CN109125718A - 在结构聚合装置中tlr激动剂的控制传递 - Google Patents

在结构聚合装置中tlr激动剂的控制传递 Download PDF

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Abstract

本发明包括用于产生和刺激抗原特异性树突状细胞免疫反应的组合物、方法和装置。所述装置和方法为主体提供了针对癌症和传染物质的预防性和治疗性免疫。

Description

在结构聚合装置中TLR激动剂的控制传递
本申请是2013年1月14日递交的申请号为201380012442.1，发明名称为“在结构聚合装置中TLR激动剂的控制传递”的分案申请。
相关申请
本申请要求2012年1月13日递交的美国临时申请第 61/586,624号的优先权。该申请通过引证在此全部并入本文。
政府支持
本发明在国家卫生研究院授予的政府支持下完成。政府享有本发明的某些权利。
技术背景
树突状细胞(DC)收集并处理抗原用于呈递给T细胞。树突状细胞是抗原呈递细胞中最有潜力的免疫***活化剂。由于树突状细胞是稀少的并且难以分离，所以针对使用树突状细胞作为治疗剂的研究进展缓慢。
发明内容
本发明的特征在于一种用于在原位刺激免疫细胞(例如，树突状细胞)的装置和方法。例如，在所述装置内容中Toll样受体 (TLR)激动剂的呈递可以用作癌症疫苗接种。嵌合在结构聚合装置中的Toll样受体(TLR)激动剂的整合和呈递能够特异性的刺激CD8(+)树突状细胞(DC)(相当于人体中的CD141+树突状细胞(DC))和浆样树突状细胞(DC)，这两个树突状细胞(DC) 子集对于癌症疫苗接种是至关重要的。
因此，本发明提供了一种装置，该装置包括一种多孔聚合结构组合物，一种肿瘤抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂。例如，所述装置包括一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和Toll 样受体(TLR)激动剂的结合，其中，所述Toll样受体(TLR) 激动剂选自由Toll样受体(TLR)1、Toll样受体(TLR)2、Toll 样受体(TLR)3、Toll样受体(TLR)4、Toll样受体(TLR)5、 Toll样受体(TLR)6、Toll样受体(TLR)7、Toll样受体(TLR) 8、Toll样受体(TLR)9、Toll样受体(TLR)10、Toll样受体 (TLR)11、Toll样受体(TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。例如，所述聚合结构包括聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)。示范性的Toll样受体(TLR)激动剂包括病原体相关的分子类型(PAMP)，例如，一种感染-模拟性组合物，例如，细菌衍生的免疫调节剂。Toll样受体(TLR)激动剂包括核酸或者脂类组合物(例如，单磷酸脂A(MPLA))。
某些核酸可以起到Toll样受体(TLR)激动剂(Toll样受体 (TLR)1激动剂、Toll样受体(TLR)2激动剂、Toll样受体(TLR) 3激动剂、Toll样受体(TLR)4激动剂、Toll样受体(TLR)5 激动剂、Toll样受体(TLR)6激动剂、Toll样受体(TLR)7激动剂、Toll样受体(TLR)8激动剂、Toll样受体(TLR)9激动剂、Toll样受体(TLR)10激动剂、Toll样受体(TLR)11激动剂、Toll样受体(TLR)12激动剂和Toll样受体(TLR)13激动剂)的作用。在一个实施例中，Toll样受体(TLR)激动剂包括 TLR9激动剂，例如，一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、一种聚(氮丙啶)(PEI)-浓缩的低聚核苷酸(ODN)(例如，聚 (氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))、或者双链脱氧核糖核酸(DNA)。TLR9激动剂可以有效用于刺激浆样树突状细胞(DC)。例如，所述装置包括5微克、10微克、25 微克、50微克、100微克、250微克或者500微克的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
在另一个实施例中，Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3 激动剂，例如，聚肌苷-聚胞苷酸(聚I：C)、一种聚(氮丙啶)(PEI) -聚(I：C)、聚腺尿苷酸(聚(A：U))、聚(氮丙啶)(PEI)-聚(A：U)、或者双链核糖核酸(DNA)。
TLR3激动剂能够有效用于刺激小鼠体内的CD8+树突状细胞(DC)和人体的CD141+树突状细胞(DC)。一系列Toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR3激动剂(比方说聚I：C)和TLR9激动剂(比方说CpG)协同作用活化抗肿瘤免疫反应。例如，所述装置包括一种TLR3激动剂(例如聚(I：C))和TLR9激动剂 (胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))或者聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。优选的，Toll 样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂、聚(I：C)和TLR9激动剂、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。与单独整合胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者聚(I：C)的疫苗相比，聚(I：C)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的结合能够起到协同作用。
在一些情况下，Toll样受体(TLR)激动剂包括一种TLR4 激动剂，所述TLR4激动剂选自由脂多糖(LPS)、单磷酸脂A (MPLA)、热休克蛋白、纤维蛋白原、肝素硫酸盐或其片段、透明质酸或者其片段、镍、阿片肽、α1-酸糖蛋白(AGP)、RC-529、鼠β-防御素2和弗氏佐剂(CFA)所组成的组中。在其他情况下， Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR5激动剂，其中所述TLR5 激动剂是鞭毛蛋白。其他适当的Toll样受体(TLR)激动剂包括TRL7激动剂，所述TRL7激动剂选自由单链RNA、鸟嘌呤核苷类似物、咪唑并喹啉(imidazoqinolines)和loxorbine所组成的组中。
优选的，Toll样受体(TLR)激动剂存在的浓度可以有效用于诱导树突状细胞局部产生白介素-12(IL-12).
本发明还提供了一种装置，所述装置包括多孔的聚合结构组合物、一种疾病相关抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂优选结合TLR3。在一些情况下，所述聚合结构组合物包括聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)。所述 TLR3激动剂存在的数量能够优选刺激CD8+树突状细胞或者 CD141+树突状细胞。
优选的，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂。在一些情况下，所述TLR3激动剂包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I：C)) 或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I：C)。例如，所述Toll样受体(TLR) 核酸包括核酸。在其他情况下，所述Toll样受体(TLR)激动剂进一步包括TLR9激动剂。例如。所述TLR9激动剂包括一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者一种聚(氮丙啶)(PEI) 胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。选择性地，所述装置包括Toll样受体(TLR)激动剂的结合，所述结合包括TLR3激动剂和TLR9激动剂。例如，所述TLR3激动剂包括聚(I：C)并且所述TLR9激动剂包括胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
做为选择，所述装置包括Toll样受体(TLR)激动剂的结合，所述结合包括TLR3激动剂和TLR4激动剂。例如，所述TLR3 激动剂包括聚(I：C)并且所述TLR4激动剂包括单磷酸脂A(MPLA)。
选择性地，所述装置进一步地包括一种募集组合物。示范性的募集组合物包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、 Flt3L和CCL20。例如，所述募集组合物包括封装的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些情况下，所述疾病相关的抗原包括一种肿瘤抗原。例如，所述肿瘤抗原包括一种肿瘤溶解产物，纯化的蛋白质肿瘤抗原，或者合成的肿瘤抗原。
选择性地，所述Toll样受体(TLR)激动剂进一步地包括病原体相关的分子类型(PAMPs)。例如，所述病原体相关的分子类型(PAMP)包括一种单磷酸脂A(MPLA)。
还提供了一种装置，所述装置包括一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和Toll样受体(TLR)激动剂的结合，其中所述Toll 样受体(TLR)激动剂选自由Toll样受体(TLR)1、Toll样受体 (TLR)2、Toll样受体(TLR)3、Toll样受体(TLR)4、Toll 样受体(TLR)5、Toll样受体(TLR)6、Toll样受体(TLR)7、 Toll样受体(TLR)8、Toll样受体(TLR)9、Toll样受体(TLR) 10、Toll样受体(TLR)11、Toll样受体(TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。
通过将主体与一种装置相接触或者将所述装置植入主体中来实施一种引起抗肿瘤免疫反应的方法，其中，所述装置包括一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂优选的结合TLR3。例如，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂。做为选择，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂和TLR9 激动剂。
优选的，所述抗肿瘤免疫反应包括CD8+树突状细胞或者 CD141+树突状细胞的活化作用。在一些情况下，所述抗肿瘤免疫反应包括浆样树突状细胞或者CD141+树突状细胞的活化作用。做为选择，所述抗肿瘤免疫反应包括肿瘤负荷的减少。
优选的，Toll样受体(TLR)激动剂存在的浓度可以有效用于诱导树突状细胞局部产生白介素-12(IL-12).
选择性地，所述装置进一步包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施例中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是封装的。另一个任选的募集组合物是一种细胞因子。例如，所述装置包括1微克、3微克、5微克、10微克、25微克或者50微克的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)。
所述装置还包括一种肿瘤抗原，例如，以肿瘤溶解产物的形式(培养细胞或者病人衍生的初级细胞)或者纯化的肿瘤抗原(例如，来自肿瘤细胞的人工合成/化学合成重组蛋白质或者生物化学纯化的抗原)。
本发明还包括一种方法，该方法通过将装置与主体相接触，例如向主体中植入所述装置来引起抗肿瘤免疫反应，所述装置包括一种多孔的聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和一种Toll样受体 (TLR)激动剂。例如，所述Toll样受体(TLR)激动剂选自由 Toll样受体(TLR)1、Toll样受体(TLR)2、Toll样受体(TLR) 3、Toll样受体(TLR)4、Toll样受体(TLR)5、Toll样受体(TLR) 6、Toll样受体(TLR)7、Toll样受体(TLR)8、Toll样受体(TLR) 9、Toll样受体(TLR)10、Toll样受体(TLR)11、Toll样受体 (TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。如上所述，所述装置与之前的疫苗更有优势。最重要的优势在于它能够刺激至关重要的树突状细胞(DC)子集，所述子集能够调节有效的抗肿瘤活性。所述方法包括，向主体施用一种装置，所述装置包括一种TLR3激动剂和/或TLR9激动剂，这种施用引发抗肿瘤免疫反应，所述抗肿瘤免疫反应以被使用疫苗的主体内浆样树突状细胞(DC)和/或CD141+树突状细胞(DC)的活化作用为特点。所述疫苗可以有效用于预防和治疗。
所述装置被施用，例如，局部使用或者植入，并存在一定的时间，例如，原位不断的募集、驯化并分散或者派遣细胞进入体内***或者疾病位点或者感染位点。对现有装置的改善包括对进入所述装置的细胞进行长时间不间断的活化作用，并且伴随长时间不问断的释放免疫活化的(例如抗原始发)细胞。所述装置包括一种脚手架组合物，一种募集组合物和一种调配组合物。所述调配组合物调节延长的并且连续流出的始发细胞，所述调配组合物是一种感染-模拟组合物，例如一种细菌衍生的免疫调节剂。在优选的实施方案中，所述细菌衍生的免疫调节剂是一种核酸，例如，一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
本发明可以用于治疗各种各样的疾病并用于研发针对各种各样抗原的疫苗。在一种优选的实施方案中，本发明用于开发一种癌症疫苗。本发明的另一个优选的实施方案包括一种感染-模拟微环境，用于活化宿主免疫***并随后用于诱导免疫反应。利用具有外源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列提供一种用于精确控制树突状细胞迁移并调节抗原特异性免疫反应的方法。事实上，使用这些合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列和/或聚(I：C)的方法与早期免疫治疗相比显示了重要的改善作用。
所述装置的各个组分被列出表格并显示在下面。
表1
这些装置完成三个主要功能，例如，向装置中吸引细胞、呈递免疫原性因子、并诱导细胞迁移出所述装置。使用脚手架(粗体字)和/或生物(标准字)组合物进行所有这些主要功能。表1 提供了示例性的脚手架或者生物组合物结合，其配对在示例性的装置(1-8)中具有至少一个主要功能。例如，所述脚手架组合物完成所有三个主要功能(装置1)。在选择性的实施例中，所述脚手架组合物完成一个主要功能，例如，向装置中吸引细胞(优选的，树突状细胞)，而所述生物组合物完成两个主要功能，例如，呈递免疫原性因子和诱导细胞(优选的，树突状细胞)迁移出所述装置(装置3)。例如，装置5是装置3相反的组合。示例性的脚手架和/或生物组合物的次要功能包括，但是不局限于，使装置靶向具体的细胞或者组织类型，将装置粘附/释放到一种或者一种以上细胞或者组织的表面上，以及，调节装置的稳定性/ 降解作用。
本发明包括一种装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物。做为选择，所述生物活性组合物被整合入脚手架组合物，或者被涂布在所述脚手架组合物上，吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子，从而活性所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物。在其他优选的实施方案中，所述脚手架组合物或者生物活性组合物分别向装置中吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述装置。
树突状细胞(DC)包括传统的树突状细胞(DC)和树突状细胞(DC)的特定子集。所述Toll样受体(TLR)激动剂，例如，TLR3激动剂，优先地吸引并且刺激人体中的CD141+树突状细胞(DC)(在小鼠中是CD8+树突状细胞(DC))。所述TLR9 激动剂，例如，CpG，优选地吸引并且刺激浆样树突状细胞(DC)。
在优选的实施方案中，所述募集组合物是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如，封装的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。所述装置暂时控制局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度，从而控制免疫细胞的募集、滞留和随后向远离装置位置的***或者组织位点(例如感染位点或者肿瘤位点)的分散/调配。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的浓度确定其是否起到募集成分或者调配成分的作用。因此，通过向主体中引入包括脚手架组合物和封装的募集组合物的装置来实施原位编程树突状细胞的方法。在引入装置后 1-7天的时间内，一股募集组合物脉冲从装置中释放出来，再装置中残留剩余量的募集组合物。在这股脉冲释放之后，剩余量的募集组合物在数周内缓慢释放。募集组合物的局部浓度和释放的暂时方式调节树突状细胞向装置中的募集、保留和随后的释放。例如，这股募集组合物脉冲包括装置中至少50％、60％、75％、 90％或者95％的募集组合物。示例性的暂时释放曲线包括一种脉冲，所述脉冲的特点在于在向主体中引入装置后的1-5天内释放所述装置中至少60％的募集组合物。在所述脉冲之后，在延长的时间(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12天或者2、3、 4、5或更多周)内剩余量缓慢的释放。其他募集组合物包括Flt3L 和/或CCL20。所述募集化合物可以分别使用或者结合使用。
通过提供一种脚手架组合物、向所述脚手架组合物中整合或者在所述脚手架组合物上涂布一种第一生物活性组合物(所述第一生物活性组合物包括能够吸引或者驱逐树突状细胞的多肽)、并且将所述脚手架组合物与一种第二生物活性组合物(其中，所述第二生物活性组合物共价或者非共价连接脚手架组合物，并且其中第二生物活性组合物包括一种免疫原性的因子)相接触来实施制备脚手架的方法。在本方法作为选择的实施方案中，重复所述连接和接触步骤从而产生多个层，其中，第二生物活性组合物包括能够活化树突状细胞的化合物的结合。
