JPH04505753A - 血小板活性化阻害ポリペプチドを製造する方法ならびにそれを用いた方法，組合せおよび組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ハ　活性　ポリペプチドを′°８する　゛。

ならびにそれを　いた　法、組合せおよび組成λ災旦１困笈互 本発明は、北アメリカヌママムシ（Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｗａｔｅｒ Ｍｏｃｃａｓｉｎ）の毒から精製された、血小板の活性化を阻害するポリペプチ ドおよびその誘導体、並びにそれらの精製方法に関する。本発明はさらに、これ らの血小板活性化阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列および組換えＤＮＡ 分子に関し、そして、血小板活性化阻害ポリペプチドと従来の抗トロンビンポリ ペプチドとの両者を含有する融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子に関 する。本発明はさらに、単独で、または従来の抗トロンビン化合物との組合せと して存在する、これらのうち少なくとも１つの天然または組換えの血小板活性化 阻害剤により特徴付けられる医薬組成物および方法に関する。本発明の組成物、 組合せおよび方法は、血栓性の疾患の治療に有用である。

１１茨五 血小板の凝集および遊離反応（まとめて血小板活性化として知られている）は止 血に必須である。しかし、止血を制御する血小板の機能が混乱すると血栓が生じ ることがあり、これが組織に通じる血流を閉塞すると病原となる。このようなこ とは、心筋梗塞、発作、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞および他の血 液系血栓症のような種々の生命に関わる血管性疾患で生じる。従って、血小板の 凝集および遊離を制御する方法が、これらの疾患の治療に望まれる（１．　Ａ、 　ＨａｒｋｅｒおよびＭ、Ｇｅｎｔ、”Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｇｅｎｔｓ　 ｔｈａｔ　Ｍｏｄｉｆｙ　ＰｌａｔｅｌｅｔＦｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　 Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ＋。

Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、Ｒ，Ｗ、Ｃｏ１ｍａｎ ら、４．　ｐ、ｐ、１４３８−５６、　Ｊ、　Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、　 Ｃｏ、、ペンシルバニア州フィラデルフィア、　（１９８７＞）。さらに、血小 板凝集の阻害は、透析、血小板濃縮液としての血小板の保存およびそれに続く血 管手術のような、体外で血液を取扱う場合にも望まれる。

血小板の凝集と遊離を起こす天然および合成の多数の化合物が知られている。こ の中には、ＡＤＰ、コラーゲン、アラキドン酸、エピネフリン、トロンビン、リ ストセチンおよびトロンボキサンＡ２疑似物質であるＵ４６８１９が含まれる。

これらの化合物が血小板の凝集または遊離を生じるメカニズムは様々であり、血 小板表面上の数種の異なるレセプターの一つが含まれる。

現在、動脈の血栓性疾患の予防および治療のために、様々な抗血小板剤が使用さ れている。これらの薬剤の多くは特定の血小板凝集および／または放出機構に特 異的であるため、治療における薬剤の選択は、阻害しようとする血小板の特定の 活性化様式に依存する。抗血小板剤は、血小板シクロオキシゲナーゼの阻害、ト ロンボキサンＡ２レセプターに対する拮抗、トロンボキサンＡ２合成阻害、ＣＡ ＭＰレベルの上昇、および血小板表面域タンパク質ｎｂ／Ｈａに対する拮抗と中 和等を含む様々な様式で作用する。

糖タンパク質ＩＩ　ｂ　／　ｍ　ａは血小板のフィブリノーゲンレセプターであ る。これは、ＡＤＰ、エピネフリン、トロンビンまたはプロスタグランジン誘導 体とその前駆体による血小板の刺激によって、カルシウム依存性の様式で二本鎖 複合体に自己会合する（Ｓ、　Ｊ、　５ｈａｔｔｉｌら、−Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉ ｎ　ｔｈｅ　ＰｌａｔｅｌｅｔＭｅｍｂｒａｎｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｉ［ｂ／Ｈａ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｄｕｒｉｎｇ　ＰｌａｔｅｌｅｔＡｃｔｉｖａ ｔｉｏｎ−、Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６０．　ｐｐ、１１１０７− １４　（１９１１５）　：Ｇ、Ａ、Ｍａｒｇｅｕｒｉｅら、−Ｈｕｍａｎ　Ｐｌ ａｔｅｌｅｔｓ　Ｐｏ５ｓｅｓｓ　ａｎ　Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ａｎｄ　５ａｔ ｕｒａｂｌｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　Ｆｉｂｒｉｎｏ ｇｅｎ”、±Ｂｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、、　２５４．　ｐｐ、５３５７−６３　（ １９７９））　ｏ　この結果、二個の血小板の活性化糖タンパク質ＩＩ　ｂ　／ 　ｍ　ａ複合体とフィブリノーゲンとの間の架橋によって媒介され、血小板凝集 が起こる。特に、糖タンパク質Ｕ　ｂ　／　ｍ　ａはフィブリノーゲンのＡｒ　 ｇ−Ｇ　１　ｙ−Ａｓ　ｐ配列に結合する（Ｍ、　Ｄ、　Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃ ｈｅｒおよびＥ、　Ｒｕｏｓｌａｈｔｊ、　−Ｃｅｌｌ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ 　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｉｂｒ。

ｎｅｃｔｉｎ　Ｃａｎ　Ｂｅ　Ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ　Ｂｙ　Ｓｍａｌｌ　５ｙ ｎｔｈｅｔｉｃ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ”、　Ｎ ａｔｕｒｅ、　３０９．　ｐｐ、　３Ｏ−３３（１９８４）　：　Ｋ、　Ｍ。

Ｙａｍａｄａおよびり、　Ｗ、　Ｋｅｎｎｅｄｙ、　−Ｄｕａｌｉｓｔｉｃ　Ｎ ａｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｄｈｅｓｊｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：　 Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ　Ａｃｔ ｉｖｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｃａｎ　Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉ ｔ　ＦｉｂｒｏｎｅｃｔｊｎＦｕｎｃｔｉｏｎ−、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 、　９９．　ｐｐ、　２９−３６　（１９８４）；　Ｎ、　Ｇｉｎｓｂｅｒｇら 、１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔ ｏ　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　Ｂｙ　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ 　ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｗｈｉａｈ　５ｕｐｐｏｒ ｔ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ”、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｆｆｌ 、、２６０゜ｐＰ、３９３１−３６　（１９８５）：　Ｅ、Ｆ、Ｐｌｏｗら、” Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ 　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｎ　Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　ａｎｄ　Ｙｏｎ　Ｗｉｌｌ ｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ”、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　８２．ｐｐ、　８０５７ −６１　（１９８５）　：　Ｔ、　Ｋ、　ＧａｒｔｎｅｒおよびＪ、Ｓ、Ｂｅｎ ｎｅｔｔ、＋Ｔｈｅ　Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ　Ａｎａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ＣｅｌｌＡｔｔａｃｈｍｅｎｔ　５ｉｔｅ　ｏｆ　Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉ ｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　 Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｌａｔ ｅｌｅｔｓ−。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２６０．　ｐｐ、１１８９１−９４　（１９８５） 　；　Ｍ、Ｋｌｏｃｚｅｖｉａｋら、“Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　 ５ｉｔｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　Ｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　ＰＩａｔｅｌｅｔ 　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｏｎ　Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｓｅｇｍｅｎ ｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　Ｇａａ＋ｌｌ１ａ　Ｃｈａｉｎ ”、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｎ＋１１゜１０７、ｐｐ、１８ １−８７　（１９ｇ２））。

最も広（使用されている抗血小板剤は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるアス ピリンである。アスピリンはＡＤＰおよびコラーゲンによる血小板凝集をブロッ クするが、トロンビンのようなアゴニストによって開始されるシクロオキシゲナ ーゼ非依存性の血小板凝集は防止できない。さらに、多くの臨床研究によっても 、アスピリンは動脈の血栓症の治療に有効性を示し得なかった（Ｌ、Ａ、　Ｈａ ｒｋｅｒおよびＭ、　Ｇｅｎｔ、前記）。

さらに、アスピリンは血小板の酵素に修飾を生じさせ、回復までに少なくとも一 週間かかる。この−週間の間に手術または重い外傷にあった場合、処置された患 者は出血の危険に置かれる。

例えばモノクローナル抗体のような、糖タンパク質ｎｂ／ｍａに特異的な阻害剤 （Ｊ、　Ｓ、　Ｂｅｎｎｅｔｔら、　”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｂｒ ｉｎｏｇｅｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｐ ｌａｔｅｌｅｔｓ　Ｂｙ　ａ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　！ｔｏ、　ｐｐ、２ ４１？−２１（１９８３）　：　Ｒ，Ｐ、　ＭｃＥｖｅｒら、”Ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＴｗｏ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔ ｉｏｎａｌｌｙ　Ｄｉｓｔｉｎｃｔ　５ｉｔｅｓ　ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔ ｅｌｅｔ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｉｂ／ｌ１ｌａ　 Ｕｓｉｎｇ　Ｍｏｎ。

ｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２ ５ｇ、　ｐｐ、　５２６９−７５　（１９８３）　；　Ｂ、　Ｓ、　Ｃａ１ｌｅ ｒ、”Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｕｒｆｎｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｔｉｂｏｄｙＲ ｅｐｏｒｔｓ　Ａｎ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｈａｎｇ ｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄｌｏｒ　Ｍｉｃｒｏｅｎ ｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｇｌｙｃｏｐｒ。

ｔｅｉｎ　Ｉ［ｂ／ｌ１ｌａ　Ｃｏｍｐｌｅｘ−、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓ ｔ、、　７６、　ｐｐ、　１０７−０８　（１９８５））、およびＡｒｇ−Ｇｌ ｙ−Ａｓｐを含有する小ペプチド類（Ｔ、に、　ＧａｒｔｎｅｒおよびＪ、Ｓ、 　Ｂｅｎｎｅｔｔ、前記）は、アスピリンに比べて毒性が低（、早く作用し、さ らに効果の持続が短い。これらの化合物は多くの異なる血小板凝集機構に対して 効果的であるが、血小板の放出機構に対しては効果を示さない。Ａｒｇ−ｃｔｙ 　Ａｓｐ含有ペプチド類および糖タンパク質ＩＩ　ｂ　／　ＩＩＩ　ａに対する 抗体の両者について、血栓症のインビボのモデルで抗血栓効果が示されている（ 　Ｙ、　Ｃａｄｒｏｙら、−Ｐｏｔｅｎｔ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｅ ｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ　（ＲＧＤＶ　）　Ｐｅ ｐｔｉｄｅ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ−、Ｃ１ｒｃｕｌａｔ、　Ｐａｒｔ　ＩＩ、　７５ ．　ｐ、Ｉｆ−３１３（１９８８）　；　Ｂ、Ｓ、Ｃｏ１１ｅｒら、”Ａｎｔｉ ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉ ｌｂ／１ｉｒａ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ａｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　 Ａｎｉｍａｌ　Ｍｏｄｅｌ−、阻二世。

６ｇ、ｐｐ、７８３−８６　（１９８６）　：　Ｓ、Ｒ，Ｈａｎｓｏｎら、−Ｅ ｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｍ。

ｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　Ｐｌａｔ ｅｌｅｔ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ１１ｂ／ＩＩ［ａ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｏｎ 　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｂａ ｂｏｏｎ−、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８１．　ｐｐ、１４９−５８　（ １９８８）　；　Ｔ、Ｙａｓｕｄａら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｙ　Ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＣＰ）Ｉｌｂ／ｌ１ｌａ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｐｒｅｖｅｎｔｓ　Ｃｏｒｏｎ ａｒｙ　ＡｒｔｅｒｙＲｅｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　Ｒｅｐｅ ｒｆｕｓｉｎｇ　Ｗｉｔｈ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ−Ｔｙｐｅ 　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎ　Ｄｏｇｓ”、Ｊ、Ｃｌ １ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、８１．　ｐｐ、１２８４−９１　（１９８８）　；　Ｂ 、Ｓ、Ｃａ１ｌｅｒら、　−１ｎｈｉｂｉｔｅｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａ ｔｅｌｅｔ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｗｉｔｈ　Ａ　Ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−、Ａｎｎａｌｓ　Ｉｎｔ、Ｍｅｄ、、１０９．　 ｐｐ、６３５−３８　（１９８８））。

