KR102523065B1 - 밀크 엑소좀의 새로운 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 밀크 엑소좀의 새로운 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 밀크 엑소좀의 기능성 화장품, 장 건강, 면역증진 등의 다양한 기능성을 가진 건강기능식품 및 창상 치료제를 포함하는 의약 등의 다양한 용도를 제공한다.

Description

밀크 엑소좀의 새로운 용도{Novel use of milk exosome}
본 발명은 밀크 엑소좀의 새로운 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 밀크 엑소좀의 기능성 화장품, 건강기능식품 및 의약 등의 다양한 용도에 관한 것이다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있는데, 이들 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있는 것으로 알려지고 있다.
엑소좀은 기본적으로 세포로부터 유래한 것이기 때문에 다른 나노입자와는 달리 생체 친화적이고, 내부나 표면에 약물이나 생물학적 활성성분을 담지하거나 표지할 수 있다는 점 때문에 약물 전달체나 화장품이나 의약품의 원료 물질로 사용하고자 하는 시도가 지속적으로 이루어지고 있다.
이와 관련하여, 대한민국 특허 제2039302호는 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 각질층의 피부장병 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제1662405호는 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 뇌혈관 질환 치료용 약학적 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허 제1894229호는 녹용 줄기세포 배양 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료용, 또는 발모 또는 육모 촉진용 조성물을 개시하고 있고, 국제공개공보 WO2016039356A1은 우유-유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항-염증제를 개시하고 있다.
그러나, 우유-유래의 엑소좀과 관련해서는 항-염증제로서의 용도에 관한 상기 국제공개공보 WO2016039356A1 외에 약물 전달체로서의 용도를 개시하고 있는 Munagala 등의 논문(Cancer Lett., 371(1): 48-61, 2016) 정도만 알려져 있을 뿐 우유-유래 엑소좀의 다른 용도에 대하여는 알려진 바 없다.
한편, 피부는 중층 편평 상피인 표피층와 촘촘한 결합 조직인 진피층, 그리고 느슨한 결합조직인 피하지방층으로 이루어진다. 표피층은 피부의 가장 바깥쪽에 위치하고 신체의 표면을 덮는 방수, 보호 막을 만들며 층상의 비늘 상피세포와 그 밑의 기저층으로 이루어진다. 표피에는 혈관이 없고, 중추신경계와 관련되어 미약하게나 신경이 존재한다. 표피를 만드는 주된 세포들의 종류로 각질형성세포, 멜라닌세포, 랑게르한스세포, 메르켈 세포가 존재한다. 진피층은 연결조직으로 이루어진 표피 밑의 피부 층으로 완충작용을 하여 신체를 압력과 장력으로부터 보호한다. 진피는 기저막을 통해 표피와 단단히 연결되어 표피를 지지하고 영양분을 공급하며, 접촉과 열을 감지하는 복수의 신경 말단을 담고 있다.
피부는 연령의 증가 또는 자외선, 외부 오염 물질 및 스트레스에 의해 점점 손상되고 이러한 요인들로부터 피부를 보호하는 기능이 약화됨으로써, 세포 보호 및 증식 능력이 떨어진다. 이 경우 우리 몸은 손상된 피부에 대하여 피부재생 과정을 시작한다. 피부재생은 손상에 대한 조직의 반응이며 조직회복의 과정으로, 주화성(chemotaxis), 세포의 분화 및 복제(differentiation and replication), 기질 단백질(matrix protein)의 합성, 혈관의 신생 및 창상의 재구성 등을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다(Steed et al., Clin. Plast. Surg., 25: 397, 1998)).
피부가 손상되면 염증반응에 이어 세포증식 과정이 진행되는데, 이는 피부가 손상된 후 2일부터 3주까지 지속된다. 이 시기에 섬유아세포는 콜라겐을 축적시켜 손상된 피부의 흠을 채우고, 섬유아세포의 증식을 유도하며, 상처부위에서는 새로운 세포와 간질성분의 재구성이 일어난다. 육아과정이라고도 불리는 이 증식과정은 상처발생 2일부터 3주까지 지속된다. 새로운 세포에 의한 어린 피부는 피부 세포의 활성이 활발하여 진피층의 섬유아세포(fibroblast)가 피부의 탄력 및 주름형성 억제에 중요한 콜라겐(collagen)의 합성과 신진대사가 왕성하다. 그리고 피부 보습에 필수적인 히알루론산(hyaluronic acid)을 포함한 당단백질류인 GAGs(Glucosamino-glycans) 합성도 활발하여 피부에 탄력, 보습 및 유연성을 부여한다. 또한 표피층에서는 기저세포(basal layer cell)의 증식이 활발하고, 피부세포간의 결합을 강화시키는 라미닌, 인테그린, 데스모좀과 같은 결합단백질(adhesion protein)의 생성이 균형적으로 이루어져 세포조직을 강화시켜 건강한 피부를 유지해 준다.
그러나, 연령이 증가할수록 피부재생 능력이 떨어지기 때문에, 자외선이나 오염물질 또는 스트레스에 의한 피부손상이 발생할 때 피부재생이 불완전하게 일어나게 됨에 따라, 탄력이 떨어지게 되고, 주름이 형성되거나 검버섯, 기미, 주근깨 그리고 점과 같은 색소변화 및 색소침착 등이 발생하며, 수분 함유 능력이 떨어지게 된다.
따라서, 탄력 있고 윤기 있는 건강한 피부를 가꾸기 위해서는 나이에 따라 감소되는 피부재생 능력을 회복시키는 것이 가장 급선무라고 할 수 있다. 이러한 피부재생 목적의 기능성 화장료 조성물에 관한 선행기술로는 개망초꽃으로부터 추출된 에센셜 오일을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 조성물에 관한 대한민국 등록특허 제1888258호, 배아줄기세포 유래 혈관형성전구세포의 배양 분비물을 포함하는 피부재생용 조성물에 관한 제1422690호, 인체 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물에 관한 특허 제1663912호 등이 존재한다.
그러나, 상기 선행기술들은 제조단가가 너무 비싸거거나 생체내 안정성 및 안전성이 확인되지 않고 있다는 단점을 가지고 있다.
한편, 면역반응은 체내에서 외래성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하고, 이를 제거 및 대사시키는 자기 방어 반응이다. 면역 반응은 초기 면역반응인 선천성 면역반응(innate immunity)과 후기 면역반응인 후천성 면역반응(acquired immunity)으로 구분될 수 있다. 초기 면역반응에서는 대식세포와 자연살해세포 (natural killer cell, NK 세포)의 활성에 의해 이물질(병원체)을 억제하여 숙주를 보호하는데, 이때 대식세포는 이물질을 탐식하면서 활성표지인 TNF-α를 생산해 분비하고 NK 세포는 활성표지인 퍼포린(perforin)을 생산하여 분비함으로써 병원체 감염세포를 살해한다. 이어서 후천성 면역에 관여하는 세포독성(cytotoxic) T 림프구, 헬퍼(helper) T 림프구 및 B 림프구가 활성화 해 감염세포를 살해하거나 항체를 만들어 숙주를 보호한다. 세포독성 T 림프구는 NK 세포처럼 퍼포린을 많이 생산 분비해 병원체 감염세포를 죽이고, B 림프구는 헬퍼 T 림프구의 의존 또는 비의존적으로 항체를 만들어 숙주를 보호한다. IL-6, IL-8, TNF-α 등의 염증성 사이토카인은 면역반응을 매개하는 물질로서, 특히 초기 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. 더구나, 선천성 면역반응은 암세포에 대한 방어 기전으로 매우 중요한 역할을 수행하기 때문에, 최근 NK 세포나 T 세포 등 선천성 면역반응의 활성화를 작용기전으로 활용한 세포치료제가 각광을 받고 있다.
일반적으로, 면역 결핍(immunodeficiency) 시에는 감염에 대한 저항력이 저하되고, 항체생성 부전인 환자는 세균에 의한 감염을 방어할 수 없으며, 호중구의 탐식작용 능력도 저하된다. 또한 이 경우에는 보체계(complement system) 활성화 반응도 저하되기 때문에 백혈구 유주인자 등이 생성되지 않아, 염증발생율이 높아지고, 바이러스 혈증이 일어나 중추신경이나 다른 곳으로 확산되기도 한다. 또한, 암환자의 경우, 화학요법이나 방사선치료 과정에서 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 영향을 줌으로써 환자의 면역력이 급격히 저하되는 부작용이 발생하기도 한다.
따라서, 암이나 감염성 질환의 예방이나 치료를 위해 면역기능을 증진시킬 수 있는 면역증진제 또는 면역기능 강화를 위한 건강기능식품의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 국민건강보험공단 건강보험정책연구원이 2001년부터 2008년까지 건강보험 진료비 지급자료를 분석한 내용에 따르면 '탈모질환'의 실진료 환자수가 2001년 10만 3천 명에서 2005년 14만 2천 명, 그리고 2008년 16만 5천 명으로 나타나, 최근 7년 동안 60% 증가하였다. 연령별로는 20 ~ 40대 실진료 환자수가 11만 4천 명으로 환자의 69.5%를 차지하였으며, 10대 이하 환자도 2만 2천 명 이상인 것으로 나타났다. 성별 실진료 환자수는 2008년 기준으로 남성이 8만 4천 명, 여성이 8만 명으로 나타나, 남성이 여성보다 약간 더 많은 실정이며, '탈모' 질환의 상병별 국내 건강보험 실진료 환자수는 2008년 기준으로 원형탈모증(13만 명), 흉터성탈모증(2만 명), 안드로젠성탈모증(9천 명), 기타 비흉터성모발손실(8천 명) 순으로 나타났다. 한편, 2003년 6월 국제 모발 및 성형미용 연구토론회 자료에 따르면, 세계적으로 2.5억 명이 탈모환자이며, 24~ 50세에서 탈모 발병율이 30 ~ 65% 정도로 나타났다. 2008년 기준으로 중국의 탈모인구는 약 3억 명에 이르며, 30대 남성인구의 30%, 그리고 50대 남성인구의 50% 정도가 탈모 증세를 나타내고 있으며 매년 탈모 환자수는 10 ~ 15% 정도 증가하고 있다. 일본인을 대상으로 2007년도 가발 판매 및 모발이식 수술을 실시하는 기업이 조사한 자료에 따르면, 일본인의 탈모 발병율이 26.5%로 이며, 추정 탈모환자 인구수는 1,293만 명 정도로 예상되었다.
현재 탈모치료를 위한 제제는 크게 의약품과 의약외품, 그리고 화장품으로 분류되고 있다. 의사의 처방이 있어야 구입이 가능한 전문의약품에는 미국 Merck사에서 개발 판매하고 있는 '프로페시아'가 있다. 프로페시아의 주성분인 피나스테라이드(finasteride)는 1997년 12월 미국 FDA로부터 탈모치료제 승인을 받았다. 피나스테라이드는 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론(DHT, dihydrotestosterone)으로 전환하는 5-알파-환원효소(5-αreductase)를 억제하는 약제로서 연모를 굵고 긴 모발로 성장하게 하는 역할을 한다. 이는 단기적으로는 탈모개선에 효과가 있으나, 발기부전, 성기능 감퇴, 남성의 유방 비대 등과 같은 부작용을 동반한다. 안전성과 유효성이 인정되어 의사의 처방 없이도 구입이 가능한 일반의약품으로는 미녹시딜(Minoxidil)이 있으며, 1997년 12월 미국 FDA로부터 최초의 바르는 탈모 치료제로 승인되었다. 이 약품은 혈액순환을 개선시키고 칼륨 채널을 개방시킴으로써 모발성장을 촉진시키는 효과가 있으나 가려움, 발진 등의 국소반응이 올 수 있으며, 빈맥 등이 나타날 수 있다.