所述方法包括连续的原位树突状细胞编程，包括向主体施用一种装置装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物。所述装置募集并刺激异源树突状细胞群落。各个子集被具体化并明显用于产生免疫反应。例如，所述装置调节胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 呈递和树突状细胞子集的富集、浆样树突状细胞的富集、或者 CD141+树突状细胞(DC)的富集，这对抗肿瘤免疫性的产生是非常重要的。
所述方法包括增加疫苗效力，包括向主体施用一种装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物，从而增加疫苗接种过程的效力。
所述方法包括向主体接种抗癌疫苗，包括对主体施用一种装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物，从而赋与主体抗肿瘤免疫能力。例如，IL-12的产生和肿瘤负荷的减少。对于局部肿瘤或者实体肿瘤的情况，所述装置被施用或者被移植在肿瘤位点或者接近肿瘤的位点，或者在肿瘤被检测或者外科手术除去的位点。例如，所述装置被植入距离肿瘤位点或者肿瘤切除位点1毫米、3 毫米、5毫米、10毫米、15毫米、20毫米、25毫米、40毫米的位点，例如，所述聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗装置被施用在距离肿瘤16-21毫米的地方。
免疫原性因子包括Toll样受体(TLR)配体。例如，所使用的免疫原性因子是被修饰Toll样受体(TLR)-9配体序列，聚 (氮丙啶)(PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。优选的，所述Toll样受体(TLR)配体是TLR3激动剂，例如聚肌苷 -聚胞苷酸(聚(I：C))或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I：C)。
脚手架组合物包括一种非生物可降解的材料。示范性的非生物可降解的材料包括，但是不局限于，金属，塑料聚合物，或者丝聚合物。而且，脚手架组合物由一种生物相容的材料组成。这种生物相容的材料是无毒的或者非免疫原性的。
生物活性组合物与脚手架组合物共价连接或者非共价连接。生物活性组合物包括一种成分，共价的或者非共价的与脚手架组合物表面键合，用于吸引树突状细胞。做为选择，或者另外，生物活性组合物包括一种成分，共价的或者非共价的与脚手架组合物表面键合，用于向树突状细胞中引入一种免疫原性因子。做为选择，或者进一步另外，生物活性组合物包括一种成分，共价的或者非共价的与脚手架组合物表面键合，用于诱导树突状细胞从脚手架组合物中迁移出来。
生物活性组合物中能够操控树突状细胞的成分是分泌氨基酸或者膜结合性氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、双核苷酸、低聚核苷酸、多聚核苷酸、聚合物、小分子或者化合物。在一种优选的实施方案中，该成分是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，由于该成分能够向脚手架组合物中吸引树突状细胞。在另一个优选的实施方案中，该成分是一种聚(氮丙啶) (PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列，这是由于该成分能够向树突状细胞中引入胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)序列从而活化所述细胞。在一些实施方案中，该成分是编码CCR7的多聚核苷酸或者多肽，一种趋化因子受体，所述趋化因子受体能够调解树突状细胞向***迁移并远离所述脚手架组合物。所述CCR7成分与聚(氮丙啶)(PEI)胞嘧啶 -鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列同时或者先后被引入树突状细胞，从而提高树突状细胞从所述脚手架组合物中迁移出来。
本发明的脚手架组合物包括外表面。做为选择，或者另外，本发明的脚手架组合物包括内表面。脚手架组合物的外表面或者内表面是固体或者多孔的。孔径小于大约10纳米，直径在大约100纳米到20微米范围内，或者大于大约20微米。在优选的实施方案中，小孔尺寸能够允许细胞(例如树突状细胞(DC))从装置中迁入以及随后迁出。例如，所述孔是纳米孔、微米孔或者大孔。例如，所述纳米孔的直径小于大约10纳米；微米孔的直径在大约100微米到20微米范围内；并且，大孔直径大于大约 20微米(优选的，大于大约100微米或更大，优选的大于大约 400微米)。在一个实施例中，所述脚手架是大孔的，具有开放的、相互连通的孔，直径大约为100-500微米，例如，直径为100-200 微米、200-400微米或者400-500微米。所述孔的尺寸和相互连接的结构的尺寸能够允许细胞进入，通过相互连通的孔穿过装置内部、然后通过孔离开装置去往装置外的身体部分，例如，肿瘤位点，并在此产生针对肿瘤细胞的免疫反应。在转移性肿瘤细胞或者血液肿瘤，例如白血病的情况下，活化的树突状细胞(DC) 从装置中迁移出来并在不连续的位点或者全身引起针对实体肿瘤的免疫反应。
本发明的脚手架组合物包括一个或者一个以上隔间。
本发明的装置被口服、***性、皮下或者经皮施用或者植入，作为动脉支架，或者手术使用。
本发明的装置和方法为一些与原位细胞连续编程方法有关的问题提供了解决方案。原位细胞编程***能够刺激细胞的免疫反应并诱导他们向外迁移到感染的或者患病的身体组织，该***能够提高恢复的成功程度，例如，特异性的消除有病的组织。一种装置能够控制细胞功能和行为，例如，运动。这种装置包括一种脚手架组合物和一个或者一个以上生物活性组合物。所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者被涂布在脚手架组合物上。所述脚手架组合物和/或生物活性组合物暂时控制并且空间上(定向)控制树突状细胞吸引、编程和迁移。
所述装置经由体内的材料来调节宿主细胞的活性募集、修饰和释放，从而改善与脚手架接触的细胞功能。例如，所述装置向所述脚手架材料中吸引或者募集已经存在于身体内的细胞，并且对已经存在的细胞进行编程后者重新编程，获得需要的历程(例如，免疫活化作用)。
该装置包括一种脚手架组合物，所述脚手架组合物能够结合生物活性组合物或者被生物活性组合物涂布；该装置调节树突状细胞的吸引、活化和迁移。根据所设计的装置的应用，所述装置通过定性脚手架本身的物理或者化学性质调节树突状细胞的吸引、活化和/或迁移。例如、所述脚手架组合物具有差别化的可渗透性，只在特定脚手架面积内允许细胞迁移。通过，例如选择或者设计具有更大或者更小孔径、密度、聚合物交联度、硬度、韧性、延伸度或者粘弹性的材料来调节所述脚手架组合物的渗透性。所述脚手架组合物包括物理通道或者路径，这些通道或者路径允许细胞更容易的从装置或者装置内的隔间流出流向目标区域。所述脚手架组合物选择性地由不同的隔间或者隔层组成，每一个都具有不同的渗透性从而可以精确地并且可预见的控制细胞穿过所述装置所需要的时间。还可以通过所述脚手架组合物的降解作用、去水合作用或者再水合作用、氧化、化学或者pH变化或者不间断的自组装调节迁移。
使用生物活性组合物调节吸引、活化和/或迁移。所述装置通过其结构控制并指挥细胞的活化和迁移。可以使用化学亲和性来引导细胞向出口特定区域流动。例如，使用细胞因子诱导或者放慢细胞迁移。通过改变生物活性物质的密度和混合物，所述装置能够控制迁移时间。通过控制这些生物活性物质的最初掺杂水平或者浓度梯度，通过将所述生物活性物质包埋在具有已知渗出率的脚手架材料中、通过随着脚手架材料降解释放、通过从浓度区域扩散、通过前体化学物质扩散进入某一区域的相互作用，或者通过现有细胞产生/分泌组合物，来控制这些生物活性物质的密度和混合物。所述脚手架的物理或者化学结构还能够调节生物活性试剂通过所述装置的扩散。
所述生物活性组合物包括一个或者一个以上能够调节细胞功能和/或行为的化合物。所述生物活性组合物与脚手架组合物共价连接或者非共价连接。
作为对免疫调节因子的相应，引发参与细胞迁移过程的信号传导事件。因此，所述装置选择性的包括一种第二生物活性组合物，所述生物活性组合物包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者聚(I：C) 序列、一种癌症抗原和/或免疫调节剂。
有时候，第二生物活性组合物与脚手架组合物共价连接，保持组合物在所述脚手架组合物上相对固定。在其它情况下，第二生物活性组合物与所述脚手架非共价连接。非共价键通常比共价键弱一至三个数量级，从而允许因子从脚手架中扩散出来进入周围的组织。非共价键包括静电、氢键、范德华键、不芳族和疏水性键。
所述脚手架组合物是生物相容的。所述组合物是生物可降解的/可吸收的，或者不会再体内分解。相对长久(抗降解)的脚手架组合物包括金属和一些聚合物(例如，丝)。优选的，所述脚手架组合物以根据物理参数而预先确定的速率降解，所述物理参数选择由温度、pH、水合作用状态、多孔性和交联密度、类型和化学作用或者主链键合对降解作用的敏感性所组成的组中，或者，所述脚手架组合物以根据化学聚合物比例预先确定的速率降解。例如，一种由单丙交酯构成的高分子量聚合物在几年的时间内降解，例如，1-2年，而由50∶50丙交酯和乙交酯混合物组成的低分子量聚合物在几周的时间内降解，例如，1、2、3、4、6、10周。一种钙交联的凝胶剂由高分子量、高古罗糖醛藻朊酸盐组成，这种凝胶剂在几个月(1、2、4、6、8、10、12月)的时间到几年的时间(1、2、5年)内体内降解，而由低分子量藻朊酸盐和/或部分氧化的藻朊酸盐组成的凝胶剂能在几周内降解。
示范性的脚手架组合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物、藻朊酸盐和藻朊酸盐衍生物、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、富含粘连蛋白的凝胶剂、琼脂糖、天然多糖和合成多糖、聚氨基酸、多肽、聚酯、聚酐、聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚(烯基氧化物)、聚(烯丙胺)(PAM)、聚 (丙烯酸酯)、修饰的聚苯乙烯、复合多元醇、聚乙氧基/聚丙氧基共聚物(polyoxamers)、聚(糖醛酸)、聚(乙烯基吡硌烷酮) 以及上述任意的共聚物或者接枝共聚物。优选的脚手架组合物包括RGD-修饰的藻朊酸盐。
另一个优选的脚手架组合物是大孔的聚丙交酯-共-乙交酯 (PLG)。例如，所述聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、危险信号和一种目标抗原，例如，一种癌症抗原，并且如他们所编程的，驻扎于此募集树突状细胞(DC)。所述募集成分，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，被封装入聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架。包括封装的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质能够提供树突状细胞募集组合物的脉冲，然后提供逐渐减缓的释放速率。在向被治疗的主体特定位点上施用后，所述脉冲包括初始量生物活性组合物的至少 40％、50％、60％、75％、80％或更多，剩余的百分比在随后的几天或者几周内逐步释放。例如，在开始的五天内释放大约60％的生物活性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负荷，然后在随后的10天内缓慢的持续释放生物活性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。这种释放曲线调节了所述因子通过周围组织扩散的速率，从而有效的募集固有的树突状细胞(DC)。
脚手架组合物的多孔性能够影响细胞通过所述装置的迁移。小孔是纳米孔、微米孔或者大孔。例如，所述纳米孔的直径小于大约10纳米；微米孔的直径在大约100微米到20微米范围内；并且，大孔直径大于大约20微米(优选的，大于大约100微米或更大，优选的大于大约400微米)。在一个实施例中，所述脚手架是大孔的，并且具有直径为400-500微米的定位孔。
该装置可以一步制成，其中，制备单层或者一个隔间，向其中注入一种或者一种以上生物活性组合物或者用一种或者一种以上生物活性组合物涂布。示范性的生物活性组合物包括多肽或者多聚核苷酸。做为选择，所述装置在两个或者更多(3、4、5、 6...10或者更多)的步骤中被制备，其中，制备单层或者一个隔间，向其中注入一种或者一种以上生物活性组合物或者用一种或者一种以上生物活性组合物涂布，随后构建第二、第三、第四或者更多层，并向其中依次注入一种或者一种以上生物活性组合物或者用一种或者一种以上生物活性组合物涂布。每个层或者隔间都是相互一致的，或者，彼此之间具有不同的生物活性组合物的数目或者混合物，或者具有不同的化学性质、物理性质和生物性质。
通过提供一种脚手架组合物以及与所述脚手架组合物共价连接或者非共价连接的第一生物活性组合物来实施制备脚手架的方法。USSN：12/867,426，USSN：13/510,356，和PCT/US2012/35505描述了示例性的装置以及制造所述装置的方法，每个所述专利通过引证在此并入本文。所述第一生物活性组合物优选的包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。所述脚手架组合物还与一种第二生物活性组合物相接触，优选的，所述第二生物活性组合物是一种或者一种以上胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)序列。第二生物活性组合物与脚手架组合物相连，产生涂料的脚手架，也就是说，包括一种或者一种以上生物活性物质的脚手架组合物。所述接触步骤可以选择性的重复从而产生多重涂料的脚手架，例如，每一次接触步骤都与不同量的第二生物活性组合物相接触，从而在脚手架装置上产生第二生物活性组合物的梯度。除了改变组合物的量之外，随后的接触步骤包括不同的生物活性组合物，例如，第三、第四、第五、第六组合物或者所述组合物的混合物，这些组合物与之前步骤中使用的组合物或者混合物相比，具有不同的因子结构或者化学式。所述方法选择性的包括将各个局部、层或者隔间彼此粘附在一起，和/或向其中或者装置的一个或者一个以上边界上***半渗透性膜、可渗透性膜或者不渗透性膜，从而进一步控制/调节细胞或者生物活性组合物的运动。
本发明装置的治疗应用包括免疫细胞的说明。例如，所述方法包括以下步骤：提供一种装置，所述装置包括在其中或者其上整合有生物活性组合物的脚手架组合物，和一种与所述脚手架相结合的哺乳动物细胞；将哺乳动物组织与所述装置相接触，例如，通过将装置植入哺乳动物组织或者附着在哺乳动物组织上。在施用所述装置或者植入装置时，各个组分(募集组合物(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L或者CCL20)、危险信号(例如，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))和抗原 (例如，纯化的肿瘤抗原或者肿瘤细胞溶解产物))示范性的相对量如下所示：GM-CSF：0.5微克-500微克；胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)：50微克-3000微克；和，肿瘤抗原/溶解产物：100微克-10000微克。
一种调节细胞(例如，宿主细胞)活性的方法，通过向哺乳动物施用一种包括脚手架组合物和整合在其中或者其上的募集组合物的装置，然后将所述细胞与一种调配信号相接触来实施。细胞离开装置后遇到抗原(及其他因子)，并且因此被活化并找出体内的肿瘤细胞，针对此肿瘤细胞确定免疫反应。在出口处的细胞活性与之前进入装置时的细胞活性不同。细胞被募集如装置后在装置中存在一段时间，例如，几分钟、0.2小时、0.5小时、 1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时；2天、4天、 6天；几周(1-4)、几月(2、4、6、8、10、12)或者几年，在此期间，细胞被暴露于结构成分和生物活性组合物，这会导致细胞活性或者活性水平的变化。在装置中与抗原或者其他化合物的相遇导致细胞被改变(再培养或者再编程)之后流出，并且所述细胞从所述装置中迁移出来进入周围组织或者更遥远的目标位置，从而找到并调节针对患病细胞(例如，肿瘤细胞)的免疫性。
所述调配信号是一种组合物，例如，蛋白质、肽、或者核酸或者细胞的活化状态。例如，在吸收抗原之后，树突状细胞(DC) 被活化并迁移到***、脾、及其他解剖学位置，在这里，树突状细胞(DC)与T细胞相遇进一步的传播抗原特异性免疫应答，例如，抗癌症反应。例如，迁移入装置的细胞在一进入装置后就遇到调配信号。在一些情况下，所述调配信号是一种核酸分子，例如，一种质粒，这种质粒包括编码诱导细胞从所述装置中迁移出来进入周围组织的蛋白质的序列。当细胞在装置中遇到所述质粒时发生调配信号，在细胞中DNA被内源化(即，细胞被转染)，并且所述细胞产生被此DNA编码的基因产物。在一些情况下，传递调配信号的分子是装置的一种成分，并且相对于细胞与募集组合物的接触，所述分子以延迟的方式从装置中释放出来(例如，暂时延迟或者空间延迟)。做为选择，所述调配信号是募集组合物的减少或者缺失。例如，募集组合物诱导细胞迁移入装置，并且所述装置中募集组合物浓度的减少或者耗尽、消散或者扩散会使细胞从装置中流出。如此，个体免疫细胞，例如T细胞、B细胞或者树突状细胞(DC)被募集入装置，装填并活化从而产生针对抗原特异性目标的免疫反应。选择性地，抗原相当于目标，希望针对此目标产生免疫反应，将此抗原整合在脚手架结构之中或者之上。细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF))也可以作为装置的组成，所述装置能够放大免疫活化作用和/或诱导细胞向***的迁移。其他细胞特异的募集组合物描述如下。
所述装置在体内募集细胞，修饰这些细胞然后促进其向体内另一个位点的迁移。在本申请中该方法结合树突状细胞和癌症疫苗的发展进行例证，但是还可以有效用于其他疫苗，例如，针对微生物病原体的疫苗以及通用的细胞治疗剂。使用这里描述装置进行的细胞培养促进组织或者器官一靠近所述材料即再生，或者在更远的位点再生。做为选择，培养所述细胞从而促进组织的破坏(局部或者在更远的位点)。该方法可以有效用于疾病预防，例如，用于促进组织结构和功能基于细胞的维持，从而停止或者放缓疾病进程或者与年龄有关的组织变化。装置中的细胞驯化，“编程”和“再编程”允许体内细胞功能或者活性的改变，从而变成多功能性干细胞并发挥治疗作用。
