KR102366276B1

KR102366276B1 - 미세먼지에 의한 세포독성으로부터 피부를 보호하기 위한 피부보호용 조성물

Info

Publication number: KR102366276B1
Application number: KR1020200030890A
Authority: KR
Inventors: 곽태일; 김광일; 김준혁; 박현철; 최재혁
Original assignee: 주식회사 팜스킨
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2022-02-23
Also published as: KR20210115310A

Abstract

본 발명은 미세먼지에 의한 세포독성으로부터 피부를 보호하기 위한 피부호보용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서 중금속으로 오염된 공기나 또는 중금속 함유 미세먼지, 초미세먼지 등의 미세먼지로부터 피부를 보호하고 피부질환을 예방할 수 있는 피부보호용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 피부보호용 조성물은 중금속을 함유하는 미세먼지로 인한 피부의 중금속 세포독성으로 인하여 발생하는 피부손상이나 암 발생으로부터 보호하는데 우수한 효능을 제공하므로, 피부미용 증진용 조성물, 화장료 조성물, 외피용 약학적 조성물, 피부세정제 등으로 유용하다.

Description

미세먼지에 의한 세포독성으로부터 피부를 보호하기 위한 피부보호용 조성물 {Skin protection composition for protecting skin from cytotoxicity caused by fine dust}

본 발명은 미세먼지에 의한 세포독성으로부터 피부를 보호하기 위한 피부보호용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서 중금속으로 오염된 공기 또는 중금속 함유 미세먼지, 초미세먼지 등의 미세먼지로 인한 세포독성과 암 발생 등으로부터 인체를 보호하고 질환을 예방할 수 있는 피부보호용 조성물에 관한 것이다.

최근 중국, 몽골 등에서 유입되는 미세먼지 농도가 증가하고 있어 피부건강에 대한 우려가 커지고 있다. 봄철의 황사, 중국의 매연, 자동차의 배기가스, 노후 화력발전소 등의 영향으로 한반도의 미세먼지 농도가 증가하고 있다. 따라서 소비자들은 다른 어떤 이슈보다 피부에 직접 와 닿는 문제로 관심이 부각되고 있다.

특히, 피부 자극의 원인이 되는 미세먼지(Particulate Matter; PM)는 입자의 크기에 따라 지름이 10㎛이하인 PM10과 지름이 2.5㎛이하인 초미세먼지 PM2.5로 분류된다. 이들 PM은 대기 오염 물질들 가운데에서도 독성이 가장 강력하다. 이들 PM의 크기, 구조 및 구성 성분에 따라 독성이 달라진다. PM을 구성하는 독성 물질(toxic hitch hiker)은 비소, 납, 카드뮴과 같은 중금속이나 연소 과정에서 생산된 황산 혹은 다환 방향족 탄화수소(sulfuric acid or polycyclic aromatic hydrocarbons) 같은 물질이 있다. 다환 방향족 탄화수소는 여러 개의 벤젠고리로 연결된 화합물로 발암성과 돌연변이성을 가진 물질로 잘 알려져 있다.

프로스타글란딘(prostaglandin, PG)은 염증 전달, 세포부착, 및 면역감시 체계 유지 등의 생리적 역할을 통해 세포 분열이나 증식에 영향을 미침으로써 위암, 유방암, 폐암 등 각종 인체 암의 발생 및 진행에 관여한다고 보고되고 있다(Bennett A. Prog Lipid Res., 25: 539-542(1986), Marnett LJ. Cancer Res., 52: 6675-5589(1992)). 특히, 프로스타글란딘 E2 (PGE2)는 각종 암 조직에서 비정상적으로 증가 되어 있다는 보고가 있다. 발암모델에서 마우스 피부에 발암물질인 7,12-dimethylbenz [a]anthracence을 국소적으로 처리하여 유발된 암에서 대량의 PGE2와 PGF2 가 관찰된다(Miyauchi-Hashimoto H. et al., J Immunol,. 166: 5782-5791(2001)).