血小板凝集を阻害するためには、Ａｒｇ−ＧＩＹ　Ａｓｐ含有ペプチド類を１０ −５Ｍより高濃度で投与しなければならない。このような必要投与Ｉは、このペ プチド類の商業上の実用性が制限されることを意味する。糖タンパク質ｎｂ／ｍ ａに対するモノクローナル抗体は血小板凝集のより強い阻害剤であるが、これら のマウスハイブリドーマ細胞中での合成は、より強い免疫学的な複雑化の要因の 問題を提起する（Ｓ。

Ｒ，Ｈａｎｓｏｎら、前記）。さらに、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドおよび 糖タンパク質ｎｂ／ｍａに対する抗体は血小板の放出はブロックしない。従って 、これらの薬剤は、遊離した血小板要素の凝集進行効果および結果として起こる 循環血小板プールの活性化のために、インビボにおいて制限された効力しか有さ ない可能性がある。

ヘパ＋Ｊ　７のようなトロンビン阻害剤もまた、血小板阻害剤として使用されて いる。これらの化合物はトロンビンが介在する血小板凝集を阻害するかまたは減 少させるが、他の機構によって生じる血小板活性化には効果が無い。さら（こ、 へ／４リンは例えば出血および血小板減少症のような、い（つかの危険な副作用 を起こすことが知られている。

他のより効果的な抗血小板剤を得ようとする多くの試みが、ヘビ毒の関連に集中 した。はとんどのヘビ毒が、血小板を活性化して凝集と放出を起こす化合物を含 有することが知られているが、幾つかは血小板凝集または血小板遊離の阻害剤を も含有することが示されている。例えばムＬ刀工包凹二お溢匹ｔｏｍａマたは江 コニｌユ匹Ｕμ山１岨から精製された、これらの阻害剤の幾つかは酵素である。

これらの２つの化合物ζよ、それぞれフィブリノーゲンおよびＡＤＰを消化する （Ｃ，Ｏｕｙａｎｇら、−７−Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ａ　ｋ ｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｔ泣旦ｏｍａ　（Ｍａｌａｙａｎ　Ｐｉｔ　Ｖｉｐｅ ｒ）　５ｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍ−、Ｔｏｘｉｃｏｎ、　２１．　ｐｐ、　２５− ３３（１９８３）　；　Ｃ，ＯｕｙａｎｇおよびＴ、　Ｆ、　Ｈｕａｎｇ、　− Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｂ ｙ　５°−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｕｒｉｍ ｅｒｅｓｕｒｕｓ　［」力至巨５ｎａｋｅ　ｌ／ｅｎｏｍ−、Ｔｏｘｉ’ｃｏｎ 、　２１．　ｐｐ、　４９１−５９１　（１９８３）　’）。池のヘビ毒由来の 阻害剤（よ、血小板フィブリノーゲンレセプターをブロックすること１こよりＩ Ｐ酵素的に作用する。この中には、Ｅｃ’ｈｊｓ　ｃａｒｉｎａｔｕ’ｓ力）ら 精製されたカリナチンおよびＴｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ＬＪ±１ｅｕＳ力）ら 精製されたトリグラミンの各タンパク質が含まれる（Ｃ，Ｏｕｙａｎｇら、”Ｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｇｒ ｅｇａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅｒ’ａｎｄ　［ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｆｒｏｍ　Ｅ ｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎａｔｕｓ　５ｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍ−、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 　Ｂｉ。

耐■１−人す１．　８４１．　＋）ｐ、ｌ−７（１９８５）　；　Ｔ、Ｆ、Ｈｕ ａｎｇらどＴｒｉｇｒａｍｉｎ”、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２ ．　ｐｐ、１６１５７−６３　（１９８７））。

たものである。これは分子ｊｌｌｏ、０００の単一ポリペプチド鎖である。フィ ブリノーゲンと糖タンノくり質ＩＩ　ｂ　／　ｍ　ａとの結合をブロックするこ とにより作用するようである（Ｋｄ＝２．１〜ｇ、８Ｘ１０−８Ｍ）。この阻害 は糖タンノイク質■ｂ　／　ｍ　ａに対するモノクローナル抗体およびＡｒｇ− Ｇｌｙ−Ａｓｐ−５ｅｒテトラペプチドによって効果的に拮抗される。還元され たＳ−ピリジルエチルトリグラミンから生じたキモトリプシン消化ペプチドの配 列分析から、このタン７＜り質はＡｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ配列を含有すること が判った。

しかし、Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐを含有する小ペプチドは１０−５Ｍを越える 濃度でのみ有効に血小板凝集をプロ・ツクするが、トリグラミンは約１０−８Ｍ の濃度で有効である。トリグラミンの効力が強いのは、三次元空間内のＡｒｇ− Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列の最適な配置、および糖タン、ｆり質ｎｂ／ｍａ−トリグラ ミン複合体中の他の構造決定基の寄与に起因するようである。この有効性にもか かわらず、トリグラミンは血小板放出反応、即ちトロンビンまたはＵ４６６１９ により誘発されるセロトニン遊離を阻害しない。そのため、インビボでのトリグ ラミンの抗血小板活性は、放出される血小板成分の凝集進行活性によって減じら れ、その結果効力が制限される。

従って、これらの従来の化合物に伴う欠点が無くなった抗血小板剤が、さらに必 要とされている。理想的には、この抗血小板剤は、血小板活性化の全ての機構を 等しく効果的に阻害し、さらにその効力は、従来の抗血小板剤に用いられる投与 量に比べて比較的低い投与量で効果的に投与し得る程であるべきである。

及朋１」Ｌ巨 本発明は、Ａ　ｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　、　１ｓｃｉｖｏｒｕｓの毒から血小板活 性化阻害ポリペプチドおよびその誘導体を精製する方法を提供することにより、 上記の問題を解決する。本発明はさらに、この血小板凝集阻害ポリペプチドコー ドするＤＮＡ配列単独で特徴付けられる、または従来の抗トロンビンポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列と融合した組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明はさ らに、これらの組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主、およびこれらの宿主に より発現される組換え産物にも関する。本発明はさらに、化学的に合成された血 小板阻害ポリペプチドにも関する。

本発明はさらに、医薬として許容される組成物および組合せ、ならびにこれらの 天然のまたは、組換えのまたは合成の抗血小板ポリペプチドを患者および体外血 液の処置に使用する方法に関する。

本発明の組合せは、ヒルジンまたはヒルジン誘導体のような他の従来の抗トロン ビン化合物の追加によって、さらに特徴付けられる。これらの、他の抗トロンビ ン化合物は、別々の分子で存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により本発明 の血小板活性化阻害ポリペプチドに結合または融合して存在する。

以下の開示から理解されるように、本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドは、 これまで製造された阻害剤のなかで最も有用な化合物である。これらは種々の機 構によって生じる血小板凝集および血小板放出を、減少し阻害するのに有効であ る。本発明の抗血小板ポリペプチドの多様な効力は、患者または体外血液中の望 ましくない血小板凝集の性質を処理前に評価する必要の無い点で、特に有利であ る。この結果、多くの診断に伴う元来の遅延なしに、治療法を設定することが可 能となる。さらに、本発明のポリペプチドの、血小板遊離を阻害するという独特 の性質は、効力の点で有意な利点を提供する。血小板の遊離は阻害し得ない従来 用いられてきた薬剤の効力は、血小板から遊離された因子によってしばしば中和 される。さらに、本発明のポリペプチドは、強力な血管収縮剤であるトロンボキ サンＡ２の遊離を阻害するため、血小板の活性化または血栓症の部位での痙縮お よび狭窄をブロックする独特の能力を有する。組換えＤＮＡ分子、それにより形 質転換された宿主およびそれから発現される産物は、本発明に従う血小板凝集阻 害ポリペプチドを商業的な量で、安価に迅速に単離することを可能にする。

旦よヱリ１里透」１医 図１は、セファデックスＧ−５０カラムで分画した■■■匹並二二」江阻江江皿 毒試料のクロマトグラムを示す。

図２は、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムで分画した本発明の血小板活性化 阻害ペプチドの部分精製試料のクロマトグラムを示す。

図３は、本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドの還元型および非還元型の各々 の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す。

図４は、コラーゲン、トロンビンおよびＡＤＰによる血小板凝集作用に対する本 発明の血小板活性化阻害ポリペプチドの種々の濃度における阻害効果を示す。

図５は、トロンビンＵ４８６１９により誘発される血小板凝集および血小板ＡＴ Ｐ放出に対する本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドの阻害効果を示す。

図６は、コラーゲンにより誘発される血小板凝集およびトロンボキサンＢ２（Ｔ ＸＢ２）として測定したトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）遊離に対する本発明の 血小板活性化阻害ポリペプチドの種々の濃度における阻害効果を示す。

図７は、ＡＤＰの存在下または非存在下における、＋２５■標識された本発明の 血小板活性化阻害ポリペプチドの血小板に対する結合の速度を示す。

図８は、トロンビン誘発血小板Ｍ渠に対する本発明の血小板活性化阻害ポリペプ チド、ヒルジン誘導体スルホＴＹｒｅ３ヒルジン５３−６４およびこれらの組合 せの阻害効果を示す。

図９は、本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドをコードする合成遺伝子のヌク レオチド配列を示す。

図１０は、本発明の血小板凝集阻害ポリペプチドをコードする完全な遺伝子の構 築に使用される１４個の合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ示す。

図１１は、ｐＮＮｏ３のポリリンカー領域のヌクレオチド配列を示す。

図１２は、ｐＮＮｏ　３の制限酵素地図を示す。

図１３は、ＰＬ−ｍｕ−ｓｍｃ’・ｔＲのヌクレオチド配列を示す。

図１４は、天然型および組換え型の本発明に従う血小板活性化阻害ポリペプチド の、コラーゲン誘発血小板凝集に対する阻害効果を示す。

及児旦１皿呈五皿 本明細書および請求の範囲を通じて、用語「血小板活性化阻害ポリペプチド」お よび「抗血小板ポリペプチド」は、交換可能に用いられ、血小板凝集および血小 板遊離反応の両者を阻害するポリペプチドのことを言う。

本発明は、ヘビ毒由来の血小板活性化阻害ポリペプチドおよびその誘導体を精製 する方法に関する。詳細には、そのヘビ毒はアメリカヌママムシ（Ａ　ｋｉｓｔ ｒｏｄｏｎ　、１ｓｃｉｖｏｒｕｓ）から得られる。この毒は生きたヘビから直 接絞り取り、または、より好ましくは市販の凍結乾燥標品として得られる。

ヘビ毒が得られたら、水性緩衝液中に溶解または希釈する。

約ｐＨ２〜１０の間で緩衝能のある任意の水性緩衝液が使用可能である。これら の緩衝液は当該技術分野で周知である。

最も好ましくは、緩衝液は約ｐＨ７，４のトリス−ＭＣＩである。選択された緩 衝液はさらに塩、好ましくはＮａＣ１を、約０．ＯＯＩＭから１．０Ｍの間の濃 度で含有してもよい。

さらに、ヘビ毒中に天然に存在するプロテアーゼにより目的のポリペプチドが分 解されるのを防ぐため、緩衝液は１または組み合わせたプロテアーゼ阻害剤を含 有することが望ましい。プロテアーゼ阻害剤は、多くの周知の化合物から任意に 選択され得る。この中には、これらに制限されないが、ＰＭＳＦＳ　ロイペプチ ン、大豆トリプシン阻害剤、ペプスタチン、ＥＤＴＡＳ　ＥＧＴＡおよびＤＦＰ が包含される。

溶解の後、溶解しない物質をクロマトグラフィーの前に取り除く必要がある。こ れは濾過または最も好ましくは遠心分離により行われる。次に、残った溶解性物 質は、分子量分離手段により、異なる分子量を有する他の分子から分画分離され る。当技術分野で知られた多数の分子！分離手段のすべてが、本発明のこの方法 に使用され得る。好ましくは、分子量分離はゲルクロマトグラフィーにより行わ れる。ゲルクロマトグラフィーに使用される樹脂は、約１８０　’ＯＯダルトン のポリペプチドが含有体積内に溶離するように選択されなければならない。好ま しい樹脂は、例えばセファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−５０、バイオ ゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０およびセファシル５−Ｚｏｏである。最も好 ましくは、セファデックスＧ−５０である。どの樹脂を使用する場合も、クロマ トグラフィーの前に、ヘビ毒の溶解に用いたのと同一の緩衝液（但し、プロテア ーゼ阻害剤を含まないもの）で樹脂を平衡化する必要がある。クロマトグラフィ ーの間にも同じ緩衝液を用いる必要がある。

