KR102500796B1 - 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 케피어(Kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(Surface Layer Protein, SLP)을 함유하는 항비만용 조성물 및 기능성 식품에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 케피어 유래 유산균의 활성 성분만을 분리하여 사용하므로, 일일 섭취량이 과도하게 많고, 가공, 포장 과정에서 프로바이오틱스를 생균 상태로 유지하기 어려웠던 기존의 가공식품의 단점을 보완할 수 있는 기능성 대체 소재로서 활용이 가능하다.

Description

케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating Obesity Comprising Surface Layer Protein of Lactic Acid Bacteria from Kefir}
본 발명은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질, 세포외다당체 및 포도씨 분말을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)는 건강에 도움이 되는 장내 세균총 즉, 숙주의 건강에 이로움을 제공하는 살아있는 미생물 즉 생균류를 의미한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 요거트 등의 발효식품의 일부 또는 식이보충제로서 소비된다. 프로바이오틱스로 알려진 미생물에는 유산균(lactic acid bacteria; LAB), 비피도박테리아(bifidobacteria), 바실러스 등이 있다. 상기 프로바이오틱스 중 일부는 비만, 인슐린 저항, 비알코올성 지방간 등에 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 최근에는 프로바이오틱스가 내놓는 대사산물인 포스트바이오틱스(postbiotics)가 치료제나 질병 진단에 효율적이라는 주장이 주목받고 있다. 프로바이오틱스와 포스트바이오틱스는 장내 건강뿐 아니라 면역과 순환, 호흡, 항상성 등 다양한 인체의 활성에 관여한다는 주장이 제기되고 있지만 아직 포스트바이오틱스에 대한 연구 및 개발은 미흡한 실정이다.
예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0033433호에서는 상업용 가축 및 반려동물의 건강 및 영양을 향상시키기 위한 프리바이오틱(prebiotic), 프로바이오틱(probiotic) 및 포스트바이오틱(postbiotic) 조성물 및 이의 사용 방법에 대해서 기재하고 있지만, 포스트바이오틱 소재로 쓰인 배양 상층액은 대사부산물로 추정되는 물질을 사료 조성물에 이용한 것으로서 성장 촉진 기능성을 제외한 다른 기능성에 대한 연구는 전무하였다.
한편, 케피어(Kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 티벳지방 승려들이 건강을 위해 음용하던 것이 대중화된 음료이다. 케피어의 구성영양소로는 단백질 및 다당체가 포함되어 있고, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민B2, 비타민B6, 비타민D, 비타민K2, 엽산, 니코틴산 및 칼슘, 철분, 요오드 등을 고루 포함하고 있다. 이러한 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리는 균종(케피어 과립균이라고도 한다)을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료이다.
케피어는 유산균(Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Acetobacter, 및 Streptococcus 종), 초산균(Acetobacter 등) 및 효모(Saccharomyces, Kluyveromyces, Torula 및 Candida 종)를 포함하는 다양한 미생물을 함유하고 있다. 케피어는 항돌연변이성, 콜레스테롤 저하, 항비만성, 지방간 예방 등의 효과를 갖는 것으로 알려지고 있지만 케피어 또는 케피어 유래 유산균, 초산균, 효모 등의 활성 성분을 추출하여 보다 우수한 효능을 달성하기 위하여 연구는 부족한 상황이다.
예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-2037897호에서는 케피어 유래 유산균 및 포도씨 분말을 이용한 항비만 조성물을 기재하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-2037898호에서는 케피어 유래 유산균과 포도씨 분말을 이용한 지방간 개선용 조성물을 기재하고 있으나, 케피어 유래 유산균을 그대로 이용하고 있어 활성 성분의 활용에 대한 개선의 여지가 남아 있다. 더욱이 이와 같이 케피어 유래 유산균을 그대로 이용하는 경우에는 항비만 효능을 내기 위해 일정 균 수 이상의 섭취가 반드시 필요하며, 제조 및 보관 과정에서 균의 감소가 불가피하므로 효율 저하가 야기된다는 단점이 있었고, 프리바이오틱스인 포도씨 분말은 항비만 효능을 나타내기 위한 하루 섭취량이 지나치게 과도하다는 단점이 있었다.
