CN112961216A - 一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽及其应用，属于生物工程技术领域，变异链球菌特异性靶向抗菌肽的氨基酸序列为TFFRLFNRGGGRRWWRF，变异链球菌特异性靶向抗菌肽是将CSP片段与短链的人工抗菌肽结合形成。本发明采用异性靶向抗菌肽窄谱、高效的抗菌特性提示，将能特异性结合于变异链球菌表面的靶向肽片段与广谱抗菌肽片段相连所得到的变异链球菌特异性靶向抗菌肽具有龋病防治的应用潜能，使用窄谱抗菌药物选择性降低牙菌斑中主要致龋菌(如变异链球菌)的含量，使非致龋菌转化为优势菌，能够有效抑制致龋菌的再定植，最终达到龋病长期预防的目的。

Description

一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽及其应用。
背景技术
龋病是人类最常见的口腔疾病，在全球范围内流行性广。至2010年，全球患有乳牙龋但未行治疗的儿童人数为6.21亿人，而未行治疗的恒牙龋患者多达24亿人，占全球人数的35％。在中国，龋病的防治工作同样十分严峻。据我国第三次和第四次口腔健康流行病学调查报告显示，我国儿童龋患情况呈现上升态势，5岁儿童乳牙龋患率为70.9％，比十年前上升了5.8个百分点；12岁儿童恒牙龋患率为34.5％，比十年前上升了7.8个百分点。而龋病的治疗需要大量的医疗支出，2010年全球在维持口腔健康方面的直接医疗支出总额达2976.7亿美元，其中用于治疗龋病以及龋病所导致的牙齿缺失共耗费530亿美元。因此，龋病的早期防治对提高生活质量和节约医疗资源均具有重要的意义。
人类口腔内的细菌种类超700种，大部分时间细菌与宿主保持和谐共处的关系，通过相互作用共同维持口腔环境的健康。而当这种和谐的关系被干扰时，则会导致机会致病菌产生疾病。龋病是一类慢性的感染性疾病，口腔微生物菌黏附、定植于牙面并代谢碳水化合物产酸，导致局部硬组织脱矿大于再矿化是龋病发生的最直接的原因。变异链球菌是公认的主要致龋菌，原因在于：①龋洞中常能分离出变异链球菌；②变异链球菌在动物模型中通过高糖饮食能成功诱导龋病形成；③变异链球菌具有高度产酸、耐酸性；④变异链球菌能产生Ⅰ/Ⅱ型表面抗原和非水溶性葡聚糖，从而提高对牙面和其他细菌的黏附。但在正常釉质表面的“健康”牙菌斑内变异链球菌的含量很低，优势菌以非变异链球菌(如血链球菌、格氏链球菌等)和放线菌为主，且能抵抗外界致龋菌的定植；而当个体的口腔卫生差且长期高糖饮食时，牙菌斑内的致龋菌逐渐转变为优势菌，变异链球菌的含量显著增高。
广谱抗菌药物能降低唾液、牙菌斑中的细菌含量，理论上能够有效预防龋病的发生发展。目前已有体外研究显示多种植物提取物及其衍生物，以及天然或人工合成的广谱抗菌肽对包括变异链球菌在内的口腔致龋菌和非致龋菌均起到一定的广谱杀菌作用。但目前暂无临床试验证实广谱抗菌药物减少龋病发生的有效性，且广谱抗菌药物在龋病防治应用时存在众多弊端：广谱抗菌药物在非特异性杀灭细菌后，仍然为致龋菌和非致龋菌的重新定植提供了“平等竞争”的机会，因此理论上它并不能长期预防变异链球菌等致龋菌的再感染；长期使用可引起口腔和肠道内菌群失衡，并产生细菌耐药、呕吐、腹泻、牙齿着色等副作用等。
发明内容
1.要解决的技术问题
针对现有变异链球菌靶向抗菌肽的抗菌肽片段多采用天然的抗菌肽或其衍生物。天然抗菌肽存在肽链长、抗菌活性不强、细胞毒性大等缺陷，而人工设计合成的新型抗菌肽由于能人为决定其特性，在防龋应用方面具有更大的潜能。如通过化学组合库法设计合成的KSL、RW和螺旋轮法得到的WLBU2、GH12等均能有效抑制变异链球菌或其他常见致龋菌。本发明的目的在于提供将CSP片段与短链的人工抗菌肽结合形成的变异链球菌特异性靶向抗菌肽的肽链更短，合成难度降低、成本减小，具有更大的应用潜能。
2.技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽，本发明中将其记为M8RW，其特征在于变异链球菌特异性靶向抗菌肽的氨基酸序列为TFFRLFNRGGGRRWWRF。
作为本发明的一种优选方案，所述的变异链球菌特异性靶向抗菌肽的制备方法的步骤：
S1:称取适量Wang树脂加入反应柱，加入二氯甲烷)(DCM)使树脂充分溶胀。二甲基甲酰胺(DMF)清洗之后抽掉DCM，然后用配制好的去保护剂去除树脂上的Fmoc保护基团(脱帽)，脱帽时间20分钟，之后用DMF洗3次，验色为蓝色则Fmoc保护基团成功去掉，如无色则表示没反应上，需要重新脱帽
