JP3188457B2 - 免疫促進剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、ラクトフェリン由来のペプチドを含み、
免疫系細胞からの炎症媒介因子（inflammatory mediato
rs）の放出を調節して細胞免疫応答を強化する活性を有
する免疫促進剤に関するものである。さらに詳しくは、
この発明は、少なくとも下記の活性を有するラクトフェ
リン由来のペプチドに関するものである：（１）多形核
好中球からのロイコトリエンB4の放出を促進させる；
（２）肥満細胞からのヒスタミン放出を促進させる。

背景技術 多形核好中球および肥満細胞は、殺菌、真菌およびウ
イルスの感染に対する宿主の防御に主要な役割を果たし
ている。微生物およびその産生物は、これらの細胞と直
接に相互作用して、ロイコトリエンおよびヒスタミンな
どの炎症媒介因子の放出を誘発することができ、これら
の因子は炎症反応の増幅および抑制に本質的で多様な効
果を有している。ロイコトリエンB4は、強力なケタモミ
ティック（走化性）およびケモタキティック（化学活動
性）因子であって、これらの因子は好中球、好酸球、単
球及びマクロファージを感染部位および組織の外傷部位
に誘引する。ロイコトリエンB4は、好中球の凝集を促進
し、内皮細胞への好中球の付着を増大させ、リソゾーム
酸素の放出および過酸化物の産生を刺激する。ロイコト
リエンB4はまた、サプレッサーＴ細胞の誘導を介してリ
ンパ細胞の増殖を抑制し、細胞殺傷性およびNK細胞の活
性を増強させる。他方で、ロイコトリエンC4、D4、およ
びE4は、アナフィラキシー反応の遅反応性物質であり、
アナフィラキシー反応は平滑筋の持続性収縮、気管狭
搾、血管収縮、粘液分泌、血管透過性の増大を引き起こ
す。ヒスタミンは、血管拡張、血管透過性の増大、気管
分泌の刺激、平滑筋の収縮を誘発する。更に、ヒスタミ
ンは、細胞殺傷、リンパ球増殖、リホカイン産生および
免疫グロブリン合成などのある種の免疫促進機能を調節
する。一般に、ロイコトリエンB4およびヒスタミンの生
物活性は、細胞性免疫応答を増強し、微生物感染に対す
る宿主防御を刺激する傾向がある。

好中球の補充および刺激というロイコトリエンB4の生
物活性が、微生物感染にたいする宿主防御の基本である
ことは広く認識されている。多形核好中球の循環血から
感染巣への遊走は、炎症プロセスの初期事象のひとつで
ある。この細胞は感染巣で循環を停止し、侵入した微生
物の近くに放出された走化性因子に応答して、走化性に
より感染部位および組織の外傷部位に導かれる。ロイコ
トリエンB4は、好中球にとって最も強力な走化性刺激で
ある。この走化性刺激は、細胞活動を増進し、付着、囲
い込み、取り込み、脱顆粒、ファゴリソーム内へのリソ
ゾーム酸素の分泌、および毒性のある酸素ラジカルの発
生、を含む宿主防御に必須のさまざまな一連のプロセス
を可能にさせ、最終的に侵入した微生物を死滅させる。
好中球は、この炎症媒介因子の生成および代謝により、
それらの環境におけるロイコトリエンB4の濃度を調節す
る。ロイコトリエンB4は、細胞表面の特異的レセプター
に結合し、内部に取り込まれ、酵素により酸化されて生
物学的に不活性な産生物である20−OH−ロイコトリエン
B4および20−COOH−ロイコトリエンB4を産生する。重度
の火傷患者のような重大な傷害の場合には、好中球の走
化応答性は損なわれ、ロイコトリエンB4の産生と放出は
減少して、ロイコトリエンB4の20−OH−ロイコトリエン
B4および20−COOH−ロイコトリエンB4への代謝は促進さ
れ、細胞表面のロイコトリエンB4レセプターの出現は減
少する。このようなロイコトリエンB4の産生の減少とロ
イコトリエンB4への応答性の低下によって、組織障害部
位における食細胞の増加が不十分となり、その結果、微
生物の侵入をゆるすことになる。