クロマトグラフィー樹脂を通る溶液の流量および集められる画分の大きさは、最 小時間内に最大の分離効率が得られるように調節される。これらの調節は当分野 の当業者に周知である。

血小板活性化阻害ポリペプチドを含む分画は、生物学的活性または特異的な抗体 による反応によって確認され得る。この目的のために、多くの周知のアッセイが 任意に使用され得る。これらのアッセイには、限定されないが、ＥＬＩＳＡ。

ラジオイムノアッセイ、血小板の凝集または放出の阻害、血小板への結合および 血小板へのリガンド結合との拮抗が包含される。画分が過剰時間にわたる貯蔵の ために分解されるのを防ぐため、アッセイは短時間で行われ得るものであること が好ましい。好ましいアッセイは、ヒト血小板試料でコラーゲン誘発性の血小板 凝集の阻害を測定する。最も好ましい７ノセイは、Ｂｉｏ−Ｄａｔａ　４−ｃｈ ａｎｎｅｌ　Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ　（Ｈａｔｂｏｒｏ社製、Ｐｅｎｎ５ｙ ｌｖａｎｉａ）のような自動アッセイ系を使用するアッセイである。

いったん同定した後、抗血小板活性を含む画分をプールする。画分の終了点は、 当業者に知られた要因の均衡に基づき選択される。これらの要因は、プール中の 活性量を最大にすること、一方不純タンパク質の混入量を最小にすることを含む 。次いで、プールされた国分をイオン交換樹脂に接触させる。これはバッチ方法 で、または、より好ましくはカラムクロマトグラフィーにより行われる。本発明 の精製方法には任意のアニオン性またはカチオン***換樹脂が用いられ得るが、 カチオン性樹脂が好ましい。特定のカチオン性樹脂は、コスト、結合能力、流量 および当業者に知られた他の要因に基づき選択される。本発明の方法に使用され 得るカチオン性樹脂の例には、ＣＭ−５２、ＣＭ−セファロース、ＣＭ−セファ デックス、Ｓ−セファデックスおよびＳ−セファロースカ包含される。本発明の 好ましい実施態様に従えば、使用されるカチオン性樹脂はＳ−セファロース（高 速）である。

どの樹脂を使用する場合にも、抗血小板ポリペプチド含有試料に接触させる前に 、樹脂を適当な緩衝液で平衡化する必要がある。選択される緩衝液は、間に緩衝 液を交換する工程が入るのを避けるために、先のゲルクロマトグラフィ一工程に 使用した緩衝液と同一の物が好ましい。精製方法の速度と経済性を最大にするた め、樹脂には、これらの初期緩衝液の条件下で抗血小板ポリペプチドが結合しな いものが選ばれる。

このようにして、不純ペプチド、特にホスホリパーゼＡ２が目的の抗血小板ポリ ペプチドから吸着除去される。イオン交換工程からの非結合画分をプールし、後 に使用されるまで約４°Ｃで貯蔵され得る。クロマトグラフィ一工程の順序（即 ち、分子量分離の後にイオン交換をすること、またはその反対）は逆にし得るこ とは、当該技術分野で自明である。従って、本発明のもう一つの実施態様におい ては、分子量分離の前にイオン交換を用いる。

本発明の方法に従った精製の最終工程は、逆相ＨＰＬＣである。様々な逆相ＨＰ ＬＣ樹脂がこの工程に使用し得る。これらには、ジシリル、テトラシリル、オク タシリルおよびオクタデシルシリル支持体が含まれる。最も好ましい樹脂はテト ラシリルである。この工程に使用される緩衝剤系は、０゜１％トリフルオロ酢酸 （ＴＦＡ）中のアセトニトリルが増加する直線濃度勾配からなることが好ましい 。しかし、この工程で残存する不純物を除き、抗血小板ポリペプチドを効果的に 精製する緩衝剤系であれば、任意のものが使用され得る。

これらの代替の緩衝液系は当該分野で周知である。カラムからの溶出物を、吸光 度２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで連続的にモニターする。ピークの吸光度を示す 画分をエバポレートし、上記の抗血小板ポリペプチドのアッセイを行う前に水に 再溶解した。

我々は、北アメリカヌママムシから単離された血小板活性化阻害ポリペプチドに 構造および生物学的活性が類似するポリペプチド、は、他のアメリカ産ヘビの毒 液にも存在すると考える。従って、本発明の精製方法はこれらの他のポリペプチ ドにも適用される。

さらに、本発明の精製方法は、北アメリカヌママムシまたは他のアメリカ産ヘビ のいずれかに由来する元のポリペプチドの生物学的活性を保持する、抗血小板ポ リペプチドのタンパク質分解断片を単離するためにも有用である（特に実施例１ を参照）。このようなタンパク質分解断片は天然に、または精製過程の結果とし て人工的に生じ得る。

本発明はさらに、上記過程で精製された血小板活性化阻害ポリペプチド、および それらの医薬として許容される組成物への使用、および血小板の凝集と遊離反応 を減少または防止する方法に関する。

本発明はさらに、ｍ換えによりおよび合成により製造された血小板活性化阻害ポ リペプチド、およびそれらの医薬として許容される組成物、組合せへの使用、お よび血小板の凝集と遊離反応を減少しまたは防止する方法に関する。

本発明の一つの実施態様に従えば、任意の上記組成物および方法が、患者または 体外血液の処置に有用である。本出願で使用される用語「体外の血液」には、透 析手順または血液濾過または手術中の血液バイパスのような過程におけるような 患者から線でつないで取出し、体外での処理を行い、そして患者に戻される血液 が含まれる。この用語にはさらに、最終的には患者に投与するための体外に貯蔵 される血液産物が含まれる。このような血液産物には、全血、血小板濃縮物およ び血小板凝集と血小板遊離の阻害が望まれる任意の他の血液分画が含まれる。本 願で使用される用語「患者」は、任意の哺乳類、特にヒトを意味する。

他の実施態様に従えば、本発明は、血小板の凝集および遊離を減少しまたは防止 するための組合せ、およびそれらを使１１　用する方法に関する。これらの組合 せには、本発明の天然から精製された、または組換えの、または合成の血小板活 性化阻害ポリペプチドに加えて、様々な他の従来の抗血小板また「　は抗トロン ビン化合物が含まれ得る。好ましい抗トロンビンゴ　化合物はヒルジン誘導体で ある。本願の目的のため、用語「ヒルジン誘導体」はヒルジンのアミノ酸配列の 任意の断片に１００％相同なアミノ酸配列を有し、抗トロンビン活性を示す任意 のペプチドを意味する。ヒルジンのＴ　Ｖ　ｒ　８３に対応スるチロシン残基を 含むヒルジン誘導体は、このチロシンが負の電荷をもつ置換基を含むように随意 改変され得る。負の電荷を有する置換基は、ペプチド化学の分野で周知のものの なかから選択され得る。改変されたおよび改変されないヒルジン誘導体の例は、 欧州特許出願公開第３３３，３５６号およびＪ、Ｍ、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら、 −Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ 　Ｈｉｒｕｄｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　 ２６４．　ｐｐ、　８６９２−９８　（１９８９）に記載されており、これらは ここに参考文献として援用されている。この用語には、さらに全長ヒルジンが含 まれる。最も好ましいヒルジン誘導体は全長ヒルジン、スルホ−ＴＶｒａｓヒル ジン５３−８４およびスルホニル−Ｔ７ｒｓｓヒルシフ　５３−ａａ＠である。

（＊スルホーＴＹｒｅｉヒルシフ５３−６７はヒルジンのＣ末端ドデカペプチド であり、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−１１ｅ−Ｐｒ ｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ１　ｕ−Ｔｙ　ｒ　（Ｏ３Ｏ３）　−Ｌ　ｅ　ｕのアミノ酸配 列を有する。

スルホニル−ＴＹｒｅａヒルジン５３−８４はヒルジンのＣ末端ドデカペプチド であり、式Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ１　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｉ　１　ｅ −Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｔｙｒ　（ＳＯｓ）−Ｌｅｕを有する。これら のペプチドは欧州特許出願公開第３３３，３５６号に記載され、この開示内容は ここに援用される。これらの同化合物の合成は従来の方法により行われ得る。） 本願で使用される用語「組合せ」は、一つの調剤の形を意味し、この意味におい て本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドは、従来の血小板阻害ポリペプチドま たは従来の抗トロンビンポリペプチドと化学的に結合され得る。あるいはこの用 語は、血小板活性化阻害ポリペプチドと他あポリペプチドとを同−組成物内に別 々の成分として含有する、一つの調剤の形を意味する。あるいは用語「組合せ」 は多数に分けられた調剤の形を意味し、この意味において血小板活性化阻害ポリ ペプチドと他のポリペプチドとは別々に、しかし同時に投与されるか、または２ つの薬剤を連続的に投与される。

血小板活性化阻害ポリペプチドと、ヒルジン誘導体のような従来の抗トロンビン ポリペプチドとの架橋は、当技術分野で周知の化学的架構方法により行われ得る 。最も好ましくは、このような組合せは、天然型または組換え型の血小板活性化 阻害ポリペプチドと合成のヒルジン誘導体とを架橋することにより形成される。

このような組合せを得るために、ヒルジン誘導体は、ジニトロフルオロベンゼン のような架橋部分をそのＮＨ２末端に有するように合成され得る。あるいは、ヒ ルジン誘導体は、グルタルアルデヒド、ジメチルアジビミデートまたは当技術分 野で知られた任意の他の二官能基性架橋剤を用いて、天然型または組換え型の血 小板活性化阻害ポリペプチドに結合され得る。組合せは、化学量論上ｌ：ｌ、ま たはより大きな比率で組換えポリペプチドに対するヒルジン誘導体を含み得る。

本発明は合成の血小板活性化阻害ポリペプチドに関する。

このような合成抗血小板ポリペプチドは、例えば固形支持体上での合成のような 従来の化学合成法で調製され得る。

本発明はさらに、血小板活性化阻害ポリペプチドをコードする組換えまたは合成 のＤＮＡ分子にも関する゛。これらのＤＮＡ分子は当技術分野でよく知られた方 法により合成され得る。例えば、これらの組換えＤＮＡ分子はＡ　ｋｉｓｔｒｏ ｄｏｎ　、ｆｓｃｉｖｏｒｕｓの毒液線ｃＤＮＡライブラリーから単離され得る 。

ｃ　ＤＮＡライブラリーの合成およびｃＤＮＡ分子をクローンし得るベクターの 選択は、従来の技術により行われる（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、−Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−、Ｃｏ ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（１９８２））。

様々な方法が、本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドに対応するｃＤＮＡ配列 の位置決定および同定に使用され得る。

２つの最も好ましい技術は、抗血小板ポリペプチドのアミノ酸配列に基づくオリ ゴヌクレオチドプローブの使用および免疫スクリーニングである。免疫スクリー ニングでは、抗血小板ポリペプチドに対する抗体を使用して抗血小板ポリペプチ ドに対応するｃＤＮＡ配列を発現するクローンが検出される。

オリゴヌクレオチドプローブは、重複が最も少ないＤＮＡ配列にコードされるア ミノ酸配列に基づき選択されることは、当業者に自明である。免疫スクリーニン グ法では、発現し得るベクターにｃＤＮＡライブラリーが含まれることが必要と なる。

（以下余白） このようなベクターにはλｇｔｌＬ　λｇｔｌｏおよび当技術分野で知られた他 の発現ベクターが含まれる。免疫スクリーニング法で使用される抗体には、完全 な血小板活性化阻害ポリペプチド対する抗体、変性した血小板活性化阻害ポリペ プチドに対する抗体、および血小板活性化阻害ポリペプチドの部分ペプチドに対 する抗体が含まれる。抗血小板ポリペプチドのｃＤＮＡが同定され単離されたら 、これをベクターから取り出し、抗血小板ポリペプチドをコードする完全な配列 を含むかどうかを分析し決定する。部分ｃＤＮＡはそれ自体ｃＤＮＡライブラリ ーを再プローブするために、および全長ｃＤＮＡの位置決定のために用いられ得 る。

より好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化 学的手段により、オリゴヌクレオチドから合成され得る。このようなオリゴヌク レオチドは、開示されている抗血小板ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき設計 され得る。