由于传统的体外树突状细胞基疫苗接种策略无法调和并维持癌症病人体内由异源树突状细胞网络调节的免疫反应，因此这种方法的临床效果是有限的。由于与之前的疫苗方式相比，pDC 的优先募集和扩散能够显著的改善针对癌症抗原的免疫反应并且减少肿瘤进程，这里描述的装置和方法具有明显优势。
多聚核苷酸、多肽或者其他试剂，可以被纯化和/或分离。具体地说，如这里所使用的，“分离的”或者“纯化的″核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽或者蛋白质是指在通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或者培养基的物质，或者是指通过化学合成的化学前体物或者其他化学试剂。纯化后的化合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。例如，纯化后的化合物按重量计算占理想化合物的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。可以通过任何适当的标准方法来测量纯度，例如，通过柱形色谱法、薄层色层分析法、或者高效液相色谱(HPLC)分析。纯化后的或者分离的多聚核苷酸(核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA))不含有哪些在其天然存在形式中存在的侧链基因或者序列。纯化后或者分离的多肽不含有那些在其天然存在的形式中存在的氨基酸或者侧链序列。纯化的也用于定义一种灭菌程度，这种灭菌程度可以安全的对人类主体给药，例如，不具有传染性或者毒剂。
同样，“基本上纯的”是指从其天然伴随的成分中分离出来的核苷酸或者多肽。通常，当核苷酸和多肽按重量计算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者甚至至少99％的蛋白质和其天然伴随存在的有机分子时，这种核苷酸和多肽是基本上纯的。
“分离的核酸”指的是一种核酸，这种核酸不含有其天然存在的基因组中的侧链基因，所述天然存在的基因组存在于所述核酸所衍生的有机体中。该术语包括，例如，(a)一种DNA，这种 DNA属于天然存在的基因组DNA分子的一部分，但是这部分 DNA不是天然存在有机体基因组分子的侧链核苷酸序列；(b)一种核苷酸，这种核苷酸与一种载体整合或者以某种方式整合入原核生物或者真核生物基因组DNA中，从而使所得到的分子不与任意天然存在的载体或者基因组DNA相一致；(c)一种分离的分子，例如互补DNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR) 产生的片段、或者限制性片断；和(d)一种重组核苷酸序列，这种重组核苷酸序列是杂合基因的一部分，即，一种基因编码的融合蛋白。根据本发明的分离的核苷酸分子进一步包括合成产生的分子，以及任意具有改变的化学主链和/或具有修饰的主链的核苷酸。例如，所述分离核酸是一种纯化的cDNA或者RNA多聚核苷酸。分离核酸分子还包括信使核糖核酸(mRNA)分子。
过渡术语“包括(comprising)”与“包含(including)”、“含有(containing)”或者“具有...的特征”是同义词，都属于包括性的或者开放式定义，不排除其他未列出的成分或者方法步骤。相反，术语“由。。。组成”不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。术语“基本上由。。。组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或者步骤，“以及那些本质上不影响要求保护的发明的本质和新颖特性的材料或者步骤”。
从下面关于本发明优选的实施方案的表述中，以及从权利要求书中，本发明的其他特点和优势将变得显而易见。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。虽然与这里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于实施或者检测本发明，但是下面描述的是适当的方法和材料。这里应用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。Genbank和NCBI指明的登记号码也通过引证在此全部并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此全部并入本文。如果出现矛盾，以本发明说明书包括定义为准。此外，这里所述的材料、方法和实施例只起到说明作用，并不作为限制。
附图简要说明
图1是针对感染的免疫反应图表。图1是一种图表，显示了细菌侵染和细菌毒素损伤固有皮肤细胞，促进炎症性细胞因子 (包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))产生并且活化皮肤内皮组织的机制。细胞因子刺激作用诱导白血球溢出并且募集皮肤固有的树突状细胞(DC)(郎格罕氏细胞)和单核细胞 /preDCs。被募集到发炎位点的树突状细胞(DC)遇上且进入 (injest)细菌和细菌产物，所述细菌和细菌产物包括抗原分子的和富含CpG的DNA，从而刺激TLR9活化。作为Toll样受体(TLR) 连接和炎症性疾病的结果，所述树突状细胞快速成熟，上调其 MHC-抗原复合物、共刺激因子和CCR7的表达，并开始居住于***处，并在此引发并传播抗原特异性T细胞反应。
图2A-C.图2A是一种示意图，显示了CpG-富集的低聚核苷酸序列的聚(氮丙啶)(PEI)凝结。具有带正电胺基的聚(氮丙啶)(PEI)聚阳离子与由带负电的磷酸基组成的CpG-ODNs 按照装载比相混合(NH3+：PO4-)，得到带正电的聚(氮丙啶) (PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物。图2B 是一种条形图，显示了胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 1826及其聚(氮丙啶)(PEI)浓缩物在装载比为4，7和15时的ζ电位。框图显示了平均值和标准偏差(n＝4)。图3C是一种条形图，显示了胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)1826及其聚(氮丙啶)(PEI)浓缩物在装载比为4，7和15时的颗粒大小。数值表示为平均颗粒大小和标准偏差(n＝4)。
图3A-D.图A-C显示了JAWSII树突状细胞(DC)的体外胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)吸收。图3A-B是细胞及其相应荧光图像的亮视场图，显示了TAMRA标记的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)分子(A)或者聚(氮丙啶)(PEI) -胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物(B)的吸收。图3c是一种条形图，显示了无保护的(-o-)和聚(氮丙啶)(PEI) -胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(-●-)浓缩物在110小时内的吸收量的定量分析。图3D是一种线性图，显示了聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物以及随后的JAWSII树突状细胞(DC)内去冷凝作用的吸收的定量分析。在70小时内监视并定量聚(氮丙啶)(PEI)-CpGODN 浓缩物在细胞中的数目(-■-)和未冷凝的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的数目()。度量-20微米。C(n＞10细胞)和D(n＞7细胞)的值表示平均值和标准偏差。
图4A-D.(A)树突状细胞(DC)活化图像.图4A是一系列活化的树突状细胞(DC)形态在荧光成像中的明场图像，显示了与聚(氮丙啶)(PEI)一起浓缩的(装载比-7)TAMRA标记的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)分子的吸收。图4B 是一系列JawsII树突状细胞(DC)的荧光激活细胞分类术直方图，所述JawsII树突状细胞(DC)对标记物CD86、MHCII和 CCR7活化作用呈阳性，在无刺激(浅色线)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(---)和聚(氮丙啶)(PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物(—)之后。图4C是显示列表数据的图表，列出了在无刺激、和使用TNF-a/LPS刺激或者胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者聚(氮丙啶)(PEI) -胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)刺激之后，对标记物 CD86、MHCII和CCR7活化作用呈阳性的树突状细胞(DC)的百分比。图4D是一种条形图，显示了胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)和树突状细胞(DC)向CCL19的迁移。测定了无刺激(■)、和聚(氮丙啶)(PEI)(■)或者胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(■)或者聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(■)刺激对树突状细胞(DC)从 transwell***顶端孔向补充有300ng/毫升CCL19的培养基迁移的作用。在24小时内对迁移计数。度量-20微米。C和D(n＝4) 的值表示平均值和标准偏差。胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)活化培养基(5微克/毫升)。*P＜0.05**P＜0.01.
图5A-B.图5A是一系列条形图，显示了在补充有0()、 50(■)和500毫微克/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(■)的培养基中，使用聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(5微克/毫升)刺激之后，对于MHCII和CCR7表达呈阳性的JawsII树突状细胞(DC)百分比。图5B是线性图，显示了在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)和树突状细胞(DC)向CCL19中的迁移。测定了无刺激(-■-)、和聚(氮丙啶)(PEI)(---)或者胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(-●-)或者聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(-●-)刺激对树突状细胞 (DC)从transwell***顶端孔向补充有300ng/毫升CCL19的培养基迁移的作用。在24小时内对迁移计数。数值表示为平均值和标准偏差(n＝4)。
图6A-C.图6A是一种线性图，显示了随着在体外磷酸缓冲液中的培养，保持在聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中的聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的百分率。图6B-C是条形图，显示了JAWS II树突状细胞 (DC)从装载胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的脚手架中的迁移。(B)从装载有5、50、500微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的脚手架中迁移到补充有300ng/毫升CCL19 的培养基中的树突状细胞(DC)的总数量。(C)在500ng/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下，从装载有25微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的脚手架中迁移到补充有300ng/毫升CCL19的培养基中的树突状细胞(DC) 的总数量。在48小时内计算迁移时间。数值表示为平均值和标准偏差(n＝4或者5)。
图7A-B.基于聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)的感染模拟连续的原位编程树突状细胞(DC)。图7a是一种图表，显示了相应于装载入聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质的不同剂量的聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的宿主树突状细胞(DC) 募集(细胞#)和树突状细胞(DC)活化(表达MHC或者CCR7％) 的表列数据。所述基质被植入C57/BL6J小鼠背部7天。图7B 是一种条形图，显示了在植入C57/BL6J小鼠背部7天之后，从装载有PEI-ODN参照、10微克聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、400和3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、和400和3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与10微克聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)结合物的基质中分离出来的 CD11c(+)MHCII(+)和CD11c(+)CCR7(+)宿主树突状细胞(DC)的数目。数值表示为平均值和标准偏差(n＝3-5)。* P＜0.05**P＜0.01.
图8A-D.感染模拟连续地原位分散编程的树突状细胞 (DC)。图8a是一种条形图，显示了在存留于FITC着色的空白基质(-□-)、FITC着色的装载粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)基质(-■-)、和FITC着色的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 基质(-■-)之后，作为时间函数的居住于腹股沟***的FITC (+)树突状细胞(DC)的数目。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的剂量是3000ng，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)的剂量是10微克。图8B是将整合了10微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)+3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(感染-模拟)的基质植入10天后，从 C57BL/6J小鼠(参照)中提取的腹股沟***的数字相片。图 8C-D是条形图，显示了在植入空白基质(□)和整合了3000ng 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(■)或者10微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)+3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(■)的基质之后第2天和第7天，从C57BL/6J小鼠中提取的腹股沟***中分离出的细胞(C)和 CD11c+树突状细胞(DC)(D)的总数量。A、C和D的值表示平均值和标准偏差(n＝4或者5).*P＜0.05**P＜0.01.
图9是一种条形图，显示了感染-模拟微环境赋与的有效抗肿瘤免疫力。在聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)癌症疫苗被植入小鼠中后，出现肿瘤的时间。比较空白聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 脚手架(空白)、只装载抗原的脚手架(Lys)、装载抗原+3000ng 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的脚手架(Lys+3000ng GMCSF)、装载有抗原+聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的脚手架(Lys+CpG)和装载有抗原、3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和聚(氮丙啶) (PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的脚手架 (Lys+3000ng+PEI-CpG-ODN)。用照射的B16-F10黑素瘤细胞(这种细胞已经被基因修饰从而产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))作为基于细胞的疫苗对动物免疫。疫苗接种 14天后，用105个B16-F10黑素瘤肿瘤细胞攻击C57BL/6J小鼠，并检测肿瘤现象的发生(n＝9或者10)。
图10A-B.感染模拟的疫苗接种效果取决于T细胞反应。图 10A是一系列代表性的从接种聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)癌症疫苗(所述疫苗适当的控制肿瘤溶解产物的呈递)的小鼠、接种3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和空白(空白)脚手架参照物的小鼠中获得的肿瘤切片的显微照片。对所述切片染色，检验渗透入从20-25天产生肿瘤的小鼠体内移植的肿瘤组织的CD4(+) 和CD8(+)T细胞。图10B是一种条形图，显示了渗透入被接种动物B16-F10黑素瘤肿瘤中的T细胞。在第20-25天，使用空白聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架(□)、或者整合有B16-F10 黑素瘤肿瘤溶解产物、3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和10微克聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架(■) 处理C57BL/6J小鼠，从该小鼠中移出肿瘤。在随机的肿瘤薄片中检验T细胞渗透(n＝4、1mm3)。刻度尺为50微米。A、D和 E中的数值代表平均值和标准偏差(n＝3或者4)。*P＜0.05** P＜0.01.