본 발명의 발명자들은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 분리하여 사용할 경우 우수한 항비만 효과를 발휘할 수 있다는 것과, 이러한 세포표면단백질을 케피어 유래 유산균의 세포외다당체 및 포도씨 분말과 복합 사용할 경우 이들의 시너지 효과에 의해 소량으로도 우수한 항비만 효과를 발휘할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP), 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS), 및 포도씨 분말을 함유하는 항비만용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 포함하는 기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 케피어(Kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 또는 이들의 복합 균체인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH5 또는 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608인 것이 보다 더 바람직하다.
본 발명은 또한, 케피어(Kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP), 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(exopolysaccharide, EPS) 및 포도씨 분말을 함유하는 항비만용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질은 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608의 세포표면단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 케피어 유래 유산균의 세포외다당체는 락토바실러스 케피어리 DH5의 세포외다당체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포도씨 분말은 와인 제조 부산물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포도씨 분말은 샤르도네(Chardonnay) 품종의 포도로 제조된 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항비만용 조성물은 케퍼란 세포외다당체(exopolysaccharide kefiran)을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 케피어(Kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)을 함유하는 기능성 식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기능성 식품은 발효식품일 수 있다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 함유하는 조성물은 항비만 및 항염증 효과를 나타낸다. 본 발명의 조성물은 케피어 유래 유산균의 활성 성분만을 분리하여 사용하므로, 일일 섭취량이 과도하게 많고, 가공, 포장 과정에서 프로바이오틱스를 생균 상태로 유지하기 어려웠던 기존의 가공식품의 단점을 보완할 수 있는 기능성 대체 소재로서 활용이 가능하다.
도 1은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질의 성분을 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 통해 분석한 결과이다.
도 2는 케피어 유래 유산균의 세포외다당체의 성분을 LCMS(Liquid Chromatograph Mass Spectrometry)를 통해 분석하여 얻은 대표 단백질 ID와 그 명칭을 나타낸 것이다.
도 3은 식이 종류에 따른 실험쥐의 일일 에너지 섭취량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 식이 종류에 따른 실험쥐의 체중 증가량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 식이 종류에 따른 실험쥐의 지방 조직 무게 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 식이 종류에 따른 실험쥐의 혈장 글루코오스 농도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 식이 종류에 따른 실험쥐의 혈장 인슐린 농도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 식이 종류에 따른 실험쥐의 인슐린부하검사(ITT) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9 및 도 10는 Microarray를 통한 유전자 발현 정도의 차이를 나타낸 결과이다.
도 11 및 도 12는 Ingenuity pathway analysis(IPA) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 Real Time RT-PCR을 통해 부고환 지방 조직으로부터 8개 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이다.
도 14는 Real Time RT-PCR을 통해 간 조직으로부터 HP 유전자의 발현 정도를 측정한 결과이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 케피어(kefir) 발효유에서 새롭게 분리된 유산균의 세포 구성성분 중에서 세포표면단백질(surface layer protein, SLP)의 항비만 효능을 규명한 것으로서, 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 케피어(kefir)는 코카서스 산간 지방에서 유래한 발효유의 일종으로, 케피어는 유산균과 효모 복합체인 케피어 그레인으로 불리는 균종을 개시제로 하여 우유를 발효시켜 얻어진 요구르트상의 음료를 의미한다.
상기 케피어 유래 유산균은 생균 또는 사균의 형태일 수 있으며, 사균인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 또는 이들의 복합 균체일 수 있다.
본 발명에서는 케피어 유래 유산균의 세포 성분 중 세포표면단백질이 고지방식이로 인한 비만 개선에 우수한 효과를 나타내며, 더 나아가 면역 증강 및 항염증 활성의 측면에도 효과적이라는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 효과는 갈색지방 형성을 비롯한 지질 대사와 관련된 유전자의 발현 촉진과 전염증성 반응을 일으키는 유전자의 발현이 억제되는 것과 관계가 있음을 확인하였다.
바람직하게는, 본 발명에서 적용 가능한 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH1, 락토바실러스 케피어리 DH3, 락토바실러스 케피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609로부터 선택된 1종 이상이다. 이들은 모두 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터에서 입수할 수 있으며, 이 중 락토바실러스 케피어리 DH5는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11837P(수탁일자: 2016년 4월 29일)로 기탁되어 있고, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM12117P(수탁일자: 2017년 9월 21일)로 기탁되어 있으며, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608은 한국생명공학연구원에 수탁번호 KCTC18854P(수탁일자: 2020년 10월 16일)로 기탁되어 있다.