식약청에서 탈모 방지와 육모(肉毛) 기능을 허가 받은 제품으로 보건복지부 장관의 고시에 의해 슈퍼마켓이나 편의점에서 판매할 수 있는 의약외품으로는 대표적으로 CJ 라이온의 '모발력 컴피턴트', 모라클의 '헤어토닉', LG생활건강의 '모앤모아' 등의 제품이 있으며, 화장품류로는 샴푸류 또는 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위해 두피나 모발에 사용되는 제품이 판매되고 있다.
사람의 탈모주기는 크게 성장기(anagen), 퇴행기(catagen), 그리고 휴지기(telogen)로 구분된다. 성장기는 모유도의 활동이 활발하면서 세포분열이 왕성하게 일어나 모발이 빠른 속도로 자라는 시기이다. 성장기의 수명은 털의 종류마다 다르지만 머리카락의 경우, 3 ~ 6년 정도이다. 성장기 모발은 전체모발의 80 ~ 90%를 차지하며, 탈모가 진행되고 있는 사람은 성장기가 짧아지고 휴지기가 긴 모발주기를 가지게 되어 전체 모발에서 성장기 모발의 비중이 감소하게 된다. 퇴행기는 모발의 성장기가 끝나고 모발 생성이 점차 느려져 결국 세포분열 및 성장이 멈추는 시기로 1 ~ 1.5개월 정도 지속되며 전체 모발의 1% 정도가 이 단계에 속한다. 휴지기는 성장의 마지막 단계로서 모낭과 모유두가 완전히 분리되어 모낭은 위축되고 모근은 더욱 위쪽으로 올라가 머리카락이 빠지는 단계이다. 휴지기는 3 ~ 4개월간 지속되고 전체모발의 4 ~ 14%가 이 단계에 해당된다. 휴지기가 끝나고 다시 모유두의 활동이 활발해지면, 새로운 모발의 모유두가 만들어지면서 휴지기에 있던 모발은 밀려나서 완전히 두피 밖으로 빠져 나오게 된다.
종래 기술의 탈모 치료제나 육모용 조성물의 경우 그 효과가 완전하게 검증된 것이 아니거나 여러가지 부작용이 발생하고 있기 때문에, 보다 안전하고 효율적인 탈모 치료제 또는 육모제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상술한 문제점을 포함한 여러가지 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 보다 효율적이고 경제적인 우유-유래 엑소좀을 이용한 피부재생용 기능성 화장료 조성물 등 다양한 화장품, 식품 및 의약품으로서의 새로운 용도를 제공하는 것이다, 그러나, 본 발명의 범위가 상기 목적에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 및 예방용, 모발용 기능성 화장품이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 탈모 치료 또는 발모 또는 육모 촉진용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체의 손상된 피부에 도포하는 단계를 포함하는 상기 개체의 손상된 피부재생 촉진 방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 면역력 강화 방법이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 탈모 예방 또는 치료방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 피부 주름 개선방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 피부 미백방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 창상 치료제의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 주름개선용 화장품의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 미백용 화장품의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 탈모 예방 및 치료제의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의육모·발모제의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 면역기능 개선용 조성물의 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유를 원심분리하여 지방 및 세포를 제거하는 1차 원심분리 단계; 원심분리된 우유 또는 산양유를 20 내지 60 μm의 망목을 갖는 여과망으로 여과하여 지방 및 세포를 추가적으로 제거하는 여과망 여과 단계; 여과된 우유 또는 산양유에 동일 부피의 증류수를 가하여 희석하는 희석 단계; 희석된 우유 또는 산양유에 산을 가하여 pH를 4 내지 5로 조정함으로써 우유 또는 산양유 내의 카세인을 침전시키는 등전점 침전 단계; 카세인이 침전된 우유 또는 산양유를 추가적으로 원심분리하여 상등액을 수집하는 2차 원심분리 단계; 및 수집된 상등액을 0.2 μm 필터로 여과하는 여과 단계를 포함하는, 우유 또는 산양유로부터 엑소좀을 분리하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 피부재생용 화장료 조성물은 피부재생 효과가 일반적인 세포배양액으로부터 분리된 엑소좀에 비해 월등하게 높을 뿐만 아니라 원가가 낮은 반면 수율이 현저하게 높고 물질의 안정성 또한 높기 때문에, 매우 경제적으로 생상될 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1a은 본 발명의 일 실시예에 따라 한외여과를 이용하여 우유 또는 초유로부터 엑소좀을 분리하는 과정을 개략적으로 나타낸 공정도이고, 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 한외여과를 사용하지 않고, 우유 또는 초유로부터 엑소좀을 분리하는 개선된 공정을 개략적으로 나타낸 공정도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 한외여과를 이용하여 분리된 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀 및 대조군으로서 다양한 세포들(HaCat, B16F10, HDF)로부터 분리된 엑소좀의 수율을 나타낸 그래프이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라,한외여과를 이용하지 않는 개선된 공정으로 엑소좀 분리시의 엑소좀 수율을 한외여과를 이용한 공정과 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀 및 대조군으로서 HEK293 세포로부터 분리된 엑소좀의 엑소좀 표면 마커를 웨스턴 블랏 분석으로 확인한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래의 엑소좀(A 및 B) 및 대조군으로서 HEK293 세포로부터 분리된 엑소좀(C 및 D)의 입도를 분석한 동적 산란 분석 결과를 나타내는 히스토그램(A 및 C) 및 상기 엑소좀을 투과 전자현미경을 촬영한 사진(B 및 D)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래의 엑소좀(상단) 및 대조군으로서 HEK293 세포 유래의 엑소좀(하단)의 2차례 동결/해동 전후의 형태를 투과 전자현미경으로 촬영한 일련의 사진이다. 사진 중의 적색 상자는 우측에 확대된 영역을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래의 엑소좀(A) 및 대조군으로서 HEK293 세포 유래의 엑소좀(B)의 2차례의 동결/해동 전후의 입도 분포를 동적 산란 분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀(우하단)과 대조 엑소좀인 HaCat 세포 유래 엑소좀(HaCat Exo, 좌상단), B16 흑색종 세포 유래 엑소좀(B16 Exo, 우상단), 및 인간 진피 섬유아세포 유래 엑소좀(HDF Exo, 좌하단)의 동결보존 전 및 동결 후 해동시 입도의 분포를 확인한 동적산란분석 결과를 나타내는 일련의 그래프이고, 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 동결보존하기 전(상단) 및 동결 후 해동하여 재현탁한 이후(하단) 투과전자현미경으로 촬영한 일련의 사진이며, 도 7c는 본 발명의 동결보존 전(가운데) 및 동결보존 후 해동한(우측) 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 처리한 인간 진피 섬유아세포에서의 제1형 콜라겐으 발현정도를 면역형광법으로 염색하여 촬영한 일련의 사진이다. 좌측 Saline은 엑소좀 처리 없이 생리식염수만 처리한 대조군이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀(Col M-exo)와 다양한 대조군 엑소좀(HaCat Exo, B16 Exo, 및 HDF Exo)를 5회 연속으로 동결-해동을 반복하면서 평균 입자 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래의 엑소좀 처리시 인간 피부 섬유아세포로 흡수됨을 보여주는 형광 현미경 사진(우측)이다. 좌측은 대조군인 PBS 처리군을 촬영한 사진이다. 청색은 핵을 대조염색하기 위한 DAPI의 형광신호를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 0.1 mg/ml 및 0.3 mg/ml의 농도로 인간 진피 섬유아세포(HDF)에 처리한 후 세포사멸 정도를 유세포분석으로 측정한 결과를 나타내는 일련의 히스토그램이다.
도 11a는 인간 진피 섬유아세포에 자외선을 조사하여 손상을 가한 후 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo) 및 초유 엑소좀(Col M-exo)를 처리하였을 때 활성산소의 생성 정도를 활성산소와 반응하여 형광을 나타내는 DCF-DA에 의한 형광 정도를 촬영함으로써 분석한 결과를 나타내는 일련의 형광 현미경 사진이고, 도 11b는 상기 도 11a에서 확인된 상대적 형광 강도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀을 각각 인간 각질형성 세포(HaCaT)에 처리한 후 세포 증식 정도를 측정한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀을 각각 인간 피부 섬유아세포(HDF)에 처리한 후 세포 증식 정도를 측정한 결과를 나타내는 일련의 그래프이다. 대조군은 PBS 완충액만 처리한 세포의 증식정도를 나타내고, 증식율은 대조군의 증식율을 100%로 정하였을 때의 상대적인 백분율을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀을 스크래치를 유도한 인간 각질형성 세포(HaCaT, A 및 B) 및 인간 피부 섬유아세포(HDF, C 및 D)에 처리한 후 세포 이동 정도를 관찰한 실험 결과를 나타내는 일련의 사진(A 및 C) 및 상기 A 및 C의 결과로부터 세포 이동 정도를 정량화한 일련의 그래프(B 및 D)를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Mat Milk Exo) 및 초유 엑소좀(Colos Exo)를 마크리겔 내에서 3차원 배양중인 쥐 유래 혈관내피 세포(SVEC4-10)에 처리한 후 관형성 정도를 현미경으로 촬영한 일련의 사진(a), 상기 a에서 관찰된 가지 형성 지점의 수(b) 및 형성된 관의 길이(c)를 각각 나타내는 일련의 그래프를 나타낸다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 형광물질(Flamma 675)로 표지한 후, 피하주사 후 생체 내 분포를 전신 생체 내 형광이미징으로 측정한 결과를 나타내는 일련의 사진이고, 도 15b는 엑소좀 주입 이틀 째에 실험동물을 희생시킨 후 주요 장기를 적출하여 장기 내의 형광분포를 생체 내 이미징 시스템으로 촬영한 결과를 나타내는 사진이며, 도 15c는 사익 도 15b의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo)와 초유 엑소좀(Colos Exo)를 창상 모델 마우스의 창상 부위에 도포한 후 시간의 경과에 따른 창상의 회복정도를 기록한 결과를 나타내는 그래프(상단) 및 창상부위를 직접 촬영한 일련의 사진이다. 대조군으로는 생리식염수만 투여한 군(Saline) 및 혈청으로부터 수득한 엑소좀(Serum Exo)를 사용하였으며, 초유 엑소좀은 1, 4, 7일째 투여한 그룹(Col M-exo)과 4, 7, 10일째에 투여한 그룹(Col M-exo-D4)으로 구분하였다.