图11A-F.树突状细胞(DC)募集和编程的体内控制。图 11A是线性图，显示了在23天的时间内粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中的累积释放。图11B是照片，显示了各个切片的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架的H&E染色，这些脚手架是在第14天后从 C57BL/6J小鼠背部皮下小袋中移出的：空白脚手架、和装载粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(3000ng)的脚手架。图11C是一系列细胞的荧光激活细胞分类术，所述细胞是从移出的脚手架中分离出来的，并用树突状细胞标记物、CD11c和CD86 染色。在植入28天后，从空白脚手架和装载有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(3000ng)的脚手架中分离细胞。荧光激活细胞分类术中的数目显示对两种标记物都呈阳性的细胞群体百分比。图11D是条形图，显示了与空白参照(空白)一致化之后，在移植后第14天，相应于1000、3000和7000ng粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 脚手架中分离出的CD11c(+)CD86(+)树突状细胞(DC)的百分比增加。图11E是线性图，显示了整合0(-)、3000(--O--) 和7000ng(--＝--)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架植入位点，移植后，作为时间函数的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的体内浓度分布曲线。图11F是一种条形图，显示了植入C57BL/6J小鼠背部之后，从装载有0(□)、400(■)、3000ng(■)和7000ng 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(T)的脚手架中分离出来的CD11c(+)CCR7(+)宿主树突状细胞(DC)作为时间函数的百分比。B中的刻度尺-500微米。A、D、E和F中的数值代表平均值和标准偏差(n＝4或者5)。*P＜0.05**P＜0.01.
图12A-G.渗透通过聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质，与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)向树突状细胞(DC) 中共呈递的抗原提高了局部CD8+cDC数量、IL-12的产生和总 CD8(+)细胞数。移植10天之后，在空白基质(空白)中和响应于单独使用3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (GM)或者100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(CpG)或其二者的结合(CpG+GM)或者与肿瘤溶解产物共同呈递(GM+Ant、CpG+Ant和CpG+GM+Ant)，浆样树突状细胞 (DC)(图12A)、(B)CD11c(+)CD11b(+)cDCs、和(图 12C)CD11c(+)CD8(+)cDCs的数目。移植10天之后，在空白基质(空白)中和响应于单独使用3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(GM)或者100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(CpG)或其二者的结合(CpG+GM)或者与肿瘤溶解产物共同呈递(GM+Ant、CpG+Ant和 CpG+GM+Ant)时，IFN-a(图12D)(E)IFN-g和(图12F) IL-12的体内浓度目。(图12G)。渗透通过空白聚(丙交酯-共- 乙交酯(PLG)基质(—)、和分别单独装载有3000ng粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的基质、或者装载有3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和肿瘤抗原(浅色线)的矩阵的CD8(+)细胞的荧光激活细胞分类术直方图。A-F中的数值表示平均值和标准偏差(n＝4或者5)。*P＜0.05**P＜0.01.
图13A-F.胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)呈递和浆样树突状细胞(DC)富集调节的肿瘤保护作用。在受到B16-F10 黑素瘤肿瘤攻击之前，接种聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗的小鼠存活14天。(图13A)比较了接种装载有肿瘤溶解产物和 1、10、50或者100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质之后小鼠的存活时间。图 13B比较了接种装载有肿瘤溶解产物和3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和1、10、50或者100微克胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 基质之后，小鼠的存活时间。在第10天，在聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗位点上，(图13C)CD11c(+)PDCA-1(+) DCs、(图13D)CD11c(+)CD11b(+)树突状细胞(DC)和(图13E)CD11c(+)CD8(+)cDCs的数目与受到B16-F10黑素瘤冲击100天后动物幸存的百分比之间的关系。图13F显示了，在第10天，在聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗位点，由CD11c(+)CD11b(+)cDCs、CD11c(+)PDCA-1(+)pDCs和 CD11c(+)CD8(+)cDCs组成的总树突状细胞的百分比。幸存百分比是使用B16-F10黑素瘤细胞攻击100天之后测定的。
图14A-B是一种线性图，显示了聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 疫苗对已有肿瘤的效果。图14A比较了使用空白聚(丙交酯-共- 乙交酯(PLG)脚手架、聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗(3 微克GM-CSF+100微克CpG-ODN+肿瘤溶解产物)处理的 C57BL/6小鼠的存活时间。图14B比较了使用空白聚(丙交酯- 共-乙交酯(PLG)脚手架、聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗 (3微克GM-CSF+100微克CpG-ODN+肿瘤溶解产物)处理的 C57BL/6小鼠的肿瘤生长。在第0天对小鼠关注5x105个B16-F10 黑素瘤肿瘤细胞，然后允许肿瘤生长7天，向小鼠中植入空白聚 (丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质或者聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 疫苗。平均肿瘤尺寸表示为产物最大和最小直径的一半。
图15A-B是线性图，显示了(A)CpG-富集的低聚核苷酸(CpG 1826)或者(B)P(I：C)从聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中的累积释放，与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 从聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中的累积释放的结合。图15C-D是条形图，分别显示了从聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 脚手架释放的P(I：C)和单磷酸脂A(MPLA)的生物活性，所述聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架的呈递与参照相比成倍增加。通过聚(I：C)和单磷酸脂A(MPLA)从聚(丙交酯-共- 乙交酯(PLG)脚手架中释放，刺激HEK293细胞表达的TLR3 和TLR4的能力来分别测定其生物活性，并用NF-κB-依赖的碱性磷酸酶报道因子稳定的转染。随着时间测定生物活性并比较未刺激的细胞参照。图15E是线性图，显示了单磷酸脂A(MPLA) 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从聚(丙交酯-共- 乙交酯(PLG)基质中的累积释放。数值表示为平均值和标准偏差(n＝5或者6)。这些数据显示了各种Toll样受体(TLR)激动剂从装载粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中体外释放的动力学和生物活性。图15F是显微照片，显示了大孔的聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG) 脚手架的上表面(刻度尺-3毫米)，和脚手架横截面的扫描电镜照片(刻度尺-50微米)。
图16A-D是条形图，显示了Toll样蛋白受体(TLR)激动剂呈递作用可以调节树突状细胞(DC)的募集和在接种位点的活化。在植入装载有GM-CSF的基质(GM)和装载有GM-CSF和CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA)和P(I：C)(P(IC))的基质7天之后(A)CD11c(+)树突状细胞，(B)对NHCII和CD86 表达呈阳性的活化的CD11c(+)树突状细胞，(C)PDCA-1(+) 浆样树突状细胞和(D)被募集到脚手架位点的CD11c(+)CD8 (+)树突状细胞的总数目。图16E是FACS直方图和曲线，显示了在植入小鼠体内7天后，在装载有GM-CSF的脚手架(Con) 中或者装载有GM-CSF和CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA) 和P(I：C)(P(IC))结合的脚手架中可渗透脚手架的树突状细胞。直方图显示了渗透所述脚手架制剂的CD11c(+)树突状细胞的相对频率。密度曲线显示了CD11c(+)与活化的树突状细胞标记物、CD86(+)和MHCII(+)染的细胞。在FACS右上象限的数字表示对活化的标记物呈阳性的CD11c(+)树突状细胞的百分比。图16F是条形图，显示了在植入装载有GM-CSF 的基质(Con)和装载有GM-CSF和CpG-ODN(CpG)、MPLA (MPLA)和P(I：C)(P(IC))的基质7天之后CD11c(+)DC、对NHCII和CD86表达呈阳性的活化的CD11c(+)树突状细胞的总数目。数值表示为平均值和标准偏差(n＝6)。与GM-CSF 装载的基质相比，*P＜0.05**P＜0.01。与GM-CSF装载的基质 (Con)相比，**P＜0.01。
图16G和16H是条形图，显示了接种位点的CD8(+)DC 和pDC子集，以及IL-12浓度。图16G显示了第7天，CD11c (+)CD8(+)DC和pDC在接种位点的总数目，以及在植入装载有GM-CSF的基质(Con)和装载有GM-CSF和CpG-ODN (CpG)、MPLA(MPLA)和P(I：C)(P(IC))的基质后(H) 局部IL-12浓度。数值表示平均值和标准偏差(n＝6).与GM-CSF 装载的基质(Con)相比，**P＜0.01.
图17A-D显示了预防性接种和接种位点CD8(+)DC 和pDC子集和IL-12浓度之间的关系。在使用B16-F10黑素瘤肿瘤(105个细胞)攻击之前，接种PLG疫苗的小鼠存活14天。图17A显示未治疗的小鼠(参照)的存活时间和使用装载GMCSF 的PLG脚手架(GM-CSF)治疗的小鼠的存货时间、或者使用装载有GM-CSF和CpG-ODN(CpG)、P(I：C)(P(IC))或者MPLA 结合的PLG脚手架治疗的小鼠的存货时间之间的比较。统一量级的(B)CD11c(+)CD8(+)DC渗透率、(C)pDC在接种位点的渗透率，和(D)局部IL-12浓度相对于受到B16-F10黑素瘤肿瘤攻击第100天后存活的动物百分比(按照A的试验情况和本***之前报道的情况获得存活数据；红色数据点)的曲线。在B-C中的r值表示，X轴变量和存活百分比之间的线性相关系数。
图18A-D是条形图，显示了脚手架植入14天后在接种位点的T细胞活性和细胞因子产量。(A)在植入装载有GM-CSF的脚手架(GM)和装载有GM-CSF和CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA)和P(I：C)(P(IC))结合的脚手架14天后CD3(+) CD8(+)细胞毒性T细胞的数目。在植入装载有GM-CSF的基质(GM)和装载有GM-CSF和CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA) 和P(I：C)(P(IC))的结合的基质14天之后体内(B)IL-12 的浓度、(C)正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)的浓度和 (D)IFN-g的浓度。数值表示平均值和标准偏差(n＝5)。与参照基质(GM-CSF装载的基质)相比*P＜0.05**P＜0.01。
图19A-F是图，显示了治疗性疫苗接种作用和抗肿瘤T细胞活性。比较已知患有黑素瘤肿瘤(与5x105个B16-F10细胞一起培养，并生长9天)的小鼠和使用装载有GM-CSF的基质(Con) 和装载有与CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA)和P(I：C)(P (IC))结合的GM-CSF的基质治疗的小鼠的(A)肿瘤大小和 (B)整体存活率。(C)FACS图显示了在肿瘤攻击18天后取出的肿瘤中分离出来的肿瘤渗透性白细胞。在与肿瘤一起培养9天后，用装载有GM-CSF的基质(Con)和装载有GM-CSF和 CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA)和P(I：C)(P(IC))的基质治疗小鼠，在第18天从肿瘤中分离细胞，对活化的细胞毒性T 细胞标记物、CD8(+)和CD107a染色。FACS图中的数字表示对这两种标记物都呈阳性的细胞群落百分比。(D)显示了未被治疗的小鼠(天然的)或者用各种疗法接种的老鼠体内对IFNγ和CD107a均呈阳性的CD8(+)(肿瘤渗透性T细胞)的数目。(E) 显示了接种小鼠脾细胞中Trp2-特异性细胞毒性T细胞的总数目。图19F是条形图，比较了在第17天的肿瘤尺寸。除非另有指明，与参照基质(GM-CSF装载的基质)相比*P＜0.05**P＜0.01。
图20是一系列条形图、线性图和点状图，显示了在缺乏CD8 (+)树突状细胞的小鼠体内疫苗接种效果被损害。(A)未被治疗的老鼠(参照)、在B16-F10黑素瘤肿瘤攻击(105个细胞)14 天前接种PLG疫苗的野生型C57BL/6J小鼠(WT)和Batf3-/-小鼠(CD8DC KO)的存活时间。(B)分析植入10天后野生型 C57BL/6J小鼠(WT)和Batf3-/-小鼠(CD8 DC KO)PLG接种位点的细胞毒性和调节性T细胞。FACS点状图显示了CD3(+) 和Trp2(+)四聚体染色的脚手架渗透性细胞。FACS图右上象限的数字表示Trp2特异性细胞毒性T细胞百分比，右下象限的数字表示疫苗接种位点剩余T细胞群落。图显示植入位点Trp2 特异性细胞毒性T细胞的总数和CD8(+)细胞毒性T细胞与常规T细胞的比值。(C)在接种位点IL-2浓度成倍增加，和(D)接种的C57BL/6J小鼠(WT)和Batf3-/-小鼠(CD8 DC KO) 脾中的Trp2特异性细胞毒性T细胞。在疫苗中辅助使用 CpG-ODN。数值表示为平均值和标准偏差(n＝5)。*P＜0.05** P＜0.01.