血小板活性化阻害ポリペプチドをコードする遺伝子の合成には、標準の方法が適 用され得る。例えば、完全なアミノ酸配列が、バック翻訳された遺伝子の構築に 使用され得る。所望の血小板活性化阻害ポリペプチドをコードし得るヌクレオチ ド配列を含有するＤＮＡオリゴマーは単一の工程で合成され得る。あるいは、抗 血小板ポリペプチドの一部をコードする幾つかの小さなオリゴヌクレオチドを合 成し、次いでこれらを結合することもできる。好ましくは抗血小板ポリペプチド 遺伝子は１０〜２０個の別々のオリゴヌクレオチドとして合成され、次いでこれ らが互いに結合される。個々のオリゴヌクレオチドは相捕的な会合のための５′ または３′突出部を有する。

オリゴマーの合成および所望のベクターの切断の後、抗血小板ポリペプチド遺伝 子の組立てが、当技術分野でよく知られた方法の１またはそれ以上の工程により 行われ得る。組立ての後、その遺伝子は制限エンドヌクレアーゼに認識される配 列によって特徴付けられる。このなかには、クローニングマタハ発現ベクターに 直接組み入れられるための特有の制限部位、使用される宿主発現系に基づ（優先 的なコドン、および転写された時に二次構造を最小限にするｍ　ＲＮ　Ａを産生 ずる配列が含まれる。適当な組立てはヌクレオチド配列決定、制限酵素地図の作 成、および適当な宿主内での生物学的に活性な抗血小板ポリペプチドの発現によ り確認され得る。

遺伝子フードの重複のため、多くの異なる合成りＮＡが本発明の血小板活性化阻 害ポリペプチドをコード可能であることが当業者に理解される。多くのこれらの ＤＮＡが、それらで形質転換された宿主内で忠実に発現されることも明かである 。従って本発明は、目的の抗血小板ポリペプチドをコードし、それらで形質転換 されたｌあるいはそれ以上の宿主で発現し得る、１つだけでなく全てのＤＮＡ分 子に関する。これらのＤＮＡ分子のほとんどは、中程度に緊縮な条件下で互いに ハイブリダイズ可能である。これらの条件は当業者に知られており、例えば４２ ℃のｌＸ５ＳＣの後、５８℃の０．　１Ｘ〜１×ｓｓｃのような幾分高い温度で 洗浄する。

他の実施態様に従えば、本発明の組換えＤＮＡ分子は、血小板活性化阻害ポリペ プチドと従来の抗トロンビンポリペプチド、好ましくはヒルジン誘導体とを含む 新規な融合タンパク質をコードする。ヒルジンをコードするＤＮＡ配列は知られ ており、様々な従来法により得ることができる（　Ｃ，Ｂｅｒｇｍａｎｎら、− Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ 　ａ　Ｇｅｎｅ　Ｃａｄｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｈｉｒｕｄｉｎ、　ｔｈｅ　Ｔｈｒｏ ｍｂｉｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｌｅｅ ｃｈ　Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ−、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、Ｈｏ　 ｅ−Ｓｅ　Ｉｅｒ、３６７、ｐｐ、７３１−４０　（１９８６）　；　Ｅ、Ｆｏ ｒｔｋａｍｐらどＣｌｏｎｉｎｇａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｆ　ｏｆ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ＤＮＡ　ｆｏｒ 　Ｈｉｒｕｄｉｎ、　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　［ｎｈｉ ｂｉｔｏｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｅｅｃｈ−、ＤＮＡ、　５．　ｐｐ、　５１１− １７　（１９８６））。

血小板活性化阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびヒルジン誘導体をコー ドするＤＮＡが得られるか、または合成されたら、２つのＤＮＡを互いに結合し て単一の融合タンパク質をコードするＤＮＡを製造する。ライゲーションは、血 小板活性化の阻害ポリペプチドをコードするＤＮＡから邪魔されることなく、リ ーディングフレームが続いて、ヒルジン誘導体ＤＮＡに入るように、またはライ ゲージマンによっては、同様にヒルジン誘導体が血小板活性化阻害ポリペプチド をコードするポリペプチドをコードするＤＮＡに入るように行われる必要がある ことを理解しなければならない。従って、２つのＤＮＡ配列は随意、各ＤＮＡの リーディングフレームの完全な状態を破壊することのないリンカ−で橋渡しされ 得る。このようなリンカ−は当技術分野で知られており、さらに１つの制限部位 をコードしていてもよい。適当な融合は、分子生物学の分野でよく知られた方法 を使用して行われる。これらの融合タンパク質は、本発明の医薬として有効な組 成物中に使用され得る。

本発明のＤＮＡ配列および組換えＤＮＡ分子は、様々なベクター内に挿入され、 これらのベクターを用いて発現される。

有用なベクターは、例えば染色体の断片、非染色体のおよび合成のＤＮＡ配列か らなり得る。例えば、ＳＶ４０の種々の知られている誘導体、および細菌のプラ スミド、例えばＣ０ＩＥＩ、ｐｃＲｌ、ｐ　ＢＨ３２２、ｐＭＢ９およびＲＰ４ を含ムＥ、ｃ　ｏ　１　ｉ由来のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばＮＭ９８ ９のようなえファージの多数の誘導体ならびにＭ２Ｓおよび他のＦｉ　１　ａｍ ｅｎｔｏｕｓ一本鎖ＤＮＡ７ｙ−ジのような他のＤＮＡファージ；イーストで有 用なベクター、例えば２μｍプラスミド：動物細胞で有用なベクター、例えばＳ Ｖ４０アデノウィルスを含むものおよびレトロウィルス由来のＤＮＡ配列；およ びプラスミドとファージＤＮＡの結合から誘導されるベクター、例えばファージ ＤＮＡまたは他のその誘導体に使用するために改変されたプラスミドである。

このような発現ベクターはさらに、ベクターに挿入された血小板活性化阻害ポリ ペプチドまたは融合タンパク質のＤＮＡ配列に、作動可能に結合され得る少なく とも１つの発現制御配列により特徴付けられる。ベクターへのこの発現制御配列 の挿入は、クローン化したＤＮＡ配列の発現を制御し調節することを目的とする 。有用な発現制御配列の例には、ｔａｃ系、上二且系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、フ ァージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク賀の 制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーターのような酵母の解糖 プロモーター、Ｐｈｏ５のような酵母酸ホスファターゼのプロモーター、酵母接 合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス およびＳＶ４０の初期および後期プロモーターのようなサルウィルスに由来する プロモーター、ならびに原核または真核細胞およびそれらのウィルスまたはそれ らの組み合せの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列が含まれる 。

このような有用な発現ベクターには、動物およびヒトの細、　Ｊ、　５ｏｕｔｈ ｅｒｎ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　１．　Ｇｅｎｅｔ、 、　１．ｐｐ。

３２７−４１　（１９８２）　；　Ｓ、５ｕｂｒａ＋ｇａｎｉら、Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　旧ｏ１．．　ｌ、ｐｐ、８５４−６４（１９８１）　；　Ｒ，Ｊ、　 Ｋａｕｆｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｐ、　Ａ、　５ｈａｒｐ、　−Ａｉ＋ｐｌｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｃｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａ　Ｍｏｄｕｌａｒ　Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏ ｌａｔａ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　Ｃｏ＋ｍｐｌｅｏ＋ｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡＧｅ ｎｅ”、　Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｂｊｏｌ、、　１５９．　ｐｐ、　６０１−２１　 （１９８２）　；　Ｒ，Ｊ、にａｕｆａ＋ａｎｎ　ａｎｄ　Ｐ、Ａ、５ｈａｒｐ 、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、１５９．　ｐｐ、６０１−６４　（１９ ８２）　；　Ｓ、１．　５ｃａｈｉｌｌら、−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎｄ　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｏｆ　Ａ 　Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｅ　ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＤＮＡ　Ｇｅｎｅ　Ｉｎ　 Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　０ｖａｒｙ　Ｃｅ１ｌｓ−、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．　ｐｐ、４６５４−５９　（１９８３）　； 　Ｇ、Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄＬ、Ａ、Ｃｈａｓｉｎ、Ｆ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７、ｐｐ、４２１６−２０　（１９８０））。

さらに、本発明の血小板活性化阻害ポリペプチドまたは融合タンパク質を含む抗 血小板ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の挿入のため、各特異的な発現ベク ター内で様々な部位が選択され得る。これらの部位は通常、これらを切断する制 限エンドヌクレアーゼによって名付けられる。これらの部位は当業者にはよく認 識されている。もちろん、本発明に有用な発現ベクターは、選択したＤＮＡ断片 の挿入のために制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要はないことが理解され る。その代わり、そのベクターは他の手段により断片に結合され得る。

発現ベクターおよび特に、選択されたＤＮＡ断片の挿入のために上記ベクター中 の選ばれた部位、および上記ベクター中の発現制御配列への上記ＤＮＡの作動可 能な結合は、様々な要因、例えば特定の制限酵素に感受性の部位の数、発現する タンパク質の大きさ、宿主細胞酵素によるタンパク質分解に対する目的のタンパ ク質の感受性、精製の間除去することが困難な、宿主細胞タンパク質による発現 するタンパク質の汚染または結合、ベクター配列に対する開始または終止コドン の位置のような発現特性および当業者に知られている他の要因などによって決定 される。ベクターの選択およびＤＮＡ配列の挿入部位は、これらの要因のバラン スにより決定され、与えられた場合について全ての選択が同様に有効であるわけ ではない。

これらのベクターで形質転換され、本発明のポリペプチドの発現に使用され得る 有用な宿主には、よく知られた原核のおよび真核の宿主、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ 　５Ｇ−９３６、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅ。

ｃｏｌ　ｉ　Ｘ１７７６％　Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　Ｘ２２８２、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ ＩおよびＥ、ｃｏｌｔ　ＭＲＣＩのようなＥ。

ｃｏｌ　ｉｍ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｆｓ のようなりａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母および他の菌類、 ＣＯ８細胞およびＣＨＯ細胞のような動物細胞、ヒト細胞、昆虫細胞ならびに組 織培養物中の植物細胞が含まれ得る。

もちろん、全ての宿主／発現ベクターの組み合せが、本発明のＤＮＡ配列の発現 、あるいは血小板活性化阻害ポリペプチドまたは融合ポリペプチドの産生に対し て同等に効果的に機能するわけではない。しかし、本願に記載の内容をよく考慮 にいれた上で、本発明の範囲を離れることなく、当業者により特定の宿主／発現 ベクターの組み合せが選択され得る。

例えば、選択は様々な要因のバランスに基づき選択される必要がある。この中に は、例えば宿主とベクターとの適合性、ＤＮＡ配列にコードされるタンパク質の 宿主に対する毒性、目的のタンパク質の回収の容易性、ＤＮＡ配列およびそれに 作動可能に結合した発現制御配列の発現特性、生物学的安全性、コスト、ならび に折畳み、フオームまたは目的のタンパク質の、他の任意の発現後修飾が含まれ る。

本発明の抗血小板ポリペプチドの重大な構造上の性質は、二量体フオームである と我々は考える。二量体の各ポリペプチドメンバーは、血小板表面に結合可能な Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を有する。本願で用いられる「結合可能な」の句は 、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｌ）配列が、その血小板表面への結合が立体的に妨害さ れないように位置付けられていることを意味する。我々はまた、これらの構造上 の性質を有する任意のポリペプチドまたはペプチド様分子が血小板の凝集および 遊離を阻害し得ると考える。従って本発明は、組換えポリペプチドに加えて、上 記の構造上の性質を有する他の血小板活性化阻害剤にも関する。

これらの他の血小板活性化阻害剤は、元の抗血小板ポリペプチドの欠失またはア ミノ酸修飾を有するポリペプチドであり得る。これらは、ＤＮＡレベルでの適切 な構築、ポリペプチドレベルでの直接の合成、あるいは元のポリペプチドの化学 的または酵素的な反応により製造され得る。あるいは、これらの他の血小板活性 化阻害剤は、ペプチド様であり得るか、あるいは標準的な有機化学的手法により 合成され得る。これらの化合物は全て有効な抗血小板剤である。これらの代替分 子の合成は、抗血小板化合物の商業的に実行可能な量の製造を可能にする。さら に、これらの代替抗血小板化合物は所望の生物学的活性を促進するようなやり方 で設計され得る。

本発明の医薬として許容され得る組成物および結合物は、好ましくは少なくとも １つ以上の医薬として許容し得る担体を含む。さらに、本発明の医薬として許容 し得る組成物および結合物は、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水のような医薬と して許容し得る緩衝剤を、塩化ナトリウム、マンニトールまたはソルビトールの ような医薬として許容され得る浸透圧調製用化合物と共に含有する。