그러나 이러한 대기 환경의 오염물질이나 중금속 함유 공기 등 미세먼지로부터 피부를 보호할만한 특별한 성분을 찾아보기 어렵다.

젖소의 초유(어미소가 출산한 직후부터 72시간 이내에 수거된 우유)에는 면역글로불린, 성장인자, 락토페린, 라이소자임(lysozyme) 및 면역체계를 강화하는 PRP (proline-rich polypeptide), 세포재생을 도와주는 EGF (epithelial growth factor), PDGF (platelet derived growth factor) 등 생명유지에 필수적인 50여 가지 생리활성 성분이 함유되어 있으며 여기에는 Cysteine, Glutamic acid, Lysine, Leucine, Proline외 12종류의 아미노산도 포함하고 있다(정석근 외. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 29(4): 457-467(2009)).

한국등록특허 제10-0964831호에서는 초유를 유효성분을 함유하는 피부 각질분화 촉진용 화장료 조성물이 제안되어 있는데, 여기서는 초유 성분이 항염, 항알러지, 보습 효과에 대해 설명하고 있는 등 초유 성분의 피부 각질분화 촉진 효능을 비롯한 화장품 적용의 다양한 유용성에 대해 설명하고 있다. 또한, 한국공개특허 제10-2018-0108504호에서는 초유의 특정 유산균 발효산물이 피부자극완화용 화장료 조성물로 적용되는 기술을 제안하고 있으며, 한국등록특허 제10-1974405호에서는 알칼리 단백분해효소를 처리하여 가수분해율이 40~50%인 초유 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 각질형성세포 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물에 관하여 제안하고 있다.

그러나 지금까지 초유 관련 화장료 조성물은 일반적인 피부 트러블에 의한 피부 자극이나 일반적인 환경에 대한 항노화를 위한 화장료 조성물, 피부 재생 등의 용도로 사용되고 있는 정도이지, 최근 크게 문제가 되고 있는 중금속 등을 함유하는 미세먼지에 대한 세포보호 효과는 기대하기 어려웠다.

특히, 종래 미세먼지 등 오염물질에 대한 피부 손상 방지를 위한 조성물로서, 한국등록특허 제10-2065171호에서는 특정 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 알려져 있다.

그러나 이러한 펩타이드는 역시 다이옥신이나 담배연기 등으로부터 피부 자극을 보호하는 것에 기전을 두고 있으며, 기존의 화장료 조성물로서의 피부 노화방지 등의 효과에 기인한 것으로 특정 펩타이드를 제시하는 기술이므로, 중금속 함유 미세먼지 등의 피부독성에 대한 피부 보호는 기대하기 어려워서 그 효과가 매우 제한적인 문제가 있다.

이와 같이, 종래에는 미세먼지 등에 공기 중에 함유된 중금속이나 초미세먼지 등으로부터 피부보호를 위한 조성물이 제대로 제안되어 있지 않아서, 최근 급속하게 증가하는 중금속 함유 미세먼지나 초미세먼지로부터 피부보호를 위한 조성물의 개발이 매우 절실한 실정이다.

본 발명은 이러한 종래기술에서 제대로 해결하지 못했던 중금속 환경이나 초미세먼지 등 미세먼지의 오염으로 인해 야기되는 피부의 여러 문제로부터 피부를 보호하는 것을 해결과제로 한다.

이에, 본 발명자들은 중금속이 함유된 미세먼지 또는 초미세먼지 등에 의해 발생하는 피부의 세포독성 문제로부터 효과적으로 차단하고 피부를 보호할 수 있는 물질에 대해 지속적으로 연구 개발한 결과, 초유 발효산물이 중금속이나 초미세먼지 등으로부터 야기되는 세포독성이나 암 유발로부터 피부를 보호할 수 있는 효과가 있다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 중금속 함유 미세먼지로부터 야기되는 피부의 세포 독성에 대한 피부보호 효과를 가지는 피부보호용 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 초유 발효산물의 새로운 용도를 제공하는데 있다.

