、実験的な目的のターゲットに対してア
ミノ酸配列を提示するのに有益である。かくして、本発明に示すポリペプチドは
、例えば生成物開発の目的で「外来」テスト配列の機能、効果、又は活性を検証
するのに有益である。言い換えると、本発明に示すポリペプチドは、活性剤を開
発する目的、特には薬学的目的にあるいは例えば低分子の治療用又は診断用薬剤
の開発に役立つ情報を得るのに有益である。

【００６０】従って、本発明は、更には候補アミノ酸配列の生物学的、薬理学的、及び／又
は生化学的活性を検討する方法を提供し、その方法は当該候補配列を本発明に従
ってポリペプチドに導入することを含む。好ましくは、本方法は更に、それによ
り生成されたテストポリペプチドをレセプター、「ポケット」、又は相互作用性
の物体（インビトロでもインビボでも）に暴露し、任意でそれらへの結合又はそ
れらとの相互作用を測定することを含む。また場合によって、当該テスト配列を
コントロール物質（テストポリペプチド不存在下、例えば結合又は相互作用とい
った反応が既知である物体）の存在下、レセプター又は他の相互作用性の物体に
暴露し、その後テストポリペプチド及び／又はコントロール物質の反応を測定し
てもよい。

【００６１】それにより本発明は、候補アミノ酸配列、例えば本発明に記載のテスト法によ
り同定可能なポリペプチド、同定可能なものとしての用途、及びそのようなポリ
ペプチドからなる医薬品製剤を提供する。更に本発明は、当該候補ポリペプチド
、特には前述で定義されるようなデンドロアスピン骨格及び候補ポリペプチド（
の残基）に導入されたテストポリペプチドからなる分子を提供する。

【００６２】薬理学的に活性なポリペプチドは、前述で定義されるようなポリペプチド、更
には場合によって薬学的に許容される賦形剤又は担体を含んでなる医薬品組成物
として製剤化されてもよい。機能性が様々である本発明に示す複数の治療用ポリ
ペプチドを所望の治療を施すために一緒に組合わせて薬学的に許容される形態に
してもよく、そして／又はそれらを１つ又はそれ以上の他の治療用又は予防用薬
剤と一緒に組合わせてもよい。

【００６３】本発明に示す治療用ポリペプチドは、静脈内注射又は静脈内投与用に製剤化さ
れるのが好ましいが、ヒト循環系中での徐放を所望するときは、他の投与方法、
例えば経口、皮下、筋肉内投与も可能である。例えば成長ホルモンを投与するの
に利用されるような埋め込み型制御放出装置と一緒に使用するポリペプチドの製
剤化もまた可能である。

【００６４】１つの製剤は、１ｎＭ−６０μＭの範囲の濃度で本発明に示すポリペプチドと
一緒に組合わせた血管外遊出血からなるもであってもよい。この血液はすぐに使
用できる形態で保存され、例えば外科的処置中又はその直後で血栓を避けねばな
らない場合において輸血で血液を迅速且つ簡単に供給し得る。本発明は、薬、好ましくは医薬品として使用する前述で定義されるような治療
用ポリペプチドを含む。

【００６５】また本発明は、薬物製造のために前述で定義されるような薬理学的に活性なポ
リペプチドの用途を提供し、例えばレセプターでの結合又は血栓に伴なう疾病；
特には血栓症、心筋梗塞、網膜血管新生、内皮損傷、調節不全型アポトーシス、
異常細胞遊走、白血球湿潤、免疫系の活性化、組織線維症、及び腫瘍形成の処置
又は予防目的となり得る。

【００６６】また本発明は、レセプターでの結合又は血栓に伴なう疾病；特には血栓症、心
筋梗塞、網膜血管新生、内皮損傷、調節不全型アポトーシス、異常細胞遊走、白
血球湿潤、免疫系の活性化、組織線維症、及び腫瘍形成の治療及び予防からなる
処置法を提供する。本方法は、前述で定義されるようなポリペプチドを治療的に
有効量投与すること含む。