S2:按照多肽的氨基酸序列加入第二种氨基酸精氨酸，并加入缩合剂HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂NMM(N-甲基***啉)或DIEA(N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后加入DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸
S3:茚三酮检测连接是否完全，检测结果是溶液亮黄，树脂透明，无杂色。
S4:洗涤后所得产物按照步骤1同样方法进行脱帽、洗涤，依照上述步骤2按照氨基酸序列依次加入氨基酸进行缩合反应、洗涤，将所有的氨基酸连接结束后采用S1方法脱去最后的Fmoc-保护基团，DMF洗涤。
S5:反应结束分别用DCM和甲醇(MeOH)洗涤收缩，后加入三氟乙酸TFA进行裂解，对裂解后的产物进行过滤后得到滤液
S6：根据S6得到的滤液中加入其3倍体积的冰***(4℃)促使多肽析出，密封后颠倒混匀，回收沉淀；用冷***重悬沉淀，重复上述步骤三次，之后将所得沉淀干燥后得到多肽粗品；
S7:合成肽粗品的纯化：采用反相高效液相法对粗品进行纯化并冷冻干燥
S8:纯化干燥后的抗菌肽用高效液相色谱(HPLC)测定纯度并用质谱(MS)检测分子质量与理论计算的分子量相符。
作为本发明的一种优选方案，所述变异链球菌特异性靶向抗菌肽是将CSP片段与短链的人工抗菌肽结合形成，肽链更短。
作为本发明的一种优选方案，所述的变异链球菌特异性靶向抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定方法：
(1)挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)；
(2)吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)，将菌液稀释至2×106CFU/mL备用；
(3)采用2倍稀释法在96孔板中加入多肽溶液20μL，BHI培养基80μL和备用菌液100μL，使多肽最终浓度为512μg/mL～0.5μg/mL，将孔板置于恒温厌氧培养罐中37℃厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)24小时；
(4)MIC为96孔板内澄清的最低多肽浓度；
(5)吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI琼脂平板，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)48小时；
(6)MBC为平板无菌落形成的最低多肽浓度；
(7)氯己定作为阳性对照，BHI培养基作为阴性对照；
(8)实验重复3次，每组设3个平行样。
3.有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)该变异链球菌特异性靶向抗菌肽肽链短，分子量小，对变异链球菌杀菌效果好,在唾液中稳定性好。
(2)该变异链球菌特异性靶向抗菌肽合成方便,成本较低,能有效杀灭变异链球菌，在抗菌药物防龋方向上有巨大应用潜能。
附图说明
图1为本发明的M8RW作用后变异链球菌生物膜死活菌染色及死菌比例分析结果；
图2为本发明的M8RW对3种细菌的抑菌环；
图3为本发明的M8RW对变异链球菌的抑菌环直径统计结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽的制备方法：
S1:称取适量Wang树脂加入反应柱，加入二氯甲烷)(DCM)使树脂充分溶胀。二甲基甲酰胺(DMF)清洗之后抽掉DCM，然后用配制好的去保护剂去除树脂上的Fmoc保护基团(脱帽)，脱帽时间20分钟，之后用DMF洗3次，验色为蓝色则Fmoc保护基团成功去掉，如无色则表示没反应上，需要重新脱帽
S2:按照多肽的氨基酸序列加入第二种氨基酸精氨酸，并加入缩合剂HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂NMM(N-甲基***啉)或DIEA(N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后加入DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸
S3:茚三酮检测连接是否完全，检测结果是溶液亮黄，树脂透明，无杂色。