상기와 같은 본 발명의 과제 해결을 위하여, 본 발명은 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는 중금속 함유 미세먼지에 의한 세포독성으로부터 피부를 보호하기 위한 피부보호용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피부보호용 조성물을 함유하는 피부미용 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피부보호용 조성물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피부보호용 조성물을 함유하는 미세먼지로 인한 피부암 예방 및 치료를 위한 외피용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 피부보호용 조성물을 함유하는 피부세정제를 제공한다.

본 발명에서 따른 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는 피부보호용 조성물은 중금속 함유 미세먼지에 의한 피부독성으로부터 피부를 보호할 수 있다.

따라서 본 발명의 초유 발효산물을 포함하는 피부보호용 조성물은 미세먼지나 초미세먼지 등에 함유된 중금속으로부터 발생되는 피부독성으로 인한 피부손상을 방지할 수 있으므로, 피부에 적용되는 화장료 조성물이나, 외용 약학적 조성물 또는 피부세정제 등으로 매우 유용하다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 중금속 함유 미세먼지에 의해 야기되는 피부의 중금속 세포독성 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 초유 발효산물이 중금속 함유 미세먼지에 함유된 중금속으로부터 피부 세포를 보호하는 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 초유 발효산물이 중금속 함유 미세먼지에 대한 Prostaglandin E2 (PEG2) 감소 효과가 있음을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 초유 발효산물과 대조군에 대한 세포독성 실험 결과를 비교하여 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 하나의 구현예로서 상세하게 설명하고, 또한 실시예, 실험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다.

그러나 본 발명에 따른 바람직한 구현예나 실시예 또는 실험예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 예들에 한정되는 것으로 해석되지 않아야 한다.

본 발명에 따른 실시예 및 실험예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공하는 것에 불과하므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본 발명은 초유의 발효산물을 단순한 화장료로 활용하여 피부의 트러블이나 각질화 등의 부분을 개선하기 위한 것이 아니라, 특히 중금속 함유 미세먼지에 의해 발생하는 중금속에 의한 피부독성으로부터 피부의 손상을 보호하기 위한 용도로 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명에서 ‘미세먼지’라 함은 중금속을 함유하는 미세먼지, 초미세먼지, 오염된 공기, 폐가스 등을 포함하며, 이를 포괄하는 표현으로 중금속에 의해 피부 독성을 야기하는 물질이 함유된 미세먼지를 의미하는 것으로서, 전형적으로는 중금속을 함유하는 미세먼지를 의미한다. 본 발명에서 말하는 미세먼지의 크기는 통상적으로는 입자직경의 크기가 90 μm이하인 먼지를 의미한다.

본 발명에서 ‘미세먼지’는 도로먼지 또는 대기의 먼지로써 이에 함유된 유해성분으로 중금속 등을 포함하며, 여기서 ‘중금속’은 백금(Pt), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 알루미늄(Al), 바륨(Ba), 카드뮴(Cd), 코발트(Co), 크롬(Cr), 철(Fe), 하프늄(Hf), 망가니즈(Mn), 몰리브데넘(Mo), 니켈(Ni), 납(Pb), 루비듐(Rb), 안티몬(Sb), 스트론튬(Sr), 티탄(Ti), 토륨(Th), 바나듐(V), 이트륨(Y), 아연(Zn) 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 ‘세포독성’이라 함은 각질세포 등의 피부손상, 카드뮴, 비소, 납, 니켈 등의 상기 열거한 중금속으로 인한 각종 암 발생, 그리고 중금속이나 유해성분 흡수로 인한 피부 알레르기, 편평상피세포암 등과 같은 질병의 발생 등을 포함하는 것이다.

본 발명에서 사용된 초유 발효산물은 바람직하게는 초유를 유산균으로 발효하여 얻은 초유 발효산물을 사용할 수 있다.

본 발명에서 초유는 통상적으로 포유동물, 예컨대 모유, 젖소, 양, 염소, 말, 산양 등으로부터 채취된 초유로서, 산후 7주일 이내, 더욱 바람직하게는 4일 이내에 채취된 초유를 의미한다. 초유는 금속 냉각 후 살균 처리하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 초유의 발효에 적용되는 균으로서는 바람직하게는 단일 유산균, 또는 복합 유산균이 사용 가능한데, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 균과 스트렙토코커스 균의 복합균을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 발효에 사용 가능한 균을 구체적으로 예시하면, 예컨대 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei subsp. casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum) 중에서 선택된 하나 이상이 바람직하게 사용될 수 있다.