【００６７】図面の簡単な説明図１は、挿入アミノ酸配列をデンドロアスピンのアミノ酸配列の下に示した修
飾型デンドロアスピンアラインメントを示している。

【００６８】実施例１ＫＧＤデンドロアスピン材料…制限酵素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｉ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピラノシド）、及びＤＨ５αコ
ンピテント細胞は、Life Technologies Ltd. (U.K.)又はPromega Ltd. (Southam
pton, U.K.)から購入した。ベント(エクソ−)ＤＮＡポリメラーゼはNew England
Biolabs Ltd. (Hitchin, U.K.)より提供された。プロテアーゼ第Ｘａ因子は、B
oehringer Mannheim (Sussex, England)から購入した。ヒトフィブリノーゲン（
グレードＬ）はKabi (Stockholm, Sweden)から購入した。凍結乾燥した蛇毒はLa
toxan(05150 Rosans, France)又はSigma Chemical Ltd. (Dorset, U.K.)のいず
れかから得た。オリゴヌクレオチドはCruachem Ltd. (Glasgow, U.K.)で作成し
、更に1５％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲル上で変性ＰＡＧＥにより精製した。
デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）ジデオキシヌクレオチド
トリホスフェート（ｄｄＮＴＰｓ）、及びプラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に結合した融合蛋白としてクローニングさ
れた遺伝子を発現するベクター、及びグルタチオン−セファロースＣＬ−４Ｂは
、Pharmacia Biotech Ltd.(Herts, U.K.)から購入した。「Geneclean」キットと
Plasmid maxi Kitは、Bio 101, La Jolla CA. USA及びQiagen Ltd., Surrey, U.
K.からそれぞれ購入した。シークエンシング酵素（シークエナーゼ２.０）は、C
ambridge Bioscience (Cambridge, U.K.)から得た。[^３５Ｓ]ｄＡＴＰ[αＳ]及
び^１２５Ｉ（１５.３ｍＣｉ/ｍｇヨウ素）は、NEN Dupont (Herts, U.K.)とAmer
sham International Plc (Amersham, Bucks, England)からそれぞれ得た。

【００６９】発現ベクターの構築デンドロアスピン遺伝子を、国際特許ＷＯ98/42834の図２Ａに示されるのと同
じ１０のオリゴヌクレオチドを用いて合成オリゴヌクレオチドから構築した。そ
れぞれ精製されたオリゴヌクレチドを、１ｍＭＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼの存在中３７℃で６０分間リン酸化した。オーバーラップするリン酸化
オリゴヌクレオチドの対をそれぞれPerkin-Elmer/Cetus熱シリンダー上で別々に
アニ−ルした。以下に示すプログラムを利用した：９５℃ ５分間、７０℃ ３
０秒、次いで室温までゆっくりと冷却する。ライゲーションは、だいたい約１ｎ
Ｍの各アニ−ルしたフラグメント、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、１
０ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＡＴＰ、及び５％ＰＥＧ８０００と５ユニットのＴ
４ＤＮＡリガーゼを含有する総量５０μｌ中において、１６℃で１５分間実施し
た。ライゲーション後、デンドロアスピン遺伝子を、テンプレートとして１μｌ
のライゲーション混合物を用いて、プライマーとしてのオリゴ１及び１０と２ユ
ニットのベントＤＮＡポリメラーゼによりＰＣＲで増幅した。以下に示すプログ
ラムを利用した：９４℃、３分と７２℃、１分の１サイクル、続いて９４℃、３
０秒と７２℃、２分の３９サイクル。その増幅生成物は、２％アガロースゲル上
で確認しながら所望の大きさ（２１６ｂｐ）となることをチェックして見つけ出
し、更に２％低融点のアガロースゲル上で精製した。デンドロアスピン遺伝子は
EcoRIとBamHIにより消化し、続いて制限ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ中でクローニン
グして組換えプラスミドｐＧＥＸ−デンドロアスピン遺伝子を生成する。非野生
型ベクター、例えばｐＧＥＸ−ＫＧＤ−デンドロアスピン遺伝子(以下参照）の
構築についても、同様の製法を実施した。

【００７０】ＫＧＤ−デンドロアスピン遺伝子をTransformer（登録商標）部位特異的突然
変異誘発キット（Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, California, USA)を
用いて生成した。選択オリゴヌクレオチドは、ACC65Iによる消化により親構造か
ら組換えの選択を可能にするために新規の制限部位（BamHI→ACC65I）をｐＧＥ
Ｘ−３Ｘベクター中に導入するようデザインした。アニーリング、ライゲーショ
ン、及び消化後、その反応混合物を大腸菌、mutＳ細胞（Clontech）中で形質転
換し、その結果形成されるコロニーをACC65I制限分析によりスクリーニングした
。ACC65Iによる制限と形質転換を２回転か３回転して、９０％以上の組換えクロ
ーンを同定した。この突然変異誘発法においては、選択プライマーdGAAGGTCGTGG
GTACCATATCGAAGGTCGTと変異誘発プライマーdTGCTTCACTCCGAAAGGTGACATGCCGGGTCC
GTACを使用した。

