Die
Erfindung hat daher die Aufgabe, neue Polypeptid-Inhibitoren von
Transglutaminasen rekombinant oder synthetisch in ausreichenden
Mengen und in reiner Form bereitzustellen.
Überraschenderweise
stellte sich das in einem heterologen Systen, z.B. in Escherichia
coli, exprimierte und aufgereinigte Tridegin Polypeptid als effektiver
Transglutaminaseinhibitor, insbesondere als Inhibitor von Faktor
XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa, heraus. Damit wurde erstmals
gezeigt, dass das Tridegin Polypeptid tatsächlich ein Transglutaminaseinhibitor,
insbesondere ein Inhibitor von Faktor XIIIa, vor allem von humanem
Faktor XIIIa, ist. Überraschenderweise
zeigten auch Tridegin Polypeptide mit einer oder mehreren Modifikationen
eine Aktivität
als Transglutaminaseinhibitor, insbesondere als Inhibitor von Faktor
XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa.
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher ein modifiziertes Tridegin
Polypeptid abgeleitet von SEQ ID No.1 mit einer oder mehreren Modifikationen
und weniger als 40 Aminosäuren.
Unter
einem Polypeptid versteht man im Sinne dieser Erfindung Peptide
mit mehr als 15 Aminosäuren (AS)
und weniger als 400 Aminosäuren
insbesondere Peptide mit mehr als 19 AS und weniger als 40 AS.
Unter
einer Modifikation versteht man im Sinne dieser Erfindung eine Veränderung
des Wildtyp Tridegin Polypeptides durch die Substitution mindestens
eines Cysteinrestes durch eine andere Aminosäure und/oder die Substitution
mindestens einer der folgenden Aminosäuren – Lys2, Lys7, His10, Gly12,
Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50, Pro55, Phe58, Asn60,
Pro65 – durch
eine andere Aminosäure und/oder
eine Deletion des N- und C-Terminus, und/oder eine kovalente Verknüpfung mit
Polyethylenglykol.
Unter
einer Substitution versteht man im Sinne dieser Erfindung das Ersetzen
einer Aminosäure
an einer bestimmten Stelle der Aminosäuresequenz eines Polypeptides
durch eine andere Aminosäure,
vorzugsweise durch eine der anderen 19 natürlichen Aminosäuren.
Unter
einer Deletion versteht man im Sinne dieser Erfindung das Entfernen
von N- und C-terminalen Bereichen der Aminosäuresequenz des Tridegins Polypeptides,
wobei das verbleibende Polypeptid noch mindestens die Aminosäuresequenz
DDIYGRPVEFPNLPLK enthält.
Überraschenderweise
zeigten die modifizierten Tridegin Polypeptide im Vergleich zum
in Escherichia coli exprimierten Wildtyp Tridegin Polypeptid folgende
vorteilhafte Eigenschaften.
Während das
aus Escherichia coli gewonnene, rekombinante Wildtyp Tridegin Polypeptid
auch hochmolekulare Aggregate bildete, zeigten diejenigen modifizierten
Tridegin Polypeptide, bei denen mindestens ein Cysteinrest, bevorzugt
ein bis vier Cysteinreste, besonders bevorzugt drei oder vier Cysteinreste
durch eine andere Aminosäure,
vorzugsweise eine kleine Aminosäure
wie Valin, Alanin, Glycin oder Serin, besonders bevorzugt durch
Alanin oder Serin, vor allem durch Alanin, substituiert war, eine
verminderte Aggregatbildung. Dies wurde in vergleichenden, analytischen
Gelfiltrationsläufen
festgestellt. Für
die experimentellen Bedingungen der Gelfiltrationsläufe wird
auf das Ausführungsbeispiel
4 verwiesen.
Außerdem zeigen
besagte modifizierte Tridegin Polypeptide bei der Lagerung bei 4°C eine langsamere
Bildung der hochmolekularen Aggregate als das Wildtyp Tridegin.
Dies wird in vergleichenden, analytischen Gelfiltrationsläufen festgestellt.
Für die
experimentellen Bedingungen der Gelfiltrationsläufe wird auf das Ausführungsbeispiel
4 verwiesen.
