CN101921326B - 一种重组抗栓肽突变体、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种重组抗栓肽突变体、制备方法及用途，本发明利用蛋白质工程技术对抗栓肽(decorsin)进行基因设计，将野生型的抗栓肽的第34位的丙氨酸突变为色氨酸，并同时将第35位的天冬氨酸突变为精氨酸，并利用基因工程技术进行生产，所获的重组蛋白具有比野生型抗栓肽更强的抗血小板聚集功效。

Description

一种重组抗栓肽突变体、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及具有抗血小板聚集功效的抗栓肽突变体，还涉及它的克隆、表达以及分离纯化。

背景技术

心血管疾病已成为全球卫生保健和卫生资源的沉重负担，是第二次卫生革命的头号敌人。发现新型特效、低毒、非静脉注射类型的用于治疗溶栓和抗栓药物已成为国内外心脑血管血栓治疗药物研究领域内的重点和热点。Seymour等(J Bio Chem，1990，265(17)：10143)首先从北美水蛭中发现抗栓肽是一种较好的血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa拮抗剂。抗栓肽(decorsin)是一种由39个氨基酸组成的小肽，等电点4.58，分子量为4384(还原型)。随着分子生物学及基因工程技术的发展，人们对蛋白质及多肽类药物的研究开发已经逐步由克隆表达天然蛋白质发展到对天然蛋白质进行设计和修饰，以期达到提高天然蛋白质药物生理活性、稳定性，降低毒副作用的目的。

文献报道(J Bio Chem，1990，265(17)：10143)的抗栓肽的半抑制浓度IC₅₀为500nmol/L，完全抑制浓度≤2.5μmol/L。

发明内容

本发明公开了一种重组抗栓肽突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列，即其氨基酸序列如下：

Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Gln-Cys-Gln-Gly-Asp-Asp-Gln-Glu-Lys-Cys-Leu-Cys-Asn-Lys-Asp-Glu-Cys-Pro-Pro-Gly-Gln-Cys-Arg-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Pro-Tyr-Cys-Glu它通过改变野生型抗栓肽(decorsin)第34位的丙氨酸为色氨酸、第35位的天冬氨酸为精氨酸得到。

本发明还公开了该突变体基因的获得、原核表达载体的构建以及该重组多肽的分离纯化方法。

本发明根据野生型抗栓肽的氨基酸序列，并结合大肠杆菌的偏好密码子，设计了将原来野生型抗栓肽第34位的丙氨酸为色氨酸，第35位的天冬氨酸为精氨酸，并设计了四条引物，经重叠PCR的方法获得目的编码序列。然后将获得的编码序列进行HindIII和Kpn I双酶切后克隆至大肠杆菌表达质粒pET32a，获得重组表达质粒pET32a-Mutation然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，并经金属螯合亲和层析并结合蛋白酶酶切技术建立了分离纯化工艺。

本发明的重组抗栓肽突变体的制备方法，依次包括下列步骤：

a、采用序列重叠的方法进行PCR扩增获得抗栓肽突变体的基因，四个参与PCR的序列分别为：

P1：5’-AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAGTGC CAG GGT GA-3’

P3：5’-CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAAAAATGC CTG TGCAAC AAA GAC GAA TGC-3’

P4：5’--AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGTCTT TGT TGC ACA-3’

P2：5’--CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGGGAAACG G-3’

b、突变体基因以限制性内切酶HindIII及Kpn I进行双酶切后***原核表达载体pET32a形成的表达质粒，转化大肠杆菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导基因表达；