예를 들어, 바람직한 예로써 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 등 상기 3종의 균을 함께 사용하는 경우에는 더욱 증진된 상승효과를 나타낼 수 있다.

특히, 본 발명에 따르면 상기 발효는 혐기성 조건보다는 세포독성의 보호를 위한 활성 조건을 충족하기 위하여 호기적 조건에서 발효를 수행하는 것이 월등하게 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 발효 원료인 저온 살균한 초유에 발효균을 접종하고 온도 15-50℃에서 30~120분간 발효시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 호기성 발효 과정을 거친 다음에는 이를 원심분리하여 발효액을 얻는 단계를 거쳐서 초유의 호기성 발효산물을 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명이 초유의 호기성 발효산물은 카세인이 제거된 것일 수 있다.

따라서 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유 발효산물은 바람직하게도 추가적으로 상기 발효액을 효소를 이용하여 발효추출물을 얻는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면 상기 발효액을 효소를 이용하여 발효추출물을 얻는 단계는 예컨대, 호기성 발효과정을 거친 초유 발효액을 정제하기 위한 응집과정을 거치는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 초유의 발효산물은 카세인이 제거된 것이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 초유의 발효산물은 초유를 발효시킨 후 얻어지는 다양한 형태의 산물을 포함할 수 있다. 바람직하게는 초유를 발효한 후 원심분리하여 얻은 상층액을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 카세인 제거를 위해 상기 상층액에 추가적으로 렌넷(Rennet)을 가하여 침전을 형성한 응집물이나, 이 응집물을 원심분리하여 얻은 발효추출물 또는 그 여과물을 발효산물로 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시에에 따르면, 상기 초유 발효산물은 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)와 락토바실러스(Lactobacillus)로 초유를 발효하여 얻은 용해물을 여과한 락토바실러스 스트렙토코커스 써모필러스 초유 발효 용해 여과물을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 초유의 발효산물은 중금속이 함유된 미세먼지 등의 피부 접촉시 피부보호용으로 적용할 수 있다. in vivo에서 중금속이 들어오게 되면 바로 배출되지 않고 단백질과 결합하여 간장과 신장에서 metallothionein 단백질의 합성이 증가된다. 이 단백질은 thiolate와 결합하여 중금속-단백질 복합체를 형성함으로써 중금속의 독성이 소멸하게 된다. 그러나 metallothionein의 수용체가 포화될 체내에 중금속 축적이 일어나 독성이 발현되게 된다. in vitro에서 시스테인 함량이 높은 metallothionein은 Cd 같은 중금속과 결합하여 칼슘 항상성에 영향을 미치는 Ca-ATPase의 활성을 회보시켜 세포독성 방어 역할을 한다고 발표하였다(최임순 외. Korean J. Zool. 36: 529-534(1993)). 특히 초유에 있는 시스테인 같은 아미노산은 thiol(-SH) 작용기를 가지고 있어 중금속과 강한 결합체를 형성할 수 있다. 따라서 초유의 풍부한 단백질과 시스테인 같은 아미노산과 중금속의 결합으로 인해 중금속이 피부세포에 대한 독성 및 피부암을 저해하여 억제한다.