S4:洗涤后所得产物按照步骤1同样方法进行脱帽、洗涤，依照上述步骤2按照氨基酸序列依次加入氨基酸进行缩合反应、洗涤，将所有的氨基酸连接结束后采用S1方法脱去最后的Fmoc-保护基团，DMF洗涤。
S5:反应结束分别用DCM和甲醇(MeOH)洗涤收缩，后加入三氟乙酸TFA进行裂解，对裂解后的产物进行过滤后得到滤液
S6：根据S6得到的滤液中加入其3倍体积的冰***(4℃)促使多肽析出，密封后颠倒混匀，回收沉淀；用冷***重悬沉淀，重复上述步骤三次，之后将所得沉淀干燥后得到多肽粗品；
S7:合成肽粗品的纯化：采用反相高效液相法对粗品进行纯化并冷冻干燥
S8:纯化干燥后的抗菌肽用高效液相色谱(HPLC)测定纯度并用质谱(MS)检测分子质量与理论计算的分子量相符。
实施例2：一种变异链球菌特异性靶向抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定
最小抑菌浓度是指在体外药敏试验中,抗菌药物能抑制培养基中病原菌生长的最低药物浓度。最小杀菌浓度指在体外药敏试验中,抗菌药物能使培养基中病原菌生长减少99.9％以上的最小药物浓度。MIC和MBC是反应药物抗菌活性的金指标。本实验采用的细菌为变异链球菌Streptococcus mutans UA159，血链球菌Streptococcus sanguisATCC10556，格氏链球菌Streptococcus gordonii DL1。阳性对照为氯已定,是强效的广谱抗菌药物，在临床上常用于牙龈炎、牙周炎、口腔粘膜溃疡等的辅助治疗。
(1)挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)；
(2)吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)，将菌液稀释至2×106CFU/mL备用；
(3)采用2倍稀释法在96孔板中加入多肽溶液20μL，BHI培养基80μL和备用菌液100μL，使多肽最终浓度为512μg/mL～0.5μg/mL，将孔板置于恒温厌氧培养罐中37℃厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)24小时；
(4)MIC为96孔板内澄清的最低多肽浓度；
(5)吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI琼脂平板，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)48小时；
(6)MBC为平板无菌落形成的最低多肽浓度；
(7)氯己定作为阳性对照，BHI培养基作为阴性对照；
(8)实验重复3次，每组设3个平行样。
表1 M8RW对3种口腔链球菌的MIC和MBC(均值±标准差，n＝3)(μg/mL)
Figure BDA0002956767000000071
结果数据：
M8RW对3种口腔链球菌的MIC和MBC结果见表1。M8RW对变异链球菌的MIC和MBC值均仅为16μg/mL。M8RW对血链球菌和格氏链球菌的MIC和MBC值较变异链球菌显著增加(P＜0.05)，MIC和MBC值均不低于64μg/mL。氯己定对3种菌的抗菌活性比M8RW强(P＜0.05)，但3种菌对氯己定的敏感性无显著性差异(P＞0.05)。
实施例3：最小生物膜形成抑制浓度(MBIC)测定
最小生物膜形成抑制浓度反映了抗菌药物抑制生物膜形成的能力，MBIC50为至少抑制50％生物膜形成的最低药物浓度，MBIC90为至少抑制90％生物膜形成的最低药物浓度。本实验采用的细菌为变异链球菌、血链球菌和格氏链球菌。本实验采用的细菌为变异链球菌Streptococcus mutans UA159，血链球菌Streptococcus sanguis ATCC10556，格氏链球菌Streptococcus gordonii DL1。
1、挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)。
2、吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)，将菌液用含1％蔗糖的BHI培养基(BHI-S)稀释至约2.0×106CFU/mL备用。
3、采用2倍稀释法在96孔板中加入多肽溶液20μL，BHI-S培养基80μL和备用菌液100μL，使多肽最终浓度为512μg/mL～0.5μg/mL，将孔板置于恒温厌氧培养罐中37℃厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)24小时。