c、工程菌发酵后离心收集菌体，超声破碎细菌，离心，收集细菌裂解液，用Ni金属螯合层析柱纯化产品，即得。

药理实验证明，本发明的抗栓肽突变体具有优异的抑制血小板聚集功能，下面是本发明的抗栓肽突变体的ADP诱导的抗血小板聚集抑制试验：

精密称取本发明的抗栓肽突变体，用50mmol/L，pH8.0的Tris-Cl配制成1000μmol/L储液，倍比稀释至100，50，25，10，5，2.5，1.0，0.5μmol/L待用。采用Born比浊法测定抗栓肽突变体的ADP诱导的抗血小板聚集活性。自健康成年志愿者(试验前10d禁服任何可引起血小板聚集活性改变的药物)取血，然后制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。使用LBY-NJ血液凝聚仪，以PRP调零点，PPP调100％透光率，在180μlPRP中放入小磁棒，然后加入10μl待测样品，置于凝聚仪上37℃预热5min，最后加入ADP至终浓度为15μmol/L(体系总体积为200μl)，检测5min，记录凝集曲线，得到5min内最大凝集率。血小板凝集抑制率(％)＝(对照血小板最大聚集率％一样品管的最大聚集率％)/对照管血小板最大聚集率％×100％。结果见图1。图1中显示抗栓肽突变体具有显著的抑制ADP诱导的血小板聚集的活性，而且抑制聚集程度呈现浓度依赖性，其半抑制浓度IC₅₀为140nmol/L，完全抑制浓度≤1.25μmol/L。与文献报道的抗栓肽的半抑制浓度IC₅₀为500nmol/L，完全抑制浓度≤2.5μmol/L相比，本发明将抗栓肽34位的丙氨酸突变为色氨酸及35位天冬氨酸突变为精氨酸后，其抗血小板聚集活性显著增强。

本发明的重组抗栓肽突变体可以和药学上可接受的载体混合，制成药学上常用的剂型用于临床。

附图说明

图1是ADP诱导的抗血小板聚集抑制试验结果

图2是重叠PCR产物琼脂糖凝胶电泳图(1：DNA markers 1500、1250、1042、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp；2：重叠PCR产物)

图3是重组质粒pET32a-Mutation的构建图(图中详细说明构建的方式方法)

图4是重组质粒pET32a-Mutation的测序结果图(图中附有序列两端的限制性内切酶切位点)

图5是重组质粒pET32a-Mutation诱导表达的SDS-PAGE电泳图(1：蛋白质分子量Markers；2：未诱导的工程菌；3：诱导后的工程菌)

图6是亲和层析分离后SDS-PAGE电泳图(1：亲和层析分离后的重组蛋白；2：蛋白质分子量Markers)

图7是重组蛋白经肠激酶酶解之后的SDS-PAGE电泳图(1：蛋白质分子量Markers；2：肠激酶酶解之前的重组蛋白；3：肠激酶酶解之后的产物)

具体实施方式

菌株与质粒

pET32a(+)为美国Novagen公司产品；大肠杆菌Escherichia coli DH5α；大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)由本实验室保存。

工具酶

TaqplusDNA聚合酶、限制性内切酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司；T4DNA连接酶购自美国Promega公司；肠激酶购自美国GeneLab公司。

其他主要试材和仪器

dNTPs、10×PCR反应缓冲液购自上海生工生物工程技术服务有限公司；HisTrap kit购自Amersham公司；PCR仪(Ampgene 4800)；LBY-NJ血液凝聚仪(北京普利生)

主要溶液

亲和色谱缓冲液：20mmol/L pH 7.4的磷酸钠，0.5mol/L NaCl(根据所需添加不同浓度咪唑)

平衡缓冲液I：20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25mmol/L咪唑

实施例1

抗栓肽突变体基因的克隆

(1)设计合成引物，同时在引物中引入HindIII及Kpn I酶切位点。

P1：5’-AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAG TGC CAG GGT GA-3’

P3：5’--CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAA AAA TGC CTG TGC AAC AAA GAC GAATGC-3’

P4：5’--AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGT CTT TGT TGCACA-3’

P2：5’--CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGG GAA ACG G-3’

(2)以(1)中的四条引物进行重叠PCR反应，获得突变体基因。

PCR反应均采用TaqplusDNA聚合酶进行扩增，各个引物浓度为25μmol/L，取引物P1，P2各5μl，引物P3，P4各1μl在50μl体系进行PCR反应，条件如下：94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，共进行25个循环，重叠PCR产物琼脂糖凝胶电泳图见图2。