도 17은 상기 도 16의 실험 동물을 희생시킨 후, 창상 부위를 절제하여 조직 절편을 제조한 후, 항-엘라스틴 항체를 이용하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
도 18a는 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Com M-exo) 및 초유 엑소좀(Col M-exo)를 인간 진피 섬유아세포(HDF)에 처리한 후, 제1형 콜라겐 단백질의 발현정도를 면역형광분석으로 분석한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo) 및 초유 엑소좀(Col M-exo)를 인간 진피 섬유아세포(HDF)에 처리한 후 매트릭스 메탈로프로테이네이즈-2(MMP-2)의 발현정도를 웨스턴블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군은 생리식염수 처리군(Saline)과 HDF 유래 엑소좀 처리군이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀(Col M-exo)를 다양한 농도로 자외선을 처리하거나 처리하지 않은 흑색종 세포에 처리하고 24간 경과후 세포로부터 멜라닌 색소를 추출하여 추출된 색소를 촬영한 일련의 사진(a), 106 세포당 멜라닌 색소의 양을 측정한 결과를 나타내는 그래프(b) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo) 및 초유 엑소좀(Col M-exo) 처리시와 다른 대조군(Saline, B16 유래 엑소좀 처리(B16 Exo))시의 멜라닌 함량을 비교한 결과를 나타내는 그래프(c)를 나타낸다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo)와 초유 엑소좀(Col M-exo)을 골수유래 대식세포(BMDM)에 처리하고 24시간 경과 후 다양한 사이토카인 발현 정도를 닷블랏 분석으로 분석한 결과를 나타내는 사진(a) 및 상기 결과를 정량화한 그래프(b)를 나타낸다.
도 21은 NIH-3T3 섬유아 세포에 각각 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo) 및 초유 엑소좀(Col M-exo)를 처리한 후, 조직재생 및 혈관신생에 관여하는 다양한 성장인자의 발현 정도를 비교하여 나타낸 도트 블랏 분석 결과(a) 및 상기 도트 블랏 분석 결과를 정량화한 그래프(b)를 나타낸다.
도 22a은 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀을 인간 모유두 세포에 처리시 처리 시간에 따른 세포내 엑소좀 흡수 양상을 관찰한 결과를 나타내는 일련의 형광현미경 사진이고, 도 22b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 인간 모유두 세포에 처리시 초유 엑소좀 처리 농도에 따른 모유두 세포의 세포증식에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 탈모 유도물질의 처리유무에 따른 인간 모유두 세포의 증식 정도의 차이를 분석한 결과를 나타내는 그래프(우측)를 나타내며, 도 22c는 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀(Comm M-exo)을 털을 제거한 실험동물에 피부내 투여로 투여한 후 시간의 경과에 따른 발모정도를 확인한 결과를 나타내는 일련의 사진이다.
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀"은 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재할지 모르는 나노 크기의 세포-유래의 소포(vesicle)이다. 엑소좀이 크기는 30 및 100 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다. 이와 관련하여, 본 문서에서 사용되는 용어 "밀크 엑소좀"은 시판유나 초유 등 포유동물의 젖으로부터 유래한 엑소좀을 의민한다. 마찬가지로 "초유 엑소좀"은 밀크 엑소좀 중 어미가 새끼를 낳은 출산 직후에 분비되는 젖으로부터 유래한 엑소좀을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "우유"는 소의 젖을 의미하나, 말이나 면양, 유산양(염소), 낙타 등 다른 포유동물의 젖도 기능적 동등물이라고 할 수 있다. 다만, 입수의 용이성 및 가격 등을 고려할 때 시판되는 소의 젖이 가장 바람직하며, 유산양(염소)으로부터 생산되어 유통되는 "산양유" 역시 훌륭한 대체물이 될 수 있다. 특히 산양유의 경우 모유와 조성이 유사하여 소화가 쉽고 영양가가 높은 편으로, 고급유로 인식되고 있다. 말의 젖(마유)도 일반적이지는 않지만 중앙아시아의 유목민족들에게 우유 대체품으로 사용되고 있다. 한편, 우유 중 임신 말기부터 부만 후 며칠간 사이에 분비되는 젖을 "초유"라고 한다. 초유에는 일반적인 젖과는 달리 생존 및 성장에 필요한 영양소와 항체가 더 많이 함유되어 있으며, 락토페린, 헤모펙신 등의 항산화 물질의 함유량도 일반 우유보다 높아 건강증진 및 영양공급 측면에서 선호되기도 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "원유"는 목장에서 채취한 우유 원액으로 살균 등 특별한 가공을 거치지 않은 우유를 의미하며, 본 문서에서 사용되는 용어 "시판 우유"는 살균 공정 및 균질화 공정을 통해 시중에 판매될 수 있는 형태로 포장된 우유를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "피부재생"은 피부의 재생주기 과정 또는 손상시 기저층에서 세포가 생성되어 피부가 복원되는 과정을 의미한다. 기저층에서 생성된 표피세포는 서서히 상층부로 밀려나 각질층에 다다른다. 이러한 과정을 피부의 재생주기 또는 턴오버 과정이라고 부른다. 일반적으로 피부의 턴오버 과정은 기저층에서 세포가 생성되어 올라오는 기간이 14일, 각질층에 머문 세포가 사멸하여 탈락되는 기간이 14일로 통상 28일을 피부재생 주기로 보은데, 나이가 들 수록 재생과 탈락의 과정이 느리게 진행되기 때문에 피부재생 주기는 최대 42일까지 증가할 수 있으며, 기본적으로 30대 이후 피부재생 주기가 늘어나는 것으로 알려지고 있다. 이 때문에, 나이가 들면 피부가 칙칙해지고 거칠게 되는 현상, 이른바 피부의 노화가 시작되는 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 화장료 조성물이 제공된다.
상기 피부재생용 화장료 조성물에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물이 제공된다.
상기 주름개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물이 제공된다.
상기 피부미백용 화장료 조성물에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 화장료 조성물은 기능성 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 스킨, 로션, 크림, 에센스, 영양수, 화장수 및 팩과 같은 화장품류와 비누, 샴푸, 린스, 클렌징, 전신세정제, 세안제, 트리트먼트 및 미용액 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩타이드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 부가적 기능성 성분을 추가로 포함할 수 있다.
수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.
유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-α-토코페롤, d-α-토코페롤, d-δ-토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체(팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-α-토코페롤, 니코틴산dl-α-토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다.
유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.
고분자 펩타이드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩타이드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.
고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.
스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피트스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.
해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.
본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.
이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다. 에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴·카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.
탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, α-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.
실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산·메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산·메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.
불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.
동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.
보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.
수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜 (중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.
지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.
수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린등을 들 수 있다.지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈·에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈·헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.
에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.
계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE·POP (폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE·POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.
음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, α-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩타이드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.
양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제4급암모늄염 등을 들 수 있다.
양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민, 카본블랙 및 이들의 복합체등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠·스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.
유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-β-알라닌칼슘, N-라우로일-β-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; Nε-라우로일-L-리진, Nε-팔미토일리진, Nα-파리토일올니틴, Nα-라우로일아르기닌, Nα-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩타이드; α-아미노카프릴산, α-아미노라우린산 등의 α-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠·스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.
자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리친산페닐, 살리친산옥틸, 살리친산벤질, 살리친산부틸페닐, 살리친산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필·디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.
살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.
pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.
알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.
또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 ∼ 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01∼ 3중량% 배합된다.
본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.
화장료의 형태의 예로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료, 비누 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장료의 구체예로서는 세안크림, 세안폼, 클렌징크림, 클렌징밀크, 클렌징로션, 마사지크림, 콜드크림, 모이스처크림, 유액, 화장수, 팩, 에프터세이빙크림, 썬텐방지크림, 썬텐용 오일, 비누, 보디샴푸, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 양모료, 육모료, 헤어크림, 헤어리퀴드, 세트로션, 헤어스프레이, 헤어브리지, 컬러린스, 컬러스프레이, 퍼머넌트웨이브액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 핸드크림, 립스틱 등을 들 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 유효성분은 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑조솜 이외에 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩타이드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택되는 성분(필요에 따라 상기에 예시되는 것 이외에 첨가해도 되는 배합 성분 등)을 공지의 방법, 예를 들어 「경피 적용 제제 개발 메뉴얼」 마츠모토미치오 감수 제1판(세이시 서원, 1985년 발행) 등에 기재된 방법에 준하여 조제함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 탈모 개선 및 예방용, 모발용 기능성 화장품이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따른 탈모 개선 및 예방용, 모발용 기능성 화장품은 샴푸의 제형으로 제공될 수 있고, 샴푸가 아닌 두피 도표형 연고나 크림, 젤 등 외용제의 제형으로 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품이 제공된다.
상기 건강기능식품의 건강 관련 기능성은 과민피부상태 개선, 면역 기능 개선, 장 건강 개선, 피부 건강 개선, 혈당 조절, 항산화 기능 또는 간 건강 개선일 수 있으나, 이로 제한이 되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따른 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 예로는 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방제품, 유제품 음료(dairy drink) 및 우유 음료, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체음식, 육류제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 효모 제품, 케이크 및 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 일 관점에 따른 건강기능식품은 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등으로 제형화하여 사용할 수 있고, 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 건강기능식품이 음료 제형의 건강기능식품인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 녹용추출물, 배변활동과 칼슘의 흡수를 도와주는 프락토올리고당, 아카시아꿀, 천연 보존제인 복합황금추출물, 침전개선 점증제인 젤란검 등의 기능성 원료도 부가할 수 있으나, 이에 한정하지는 않고 건강기능식품에 적합한 성분을 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 유효 성분인 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀은 그 기원인 우유 또는 산양유가 이미 식품 원료로 오랜 기간 동안 인류에 의해 사용되어온 식품 소재라는 측면에서 매우 안전한 물질임이 틀림이 없다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 또는 산양유 유래의 엑소좀은 다양한 건강 기능에 있어서 안전하면서도 매우 효율적인 원료물질로 사용이 될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 상기 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 100 중량%로 함유될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다.
부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴(pectin) 등 을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 외용제일 수 있다. 본 발명의 외용제에는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 수화겔을 포함한 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 일례로, 상기 조성물을 창상에 직접 적용될 수 있다. 즉, 창상부위에 산포될 수 있다. 시트의 형태인 경우는 창상 부위에 도포하는데 이때 도포한 부위에 적절히 드레싱하여 창상을 보호하면서 활성 성분의 치료효과가 감소하는 것을 방지한다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필(Compeel), 듀우덤(Duoderm), 타가덤(Tagaderm) 및 옵사이트(Opsite)를 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물이 외용제로 제공될 경우, 약제학상 허용되는 담체로는 그의 제형에 따라 다르나, 바셀린, 유동 파라핀, 겔화 탄화수소(별명: 플라스티베이스) 등의 탄화수소류; 중쇄지방산 트리글리세라이드, 돈지, 하드 팻트, 카카오지 등의 동식물성 오일; 세탄올, 스테아릴알코올, 스테아린산, 팔미틴산이소프로필 등의 고급지방산 알코올 및 지방산 및 그의 에스테르류; 마크로골(폴리에틸렌글리콜), 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤, 젤라틴, 백당, 당알코올 등의 수용성 기제; 글리세린 지방산에스테르, 스테아린산폴리옥실, 폴리옥시에틸렌경화 피마자유 등의 유화제; 아크릴산에스테르, 알긴산나트륨 등의 점착제; 액화석유가스, 이산화탄소 등의 분사제; 파라옥시벤조산에스테르류 등의 방부제 등을 들 수 있으며, 본 발명의 외용제는 이들을 사용하여 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 이들 이외에도 안정제, 향료, 착색제, pH 조정제, 희석제, 계면활성제, 보존제, 항산화제 등을 필요에 따라 배합할 수도 있다. 본 발명의 외용제는 사용은 통상의 방법에 의해 국소창상부에 도포 될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 외용제는 통상적인 반창고의 창상 박리 커버 등과 같은 고체 지지체상에 점착되어 사용될 수 있다. 본 발명의 양태로서, 고체 지지체를 먼저 점착층으로 피복하여 고체 지지체에 배양액의 부착을 향상시킨다. 점착제의 예로는 폴리아크릴레이트 및 시아노아크릴레이트가 포함될 수 있다.