このような組成物を、経口、非経口および局所投与のために適当に調節し、非経 口用組成物が最も好ましい。局所投与のために処方された組成物は、例えば水性 ゼリー、油性懸濁液または乳化性軟膏の形態であり得る。非経口投与のために、 本発明の組成物または結合物および滅菌ビヒクルを含有する液体投与単位形態が 調製され得る。医薬として許容され得る組成物または結合物に含まれるポリペプ チドは、使朋するビヒクルの性質に依存して懸濁または溶解され得る。非経口用 組成物は通常ビヒクル中にポリペプチドを、随意に他の成分と共に溶解すること により調製され、適当なバイアルまたはアンプルに入れる前に濾過滅菌し、封を する。好ましくは、局所麻酔薬、保存剤および緩衝薬剤のような補助薬がビヒク ル中に溶解され得る。次に組成物は、安定性を増すために凍結および凍結乾燥さ れる。　゛ 非経口用懸濁液は、ポリペプチドをビヒクルに溶解するのではなく懸濁すること 以外は、実質的に同一の方法で調製される。ポリペプチドおよび他の随意加える 成分の滅菌は、好ましくは滅菌ビヒクル中に懸濁する前に酸化エチレンに曝すこ とにより行われる。有利には、ポリペプチドと任意の他の随意に加える成分の均 一な分散を促進するため、組成物中には医薬として許容され得る界面活性剤また は湿潤剤が含まれ得る。

経口投与のための錠剤およびカプセルは、結合剤、賦形剤、希釈剤、製錠剤、潤 滑剤、崩壊剤、着色剤、着香剤および湿潤剤のような通常の賦形剤を含有し得る 。錠剤は当技術分野でよく知られた方法に従いコートされ得る。

使用のために好適な賦形剤には、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび 他の同様の薬剤が包含さ゛れる。好適な崩壊剤には、これに制限されないが、で んぷん、ポリビニルピロリドンおよびでんぷんグリコール酸ナトリウムのような でんぷん誘導体が包含される。好適な潤滑剤には、例えばステアリン酸マグネシ ウムが包含される。有用で好適な湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが包含さ れる。

経口用液体調製物は、水性または油性懸濁液、溶液、乳化物、シロ、ブまたはエ リキシルであり得、使用前に水または他の適当なビヒクルに再溶解させるための 乾燥生成物として調製され得る。このような液体調製物は通常の添加物を含有し 得る。これらには、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒ ドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミ ニウムゲルまたは水素添加食用油脂のような懸濁剤：レシチン、モノオレイン酸 ソルビタンまたはアカシアを含む乳化剤；アーモンド油、分画コフナノツ油およ び油性エステルのような非水性ビヒクル；メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシ 安息香酸またはソルビン酸のような保存剤が含まれる。

天然型、組換え型または合成の血小板活性化阻害ポリペプチドの注射による投与 のための治療量は、通常的０．０１〜１００　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の範囲の 投与量であり、好ましくは約０．１〜５０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重である。体 外血液の処置のためには、本発明の抗血小板ポリペプチドは、体外血液に対し約 ０．０５〜１０μｇ　／　ｍ　１で用いられ、好ましくは約０．５〜５μｇ　／ 　ｍ　１で用いられる必要がある。本発明に従う有効な結合物は、約０．０１〜 １００ｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは約０．　１〜５０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ 体重の天然型、組換え型または合成の血小板活性化阻害ポリペプチド、および約 ｏ、。

１〜１０　ｏｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの従来 の抗血小板または抗トロンビン剤を含有スる。本発明の結合物を使用する体外血 液の処理には、血小板活性化阻害ポリペプチドおよび従来の抗血小板または抗ト ロンビン剤の両者が、体外血液に対し約０．０５〜ｌＯμｇ／ｍ１、好ましくは 約０．５〜５μｇ　／　ｍ　１で使用されなげればならない。上記に示した範囲 外の他の投与利用が本発明の医薬組成物および結合物に使用され得ることが理解 されなければならない。

本発明の他の実施態様に従って、本発明の天然型、組換え型または合成の血小板 活性化阻害ポリペプチドは組成物および挿入装置の表面をコートする方法に処方 され、その結果このような装置を入れた患者における血小板活性化の危険性が低 くなる。あるいは、本発明の抗血小板ポリペプチドおよび従来の抗トロンビン剤 を含む結合物も使用され得る。本発明の方法、結合物および組成物に従いコート され得る表面の例は、人工器官、人工弁、血管移植片、ステントおよびカテーテ ルの表面である。これらの装置をコートする方法および組成物は当業者に知られ ている。この中には、抗血小板ポリペプチド含有組成物の装置表面への化学的架 橋または生理的吸着が含まれる。

Ａｒ　ｚ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ含有ペプチドおよびポリペプチドがフィブロ ネクチンおよびビトロネクチンのような細胞マトリックスタンパク質に対する腫 瘍細胞の結合を阻害する能力は、既に示されている（　Ｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍｐｈ ｒｉｅｓら、　−１ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉ。

ｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｆｃａｌ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｎｔｉ− Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｖｅ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｔｈａ ｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｏｆ Ｂ１６−ＦＩＯＭｕｒｉｎｅ　Ｍｙｅｌｏｏ＋ａ　Ｃｅ１ｌｓ−、Ｊ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１．ｐｐ、７８２　（１９１１８））。さらにトリ グラミンが、フィブロネクチンマトリックスに対するヒトメラノーマ細胞の付着 を阻害することが示されている（　Ｌ　Ａ、　Ｘｎｕｄｓｅｎら、　−Ｔｒｉｇ ｒａｍｉｎ、　Ａｎ　ＲＧＤ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｐｅｐｔｅｄｅ　ｆｒｏ ｍ　５ｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍ、Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ＣＣｅ１１−５ｕｂｓｔｒａ ｔｕ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｌａｎｏｍａ　Ｃｅ１ｌｓ− 、Ｅｘ　、Ｃｅ１１．−匠、　１７９．　ｐｐ、　４２−４９　（１９８８）　 ”）。本願に記載のように、本発明の抗血小板ポリペプチドはＡｒ　ｇ−Ｇ　１ 　ｙ−Ａ　ｓ　ｐ配列を含有する。従って、これもまた、細胞外マトリ、ｙクス に対する癌細胞の結合を阻害する。このように、本発明の他の実施態様は、細胞 外マトリックスに対する癌細胞の結合を阻害する組成物および方法に関する。こ れらの組成物および方法には、本発明に従う天然型、組換え型または合成の血小 板活性化阻害ポリペプチドが使用される。このような組成物および方法は、癌の 有効な治療的処置を提供する。

本発明がさらに充分に理解されるために、以下に実施例を述べる。これらの実施 例は説明の目的のためのみのものであり、いかなる場合も本発明を限定すると解 釈されるべきではないことが理解されねばならない。

１血且よ ハ　活　ポリペプチドの 江■…二迦工ｌ」江鋭江旺旦由来の凍結乾燥毒素（Ｍｊａｍｉ　Ｓｅｒｐｅｎｔ ａｒｉｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、５ａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃ１ｔｙ、Ｕｔ ａｈ）を、室温で、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　ＰＭＳＦを含有する１０ｍ １の０．０２５Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５に０．５ｇ溶解した。次に毒素溶 液を３．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離し不溶性物質を取り除いた。次いで上 溝を、予め１ｍＭＥＤＴＡを含む０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ５　ｐＨ７，５で 平衡化したセファデックスＱ　−５０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓ ｓ。

ｕｒｉ）のカラム（２，５ｃｍｘ９０ｃｍ）にかけた。５ｍｌずつの分画を果め た。２８０ｎｍの吸光度を測定することにより、分画のタンパク質含有量をアッ セイした。さらに、各分画の一部について、製造元の指示に従い、Ｂｉｏｃｉａ ｔａ４−ｃｈａｎｎｅｌ　Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒで、新鮮なヒト富血小板血 漿（０，５ｍ１）およびフラーゲン（ｌＡｔｇ／　ｍ　ｌ　）を用いて抗血小板 活性をアッセイした。図１はセフ１デックスＧ−５０からのクロマトグラフ溶離 パターンを示す。この工程で、抗血小板ポリペプチドと共にホスホリパーゼＡ２ も共に溶離することが知られている（Ｊ、　Ｍ、　Ｍａｒａｇａｎｏｒｅら、” Ａ　Ｎｅｗ　Ｃ１ａｓｓ　ｏｆ　Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅｓ　Ａ２　Ｗｉｔ ｈ　Ｌｙｓｉｎｅ　ｉｎ　Ｐｌａｃｅ　ｏｆ　Ａｓｐａｒｔａｔｅ　４’Ｊ”、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９．　ｐｐ、１３８３９−４３（１９ｇ４ ））。

抗血小板活性を含む分画をプールし、次に高速Ｓ−セファロース（Ｓｉｇｍａ） の７５ｍ１カラムにかけた。Ｓ−セファロースカラムは予めＱ、０２５Ｍ）リス −ＭＣＩ、ｐＨ７，５で平衡化していた。セファデックスＧ−５０からのプール を陽イオン交換樹脂にかけた後、溶離液の２８０ｎｍでの吸光度が一定になるま でカラムを平衡化緩衝液で洗浄した。溶離液は抗血小板活性を含んでいた。この 陽イオン交換工程は、ホスホリパーゼＡ２のような混入タンパク質を吸着除去す ることにより精製を進める。もし必要ならば、次に使用するまで４℃で溶離液を 保存する。

最終の精製工程として、Ｓ−セファロース溶離液の０．　５ｍｌを０．４６ｃｍ ｘ２５ｃｍのＶｙｄａｃ　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムにかけた。ＨＰＬＣは、Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉ。

ｓｙｓｔｅｍｓ　１５０Ａ液体クロマトグラフシステム（Ｆｏｓｔａｒ　Ｃ１ｔ ｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行ったｏｃ４カラムは０．　１％ＴＦＡ 水溶液で予め平衡化した。カラムを０．　１％ＴＦＡ中のアセトニトリル増加の 直線濃度勾配（０〜３０％）で、流速１．０ｍｌ／分で６０分間、展開した。溶 離液を２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターした。０．５ｍｌずつ分画を集め 、５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ装置（Ｓａｖａｎｔ　：　Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、　Ｎｅ ｖ　Ｙｏｒｋ）で乾燥させ、それぞれ０．１ｍｌの水に再溶解した。

次に分画を、前記のように抗血小板活性について試験した。

１２％アセトニトリルで最大のよく分離されたピークを見つけ、ここに抗血小板 活性が含まれていた（図２、ピークＡ）。

このピークは完全な精製血小板活性化阻害ポリペプチドに相当した。我々はより 小さなマイナーピークも見いだし、ここにも抗血小板活性が含まれていた（図２ 、ピークＢ）。後者のピークは前者のピークの４１個のＮＨ２末端アミノ酸と同 一のアミノ酸を含んでいることが見いだされた。この後者のピークは抗血小板ポ リペプチドのＣ末端がタンパク質分解された形を表していると考えられる。この 方法による完全な抗血小板ポリペプチドの精製収率は、毒素１ｇ当り３ｍｇのポ リペプチドであった。

宜３１エ バ　活性北限　ポリペプチドの　浩に　する研六実施例１で調製された精製血小 板活性化阻害ポリペプチドについて、還元および非還元の両条件下でＳＤＳポリ アクリルアミドゲル電気泳動を行った（図３）。より詳細には、βメルカプトエ タノールの存在下または非存在下で１９％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用 いてタンパク質を電気泳動し、クーマシーブルー染色によりタンパク質を可視化 した。

非還元条件下では抗血小板ポリペプチドは見かけの分子量１８．０００ダルトン に移動した。還元剤の存在下では、抗血小板ポリペプチドは見かけの分子量９， ０００ダルトンに移動することが判った。このデータは、血小板活性化阻害ポリ ペプチドが天然には二量体として存在することを示す。ポリペプチドはクーマシ ーブルーで弱くしか染色されず、適度に可視化するためには少なくとも１０〜２ ０μｇの量を必要としたことに注意する必要がある。