Diejenigen
modifizierten Tridegin Polypeptide, bei denen mindestens eine, bevorzugt
eine bis zehn, besonders bevorzugt eine bis sechs, vorallem eine
bis drei, insbesondere aber nur eine der folgenden Aminosäuren – Lys2,
Lys7, His10, Gly12, Leu24, Tyr31, Phe34, Arg39, Ile45, Met48, Asp50,
Pro55, Phe58, Asn60, Pro65 – durch
eine andere Aminosäure,
vorzugsweise eine kleine Aminosäure
wie Valin, Alanin, Glycin oder Serin, besonders bevorzugt durch
Alanin und Glycin, vor allem durch Alanin substituiert wurden, zeigen überraschenderweise
eine im Vergleich zum Wildtyp Tridegin verminderte Antigenizität, überraschenderweise
bei einer mit dem Wildtyp Tridegin Polypeptid vergleichbaren inhibitorischen
Aktivität
auf den humanen Faktor XIIIa, was wiederum überraschend war.
Bei
der Suche nach einer vom Wildtyp Tridegin Polypeptid abgeleiteten
minimalen, den Faktor XIIIa inhibierenden Aminosäuresequenz, ergab sich überraschenderweise,
dass Polypeptide, die mindestens die Aminosäuresequenz DDIYQRPVEFPNLPLK
enthielten, eine inhibitorische Wirkung auf den humanen Faktor XIIIa
aufwiesen. So inhibierten selbst Polypeptide von nur 20 Aminosäuren Länge, welche
die oben genannte Aminosäuresequenz
enthielten, den humanen Faktor XIIIa. Kurze Polypeptide, mit weniger
als 40, bevorzugt mit weniger als 30, besonders bevorzugt mit weniger
als 25 Aminosäuren,
die mindestens die Aminosäuresequenz
DDIYQRPVEFPNLPLK enthalten, haben überdies den Vorteil, dass sie
weniger zur Aggregation neigen, chemisch in großen Men gen synthetisiert werden
können
und, im Vergleich zum Wildtyp Tridegin Polypeptid, eine verminderte
Antigenizität
aufweisen.
Weitere
vorteilhafte, modifizierte Tridegin Polypeptide sind Tridegin Polypeptide,
die kovalent mit Polyethylenglykol verknüpft sind. Die Reaktionsbedingungen
für die
Modifikation mit PEG sind z.B. in Cohen et al., Biochem. J., 357(3):
795-802 (2001) beschrieben. Das in die Mofizierungsreaktion eingesetzte
Polyethylenglykol sollte ein Molekulargewicht von 500 Da bis 20000
Da, bevorzugt zwischen 1000 Da und 10000 Da, besonders bevorzugt
zwischen 2000 Da und 5000 Da haben. Es sollte in einem molaren Verhältnis Polyethylenglykol
: erfindungsgemäßes Polypeptid
von zwischen 0,5:1 und 10:1, bevorzugt zwischen 0,8:1 und 4:1, besonders
bevorzugt zwischen 1:1 und 2:1 eingesetzt werden. Diese modifizierten
Polypeptide haben den Vorteil, nach Injektion in die Blutbahn eines
Säugers
weniger schnell abgebaut zu werden als das unmodifizierte Polypeptid.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
der vorangehend beschriebenen Polypeptide. So können die erfindungsgemäßen Poylpeptide
mit gentechnischen oder peptid-chemischen Verfahren hergestellt
werden.
Ein
gentechnisches Verfahren zur Herstellung eines der genannten Polypeptide
besteht z.B. darin, eine Nukleinsäure, die für eines der beschriebenen Polypeptide
kodiert, in geeigneter Weise in prokaryotische oder eukaryotische
Expressionsvektoren zu klonieren (Sambrook et al., "Molecular cloning:
a laboratory manual" Second
edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Derartige
Expressionsvektoren umfassen mindestens einen Promotor, mindestens
ein Translationsinitiationssignal, mindestens eine Nukleinsäuresequenz,
die für
eines der er findungsgemäßen Polypeptide
kodiert, und ein Translationsterminationssignal im Falle von prokaryotischen
Expressionsvektoren, im Falle von eukaryotischen Expressionsvektoren
zusätzlich ein
Transkriptionsterminierungssignal sowie ein Polyadenylierungssignal.
Beispiele
für prokaryotische
Expressionsvektoren sind für
die Expression in Escherichia coli z.B. Expressionsvektoren basierend
auf Promotoren, die von der T7 RNA Polymerase erkannt werden, wie
in
US 4,952,496 beschrieben,
für eukaryotische
Expressionsvektoren für
die Expression in Saccharomuces serevisiae z.B. die Vektoren p426Met25
oder p526GAL1 (Mummberg et al. (1994) Nucl. Acids Res., 22, 5767-5768), für die Expression
in Insektenzellen z.B. Baculovirus-Vektoren wie in EP-B1-0 127 839
oder EP-B1-0 549 721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen
z.B. die Vektoren Rc/CMV und Rc/RSV oder SV40-Vektoren, welche alle
allgemein erhältlich
sind.