본 발명에서, 항비만 활성을 위하여 특히 바람직한 케피어 유래 유산균은 락토바실러스 케피어리 DH5 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608이다.
또한, 본 발명은 케피어(Kefir) 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)과, 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(exopolysaccharide, EPS) 및 포도씨 분말의 항비만에 대한 시너지 효과를 규명한 것으로서, 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)과, 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS)와, 포도씨 분말을 함유하는 항비만용 조성물에 관한 것이다.
상기 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)은 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 또는 이들의 복합 균체의 세포표면단백질일 수 있고, 바람직하게는, 락토바실러스 케피어리 DH1, 락토바실러스 케피어리 DH3, 락토바실러스 케피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 특히, 락토바실러스 케피어리 DH5의 세포표면단백질 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608의 세포표면단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608의 세포표면단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 케피어 유래 유산균의 세포외다당체는 락토바실러스 케피어리(Lactobacillus kefiri), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 또는 이들의 복합 균체의 세포외다당체일 수 있고, 바람직하게는, 락토바실러스 케피어리 DH1, 락토바실러스 케피어리 DH3, 락토바실러스 케피어리 DH5, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1607, 류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1609로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 특히, 락토바실러스 케피어리 DH5의 세포외다당체 및 류코노스톡 메센테로이데스 DH1606의 세포외다당체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는, 락토바실러스 케피어리 DH5의 세포외다당체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 락토바실러스 케피어리 DH5(수탁번호 KCCM11837P, 수탁일자: 2016년 4월 29일)의 세포외다당체와 류코노스톡 메센테로이데스 DH1604(수탁번호 KCCM12117P, 수탁일자: 2017년 9월 21일)의 세포표면단백질의 조합이 가장 우수한 시너지 효과를 발휘하여 체중 증가를 감소시킬 수 있는 활성이 매우 뛰어나다는 것을 확인하였다.
본 발명의 항비만용 조성물은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)과 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS)를 1:1 내지 1:10의 중량비로 포함할 수 있고, 바람직하게는 1:1 내지 1:3의 중량비로 포함할 수 있다.
본 발명자들은 포도씨 분말이 프로바이오틱스에서 유래한 포스트바이오틱스인 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)과 세포외다당체(EPS)의 활성에 유익한 영향을 미치는 프리바이오틱스로 작용한다는 것을 확인하였다.
본 발명에 이용되는 포도의 품종, 산지 또는 수확시기 등에는 특별한 제한은 없으나, 샤르도네(Chardonnay) 포도를 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 포도씨 분말은 포도를 재료로 하는 음료나 주류의 제조과정에서 발생되는 부산물로부터 생성될 수 있으며, 바람직하게는, 포도주 또는 와인(wine)의 제조과정에서 발생되는 부산물로부터 생성될 수 있다. 여기서 "부산물"이란 포도를 원료로 하여 파쇄 및 발효 공정을 거친 후 증류 공정에서 생성되는 와인 또는 포도주 증류액을 제외한 나머지 생성물을 총칭한다.
통상적으로, 와인 또는 포도주 제조시 발생되는 부산물들은 폐기되고 있다.그러나 이러한 폐기물은 원료 포도의 40% 정도에 이르러 경제적으로 큰 손실이 아닐 수 없다. 본 발명에 따르면, 와인 제조시 발생되는 부산물을 프리바이오틱스로 활용할 수 있기 때문에, 환경적, 경제적으로도 큰 이점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 "포도씨 분말"(Grape seed flour, GSF)은 와인을 생산하고 남은 부산물로부터 포도씨를 분리, 건조한 뒤, "냉각프레스", "열프레스" 기법 등을 이용하여 포도씨로부터 오일을 추출한 다음, 가루로 분쇄함으로써 생성될 수 있다. 포도씨 분말의 분리, 건조, 압축, 분쇄 방법은 종래 알려진 기술들에 의해 다양한 형태로 수행될 수 있다.