ラクトフェリンは鉄結合性タンパク質であって、哺乳
動物の乳、唾液、涙および粘膜分泌物を含む様々な体液
中に存在し、また炎症部位における活性化された多形核
好中球から放出される。牛ラクトフェリンは牛乳由来の
生の脱脂乳またはチーズ・ホエーから抽出することによ
り大量に得られるため、牛ラクトフェリンは酪農工業の
商業産物として容易に入手できる。ラクトフェリンは鉄
を含まない状態で広範な抗微生物活性を示し、その活性
は一般にラクトフェリンが鉄をキレートして、微生物の
生育を抑制する鉄欠乏環境を生ぜしめる能力によるもの
とされていた。この発明の発明者らはこのラクトフェリ
ンを酵素分解することにより、さらに強力な抗筋活性を
有するペプチドが生成されることを初めて見いだした
（特開平２−238364）。ラクトフェリンの由来の抗菌性
ペプチドは鉄結合性とは別のメカニズムにより機能し、
しかもヒトおよび動物の公知の病原菌株を含めて、グラ
ム陰性菌、グラム陽性菌、酵母、および黴の多くの種に
低濃度で効果があることが明らかになった。このペプチ
ドの微生物に対する効果は致死的であって、コロニー形
成能を急速に失わせる。安全で有効な抗菌剤としてのこ
のペプチドの広範な商業的用途に関しては多くの可能性
が存在し、特願平３−150604に記載されているようにそ
のペプチドの大量生産の新規な製造法も確立されてい
る。

ラクトフェリンがカルシウム・イオノフォアにより誘
発される腹腔肥満細胞からのヒスタミンの放出を阻害す
る活性を有することは実証されている［Theobald,K.et
al.,（1987）,Agents and Actions 20:10−16）］が、
ロイコトリエンなどの他の炎症媒介因子の放出について
の効果は知られていない。ラクトフェリン由来のペプチ
ドが免疫系細胞からの炎症媒介因子の放出を調節するか
否かについては従来研究されていなかった。

この発明の発明者らは、免疫系細胞からの炎症媒介因
子の放出に関してラクト フェリン由来のペプチドの効
果を始めて研究した。そして、驚くべきことに、特願平
２−238364に記載されたラクトフェリンの抗菌性ペプチ
ドが、免疫促進性ペプチドであり、多形核好中球および
肥満細胞からのロイコトリエンB4およびヒスタミンの放
出を調節し、それによって細胞性免疫応答を強化する優
れた活性を有することを発見した。これに反してラクト
フェリンはこのような免疫増進活性を示さなかった。

発明の開示 この発明は、ラクトフェリン由来のペプチドが免疫系
細胞からの炎症媒介因子の放出を調節し、それによって
ヒトおよび動物の細胞性免疫応答を強化する能力を有す
るという発見に基づいている。

この発明の目的は、ラクトフェリン由来のペプチドを
含む免疫促進剤を提供することである。

この発明の他の目的は、ラクトフェリン由来のペプチ
ドを有効成分として含む免疫促進性組成物を提供するこ
とである。

この発明のこれらの目的は、少なくとも下記の活性を
有するラクトフェリン由来の免疫促進性ペプチドを提供
することにより達成される：（１）多形核好中球からの
ロイコトリエンB4の放出を促進すること；（２）肥満細
胞からヒスタミンの放出を促進すること。

この発明を実施する最良の態様 この発明のペプチドは、ラクトフェリンの加水分解も
しくは公知のペプチド合成法により生産し、精製するこ
とができる。例えば、この発明のペプチドを得る好適な
方法は次のとおりである。脱脂乳またはチーズ・ホエー
から分離した牛ラクトフェリンを蒸留水に５％（w/v）
の濃度で溶解し、1NのHClを加えてpHを3.0に調整する。
ペプシンを３％（基質に対してw/w）の最終濃度で添加
し37℃で４時間加水分解を行う。この反応を80℃、15分
間の加熱により停止させ、得られたペプチド混合物のpH
を1NのNaOHを添加して7.0に調整する。不溶性ペプチド
を濾過または遠心により除去し、得られた溶液から活性
ペプチドを精製する。例えば、ブチル−トヨパール650M
（トーソー）のようなブチル基を有する疎水性クロマト
グラフ用担体にこの溶液を接触させ、この担体を水で洗
浄して結合していないペプチドを除去し、一定のpH、好
ましくはpH4.8〜5.2で目的とする免疫促進性ペプチドを
脱離し、得られた脱離液を脱塩する。脱塩は例えば同一
のブチル−トヨパール650Mカラムを用いて行うことがで
きる。このペプチドを含有する溶液を1NのNaOHを加えて
pH7.0に調整し、疎水性担体と接触させる。この担体を
水で洗浄して緩衝液の塩を除去し、最後に活性ペプチド
を10mMのHClで脱離して凍結乾燥する。これにより、一
切の生物活性物質を含まず、所望の品質をもったこの発
明のペプチドが99％以上の純度で得られる。