Die
molekularbiologischen Methoden zur Herstellung dieser Expressionsvektoren
sowie die Methoden zum Einbringen der Expressionsvektoren in die
Wirtszellen und auch die Bedingungen zur Kultivierung der transformierten
Wirtszellen und schließlich
die Bedingungen zur Induktion der Expression des gewünschten erfindungsgemäßen Polypeptids
in den Wirtszellen sind dem Fachmann vertraut. Beispiele für die gentechnische
Herstellung erfindungsgemäßer Polypeptide
sind in den Ausführungsbeispielen
1, 2 und 4 angegeben.
Die
vorangehend beschriebenen Polypeptide können aber auch durch ein peptidchemisches
Verfahren hergestellt werden, wie im Ausführungsbeispiel 3, also z.B.
mit der allgemein bekannten Festphasensynthese, wie in Merrifield,
J. Am. Che. Soc. 85: 2149 (1962) beschrieben. Techniken zur Synthese
und Aufreinigung von Peptiden sind z.B. auch in Stewart and Young, "Solid Phase Peptide
Synthesis" (Freeman,
San Francisco, 1969) auf den Seiten 27-62 beschrieben, sowie in
US 4,269,827 .
Ein
anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines der oben
genannten Polypeptide als Inhibitoren von Transglutaminasen, insbesondere
von Faktor XIIIa, vor allem von humanem Faktor XIIIa. Die oben genannten
Polypeptide haben die Eigenschaft die vom Faktor XIIIa katalysierte
Freisetzung von Ammonium-Ionen, die bei der von Faktor XIIIa katalysierten
Reaktion von einem spezifischen Peptidsubstrat mit Glycinethylester
freigesetzt werden, wie z.B. im Behrichrom® assay
(Fa. Dade Behring GmbH, Marburg), zu inhibieren. Eine derartige
inhibitorische Wirkung der oben genannten Polypeptide kann, zum
Beispiel, im Behrichrom® assay nachgewiesen werden,
wie in den Ausführungsbeispielen
1 bis 4 beschrieben.
Des
weiteren können
die erfindungsgemäßen Polypeptide
die zum humanen Faktor XIIIa homologen Säugerproteine inhibieren, z.B.
das mit dem humanen Faktor XIII homologe Protein aus Rattus norvegicus,
bei dem 617 von 732 Aminosäuren
identisch sind (84%), und 689 von 732 Aminosäuren verwandt (93%).
Neben
ihrem inhibitorischen Effekt auf den Faktor XIIIa inhibieren die
oben genannten Polypeptide auch weitere Transglutaminasen, z.B.
die in den Keratinozyten exprimierte Transglutaminase 1, die an
der Bildung der Epidermis beteiligte Transglutaminase 3, die im
Samenleiter bei der Quervernetzung von Proteinen und der Konjugation
von Polyaminen beteiligte Transglutaminase 4, sowie die bei der
Verhornung von Keratinozyten beteiligte Transglutaminase 5, und
damit alle sechs bislang beschriebenen Transglutaminasen des menschlichen
Proteoms.
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung besteht in der Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptides
zur Prävention
und Therapie von Thrombosen. Indem die erfindungsgemäßen Polypeptiden
den Faktor XIIIa inhibieren, inhibieren sie auch die Bildung von
Quervernetzungen von Fibrinpolymeren. Damit wird die Bildung von "harten" Blutthromben, die
resistent gegen den Abbau durch fibrinolytische Enzyme sind, inhibiert.
Die
erfindungsgemäßen Polypeptide
ermöglichten
z.B. eine schnellere Lyse von humanen Blutthromben und inhibierten
auch das Einsetzen der Blutgerinnung, wie im Ausführungsbeispiel
5 beschrieben. Sie eignen sich somit zur Prävention und Therapie von Thrombosen.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Arzneimittel enhaltend
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
und mindestens einen galenischen Hilfsstoff. Die erfindungsgemäßen Polypeptide
sind potente Transglutaminase-Inhibitoren, weisen aber nur ein geringes
Maß an
Toxitität
auf und können
darum zur Herstellung von Arzneimitteln besonders gut verwendet
werden.
Der
Begriff "galenischer
Hilfsstoff" bedeutet
erfindungsgemäß jedes
inerte, nichttoxische, feste oder flüssige Füll-, Verdünnungs-, oder Verpackungsmaterial,
solange es nicht ungebührend
nachteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder dem Patienten
reagiert. Flüssige
galenische Hilfsstoffe sind zum Beispiel steriles Wasser, physiologische
Kochsalzlösung,
Zuckerlösungen,
Ethanol und/oder Öle.