포도씨 분말의 입자 크기는 분쇄 환경에 따라 다양하게 조절할 수 있으며, 더 작은 입자를 가진 분말을 생성하기 위해 체로 거르는 작업을 추가할 수 있다.
포도씨 분말의 입자 크기는 식품, 의약품 등 활용 용도와 목적에 맞게 조절 가능하다.
본 발명에서는 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)과, 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS)와, 포도씨 분말을 복합 섭취하는 경우 소량으로도 고지방식이로 인한 비만 개선에 우수한 효과를 나타내며, 더 나아가 면역 증강 및 항염증 활성의 측면에도 효과적이라는 것을 발견하였다. 특히, 이들은 함께 섭취되었을 때 시너지 효과를 발휘하여 이들을 각각 섭취하였을 경우로부터 예측하기 어려운 현저한 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명의 항비만용 조성물에 있어서, 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)과 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS)의 합계 함유량은 포도씨 분말의 함유량에 대하여 0.1 내지 10중량%일 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 5중량%일 수 있다.
본 발명에 따른 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 함유하는 조성물은 항비만용 기능성 식품으로 적용될 수 있다.
상기 기능성 식품은 발효식품인 것이 바람직하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어서, 상기 기능성 식품은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류일 수 있으며, 더욱 자세히는, 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 젤리류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방 제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 차, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체 음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 케이크, 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균 중 하나 이상의 세포표면단백질을 포함하는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등의 제형으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 기능성 식품은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질 외에도 유효성분으로서 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 과일주스나 야채 음료 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질은 또한, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질을 유효성분으로서 함유하며, 통상의 방법에 따른 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)]에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리 식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 지식을 가진 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실험예 1: 케피어 유래 유산균의 대량 배양
아래 표 1에 나열한 케피어 유래 유산균 균주 3종을 각각 MRS(man Rogosa Sharpe) agar에 도말하여(spreading) 48시간 동안 배양하였다. 이후 10ml의 MRS broth에 옮겨 48시간 동안 120rpm으로 진탕하여(shaking) 배양하였다. 이후 500ml의 MRS broth에 옮겨 48시간 동안 120rpm으로 진탕하여 대량 배양하였다. 이 때, 락토바실러스 케피어리는 37℃의 온도에서, 류코노스톡 메센테로이데스는 30℃의 온도에서 배양하였다.
균주 단축명 출처
락토바실러스 케피어리 DH5 DH5 건국대학교 수의학대학 식품안전연구센터
류코노스톡 메센테로이데스 DH1606 LCM6
류코노스톡 메센테로이데스 DH1608 LCM8
실험예 2: 케피어 유래 유산균으로부터 세포외다당체(EPS) 추출 및 성분 분석
실험예 1에서 대량 배양한 유산균 중 DH5 및 LCM6 각각에 80%의 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)를 첨가하여 최종 농도 17.5%가 되도록 하였다. 이후 진탕 배양기(shaking incubator)에서 30분간 반응시킨 다음 8,000×g의 속도로 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 이 중 상층액을 분리하여 2배 부피의 에탄올(99.9%)과 혼합하고, 이를 냉장고에 넣어 24시간 방치하였다. 이 과정을 2회 반복하고, 상층의 에탄올을 버린 후, 침전물을 얻었다.
이후 침전물을 코니칼 튜브(conical tube)에 소분하여 8,000×g의 속도로 4℃의 온도에서 20분간 원심분리하였다. 이후 상층액을 버리고 난 침전물을 3차 증류수와 섞어 Spectra/Por 4 RC dialysis membrane에 담고 3차 증류수에 48시간 투석을 진행하였다. 투석이 끝난 세포외다당체를 50ml 코니칼 튜브에 옮겨 닮고 초저온 냉장고(deep freezer)에서 -80℃의 온도로 24시간 동안 보관하였다. 이후 동결건조하여 분말화하여 DH5 및 LCM6의 세포외다당체(EPS)를 얻었다.
이후 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 통해 DH5 및 LCM6의 EPS의 성분을 분석하였으며, 그 결과를 각각 도 1의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
도 1을 통해, DH5 및 LCM6의 EPS를 구성하는 당의 주요 성분은 마노스(mannose), 글루코스(glucose), 갈락토오스(galactose), 아라비노오스(arabinose) 및 푸코스(fucose)인 것을 알 수 있다.