이러한 형태의 제형은 시판되고 있는 것이 많으며 예로는 천공된 플라스틱 필름 형태의 비부착성 창상 박리 커버를 갖는 반창고(Smith & Nephew Ltd.), Johnson & Johnson의 얇은 스트립(strip), 패취(patch), 스포트(spot), 가소성 스트립 형태의 밴드-에이드(BAND-AID); Colgate-Palmolive Co.(Kendall)의 큐리티 큐러드(Curity CURAD) 오우취리스(Ouchless) 반창고; 및 American WhiteCross Laboratories, Inc.의 스틱-타이트(STIK-TITE) 탄성 스트립 등을 들 수 있다.
본 발명의 일례로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 또는 산양유 유래의 엑소좀과 생리식염수를 일정한 부피비로 혼합하고 액상 도포제의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 일례로서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기한 본 발명의 발명의 일 실시예에 따른 우유 또는 산양유 유래의 엑소좀과 수용성 연고기제를 혼합하고 여기에 생리식염수를 첨가하여 연고제의 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체의 손상된 피부에 도포하는 단계를 포함하는 상기 개체의 손상된 피부재생 촉진 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
상기 치료적으로 유효한 양은 환자의 창상 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 본 발명의 약학 조성물의 일일 유효량은 세포 배양액을 창상에 적용시 1 내지 50 μl/cm2일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20 ㎕/cm2일 수 있다.
상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
상기 투여하는 단계는 경구투여, 피하투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 비강내 투여에 의해 수행될 수 있으나, 정맥내 투여나 피하투여가 바람직하며 적절한 피부도포형 제형으로 제형화될 경우 환부에 직접 도포처리하는 것도 가능하다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 면역력 강화 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 탈모 예방 또는 치료방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
상기 투여하는 단계는 경구투여, 피하투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 비강내 투여에 의해 수행될 수 있으나, 정맥내 투여나 피하투여가 바람직하며 적절한 피부도포형 제형으로 제형화될 경우 탈모가 진행 중인 두피에 직접 도포처리하는 것도 가능하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 피부 주름 개선방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
상기 투여하는 단계는 경구투여, 피하투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 비강내 투여에 의해 수행될 수 있으나, 정맥내 투여나 피하투여가 바람직하며 적절한 피부도포형 제형으로 제형화될 경우 환부에 직접 도포처리하는 것도 가능하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 피부 미백방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유일 수 있다.
상기 투여하는 단계는 경구투여, 피하투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 비강내 투여에 의해 수행될 수 있으나, 정맥내 투여나 피하투여가 바람직하며 적절한 피부도포형 제형으로 제형화될 경우 환부에 직접 도포처리하는 것도 가능하다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 창상 치료제의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 주름개선용 화장품의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 미백용 화장품의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 탈모 예방 및 치료제의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의육모·발모제의 제조을 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀의 면역기능 개선용 조성물의 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 우유 또는 산양유를 원심분리하여 지방 및 세포를 제거하는 1차 원심분리 단계; 원심분리된 우유 또는 산양유를 20 내지 60 μm의 망목을 갖는 여과망으로 여과하여 지방 및 세포를 추가적으로 제거하는 여과망 여과 단계; 여과된 우유 또는 산양유에 동일 부피의 증류수를 가하여 희석하는 희석 단계; 희석된 우유 또는 산양유에 산을 가하여 pH를 4 내지 5로 조정함으로써 우유 또는 산양유 내의 카세인을 침전시키는 등전점 침전 단계; 카세인이 침전된 우유 또는 산양유를 추가적으로 원심분리하여 상등액을 수집하는 2차 원심분리 단계; 및 수집된 상등액을 0.2 μm 필터로 여과하는 여과 단계를 포함하는, 우유 또는 산양유로부터 엑소좀을 분리하는 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 1차 원심분리 단계는 4℃의 온도조건에서 4,000 내지 6,000 ×g로 20 내지 40분간 수행될 수 있고, 더 바람직하게는 4℃의 온도조건에서 4,000 내지 5,000 ×g로 30분간 수행될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 여과망은 30 내지 50 μm의 망목을 갖는 여과망일 수 있고, 더 바람직하게는 35 내지 45 μm의 망목을 갖는 여과망일 수 있으며, 가장 바람직하게는 40 μm의 망목을 갖는 여과망일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 산은 염산, 질산, 초산 또는 황산일 수 있고, 더욱 바람직하게는 염산일 수 있으며, 가장 바람직하게는 6 N 염산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 2차 원심분리 단계는 상온에서 4,000 내지 6,000 ×g로 15 내지 30분간 수행될 수 있고, 더 바람직하게는 상온에서 4,500 내지 5,500, ×g로 15 내지 25분간 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 상온에서 5,000 ×g로 20분간 수행될 수 있다.
우유에는 엑소좀이 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있다. 더구나, 줄기세포에 비해서 저렴한 비용으로 대량으로 엑소좀을 생산할 수 있는 엑소좀 생산 플랫폼이 될 수 있기 때문에, 우유나 초유로부터 엑소좀을 대량생산하는 방법을 확립하였다(도 1a). 아울러, 상기와 같이 확립한 방법을 통해 우유로부터 엑소좀 분리시 HEK293 세포에서 분리할 때보다 현저하게 많은 양의 엑소좀이 분리됨을 확인할 수 있었으며(도 2a 참조), 특히, 초유를 원료로 사용하였을 경우 단백질 함량으로 환산시 0.45 내지 1.5 mg/ml이라는 매우 높은 수율로 생산이 됨을 확인하였다. 이는 HEK293 세포의 수율과 비교시 최고 100배가 넘는 수치임을 알 수 있었다(도 2 참조). 아울러, 본 발명자들은 우유로부터 엑소좀 생산 수율을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 한외여과를 사용하지 않는 더욱 간편한 방법을 개발하였으며(도 1b), 이러한 개선된 방법에 의해 우유로부터 엑소좀을 분리할 경우, 종래 한외여과 방식과 비교하여 무려 400 내지 1000배 이상의 수율을 달성할 수 있음을 확인하였다(도 2b). 한편, 상기 방법으로 제조된 엑소좀이 정상적인 엑소좀인지 여부를 확인하기 위해 엑소좀 표지자인 CD8, CD63, CD81, 및 TSG 101의 발현 여부를 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였고, 엑소좀의 입도분포를 동적산란분석으로 분석하였다. 그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이 대조군인 HEK293 세포 유래의 엑소좀에 비해서 다소 낮게 나타나기는 하나 엑소좀 표지자들이 정상적으로 확인되었고, 도 4에서 확인되는 바와 같이 우유 유래 엑소좀은 평균 입자 직경이 68.05 nm로 30 내지 100 nm의 입자크기 분포를 갖는 나노사이즈의 입자임이 확인되었다. 이는 대조군 엑소좀과 유사한 크기 분포를 갖는 것으로서, 상기 결과애소 우유로부터 엑소좀이 정상적으로 분리될 수 있음을 확인하였다.
이어, 본 발명자들은 세포배양액으로부터 분리된 엑소좀의 화장품 원료로서의 사용가능성을 타진해보기 위해, 안정성 분석을 수행하였다. 구체적으로 재조합 엑소좀을 생산하는데 사용되는 일반적인 인간세포주인 HEK293 세포에서 분리된 엑소좀을 두 차례 동결건조 후 해동한 후, 동적산란 분석 및 투과 전자현미경으로 형태를 관찰하였다(도 5 및 6 참조). 그 결과 HEK293 세포 유래의 엑소좀은 두 번째 동결건조 및 해동시 응집에 의해 본래의 형태를 유지하지 못하는 것으로 확인이 되었다. 따라서, 일반 세포주 유래의 엑소좀은 동결건조된 원료 형태로 사용되며 이후 상온 보관을 목표로 하는 화장료 조성물의 성분으로는 다소 부적합한 원료임을 알 수 있었다.
이에, 본 발명자들은 우유로부터 분리된 엑소좀의 안정성을 다른 세포 유래의 엑소좀의 범위를 확대하여 비교분석하였다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀과 다른 세포 유래 엑소좀(HaCat Exo, B16 Exo 및 HDF Exo)을 동결보존 전후로 동적산란 분석을 통해 입통해 입도분석을 수행하였다. 대조군 엑소좀과는 달리 우유 유래의 엑소좀은 동결건조 및 해동에도 불구하고 그 형태를 온전히 유지하고 있음을 알 수 있었고(도 7a 및 7b), 동결 전후의 초유 엑소좀을 인간 진피 섬유아세포에 처리한 결과 제1형 콜라겐 발현 유도능이 그대로 유지가 됨을 확인하였다. 이는 동결보존 처리에도 불구하고 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀의 생물학적 활성이 유지가 됨을 보여주는 것이다.
더구나, 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀은 반복적인 동결 및 해동에도 불구하고 그 크기가 그대로 유지되는 것으로 나타난 반면, 다른 세포 유래 엑소좀은 동결-해동 횟수가 증가함에 따라 입자 크기가 증가하는 양상이 나타나 응집이나 융합현상이 발생하는 등 불안정한 모습을 나타냄을 확인하였다(도 8 참조).
아울러, 본 발명자들은 우유에서 분리된 엑소좀이 피부세포에 잘 전달되는지 여부를 확인하기 위해, 형광 표지를 한 우유 유래 엑소좀을 인간 피부 섬유아세포(HDF)에 처리한 후 형광현미경으로 엑소좀의 위치를 확인하였다(도 9 참조). 그 결과, 본 발명의 우유 유래 엑소좀은 섬유 피부아세포의 세포질로 잘 이행이 되어 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 혹시 세포독성을 유발할 가능성은 없는지 확인하기 위해 0.1 mg/ml 및 0.3 mg/ml의 고농도로 인간 진피 섬유아세포에 처리하였으나, 세포사멸이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 자외선 유도 산화성 세포손상에 대한 억제활성을 갖는지 확인하기 위해 인간 진피 섬유아세포에 자외선으로 손상을 유도한 후 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 처리한 후 활성산소종의 발생 유무를 확인한 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀은 다른 세포 유래의 대조 엑소좀들과는 달리 자외선 유도 활성 산소종의 생성을 유의하게 억제하였다(도 11a 및 11b).