Galenische Hilfsstoffe zur Herstellung von Tabletten und Kapseln
können
zum Beispiel Bindemittel und Füllmaterial
enthalten.
Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kombinationspräparat enthaltend
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
sowie mindesten einen pharmazeutischen Wirkstoff.
Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung besteht in einem Kombinationspräparat enthaltend mindestens
eines der erfindungsgemäßen Peptide
sowie einen weiteren Wirkstoff in Form eines Antikoagulanz. Antikoagulanzien
fördern
entweder die Lyse von Blutthromben oder inhibieren die Bildung von
Blutthromben. Beispiele sind thrombolytische Wirkstoffe, also Wirkstoffe
die den Abbau von aktivem Thrombin oder dem Prothrombin fördern, fibrinolytische
Wirkstoffe, also Wirkstoffe, die den Abbau von polymerem Fibrin
fördern, oder
fibrinogenolytische Wirkstoffe, also Wirkstoffe, die den Abbau von
Fibrinogen fördern.
Be vorzugte Antikoagulanzien sind Aktivatoren von Plasmin oder Plasminogen
oder Inhibitoren von Thrombin, Faktor Xa oder Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation.
Besonders
bevorzugte Antikoagulanzien, die in Kombinationspräparaten
gemeinsam mit den erfindungsgemäßen Peptiden
verwendet werden können,
sind Acetylsalicylsäure,
Heparin, niedermolekulares Heparin, Heparinoid, Hirudin, Bivalirudin,
Melagatran, Abciximab, Eptifibabide, Gewebe Plasminogen Aktivator (tPA),
Streptokinase, Staphylokinase, Urokinase, Eminase, Hementin und/oder
Plasmin.
Acetylsalicylsäure wirkt
u.a. als Inhibitor der Blutplättchen-Aggregation.
Heparin ist ein körpereigenes polyanionisches
Polysaccharid mit einem Molekulargewicht von 6000 Da bis 30000 Da
und erhöht
die Wirksamkeit des körpereigenen
Antithrombin III. Niedermolekulares Heparin wird durch begrenzten
Abbau von Heparin gewonnen und hat ein Molekulargewicht von 4000
Da bis 6000 Da. Hirudin ist z.B. in
EP
0347376 und
EP 0501821 beschrieben.
Mit Hirudin bezeichnet man eine Familie von homolgen Polypeptiden
aus Blutegeln, die Thrombin inhibieren und die Blutgerinnung inhibieren.
Bivalirudin ist ein Thrombin inhibierendes Peptid (Kelly et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 6040-6044 (1992). Melagatran ist
ein Thrombin inhibierendes Peptid Mimetikum (Thromb Haemost 79(1):
110-118 (1998)).
Abciximab ist ein Antikörper
und Eptifibabide ein Peptid; beide binden GP IIb/IIIb, das "platelet glycoprotein" IIb/IIIb, und hemmen
die Blutplättchen-Aggregation. Hementin
ist z.B. beschrieben in WO 91/15576, wird in verschiedenen Blutegeln
gefunden, baut Fibrinogen ab und verhindert damit die Blutgerinnung.
Ebenso führen
Plasmin oder Eminase zum Fibrinabbau, während Streptokinase, Urokinase,
Staphylokinase und der Gewebe Plasminogen Aktivator (tPA) das Plasminogen
aktivieren und durch die Generierung von aktiven Plasmin zum Fibrinabbau
führen.
Ein
besonderer Vorteil der Kombination der erfindungsgemäßen Polypeptide
mit den Antikoagulanzien und gegebenenfalls einem weiteren pharmazeutischen Wirkstoff,
besteht darin, dass Blutthromben durch die Kombination der Wirkstoffe
auf synergistische Weise schneller aufgelöst werden als durch einen Wirkstoff
allein. Besonders die Kombination mit fibrinolytischen Agenzien,
wie z.B. Urokinase und Gebwebe Plasminogen Aktivator (tPA), bewirkte
eine verminderte Stabilität
und eine beschleunigte Auflösung
von Blutthromben, wie im Ausführungsbeispiel
5 detailliert beschrieben ist.
Die
Erfindung soll nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele
weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
Beschreibung der Figuren
und Sequenzen:
1:
Karte des Expressionsplasmids pET22b-14 (A) und Angabe der für das Tridegin
Polypeptid kodierenden Sequenz (B). Nummerierung der Basen gemäß der Plasmidkarte.
2:
Reinigung von rekombinantem wildtyp Tridegin Polypeptid, untersucht
mittels SDS-PAGE (10% Gel)
Spur 1 ist E. coli-Totallysat vor
Auftrag auf die Ni-NTA-Säule.