실험예 3: 케피어 유래 유산균으로부터 세포표면단백질(SLP) 추출 및 성분 분석
실험예 1에서 대량 배양한 유산균 중 DH5 및 LCM8 각각을 500ml의 원심분리용 병(centrifuge bottle)에 250ml씩 소분하여 10,000×g의 속도로 4℃의 온도에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 난 침전물에 1X PBS(pH 7.2)를 넣어 현탁시켰다. 이후 다시 10,000×g의 속도로 4℃의 온도에서 10분간 원심분리하였다.
이후 상층액을 버리고 난 침전물에 5M LiCl을 병 당 150ml 넣고 볼텡싱(vortexing)하고, 쉐이커(shaker)에서 200rpm의 속도로 1시간 반응시켰다.
이후 50ml 코니칼 튜브에 소분하여 16,000×g의 속도로 4℃의 온도에서 30분간 원심분리하였다. 상층액만 모은 후, 0.45μm의 셀룰로오스 에스테르 멤브레인(cellulose ester membrane)을 이용하여 감압여과하여 멸균한 플라스크에 모았다.
여과물을 Spectra/Por 4 RC dialysis membrane에 담고, 1X PBS와 0.05% tween-20 혼합액에 24시간 투석을 진행하였다. 투석 후 50ml의 코니칼 튜브에 소분하여 초저온 냉장고에서 -80℃의 온도로 24시간 동안 보관하였다. 이후 동결건조하여 분말화하여 DH5 및 LCM8의 세포표면단백질(SLP)을 얻었다.
이후 LCMS(Liquid Chromatograph Mass Spectrometry)를 통해 LCM8의 SLP의 성분을 분석하였으며, 그 결과로서 얻은 대표 단백질 ID와 그 명칭을 도 2에 나타내었다.
도 2를 통해, LCM8의 SLP에 가장 많이 존재하는 단백질은 항염증 대사작용과 밀접한 관련이 있는 transcriptional regulator with CBS domains인 것을 알 수 있다.
실험예 4: 식이에 따른 실험쥐의 체중 변화 분석
C57BL/6 실험쥐를 11개 그룹으로 나누어 아래 표 2에 나타낸 식이를 7주간 제공하였다.
표 2에서 BW는 Body weight를 나타내며, 포도씨 분말의 함량은 고지방식이 총 중량에 대한 비율(중량%)이다. 포도씨 분말은 샤르도네(Chardonnay) 포도씨 가루를 사용하였다.
그룹 No. 식이 종류
1 정상식이(chow diet)
2 고지방식이(high-fat diet, HF)
3 DH5의 EPS(250mg/Kg BW) 함유 고지방식이
4 LCM6의 EPS(250 mg/Kg BW) 함유 고지방식이
5 DH5의 SLP(120mg/Kg BW) 함유 고지방식이
6 LCM8의 SLP(120mg/Kg BW) 함유 고지방식이
7 DH5의 EPS(62.5mg/Kg BW), DH5의 SLP(30mg/Kg BW) 및 포도씨 분말(0.5%) 함유 고지방식이
8 LCM6의 EPS(62.5mg/Kg BW), LCM8의 SLP(30mg/Kg BW) 및 포도씨 분말(0.5%) 함유 고지방식이
9 DH5의 EPS(62.5mg/Kg BW), LCM8의 SLP(30mg/Kg BW) 및 포도씨 분말(0.5%) 함유 고지방식이
10 LCM8의 EPS(62.5mg/Kg BW), DH5의 SLP(30mg/Kg BW) 및 포도씨 분말(0.5%) 함유 고지방식이
11 포도씨 분말(2%) 함유 고지방식이
도 3은 식이 종류에 따른 실험쥐의 일일 에너지 섭취량(kcal)을 나타내며, 도 4는 식이 종류에 따른 실험쥐의 체중 증가량(g)을 나타낸다.