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래 엑소좀이 피부재생 능력이 있는지 조사하였다. 이를 위해, 인간 각질형성 세포인 HaCaT 세포와 인간 피부 섬유아세포(HDF)에 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀을 처리하고 세포 증식 정도를 확인한 결과(도 12a 및 12b 참조), 본 발명의 우유 유래 엑소좀은 대조군(PBS 처리)에 비해서 세포증식 효과가 우수한 것으로 나타났다. 특히 초유의 경우 시판 우유에 비해서 세포증식 능력이 더 우수한 것으로 확인이 되었다. 이어, 본 발명자들은 세포 재생 능력의 척도 중의 하나인 세포 이동능에 미치는 영향을 조사하였다(도 13 참조). 그 결과 본 발명의 우유 유래 엑소좀은 인간 각질형성 세포인 HaCaT는 물론 인간 피부 섬유아세포인 HDF에 처리시 대조군에 비해 세포이동을 증가시켰으며 특히 초유 유래 엑소좀의 경우 세포이동능이 현저하게 높게 나타났다.
더 나아가, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀의 다양한 용도를 확인하기 위해, 혈관 내피세포 처리시 관형성 여부(도 14), 생체 내 투여시 시간 경과에 따른 생체 분포 양상 분석(도 15a 내지 15c), 실제 창상모델 동물에 창상을 인위적으로 도입한 후 투여시 창상 회복능 비교(도 16), 창상부위 처리시 엘라스틴 발현 분석(도 17), 인간 진피 섬유아 세포에 처리시 제1형 콜라겐 발현 유도 및 MMP-2 발현 억제능을 통한 주름개선효과(도 18a 및 18b), 흑색종 세포에서의 멜라닌 합성 저해효과를 통한 미백효과(도 19) 및 골수유래 대식세포(BMDM)에 처리시 면역활성화와 관련된 사이토카인의 발현유도능(도 20), 섬유아 세포에 처리시 염증 관련 성장인자들의 발현 유도능(도 21), 인간 모유두 세포로의 흡수능력(도 22a), 정상 및 탈모유도 조건에서의 인간 모유두 세포에 대한 증식능(도 22b) 및 동물실험을 통한 육모·발모 성능 분석(도 22c)을 통한 탈모치료효과 등을 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀은 창상치료, 주름개선, 미백효과, 면역증진 효과, 탈모예방 및 효과 등 매우 다양한 생물학적 활성을 나타내는 물질임을 알 수 있었다.
이러한 결과로부터 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래 엑소좀이 피부 재생과 창상 치료는 물론, 미백, 주름개선 등의 기능성 화장품의 제조와, 탈모치료나 면역강화 등의 매우 다양한 용도로 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
비교예: HEK293 세포로부터 엑소좀의 분리
HEK293 세포로부터 엑소좀 분리를 위하여 HEK293T 세포(6x106)는 10% FBS, 1% 항생제가 첨가된 고포도당 배양배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM, 4,500 mg/L glucose)에서 배양하였고, 37℃, 5% CO2 조건에서 유지되었으며 15 cm 배양접시에서 80~90%의 세포포화도(confluency)을 나타낼 때, 엑소좀을 분리하기 위하여 세포배양 상층액을 분별원심분리(differential centrifugation) 방법으로 수득하였고 상세한 방법은 하기와 같다:
먼저, 엑소좀을 포함하는 배양액에서 세포 찌꺼기와 다른 세포 성분을 제거하기 위하여 300 g으로 10분, 2000 g으로 10분 및 10000 g으로 30분간 순차적으로 원심분리를 하였고 상기 배양액을 0.22 μm 필터로 여과 후 70 Ti rotor(Beckman Instruments)를 이용하여 36,900 rpm에서 2시간 동안 초원심분리(ultra-centrifugation)를 수행하였다. 이후 수득한 엑소좀은 단백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였다.
실시예 1: 시판 우유로부터 엑소좀의 분리
본 발명자들은 하기와 같은 방법으로 시판 우유로부터 엑소좀을 분리하였다.
우선 시판 우유를 3,000 g에서 30분간 원심분리한 후, 12,000 g에서 1시간, 35,000 g에서 1시간 그리고 70,000 g에서 3시간 순차 초원심분리를 수행하였다. 그런 다은 0.8 μm 필터로 1차 여과를 하고, 0.45 μm 필터로 2차 여과를 한 후, 0.2 μm 필터로 3차 여과를 하였다. 여과액을 100,000 g로 1시간 동안 초원심분리를 한 후 펠렛을 회수하여 닥백질 분해효소 억제제(Roche)를 포함하는 PBS에 재현탁하였다(도 1). 상기 우유로부터 분리된 엑소좀 역시 상기 비교예와 2같은 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 분리된 엑소좀의 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 2: 초유로부터 엑소좀의 분리
본 발명자들은 시판 우유 대신 초유(경남 창녕군 계성면 봉산관동 1로 20 소재 이성영 창북목장으로부터 입수)를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 초유로부터 엑소좀을 분리하였다.
실시예 3: 엑소좀 분리 방법의 개선
상기 실시예 1 및 2에서 사용한 방법은 초원심분리를 필요로 하고 순차적 원심분리를 수차례 수행하기 때문에, 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이에 본 발명자들은 좀더 간편하면서도 효율성이 높은 엑소좀 분리방법을 개발하고자 하였다.
이를 위해 구체적으로 본 발명자들은 종래에 보고된 우유로부터 엑소좀을 분리하는 방법(Yamauchi et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 45(3): 359-364, 2019)을 변형하여 새로운 엑소좀 분리방법을 고안하였다. Yamauchi 등에 의해 보고된 상기 방법은 우유 원유를 4℃에서 2,000 ×g로 20분간 원심분리하여 지방과 세포를 제거한 후(1차 원심분리), 동일 부피의 증류수를 가하여 희석하고(증류수 희석), 6 N HCl를 가하여 pH를 4.6로 적정함으로써 카세인을 등전점 침전(isoelectric precipitation)으로 제거한 후(등전점 침전), 상온에서 5,000 ×g로 20분간 원심분리하고(2차 원심분리), 1.0, 0.45 및 0.2 μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과하는 공정(순차여과)을 사용한다. 본 발명자들은 상기 방법에서 1차 원심분리 공정을 4℃에서 5,000 ×g로 30분간 수행하는 것으로 변경하고 증류수로 희석하기 전에 40 μm 여과망(strainer, Falcon®, Corning, USA)으로 사전여과(prefilter)함으로써 지방과 세포를 추가로 제거하는 공정을 도입하였으며, 2차 원심분리 후 순차 여과를 하지 않고 0.2 μm 필터만을 사용하는 단회여과 공정을 사용하였다.
실험예 1: 엑소좀 분리 수율 분석
상기 비교예에 따라 분리된 HEK293 세포 유래의 엑소좀, 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따라 각각 분리된 시판 우유 및 초유로부터 분리된 엑소좀의 수율을 BCA 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 이용하여 분석하였다.
그 결과 도 2a에서 확인되는 바와 같이, HEK293 세포로부터 분리된 엑소좀은 수율이 극히 낮은 것으로 나타난 반면 본 발명의 실시예 1에 의해 HEK293 세포 유래의 엑소좀의 분리 수율이 0.01 mg/ml인데 비하여 시판유 유래 엑소좀의 분리 수율은 이보다 5배 정도 높은 0.05 mg/ml인 것으로 확인되었다. 특히, 초유의 경우 단백질 기준으로 최소 0.45 mg/ml로 시판 우유에 비해서도 현저하게 높은 수율을 나타냈다.
한편, 상기 실시예 3의 방법을 이용하여 우유로부터 엑소좀을 분리한 결과, 도 2b에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 비-한외여과 방식의 엑소좀 분리방법을 사용할 경우, 한외여과 방식을 사용한 경우와 비교하여 현저하게 높은 수율을 확인할 수 있었다. 특히, 초유 엑소좀의 경우 한외여과 방식과 비교하여 무려 1000배 이상의 수율을 나타냈다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 우유로부터 엑소좀을 분리하는 방법이 생산성 면에서 매우 우수한 방법임을 입증하는 결과이다.
실험예 2: 엑소좀 마커 확인
본 발명자들은 시판 우유 및 초유에서 분리된 엑소좀이 엑소좀 특성을 그대로 유지하고 있는지 확인하기 위해, 엑소좀 마커인 CD9, CD63, CD81 및 TSG 101에 각각 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.
그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 시판 우유 또는 초유 유래의 엑소좀은 엑소좀 특이적 마커가 정상적으로 확인이 되었다.
실험예 3: 엑소좀 크기 및 형태 확인
본 발명자들은 이어서 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 엑조솜의 입도를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석 장치(Malvern zetasizer nano ZS, UK)을 이용하여 분석하는 한편, 투과 전자현미경으로 생성된 엑소좀을 촬영하였다(도 4). 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 우유 유래 엑소좀은 대조군 엑소좀과 유사하게 그 크기가 68.05 nm 내외의 상당히 좁은 스펙트럼을 갖고 있는 것으로 나타났고, 형태 역시 대조군 엑소좀과 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.
실험예 4: 동결/해동 안정성 분석
본 발명자들은 실시예 1 및 2에 의해 각각 분리된 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀을 화장품 원료로 사용하려고 하였기 때문에, 보관 안정성 특히 동결 후 해동시 안정성 항목을 평가하고자 하였다.
이를 위해 대조군 엑소좀(HaCat 유래 엑소좀)과 실시예 1에서 제조된 시판유 유래 엑소좀 -85℃에서 동결시킨 후 상온에서 해동한 후 투과 전자 현미경 촬영을 하였고, 해동된 엑소좀을 다시 -85℃에서 2차 동결한 후 상온에서 해동시킨 후 투과 전자현미경을 촬영을 하였고(도 5), 동적 산란 분석을 통해 입도분포를 분석하였다(도 6).
그 결과, 도 5에서 확인되는 바와 같이, 대조군 엑소좀은 1차 동결후 해동시 이미 엑소좀 간의 응집현상이 발생하여 원래의 엑소좀 형태를 상실한 반면, 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래 엑소좀의 경우 2차 동결/해동시에도 원형을 그대로 유지하고 있음을 확인할 수 있었다.