Spur
2–7 sind
Fraktionen der Elution mit Imidazol. Alle Proben wurden mit SDS-Probenpuffer
versetzt und 5 min. bei 95° C
inkubiert.
3:
Inhibitorische Wirkung des rekombinanten, gereinigten Tridegin Polypeptides
auf den Faktor XIIIa im Berichom®-Assay.
Als
Kontroll-Substanz wurde Cerulenin (der Fa. Calbiochem) verwendet.
4:
Schematische Darstellung eines Thrombelastogrammes.
Die
für die
beschriebenen Experimente relevanten Parameter sind CT (clotting
time, Gerinnungszeit), MCF (maximum clot firmness, maximale Thrombus
Festigkeit) und LT (lysis time, Fibrinolyse Zeit).
5:
Thrombelastogramme von Citrat-Vollblut in Ab- (A, C, E) und Anwesenheit
(B, D, F) von rekombinantem Tridegin.
Alle
Ansätze
enthalten Citrat-Vollblut (300 μl),
Ca2+ (20 μl
Starteg-Reagenz) und Thromboplastin-Phospholipid (10 μl Integ-Reagenz).
- B: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID
No.1 (10 μM)
- C: + Urokinase (25 E)
- D: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No.1 (10 μM) und Urokinase
(25 E)
- E: + tPA (40,5 ng)
- F: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No.1 (10 μM) und tPA
(40,5 ng)
6:
Thrombelastogramme von Citrat-Vollblut in Ab- (A, C, E) und Anwesenheit
(B, D, F) von SEQ ID No. 25
Alle
Ansätze
enthalten Citrat-Vollblut (300 μl),
Ca2+ (20 μl
Starteg-Reagenz) und Thromboplastin-Phospholipid (10 μl Integ-Reagenz).
- B: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID
No. 25 (20 μM)
- C: + Urokinase (25 E) + inaktives Kontroll-Peptid (Acetyl-Adhesin
(1025-1044) Amid der Fa. Bachem) (20 μM)
- D: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No. 25 (20 μM) und Urokinase
(25 E)
- E: + tPA (40,5 ng) + inaktives Kontroll-Peptid (20 μM)
- F: + Transglutaminase Inhibitor der SEQ ID No. 25 (20 μM) und tPA
(40,5 ng)
SEQ
ID Nr. 1 zeigt das Wildtyp Tridegin Polypeptid.
SEQ
ID Nr. 2 bis SEQ ID Nr. 26 zeigen je 20 Aminosäure lange Peptide von SEQ ID
No. 1.
SEQ
ID No. 27 bis SEQ ID No. 46 zeigen für die Mutangenese des Tridegin
Polypeptides verwendete Oligonukleotide.
SEQ
ID Nr. 47 zeigt ein 16 Aminosäure
langes Peptid von SEQ ID Nr. 1.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Expression
und Reinigung von rekombinantem Tridegin Polypeptid (SEQ ID NO:1)
aus Escherichia coli
Das
Expressionsplasmid pET22b-14, das die codierende Sequenz für das rekombinante
Tridegin Polypeptid enthält,
ist in 1 dargestellt. Das Plasmid wurde nach gängigen Verfahren
in den Escherichia coli-Expressionsstamm Origami® B
(DE3) (der Fa. Novagen, Best. Nr. 70837) transferiert und in LB-Flüssigmedium
mit Ampicillin (100 μg/ml),
Kanamycin und Tetracyclin (je 5 μg/ml)
kultiviert. Der Expressionsstamm BL21(DE3) (der Fa. Novagen) lieferte ähnliche
Ergebnisse und kann ebenso für
die Expression der modifizierten Tridegin Polypeptide verwendet
werden. Die Hauptkultur wurde bei 37°C und 220 rpm geschüttelt, bis
eine OD600 von 0,7 erreicht wurde. Bei einer Zelldichte von 0,7–0,9 OD600/ml
wurde die Kultur zur Induktion der Genexpression mit 2 mM IPTG/ml
versetzt und für
weitere 4h bei 37°C
bei 200–240
rpm geschüttelt.
Die Zellen wurden durch anschliessende Zentrifugation geerntet (15
min, 5825 × g).
Das Zellsediment wurde in 1:10 mit Reinst-Wasser verdünntem BugBuster
10 × Protein
Extraction Reagent (der Fa. Novagen) resuspendiert und zum Aufschluss
mit Benzonase (der Fa. Novagen) und Protease-Inhibitor-Cocktail
(Complete ohne EDTA, der Fa. Roche Diagnostics GmbH) für 10–20 min
unter Schütteln
bei 4°C
inkubiert. Durch anschließende
Zentrifugation bei 16,000 × g
für 20
min bei 4°C
wurde der Überstand
gewonnen und mit dem gleichen Volumen an Lysispuffer (50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 300
mM NaCl, 10 mM Imidazol) versetzt. Die so erhaltene Proteinsuspension
wurde bei 4°C über Nacht
gelagert. Zur Reinigung wurden 3 ml Nickel-NTA-Agarose (der Fa.