도 3에서 일일 에너지 섭취량은 고지방식이를 섭취한 실험군(그룹 2 내지 그룹 11) 사이에 유의적인 차이가 없었음에도 불구하고, 도 4에서 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 섭취한 그룹 5 및 6은 유의적으로 낮은 체중 증가(대조군인 그룹 2 대비 체중 증가량이 20% 이상 감소)를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP), 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS) 및 포도씨 분말을 복합 섭취한 그룹 7 내지 10의 결과를 비교하면, DH5의 EPS 및 DH5의 SLP를 포도씨 분말과 함께 섭취한 그룹 7의 경우 DH5의 SLP만 섭취한 그룹 5보다 더 적은 체중 감소를 나타낸 반면, DH5의 EPS 및 LCM8의 SLP를 포도씨 분말과 함께 섭취한 그룹 9의 경우 모든 그룹 중 가장 큰 체중 감소(대조군인 그룹 2 대비 체중 증가량이 약 28% 감소)를 나타내어, 비만에 대한 시너지 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 식이에 따른 실험쥐의 지방 조직 무게 변화 분석
도 5는 식이 종류에 따른 실험쥐의 지방 조직의 무게 변화량(g)을 나타낸다.
총 에너지 섭취량은 고지방식이를 섭취한 실험군(그룹 2 내지 그룹 11) 사이에 유의적인 차이가 없었음에도 불구하고, 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 섭취한 그룹 5 및 6은 유의적으로 낮은 지방 조직 무게 변화량을 나타냈으며, 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP), 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS), 및 포도씨 분말을 복합 섭취한 그룹 8 내지 10 또한 유의적으로 낮은 지방 조직 무게 변화량을 나타냈다.
실험예 6: 생화학적 검사
실험예 4에서 7주간 식이를 섭취한 실험쥐의 혈액으로부터 생화학자동분석기(7020, HITACHI, JAPAN)를 이용하여 혈장 글루코오스 농도(mg/dL) 및 혈장 인슐린 농도(mg/dL)에 대한 시험을 수행하였고, 그 결과를 도 6 및 7에 각각 나타내었다.
도 6에서, 혈장 글루코오스 농도는 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)을 섭취한 그룹 5 내지 10에서 더 낮은 수치가 나타났으며, 특히, DH5의 EPS 및 LCM8의 SLP를 복합 섭취한 그룹 9에서 가장 낮은 수치를 나타내었다.
도 7의 혈장 인슐린 농도의 결과도 도 6과 유사한 경향을 나타내었다.
실험예 7: 인슐린부하검사(ITT)
실험예 4의 실험 종료 전 각 그룹마다 실험쥐 5~6마리를 선별하여 5~7시간 절식시킨 후, 인슐린(0.5 U/kg)을 복강 주사하였다. 혈당 수치(mg/dL)는 인슐린 투여 후 0, 15, 30, 60 및 90분 후에 꼬리 정맥에서 채혈하여 측정하였으며, 그 결과를 각각 도 8에 나타내었다.
도 8에서, LCM8의 SLP 단독 섭취(그룹6) 혹은 EPS와 SLP를 포도씨 분말과 함께 섭취한 그룹 8, 9 및 10에서 ITT의 AUC(Area Under Curve) 값이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다. 비만의 경우 인슐린 저항성이 증가하여 인슐린에 대한 반응이 감소하므로 인슐린 투여 후 전반적인 혈당수치가 높게 유지되어 AUC 값은 정상보다 더 크다. 도 8에서 AUC 값이 감소한 그룹은 인슐린에 의한 혈당 조절이 잘 이루어졌다는 것을 뜻하므로 그룹 6, 8, 9 및 10에서 인슐린에 대한 반응이 향상되었음을 나타낸다.
실험예 8: 부고환 지방조직에서 microarray 분석에 의한 gene profiling
실험예 4의 실험 종료 후 그룹 2, 그룹 6 및 그룹 9의 실험쥐의 부고환 조직에서 RNA를 분리한 후 Agilent microarray chip을 사용하여 microarray 분석을 실시하였다. 그룹 6와 대조군인 그룹 2의 유전자 발현 정도의 차이를 도 9에 나타내었으며, 그룹 9와 대조군인 그룹 2의 유전자 발현 정도의 차이를 도 10에 나타내었다.