아울러, 본 발명자들은 상기와 같은 차이가 대조군 엑소좀의 세포유형에 따른 차이인지 확인하기 위해 대조군의 범위를 확장하여 비교분석을 수행하였다. 이를 위해 구체적으로 본 발명자들은 실시예 2에서 제조된 초유 엑소좀과 인간 각질형성 세포(HaCaT), 마우스 흑색종 세포(B16), 세포 인간 진피 섬유아세포(HDF)로부터 추출된 엑소좀을 동적광산란 분석법을 이용해 동결건조 전과 후 입자의 크기를 측정하였다(도 7a). 그 결과 도 7a에서 확인되는 바과 같이, 세 가지 세포 유래 엑소좀은 동결건조 전과 후에 입자의 크기가 변하는 반면 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀은 입자 크기의 변화가 거의 없는 것을 확인 할 수 있다. 또한 투과전자현미경으로 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀의 동결건조 전 후의 형태를 확인하였는데, 도 7b에서 확인되는 바와 같이, 동결건조 전후로 형태에 있어서 큰 변화가 없는 것으로 나타났다. 따라서 초유 엑소좀은 동결건조 시 구조적 안정성이 뛰어나다는 것을 알 수 있다. 추가적으로 본 발명자들은 인간 진피 섬유아세포에 동결건조 전과 후의 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀을 0.1 mg/ml의 농도로 처리한 후 24시간 뒤 제1형콜라겐 단백질의 발현량을 면역 형광법으로 염색한 후 형광현미경으로 확인하였다(도 7c). 그 결과 도 7c에서 확인되는 바와 같이, 동결건조 후 해동하였을 때에도 콜라겐 합성능이 일정 정도 유지되는 것으로 보아 초유 엑소좀은 동결건조 시 기능적 안정성도 갖추고 있음을 확인할 수 있었다.
아울러, 본 발명자들은 냉동-해동 시 밀크 엑소좀의 구조적 안정성을 확인하기 위하여 냉동-해동 후 입자의 크기를 비교하였다(도 8). 초유로부터 추출한 엑소좀과 인간 각질형성 세포(HaCat), 마우스 흑색종 세포(B16), 인간 진피 섬유아세포(HDF)로부터 추출한 엑소좀을 동적광산란 분석법을 이용해 냉동-해동 횟수를 증가시켜가며 입자의 크기를 측정하였다. 세포 엑소좀은 냉동-해동 횟수를 증가 시킬수록 입자의 크기가 증가하는 반면 초유 엑소좀은 냉동-해동을 5회 까지 실시 하여도 크기의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서 초유 엑소좀은 냉동-해동 시 구조적 안성을 갖는다는 것을 확인 할 수 있다.
실험예 5: 피부 세포 내로의 전달능 평가
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래의 엑소좀이 피부 세포 내로 잘 전달이 되는지 여부를 조사하였다.
구체적으로 본 발명의 실시예 1에 의해 분리된 시판유 유래의 엑소좀의 세포막을 적색형광염색시료인 NHS-Cy5.5로 염색한 다음, 인간 피부 섬유아세포인 HDF 세포에 처리하고 30분 경과 후, 공초점 형광 현미경으로 형광 신호를 관찰하였다. 핵에 대한 대조염색을 위해 DAPI를 사용하였다(도 9).
그 결과, 도 9에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀은 피부 섬유아세포의 세포질로 잘 흡수됨을 알 수 있었다.
실험예 6: 세포독성 평가
본 발명자들은 초유 엑소좀을 처리해 준 인간 진피 섬유아세포인 HDF의 괴사와 자멸사의 비율을 계산하여 초유 엑소좀의 세포독성을 확인하고자 하였다. 0, 0.1, 및 0.3 mg/ml의 농도로 초유 엑소좀을 처리한 후 24시간 뒤 괴사한 세포의 DNA를 염색하여 형광을 나타내는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)와 자멸사한 세포의 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 반응하는 하여 형광을 나타내는 Annexin V/FITC로 염색한 후 유세포분석기로 분석하였다. 그 결과 도 10에서 확인되는 바와 같이, 대조군과 비교하여 괴사나 자연사한 세포의 비율을 확인해 보았을 때 초유 엑소좀 0.3 mg/ml의 농도까지 세포독성을 보이지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 초유 엑소좀이 안전한 물질임을 보여주는 것이다.
실험예 7: 자외선에 의해 손상된 세포 내 항산화 효과 분석
본 발명자들은 자외선 조사로 손상을 입힌 인간 각질형성 세포인 HaCaT에 초유 엑소좀을 처리하였을 때 발생하는 활성산소 감소효과를 통하여 밀크 엑소좀의 항산화 효과를 확인하고자 하였다. HaCaT에 0.05 mg/ml의 농도로 시판유 유래 엑소좀과 초유 엑소좀을 처리 한 후 24시간 뒤 세포에 자외선을 조사하여 세포에 손상을 주었다. 6시간 뒤 활성산소와 반응하여 형광을 나타내는 DCF-DA를 이용하여 세포 내 발생된 활성산소의 정도를 형광 현미경 통해 분석하였다. 그 결과, 도 11a 및 11b에서 확인되는 바와 같이, 자외선으로 손상된 세포 내에서 유통유 유래 엑소좀 및 초유 엑소좀 모두 유의한 항산화 효과를 나타냈으며, 줄기세포 유래 엑소좀 처리시보다 항산화 활성이 더 우수함을 확인하였다.
실험예 8: 피부 세포 재생 및 창상치료효능 평가
이어 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래 엑소좀이 피부세포에 대한 재생능력이 있는지를 조사하였다.
8-1: 피부세포 증식능 평가
이를 위해 구체적으로, 피부세포의 일종인 HaCaT 인간 각질형성 세포와 상기 실험예 5에서 사용된 HDF를 웰당 1x104 cell의 농도로 파종한 후, 시판 우유 유래 엑소좀, 또는 초유 유래 엑소좀 0.2 mg/ml을 처리한 후 48 시간 경과 후 세포를 계수하여 세포 증식 정도를 측정하였다. 대조군에는 동량의 생리식염수만 처리하였다(도 12a 및 12b).
그 결과, 도 12a 및 12b에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래 엑소좀은 대조군에 비해서 두 가지 피부 세포 모두에 있어서 증식능력이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 특히, 초유 유래의 엑소좀의 경우 시판 우유 유래 엑소좀에 비해서 피부세포 증식능력이 더욱 뛰어난 것으로 확인되었다.
8-2: 피부 세포 이동능 평가
피부재생 과정에 있어서, 피부세포의 이동은 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 우유 유래 엑소좀이 세포 이동에 미치는 영향을 확인하기 위해, 스크래치 상처 분석(scratch wound assay)을 실시하였다.
구체적으로, 상기 HaCaT 인간 각질형성 세포와 HDF를 7회 계대배양 시점에 100 mm 디쉬에 80% 세포포화도(confluency)에 도달할 때까지 배양하였다. 24-웰 플레이트에서 웰의 중앙에 표시한 후, 0.1% 젤라틴 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 DPBS로 1회 세척하여 젤라틴으로 코팅된 24-웰 플레이트를 준비하였다. 세포들을 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 분리한 후, 코팅된 플레이트에 웰 당 9×104 cells의 농도로 파종하였다. 세포를 밤새 37℃에서 배양한 후, 200 μL 피펫 팁을 사용하여 세포를 스크래치하고 잔해를 제거하기 위하여 웰을 DPBS로 2회 세척하였다. 그런 다음, 0.5% FBS가 함유된 1 mL 배지를 웰 당 첨가하고 스크래치 0시간 시점을 측정하기 위하여 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 촬영하였다. 다음 군[양성 대조군(10 % FBS DMEM 1 mL), 음성 대조군(0.5 % FBS DMEM 1 mL), EGF(10 ng/mL EGF 0.5 % FBS DMEM 1 mL)]을 제외하고는 0.5% FBS를 함유한 배지를 웰 당 800 μL로 대체하였다. 실시예 1 및 2에서 각각 분리된 엑소좀을 트랜스웰 인서트에 넣고 DMEM에 1% FBS가 함유된 200 μL 배지를 인서트에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 8시간 동안 배양한 후 스크래치된 부분을 찍었다. 스크래치 폭은 이미지-프로 플러스 소프트웨어(Image-Pro Plus software, Media Cybernetics, USA)를 사용하여 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.
[수학식 1]
상처 면적의 배수 = {(A0 - At)/A0}/음성 대조군의 결과값
(식에서 A0는 원래의 상처 면적이고, At는 48시간 후에 상처 면적이다.)
그 결과, 도 13에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래 엑소좀은 대조군 대비 피부 세포 이동능력이 증가함을 알 수 있었다. 특히, 초유 유래의 엑소좀은 우유 유래 엑소좀에 비해서 피부세포 이동능이 현저하게 증가하는 것으로 확인되었다. 그러나, 이러한 사실이 시판 우유의 경우 원료 수급이나 비용 등의 측면에서 더 유리할 수 있으므로, 시판 우유 유래의 엑소좀의 기능성 화장품의 원료로서의 유용성을 해치는 것은 아니다.
8-3: 혈관 내피세포에 의한 관 형성률 분석
본 발명자들은 쥐 유래 내피세포(SVEC4-10)에 초유, 시판유, 혈청 유래 엑소좀을 200 μg/ml의 농도로 처리하여 각 그룹 간의 관 형성 정도를 비교하였다.
먼저 내피세포가 관을 형성할 수 있도록 세포외 기질 역할을 하는 마트리젤(Corning #356237)을 96 well plate에 50 μ씩 분주하여 37℃에서 약 30분 간 굳혔다. 그리고 그 위에서 엑소좀을 처리한 세포를 약 8시간 동안 부착 배양하였다. 이때 관이 형성되는 정도를 현미경(DIC) 사진으로 관찰 비교하였는데 3개 이상의 관이 만나는 점(branch point)과 관의 길이(tube length)를 수치화하여 그래프로 나타내었다(도 14).
측정 결과, 도 14에서 확인되는 바와 같이, 시판유 및 초유와 같은 우유 유래 엑소좀을 처리한 그룹의 경우 아무 처리도 하지 않은 대조군 대비 더 높은 관 형성률을 보였고, 혈청 유래 엑소좀 그룹은 대조군과 크게 차이나지 않는 비슷한 결과를 보여주었다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래 엑소좀은 혈관형성을 촉진함으로써 창상 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
8-4: 생체 내 이미징을 통한 밀크 엑소좀의 생체내 분포 확인
본 발명자들은 쥐의 생체 내 이미징(IVIS)을 통하여 초유 엑소좀을 처리하였을 때 생체 내 분포를 분석하였다.
초유 엑소좀은 PBS 버퍼를 이용하여 1μg/μl의 농도로 맞추고 Flamma 675 NHS ester(BioActs #PWS1515)를 엑소좀 100 μg 기준 1 μl씩 첨가하여 4℃에서 밤새 표지하였다. 이후에는 1시간씩 2번 에어퓨즈를 실행하여 엑소좀에 붙지 않은 염색 물질을 제거하였다. 쥐 한 마리당 엑소좀 100 μg씩 쥐의 왼쪽 허벅지 위쪽에 피하주사를 진행하였으며 주입한 날부터 매일 7일 동안 같은 시간대에 IVIS® 생체내 이미징 시스템(PerkinElmer, USA)을 이용하여 생체내 이미징을 수행하였다(도 15a). 이때 둘째 날에는 5대 장기와 피부 조직을 적출을 하여 초유 엑소좀이 분포하는 정도를 장기별로 확인하였다(도 15b 및 15c). 그 결과, 도 15a에서 확인되는 바와 같이, 초유 엑소좀은 3일 이후 대부분 체내에서 빠지는 것을 확인할 수 있었으며 완전히 체내에서 빠져나가는 데에는 약 7일이 걸렸다. 장기 적출 결과, 도 15b 및 15c에서 확인되는 바와 같이, 피부에서 형광이 가장 많이 검출되고 그 다음으로는 간, 폐, 신장 순으로 나타났다. 이를 통하여 초유 엑소좀이 체내에 머무른 후 신장을 통해 결국 빠져나가는 것도 확인할 수 있었다.