この発明者らは、定義された性質と機能とをもった牛
ラクトフェリンのペプチドの分離と精製に成功し、引き
続き免疫系細胞からの強力な炎症媒介因子の放出を促進
する活性を実証することに初めて成功した。

例えば、この発明のペプチドはPhe−Lys−Cys−Arg−
Arg−Trp−Gln−Trp−Arg−Met−Lys−Lys−Leu−Gly−
Ala−Pro−Ser−Ile−Thr−Cys−Val−Arg−Arg−Ala−
Pheの配列をもったアミノ酸の単一鎖からなっている。
このペプチドは、特願平２−238364に記載された、広範
な抗菌活性を有るペプチドと同一である。即ち、この発
明のペプチドは免疫促進特性と抗菌特性との両方を有し
ている。

この発明の明細書においては、アミノ酸およびペプチ
ドは生化学命名についてのIUPAC−IUB協会により採用さ
れた略号により下記のとおりに標記されている。

Ala−:L−アラニン残基 Arg−:L−アルギニン残基 Asn−:L−アスパラギン残基 Asp−:L−アスパラギン酸残基 Cys−:L−システイン残基 Gln−:L−グルタミン残基 Glu−:L−グルタミン酸残基 Gly−：グリシン残基 His−:L−ヒスチジン残基 Ile−:L−イソロイシン残基 Leu−:L−ロイシン残基 Lys−:L−リジン残基 Met−:L−メチオニン残基 Phe−:L−フェニララニン残基 Pro−:L−プロリン残基 Ser−:L−セリン残基 Thr−:L−スレオニン残基 Trp:−Ｌ−トリプトファン残基 Tyr−:L−チロシン残基 Val−:L−バリン残基 哺乳動物のラクトフェリンはアミノ酸配列の相同性が
高いことがよく知られていると言う事実を考慮すれば、
この発明のペプチドのアミノ酸配列を実質的に含むが、
免疫促進特性を失わない程度にわずかなアミノ酸が置換
された免疫促進性ペプチドが、例えばヒト、水牛、羊、
山羊など他の動物のラクトフェリン加水分解により生産
できるかもしれないことは、この発明の発明者らの発見
の結果から明らかである。さらに、この発明のペプチド
配列を実質的に含むが、免疫促進特性を失わない程度に
わずかなアミノ酸が欠如し、付加され、あるいは置換さ
れ、あるいはさらにわずかな化学的修飾を受けた免疫促
進性ペプチドが、公知のペプチド合成法により生産でき
るかもしれないことは明らかである。従って、そのよう
な自明のペプチドがこの発明にとって新規または別のも
のと考えるべきではなく、この発明は当然それらのペプ
チドも対象としている。

このようにして得られたペプチドは少なくとも下記の
免疫促進活性を有する：（１）多形核好中球からのロイ
コトリエンB4の放出を促進する；（２）肥満細胞からの
ヒスタミンの放出を促進する。これらの有用な活性は、
例えばこの明細書において後に詳述する方法（試験例１
〜３参照）により容易に実証できる。好中球及び肥満細
胞からのこのような強力な炎症媒介因子の放出の促進に
より、本発明のペプチドは細胞性免疫応答を強化し、感
染症に対する宿主防御を増進する。最も重要なことは、
好中球からのロイコトリエンB4の放出を促進する活性
が、感染部位および組織傷害部位での貧食細胞の増殖お
よび刺激を促進し、それにより侵入した微生物の破壊を
促進することができるということである。

このような活性は、例えば重度の火傷のような重大な
傷害の場合にとりわけ有益である。このような傷害では
多形核好中球はロイコトリエンB4の産生低下を示し、ま
たロイコトリエンB4にたいする応答性を低下させる。