【００７１】形質転換と蛋白発現組換え遺伝子（５ｎｇ）を常法（３４）により５０μｌの大腸菌ＤＨ５αコン
ピテント細胞を形質転換するのに利用した。その構築物が正しいコード配列であ
ることは、ジデオキシチェーンターミネーター法（３５）を用いて挿入フラグメ
ントの相補的なＤＮＡ配列決定により検証した。細菌培地条件は、以下に示す通
りで実施した：培地を、一晩種培養して播種し（１％、v/v）、ＬＢ／アンピシ
リン培地（１００μｇ/ｍｌ）中で培養し、Ａ_６００が０.７に達するまで３７℃
で振盪し、次いで誘導用に最終濃度が０.１ｍＭとなるまでＩＰＴＧを添加した
。細胞を、３０℃より低い温度で更に４時間培養し、遠心分離により収集した。

【００７２】天然及び組換え蛇毒ＲＧＤ蛋白の精製エレガンチン（elegantin）及びデンドロアスピンを従来法（３６）に示され
るような逆層ＨＰＬＣを用いて精製した。組換えデンドロアスピンは以下のよう
に精製した：細胞のペレットを、１％ TritonＸ−１００とプロテアーゼ阻害剤
ＰＭＳＦ（１Ｍ）、ペプスタチン（５ｇ/ｍｌ）、アプロチニン（５μｇ/ｍｌ）
、トリプシン阻害剤（１μｇ/ｍｌ）、１ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッフ
ァー（ｐＨ７.４）中に懸濁し、氷上で超音波処理した。その超音波処理した混
合物を４℃、７,８００xｇで細胞残屑と不溶性物質をペレット状に遠心分離した
。上清から組換えＧＳＴデンドロアスピンとＧＳＴ変異デンドロアスピンをグル
タチオン−セファロースＣＬ−４Ｂカラム上で１５０ｍＭＮａＣｌを含有する
ＰＢＳ中で吸収し１０ｍＭ還元グルタチオン（ｐＨ８.０）を含有する５０ｍＭ
のTris−ＨＣｌで溶出することによりアフィニティークロマトグラフィーで精製
した。ペレット中に残存する不溶性の融合蛋白については、８Ｍ尿素の存在中、
室温で３０分間ゆっくり振盪し、続いてTris−ＨＣｌバッファーに対して室温で
連続的に希釈及び透析することにより再生させて、可溶化した。リフォールディ
ングした蛋白混合物を更に遠心分離しアフィニティー精製した。精製はＳＤＳ−
ＰＡＧＥでモニターし、組換えＧＳＴデンドロアスピンとＧＳＴ変異デンドロア
スピンからなる適切な画分を１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＣａＣｌ_２、及び第
Ｘａ因子（１：１００、w/w 第Ｘａ因子：融合蛋白）の存在中、４℃で２４時間
消化した。切断後、当該画分をVydacＣ１８逆層ＨＰＬＣ分析用カラム（ＴＰ１
０４）上に添加し、０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有するグラジエン
ト０−２６％アセトニトリル（分当たり１.７８％）、続いて０.１％ＴＦＡ中
、２６−３６％アセトニトリル（分当たり０.２５％）で溶出した。必要であれ
ば、更に分析用カラムを同じ条件下で使用した。ＨＰＬＣからの画分を凍結乾燥
し、水中で溶解し、そしてＡＤＰ−誘発血小板凝集の阻害をアッセイした。精製
した野生型デンドロアスピンと変異体は、２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとエレクトロ
スプレーイオン化質量分析により同定した。

【００７３】血小板凝集の定量血小板凝集を、従来法（３６、３７）に示されるように光透過率の増加で定量
した。簡単に示すと、２００ｘｇで１５分間、遠心分離により健常人から得た血
小板リッチな血漿（ＰＲＰ）を保存ヒト血液から調製した。洗浄血小板をＰＲＰ
から調製し、接着／凝集バッファー（１４５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ、１
ｍＭＭｇＣｌ_２、２ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭグルコース、３.５ｍｇ/ｍｌ
ＢＳＡ、及び１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.３５）中に再懸濁し、３ｘ１０^８/m
lカウントに調節した。血小板凝集（３２０μｌインキュベーション溶液）は、
１.６７ｍｇ/ｍｌのフィブリノーゲンの存在中１０μＭＡＤＰで誘導し、チャ
ートレコーダーに連結したPayton Dual-Aggregometerを用いて定量した。ＫＧＤ
−デンドロアスピンがＡＤＰ誘発血小板凝集の強力な阻害を示すことが分かった
。