图21是一系列条形图。图21A显示了植入装载有GM-CSF 的脚手架(Con)和装载有与CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA) 和P(I：C)(P(IC))结合的GM-CSF的脚手架之后的局部IFN-α浓度。数值表示为平均值和标准偏差(n＝5)。与GM-CSF装载的基质(参照)相比**P＜0.01。图21B显示了植入装载有GM-CSF 的脚手架(Con)和装载有与CpG-ODN(CpG)、MPLA(MPLA) 和P(I：C)(P(IC))结合的GM-CSF的脚手架之后的局部TNF-α浓度。数值表示为平均值和标准偏差(n＝5)。与GM-CSF装载的基质(参照)相比。图21C显示了向野生型(vax)和Cd8atm1Mak/J小鼠(CD8 Tc KO)中植入装载有GM-CSF脚手架(Con)和疫苗脚手架(装载有肿瘤溶解产物、GM-CSF和CpG-ODN)(CpG) 之后的局部IL-12p70浓度。图21D显示了向野生型(vax)和B6.129S2-Cd8atm1Mak/J小鼠(CD8 Tc KO)中植入装载有 GM-CSF脚手架(Con)和疫苗脚手架(装载有肿瘤溶解产物、 GM-CSF和CpG-ODN)(CpG)之后的局部IFN-γ浓度。
图22是线性图，显示了整合了CpG-ODN和/或P(I：C)的 PLG疫苗产生显著的肿瘤预防效果。用空白基质[空白]或者单独装载有CpG-ODN或者P(I：C)的基质或者装载[CpG-ODN+P(I：C)] 的基质治疗患有黑素瘤肿瘤的小鼠，记录其整体存活率。小鼠被 105个B16-F10细胞攻击并在3天后接种PLG疫苗。疫苗中Toll 样受体的总剂量大约是100微克。
图23是条形图，显示了树突状细胞的体外趋化性和化学促活作用。图23A显示了作为对参照培养基和补充有GMCSF、Flt3L 和CCL20培养基的响应，骨髓衍生的树突状细胞的体外趋化性，图23B显示了其体外化学促活作用。与装载有GM-CSF的基质相比*P＜0.05**P＜0.01。数值表示为平均值和标准偏差(n＝4)。
图24是一系列线性图、条形图和显微镜照片，显示了能够释放细胞因子募集树突状细胞的PLG脚手架。图24A显示 GM-CSF、Flt3L或者CCL20从PLG脚手架中的累积释放。图24B 是脚手架横切片代表性的照片，所述脚手架被染色，显示了植入 10天之后，CD11(+)树突状细胞渗透入(粉色)大孔空白(左) 和装载GM-CSF的脚手架(右)中。刻度尺-100微米。图24C 显示了植入空白PLG基质(Con)和装载有GM-CSF(GM)，Flt3L (FL3)和CCL20(CCL20)的基质7天之后再脚手架位点处的CD11c(+)树突状细胞总数。数值表示为平均值和标准偏差(n＝6)。与装载有GM-CSF的基质相比*P＜0.05**P＜0.01。
图25是一系列线状图、点图和棒状图，显示了装载有细胞因子和CpG-ODN的PLG基质调节的树突状细胞的募集和活化。图25A显示了FACS直方图和曲线，代表了向小鼠中植入装载有 CpG-ODN的PLG脚手架(Con)或者在装载有GM-CSF(GM)， F1t3L(F13L)或者CCL20(CCL20)与CpG-ODN结合的脚手架 7天之后的脚手架渗透性树突状细胞。直方图显示了能够渗透所述脚手架制剂的CD11c(+)树突状细胞中MHCII和CD86表达的相对频率。点图显示了用CD11c(+)和活化的、浆样树突状细胞标记物PDCA-1结合物染色的细胞。FACS图右上象限中的数字表示CD11c(+)PDCA-1(+)pDCs的百分比。图25B显示了活化的、对MHCII和CD86表达呈阳性的CD11c(+)DCs的总数，以及图25C显示了在植入装载有CpG-ODN的脚手架(Con) 或者装载有GM-CSF(GM)，Flt3L(F13L)或者CCL20(CCL20) 与CpG-ODN的结合物的脚手架7天之后，脚手架中存在的 CD11c(+)PDCA-1(+)pDC。数值表示为平均值和标准偏差 (n＝5)，除非另有指明，与参照相比*P＜0.05**P＜0.01。
图26是一系列条形图和线性图，显示了PLG疫苗能够产生免疫保护性细胞因子、抗原特异性T细胞并预防癌症。在植入装载有B16-F10肿瘤溶解产物、CpG-ODN和GM-CSF(GM)，Flt3L (F13L)或者CCL20(CCL20)的结合物的脚手架之后，局部IL-12 (图26A)浓度和IFN-γ(图26B)浓度成倍变化。使用参照值 (传递溶解产物和CpG-ODN，不传递细胞因子)对这些浓度进行均一化。图26C显示的是，植入10天后，被接种的动物脾中存在的Trp2-特异性CD8(+)T细胞总数。图26D显示了患有黑素瘤肿瘤的小鼠以及使用装载有CpG-ODN的基质(空白)或者装载有CpG-ODN和GMCSF、F1t3L和CCL20结合物的基质治疗后的小鼠(n＝8)总的存活率。数值表示为平均值和标准偏差 (n＝5)。与装载有CCL20的基质(CCL20)相比*P＜0.05.
具体实施方式
在本发明之前，癌症疫苗通常依赖实验室中繁重并昂贵的细胞操作，以及随后的细胞移植，使较弱的***复位并产生有限的作用。本发明使用能够模拟细菌感染关键方面的材料直接控制免疫细胞运输及在体内的活化，从而解决这些问题。Toll样受体 (TLR)激动剂对于癌症疫苗接种的呈递导致改善的免疫细胞活性。所述疫苗和方法包括整合并呈递迁入在结构聚合装置中的 Toll样受体(TLR)激动剂。这里描述的数据显示CD8(+)树突状细胞(DCs)和浆样树突状细胞(DC)(以及传统的树突状细胞(DC))对于癌症疫苗接种的至关重要的作用，使用包括Toll 样受体(TLR)激动剂的结构聚合装置优先募集并活化这些细胞。所述装置被制成一种小的生物工程多孔盘，其中装满肿瘤特异抗原和Toll样受体(TLR)激动剂。这种盘被植入人体，例如，***皮肤下，在此活化免疫***，毁坏肿瘤细胞。而通常，之前的方法包括在体外生长细胞，本发明方法再编程已经存在于体内的细胞。
在一些实施例中，所述装置包括一种募集组分。因此，所述装置选择性地包括一种募集分子，比如一种细胞因子。在一些情况下，聚合物被设计成首先释放一种细胞因子，用于募集和收容宿主树突状细胞(DC)，随后呈递癌症抗原和危险信号，以活化存留的树突状细胞(DC)并显著提高其瞄准***。使用这些材料可以产生特异性的和保护性的抗肿瘤免疫力，除了在25天内死于癌症的那些，在动物体内实现90％的残留。这些材料可以有效用于癌症及其他疫苗中，用于编程并控制体内各种细胞类型的运输。
聚合物***被设计成不仅能够用作药物传递装置，还可以作为一种物理的抗原呈递结构，此结构可以募集树突状细胞(DC)，并且，使用材料(聚[丙交酯-共-乙交酯])和生物活性分子(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))活化树突状细胞(DC)在被活化时，该树突状细胞(DC)所居住于此抗原呈递结构中。这些生物活性分子具有突出的安全曲线。所述材料***可以用作一种有效的癌症疫苗，消除现有细胞治疗剂所具有的时间、费用和调整负担，并减少或者消除多次、全身注射的需要和高的总药装载量。这里所描述的装置使用感染模拟材料原位编程树突状细胞(DC)。
为了适当的设计疫苗的材料***，定量研发粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)体外影响树突状细胞(DC)募集、活化和迁移的能力。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以一种剂量依赖型方式提高树突状细胞(DC)的募集和增殖能力。然而，高浓度(＞100纳克/毫升)的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)能够抑制树突状细胞(DC)向***衍生的趋化性细胞诱导因子(CCL19)的迁移。免疫组织化学染色显示高浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(500纳克/毫升)还可以树突状细胞(DC)表达的下调节CCL19受体CCR7 和MHCII。这些结果显示，体内树突状细胞的募集和编程都需要控制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的接触。如果在这两种情况下只使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，应该设计其局部浓度能够随着时间减少，从而释放树突状细胞，所述树突状细胞随后被包裹在材料中。做为选择，在局部环境中提供危险信号(例如，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))，一旦到达感染模拟位点，这可以用于从粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制作用中释放树突状细胞(DC)。
在这些理解的基础上，大孔聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质被设计为可以在体内，以预先确定的空间与时间方式呈递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、危险信号和癌症抗原，并且按照其所编程的，存留于此募集树突状细胞(DC)。使用高压CO2泡沫法将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)封装入聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中(效率为54％)。这些基质在头五天内释放大约60％的生物活性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负荷，然后在随后的10天内缓慢的持续释放生物活性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。这种释放曲线允许所述因子通过周围组织扩散，从而有效的募集固有的树突状细胞(DC)。
如这里所述，利用原位靶向树突状细胞的***，使用Toll样受体(TLR)激动剂治疗性的控制免疫***。如下面的详细描述，设计大孔聚合脚手架从而在体内传递三种不同种类的Toll样受体(TLR)：CpG-OND、单磷酸脂A(MPLA)和P(I：C)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L或者CCL20的结合，以扩大树突状细胞(DC)的募集和活化。B16-F10黑素瘤模型还能够表征Toll样受体(TLR)从大孔基质中原位呈递调节树突状细胞(DC)子集产生和癌症疫苗效力的能力。无论Toll 样受体(TLR)激动剂的类型或者剂量如何，这些***提供免疫预防和消除肿瘤的能力需要CD8(+)树突状细胞(DC)，并且与浆样树突状细胞(DC)(pDCs)和IL-12产生高度相关。因此，这里的结果显示，为了进行免疫治疗可以使用三维聚合基质原位调节树突状细胞(DC)子集，并且说明了CD8(+)树突状细胞 (DC)、pDCs和IL-12信号是成功的基于材料的疫苗方案中至关重要的组分。
随着对抗感染和肿瘤时树突状细胞(DC)激发细胞毒淋巴细胞(CTL)，免疫性的产生需要树突状细胞(DC)和T细胞的合作(Lanzavecchia A.and SallustoF.，2001 Cell，106：263-266)。树突状细胞(DC)通过识别、加工和解码病原体相关的分子类型 (PAMP)和抗原分子来调节免疫反应(Banchereau J，and Steinman RM.，1998 Nature，392：245-252；Mellman I.and Steinman R.M.，2001 Cell，106：255-258；Sansonetti P.J.，2006Nat.Immunol.，7：1237-1242；Meylan et al.，2006Nature，442：39-44； Akira et al.，2006Cell，124：783-801)。通过模式识别受体(PRRs) 识别的病原体相关的分子类型(PAMP)存在于细胞内，或者存在于树突状细胞(DC)表面，开启感染呈递并处罚信号传导途径，最终导致树突状细胞(DC)的活化(Sansonetti P.J.，2006 Nat. Immunol.，7：1237-1242；Meylan etal.，2006Nature，442：39-44； Akira et al.，2006 Cell，124：783-801)。通常，活化的树突状细胞 (DC)的特点在于MHC和共刺激性分子和发炎前细胞因子表达的增加，这能够使树突状细胞(DC)可以向天然T细胞中翻译病原性信号并处罚适应性免疫反应(Banchereau J，and Steinman RM.，1998 Nature，392：245-252；Mellman I.and Steinman R.M.， 2001Cell，106：255-258；Sansonetti P.J.，2006 Nat.Immunol.，7： 1237-1242；Meylan etal.，2006 Nature，442：39-44；Akira et al.， 2006 Cell，124：783-801；Gilboa，E.，2007JClin Invest.，117： 1195-1203；Banchereau J.and Steinman R.M.，2007 Nature，49：419-426)。树突状细胞(DC)可以作为不同子集的网络，完成专门的功能，刺激并使T细胞反应极化，协调免疫调节作用(Naik et al.，2007 Nat Immunol，8：1217-1226；O′Garra1A.and Trinchieri G. 2004Nat Immunol，5：1206-1208；D′Amico A and Wu L.，2003J ExpMed，2：293-303；Villadangos JA and Schnorrer P，2007 Nat Rev Immunol，7：543-555；Liu YJ，2001 Cell，106：259-262；Jego et al.，2003 Immunity，19：225-234；Randolph etal.，2008 Annu.Rev. Immunol.，26：293-316)。抗原加工和向T细胞的呈递主要归因于传统树突状细胞(DC)子集(cDCs)，所述子集由CD8(-)树突状细胞(DC)和CD8(+)树突状细胞(DC)组成。CD8(+) 树突状细胞(DC)尤其适用于外原性抗原的交叉呈递、IL-12产生和细胞毒性T细胞反应的诱导(Schnorrer P，2006 PNAS 28： 10729-34；Skokos D.and NussenzweigM.C.，J Exp Med，204： 1525-1531；Den Haana et al.，2000 J Exp Med，12：1685-1696；Moser M.and Murphy K.M.，2000 Nat.Immunol.，1：199-205； Hildner et al.，2008Science，322：1097-1100)。所述浆样树突状细胞(pDC)子集能够根据微生物核酸产生绝大多数的1-型干扰素 (IFN)，尤其在病毒感染期间，从而促进T细胞活化、生长和疾病清除率的残留(Liu YJ，2001 Cell，106：259-262；Jego et al.，2003 Immunity，19：225-234；Randolph et al.，2008 Annu.Rev.Immunol.， 26：293-316；Kanzler et al.，2007Nat.Med.，13：552-559)。而且， pDC和CD8(+)树突状细胞(DC)子集所调节的加工过程与感染和肿瘤支配下的t-辅助因子1(Th1)效应细胞的激发有关。活化树突状细胞(DC)子集的平衡分配与自身免疫性疾病和肿瘤的控制有关，说明这些细胞在预防性免疫功能产生期间相互合作。
在这里描述的发明之前，癌症疫苗被设计能够引入抗原，并能够免疫刺激信号传导从而在使用前体外或者原位活化树突状细胞(DC)(GilboaE.，2007J Clin Invest.，117：1195-1203； BanchereauJ.and Steinman R.M.，2007 Nature，49：419-426； Kanzler etal.，2007 Nat.Med.，13：552-559；Hansen et al.，2013 Vaccine，31(4)，639-46；Schuleret al.，2003 Curr Opin Immunol，15： 138-147；Curiel T.J，2002 J Clin Invest，109：311-312).多种刺激物可以用于触发树突状细胞(DC)成熟过程和分化作用，包括发炎前细胞因子、Toll样受体(TLR)族识别的病原体相关的分子类型(PAMP)和来自先天和适应性免疫细胞的反馈信号。如下面所详细描述的，这些刺激物和树突状细胞(DC)子集的非连续性结合差异化的控制T细胞活化和极化作用，并且对这些组分进行优化开发，产生有效的免疫反应，消除肿瘤剂和传染剂。但是，目前并不清楚什么组分和树突状细胞子集应该被包括在癌症疫苗内，这一部分是由于目前的技术局限了能够被培养或者靶向的细胞类型(Kanzleret al.，2007Nat.Med.，13：552-559； Hansen et al.，2013 Vaccine，31(4)，639-46；Schuler et al.，2003 Curr Opin Immunol，15：138-147；Curiel T.J，2002 J ClinInvest， 109：311-312)。标准的基于树突状细胞(DC)的方法可以被广泛的用于临床，该方法使用单核细胞衍生的传统树突状细胞，这种细胞不会交叉呈递抗原，或者有效的产生IL-12或者I型IFN，从而激发CTL-调解的免疫反应和肿瘤细胞死亡(Hansen et al.，2013Vaccine，31(4)，639-46；Schuler et al.，2003Curr Opin Immunol，15： 138-147；CurielT.J，2002J Clin Invest，109：311-312)。在这里描述的发明之前，有人试图使用1型分化树突状细胞与Toll样受体 (TLR)的结合促进CTL激发能力，但是这个成熟过程在移植后伴随着迁移作用和刺激功能的减少(Hansen et al.，2013 Vaccine， 31(4)，639-46)。这里描述的大孔聚合物基质能够通过控制 GMCSF和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)助剂的呈递调节树突状细胞的体内运输和活化(Ali et al.，2009Nat Mater，2： 151-8；Ali etal.，2009 Sci Transl Med，1：8-19)。当作为疫苗使用时，这些基质会导致CTL-调节的黑素瘤肿瘤的根除(Ali et al.， 2009 Sci Trans1 Med，1：8-19).