このようにして得られた免疫促進性ペプチドは、組成
物中に有効成分として少なくとも1ppm、好ましくは10か
ら100ppmの濃度で含有させて、この発明の免疫増進性組
成物を得ることができる。

この組成物は薬学的に許容される溶剤（例えば水、エ
タノール、グリセロール、プロピレングリコール、液状
ポリエチレングリコール）、改良、甘味料、バインダ
ー、等張化剤（isotonic agents）、コーティング剤、
表面活性剤、吸収遅延剤、等を含んでいてもよい。これ
らの素材の使用は当該技術分野において周知である。有
効成分と不適合である場合を除き、あらゆる既存の媒体
または素材をこの組成物に使用することができる。補充
的な活性成分もこの組成物中に含ませることができる。
もちろん組成物を調製するのに用いられるすべての素材
は使用量において毒性がないことは当然である。

この発明のペプチドはヒトまたは動物に投与でき、例
えば、経皮的、点眼的、経耳的、経鼻的、経肛門的また
は経膣的に、粉末のまま、または溶液、懸濁液、クリー
ム、軟骨、スプレーの成分として投与できる。このペプ
チドは経口的に投与することができ、例えば粉末、水溶
液として投与でき、あるいはまたカプセル、錠剤、シロ
ップ、エリキシルなどに含ませてもよく、さらに通常の
食品中に直接混入してもよい。このペプチドはまた滅菌
注射液の成分として腸管外、腹腔内、または経筋肉内に
投与できる。

この発明のペプチドは医薬製品（眼薬、乳腺炎治療
薬、水虫治療薬など）、医薬部外品（口内洗浄剤な
ど）、化粧品（スキンローション、クリームなど）、食
品（チューインガムなど）にも用いることができ、さら
にこの発明のペプチドは免疫促進活性が望まれるあらゆ
る製品（手術着、包帯など）に添加し、配合し、散布
し、付着し、被覆し、浸透させることができ、あるいは
免疫促進活性が望まれるあらゆる製品の処理に用いるこ
とができる。

この発明を下記の試験例により更に詳しく説明する。

試験例 １ この試験は、カルシウム・イオノフォアA23187により
誘導されたラットの腹腔肥満細胞からのヒスタミン放出
の促進に対するこの発明のペプチドの活性を検討するた
めに行った。

（１）試料の調製 リン酸塩緩衝液含有食塩水（120mMのNaCl、10mMのNa₂
PO₄、3mMのKH₂PO₄からなりpH7.4）をウィスター系ラッ
トの腹腔内に注入した後、ラットの腹部をマッサージし
て腹腔細胞を含む緩衝液を回収した。これらの細胞を30
0×ｇ、15分間遠心分離してリン酸塩緩衝液含有食塩水
で２回洗浄し貯蔵して実験に供した。

（２）試験方法。

約１×10⁵個/mlの肥満細胞を含むラットの腹腔細胞を
標的細胞として用いた。この細胞懸濁液500μを100μ
の試験物質［実施例１と同様の方法により得た精製ペ
プチド、またはヒト・ラクトフェリン（シグマ社）、ま
たはウシ・ラクトフェリン（森永乳業株式会社）］と共
に37℃で30分間培養した。その後、カルシウム・イオノ
フォアA23187（シグマ社）を最終濃度５μＭとなるよう
添加して肥満細胞からのヒスタミン放出を誘導した。10
分間培養後、細胞を300×g,15分間遠心分離し、上澄液
を回収し、2mMのHClO₄（２％）を添加して除タンパク処
理した。除タンパク処理後のサンプルを2000×ｇ、20分
間遠心分離し上澄液中のヒスタミン含量を蛍光光度分析
機（Auto Analyzer:テクニコン社）により決定した。リ
ン酸塩緩衝液含有食塩水の存在下における細胞を対照と
して用いた。

（３）効 果 表１に示した実験データは、この発明のペプチドが、
カルシウム・イオノフォアA23187により誘発された肥満
細胞からのヒスタミンの放出を促進することを示してい
る。この発明のペプチドは１から100ppmの範囲内の低濃
度でこのような活性を示し、ヒスタミンの放出はペプチ
ドの濃度に依存して投与量依存的に増大する。一方、こ
の実験結果は、ヒトおよびウシ・ラクトフェリンは、活
性を有するもののわずかでしかないことを示している。