미세먼지에 함유된 중금속 등 유해성분은 백금(Pt), 로듐(Rh), 팔라듐(Pd), 알루미늄(Al), 바륨(Ba), 카드뮴(Cd), 코발트(Co), 크롬(Cr), 철(Fe), 하프늄(Hf), 망가니즈(Mn), 몰리브데넘(Mo), 니켈(Ni), 납(Pb), 루비듐(Rb), 안티몬(Sb), 스트론튬(Sr), 티탄(Ti), 토륨(Th), 바나듐(V), 이트륨(Y), 아연(Zn) 등과 같은 중금속이나 화석연료의 연소 과정에서 생산된 황산 혹은 다환 방향족 탄화수소 등이다. 이들 가운데 국제암연구소(IARC)가 인체 발암물질 1군으로 분류한 카드뮴, 비소, 납, 니켈 등에 의해 세포독성을 나타내고 피부암 발생의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

실제로 미세먼지에 함유된 중금속이 DNA 복구를 저해함으로써 암이 발생하는 것으로 연구된 바 있다(Asmuss M. et al., Carcinogenesis, 21: 2097-2104(2000)). 그러므로 이러한 본 발명의 초유 발효산물을 함유하는 피부보호용 조성물은 중금속함유 미세먼지를 피부로부터 원천적으로 차단하거나 단백질 결합으로 중금속의 피부독성이나 피부암 유발로부터 피부를 보호함으로서 사전에 예방할 수 있다.

본 발명에 따르면, 이러한 미세먼지에 함유된 중금속에 의한 피부 세포독성으로 인해 나타나는 병변으로는 대표적으로 피부암을 들 수 있으며, 그 외에도 접촉성 피부염, 피부 발진, 홍반성, 소포성 등의 질병이 발생할 수 있다. 그러므로 본 발명에서는 미세먼지에 함유된 중금속이 피부에 축적되어 발생하는 질병으로부터 보호하기 위해서 초유 발효산물을 피부보호용 조성물로 이용할 수 있는 것이다.

여기서 피부암은 악성피부질환들을 모두 총칭하는 말로서, 기저세포암, 흑색종, 카포시육종, 편평세포암 등등 여러 종류가 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 초유의 발효산물을 전체적인 피부보호용 조성물에 1-30중량%, 바람직하게는 1-20중량%로 사용할 수 있다. 다른 예로서는 피부외용제, 예컨대 화장료 조성물이나 외용제, 약학적 조성물 등으로 사용하는 경우 1-5중량%로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 이러한 조성물은 피부에 적용하는 피부세정제, 전형적으로는 세안제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면 상기와 같은 피부보호용 조성물을 화장료 조성물이나 피부미용 증진용 조성물로 사용하는 경우 크림 등으로 제형화하여 사용 가능하며, 보습용, 미백용, 주름개선용 또는 자외선차단용의 화장료 조성물로 적용하여 피부보호용으로 사용이 가능하다.

또한, 본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 상기 초유의 발효산물로 얻어지는 조성물은 식품조성물로 적용될 수 있다.

또한, 본 발명이 바람직한 구현예에 따르면, 상기 초유의 발효산물로 얻어지는 조성물은 외피용 약학적 조성물로 적용될 수 있다. 예컨대, 연고, 크림, 패취 형태로 적용될 수 있다.

본 발명의 초유 발효산물을 유효성분으로 하는 피부 적용 조성물은 구체적으로는 1-500mg/ml로 피부에 수회 도포하여 적용할 수 있다.

이러한 형태는 피부에 적용하는 화장품으로 제조하여 적용하는 경우에도 역시 1-500mg/ml로 구성하여 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 더욱 바람직하게는 10-400mg/ml로 적용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는 보습용 화장료 조성물을 이용한 화장품이나, 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는 피부미용 증진용 조성물 또는 피부연고제는 상기 함량 범위 내에서 예컨대 50mg/ml, 100mg/ml, 200mg/ml, 400mg/ml로 등의 다양한 함량으로 제조하여 바람직하게는 1일 1-5회 피부에 도포하여 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 건강식품이나 약학적 조성물은 예컨대 경구제로서 1정에 50mg, 100mg, 200mg, 400mg, 500mg 또는 1,000mg로 하루 1-3회 경구 투여할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 초유 발효산물이 상기의 함량 범위의 하한치를 벗어나면 그 효과가 현저하게 감소되며, 상한치를 벗어나면 피부 적용을 위한 조성물이나 제형으로 제조하기 곤란하거나, 첨가량에 비하여 기대 효과가 크게 향상하지 않으므로 경제적인 측면에서 바람직하지 아니하다.