如这里所述，对基质进行修饰，呈递3个不同种类的Toll样受体(TLR)激动剂、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A(MPLA)和聚肌胞甘酸(P(I：C))，所有这些都与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)结合。首先定量各个疫苗体内募集和产生活化树突状细胞(DC)子集的能力。随后评价 B16-F10黑素瘤疫苗模型中树突状细胞(DC)诱导作用对T细胞调节的免疫性和癌症防疫效果的影响。这些研究证明抗肿瘤效力需要CD8(+)树突状细胞(DC)，并且与pDC数目和局部IL-12 产量高度相关。存活结果海域一系列炎症性细胞因子相关，这说明IL-12产量和抗癌效果之间的显著关系。总而言之，该结果显示多种树突状细胞(DC)子集被募集并用于原位疫苗接种，同时提供了重要的细胞和分子观点进行癌症疫苗设计。
炎症性调节因子
树突状细胞(DC)增殖、迁移和成熟过程对于炎症性调节因子十分敏感，并且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及被认为是一种有效的免疫反应刺激因子，具体的说，抗癌症抗原免疫反应细胞因子。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 还能够募集和编程抗原呈递免疫细胞。另外，在细菌DNA中发现的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列是一种有效的免疫调节剂，所述免疫调节剂刺激树突状细胞(DC)活化，导致特异性T细胞反应。通过呈递外源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)创建感染模拟微环境，这为精确控制树突状细胞迁移的数目和时间并调节抗原特异性免疫反应提供了一条途径。
脊椎动物免疫***使用各种的机制进行病原体识别，这使其更易于产生抗原特异性反应并清除感染。通过抗原递呈细胞 (APCs)，尤其是树突状细胞(DC)来控制免疫性，这可以捕获抗原并通过刺激因子活化，所述刺激因子是侵入的病原体独特的“危险信号”，例如细菌DNA中CpG二核苷酸序列(Banchereau J，and Steinman RM.Nature.392，245-252.(1998)；Klinman DM. Nat.Rev.Immunol.4，249-58(2004)；该专利通过引证在此并入本文)。
然而，然而来源于自体组织的癌细胞不含有信号树突状细胞 (DC)成熟过程所需要的危险信号，并且反而能够促进允许细胞逃避免疫性的免疫抑制微环境。感染的关键元素是炎症性细胞因子和危险信号(图1)。聚合材料***能够理想的以所需要的时间空间方式呈递这些因子，从而提供了一种原位感染模拟微环境，可以有效的用作疫苗。这些感染模拟物提供了连续编程的宿主树突状细胞(DC)，为有效的树突状细胞活化和原位分配做准备。这些感染模拟装置可以有效用于多种疫苗应用，包括黑素瘤癌症疫苗。
在许多感染中，炎症性细胞因子和危险信号刺激特异性树突状细胞(DC)反应，所述特异性树突状细胞(DC)反应能调节免疫识别和病原体清除率(图1)。例如，随着细菌感染和毒素释放，皮肤细胞(例如，成纤维细胞、角质化细胞和黑素细胞)受到损伤，导致炎症性细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的释放(Hamilton J.Trends inImmunol.23， 403-408.(2002)；Hamilton J.，and Anderson G.Growth Factors. 22(4)，225-231.(2004)；该专利通过引证在此并入本文)，该释放能够募集郎格涵树突状细胞(DC)(皮肤)和树突状细胞 (DC)前体(单核细胞；血液)(Hamilton J.Trends in Immunol.23，403-408.(2002)；Hamilton J.，and Anderson G.Growth Factors. 22(4)，225-231.(2004)；Bowne W.B.，et al.CytokinesCell Mol Ther.5(4)，217-25.(1999).；Dranoff，G.Nat.Rev.Cancer 4，11-22 (2004)；该专利通过引证在此并入本文)。当树突状细胞到达感染位点后开始分化，然后响应于发炎，增加吞噬细胞能力。 (Mellman I.，and SteinmanR.M.Cell.106，255-258.(2001)，该专利通过引证在此并入本文)，并且，吸收了细菌或者其产物的树突状细胞(DC)开始处理抗原，并且通过细菌DNA中的CpG 二核苷酸序列刺激的内TLR9信号传导进行树突状细胞(DC)的成熟过程(Krieg A.M.，Hartmann G.，and WeinerG.J.CpG DNA：A potent signal for growth，activation，and maturation of humandendritic cells.Proc Natl Acad Sci U S A.16，9305-9310(1999)，该专利通过引证在此并入本文)。然后成熟的树突状细胞(DC) 回到***，并在此激发抗原特异性T细胞反应，清除感染。
CpG-ODN是有效的“危险信号”，能够上调CCR7、CD80 /86共刺激分子的树突状细胞(DC)表达和MHC-抗原复合物。重要地是，TLR9信号诱导树突状细胞(DC)，通过产生细胞因子(例如1类IFN)和在MHCI分子上交叉呈递抗原来促进Th1- 样、细胞毒性-T细胞反应。这些信号和肿瘤抗原一起呈递，提供了一种免疫信号，这种免疫信号是促进有效抵抗癌细胞的免疫反应所必须的。
根据ODN不同的结构和序列，不同种类的CPG-ODN促进不同的免疫反应。本发明利用的ODN是胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)1826，这已经在多种小鼠疫苗接种模型(包括黑素瘤)中被成功的检验了。胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)1826在单独使用时或者用作肽疫苗和全细胞疫苗的助剂时显示有益的效果。而且，已经显示ODN 1826能够直接促进树突状细胞(DC)成熟过程和细胞因子产生。这些具体的 CpG ODN序列还能间接活化Th1细胞和NK细胞，并且，因此增加适应性细胞免疫反应。
已经研发出能够促进CpG内化入树突状细胞(DC)，增加传递及其对TLR9定位能力的载体***。富含胺的聚阳离子、聚(氮丙啶)(PEI)已经广泛的用于浓缩质粒DNA，通过与DNA磷酸基的结合，导致小正电荷浓缩物，促进细胞膜结合和DNA被细胞吸收(Godbey W.T.，Wu K.K.，and Mikos，A.G.J.of Biomed Mater Res，1999，45，268-275；Godbey W.T.，WuK.K.，and Mikos， A.G.Proc Natl Acad Sci U S A.96(9)，5177-81.(1999)；该专利通过引证在此并入本文)。因此，聚(氮丙啶)(PEI)已经被用作一种非病毒载体，提高基因转染并制造装载有聚(氮丙啶) (PEI)-DNA的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质，促进宿主细胞中的原位长效基因表达(Huang YC，Riddle F，Rice KG，and Mooney DJ.Hum Gene Ther.5，609-17.(2005)，该专利通过引证在此并入本文)。因此，CpG-ODN与聚(氮丙啶)(PEI)分子一起浓缩，这些聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)浓缩物的尺寸和电荷取决于胺类-磷酸盐电荷比，并对其进行表征。评价聚(氮丙啶)(PEI)冷凝作用增加的树突状细胞(DC)内化胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的能力，然后在树突状细胞(DC)对聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)去冷凝，体外分析树突状细胞活化的促进作用。为了确定PEI-CpG-ODN能否促进第3章描述的基于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的***的疫苗接种作用，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下检验PEI-CpG-ODNs对树突状细胞(DC)成熟和移动的刺激作用。
为了适当的模拟感染和原位编程细胞，设计一种聚-丙交酯- 共-乙交酯(PLG)***，这种***不但可以作为一种药物传递装置释放炎症性细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF))，还可以作为一种可以募集树突状细胞并使其在被危险信号(例如，CpG-ODN)活化时居住于此的物理结构。通过暂时控制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的原位传递来实现控制多孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中树突状细胞(DC)募集和存留的能力，这回导致一批被编程的树突状细胞(DC)在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度原位下降时被分散。该***向***分散6％的编程的树突状细胞，并且，当作为癌症疫苗时，该***在23％的小鼠中诱导保护性的抗-肿瘤免疫性。使用过载的二次信号(胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))能够改善细胞编程和分散效率，所述二次信号能够连续的从粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制中释放树突状细胞(DC)，并在高水平粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下原位促进树突状细胞(DC)的成熟和分散。具体地说，制备聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质来局部呈递具有外源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 的合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)，允许粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集的树突状细胞(DC)被胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)原位刺激。
树突状细胞
树突状细胞(DC)是哺乳动物免疫***内的免疫细胞，来源于造血性骨髓祖细胞。更具体的说，根据来源于淋巴(或者浆样) 或者脊髓前体细胞不同，树突状细胞可以被分类为淋巴***的 (或者浆样)树突状细胞(pDC)和脊髓的树突状细胞(mDC) 分支。无论祖细胞的类型是什么，从祖细胞中可以产生一种不成熟的树突状细胞。不成熟的树突状细胞的特点在于高的内吞活性和低的T细胞活化能力。因此，不成熟的树突状细胞可以作为其直接周围环境病原体的组成性样品。示范性的病原体包括，但是不局限于，一种病毒或者一种细菌。样品含有模式识别受体 (PRRs)，例如toll-样受体(TLRs)。一旦病原体被模式识别受体，例如toll样受体所识别，树突状细胞被活化并成熟。
成熟的树突状细胞不但吞噬病原体并使其破坏，还可以降解其蛋白质并使用MHC(主要组织相容性复合体)分子(I类、II 类和III类)在其细胞表面呈递这些蛋白(也叫做抗原)。成熟的树突状细胞还能够上调细胞表面受体，所述细胞表面受体可以作为T细胞活化的共受体。示范性的共受体包括，但是不局限于， CD80、CD86和CD40。同时，成熟的树突状细胞上调趋化因子受体，例如CCR7，所述趋化因子受体允许细胞随着血液流或者淋巴***移向脾或者***。
树突状细胞存在于与外界环境接触的外部组织中，例如皮肤 (居住在皮肤中的树突状细胞还叫做郎格罕氏细胞)。或者，树突状细胞存在于与外界环境接触的内部组织中，例如鼻、肺、胃和肠。最后，不成熟的树突状细胞居住在血流中。一旦被活化，来自所有这些组织中的树突状细胞被迁移到淋巴组织中，在这里他们呈递抗原并影响T细胞和B细胞，引发免疫反应。对本发明十分重要的一个信号传导***包括在树突状细胞表面上表达的趋化因子受体CCR7和***结构分泌的用于吸引成熟的树突状细胞向高浓度的免疫细胞迁移的趋化因子受体配体CCL19。通过与成熟树突状细胞接触而活化的示范性的免疫细胞包括，但是不局限于，辅助性T细胞、杀伤性T细胞和B细胞。虽然在免疫***中有多种细胞类型能够呈递抗原，例如，巨噬细胞和B淋巴细胞，但是在这些抗原呈递细胞中，树突状细胞是最有效的活化剂。
树突状细胞因其特征性的细胞形状而得名，其细胞形状包括从细胞体中延伸出来的多个树状突。这些细胞形状的功能优势在于能够相对于细胞体积显著的增加细胞表面积和细胞与周围组织接触的面积。有时，不成熟的树突状细胞缺乏特征性的树状突形成，被命名为帘细胞。帘细胞具有大面积的细胞质网膜而不是树状突。
浆样树突状细胞(pDCs)是先天免疫细胞，该细胞在血液中循环，并被发现在外周淋巴器官中。他们构成了0.4％的外周血液单核细胞(PBMC)。在人体中，这些细胞表达表面标志物 CD123、BDCA-2(CD303)和BDCA-4(CD304)，但是不表达高浓度的CD11c或者CD14，这使其与传统的树突状细胞或者单核细胞区分开来。小鼠pDC表达CD11c、B220、BST-2(mPDCA)和Siglec-H，并且对于CD11b成阴性。作为先天免疫***的组成部分，这些细胞表达细胞内Toll样受体7和9，Toll样受体7和 9分别检验ssRNA和CpG DNA部分。随着刺激作用和随后的活化作用，这些细胞产生大量I类干扰素(主要是IFN-α(alpha) 和IFN-β(beta))，这些I类干扰素是重要的多效性抗病毒化合物，调节各种各样的作用。所述CD8-子集使用II类途径将抗原呈递到CD4+辅助性T细胞。CD8+子集使用I类途径呈递抗原。肽/1类MHC分子被CD8+T细胞呈递，CD8+T细胞随后编程细胞毒淋巴细胞(CTL)。小鼠中的CD8细胞表面蛋白相当于人体中的CD141细胞表面蛋白。CD8/CD141-阳性细胞表达TLR3，并且优选的被TLR3激动剂活化。
Toll-样受体(TLRs)
Toll-样受体(TLRs)是一种单横跨膜区域、非催化性受体，识别结构保守分子，所述结构保守分子被叫做病原体相关的分子类型(PAMP)。微生物中存在病原体相关的分子类型(PAMP) 并且与宿主分子相区别。Toll-样受体(TLRs)存在于所有的脊椎动物中。在人体和小鼠中已经识别了十三种Toll-样受体(TLRs) (顺序编码为TLR1-13)。人包括Toll-样受体(TLRs)1-10。
Toll-样受体(TLRs)和白介素-1(IL-1)受体包括一种受体总科，其中的成员具有相同的TIR结构域(Toll-IL-1受体)。不由三种不同功能的三种变体中存在TIR结构域。亚群1的TIR结构域存在于白介素受体中，所述白介素由巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞产生。亚群2的TIR结构域存在于传统的Toll-样受体 (TLRs)中，直接或者间接与来源于微生物的分子相结合。亚群 3的TIR结构域存在于胞浆调节因子中，能够调节蛋白质之间信号传导的蛋白质包括亚群1和2的TIR结构域。
Toll样受体(TLR)配体包括一些分子，这些分子能够与威胁宿主存活率的迹象(例如病原体或者细胞应力)持续结合并具有高度的特异性。Toll样受体(TLR)配体对病原体具有特异性，但是对宿主没有。示范性的病原体分子包括，但是不局限于，脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂***甘露聚糖、鞭毛蛋白、双链RNA 和DNA的未甲基化的CpG岛。
在本发明的一个优选的实施方案中，使用在树突状细胞内隔间中发现的细菌DNA或者合成低聚核苷酸(ODNs)中的包括特异性未甲基化的CpG的序列活化Toll-样受体9(TLR9)。CpG 位点的甲基化状态是细菌DNA和哺乳动物DNA之间以及正常组织和癌组织之间的主要区别。未甲基化的低聚核苷酸(ODNs) 包括一种或者一种以上CpG部分，这种未甲基化的低聚核苷酸 (ODNs)模拟细菌DNA的作用。做为选择或者另外，包括一种或者一种以上CpG部分的未甲基化的低聚核苷酸(ODNs)在致癌基因呈递过程中在恶性肿瘤细胞内产生。
Toll样受体(TLR)-9受体的一种或者一种以上序列能够识别一种或者一种以上本发明的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)序列。下面的序列表述了本发明所包括的Toll样受体(TLR)-9受体。
人Toll样受体(TLR)-9(同种型A)被下列的mRNA序列编码(NCBI登记号NM_017442和SEQ ID NO：1；所有mRNA 序列的起始密码子以黑体和大写字母表示)：
人Toll样受体(TLR)-9，同种型A，(由下列氨基酸顺序(NCBI 登记号NP_059138和SEQ ID NO：2)编码：
MGFCRSALHPLSLLVQAIMLAMTLALGTLPAFLPCELQPHGLVNCNWLFLKSVPHFSMAAPRGNVTSLSLSSNRIHHLHDSDFAHLPSLRHLNLKWNCPPVGLSPMHFPCHMTIEPSTFLAVPTLEELNLSYNNIMTV PALPKSLISLSLSHTNILMLDSASLAGLHALRFLFMDGNCYYKNPCRQALEVAPGALLGLGNLTHLSLK YNNLTVVPRNLPSSLEYLLLSYNRIVKLAPEDLANLTALRVLDVGGNCRRCDHAPNPCMECPRHFPQL HPDTFSHLSRLEGLVLKDSSLSWLNASWFRGLGNLRVLDLSENFLYKCITKTKAFQGLTQLRKLNLSFN YQKRVSFAHLSLAPSFGSLVALKELDMHGIFFRSLDETTLRPLARLPMLQTLRLQMNFINQAQLGIFRAF PGLRYVDLSDNRISGASELTATMGEADGGEKVWLQPGDLAPAPVDTPSSEDFRPNCSTLNFTLDLSRN NLVTVQPEMFAQLSHLQCLRLSHNCISQAVNGSQFLPLTGLQVLDLSHNKLDLYHEHSFTELPRLEALD LSYNSQPFGMQGVGHNFSFVAHLRTLRHLSLAHNNIHSQVSQQLCSTSLRALDFSGNALGHMWAEGD LYLHFFQGLSGLIWLDLSQNRLHTLLPQTLRNLPKSLQVLRLRDNYLAFFKWWSLHFLPKLEVLDLAG NQLKALTNGSLPAGTRLRRLDVSCNSISFVAPGFFSKAKELRELNLSANALKTVDHSWFGPLASALQIL DVSANPLHCACGAAFMDFLLEVQAAVPGLPSRVKCGSPGQLQGLSIFAQDLRLCLDEALSWDCFALSL LAVALGLGVPMLHHLCGWDLWYCFHLCLAWLPWRGRQSGRDEDALPYDAFVVFDKTQSAVADWV YNELRGQLEECRGRWALRLCLEERDWLPGKTLFENLWASVYGSRKTLFVLAHTDRVSGLLRASFLLA QQRLLEDRKDVVVLVILSPDGRRSRYVRLRQRLCRQSVLLWPHQPSGQRSFWAQLGMALTRDNHHFY NRNFCQGPTAE
人TLR3被下列mRNA序列编码(GenBank登记号：NM_003265.2 (GI：19718735)，通过引证在此全部并入本文；SEQ ID NO：5)：
人TLR3被下列氨基酸序列编码(GenBank登记号： ABC86910.1(GI：86161330)，通过引证在此全部并入本文；SEQ ID NO：4)：