抗血小板ポリペプチドのアミノ酸分析を行った。初めにタンパク質を６Ｎ　ＨＣ ｌ中で、１１０℃で２４時間、真空下で加水分解した。次に、ベックマンシステ ム６３００アミノ酸分析機（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用 いて加水分解物をイオン交換クロマトグラフィーで分析し、カラム後ニンヒドリ ン誘導体化を行った。アミノ酸分析により、システィン（２１゜１％）およびプ ロリン（９，２％）を高度に含有することが示された。我々は、抗血小板ポリペ プチド分子中にトリプトファンが全くないことにも気付いた。アミノ酸分析の結 果とＡｓｐ　Ｌ３．コ　Ｔｈｒ　２．２　ｓｅｒ　１．７Ｇｌｕ　９．９　Ｇｌ ｙ　工０．９　人１ａ　９．０Ｃｙｓ　２１．Ｉ　Ｖａｌ　２．７　Ｍａｔ　Ｏ ，９工１ａ　１．２　Ｌｅｕ　２．６　Ｐｒｏ　９．２′Ｉ′ｙｒ　１．１　ｐ ｈａ　２．５　Ｈｉｓ　１．４ＬＹＳ　３．Ｓ　Ｔｒｐ会　０．ＯＡｒｇ　６． ４★ＵＶスペクトル分析による２８０ｎｍの吸収がないことより決定した。

アミノ酸配列を決定する前に、完全な抗血小板ポリペプチドの一部を、半システ ィンの還元とＳ−ピリジルエチル化により修飾した（ＲＰＥ−抗血小板ポリペプ チド）。詳細には、０．１ｍｇの抗血小板ポリペプチドを０．５ｍｇの０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ５　ｐＨ８，０１６Ｍ塩化グアニジウムおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ で変性させた。この溶液に１５μ工のβ−メルカプトエタノールを加え、穏やか なＮ２気流下、室温で２時間インキュベートした。次にこの溶液に１００μｌの ビニルピリジンを加えた。次いで混合物に蓋をして暗所で３０分間放置した。反 応は１０μｌのβ−メルカプトエタノールを加え停止し、溶液を１０倍量の１％ 酢酸に透析した。透析の後、ＲＰＥ抗血小板ポリペプチドを凍結乾燥し、次に使 用するまで粉末として４℃で保存した。

抗血小板ポリペプチドの他の一部分も、半システィン残基の還元とＳ−カルボキ シメチル化により修飾した（ＲＣＭ抗血小板ポリペプチド）。この反応のため、 ０．１ｍｇの抗血小板ポリペプチドを０．５ｍｇの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ。

ｐＨ８，０，６Ｍ塩化グアニジウムおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解した。残りの 反応工程は標準法で行った（Ｃ，Ｈ，Ｗ、　Ｈｔｒｓ、Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ａ ｎｄ　Ｓ−Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ− 、ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、ＸＩ、　ｐｐ、　１９９− ２０３　（１９６７））。

アミノ末端のアミノ酸配列分析は、モデル９００Ａデータシステムを備えたアブ ライドバイオシステムダ４フ０Ａ気相配列決定機（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、Ｃ ａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、抗血小板ポリペプチドおよびそれに由来するペ プチドの自動エドマン分解により行った。エドマン分解の後、得られたフェニル チオヒダントニン（ＰＴＨ）アミノ酸を、１２０Ａ　ＰＴＨ分析機（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＰＴＨ−Ｃ１８カラム（２゜ＩＸ２２０ｍ ｍ）を用いてオンラインで分析した。ＰＴＨアミノ酸分析機は各配列決定の前に 、製造元が販売する外部標準を用いてキャリプレートした。

無改変の、ＲＣＭ−１およびＲＰＥ−抗血小板ポリペプチドは、すべて、種々の 配列決定分析に使用した。血小板活性化阻害ポリペプチドの完全なアミノ酸配列 は、元の抗血小板ポリペプチドおよびＲＰＥ−抗血小板ポリペプチド、ならびに ＲＣＭ−抗血小板ポリペプチド由来のタンパク質分解ペプチドについてアミノ末 端配列を配列決定することにより決定した。タンパク質分解断片は、ＲＣＭ−抗 血小板ポリペプチドをトリプシン（Ｔ−ＲＣＭ−抗血小板ポリペプチド）または 牛モトリプシン（Ｃ−ＲＣＭ−抗血小板ポリペプチド）のどちらかで分解するこ とにより作成した。

キモトリプシン分解のために、０．２ｍｇのＲＣＭ−抗血小板ポリペプチドを２ ％（Ｗ／Ｗ）のα−キモトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｃｅ、　Ｉｎｄｉａｎａ）を含む５０ｍＭトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７，５に３７℃で４時間溶解した。

得られた断片を、次にＶｙｄａｃオクタデシルシリルカラム（０，４６ｃｍＸ２ ５ｃｍ）上の逆相ＨＰＬＣを用い、２段階の勾配溶離により分離した。最初の段 階は６０分にわたる０〜２８％のアセトニトリルの直線濃度勾配であり、次の段 階は５分にわたる２８〜７０％のアセトニトリル濃度勾配である。アセトニトリ ル溶液には全て０．１％ＴＦＡが含まれ、両段階は１．０ｍｌ／分の流速で行わ れた。溶離液は２１４ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度でモニターした。ピーク分 画を集め、それらを真空下で乾燥した後、これらを上記のようにアミノ酸配列決 定した。

トリプシン分解は、０．２ｍｇのＲＣＭ−抗血小板ポリペプチドを２％（Ｗ／Ｗ ）のトリプシン（Ｂｏｅｈｒｆｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ■）を含む５０ｍＭト リス、ｐＨ７，５に溶解して行った。得られた断片は上記のように同じＣ１８カ ラムを用いて分離した。再び２段階の勾配を用いた。最初の段階は８０分にわた る０〜２８％のアセトニトリル直線濃度勾配であり、次の段階は１０分にわたる ２８〜１００％のアセトニトリル６度勾配である。ピーク分画を集め、ＣＲＣＭ −抗血小板ポリペプチドについて上記のように配列決定した。

アミノ末端配列分析では、血小板活性化阻害ポリペプチドの残基ｌ〜３０が決定 された。ＲＰＥ抗血小板ポリペプチドの７ミノ末端配列決定から残基１〜６２の 直線配列が得られ、これから最初の３０個のアミノ酸が確定した。ＲＣＭ−抗血 小板ポリペプチドのトリプシン断片の１つから、アミノ酸５３〜６８の配列が得 られた。他のトリプシン断片からアミノ酸６９〜７２の配列が得られた。残基５ ９〜７２はＲＣＭ−抗血小板ポリペプチドのキモトリプシンペプチドの分析によ り決定された。

血小板活性化阻害ポリペプチドの決定された全アミノ酸配列は以下の通りである ： 上記のように、アミノ酸配列は以下の一文字コードにより表される： Ｐｈｅ：　Ｆ　Ｌａｕ：　Ｌ　工１ｅ：　咀　Ｍｅｔ：　Ｍ　Ｖａｎ：　ＶＳｅ ｒ：　Ｓ　Ｐｒｏ：　Ｐ　Ｔｈｒ：　Ｔ　Ａｌａ：　Ａ　Ｔｙｒ：　ＹＨｉｓ： 　ＨＧｉｎ：　Ｑ　Ａｓｎ：　Ｎ　Ｌｙｓ：　Ｋ　Ａｓｐ：　ＤＧｌｕ：　Ｅ　 Ｃｙｓ：　ＣＴｒｐ：　Ｗ　Ａｒｇ：　ＲＧｌｙ：　Ｇ元のタンパク質のエルマ ン試薬（Ｇ、　Ｅ、　ＭｅａｎｓおよびＲ，Ｅ、　Ｆｅｅｎｅｙ、−Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ−、Ｈｏ１ｄｅｎ− Ｄａｙ、！ｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ｐ ｐ、１５５−５６　（１９７１）　）との反応から、遊離または接触性のチオー ル基は存在しないことが示された。アミノ酸配列の分析から、親油性アミノ酸が ほとんど無いことが明らかになった。多数のシスティン残基（１２モルのシステ ィン１モル抗血小板ポリペプチド）が、タンパク質が球状構造をとる場合、その 親油性コアに提供されることが可能である。この血小板活性化阻害ポリペプチド は、少な（とも２個のジスルフィド結合によって結合した２つの同一サブユニッ トを含む二量体として天然に存在すると考えられる。　− 支１己主 ハ　の′　および離の 様々な血小板アッセイに使用するのため、健康なヒト提供者から富血小板血漿を 調製した。より詳細には、血液は、２注射器法により２１ゲージのバタフライカ ニユーレで、１７１０ｊｌの３．８％クエン酸三ナトリウム中に集めた。富血小 板血漿は、クエン酸処理した全血を室温で１００Ｘｇで１５分間遠心分離して調 製した。富血小板血漿は約３５７．０００血小板／μｍを含有していた。貧血小 板血漿は、クエン酸処理した全血を１２．ＯＯＯＸｇで２分間遠心分離して調製 した。　血小板凝集は、４チヤンネルの血小板凝集プロフィラー（ＰＡＰ４、Ｂ ｉｏｄａｔａ、　Ｈａｔｂｏｒｏ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）により製造元 の指示に従ってアッセイした。実施例１で調製した抗血小板ポリペプチドによる 血小板凝集の阻害は、様々な量のポリペプチドを攪拌ヒト富血小板血漿に加えて 調べた。詳細には、ポリペプチドを血小板と共に３７℃で１分間インキュベート した後、コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）、ＡＤＰ（１０μＭ）またはヒトα−ト ロンビン（ｏ、４Ｕ／ｍｌ）　を加ｔた。図４は、抗血小板ポリペプチドが、コ ラーゲン、ＡＤＰおよびトロンビンに誘発された血小板凝集を、濃度依存的に阻 害することを示す。

次に、ルミアブリボメーター（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃｏｒｐ、、　Ｈａｖｅｒ ｔ。

ｖｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）を使用し、血小板凝集および付随するＡＴ Ｐ遊離に対する抗血小板ポリペプチドの効果をアッセイした。

この装置は凝集を濁度測定により測定し、同時にＡＴＰ遊離を蛍光で測定する。

このアッセイのため、抗血小板ポリペプチド（６００ｎｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ の富血小板血漿に３７℃で加え、１分後、ヒトα−トロンビン（０，４０／ｍｌ ）またはトロンボキサンＡ２類似物であるＵ４６６１９　（３μＭ）を加えた。

図５は、抗血小板ポリペプチド非存在下でインキュベートしたコントロールと比 較して、血小板活性化阻害ポリペプチドがＵ４６６１９またはトロンビンに誘発 された血小板凝集およびＡＴ−Ｐ遊離の両者を共に効果的に阻害したこ抗血小板 ポリペプチドがコラーゲンの刺激による血小板トロンボキサンＡ２生成を阻害す る能力もアッセイし、コラーゲンに誘発される血小板凝集の阻害と比較した。こ のアッセイにおいて、種々の濃度の抗血小板ポリペプチドを、３７℃に維持して いる攪拌富血小板血漿の懸濁液に加えた。ポリペプチドを加えてから１分後、コ ラーゲンを最終濃度が１Ｈｇ／ｍｌになるように加えた。反応を４分間行わせ、 その後水冷インドメタシンを最終濃度が１０μＭになるように加え反応を停止し た。次いで懸濁液を１２．ＯＯＯＸｇで２分間遠心分離し、上清を除去し、トロ ンボキサンＡ２の安定な代謝体であるトロンボキサンＢ２の遊離をラジオイミュ ノアッセイにより分析した。アゴニストまたは抗血小板ポリペプチドの存在しな い時、検出されたトロンボキサンＢ２のレベルは＜０．５ｎｇ／１０’個の血小 板であった。図６は、血小板凝集の阻害がトロンボキサンＢ２として測定したト ロンボキサンＡｚ；１１離の阻害と相関することを示す。