본 발명의 조성물을 피부보호용으로 사용하는 경우 중금속을 함유하는 미세먼지 등으로 인한 얼굴 등의 피부 세포독성으로부터 피부를 보호할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 : 초유 발효산물의 제조

제1단계 : 초유준비

초유로부터 발효산물을 제조하기 위하여 갓 짠 소의 초유를 급속 냉각한 후 항온수조에 넣어 초유의 온도가 63℃가 된 후부터 30분간 살균처리한 후 35℃까지 온도를 낮추어 발효 원료를 준비한다.

제2단계 : 초유 발효액의 제조

락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, ATCC 11842), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus, ATCC 19258), 락토바실러스 람노서스지지(Lactobacillus rhamnosus GG, ATCC 53103), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, ATCC 4356), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei subsp. casei, ATCC 393), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ATCC 10241)의 유산균을 제1단계의 발효 원료에 1 x 10⁴ cfu/mL로 접종하고 온도 35℃에서 60분간 발효시켜 발효물(발효액)을 얻는다.

제3단계 : 초유 발효산물의 제조

상기 제2단계에서 얻은 발효액을 2000rpm, 20분간 원심분리하여 부유물을 제거하고 침전물을 제외한 상층액을 회수하여 발효초유액을 초유의 발효산물로 얻는다. 상기 발효초유액을 33℃로 맞추고 렌넷(Rennet)을 첨가하여 60분간 응집시킨 후 발효액 초유가공물을 회수한다. 상기에서 얻은 발효액 초유가공물을 13,000rpm에서 60분간 원심분리하여 상층액을 유산균 발효산물인 초유 발효물을 얻는다. 상기 상층액을 0.4 ㎛와 0.2 ㎛의 여과지로 2차 여과시킨 후 최종적인 초유 발효물로서 초유 발효산물을 제조하였다.

실험예 1 : 중금속 함유 미세먼지(PM)의 세포독성 효과

세포독성은 Moseman의 방법(Moseman T., J. Immuno. Methods, 65, 55(1983)) 및 Skaper 등의 방법(Skaper SD., et al., Cell Culture, 2, 17-33(1990))을 이용한 MTT (3-4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 측정법을 이용하여 수행하였다. 인간유래의 각질형성세포 HaCaT를 96 well plate에 배양하였다. PM을 처리 24시간 후, MTT 용액을 각 well에 처리한 후에 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거한 후 DMSO를 넣어 형성된 포마르잔 크리스탈을 녹여서 ELISA 판독기를 이용하여 595 nm에서 측정하였다. 세포에 대한 독성은 각각의 대조구의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타냈다.

인간유래의 각질형성세포에서 PM의 세포독성을 조사하기 위하여 농도별로 처리하였을 때, 대조구인 DMSO만을 처리한 것과 비교하여 세포증식의 변화 정도를 계산하여 세포독성을 조사하였다.

결과를 첨부도면 [도 1]에 나타내었다. 이 결과에 따르면, PM의 경우 200 ug/mL까지 농도 의존적으로 세포독성이 나타났다.

실험예 2 : 초유 발효산물(FC)의 중금속 함유 미세먼지에 대한 세포보호 효과

인간유래의 각질형성세포 HaCaT를 96 well plate에 배양하였다. PM과 FC와 카드뮴, 크롬, 납 등의 중금속을 함유한 90 μm 이하 먼지를 함께 24시간 처리 후, MTT 용액을 각 well에 처리하여 반응시켰다. 배지를 제거한 후 DMSO를 넣어 형성된 포마르잔 크리스탈을 녹여서 ELISA 판독기를 이용하여 595 nm에서 측정하였다. 세포의 보호효과는 각각의 대조구의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타냈다.

중금속 함유 미세먼지로부터 인간유래의 각질형성세포 보호를 확인하기 위하여 PM 0. 200 μg/mL 농도와 FC 3%로 동시에 처리하였다. 그리고 무처리군과 비교하여 세포생존율 변화 정도를 확인하였다.