GenBank登记号NM_003263.3(GI：41350336)中提供了人 TLR1的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_003254.2(GI：41350337)中提供了人TLR1的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_003264.3(GI：68160956)中提供了人 TLR2的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_003254.2(GI：19718734)中提供了人TLR2的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_138554.4(GI：373432600)中提供了人 TLR4的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_612564.1(GI：19924149)中提供了人TLR4的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_003268.5(GI：281427130)中提供了人 TLR5的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_003259.2(GI：16751843)中提供了人TLR5的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_006068.4(GI：318067953)提供了人 TLR6的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_006059.2(GI：20143971)中提供了人TLR6的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_016562.3(GI：67944638)提供了人TLR7 的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_057646.1(GI：7706093)中提供了人TLR7的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_138636.4(GI：257196253))提供了人 TLR8的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_619542.1(GI：20302168)中提供了人TLR8的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_030956.3(GI：306140488)提供了人 TLR10的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_112218.2(GI：62865618)中提供了人TLR10的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_205819.3(GI：408684412)提供了小鼠 TLR11的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_991388.2(GI：408684413)中提供了小鼠TLR11的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_205823.2(GI：148539900)提供了小鼠 TLR12的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_991392.1(GI：45430001)中提供了小鼠TLR12的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_205820.1(GI：45429998)提供了小鼠 TLR13的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_991389.1(GI：45429999)中提供了小鼠TLR13的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
下面的表2中提供了Toll样受体(TLR)激动剂(包括合成的和天然配体)及其相应受体的代表性列表。
表2
*TLR1和TRR2识别的配体
**TLR2和TRR6识别的配体
参考文献
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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种蛋白质，由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞所分泌。具体地说，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种细胞因子，可以起到白细胞生长因子的功能。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激干细胞产生粒性白细胞和单核细胞。单核细胞从血流中出来，移入组织，并随后成熟进入巨噬细胞。
这里描述的脚手架装置包括并且释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽，用于将宿主树突状细胞(DC)吸引到所述装置中。预计的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 多肽是从体内分离的，或者是体内或者体外合成的。内生的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是从健康的人类组织中分离出来的。在将模板DNA转染或者转化进入宿主有机体或者细胞(例如，哺乳动物或者培养的人细胞系)中之后，体内合成性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽。做为选择，合成性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是使用聚合酶链式反应(PCR)或者其他本领域内已知的方法Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：一种实验室手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，NY，Vol.1，2，3(1989)，通过引证在此并入本文)体外合成的。[01]粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽被修饰以增加体内蛋白质的稳定性。做为选择，对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽进行设计使其具有更多或者更少的免疫原性。内原性的成熟人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是糖基化的，据报道，在氨基酸残基23(白氨酸)、27(天门冬酰胺)和39(谷氨酸) 处糖基化(参见美国专利第5,073,627号)。相对于糖基化状态，在一个或者一个以上的氨基酸残基上修饰本发明的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是重组的。做为选择，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是哺乳动物粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽的人源化衍生物。可以衍生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽的示范性的哺乳动物种类包括，但是不局限于，小鼠、大鼠、仓鼠、荷兰猪、白鼬、猫、狗、猴子或者灵长类动物。在一种优选的实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种重组人蛋白质(PeproTech公司，编目号300-03)。做为选择，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种重组鼠科(小鼠)蛋白质(PeproTech公司，编目号#_315-03)。最后，粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是重组体小鼠蛋白质人源化的衍生物。
人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (PeproTech公司，编目#_300-03)(由下列多肽序列编码(SEQ ID NO：3))：
MAPARSPSPS TQPWEHVNAI QEARRLLNLS RDTAAEMNET VEVISEMFDL QEPTCLQTRLELYKQGLRGS LTKLKGPLTM MASHYKQHCP PTPETSCATQ IITFESFKEN LKDFLLVIPF DCWEPVQE
鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (PeproTech公司，编目#_315-03)(由下列多肽序列编码(SEQ ID NO：7))：
MAPTRSPITV TRPWKHVEAI KEALNLLDDM PVTLNEEVEV VSNEFSFKKL TCVQTRLKIFEQGLRGNFTK LKGALNMTAS YYQTYCPPTP ETDCETQVTT YADFIDSLKT FLTDIPFECK KPVQK
人内原性的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(由下列mRNA序列(NCBI登记号NM_000758和SEQ ID NO：8) 编码)：
人内原性的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(由下列氨基酸序列(NCBI登记号NP_000749.2和SEQ ID NO：9)编码)：
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETV EVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)低聚核苷酸(CpG-ODN)序列
CpG位点是脱氧核糖核酸(DNA)区域，在此区域中，基质线性序列沿着其长度方向胞嘧啶核苷紧挨着鸟苷酸(“p”表示他们之间存在的磷酸键，并将他们与胞嘧啶-鸟嘌呤互补碱基对相区别)。CpG位点在DNA甲基化过程中发挥关键作用，这是细胞用来静止基因表达的一些内源性机制中的一个。启动子元素内 CpG位点的甲基化能够使基因静止。在癌症的情况下，已知肿瘤抑制基因通常是静止的，而致癌基因或者癌症诱导基因被表达。重要地，已经证实肿瘤抑制基因(预防癌症形成的基因)启动子区域中的CpG位点是被甲基化的，而在某些癌症中致癌基因启动子区域中的CpG位点是低甲基化的或者未甲基化的。Toll样受体(TLR)-9受体结合DNA中未甲基化的CpG位点。
本发明包括CpG二核苷酸和低聚核苷酸。预计的CpG低聚核苷酸是从体内分离的，或者是体内或者体外合成的。示范性的内源性CpG低聚核苷酸来源包括，但是不局限于，微生物、细菌、真菌、原生虫、病毒、霉菌或者寄生虫。或者，内源性的 CpG低聚核苷酸是从哺乳动物良性或者恶性赘生性肿瘤中分离出来的。合成的CpG低聚核苷酸是在将模板DNA转染或者转化入宿主有机体内之后，在体内合成的。做为选择，合成性CpG 低聚核苷酸是使用聚合酶链式反应(PCR)或者其他本领域内已知的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：一种实验室手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，NY，Vol. 1，2，3(1989)，通过引证在此并入本文)体外合成的。
呈递CpG低聚核苷酸用于树突状细胞的胞内吸收。在一个实施方案中，使用无保护的CpG低聚核苷酸。术语“无保护的”用于描述一种分离的内源性或者合成的多聚核苷酸(或者低聚核苷酸)，其上不含有额外的取代基。在另一个实施方案中，CpG 低聚核苷酸与一种或者一种以上化合物相结合，增加细胞吸收的效率。做为选择或者另外，CpG低聚核苷酸与一种或者一种以上的化合物结合，增加脚手架和/或树突状细胞内低聚核苷酸的稳定性。
在细胞吸收之前，浓缩CpG低聚核苷酸。在一个优选的实施方案中，使用聚(氮丙啶)(PEI)浓缩CpG低聚核苷酸，所述聚(氮丙啶)(PEI)是一种阳离子聚合物，能够增加树突状细胞细胞吸收的效率。
本发明的CpG低聚核苷酸可以被分成多个种类。例如，本发明组合物、方法和装置中包括的示范性的CpG-ODNs是刺激性的、中性的或者抑制性的。这里使用的术语“刺激性的”用于描述一类能够活化TLR9的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 序列。这里使用的术语“中性的”用于描述一类不能活化TLR9 的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。这里使用的术语“抑制性的”用于描述一类能够抑制TLR9的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。术语“活化的TLR9”描述了一种方法，使用此方法TLR9能够引起细胞内的信号传导。
刺激性CpG-ODNs可以进一步被分成三种类型，A、B和C，这些类型在免疫刺激活性方面有所不同。A类刺激性CpG ODN 的特点在于包括磷酸二酯中心性CpG的回文部分和一种硫代磷酸3’聚G线。在TLR9活化之后，这些CpG-ODN诱导浆样树突状细胞(pDC)中产生高产量的IFN-α。A类CpG-ODN微弱地刺激TLR9-依赖性的NF-κ B信号传导。
B型刺激性CpG ODNs包括一种全硫代磷酸主链，具有一种或者一种以上CpG二核苷酸。在TLR9活化后，这些CpG-ODNs 有力的刺激B细胞。与A类CpG-ODNs不同，B类CpG-ODNs 微弱地刺激IFN-α分泌。
C类刺激性CpG ODNs包括A和B类的特征。C类CpG-ODNs 包括一种全硫代磷酸主链和一种包括CpG的回文结构部分。与A 类CpG ODNs相似，C类CpG ODNs诱导pDC产生大量的IFN- α。与B类CpG ODNs相似，C类CpG ODNs诱导强烈的B细胞刺激。
示范性的刺激性CpG ODNs包括，但是不局限于，ODN 1585、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2006-G5、 ODN 2216、ODN 2336、ODN 2395、ODN M362(都来自 InvivoGen)。本发明还包括前述CpG低聚核苷酸(ODNs)任何人源化的版本。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物、方法和装置包括ODN 1826(其序列从5’到3’是 tccatgacgttcctgacgtt，其中CpG元素用黑体表示，SEQ ID NO：10)。
不刺激TLR9的中性或者参照CpG ODNs被包括在本发明中。这些低聚核苷酸(ODNs)包括与其刺激性对应物相同的序列，但是不含有CpG二核苷酸，而是含有GpC二核苷酸。
本发明所包括的示范性的中性或者参照CpG ODNs包括，但是不局限于，ODN 1585参照物、ODN 1668参照物、ODN 1826 参照物、ODN 2006参照物、ODN 2016参照物、ODN 2336参照物、ODN 2395参照物、ODN M362参照物(都来自InvivoGen)。本发明还包括前述CpG低聚核苷酸(ODNs)任何人源化的版本。
本发明包括抑制性的CpG ODNs，这种CpG ODNs能够抑制 TLR9。有效抑制性序列的示例是发现在哺乳动物端粒中的 (TTAGGG)4(ODN TTAGGG，InvivoGen公司)和CpGODN 2088(InvivoGen公司)，ODN 2088是一种来源于鼠科的刺激性 CpG ODN，有3个碱基取代。内囊中抑制性低聚核苷酸(ODNs) 与TLR9共定位的断裂不会影响细胞结合和吸收。本发明包括的抑制性的CpG低聚核苷酸(ODNs)被用于调整、驯化、逆转或者抵抗刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的作用。做为选择或者，另外，本发明的组合物、方法或装置包括抑制性CpG低聚核苷酸(ODNs)，所述抑制性的CpG低聚核苷酸(ODNs) 可以用于治疗自体免疫疾病或者在植入后预防免疫反应。
癌症抗原
本发明的组合物、方法和装置包括癌症抗原，用于向施用此装置的主体接种和/或提供预防性免疫力。癌症抗原可以单独使用，或者与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者免疫调节剂结合使用。而且，癌症抗原可以与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者免疫调节剂同时或者先后使用。
本发明的组合物、方法和装置中包括的示范性的癌症抗原包括，但是不局限于，从活体检查中提取的肿瘤溶解产物、照射的肿瘤细胞、抗原的MAGE系列(例如MAGE-1)、MART-1/梅拉纳、酪氨酸酶、神经节苷脂、gp100、GD-2、O-乙酰化GD-3、 GM-2、MUC-1、Sos1、蛋白激酶C-结合蛋白、反转录酶蛋白质、 AKAP蛋白质、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、现代人端粒酶发酵产物(hTRT)、细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白质T4-A)、鳞状细胞癌抗原2 (SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、粘蛋白1(肿瘤相关的粘蛋白)、癌-相关的粘蛋白)、(多形态上皮细胞粘蛋白)、(PEM)、(PEMT)、(EPISIALIN)、(肿瘤相关的上皮细胞膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(花生反应性的尿粘蛋白)、(PUM)、(乳腺癌相关的抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原se1-1、 CTCL肿瘤抗原se14-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原 se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-1、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL 肿瘤抗原se57-1、CTCL肿瘤抗原se89-1、***特异性膜抗原、 5T4癌坯滋养层糖蛋白、Orf73皮肤多发性出血性肉瘤相关的疱疹病毒、MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1抗原 (MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、 MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原 NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌症相关的表面抗原、腺癌抗原ART1、伴生肿瘤相关的脑-睾丸-癌症抗原(旁瘤抗原 MA2；伴生肿瘤神经元抗原)、神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关的抗原CO-029、肿瘤相关的抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤、X断点2、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学检测的结肠癌抗原1、血清学检测的乳癌抗原 NY-BR-15、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌的蛋白质1、DUPAN-2、CA19-9、CA72-4、CA195、癌胚抗原(CEA)。
免疫调节剂
本发明的组合物、方法和装置包括免疫调节剂，所述免疫调节剂包括但不限于，Toll样受体(TLR)配体、生长因子和临终细胞产物，例如热休克蛋白，用于刺激树突状细胞活化。免疫调节剂可以单独使用，或者与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者癌症抗原结合使用。免疫调节剂可以与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 序列、或者癌症抗原同时或者先后使用。
本发明的组合物、方法和装置包括所有已知的在细胞表面发现的或者在细胞隔间内发现的Toll样受体(TLR)配体。示范性的Toll样受体(TLR)配体包括，但是不局限于，三酰基脂蛋白 (TLR1)；脂蛋白，革兰氏阳性肽聚糖、脂磷壁酸、真菌和病毒糖蛋白(TLR2)；双链RNA、聚I：C(Toll样受体(TLR)3)；脂多糖、病毒糖蛋白(Toll样受体(TLR)4)；鞭毛蛋白(TLR5)；二酰基脂蛋白(TLR6)；小合成性化合物、单链RNA(TLR7和 Toll样受体(TLR)8)；未甲基化的CpG DNA(TLR9)；前纤维蛋白(TLR11)。还包括作为TRL配体的宿主分子样粘连蛋白和热休克蛋白(HSPs)。本发明还包括宿主Toll样受体(TLR)配体。Toll-样受体(TLRs)在先天免疫性中的作用以及用于活化和抑制Toll-样受体(TLRs)的信号传导分子的作用在本领域内是已知的(作为回顾，参见Holger K.Frank B.，Hessel E.，and CoffmanRL.Therapeutic targeting of innate immunity with Toll-like receptor agonistsand antagonists(使用Toll样受体激动剂和拮抗剂进行的天然免疫性的治疗性靶点).Nature Medicine 13， 552-559(2007)，该专利通过引证在此并入本文).