Quiagen) in eine Leer-Säule
gepackt und mit 5 Säulenvolumina
Lysispuffer equilibriert. Die Proteinsuspension wurde auf die Säule aufgetragen
(ohne Pumpe, Fluß durch
Schwerkraft) und anschließend
mit Waschpuffer (50 mM NaH2PO4 pH
8.0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) gewaschen (10 Säulenvolumina).
Die Elution erfolgte mittels Elutionspuffer (2–3 Säulenvolumina) (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl,
250 mM Imi dazol, pH 8). Fraktionen wurden gesammelt und mit SDS-PAGE
auf die Anwesenheit von Transglutaminase-Inhibitor geprüft (siehe 2).
Die Ausbeute betrug 20 mg rekombinantes Tridegin Polypeptid pro
Liter Expressionskultur bei einer Reinheit von > 90 %. Die Fraktionen, die das rekombinante
Tridegin Polypeptid enthielten, wurden vereinigt und extensiv gegen
50 mM NaH2PO4 pH
8.0, 300 mM NaCl dialysiert (2 × gegen
21). Anschließend
wurde die inhibitorische Aktivität
des gereinigten Proteins auf Faktor XIIIa getestet. Als Testverfahren
wurde der Berichrom®-Assay (der Fa. Dade Behring)
verwendet.
Durchführung des Behrichrom® Assays:
Der
Assay beruht darauf, daß Faktor
XIII durch in den Reagentien vorhandenes Thrombin zu Faktor XIIIa
aktiviert wird. Faktor XIIIa verknüpft ein spezifisches Peptidsubstrat
mit Glycinethylester unter Freisetzung von Ammonium Ionen. Diese
werden in einer parallel ablaufenden enzymatischen Reaktion bestimmt. Gemessen
wurde die Abnahme von NADH über
die Extinktion bei 340 nm.
Peptide
lagen für
die Messung in 50% Acetonitril in einer Stamm-Konzentration von
5 mM vor. Die vom Hersteller gelieferten NADH- und Nachweis-Reagentien
wurden in 3 ml Wasser, und das Aktivator-Reagenz anschließend in
3 ml NADH-Reagenz
gelöst.
Aktivator- und Nachweisreagenz wurden 1:1 zum Gebrauch gemischt.
Zur Messung im Mikrotiterplattenformat wurden 100 μl Probe (Inhibitor,
bzw. Kontrollpuffer), 25 μl
Faktor XIII (10 E/ml) und 150 μl
Gebrauchsreagenz gemischt. Die Messung erfolgte kontinuierlich über 20 min
bei 37°C
in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 340 nm. Zur Auswertung
wurden die Differenzen der Messwerte nach 16 und 20 min verglichen.
Die
Messung ergab für
den gereinigten Transglutaminase Inhibitor einen IC50 von
2–4 μM (s. 3)
Beispiel 2: Expression
und Reinigung von modifizierten Trideginen aus Escherichia coli
Modifizierte
Tridegine wurden durch gezielte Mutagenese des für das Wildtyp Tridegin Polypeptid
kodierenden Expressionsplasmides erzeugt. Die Mutagenese wurde durch
PCR mit den QuikChange Reagenzien (der Fa. Stratagene) laut Anleitung
des Herstellers durchgeführt.
Die Oligonukleotide SEQ ID Nr. 27 bis SEQ ID Nr. 40 und die jeweiligen
revers-komplementären
Sequenzen wurden für
die Mutagenese verwendet.
Die
DNA-Sequenzen der erhaltenen Mutanten wurden durch Sequenzierung überprüft. Die
jeweilige codierende Sequenz im Plasmid pET22b wurde nach gängigen Verfahren
in den Escherichia coli -Expressionsstamm Origami® B(DE3)
(der Fa. Novagen) transferiert und in LB-Flüssigmedium mit Ampicillin,
Kanamycin und Tetracyclin wie oben bereits beschrieben kultiviert.
Zusätzlich
gefundene, spontan aufgetretene Doppelmutanten wurden auch exprimiert
und gereinigt. Die Expression, Reinigung und Aktivitätsbestimmung
erfolgte wie in Beispiel 1 genannt. Folgende Aktivitäten wurden
für die
einzelnen modifizierten Tridegine gemessen (Tabelle 2). Die Bezeichnung
der modifizierten Tridegine erfolgte nach dem Schema XnY.