이 결과를 첨부도면 [도 2]에 나타내었다.

도 2에서 보면, 상기 실시예에 따른 초유 발효산물이 중금속을 함유한 미세먼지로 인해 발생하는 피부세포 손상을 억제함을 확인하였다.

반면에, 이 실험에서 비교대상 제품으로서 사용한 항염효과로 잘 알려진 천마 추출물의 경우에는 독성이 없는 농도인 5ug/ml에서 중금속을 함유한 미세먼지로부터 세포 보호효과가 나타나지 않았다.

이러한 실험결과로부터 실시예에 따른 초유 발효산물이 중금속을 함유한 먼지로 인해 발생하는 피부세포 손상 억제효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

특히, 이러한 초유 발효산물의 세포보호 효과로 인해, 여기서 사용되는 초유 발효산물은 인체 독성이 없는 무해한 것을 확인할 수 있다.

실험예 3 : PEG 생성 측정

인간유래의 각질형성세포 HaCaT를 24 well plate에 배양하였다. 초유 발효산물과 카드뮴, 크롬, 납 등의 중금속을 함유한 90 μm 이하 먼지를 함께 24시간 처리 하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상층액의 PEG2는 ELISA kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 측정하였다.

이 결과를 첨부도면 [도 3]에 나타내었다.

도 3에서 보면, 상기 실시예에 따른 초유 발효산물이 중금속을 함유한 먼지로 인해 발생하는 PGE2 생성을 현저하게 감소시킴을 알 수 있었다.

실험예 4 : 세포독성 실험

각 샘플에 대하여 세포생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다.

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써, 세포증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로, 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT가 숙신산탈수소효소에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다.

먼저 6-well plate에 1x10⁵cells/well 의 밀도로 HaCaT cell을 접종하고 37℃에서 하루동안 배양하였다. 그 후 각각의 well에 각각의 샘플(우유, 우유발효, 초유, 초유발효)을 농도별(1, 5, 10, 20, 40, 50ug/ml)로 처리하였다. 그 후 37℃에서 12시간, 24시간 배양한 뒤에 MTT solution을 처리하고 1시간 activation을 시킨 후 ELISA reader로 450nm에서 측정하였다. 컨트롤은 H₂O₂로 진행하였으며, 대조군 대비 세포 생존율을 나타내었다.

그 실험결과는 다음 표 1과 [도 4]에 나타내었는바, 초유 발효산물(초유발효)이 다른 비교군에 비해 월등한 생존율을 나타내는 것을 확인되었다.

		12H
control		100	0.2
우유	1ug/ml	90	0.05
	10ug/ml	118	0.1
	20ug/ml	107	0.04
우유발효	1ug/ml	100	0.06
	10ug/ml	105	0.18
	20ug/ml	94	0.1
초유	1ug/ml	81	0.1
	10ug/ml	108	0.11
	20ug/ml	106	0.07
초유발효	1ug/ml	122	0.18
	10ug/ml	126	0.14
	20ug/ml	125	0.26

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 초유 발효산물을 유효성분으로 함유한 조성물은 중금속 함유 미세먼지에 의해 발생하는 피부의 세포손상으로부터의 보호 효과를 발현하는 피부보호용 조성물로 활용이 가능하고, 이를 이용하는 피부미용 증진용 조성물, 화장료 조성물이나 외피용 약학적 조성물로 적용이 가능하다.

또한, 이러한 피부보호용 조성물을 피부 바이오 소재 등의 천연소재 조성물로 활용이 가능하기 때문에 생명바이오 의약 산업상 다양한 형태의 피부세포 보호용의 첨가제로 적용하는 경우 매우 유용한 바이오 소재로 사용될 수 있다.

Claims

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스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)와 락토바실러스(Lactobacillus)로 초유를 발효하여 얻은 용해물을 여과한 락토바실러스 스트렙토코커스 써모필러스 초유 발효 용해 여과물인 초유 발효산물을 유효성분으로 함유하는, 중금속 함유 미세먼지에 의한 세포독성으로부터 피부를 보호하기 위한 피부보호용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
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