8-5: 창상 모델 동물을 이용한 효능 분석
본 발명자들은 우유 유래 엑소좀의 실제 피부 조직 재생 효과를 확인하기 위하여 창상 동물 모델링을 진행하였다.
동물은 웅성 Balb/c 7주령 쥐를 사용하였고 직경 8 mm 생검 피부 펀치를 사용하여 등에 창상을 유도하였다. 실험군은 총 5가지(대조군, 혈청, 시판유, 초유 및 초유-4일차)로 나누었고 상기 실험예 8-4의 생체 내 분포 결과를 바탕으로 3일 간격으로 총 3번 엑소좀을 피하주사로 투여하였다. 초유-4일차 그룹을 제외한 나머지 네 그룹은 1, 4, 7일차에 각각의 물질을 투여하였고 초유-4일차 그룹은 4, 7, 10일에 초유 엑소좀을 투여하였다. 이때 물질 처리 농도는 1 μg/μl로 한 마리당 총 부피 100μl씩 처리하여 약 25일 동안 경과를 살펴보았다(도 16).
그 결과, 도 16에서 확인되는 바와 같이, 초유 엑소좀을 투여한 그룹과 초유-4일차 그룹이 현저히 빠르게 피부 상처가 재생되었으며, 특히 초유-4일차 그룹은 4일부터 10일 사이에 다른 그룹보다 더 빠른 재생 속도를 보여주었다. 초유 처리군 다음으로는 시판유 엑소좀을 처리한 그룹과 PBS를 처리한 대조군, 그리고 혈청 유래 엑소좀을 처리한 그룹 순으로 피부가 재생되는 것을 확인하였고 이를 통해 우유 유래 엑소좀이 다른 실험군보다 더 높은 피부재생 효과를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.
8-6: 면역조직화학 분석
본 발명자들은 창상 모델 동물 실험 후에 조직 분석을 위해 면역 조직 화학법을 실행하였다.
구체적으로, 동물 실험 25일 차에 쥐를 희생시킨 후, 창상 부위 조직을 절제하여 고정액에 밤새 두고 조직을 고정시켰다. 조직에 파라핀을 침투시키기 위하여 자일렌부터 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올까지 차례로 거쳐 탈수 과정을 진행하였고 이후에 파라핀으로 엠베딩하여 블록을 만들었다. 조직 박절기를 이용하여 6 μm 두께의 파라핀 조직 절편을 내어 DAB 키트(Abcam #ab64264)에서 제공하는 실험방법에 따라 실험하였다. 먼저 슬라이드 위 조직에서 파라핀 성분을 제거하고 하이드로젠 퍼옥시데이즈(hydrogen peroxidase) 차단 완충액으로 상온에서 10분간 반응시킨 후 리트리벌(Retrieval) 용액을 넣고 95℃에서 10분간 끓여서 단백질간 가교결합(cross-liking)을 끊어내었다. 그 다음 단백질 차단 완충액으로 상온에서 10분간 반응시킨 후 엘라스틴에 대한 1차 항체(santacruz #sc-58756)를 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 바이오틴화 염소 항-1차 항체 용액과 스트렙타비딘-퍼옥시데이즈 용액을 첨가하고 각각 상온에서 10분씩 반응시키고 DAB 발색체(chromogen)와 DAB 기질을 1:50 비율로 혼합하여 항체-처리된 조직 박편 위에 올려 상온에서 10분 간 발색 변화를 관찰하였다. 마지막으로 대조염색을 진행하여 핵을 염색하고 톨루엔으로 마운팅하여 마무리하였다.
조직 현미경 관찰 결과, 도 17에서 확인되는 바와 같이, 우유 유래 엑소좀 중에서도 특히 초유 엑소좀을 처리한 그룹의 조직에서 다른 그룹보다 더 진하게 갈색이 발현되는 것을 확인할 수 있었고 이는 해당 그룹의 조직에서 엘라스틴 성분이 더 많이 검출되는 것으로 결론지을 수 있다. 아울러, 이러한 밀크 엑소좀의 엘라스틴 발현 강화 효능은 이하 기재될 주름개선 효과와도 밀접한 관련이 있다.
실험예 9: 주름 개선 효과 분석
피부 주름은 진피층의 세포외 기질의 주성분인 콜라겐이 피부 재생 주기 동안 분해가 된 후 콜라겐 생성효소에 의해 다시 생성이 되어야 하는데 콜라겐 생합성이 원활하게 이루어지지 않아 진피층의 세포외 기질이 회복이 되지 않기 때문에 발생하는 증상이다. 따라서, 본 발명자들은 피부주름 개선의 척도로 콜라겐 생합성의 증진 및 콜라겐 분해효소인 메탈로프로테이네이즈 2(MMP-2)의 발현 억제 정도를 측정함으로써 조사하였다.
이를 위해 본 발명자들은 구체적으로 사람의 피부 섬유아세포(HDF)를 35π 글래스바텀 디쉬에 파종하고(3x105 cells) 37℃, 5% 농도의 CO2 배양기에서 24시간 배양한다. 그런 다음 실시예 1 및 2에서 각각 분리된 시판유 유래 엑소좀 및 초유 유래 엑소좀을 각각 0.1 mg/ml의 농도로 처리 한 후 24시간 뒤 콜라겐 타입 1 단백질을 면역 형광법을 이용해 염색한 후 형광 현미경으로 확인하였고, 금속단백분해효소 2는 웨스턴 블랏으로 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과 도 18a 및 18b에서 확인되는 바와 같이, 시판유 유래 엑소좀 및 초유 엑소좀을 처리한 HDF에서 콜라겐 타입 1 단백질의 발현량은 증가하고 MMP-2 단백질의 발현량은 감소하는 것으로 확인되었으며, 따라서, 상기 실험예 8-6의 결과와 종합하여 살펴보면, 밀크 엑소좀의 피부 주름개선 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실험예 10: 미백 활성 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래의 엑소좀이 피부 미백활성을 갖는지 확인하기 위해서 미백활성의 대표적인 지표인 멜라닌 생성 저해를 조사하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 마우스 흑색종 세포인 B16F10에 밀크 엑소좀(시판유 유래 엑소좀 및 초유 엑소좀)을 처리한 뒤 생성되는 멜라닌 색소의 양을 측정하여 멜라닌 색소 감소 효과를 확인하고자 하였다. 대조군으로는 B16F10 세포로부터 분리한 엑소좀을 사용하였다. B16F10 세포에 0, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02 mg/ml의 농도로 각각의 엑소좀을 처리하고 24시간 뒤 세포에 자외선을 조사하여 자극시켰다. 그런 다음, 24시간 뒤 같은 양의 세포로 부터 멜라닌 색소를 추출하고 추출한 멜라닌 색소를 490 nm 파장대에서 측정·분석하였다. 그 결과, 도 19에서 확인되는 바와 같이, 대조군과 비교해 보았을 때 초유 엑소좀의 농도 0.002 mg/ml 까지 멜라닌 색소의 생성량은 큰 차이가 없는 반면 초유 엑소좀의 농도 0.005 mg/ml 내지 0.02 mg/ml의 처리농도에서는 멜라닌 색소 감소 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 B16F10에서 추출한 엑소좀, 시판유 유래 엑소좀과 초유 엑소좀을 0.1 mg/ml의 농도로 B16F10에 처리하여 24시간 뒤 멜라닌 색소 생성량을 비교하였다(도 19의 c). 그 결과, 세포에 자외선으로 자극을 주었을 때와 자극을 주지 않았을 때 모두 밀크 엑소좀을 처리해 준 세포에서 멜라닌 색소 생성량이 가장 많이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 11: 면역기능 활성 분석
본 발명자들은 BMDM(골수 유래 대식세포)에 시판유 유래 엑소좀, 초유 엑소좀 50 μg/ml을 처리하여 24시간 후 세포배양액에서의 사이토카인(cytokine)을 분석하였다.
구체적으로 본 발명자들은 세포 배양액에 있는 사이토카인을 분석하기 위해, 세포 배양액 1 ml을 사용하였으며, 사이토카인 어레이 키트(ARY006)에서 제공된 실험방법을 활용하였다. 먼저, 여러 사이토카인에 대한 1차 항체가 결합되어 있는 막을 차단완충액으로 상온에서 30분간 차단한 후, 세포 배양액 1 ml을 막에 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후 막에 바이오틴이 결합된 2차-항체 칵테일을 처리하여 4℃에서 밤새 반응시킨 후, HRP-스트렙타비딘을 상온에서 2시간 반응시키고, 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다. 그 결과, 도 19에서 확인되는 바와 같이, 시판유 및 초유를 처리한 그룹에서 T 세포, 수지상 세포 확성화 및 염증반응에 관여하는 인자인 CD54, CXCL1, CCL3, CCL5, 및 TNF-α의 발현이 아무것도 처리하지 않은 대조군 그룹과 비교하여 상대적으로 높게 나타났다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 면역반응을 활성화시킴을 의미하는 것이다.
실험예 12: 성장인자 발현 증가능 분석
본 발명자들은 NIH-3T3 섬유아 세포에 시판유 유래 엑소좀 및 초유 엑소좀을 각각 100 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 후 세포 배양액과 세포 용해물로부터 다양한 성장인자의 발현 정도를 분석하였다. 실험을 위해 세포 용해물을 단백질 정량기준 500 μg씩 준비하고 시료 용액 부피가 총 1 ml이 되도록 세포 배양액을 추가하였다. 단백질 발현 정도 분석은 성장 인자 어레이 키트(RayBiotech #AAM-GF-3-4)에서 제공된 실험방법에 따라 수행하였다. 먼저 성장인자에 대한 1차 항체가 결합되어 있는 막을 상온에서 30분간 차단 완충액으로 처리한 후, 준비한 시료 1 ml를 첨가한 뒤 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날 충분히 막을 세척한 후 바이오틴화 2차 항체 칵테일을 처리하여 상온에서 2시간 반응시키고 차례로 HRP-스트렙타비딘을 상온에서 2시간 반응시켜서 해당 결과를 화학발광(Bio-Rad)에 의해 시각화하여 나타내었다. 그 결과, 도 21에서 확인되는 바와 같이, 시판유 유래 엑소좀 및 초유 엑소좀을 처리한 실험군의 경우 대조군과 비교했을 때, 항염증 반응과 조직 재생, 혹은 혈관신생에 관여하는 HGF, IGF-1, PDGF-AA, 및 VEGF-A가 더 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 13: 간세포 증식 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래의 엑소좀이 간 건강 개선을 위한 건강기능식품의 원료로 효능평가를 위해서 인간 유래의 간세포의 활성도를 조사한다.