Dabei
bezeichnet X die Aminosäure,
die durch Mutagenese verändert
wurde, n definiert die Position dieser Aminosäure in der Polypeptidkette
und Y bezeichnet die nach der Mutagenese vorhandene Aminosäure.
Tabelle
2: Inhibitorische Wirkung modifizierten Trideginen auf den Faktor
XIIIa im Berichrom
®-Assay.
Die
relative inhibitorische Wirkung (%) wurde bei einer Endonzentration
der Variante von 5,45 μM
bestimmt. Die inhibitorische Wirkung des rekombinanten Tridegin
Polypeptides wurde auf 100 % (bei 5,45 μM) normiert.
Beispiel 3: Inhibitorische
Wirkung von Fragmenten des Tridegin Polypeptides
25
Peptide mit einer Länge
von 20 Aminosäuren
wurden auf Basis des rekombinanten Tridegin Polypeptides nach einem
gängigen
Verfahren der Peptidsynthese chemisch synthetisiert (von der Fa.
Pepscan, Lelystad, NL). Die Peptide tragen N-terminal eine Acetylgruppe und C-terminal
entsprechend eine Amidgruppe. Die Sequenzen wurden so gewählt, dass
diese
- a) die gesamte Sequenz 1 abdecken und
- b) mit jeweils in 18 Aminosäurenresten überlappen
(siehe Tabelle 3, Sequenzen 2–26).
Die
relative inhibitorische Wirkung (%) wurde mittels des oben beschriebenen
Berichrom®-Assays
bei einer Endkonzentration der Peptide von 7,27 μM bestimmt. Die inhibitorische
Wirkung des rekombinanten Tridegin Polypeptides wurde bei einer
Endkonzentration von 7,27 μM
auf 100 % normiert.
Tabelle
3: Inhibitorische Wirkung von Peptiden des rekombinanten Tridegins
auf den Faktor XIIIa im Berichrom
®-Assay.
Die
drei C-terminalen Peptide (SEQ ID NO:24, 25, 26) wurden nach HPLC
Aufreinigung nochmals getrennt auf ihre inhibitorische Wirkung auf
den Faktor XIIIa mittels Berichrom®-Assay
gemessen. Folgende IC50-Werte wurden gemessen:
- • SEQ
ID No. 24: IC50: 7 μM
- • SEQ
ID No. 25: IC50: 4 μM
- • SEQ
ID No. 26: IC50: 5 μM
Beispiel 4: Expression
und Reinigung von durch Austausch von Cystein- Resten modifizierten Trideginen aus Escherichia
coli
Diese
modifizierten Tridegine wurden durch gezielte Mutagenese der im
wildtyp Tridegin enthaltenen Cysteine erzeugt. Das Ziel dieser Mutagenese
war der schrittweise Austausch der Cysteinreste, die zur Ausbildung
von intermolekularen Disulfidbrücken
geeignet sind. Die Neigung zur Bildung von Disulfidbrücken und die
damit einhergehende Aggregation des Endproduktes wurde durch entsprechende
chromatographischen Analysen des originären Transglutaminase-Inhibitor
(SEQ ID No.1) in An- bzw. Abwesenheit von reduzierenden Agenzien
(z.B. Mercaptoethanol, DTT) nachgewiesen. So zeigte das aufgereinigte,
rekombinante Tridegin Polypeptid bei einem Gelfiltrationslauf (auf
einer HiPrep 26/60 Sephacryl-S200
HR Säule
der Fa. Amersham-Pharmacia; 20mM Natriumphosphat pH 8,0, 300mM NaCl;
1 ml/min) etwa einen Anteil von 80% multimeren, hochmolekularen
Aggregaten. Die Anteil der Aggregate war signifikant geringer (< 20 %) wenn das
rekombinante Tridegin unter reduzierenden Bedingungen in einem Gelfiltrationslauf
in 1.5 mM DTT, 20mM Natriumphosphat pH 8,0, 300mM NaCl aufgetrennt
wurde.
Die
Mutagenese wurde mit den QuikChange Reagenzien (der Fa. Stratagene)
laut Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Oligonukleotide SEQ
ID No. 41 bis SEQ ID No. 46 und die jeweiligen revers-komplementären Sequenzen
wurden für die
Mutagenese verwendet. Die DNA-Sequenzen der erhaltenen Mutanten wurden
durch Sequenzierung überprüft.