【００７４】血小板粘着の測定血小板粘着を、従来法（３７）で示されるように定量する。簡単に示すと、９
６ウェルのプレートを一晩４℃でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７.４）中
で再構築したヒトフィブリノーゲン又はフィブロネクチンのいずれかにより適当
な濃度（２−１０μg/ml、１００μl）でコーティングする。血小板は、１０μ
ｌの５００μＭＡＤＰ（最終濃度５０μＭ）を予め添加したマイクロタイター
プレートに添加（９０μｌ）前に３分間適当な温度でアンタゴニストを用いて処
置し、粘着血小板の数を１３０μｌ／ウェルのディベロッピングバッファー（酢
酸ナトリウム、ｐＨ５.５、１０ｍＭｐ−ニトロフェニルホスフェート、０.１
％ TritonＸ-１００）を用いて内因性の酸ホスファターゼを定量して検討し、自
動プレートリーダー上において４１０/６３０ｎｍで読み取った。

【００７５】リガンドのヨー素化とリガンド結合の検討本検討に使用される蛋白のヨー素化は、製造業者の仕様書に従ってEnzymobead
Radioiodination Reagent (Biorad Laboratories)を用いて実施した。^１２５Ｉ
−標識化ディスインテグリン、デンドロアスピン、及び変異デンドロアスピンの
洗浄血小板への結合は、本質的には従来法で（３７）示されるように平衡条件下
実施する。簡単に示すと、そのインキュベーション混合物は、３００μｌの洗浄
血小板（３ｘ１０^８/ｍｌ）、１０μｌのアゴニスト（最終濃度５０μＭを呈す
る１.７５ｍＭＡＤＰ）、１０μｌの^１２５Ｉ−標識化蛋白試料、５−２０μｌ
の再懸濁バッファーからなり、最終容量を３５０μｌにする。抗体阻害の検討に
おいて、血小板懸濁物をＡＤＰに暴露する前に３０分間、抗体で処置し、次いで^１２５Ｉ−蛋白試料に添加し、該混合物を室温で更に６０分間インキュベートす
る。２５％（w/v）スクロース、１％ＢＳＡ緩衝液上に添加することによりイン
キュベーションを止めて１２,０００xｇで１０分間遠心分離する。血小板ペレッ
トと上清の両方をカウントして、結合したリガンドとしていないリガンドの量を
決定する。バックグラウンドの結合量は、５０倍過剰の非標識化ディスインテグ
リン又は１０ｍＭＥＤＴＡの存在中で決定する。

【００７６】組換え野生型デンドロアスピン及び変異デンドロアスピンの発現と精製合成野生型及び変異型デンドロアスピン遺伝子を、これらの組換え蛋白に対し
てコードする遺伝子の５'位に第Ｘａ因子切断配列を有するグルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子のカルボキシル末端の発現ベクターｐＧＥＸ
−３Ｘ中でクローニングした。大腸菌でのＧＳＴ−融合蛋白の発現は、「発現ベ
クターの構築」及び「形質転換と蛋白発現」の表題の段落で示されるように、培
養培地へのＩＰＴＧの添加により誘発した。非誘発性の形質転換と対照的に、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによるＩＰＴＧ処置細胞可溶化液の分析により、ＧＳＴ−融合蛋
白に相当する３２ｋＤａの蛋白の存在が示された。ＧＳＴ−蛋白を、グルタチオ
ン−セファロースＣＬ−４Ｂカラム上でアフィニティクロマトグラフィーにより
精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモニターした。グルタチオンで吸着した物質の溶出
の結果、１２.５％のポリアクリルアミドゲル中、３２ｋＤａで出現するメジャ
ーバンドと２８ｋＤａでのマイナーバンドが見られた。このマイナーな２８ｋＤ
ａの成分は、相対的量が調製毎に様々であることから、第Ｘａ因子様の活性を有
する内因性の細菌性プロテアーゼによりＧＳＴ蛋白から遊離した遊離ＧＳＴに相
当し得る。精製ＧＳＴ蛋白を第Ｘａ因子で処置することによりデンドロアスピン
のサイズに近い７ｋＤａのバンドとして出現する組換え蛋白を遊離し、２８ｋＤ
ａのバンドの強度として出現する遊離ＧＳＴがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定され
た。その７ｋＤａの蛋白を更に精製して、ＰＲＰ中でＡＤＰ誘発性血小板凝集を
阻害可能な各ピークから等分量を試験して同定した活性であるフラクションと一
緒に逆層ＨＰＬＣにより均質化した。更に質量分析で特徴付けして、第Ｘａ因子
プロテアーゼ処置によりArg^１できちんと切断していることを確認する。