4、将孔板内的上清液移除，使用PBS缓冲液洗涤去除浮游菌。
5、生物膜使用甲醇固定15min，0.1％结晶紫染色5min,然后流水下轻柔漂洗并干燥1小时。
6、孔板内加入200ul的95％乙醇并置于摇床半小时，将溶液转移到新的96孔板中，酶标仪测定A595值。抑制率＝(1-A595实验组/A595阴性对照组)×100％。
7、记录MBIC50和MBIC90。
8、氯己作为阳性对照，BHI-S培养基作为阴性对照。
9、实验重复3次，每组设3个平行样。
表2 M8RW对3种口腔链球菌的MBIC50和MBIC90(均值±标准差，n＝3)(μg/mL)
Figure BDA0002956767000000081
结果数据：
M8RW对3种口腔链球菌的MBIC结果见表2。M8RW对变异链球菌的MBIC50和MBIC90均仅为16μg/mL，与MIC和MBC值相同。M8RW对血链球菌和格氏链球菌的MBIC50和MBIC90值较变异链球菌显著增加(P＜0.05)，M8RW浓度达到64μg/ml时能抑制90％血链球菌生物膜形成；达到256μg/mL时能抑制90％血链球菌生物膜形成。氯己定对3种菌的抑制生物膜形成能力比M8RW强(P＜0.05)，在4μg/mL浓度时，就能同时抑制3种菌的生物膜形成。
实施例4：荧光显微镜观察M8RW对变异链球菌生物膜的抗菌活性
本实验采用荧光显微镜观察M8RW对变异链球菌生物膜的短时杀菌效果。本实验采用的细菌为变异链球菌Streptococcus mutans UA159。
1、挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)。
2、吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)，将菌液用含1％蔗糖的BHI培养基(BHI-S)稀释至约1.0×107CFU/mL备用。
3、在24孔板底放置圆形玻片，加入备用菌液2mL，37℃厌氧(80％N2，10％H2,10％CO2)培养6h后移除菌悬液，生理盐水清洗玻片2次。
4、实验组孔内加入浓度为64μg/mL的M8RW溶液200μL，室温培养5min后生理盐水清洗2次。
5、将LIVE/DEAD细菌活性试剂盒中的SYTO 9和Propidium iodide以1:1混匀，生理盐水稀释后吸取200μL加入孔板内，避光培养15min，生理盐水清洗后玻片吸干水分，封片，置于荧光显微镜观察。
6、每个样本随机选择三个视野后采图，Image J 6.0分别计算红绿荧光面积，从而得到死菌所占的比例。
7、氯己定(终浓度为0.12％)作为阳性对照，生理盐水溶液作为阴性对照。
8、每组设3个平行样。
结果数据：变异链球菌生物膜死活菌染色的结果如图1所示。图1中的绿色荧光提示活菌，红色荧光提示死菌。阴性对照组(图1A)未经M8RW或氯己定处理，变异链球菌生物膜中仅少许细菌呈红色荧光。阳性对照组(图1C)经0.12％氯己定作用5min后，可见大部分细菌呈现红色荧光，死菌比例达90％以上(图1D)。而生物膜经64μg/mL的M8RW作用5min后(图1B)，红色荧光的细菌明显增加，死菌比例达70％以上(图1D)，显著高于阴性对照组(P＜0.05)。
实施例5：抑菌环实验
本实验通过测定M8RW分别溶于水和唾液时所形成的抑菌环来观察M8RW在唾液中抗菌效果的稳定性。本实验采用的细菌为变异链球菌Streptococcus mutans UA159，血链球菌Streptococcus sanguis ATCC10556，格氏链球菌Streptococcus gordonii DL1。
1、收集3位健康志愿者非刺激性唾液，混合后4℃10,000rpm离心20min,上清液经0.22μm滤器过滤除菌后备用。
2、挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)。
3、吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)，将菌液稀释至1×109CFU/mL备用。
4、M8RW分别溶于水和唾液中，使得多肽浓度为1280μg/mL和640μg/mL。
5、将109CFU/ml备用菌液加入软琼脂培养基(0.75％琼脂)内混匀稀释至108CFU/mL，平铺于BHI琼脂培养基上室温冷却1小时，得到含菌的琼脂平板。