Die
jeweilige codierende Sequenz im Plasmid pET22b wurde nach gängigen Verfahren
in den Escherichia coli-Expressionsstamm Origami® B(DE3)
(der Fa. Novagen) transferiert und in LB-Flüssigmedium wie oben beschrieben
kultiviert. Die Expression, Reinigung und Aktivitätsbestimmung
erfolgte wie in Beispiel 1 genannt. Folgende inhibitorische Aktivitäten wurden
für die
einzelnen Mutanten gemessen (siehe Tabelle 4). Die Bezeichnung der
Mutanten erfolgte nach dem Schema XnY.
Dabei
bezeichnet X die Aminosäure,
die durch Mutagenese verändert
wurde, n definiert die Position dieser Aminosäure in der Polypeptidkette,
und Y bezeichnet die nach der Mutagenese vorhandene Aminosäure.
Tabelle
4: Inhibitorische Wirkung von durch Austausch von Cystein-Resten
modifizierten Trideginen auf den Faktor XIIIa im Berichom
®-Assay.
Die
relative inhibitorische Wirkung (%) wurde bei einer Endonzentration
der Variante von 5,45 μM
bestimmt. Die inhibitorische Wirkung des rekombinanten wildtyp Tridegin
Polypeptides wurde auf 100 % (bei 5,45 μM) normiert.
Beispiel 5: Verbesserung
der fibrinolytischen Aktivität
von Gewebe-Plasminogen
Aktivator (tPA) und Urokinases in Anwesenheit von rekombinantem
Tridegin oder einem Fragment von Tridegin.
Um
das therapeutische Potential der erfindungsgemäßen Polypeptide aufzuzeigen
wurde die Blutgerinnung und Fibrinolyse in Anwesenheit von rekombinantem
Tridegin Polypeptid (SEQ ID NO: 1, 5) oder einem
Fragment von Tridegin (SEQ ID NO: 25, 6) in Vollblut
gemessen. Dazu wurden sogenannte Thrombelastogramme aufgezeichnet.
Die Thrombelastographie ist ein gängiges Verfahren zur Messung
von Gerinnung und Fibrinolyse. Dabei wird die Änderung der Viskosität des Blutes
durch die Änderung
des Drehwiderstandes eines im Blut befindlichen Stempels gemessen
(Calatzis et al., 2000). Die 4 zeigt
die typischen Phasen der Gerinnung und Fibrinolyse in einem Thrombelastogramm.
Thrombelastogramme quantifizieren wichtige Parameter der Hämostase:
- • Gerinnungszeit
(Zeit zwischen Initiierung der Gerinnung bis zum Beginn einer messbaren Änderung
der Blut-Viskosität,
Clotting time, CT)
- • Stabilität des Thrombus
(Maximale Amplitude, Maximum Clot Firmness, MCF)
- • Zeit
der Fibrinolyse (Zeit zwischen dem Beginn einer messbaren Änderung
der Blut-Viskosität
und Erreichen des Ausgangswertes vor der Gerinnung, Lysis-time,
LT).
Für die dargestellten
Messungen wurde das ROTEG®-Gerät der Fa. Pentapharm GmbH,
München verwendet. 5 und 6 zeigen
die Thrombelastogramme von Citrat-Vollblut nach Zugabe von Ca2+ (Starteg-Reagenz, Fa. Pentapharm GmbH)
und Thromboplastin-Phospholipid (Integ-Reagenz, Fa. Pentapharm GmbH).
Diese Reagenzien dienen zur Induktion der Koagulation.
Um
die erfindungsgemäße synergistische
Wirkung von herkömmlichen,
in der Thrombose-Therapie verwendeten, fibrinolytischen Agenzien
mit rekombinantem Tridegin Polypeptid und modifizierten Trideginen zu
zeigen, wurden verschiedene Versuche durchgeführt. Die Thrombelastogramme
zeigen, dass das rekombinante Tridegin Polypeptid und ein modifiziertes
Tridegin die Fibrinolyse durch die als Beispiel gewählten fibrinolytischen
Agenzien Gewebe-Plasminogen Aktivator (tPA) und Urokinase beschleunigt
und verbessert. Dies wird durch
- a) die geringere
Amplitude (geringere Stabilität
des Thrombus) und
- b) die beschleunigte Fibrinolyse deutlich.
Aus
der Verlängerung
der Gerinnungszeit (CT) von 190 Sekunden in Abwesenheit eines Transglutaminase
Inhibitors zu 380 Sekunden in Anwesenheit des rekombinanten wildtyp
Tridegin Polypeptides (SEQ ID NO: 1) oder eines modifizierten Tridegins
wird außerdem
ersichtlich, dass das rekombinante Tridegin Polypeptid und ein modifiziertes
Tridegin zusätzlich
die Blutgerinnung hemmt (vgl. 5A und
B).