인간 유래 간세포를 96웰 플레이트에 웰당 1x104 cell의 농도로 파종한 후, 37℃, 5% 농도의 CO2 배양기에서 24시간 배양한다. 실시예 1 및 2에서 각각 분리된 시판 우유 및 초유 유래 엑소좀 (0.2) mg/ml을 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하고, 세포의 증식을 CCK-8 assay(Dojindo molecular technologies, Japan)를 이용하여 평가한다. 대조군에는 동량의 생리식염수만 처리한다. CCK-8 염색 용액을 각 웰에 10 ul를 첨가하고 4시간 배양 후 450nm에서 흡광도 값을 측정하여 비교한다.
실험예 14: 탈모방지 및 육모·발모 효과 분석
14-1: 모유두 세포에 의한 밀크 엑소좀 흡수 분석
본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 탈모예방 또는 치료효과를 나타내기 위해서는 모발성장을 돕는 세포인 모유두 세포에 의해 흡수되어 증식을 촉진하는 모유두 세포 증식활성을 나타내야 한다. 이에, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 배양중인 모유두 세포에 의해 잘 흡수가 되는지 여부를 조사하였다.
이를 위해 구체적으로 본 발명자들은 Cy5.5 형광 염료로 표지한 시판유 유래 엑소좀 100 μg/ml을 배양중인 인간 모유두 세포에 각각 1시간, 4시간, 12시간 및 24시간 동안 처리한 후, 세포 내 흡수 정도를 형광현미경으로 관찰하였다(도 22a). 그 결과, 도 22a에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀은 처리 시간에 비례하여 인간 모유두 세포에 의해 잘 흡수가 됨을 확인할 수 있었다.
14-2: 모유두 세포 증식 분석
본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 유래의 엑소좀이 모발 건강 및 탈모 개선 기능을 평가를 위해서 인간 모유두 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였다.
이를 위해 구체적으로 본 발명자들은 먼저, 실시예 1에서 제조된 시판유 유래 엑소좀 100, 250, 및 500 μg/ml을 인간 모유두 세포에 48시간동안 처리하여 셀 카운트 키트 8(CK04-20)에 제공된 실험방법을 활용하여 세포를 계수하였다. 세포배양액 200 μl에 셀 카운트 키트 반응용액 20 μl씩 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 30분간 반응을 시켰다. 이후 450 nm 파장에서 그 값을 측정하여 시각화하였다. 아울러 인간 모유두 세포에 탈모유발물질(다이하이드로테스토스테론, DHT) 100 μM을 24시간 처리한 후 시판유 유래 엑소좀 500 μg/ml을 48시간동안 처리한 후, 세포배양액 200 μl에 셀 카운트 키트 반응용액 20 μl씩 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 30분간 반응시켰다. 이후 450 nm 파장에서 그 값을 측정하여 시각화하였다(도 22b). 그 결과, 도 22b에서 확인되는 바와 같이, 시판유 유래 엑소좀 500 μg/ml 처리한 그룹이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 세포가 활발하게 세포증식을 유도함을 확인할 수 있었다. 반면, 탈모 유발물질만 처리한 그룹에서는 대조군에 비해 세포증식 활성도가 감소했으나, 탈모 유발물질 처리 후, 시판유 유래 엑소좀 500 μg/ml을 처리한 그룹에서는 세포증식 활성도가 다시 DHT 처리 전 수준으로 회복됨을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 탈모 방지에도 효과가 있음을 시사하는 것이다.
14-3: 육모·발모효과 분석
상기 실험예 14-2의 결과를 바탕으로 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀이 탈모방지 뿐만 아니라 육모·발모에도 효과가 있는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 실험동물을 이용한 육모·발모 촉진효과를 조사하였다.
이를 위해 구체적으로, 본 발명자들은 웅성 C57BL/6 7주령 쥐의 등 전체면적을 짧게 깎고 비트크림을 도포하여 킴테크로 잔여 털을 깔끔하게 제거한 뒤(0일차), 1일차부터 격일로 시판유 유래 엑소좀 20 μl씩을 등 가운데 5 부위(척추를 따라서)에 총 100 μl(200 μg) 피부내 주사(intradermal injection)로 투여하였다. 그런 다음, 3-4일 간격으로 발모양상을 모니터링하였다. 그 결과, 도 22c에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 시판유 유래 엑소좀을 투여한 그룹에서 털이 더 빨리 자라는 것을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 밀크 엑소좀은 탈모방지는 물론 육모·발모 성능이 우수함을 알 수 있다.
제조예 1: 영양화장수(lotion)
본 발명의 일 실시예에 따라 수득된 시판 우유 또는 초유 유래의 엑소좀을 함유한 영양화장수를 하기의 표 1의 성분비로 배합하여 제조하였다.
영양화장수의 배합비
성분 함량(단위: 중량%)
우유 유래 엑소좀 0.5
글리세릴 스테이라에트 SE 1.5
세테아릴 알코올 1.5
라놀린 1.5
폴리솔베이트 60 1.3
솔비타스테아레이트 0.5
경화야자유 4.0
광물유 5.0
트리옥타노인 2.0
디메치콘 0.8
초산 토코페롤 0.5
카르복시비닐 폴리머 0.12
글리세린 5.0
1,3-부틸렌글리콜 3.0
소듐하이알루로네이트 5.0
트리에탄올아핀 0.12
유니사이드-유 13 0.02
증류수 잔량
합계 100
제조예 2: 영양크림
본 발명의 일 실시예에 따라 수득된 시판 우유 또는 초유 유래의 엑소좀을 함유한 영양크림을 하기의 표 2의 성분비로 배합하여 제조하였다.
영양크림의 배합비
성분 함량(단위: 중량%)
우유 유래 엑소좀 0.5
친유형 모노스테라린산 글리세린 1.5
세테아릴 알코올 1.5
스테아린산 1.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비타스테아레이트 0.6
이소스테아릴 이소스테레이트 5.0
스쿠알렌 5.0
광물유 35.0
디메치콘 0.5
하이드록시에틸셀룰로오스 0.12
트리에탄올아민 0.7
글리세린 5.0
유니사이드-유 13 0.02
증류수 잔량
합계 100
제조예 3: 탈모 개선용 샴푸의 제조
본 발명의 일 실시예에 따라 수득된 시판 우유 또는 초유 유래의 엑소좀을 함유한 탈모 개선용 샴푸를 하기의 표 3의 성분비로 배합하여 제조하였다.
탈모 개선용 샴푸의 배합비
성분 함량(단위: 중량%)
우유 유래 엑소좀 1.0
소듐파우레스설페이트 0.7
소듐라우릴설페이트 0.7
폴리쿼터늄-7 1
하이드롤라이즈드실크 0.5
판테놀 1.0
글리세린 2.5
코카미도플로필베타인 0.7
필리쿼터늄-10 0.5
에틸헥실글리세린 3.5
디소듐이디티에이 1.0
구연산 0.7
부틸렌글리콜 0.7
페녹시에탄올 0.5
향료 0.2
증류수 잔량
합계 100
제조예 4: 건강기능식품(연질캡슐제)의 제조
본 발명의 일 실시예에 따라 수득된 시판 우유 또는 초유 유래의 엑소좀을 함유한 연질캡슐제를 하기의 표 4의 성분비로 배합하여 제조하였다. 하기 분량의 재료를 혼합하고 균질화한 다음 통상의 방법에 따라 일정 중량의 연질캅셀에 충전하여 제조한다.
연질 캡슐의 제조
성분 함량(단위: mg)
동결건조 우유 유래 엑소좀 1000
히알루론산 75
콜라겐 펩타이드 75
비타민 C 75
비타민 B2 4
비타민 B6 3
토코페롤 50
식이섬유 100
소백배아유 3,500
밀납 500
왁스 500
본 발명의 일 실시예에 따른 시판 우유 및 초유 유래의 엑소좀은 일반 배양 세포 유래의 엑소좀에 비해 수율이 매우 높을 뿐만 아니라, 일반 배양세포가 가지지 못하고 있는 저장 안정성을 나타냈을 뿐만 아니라, 피부 세포의 재생능력이 매우 탁월한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 우유 또는 산양유 유래의 엑소좀은 피부재생을 위한 기능성 화장품의 원료로 매우 효율적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (20)

  1. 초유로부터 분리된 초유 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부재생용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유인, 주름개선용 화장료 조성물.
  5. 초유로부터 분리된 초유 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물.
  6. 삭제
  7. 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 탈모개선 용 기능성 샴푸.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유인, 탈모개선용 기능성 샴푸.
  9. 초유를 4℃의 온도조건에서 4,000 내지 6,000 ×g로 20 내지 40분간 원심분리하여 지방 및 세포를 제거하는 1차 원심분리 단계; 원심분리된 초유를 20 내지 60 μm의 망목을 갖는 여과망으로 여과하여 지방 및 세포를 추가적으로 제거하는 여과망 여과 단계; 여과된 초유에 동일 부피의 증류수를 가하여 희석하는 희석 단계; 희석된 초유에 산을 가하여 pH를 4 내지 5로 조정함으로써 초유 내의 카세인을 침전시키는 등전점 침전 단계; 카세인이 침전된 초유를 상온에서 4,000 내지 6,000 ×g로 15 내지 30분간 추가 원심분리하여 상등액을 수집하는 2차 원심분리 단계; 및 수집된 상등액을 0.2 μm 필터로 여과하는 여과 단계를 포함하는 방법에 의해 분리된 초유 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 T 세포 및 수지상 세포의 활성화 및 염증반응 강화를 특징으로 하는 면역 기능 개선용 건강기능식품
  10. 우유 또는 산양유로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항산화 기능성 건강기능식품.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 우유 또는 산양유는 원유, 시판 우유 또는 산양유 또는 초유인, 항산화 기능성 건강기능식품.
  12. 초유로부터 분리된 초유 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 창상 치료용 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 치료적으로 유효한 양의 초유로부터 분리된 초유 엑소좀을 인간을 제외한 포유동물 개체의 손상된 피부에 도포하는 단계를 포함하는 상기 개체의 손상된 피부재생 촉진 방법.
  15. 삭제
  16. 우유 또는 산양유를 4℃의 온도조건에서 4,000 내지 6,000 ×g로 20 내지 40분간 원심분리하여 지방 및 세포를 제거하는 1차 원심분리 단계;
    원심분리된 우유 또는 산양유를 20 내지 60 μm의 망목을 갖는 여과망으로 여과하여 지방 및 세포를 추가적으로 제거하는 여과망 여과 단계;
    여과된 우유 또는 산양유에 동일 부피의 증류수를 가하여 희석하는 희석 단계;
    희석된 우유 또는 산양유에 산을 가하여 pH를 4 내지 5로 조정함으로써 우유 또는 산양유 내의 카세인을 침전시키는 등전점 침전 단계;
    카세인이 침전된 우유 또는 산양유를 상온에서 4,000 내지 6,000 ×g로 15 내지 30분간 추가적으로 원심분리하여 상등액을 수집하는 2차 원심분리 단계; 및
    수집된 상등액을 0.2 μm 필터로 여과하는 여과 단계를 포함하는, 우유 또는 산양유로부터 엑소좀을 분리하는 방법.
  17. 삭제
  18. 제16항에 있어서,
    상기 여과망은 30 내지 50 μm의 망목을 갖는 여과망인, 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 산은 염산, 질산, 초산 또는 황산인, 방법.
  20. 삭제
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