試験例２ この試験は、α−トキシンを産出するスタフィロコッ
カス・アウレウスの細胞により誘発されたラットの腹腔
肥満細胞からのヒスタミンの放出促進に対するこの発明
のペプチドの活性を検討するために行った。

（１）試料の調製 α−トキシン産生株であるスタフィロコッカス・アウ
レウス121を、ブレイン・ハート・インフュージョン培
地中に37℃で一晩培養した。細菌細胞を4000×ｇ、20分
間遠心分離して回収し、リン酸緩衝液含有食塩水で洗浄
し、同一の緩衝液に懸濁させて実験に供した。ラットの
腹腔細胞は試験例１と同様に調製した。

（２）試験方法 試験例１と同一の方法を用いた。ただし、肥満細胞か
らのヒスタミン放出はα−トキシン産生スタフィロコッ
カス・アウレウス細胞を1mlあたり最終濃度約1.0×10⁸
個となるよう加えて誘発した。

（３）結 果 表２に示した実験データは、この発明のペプチドがα
−トキシン産生スタフィロコッカス・アウレウス細胞に
より誘発された肥満細胞からのヒスタミンの放出を促進
することを示している。この発明のペプチドは、１から
100ppmの範囲内の低濃度でこのような活性を示し、ヒス
タミインの放出量はペプチドの濃度に依存して投与量依
存的に増大する。一方、この実験結果は、ヒトおよびウ
シ・ラクトフェリンは、活性を有するもののわずかでし
かないことを示している。

試験例３ この試験は、カルシウム・イオノフォアA23187により
誘発されたヒト多形核好中球からのロイコトリエンB4の
放出促進に対するこの発明のペプチドの活性を検討する
ために行った。

（１）試料の調製 ヒト多形核好中球は、フィコル−メトリゾエート（Fi
coll−metrizoate）濃度勾配を用いて健常な供与者のヘ
パリン化された血液から白血球を分画し、次いでデキス
トラン沈降法により調製した。この細胞を300×ｇで遠
心分離し、リン酸緩衝液含有食塩水で３回洗浄した。残
存血小板は２％以下であった。赤血球は、これらの細胞
を低張性条件にさらして除去した。多形核好中球画分の
純度は光学顕微鏡により97％以上であることが確認され
た。

（２）試験方法 ロイコトリエン放出の分析のため、ヒト好中球をリン
酸塩緩衝液含有食塩水におよそ１×10⁷個/mlの懸濁した
ものを標的細胞として使用した。これらの細胞は試験物
質［実施例１と同様の方法で得た精製ペプチド、また
は、ヒト・ラクトフェリン（シグマ社）またはウシ・ラ
クトフェリン（森永乳業株式会社）］の存在下で30分間
培養した。好中球からのロイコトリエンの放出はカルシ
ウム・イオノフォアA23187（シグマ社）を最終濃度５μ
Ｍの濃度で添加して誘発した。30分後、刺激された細胞
の上澄液に2mlのメタノール−アセトン（1:1）を加えて
脱タンパクし、−70℃で12時間凍結した。1000×ｇ、15
分間遠心した後、上澄液を凍結乾燥機で蒸発乾燥して、
その乾燥物を0.5mlのメタノール−水（30:70）に懸濁
し、窒素雰囲気中におき、−70℃で一晩貯蔵した。試料
を1000×ｇで遠心分離して、その上澄をヌクレオシル
（C18;5μｍ粒子）の逆相カラムを用いて40℃で高速液
体クロマトグラフィーによりロイコトリエンの存在を分
析した。溶媒はリン酸塩緩衝液（0.05％EDTAを含む17mM
のK₂HPO₄）、アセトニトリルおよびメタノール（50:30:
20）の混合物をリン酸によりpH5.0に調整して用いた。
カラムの溶出液の280nmにおける吸光度をモニターして
記録した。溶出されたロイコトリエンの濃度は積分機に
よりピーク面積から決定した。ロイコトリエンは既知の
標準値を基準として滞留時間から同定された。最小検出
量は1ngであった。ロイコトリエンB4は、この実験の条
件下では好中球によって生物学的に不活性な20−OH−ロ
イコトリエンB4および20−COOH−ロイコトリエンB4に急
速に代謝されるから、放出されたロイコトリエンB4の総
量はこれらの不活性な産生物の合計をも含む。