次に、血小板活性化阻害ポリペプチドが血小板からの３Ｈ−セロトニンの遊離を 阻害する能力を分析した。クエン酸処理した富血小板血漿中の血小板に、３７℃ で３００分間インキュベートることにより［’Ｈ］−セロトニン即ち５−ヒドロ キシ［６−３Ｈ］　トワブタミンクレアチンスルフェート（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、１１１ｉｎｏｉｓ）で［２した。血漿中 の〔３Ｈ］−セロトニン標識した血小板（０，５ｍ１）を攪拌しながら３７°Ｃ で、種々の量の抗血小板ポリペプチド（最終濃度０〜２．５μｇ／ｍｌ）と共に １分間インキュベートした。次に血小板を、ＡＤＰ　（２μＭまたは１０μＭ） 、ヒトグートロンビン（最終濃度５〜２０μｇ／ｍｌ）、またはコラーゲン（１ ０μｇ／ｍｌ）の添加で刺激した。アゴニスト添加の４分後、１／１０容量の水 冷ＥＴＰ　Ｉカクテル（３，３％ＥＤＴＡ、１０ｍＭテオフィリン、１μｇ　／ 　ｍ　！プロスタグランジンＥ１および５００ＩＭイミブラミン）を加え、反応 を停止し、セロトニン遊離および再取り込みをブロックした。ＥＴＰＩの添加後 、１２．ＯＯＯＸｇで２分間遠心分離して血小板を回収した。［３Ｈ］放射活性 を液体シンチレーション計測することにより、遊離を測定した。結果を以下の表 に示す。

（以下余白） ＡＤＰ（１０４４Ｍ）　０．０　５７　２９（１０崗／ｍ上）　０．５　６３　 ３４まとめると、これらの結果から、抗血小板ポリペプチドの血小板凝集および 遊離に対する効果は非常に相関しており、そしておそらく単一の作用様式に由来 することが示唆される。

抗血小板ポリペプチドによる血小板作用の阻害のモルｒｃｓｓ値は以下の通りで ある。

了う１トン峠１址１工、８　ｒＬＭ　１コ、３　ｎＭ　Ｎ、Ｄ。

、Ｎ、Ｄ、Ｗ　ｌ’Ｊｌ乏ψ・丁Ｊい　）抗血小板ポリペプチドの血小板反応阻 害のｒｃｓａは、く１０ｎＭから１４５ｎＭの間の範囲であり、使用するアゴニ ストの型と濃度に依存することが判った。１０μｇ　／　ｍ　ｌコラーゲンを例 外として、使用された全ての濃度の全てのアゴニストにより誘導される血小板活 性化は、１９４ｎＭ（＜３゜５μｇ／ｍ　１　）の濃度の抗血小板ポリペプチド により完全に阻害された。

５μＭ　ＡＤＰの存在下または非存在下で、１２５Ｉ標識した抗血小板ポリペプ チドの血小板に対する結合を調べた。ポリペプチドは１２５エーボルトンハウザ ー試薬により、以下のように標識した。実施例１で精製した血小板活性化阻害ポ リペプチドの１０μｇを２５μｌのほう酸ナトリウム、ｐＨ９，０に溶解し、つ いで１ｍＣ１の１２５Ｉ−ボルトンハウザー試薬（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ ｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を加えた０反 応は室温で３０分行われた。ヨード化は、モルにして１０００倍過剰のグリシン を加えることにより停止した。リン酸緩衝生理食塩水で平衡化したセファデック スＧ−２５のカラムで脱塩することにより、遊離の１２５Ｉ−ボルトンハウザー 試薬から１２５ニー抗血小板ポリペプチドを取り出した。１２５Ｉ−抗血小板ポ リペプチド（１５，２ｘｌＯ’ｃｐｍ／μｇ）を、非標識の抗血小板ポリペプチ ドで２００Ｉｇ　／　ｍ　１の濃度まで希釈した。

１２５Ｉ−抗血小板ポリペプチドの結合は、ＡＤＰ　（５μＭ）の存在下または 非存在下で１．０ｍｌのヒト富血小板血漿を１分間インキュベートした後、放射 標識した抗血小板ポリベブチド（最終濃度２　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｉ　）を、また は放射標識抗血小板ポリペプチドとモルにして１００倍過剰の非標識抗血小板ポ リペプチドとを加えることにより行った。特異的な＋２５１−抗血小板ポリペプ チドの結合の反応速度は、様々な時間間隔（０〜１２０分）で血小板懸濁液から ０．１ｍ１部分ずつ取り出すことにより測定した。取り出した０、１ｍｌを０． 　１ｍｌの３０％シー１糖の上部に置き、１２．ＯＯＯＸｇで３分間遠心した。

上清の一部（５０μｌ）の放射活性をγカウンター装置で計測した。図７は、Ａ ＤＰ刺激および非刺激の両方の血小板に対する抗血小板ポリペプチドの結合が１ ０分後に最大になることを示す。図７は、抗血小板ポリペプチドが、非刺激血小 板に比べ２．５倍高い親和性でＡＤＰ刺激血小板に結合することも示す。

犬立五立 ハ　活　ポリペプチドと ヒルジン　との　Ａせの 血小板活性化阻害ポリペプチドと従来の抗トロンビン剤との結合物の、血小板凝 集に対する阻害の効果を測定するため、トロンビン誘発の血小板凝集アッセイを 行った。詳細には、０．５ｍｌの攪拌富血小板血漿を、様々な濃度の実施例１で 精製した抗血小板ポリペプチド（０〜１６０　ｎ　ｇ　／　ｍ　１　）、スルホ Ｔ　Ｙ　ｒ　８３ヒルジン５３−６４（０〜１１５ｎｇ／ｍｌ）またはこれら２ つの分子の結合物とともにインフレ−ムした。

−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌ　ｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ− Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕは、アプライドバイオシステムダ４３０Ａペプチド合成 機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。

Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を用いた固相ペプチド合成 法により合成した。次に、１ｇのペプチドをＮ、Ｎ’　−ジシクロへキシルカル ボジイミド（０，２ｇ１０．１６ｍ１ジメチルホルムアミド）５ｍｌの存在下、 ４０ｍ１のジメチルホルムアミドに溶解することにより、ペプチドを唯一のチロ シン残基部でスルホ化した。混合物をＯ″Ｃで攪拌し、沈澱が形成されるまで反 応混合物に０．５ｍｌの濃硫酸を滴下した。反応は、４０　ｍ　ｌの水を加えて 停止し、スルホＴｙｒ６３ヒルジン５３−６４の精製は、ＤＥＡＥセファロース のクロマトグラフィーにより行った。カラムはＮａＣ１のＯ〜０．４Ｍの直線濃 度勾配により展開した。目的の生成物は０．２〜０．　３Ｍ　ＮａＣ１で溶離し た。

１分後、試料にヒトα−トロンビンを最終濃度０．４Ｕ／ｍｌになるように添加 した。血小板凝集は、ＰＡＰ４装置で前記のように測定した。図８は、抗血小板 ポリペプチドおよびスルホＴｙｒ６２ヒルジン６３−８Ｊは、−緒に用いたとき 、トロンビン誘発の血小板凝集を阻害する相加的効果を有することを示している 。

Ｌ立五立 え　の　ハ　゛　ポリペプチドの一 本発明の抗血小板ポリペプチドをコードする合成遺伝子（図９）は、天然のタン パク質の完全なアミノ酸配列および逆翻訳コンビニ−タープログラム（Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｆｉｓｃｏｎｓｉｎ。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ、　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．２） を使用して設計した。２２９塩基対からなる全遺伝子を、互いに結合させると図 ９に示す制限配列を形成する１４個の異なるオリゴマーとして合成した。図１０ に示すように、１４個のオリゴマーは７個の本質的に相補的なオリゴヌクレオチ ド対として合成される。オリゴマーの相補対の結合部位から突出する配列は、６ 塩基の長さである。

１４個のオリゴマーはクローニングベクターｐＮＮＯ３に組立てられる。プラス ミドｐＮＮｏ　３は市販のプラスミドｐＵＣ８に由来する。これを創造するため 、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥＣ０ＲＩで消化して、ｐＵＣ８の全ポリリンカー領域 を除いて作成した。異なる制限部位を含む他のポリリンカー（図１１）を標準法 で合成し、ｐＵＣ８のＨｆｎｄｌＩＩ／旦ｃｏＲＩで開裂させたｐＵＣ８に結合 させた。ｐＮＮＯ３の制限地図を図１２に示す。

プラスミドｐＮＮｏ　３は制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより開裂さ れる。１４個のオリゴマーを開裂されたベクターに加え、Ｔ４リガーゼでライゲ ージコンする。次に、Ｅ、ｃｏｌｉｌｉＥ胞をライゲーションした混合物で形質 移入し、テトラサイクリン耐性を発現するクローンを単離する。プラスミドをこ れらのコロニーから単離し、制限地図の作成およびヌクレオチド配列決定を行い 、完全な合成抗血小板ポリペプチド遺伝子を含有するかどうかを決定する。組み 立てたベクターが完全であることが証明された後、単離されたプラスミドをＮｃ ｏＩおよびＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで開裂し、抗血小板ポリペプチドをコードする遺 伝子を遊離させる。次に遺伝子を発現ベクターｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡＩとラ イゲーションさせる（Ｊ、　Ｇｈｒａｙｅｂらど５ｅｃｒｅｔｉｏｎ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｉｎ　Ｅｓ並ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ”、　ＥＭＢ ＯＪ、、　ｐｐ、２４３７−４２　（１９８４））。このベクターは、５′から ３′方同にｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーターオペレーターおよびＥ、ｃ ｏｌｉの外膜タンパク質であるｏｍｐＡタンパク質のシグナルペプチドをコード するＤＮＡ断片を含有する。ベクターはさらにアンビシソン耐性遺伝子も含有す る。抗血小板ポリペプチド遺伝子は、組換えポリペプチドが発現後、ペリプラズ ムに同かうように、ＯｍｐＡシグナルペプチドに隣接してインフレームで挿入さ れる。

詳細には、ｐＩＮ−Ｉ　Ｉ　Ｉ−ｏｍｐＡＩベクターをＥｃ。

ＲＩで消化し、生じた付着末端をマングビーンヌクレアーゼで除去する。次に、 平滑末端を有する直鎖状ベクターを比重ｎｄＩＩＩで開裂させる。次に、ｐ　Ｉ Ｎ−Ｉ　Ｉ　Ｉ−ｏｍｐＡＩの大きな７．５ｋｔ）断片を単離し、抗血小板ポリ ペプチド遺伝子とライゲーションさせる。次に、得られたベクターｐＩＮ−Ｉ　 Ｉ　Ｉ−ｏｍｐＡ−ａｐｐをＥ、ｃｏｌｔ　ＪＡ２２１ｓ＠細胞の形質転換に使 用した。形質転換体はＬＢアガー＋アンピシリンのプレートで増殖させた。ｐＩ Ｎ−ＩＩＩ−。

ｍｐＡ−ａｐｐを含有するクローンを制限酵素分析により同定し、続く組換え抗 血小板ポリペプチドの産生に使用した。

もう一つの発現ベクターであるＰＬ−ｍｕ−ｓｍｃ””は、組換え抗血小板ポリ ペプチドが、発現の後、形質転換されたＥ、ｃｏｌｉの細胞質画分に向けられる ために使用する。ＰＬ−ｍＬＩ−５ｍＣ”・ｔＲは、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ ３６１０５８１０号に既に記載のＰＬ−ｍ　ｕ　−Ｓ　ｍ　Ｃ””のテトラサイ タリン耐性誘導体である。ＰＬ−ｍｕ−ｓｍｃｔ・ｌの完全なヌクレオチド配列 を図１３に示す。詳細には、ＰＬ−ｍｕ−ｓｍｃ　ｔ　＠　ｔ　ＲはＮｃｏｌお よびＨｉｎｄＩＩＩで開裂させ、抗血小板ポリペプチドをコードする遺伝子とラ イゲーションさせる。

ライゲーションした産物をＥ、ｃｏｌｉの形質転換に使用し、ＰＬプロモーター の温度誘導により、組換え抗血小板ポリペプチドを発現させる。

Ｃニス碌自） 実ｆｆｉ ハ　ポリペプチドの組　え発 ｐＩＮ−Ｉ　Ｉ　Ｉ−ｏｍｐＡ−ａｐｐプラスミドを有することが確認されたク ローンを４　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のグルコース、２０μｇ　／　ｍ　１のトリプ トファン、２０μｇ　／　ｍ　Ｉのロイシン、２μｇ　／　ｍ　１のチアミンお よび５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを添加した１リツトルのＭ−９培地中 で３７℃で培養した。