(3)将(2)获得的序列进行HindIII和Kpn I双酶切反应后，定向***表达载体pET32a(+)，获得表达载体pET32a-Mutation，重组质粒pET32a-Mutation的构建图见图3，而重组质粒pET32a-Mutation的测序结果图见图4。

(4)表达载体pET32a-Mutation转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，用含氨苄青霉素50μg/ml)的LB平板进行阳性克隆筛选，并将阳性转化子进行测序验证。

测序结果表明，获得的基因序列的对应的氨基酸序列为(从N端到C端)：

Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Gln-Cys-Gln-Gly-Asp-Asp-Gln-Glu-Lys-Cys-Leu-Cys-Asn-Lys-Asp-Glu-Cys-Pro-Pro-Gly-Gln-Cys-Arg-Phe-Pro-Arg-Gly-Asp-Trp-Arg-Pro-Tyr-Cys-Glu

实施例2

抗栓肽突变体的表达及分离纯化

(1)抗栓肽突变体的表达

将克隆菌转接入LB培养基，使用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达4h，离心收集菌体沉淀，使用12％SDS-PAGE检测目的蛋白，如图5。

(2)抗栓肽突变体的分离纯化

A.细胞破碎：将收集菌体悬浮于20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.5mmol/LEDTA缓冲液中。冰水浴上超声裂菌。待菌液粘度下降后，10000r/min离心10min收集菌液上清。

B.HisTrap kit亲和层析：将细胞裂解液上清上样于已用平衡缓冲液I(20mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，25mmol/L咪唑)预平衡过的HisTrap亲和柱。上样完毕后，先用10倍柱体积的平衡缓冲液I充分洗柱，每一柱体积收集一管，然后10倍柱体积含100mmol/L咪唑的20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)进行梯度洗脱，收集主要位于100mmol/L的咪唑洗脱峰洗脱峰，亲和层析分离后SDS-PAGE电泳图见图6。

C.肠激酶酶切：将B中获得的蛋白用肠激酶酶切，根据1U的肠激酶可以有效剪切25μg的目的蛋白的量，将B中获得的蛋白在23℃孵育16h，经HisTrapTM-HP柱纯化，收集前流份，SDS-PAGE电泳图见图7。

序列表

<110>中国药科大学

<120>一种新型重组抗栓肽突变体及制备方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>39

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Ala Pro Arg Leu Pro Gln Cys Gln Gly Asp Asp Gln Glu Lys Cys Leu

1               5                   10                  15

Cys Asn Lys Asp Glu Cys Pro Pro Gly Gln Cys Arg Phe Pro Arg Gly

            20                  25                  30

Asp Trp Arg Pro Tyr Cys Glu

        35

Claims (4)

1.一种重组抗栓肽突变体，其特征是：序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1的重组抗栓肽突变体的制备方法，依次包括下列步骤：

a、采用序列重叠的方法进行聚合酶链式反应扩增获得抗栓肽突变体的基因，四个参与PCR的序列分别为：

P1：5’-AAA GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCA CCG CGT CTG CCG CAGTGC CAG GGT GA-3’

P3：5’-CTG CCG CAGTGC CAG GGT GAC GAC CAG GAAAAA TGC CTG TGCAAC AAA GAC GAA TGC-3’

P4：5’--AGT CAC CAC GCG GGA AAC GGC ACT GAC CCG GCG GGC ATT CGTCTT TGT TGC ACA-3’

P2：5’--CCC AAG CTT TTA TTC GCA GTA CGG GTC CCA GTC ACC ACG CGGGAA ACG G-3’

b、突变体基因以限制性内切酶HindIII及Kpn I进行双酶切后***原核表达载体pET32a形成的表达质粒，转化大肠杆菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导基因表达；

c、工程菌发酵后离心收集菌体，超声破碎细菌，离心，收集细菌裂解液，用Ni金属螯合层析柱纯化产品，即得。

3.权利要求1的重组抗栓肽突变体用于制备抑制血小板聚集的药物的用途。

4.一种药物组合物，其中含有权利要求1的重组抗栓肽突变体和药学上可接受的载体。

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