【００７７】修飾分子図１は、本明細書と国際特許ＷＯ98/42834中に示すのようなデンドロアスピン
遺伝子の突然変異誘発により獲得可能な修飾一機能性及び二機能性デンドロアス
ピンの配列を示している。

【００７８】実施例２ＫＱＡＧＤＶ−デンドロアスピン実施例１に示されるのと同じ方法で、ＫＱＡＧＤＶ−デンドロアスピンを発現
し、精製した。部位特的突然変異誘発に利用する変異誘発プライマーは： dGGT TGC TTC ACT CCG AAA CAG GCT GGT GAC GTT CCG GGT CCG TAC TGCでありこ
れはアミノ酸配列：ＧＣＦＴＰＫＱＡＧＤＶＰＧＰＹＣと一致する。

【００７９】以上より本発明は、天然のＲＧＤモチーフを除去したり（ｉ）インテグリン結
合活性のないアミノ酸配列、又は（ii）ＲＧＤ以外のアスパラギン酸又はグルタ
ミン酸含有インテグリン結合アミノ酸配列により置き換えたりしたデンドロアス
ピンフレームワーク中の１つ又はそれ以上の非野生型デンドロアスピンアミノ酸
配列に対する骨格としてのデンドロアスピンの用途を提供することが理解されよ
う。