또한, Ingenuity pathway analysis(IPA)를 통해 유의적인 경로(pathway)를 각각 도 11 및 12에 나타내었다. 구체적으로 도 11은 대조군인 그룹 2에 비해 그룹 6의 부고환 지방 조직에서 나타난 주요 5개의 생화학적 기능과 표준 및 관련 대사 경로를 나타낸 것이고, 도 12는 대조군인 그룹 2에 비해 그룹 9의 부고환 지방 조직에서 나타난 주요 5개의 생화학적 기능과 표준 및 관련 대사 경로를 나타낸 것이다.
도 9 및 도 10를 통해, 그룹 6 및 그룹 9는 대조군인 그룹 2와 비교하여, Ebf2, Cfd 유전자의 발현이 증가되고, Dock8, Ubd 등의 유전자의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있다. Ebf2는 백색 지방으로부터 갈색 지방이 형성되도록 하는 유전자이고, Cfd는 염증 및 면역 반응과 관련된 유전자로서 비만일 경우 감소하는 경향을 보인다. 또한, Dock8은 B 세포의 면역 시냅스 형성과 관련된 유전자이고, Ubd는 염증 반응을 촉진하고 지방 대사가 억제되도록 하는 유전자이다. 이 결과는 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)의 섭취, 또는 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP), 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS) 및 포도씨 분말의 복합 섭취가 비만을 억제하고, 면역 및 염증 반응을 개선하는 데에 효과적이라는 것을 의미한다.
도 11 및 도 12의 Ingenuity pathway analysis(IPA) 분석 결과 또한 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP)의 섭취, 또는 케피어 유래 유산균의 세포표면단백질(SLP), 케피어 유래 유산균의 세포외다당체(EPS) 및 포도씨 분말의 복합 섭취가 면역 및 염증 반응의 개선, 대사성 질환 방지와 유의미하게 관련되어 있음을 나타낸다.
실험예 9: Real time RT-PCR을 통한 지방 조직 및 간 조직의 유전자 발현 측정
Real time RT-PCR에 필요한 cRNA를 합성하기 위하여, 실험예 4의 실험 종료 후 그룹 2, 그룹 6 및 그룹 9의 실험쥐의 부고환 지방 조직과 그룹 2, 그룹 3, 그룹 5, 그룹 6, 그룹 8, 그룹 9 및 그룹 10의 실험쥐의 간 조직으로부터 RNA를 분리하여 250ng/㎕로 농도를 맞추었다. Takara Prime Script reagent kit의 5X Prime script buffer 2㎕, PrimeScript RT enzyme mix 0.5㎕, Oligo dT Primer(50μM) 0.5㎕, Random 6 mers(100μM) 0.5㎕를 섞고 RNA와 RNase free water를 첨가하여 각 샘플마다 최종 10㎕의 혼합물을 만들었다.
이후 Real Time RT-PCR에서 지방 조직을 이용해 실험예 8의 Microarray 분석 결과 유의미했던 유전자 중 다음의 8개 유전자(Acsm3, Atp6v0d2, Cfd, Dock8, Ebf2, Mrc2, Trem2, Ubd) 발현량을 측정하여 그 결과를 도 13에 나타내었고, 또한 간 조직을 이용해 HP 유전자의 발현량을 측정하여 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 13를 통해 지방 조직에서 시험한 모든 유전자의 발현량이 실험예 8에서의 Microarray 분석 결과와 일치하는 경향을 보인다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 14을 통해 간 조직에서 장 투과성과 관련된 HP 유전자의 발현량이 특히 그룹 9에서 현저히 감소하였다는 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. 케피어(Kefir) 유래 유산균인 류코노스톡 메센테로이데스 LCM8(Leuconostoc mesenteroides LCM8, 기탁번호: KCTC18854P)의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP), 락토바실러스 케피어리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5, 기탁번호: KCCM11837P)의 세포외다당체 (exopolysaccharide, EPS) 및 포도씨 분말을 유효성분으로 포함하는, 비만 개선용 기능성 식품 조성물.
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  5. 케피어(Kefir) 유래 유산균인 류코노스톡 메센테로이데스 LCM8(Leuconostoc mesenteroides LCM8, 기탁번호: KCTC18854P)의 세포표면단백질(surface layer protein, SLP), 락토바실러스 케피어리 DH5(Lactobacillus kefiri DH5, 기탁번호: KCCM11837P)의 세포외다당체 (exopolysaccharide, EPS) 및 포도씨 분말을 포함하는, 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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