細胞の濃度が０．４０Ｄｓｓａになったとき、培養液に２ｍＭのＩ　ＰＴＧを加 え、ｌａｃプロモーターを誘導し、更に細胞を３時間培養した。

次に細胞を遠心分離によって回収し、１００　ｍ　ｌの１０ｍＭトリス−）（Ｃ Ｉ、ｐＨ７，１，３０ｍＭ　ＮａＣ１で２回洗浄した。細胞の沈澱を次に標準的 な浸透圧ショックの手順に供し、ペリプラズムポリペプチドを単離した（　Ｑ、 　Ｋｅｌ　ｌｅｒｍａｎら、　”Ｍａｌｔｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　ｆｒｏ＋＊　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ”、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ ｚ　ｍｏｌ、、　９０．　ｐｐ、　４５９−６３　（１９８２））。まず、細胞 を５０ｍ１の３０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，１，２０％ショ糖、０．１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡに、常に攪拌しながら室温で１５分間再懸濁した。次に細胞を１２ ．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、次に細胞の沈澱を、水冷 した低浸透圧性の０．１ｍＭ　ＭｇＣｌ２に再懸濁した。混合物を４°Ｃで１０ 分攪拌し、次に再度遠心分離した。浸透圧ショックの上清を回収し、凍結乾燥し 、そして再び１０ｍｌの２０ｍＭ　）リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，１，１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ中に溶解した。

浸透圧ショックの上清分画を、本発明の抗血小板ポリペプチドに対する抗体を用 いたウェスタンブロッティングで分析した。視覚的な分析によって、ペリプラズ ム分画中の組換え抗血小板ポリペプチドの１０％未満が、シグナル配列が開裂さ れていることが決定された。

抗血小板ポリペプチドは、浸透圧ショックの上清から更にＧ−５０カラム（１， ５ｘ９０ｃｍ）で４℃で精製された。

分画（２ｍｌ）を回収し、そのうちの一部を、ウェスタンブロッティングによる 、抗血小板ポリペプチドの存在の分析に供した。抗血小板ポリペプチドを含む分 画をプールし、凍結乾燥し、０．１％のトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）水溶液 中に再溶解した。組換え抗血小板ポリペプチドをさらに、ｖｙｄａｃＣ４カラム （０，４６ｘ２５ｃｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣは、アブラ イドバイオシステニス１５０Ａ液体クロマトグラフィーシステムを用いて行った 。カラムは試料をロードする前に０．　１％ＴＦＡ水溶液で平衡化した。カラム を６０分間に渡り、流速１．０ｍｌ／分で、０゜１％ＴＦＡ中のアセトニトリル の増加の（０〜３０％）直線濃度勾配で展開した。溶離液は、２１４ｎｍおよび ２８０ｎｍでモニターした。０．５ｍｌずつの分画を集め、５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ 器真中で乾燥させ、そして０．１ｍｌの水に再溶解した。

一部のアミノ酸配列決定から、精製された組換え抗血小板ポリペプチドは、Ｎ末 端に追加のアミノ酸であるアラニンを含むことが判った。このことは、発現ベク ターｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ−ａｐｐの構築に基づいて予想された。組換え型 抗血小板ポリペプチドは、本来のポリペプチドに見られるのと同じく、酸化した こ量体の形で分泌されることが判った。

組換え型抗血小板ポリペプチドの抗血小板活性は、実施例３に述べられたように アッセイした。このポリペプチドは、図１４に示されるように、コラーゲン誘発 性血小板凝集に対し、用量依存的な阻害を示す。

爽立立エ マウスモデル　のヒトメラノーマの　に・　るハ　ポリペプチドの ヒトメラノーマ細胞（１〜５Ｘ１０’個）の一部分を様々な量（０〜５０μｇ／ ｍ　ｌ　）の、それぞれ実施例１および７に述べたように精製した天然型あるい は組換え型の抗血小板ポリペプチドで処理する。次にこの細胞をヌードマウスの 腹部表面の皮下に移植する。

抗血小板ポリペプチドペプチド処理した細胞を受容するマウスは、天然型あるい は組換え型の抗血小板ポリペプチド（０，１ｍｇ／ｋｇ）を毎日２回、皮下注射 される。未処理の細胞を移植されたコントロールのマウスは、毎日２回、生理食 塩水を皮下注射される。実験用およびコントロールのマウス両方における腫瘍の 成長を、膿瘍の塊を測定することによって、３０日にわたりモニターする。３０ 日が終わった時点で、実験用のマウスは、コントロールのマウスより小さ０腫瘍 を持つ。

我々は本明細書でこれまで本発明の多数の実施態様を述べてきたが、我々の基本 的な構成が、本発明のポリペプチド、医薬的な組成物および組合せ、ならびに組 換えＤＮＡ分子を利用する他の実施態様を提供するために変更し得ることは、明 かである。従って、本発明の範囲は、実施例としてこれまでに示された特定の実 施態様によってではなく、ここに添付の請求の範囲によって規定されると認識さ れる。

ＦＩＧ、／ ＃、ｈ杏考 ＦＩＧ３ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ ０　２７）０　４１）ｌ）　６１）ｌ）　１ｍ　Ｉｔ）（Ｘ）ｎ３／／７７／ ６．５θ　／θθ 時Ｐ／Ｉ（′ガ２ ２　ＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＴＴＣｔｒＡＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴ入ＧＧＧ４　Ｇ ＣＣ’！？！’ＴＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧ８　に’ｌ’ｃ ＡｃＡｃＧＴｃ’！ＴＣＣ入Ｇ入Ｃ入ＣＧ入ＣＧＣＴＧＧＴＣ入Ｃσｆｆｉ入Ａ ＧＴＡｃＴ１０　ＩＣＡＴＧＧＣＭＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣＣ１２Ａ ！’ｒ’ｌ’ＧＣ’ｒ’ＧＡＴＧＡＣ’ＧＡＡＧ４ズｈｒｈａｈａ１３　’ＴＡ Ｔ’σ■コｍｚ門＆ＣＣＧＣＧＴＡＡＣＣＣα「代℃λσ■講τＧＡ１４　ＡＣ ＧＴＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＣＡ７■℃Ｇシ山Ｇｇｒ′ＧＡＣＴＡＣｊＸＸ講〜 ＦＩＧ、／４Ａ ｆ　２　°３４−５Ｇ７ θ季　間　（りン １Ｍ（ｉｐ ＦＩＧ、／４Ｂ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年７月２６日「

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａｇｋｉｓｔｒｏｎｄｏｎ ｐ．ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓの毒から血小板活性 化阻害ポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）該毒を水性緩衝液に溶解す る工程、（ｂ）該溶解毒液から不溶性物質を全て取り除く工程、（ｃ）該溶解毒 液を分子量分離手段により分画し、該ポリペプチドを含む第１画分を該ポリペプ チドと相違する分子量を有する不純物を含む第２画分から分離する工程、（ｄ） 該ポリペプチドを含む非結合画分から不純物を含む結合画分を分離する条件下で 、該第１画分を陽イオン交換樹脂に接触させる工程、および （ｅ）該非結合画分を逆相ＨＰＬＣにより分画し、工程（ｄ）後に残存する不純 物から該ポリペプチドを分離する工程を包含する、方法。
2. ２．Ａｇｋｉｓｔｒｏｎｄｏｎ　ｐ．ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓの毒から血小板活性 化阻害ポリペプチドを精製する方法であって、（ａ）少なくとも１種のプロテア ーゼ阻害剤の存在下で該毒を水性緩衝液に溶解する工程、 （ｂ）該溶解毒液から不溶性物質を全て取り除く工程、（ｃ）該ポリペプチドを 含む非結合画分から不純物を含む結合画分を分離する条件下で、該溶解毒液を陽 イオン交換樹脂に接触させる工程、 （ｄ）該非結合画分を分子量分離手段により分画し、該ポリペプチドを含む第１ 画分を該ポリペプチドと相違する分子量を有する不純物を含む第２画分から分離 する工程、および（ｅ）該第１画分を逆相ＨＰＬＣにより分画し、工程（ｄ）後 に残存する不純物から該ポリペプチドを分離する工程を包含する、方法。
3. ３．請求項１または２に記載の方法により製造される血小板活性化阻害ポリペプ チドであって、該ポリペプチドが２つの相同なジスルフィド結合したポリペプチ ド鎖で主としてなり、該ポリペプチド鎖の各々が以下のアミノ酸配列を有する、 ポリペプチド： 【配列があります】
4. ４．請求項３に記載の血小板活性化阻害ポリペプチドを発現される状態でコード するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ配列が以下の群から 選択される、組換えＤＮＡ分子： （ａ）【配列があります】 （ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズし、血小板活性化阻害ポリペプチド を発現される状態でコードするＤＮＡ配列；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ配列のいずれかに、発現される状態でコード される血小板活性化阻害ポリペプチドを、発現される状態でコードするＤＮＡ配 列。
5. ５．（ａ）請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子を特徴付けるＤＮＡ配列からなる 群から選択される、血小板活性化阻害ポリペプチドをコードする第１ＤＮＡ配列 ；および（ｂ）ヒルジン誘導体をコードする第２ＤＮＡ配列を含有する組換えＤ ＮＡ分子であって、血小板活性化阻害ポリペプチドのアミノ酸配列およびヒルジ ン誘導体のアミノ酸配列を含む単一ポリペプチドを、発現される状態でコードす るように、該第１ＤＮＡ配列が該第２ＤＮＡ配列に融合されている、組換えＤＮ Ａ分子。
6. ６．請求項４または５に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主であって 、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母および他の菌類および細菌からなる群か ら選択される、宿主。
7. ７．請求項６に記載の宿主を培養する工程を包含する、血小板活性化阻害ポリペ プチドの製造方法。
8. ８．請求項７に記載の方法により製造される血小板活性化阻害ポリペプチド。
9. ９．患者または体外の血液中の血小板凝集および血小板遊離を減少させまたは阻 害する医薬組成物であって、医薬として許容される担体、ならびに請求項３に記 載のポリペプチドおよび請求項８に記載のポリペプチドからなる群から選択され る少なくとも１種のポリペプチドを含む、組成物。
10. １０．患者または体外の血液中の血小板凝集および血小板遊離を減少させる方法 であって、該患者または該体外の血液を請求項９に記載の組成物で処理する工程 を包含する、方法。
11. １１．前記ポリペプチドの投与量が前記患者当り約０．０１および１００ｍｇ／ ｍｌの間である、請求項９に記載の組成物。
12. １２．前記ポリペプチドの投与量が前記体外の血液当り約０．０５および１０μ ｇ／ｍ１の間である、請求項９に記載の組成物。
13. １３．患者に挿入される挿入装置の表面をコートする組成物であって、請求項３ に記載のポリペプチドおよび請求項８に記載のポリペプチドからなる群から選択 される少なくとも１種のポリペプチドを含む、組成物。
14. １４．患者に挿入される挿入装置の表面をコートする方法であって、該患者に挿 入される前に請求項１３に記載の組成物を該表面に接触させる工程を包含する、 方法。
15. １５．患者または体外の血液中の血小板凝集および血小板遊離を減少しまたは阻 害する、医薬として許容される組合せであって、 （ａ）請求項３または８に記載の血小板活性化阻害ポリペプチド； （ｂ）ヒルジン、スルホＴｙｒ６３ヒルジン５３−６４およびスルホニルＴｙｒ ６３ヒルジン５３−６４からなる群から選択される抗トロンビン剤；および （ｃ）医薬として許容される担体 を含有する、組合せ。
16. １６．患者または体外の血液中の血小板凝集および血小板遊離を減少しまたは阻 害する方法であって、該患者または該体外の血液を請求項１５に記載の組合せで 処理する工程を包含する、方法。
17. １７．前記ポリペプチドの投与量が前記患者の体重当り０．０１および１００ｍ ｇ／ｋｇの間であり、前記抗トロンビン剤の投与量が前記患者の体重当り０．０ １および１００ｍｇ／ｋｇの間である、請求項１５に記載の組合せ。
18. １８．前記ポリペプチドの投与量が体外の血液当り０．０５および１０μｇ／ｍ １の間であり、前記抗トロンビン剤の投与量が前記体外の血液当り０．０５およ び１０μｇ／ｍ１の間である、請求項１５に記載の組合せ。
19. １９．患者の癌を処置または予防するための医薬組成物であって、医薬として許 容される担体および請求項３または８に記載の血小板活性化阻害ポリペプチドを 含む、組成物。
20. ２０．患者の癌を処置または予防する方法であって、請求項１９に記載の組成物 を患者に投与する工程を包含する、方法。
21. ２１．ジスルフィド結合した二量体構造により特徴付けられる血小板活性化阻害 剤であって、該二量体構造の各成分が血小板表面に結合可能なアミノ酸配列Ａｒ ｇ−Ｇ１ｙ−Ａｓｐを含む、阻害剤。