【００８０】参考文献 1. Kieffer, N., and Phillips, D.R. (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 6, 329-35
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【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、挿入されたアミノ酸配列をデンドロアスピンのアミノ酸
配列の下に示した修飾型デンドロアスピン配列を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ビジェイ・バー・カッカーイギリス、エスダブリュー３・６エルアール、ロンドン、チェルシー、マンレサ・ロード、エマニュエル・ケイ・ビルディング、スロンボシス・リサーチ・インスティテュートＦターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 CA06 DA06 EA04 FA02 FA18 GA11 HA01 4B064 AG02 AG30 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 AA17 BA41 BA44 CA53 DB53 DB54 DB55 DC15 DC17 DC35 NA05 ZA362 ZA542 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA20 CA53 DA65 DA83 EA24 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然のＲＧＤモチーフが除去されているか又は天然のＲＧＤ
モチーフが（ｉ）インテグリン結合活性のないアミノ酸配列又は（ii）インテグ
リン結合アミノ酸配列である置換アミノ酸配列により置き換えられているデンド
ロアスピン骨格からなり、且つＧに隣接するＤ又はＥを含有するＲＧＤ以外のト
リペプチド配列からなる生成物。
【請求項２】該トリペプチド配列が式Ｂ−Ｊ−Ｚからなるものであって、式中、（Ｉ）Ｊ−ＺはＧＤ又はＧＢであり、ＢはＲ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｖ、Ｉ
、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、又はＷである；（II）Ｂ−ＪはＤＧ又はＥＧであり、Ｚは任意のアミノ酸である；又は（III）ＪはＤ又はＥで、Ｂ及びＺはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、又はＷの中
からそれぞれ独立して選ばれる、請求項１に記載の生成物。
【請求項３】Ｊ−ＺがＧＤである、請求項２(Ｉ)に記載の生成物。
【請求項４】ＢがＲ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｈ、又はＮであり、且つＢ−Ｊ−Ｚは
ＧＤではない、請求項２(Ｉ)又は請求項３に記載の生成物。
【請求項５】ＢがＲ、Ｋ、Ｑ、又はＡである、請求項４に記載の生成物。
【請求項６】Ｂ−Ｊ−ＺがそのＣ末端でＭ、Ｗ、Ｎ、又はＶに結合してい
る、請求項２(Ｉ)及び３〜５のいずれかに記載の生成物。
【請求項７】当該Ｍ、Ｗ、Ｎ、又はＶ残基の後が野生型デンドロアスピン
の４７位にあるＰ、又はＰが置換されたＡ残基である、請求項６に記載の生成物
。
【請求項８】インテグリン結合アミノ酸配列の前が野生型デンドロアスピ
ンの４７位にあるＰ、あるいはＰが置換されたＡ残基である、請求項２(Ｉ)及び
３〜７のいずれかに記載の生成物。
【請求項９】ＢがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗである、請求項２(Ｉ)又は
３に記載の生成物。
【請求項１０】ＢがＬ又はＶである、請求項９に記載の生成物。
【請求項１１】ＢがＬであり、Ｂの前がＭである、請求項１０に記載の生
成物。
【請求項１２】Ｂ−ＪがＤＧである、請求項２(II)に記載の生成物。
【請求項１３】ＺがＥ、Ｒ、又はＰである、請求項２(II)又は請求項１２
に記載の生成物。
【請求項１４】Ｚの後が野生型デンドロアスピンの４７位にあるＰ、又は
野生型の４７位のＰの前に挿入されたＡである、請求項２(II)、１２、及び１３
のいずれかに記載の生成物。
【請求項１５】ＪがＤである、請求項２(III)に記載の生成物。
【請求項１６】Ｂ−Ｊ−ＺがＬＤＶである、請求項２(III)に記載の生成
物。
【請求項１７】Ｂ−Ｊ−Ｚの前がＩ残基である、請求項２(III)、１５、
及び１６のいずれかに記載の生成物。
【請求項１８】当該（ｉ）インテグリン結合活性をもたない置換アミノ酸
配列からなり、当該置換アミノ酸配列がレセプター結合機能を有する、請求項１
に記載の生成物。
【請求項１９】当該（ｉ）インテグリン結合活性をもたない置換アミノ酸
配列からなり、当該置換アミノ酸配列が天然のポリペプチド中でポケットに入り
込んで機能する配列である、請求項１に記載の生成物。
【請求項２０】ＲＧＤモチーフの除去又は置き換えに加えて、外来（非野
生型デンドロアスピン）ドメインを少なくとも１つ含む、請求項１〜１９のいず
れかに記載の生成物。
【請求項２１】該少なくとも１つの非野生型デンドロアスピンドメインが