（３）結 果 表３に示した実験データは、この発明のペプチドが多
形核好中球からのロイコトリエンB4の放出を促進したこ
とを示している。この発明のペプチドは１から100ppmの
低濃度でこの活性を示し、放出されるロイコトリエンB4
の量は、ペプチドの濃度に依存して、投与量依存量に増
大する。一方、この結果は、ヒトおよびウシ・ラクトフ
ェリンは、活性を有するもののわずかでしかないことを
も示している。試験された組成物のどれもが痙攣誘発性
ロイコトリエンC4の放出を促進しなかった。

実施例 １ この発明のペプチドの製造を以下に例証する。脱脂乳
から分離されたウシ・ラクトフェリン（2.0kg:森永乳業
株式会社；純度約90％）を５％（w/v）の濃度で蒸留水
に溶解し、1NのHClを加えてpHを3.0に調整した。ペプシ
ン結晶（ディフコ・ラボラトリー）を３％（基質にたい
するw/w）の最終濃度で添加し、37℃、４時間加水分解
した。この反応を80℃、15分間加熱して停止させた。得
られたペプチド混合物のpHの1NのNaOHを添加して7.0に
調整し、不溶性のペプチドを濾過して除去した。ペプチ
ド溶液を噴霧乾燥して、粉末品1.9kgを得た。この粉末
品の600gを蒸留水に溶解し、最終濃度５％（w/v）とし
た。ブチル−トヨパール650M（トーソー社）を使用前に
水で洗浄して平衡化し、約3.0リットルの疎水性ゲルと
した。この出発物質（粉末品溶液）を攪拌タンク中で疎
水性媒体と先ず接触させ、次いで、液体を回収し担体を
クロマトグラフィーのカラム（内径10cm×20cm）に移し
た。回収した液体をカラム中の担体に再び接触させ、次
いで疎水性担体を400ml/分の流速の水で洗浄し、非結合
ペプチドを除去した。担体の洗浄は担体から溶出された
水のタンパク質成分が280nmでの吸光度が約0.06となる
ような低レベルになるまで継続した。免疫促進性ペプチ
ドを含む担体結合タンパク質は10mMのHClと等量のマッ
キルベイン緩衝液との混合液、pH7.0（0.1Mのクエン酸
および0.2MのNa₂HPO₄を177:824の比率で混合して調製し
た）を用いて担体から脱離した。得られたペプチドの緩
衝溶液を疎水性担体と接触させ、その担体を同一の緩衝
液６リットルで洗浄した。活性ペプチドは約９リットル
のマッキルベイン緩衝液、pH5.0（0.1Mのクエン酸と0.2
MのNa₂HPO₄との溶液を485:515の比率で混合して調製し
た）で一定のpHで担体から脱離させた。得られた溶液の
脱塩は300mlの同一のブチル−トヨパール650Mを用いて
行った。この溶液を1NのNaOHを加えてpH7.0に調整し、
上記疎水性担体と接触させ、その担体を約30リットルの
水で洗浄して緩衝液の塩を除去した。最後に活性ペプチ
ドを10mMのHClで脱離し、凍結乾燥して10.5グラムの粉
末品を得た。製品の純度は逆相高速液体クロマトグラフ
ィーにより推定して99％以上であった。