6、将溶于水和唾液的M8RW各吸取5μL依次点在含菌的琼脂平板上，室温孵育1h后，37℃厌氧培养48h，使用游标卡尺测量抑菌环直径。
7、不含多肽的唾液作为阴性对照。
8、实验重复3次，每组设3个平行样。
结果数据：
M8RW对变异链球菌所形成的抑菌环和直径测量结果见图2和图3。如图2所示，水溶640μg/mL浓度的M8RW能在含变异链球菌的琼脂平板上形成边界清晰的抑菌环，而M8RW溶于唾液后所形成的抑菌环清晰度降低，抑菌环直径减小，但直径差异无统计学意义(P＞0.05)。当M8RW浓度增加至1280μg/mL时，水溶或唾液溶M8RW形成的变异链球菌抑菌环直径均显著性增加(P＜0.05)，且差异无统计学意义(P＞0.05)。
而640μg/mL浓度的M8RW未能在含血链球菌或格式链球菌的琼脂平板上形成明显的抑菌环。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.变异链球菌特异性靶向抗菌肽，其特征在于变异链球菌特异性靶向抗菌肽的氨基酸序列为TFFRLFNRGGGRRWWRF。
2.根据权利要求1所述的变异链球菌特异性靶向抗菌肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1:称取适量Wang树脂加入反应柱，加入二氯甲烷)(DCM)使树脂充分溶胀。二甲基甲酰胺(DMF)清洗之后抽掉DCM，然后用配制好的去保护剂去除树脂上的Fmoc保护基团(脱帽)，脱帽时间20分钟，之后用DMF洗3次，验色为蓝色则Fmoc保护基团成功去掉，如无色则表示没反应上，需要重新脱帽
S2:按照多肽的氨基酸序列加入第二种氨基酸精氨酸，并加入缩合剂HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂NMM(N-甲基***啉)或DIEA(N,N二异丙基乙胺)进行缩合反应；反应结束后加入DMF进行反复洗涤，除去未反应的氨基酸
S3:茚三酮检测连接是否完全，检测结果是溶液亮黄，树脂透明，无杂色。
S4:洗涤后所得产物按照步骤1同样方法进行脱帽、洗涤，依照上述步骤2按照氨基酸序列依次加入氨基酸进行缩合反应、洗涤，将所有的氨基酸连接结束后采用S1方法脱去最后的Fmoc-保护基团，DMF洗涤。
S5:反应结束分别用DCM和甲醇(MeOH)洗涤收缩，后加入三氟乙酸TFA进行裂解，对裂解后的产物进行过滤后得到滤液
S6：根据S6得到的滤液中加入其3倍体积的冰***(4℃)促使多肽析出，密封后颠倒混匀，回收沉淀；用冷***重悬沉淀，重复上述步骤三次，之后将所得沉淀干燥后得到多肽粗品；
S7:合成肽粗品的纯化：采用反相高效液相法对粗品进行纯化并冷冻干燥
S8:纯化干燥后的抗菌肽用高效液相色谱(HPLC)测定纯度并用质谱(MS)检测分子质量与理论计算的分子量相符。
3.根据权利要求2所述的变异链球菌特异性靶向抗菌肽，其特征在于：所述变异链球菌特异性靶向抗菌肽是将CSP片段与短链的人工抗菌肽结合形成，肽链更短。
4.根据权利要求1或2所述的变异链球菌特异性靶向抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测定，其特征在于：
(1)挑取单菌落于10mLBHI培养基中，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)。
(2)吸取100μL过夜菌液加入10mL培养基，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)，将菌液稀释至2×106CFU/mL备用。
(3)采用2倍稀释法在96孔板中加入多肽溶液20μL，BHI培养基80μL和备用菌液100μL，使多肽最终浓度为512μg/mL～0.5μg/mL，将孔板置于恒温厌氧培养罐中37℃厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)24小时。
(4)MIC为96孔板内澄清的最低多肽浓度。
(5)吸取澄清孔内100μL菌液涂布于BHI琼脂平板，置于恒温厌氧培养罐中37℃过夜厌氧培养(80％N2，10％H2,10％CO2)48小时。
(6)MBC为平板无菌落形成的最低多肽浓度。
(7)氯己定作为阳性对照，BHI培养基作为阴性对照。
(8)实验重复3次，每组设3个平行样。
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