生成物に機能性を与える非デンドロアスピンドメインを少なくとも１つ含む、請
求項２０に記載の生成物。
【請求項２２】少なくとも２つの該非野生型デンドロアスピンドメインか
らなり、その非野生型デンドロスピンドメインはで同一配列を有していてもよい
、請求項２０又は請求項２１に記載の生成物。
【請求項２３】当該少なくとも１つの非野生型デンドロアスピンドメイン
が、デンドロアスピンのアミノ酸残基の少なくとも１つにより分離された２つ又
はそれ以上のアミノ酸配列部分を有する当該ドメインを含む、請求項２０〜２２
に記載の生成物。
【請求項２４】血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）活性、糖蛋白ＩＢ_α活性
、ヒルジン活性、トロンボモジュリン活性、血管上皮成長因子活性、トランスフ
ォーミング成長因子β_１活性、塩基性繊維芽細胞成長因子活性、アンギオテンシ
ンII活性、第VIII因子活性、フォンウィルブランド因子活性、ダニ抗凝固蛋白（
ＴＡＰ）因子活性、又は線虫抗凝固蛋白（ＮＡＰ）因子活性を与える当該非野生
型デンドロアスピンドメインを含有する、請求項２０〜２３のいずれかに記載の
生成物。
【請求項２５】該非野生型デンドロアスピンドメインが、血小板成長因子
（ＰＤＧＦ）、糖蛋白ＩＢ_α、ヒルジン、トロンボモジュリン、血管上皮成長因
子、トランスフォーミング成長因子β_１、塩基性繊維芽細胞成長因子、アンギオ
テンシンII、第VIII因子、フォンウィルブランド因子、ＴＡＰ、又はＮＡＰ（例
えばＭＡＰ５）に由来する配列、又は当該配列の少なくとも一部分と相同する配
列である、請求項２４に記載の生成物。
【請求項２６】該非野生型ドメイン／ドメイン群が、デンドロアスピン骨
格の（ａ）ループＩ及び／又はループII；（ｂ）ループＩ及び／又はループIII
；（ｃ）ループII及び／又はループIII；又はループＩ、ループII、及びループI
IIに導入されている、請求項２０〜２５に記載の生成物。
【請求項２７】単一の当該非野生型ドメインが存在し、そのドメインがル
ープＩ又はループIIのいずれかに導入されている、請求項２６に記載の生成物。
【請求項２８】該非野生型ドメイン／ドメイン群が、デンドロアスピン骨
格中の４−１６、１８−２１、又は２３−２６から選ばれたアミノ酸残基間、又
は残基５０の後のデンドロアスピン骨格の末端部に含有されている、請求項２０
〜２５に記載の生成物。
【請求項２９】単一の非野生型ドメインが存在する、請求項２８に記載の
生成物。
【請求項３０】ＲＧＤモチーフが１つのドメインで当該インテグリン結合
アミノ酸配列により置き換えられたデンドロアスピン骨格と別のドメインに第２
の機能を与える非デンドロアスピン種を含むポリペプチドである、請求項２０〜
２５に記載の生成物。
【請求項３１】デンドロアスピン骨格の非ループ領域の残基が、非デンド
ロアスピン種をデンドロアスピン骨格の末端配列へ直接又はリンカーを通じてラ
イゲーションして、非デンドロアスピン種により増大されている、請求項３０に
記載の生成物。
【請求項３２】ループIIIが、天然のデンドロアスピンと比較して１つ又
はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、除去、又は置換により更に修飾されている、
請求項１〜３１のいずれかに記載の生成物。
【請求項３３】当該ループIII内部の更なる修飾により最大８個で最小１
個のアミノ酸が修飾されている、請求項３２に記載の生成物。
【請求項３４】ＲＧＤが、当該インテグリン結合配列により置き換えられ
、そして当該更なる修飾が当該インテグリン結合配列に隣接するアミノ酸の修飾
を含む、請求項３２又は請求項３３に記載の生成物。
【請求項３５】ループＩ及び／又はループIIが、１つ又はそれ以上のアミ
ノ酸残基の挿入、除去、置換によって更に修飾されている、請求項１〜３４のい
ずれかに記載の生成物。
【請求項３６】天然のデンドロアスピンよりも最大で１００個多いアミノ
酸残基を含有する、請求項１〜３５のいずれかに記載の生成物。
【請求項３７】天然のデンドロアスピンよりも１４〜３６個多いアミノ酸
残基を含有する、請求項１〜３６のいずれかに記載の生成物。
【請求項３８】請求項１〜３７のいずれかに記載のポリペプチド生成物を
コードする、核酸分子。
【請求項３９】プロモーターに有効に結合し、場合によって異種蛋白又は
ペプチドをコードする核酸配列にも結合し、これにより融合生成物をコードする
、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】該プロモーターがＩＰＴＧ誘発性であり、場合によって該
異種蛋白又はペプチドがグルタチオンＳ−トランスフェラーゼであってもよい、
請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】請求項３８〜４０のいずれかに記載の核酸を含んでなる、
プラスミド。
【請求項４２】請求項３８に記載の核酸を含んでなる、プラスミドｐＧＥ
Ｘ−３Ｘ。
【請求項４３】請求項４１又は請求項４２に記載のプラスミドで形質転換
された、宿主細胞。
【請求項４４】大腸菌である、請求項４３に記載の宿主細胞。
【請求項４５】請求項４３又は請求項４４に記載の宿主細胞を含んでなる
、細胞培養体。
【請求項４６】当該ポリペプチドを発現するように請求項４３又は請求項
４４に記載の宿主細胞を培養し、その培養体から該ポリペプチドを抽出し、そし