実施例 ２ この発明のペプチドの製造をさらに以下に例証する。
このペプチドは、LKB Biolynkモデル4170自動ペプチド
合成機（ファルマシアLKB バイオテクノロジー社製）
を用いて、化学的に合成した。390mgのFmoc−フェニル
アラニン無水物をジメチルアミノピリジンを触媒として
用いてカルボキシル基を介してウルトロシンＡ樹脂（フ
ァルマシアLKB バイオテクノロジー社）に固定した。
次いで、この樹脂をピペリジンを含むジメチルホルムア
ミドで洗浄し、Ｃ末端アミノ酸のアミン官能基の保護基
を除去した。次いで、Ｃ末端から２番目のアミノ酸残基
であるFmoc−アラニン無水物156mgを、上記のフェニル
アラニン残基の脱保護アミン基に結合した。以下、所望
の一連のアミノ酸を同様の方法で結合したが、システイ
ンの場合にはアセトアミドメチル化されたFmoc−アミノ
酸を用いた。このようにしてＣ末端から25番目のフェニ
ルアラニン残基まで結合し、所望のアミノ酸配列のペプ
チド鎖を形成した。次いで、保護基を除去し、溶媒（94
％のトリフルオロ酢酸、５％のフェノール、および１％
のエタンジオールよりなる）によりペプチドを脱離し、
このペプチドを高速液体クロマトグラフィーにより精製
し、真空乾燥し、約150mgのアセトアミドメチル化され
たペプチドを得た。このペプチドを10mlの90％酢酸溶液
に溶解し、2.5mlの1M塩酸を加え、この溶液を30分間よ
く攪拌し、5mlの1Mチオ硫酸ナトリウム水溶液を加えて
反応を停止させ、この溶液をロータリー蒸発機で約40ml
に濃縮した。この濃縮溶液をセファデックスG15（ファ
ルマシア社製）カラム（50×500mm）を用いて精製し、
真空乾燥し、約70mgの免疫促進性ペプチドを得た。

実施例 ３ 実施例１と同様の方法で得た20mgの免疫増進性ペプチ
ドを1000mlの純水に溶解し、免疫増進剤を調製した。

実施例 ４ 実施例２と同様の方法で得た免疫促進性ペプチド50mg
を5gのメチルセルロース及び1000mlの純水の混合物に溶
解して免疫促進剤を得た。

実施例 ５ 実施例１と同様の方法で得た免疫促進性ペプチド100m
gを200mlのエチルアルコールおよび800mlの純水の混合
物に溶解して免疫促進剤を得た。

実施例 ６ 口内洗浄剤を下記の配合で調製した。この口内洗浄剤
は使用時に50から100倍に水で希釈する。

エチルアルコール 20.0 g サッカリン・ナトリウム塩 3.0 g 実施例１の免疫促進性ペプチド 0.1 g 純水 76.0ml 実施例 ７ 点眼剤を下記の配合で調製した。

硼酸 1.9 g 実施例１の免疫促進性ペプチド 0.02g メチルセルロース 0.5 g 純水 97.4g 実施例 ８ 皮膚用スプレー剤を下記の配合で調製した。

プロピレングリコール 0.4g エチルアルコール 3.5g フェロン11（商標：デュポン社製； トリクロロフルオロメタン） 30.0g フェロン12（商標；デュポン社製； ジクロロジフルオロメタン） 48.0g ジエチルエーテル 16.0g 実施例１の免疫促進性ペプチド 0.1g 産業上の利用分野 このペプチドは、ヒトおよび動物の細菌、真菌、およ
びウイルス性感染の予防および治療用免疫促進剤として
有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 冨田 守 神奈川県横浜市金沢区東朝比奈１―47― ６ (72)発明者 島村 誠一 神奈川県横浜市港北区篠原町1558 (72)発明者 川瀬 興三 埼玉県浦和市白鍬761―１ (72)発明者 高瀬 光徳 埼玉県大宮市南中丸138―10 (72)発明者 ベラミー ウェイン ロバート 神奈川県座間市東原３―22―６ ヴィラ さがみ野ウエストＣ―５ (56)参考文献 特開 平３−220130（ＪＰ，Ａ) ＴＨＥＯＢＡＬＤ，Ｋｌａｕｓ．，’ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔ ａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｖ ｉｔｒｏ ｂｙ ａｂｌｏｃｋｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗ ｉｔｈ ｔｈｅ ｉｒｏｎ ｂｉｎｄｉ ｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｒａｎｓｆ ｅｒｒｉｎ ａｎｄ Ｉａｃｔｏｆｅｒ ｒｉｎ’，Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃ ｔｉｏｎｓ，1987年、第20巻、第１／２ 号、ｐｐ10−16 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 - 38/58 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列： を有するペプチドを含む免疫促進剤。
2. 【請求項２】ペプチドが少なくとも1ppm（重量）の濃度
   で含まれている請求項１記載の免疫促進剤。
3. 【請求項３】次のアミノ酸配列： を有するペプチドを少なくとも1ppm（重量）の濃度で有
   効成分として含む免疫促進用組成物。
4. 【請求項４】請求項１または２記載の免疫促進剤、もし
   くは請求項３記載の免疫促進用組成物を使用して製品に
   免疫促進活性を付与する処理方法。