てそのポリペプチドを精製することを含む、請求項１〜３７のいずれかに定義さ
れるようなポリペプチドの生成法。
【請求項４７】デンドロアスピン骨格からなるポリペプチドの生成法であ
って、その方法が：ａ）有効にプロモーターと結合し、更に場合によりそれと共に共発現するため
に異種の蛋白をコードする核酸配列と結合した請求項１に示すデンドロアスピン
骨格をコードする核酸配列からなる発現ベクターを調製し；そしてｂ）当該ベクターと一緒に宿主細胞を形質転換し、宿主細胞に修飾デンドロア
スピン核酸配列を発現させることを含む、方法。
【請求項４８】段階（ａ）が、ａ）（ｉ）オーバーラップするオリゴヌクレオチドからＲＧＤモチーフを含有
するデンドロアスピン骨格のコード配列を構築し、その結果生成するｃＤＮＡを
有効にプロモーターに連結し、更に場合により当該プロモーターを融合蛋白を発
現するために異種の蛋白をコードする核酸配列にも連結し；そしてａ）（ii）ＲＧＤが除去されているか又は請求項１〜１４のいずれかに定義さ
れるような置換アミノ酸配列により置き換えられたデンドロアスピン骨格をコー
ドするように発現ベクターのＲＧＤコードドメインを修飾することを含む、請求
項４７に記載の方法。
【請求項４９】段階（ａ）（ii）が当該修飾の前か後に、更にデンドロア
スピン骨格をコードするベクターの核酸配列の他のドメインの少なくとも１つを
１つ又はそれ以上の核酸残基の挿入、除去、又は置換により修飾することを含み
、これにより発現によってデンドロアスピン骨格が非野生型デンドロアスピン配
列に相当するドメインを含むようにした請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】段階（ａ）が、ＲＧＤをコードするドメインが除去されて
いるか又はこれが請求項１〜１４のいずれかにおいて定義されるような置換アミ
ノ酸配列により置換されたデンドロアスピン配列をコード核酸配列からなる発現
ベクターをオリゴヌクレオチドから構築し、更にデンドロアスピン骨格をコード
するベクターの核酸配列の他のドメインの少なくとも１つを１つ又はそれ以上の
核酸残基の挿入、除去、又は置換により修飾し、これによって発現よってデンド
ロアスピン骨格が非野生型デンドロアスピン配列に相当するドメインを含むよう
にしてもよい、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】方法が：ｄ）宿主細胞培養体から修飾デンドロアスピンを抽出し、ｅ）当該細胞培養体抽出物から修飾デンドロアスピンを精製し、そしてその修
飾デンドロアスピンが融合蛋白であれば、当該融合蛋白の異種部分からデンドロ
アスピン部分を切断することからなる段階を更に含む、請求項４６〜５０のいず
れかに記載の方法。
【請求項５２】該異種蛋白が、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）であり、その精製が、ＧＳＴアフィニティークロマトグラフィーに続いてＧ
ＳＴから修飾デンドロアスピンを切断すること含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】請求項４６〜５２のいずれかに記載の方法により取得可能
な、請求項１〜３７のいずれかに記載のポリペプチド生成物。
【請求項５４】請求項１〜３７又は５３のいずれかに記載の薬理学的に活
性である生成物を含んでなる、医薬品組成物。
【請求項５５】更に薬学的に許容される賦形剤又は担体を含んでなる、請
求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】医薬品としての使用を目的とする、請求項１〜３７又は５
３のいずれかに記載の薬理学的に活性な生成物。
【請求項５７】血栓症に伴なう疾病の処置又は予防用の薬物を製造するた
めである、請求項１〜３７又は５３のいずれかに記載の薬理学的に活性な生成物
の用途。
【請求項５８】当該疾病が、血栓症、心筋梗塞、網膜血管新生、及び内皮
損傷の１つ又はそれ以上である、請求項５７に記載の用途。
【請求項５９】ヒト又は動物患者における血栓症に伴なう疾病の処置又は
予防法であって、当該患者に請求項１〜３７又は５３のいずれかに記載されるよ
うな薬理学的に活性な生成物を有効量投与することを含む、方法。
【請求項６０】生成物中に含有される１つ又はそれ以上の非野生型デンド
ロアスピン配列の機能、効果、又は活性を検討するためである、請求項１〜３７
又は５３のいずれかに記載の生成物の用途。
【請求項６１】野生型デンドロアスピン配列以外の種の機能、効果、又は
活性を検討する方法であって、当該種を含む請求項１〜３７又は５３のいずれか
に記載の生成物を調製し、当該生成物でインビボ又はインビトロのテストを実施
することを含む、方法。
【請求項６２】請求項６１に記載の方法を実施することにより機能、効果
、又は活性が検討された種を含有する生成物を薬物に製剤化することを更に含む
、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】天然のＲＧＤモチーフが除去されているか又はこれが（ｉ
）インテグリン結合活性のないアミノ酸配列、又は（ii）ＲＧＤ以外のアスパラ
ギン酸又はグルタミン酸含有インテグリン結合アミノ酸配列により置き換えられ
たデンドロアスピンフレームワーク中の１つ又はそれ以上の非デンドロアスピン
アミノ酸配列に対する骨格としての、デンドロアスピンの用途。