本发明的组合物、方法和装置包括所有已知的生长因子。示范性的生长因子包括，但是不局限于，转化生长因子β(TGF- β)、粒性白细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)、神经素营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、***(EPO)、促血小板生成素(TPO)、肌骨素(GDF-8)、生长分化作用因子-9(GDF9)、酸性的成纤维细胞生长因子(aFGF或者FGF-1)、碱性的成纤维细胞生长因子(bFGF或者FGF-2)、表皮生长因子 (EGF)、肝细胞生长因子(HGF)。本发明包括刺激树突状细胞活化的细胞因子以及生长因子。示范性的细胞因子包括，但是不局限于，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-121L-15， 1L-17，1L-18，TNF-α，IFN-γ，和IFN-α.
细胞死亡和临终细胞产物的指示剂刺激树突状细胞活化。因而，本发明的组合物、方法和装置包括所有的临终细胞产物。示范性的细胞死亡产物包括，但是不局限于，细胞的任何细胞内特征，例如细胞器、气囊、细胞骨架成分、蛋白质、DNA和RNA。尤其重要的是热休克蛋白，当细胞在受力的情况下表达热休克蛋白并在细胞死亡时释放。示范性的热休克蛋白包括，但是不局限于，Hsp10，Hsp20，Hsp27，Hsp33，Hsp40，Hsp60，Hsp70，Hsp71， Hsp72，Grp78，Hsx70，Hsp84，Hsp90，Grp94，Hsp100，Hsp104， Hsp110.
微环境和疫苗效力
这里描述的装置/脚手架代表一种模拟感染的微环境。各个装置组成能够吸引/接受、培养/刺激和长出周围身体组织的工厂，所述组织被树突状细胞活化，能够刺激/增加对具体抗原的免疫反应。具体地说，所述脚手架装置被植入或者用病原性分子包覆，达到模拟的传染性微环境中，从而进一步活化树突状细胞反应。
当用作癌症疫苗时，使用材料***适当的模拟感染方面可以通过连续补充、活化和使树突状细胞(DC)复位到LN来显著的影响肿瘤进程。第一个PLG疫苗只使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，导致一系列过程，在此过程中，宿主树突状细胞(DC)被粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集、停留在肿瘤抗原呈递位点，然后被封闭直到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水平下降，并且细胞可以被活化和分散 (参见U.S.S.N.11/638,796；通过引证在此并入本文)。局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度的暂时变化能够随着被募集的树突状细胞(DC)的数目被控制，并且使其活化和分散同步。虽然最好的基于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的疫苗能够赋与几乎四分之一的待检测动物保护性免疫作用，但是大约26％的募集的树突状细胞(DC)被活化(大约240,000个树突状细胞(DC))和大约6％的树突状细胞(DC) 被分散到LN。高水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)募集大量的树突状细胞(DC)，并且限制树突状细胞(DC)活化，在脚手架内留下潜在的治疗性树突状细胞(DC)。这些结果刺激了改善性***的发展，所述改善性***能够通过局部呈递CpG-ODNs作为过载的“危险信号”来模拟细菌感染，并且抵抗树突状细胞(DC)活化和分散的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制作用。这里描述的装置通过调节树突状细胞增加的、连续性的流出来显示重要的促进作用。
使用聚(氮丙啶)(PEI)浓缩胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)分子，这不仅可以促进ODN被树突状细胞(DC) 吸收和定位其Toll样受体(TLR)-9受体(图3)，还可以将该分子静电固定进入PLG基质中，与肿瘤抗原同时呈递(图6)。体外结果显示，在抑制性浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)(500纳克/毫升)存在的情况下，聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物可以被树突状细胞(DC)去冷凝，并刺激能够促进树突状细胞(DC)活化和向着***衍生的趋化因子(CCL19)分散的Toll样受体(TLR)信号传导。
在体内，适当的设计感染-模拟物调节一种连续过程，所述连续过程通过用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集使树突状细胞(DC)穿过感染-样微环境，随后通过浓缩的胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)呈递直接活化原有的树突状细胞并随后释放。体内筛选剂量作用显示，在高浓度的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(＞50微克)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(＞1微克)剂量下，与非正常去耦合的 CCR7和MHCII表达结合的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)的传递对树突状细胞(DC)活化具有差动效应，而最优的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)剂量(10-25 微克)产生重要的树突状细胞(DC)活化作用(44％，和1.5x106个细胞)，即使再被高粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 浓度(3微克，体内)抵抗时。因此，最佳的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)呈递作用可以活化大量的树突状细胞(DC)，所述树突状细胞(DC)使用强壮的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲原位募集的，并且，被活化的树突状细胞(DC) 数目超过在体外方案中被编程和移植的数量(图7)。
当树突状细胞被强烈的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)脉冲募集穿过传染性-样-微环境，随后通过浓缩的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)刺激编程和释放原有树突状细胞(DC)时，这种树突状细胞(DC)编程技术被证明是连续的。居住于***中的树突状细胞的百分比从6％变化到 13％，几乎加倍(U.S.S.N.11/638,796和图8)，这相当于180000 个编程的树突状细胞(DC)(与不含有胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)的装置相比提高了大约4倍)倍分散到***处，产生感染模拟物(图7和图8)。令人吃惊的是，在此病况中，***显著的增大了(图8)并且装载有大量牺牲性树突状细胞 (DC)，证实了这些动物身上已经产生感染模拟。
这种传染性材料***连续的控制树突状细胞运输和活化的能力被翻译为这些癌症疫苗的调节效力。随着居住于材料中的被编程并分散到***处的活化树突状细胞(DC)数目的增加，所述效力从0增加到23，最后为50％。在实际形成并且其中发现疫苗效力的肿瘤中，宿主细胞调节免疫预防作用和CD-4和 CD-8淋巴细胞数目之间的明确关系(由于感染模拟，增加大约 50％)。这一结果与使用工程设计的照射肿瘤细胞分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)而体外产生的疫苗从性质上来讲是一致的，这种***已经被发现能够刺激有效的、特异性的和长时间的抗肿瘤免疫性(Akira S，Takeda K，Kaisho T.NatureImmunol，2，675-80，2001).但是，相反的，模拟感染材料***编程的树突状细胞原位和省略所有体外细胞操作和移植，并且密切控制募集、活化和分散到***(LNs)处的树突状细胞的数目。
这些结果显示密切控制细胞行为和原位编程的价值。在这些研究中，随着树突状细胞移动和编程清楚、适当的控制疫苗效力背后的机制。感染模拟物是一种有效的发展疫苗的工具，用于对致命的感染、癌症和自身免疫性产生免疫性。
脚手架组合物和结构
脚手架的组分可以被制成各种几何形状(例如，圆盘形、小珠、球粒)、存在于不同的环境下，不同的平面层(例如薄层) 中。例如，所述圆盘的直径大约为0.1-200毫米，例如，直径是 5、10、20、40、50毫米，所述圆盘被皮下植入。所述圆盘的厚度是0.1到10毫米，例如，是1、2、5毫米。这种圆盘可以容易的被压缩或者冷冻干燥，然后对病人施用。一种用于皮下给药的示例性的圆盘具有以下尺寸：直径为8厘米，厚度为1厘米。多组分的脚手架优选的是同心层结构，每一层的特点在于具有不同的物质质量(％聚合物、％聚合物交联物)、脚手架的化学成分、孔径、多孔性和多孔结构、不同的硬度、韧性、延伸度、粘弹性以及不同的生物活性物质组合物(例如，生长因子、复位/迁移因子、分化作用因子)。每个微环境中都对细胞群体具有特异性作用，例如，促进或者抑制抑制具体的细胞功能、增殖作用、分化作用、分泌的因子或者酶的加工或者迁移。在这种脚手架中的细胞被培养并诱导向着脚手架外迁移，从而直接影响靶点组织，例如，受损害的组织位点。例如，在片状结构中使用基质血管细胞和平滑肌细胞，这些细胞被用于恢复血管样结构，例如血管或者身体腔层。例如，这种结构被用于修复腹壁损伤或者缺损，例如腹裂。同样，向片状的脚手架上接种皮肤干细胞和/或角质化细胞，在绑带或者伤口包裹物上使用这种片状的脚手架用于使皮肤组织再生。所述装置被放置或者移植在靶点组织上或者紧挨着靶点组织，位于身体中的受保护位置，紧挨着血管，或者在外用伤口包覆物的存在下体外使用。使用各种各样已知的方法和工具将这些装置引入体中或者身体上，例如，勺子、镊子或者抓子、皮下注射针头、内窥镜的机械手、内血管导管或传血管导管、立体定位针、蛇管装置、器官表面爬行机器人(美国专利申请20050154376；Ota et al.，2006，Innovations1：227-231)、最小侵入性外科装置、外科移植工具和透皮贴片。这些装置可以被组装，例如通过先后注射或者***基质材料来组装。选择性的，脚手架装置可以被再充入细胞或者生物活性组合物，例如，通过连续注射或者喷雾物质(例如生长因子或者分化作用因子)再充入。
脚手架或者脚手架装置是一种实质的结构，相关的细胞附在其上或者其中，并且，所述脚手架组合物是用于制备此结构的材料。例如，脚手架组合物包括生物可降解材料或者永久材料，例如下面所列的。所述脚手架的机械特性随之应用或者需要再生的组织类型变化。他是可以生物降解的(例如，胶原蛋白、藻酸盐、多糖、聚乙二醇(PEG)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(L-丙交酯) (PLA)、或者聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、或者永久的(例如，丝绸)。在可生物降解的结构中，所述组合物可以被物理降解或者化学降解，例如，通过水合作用、加热或者离子交换，或者通过细胞作用，例如通过邻近的或者原有的细胞进行的酶、肽或者其他化合物的加工。粘稠度可以是软的/柔韧的(例如凝胶)到玻璃状的、橡胶状的、易碎的、坚韧的、有弹性的、非弹性的。所述结构包括小孔，所述小孔可以是纳米孔、微孔或者大孔，并且选择性的，所述孔的类型可以是均质的、异质的、排列的、重复的或者随机的。
藻酸盐是一种基于聚合物的多用多糖，可以根据具体的应用配制来控制分子量、降解速度和脚手架形成的方法。可以使用偶联反应将生物活性抗原决定簇(例如细胞粘着序列RGD)与聚合物骨架共价相连。藻酸盐聚合物被放入各种类型的脚手架中。可注射的水凝胶由低分子量的藻酸盐溶液在加入交联剂(例如，钙离子)的情况下制成，而通过冷冻干燥高分子量的藻酸盐制成大孔脚手架。脚手架配方中的差异能够控制脚手架降解的动力学。呈递成形素的脚手架配方可以以空间和时间的控制方法控制成形素或者其他生物活性物质从藻酸盐脚手架中释放的速率。这种控制的释放不但消除了全身性副作用，不需要多次注射，而且可以用于创建一种微环境，这种微环境能够活化位于在植入位点的宿主细胞和接种在脚手架上的移植的细胞。
所述脚手架包括一种生物相容性聚合基质，选择性地，这种生物相容性聚合基质是完全生物可降解的或者部分生物可降解的。水凝胶是一种适当的聚合基质材料。可以用于形成水凝胶的材料的实施例包括聚乳酸、聚乙醇酸聚乳酸-乙醇酸共聚物 (PLGA)、藻酸盐和藻酸盐衍生物、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、天然多糖和合成多糖、聚氨基酸(例如多肽，尤其是聚赖氨酸)、聚酯(例如聚羟基丁酯和聚ε己内酯)、聚酐；聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚(氧化烯)(尤其是聚(环氧乙烷))、聚(烯丙胺) (PAM)、聚(丙烯酸酯)、修饰的聚苯乙烯(例如聚(4-氨基甲基苯乙烯))、复合多元醇、聚乙氧基/聚丙氧基共聚物、聚(糖醛酸)、聚(乙烯基吡硌烷酮)和上述物质的共聚物，包括接枝共聚物。
所述脚手架由合成的聚合物和天然存在的聚合物制成，所述聚合物，例如，但不局限于，胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖和富集粘连蛋白的凝胶剂。一个优选的用于水凝胶的材料是藻朊酸盐或者修饰藻朊酸盐材料。藻酸盐分子由(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸(M单元)和αL-古罗糖醛酸(G单元)单体组成，聚合物链上这两个单体的比例和分布顺序是可以变化的。藻朊酸盐多糖是一种聚合电解质***，这种***对于二价阳离子(例如，Ca+2、Mg+2、Ba+2)具有很强的亲和力，当暴露在这些分子中时，会形成稳定的水凝胶。参见Martinsen A.，et al.， Biotech.&Bioeng.，33(1989)79-89.)例如，钙交联的藻酸盐水凝胶可以有效用于牙科，伤口包覆软骨细胞移植物并作为其他细胞类型的基质。
示范性的装置利用分子量相对低的藻酸盐或者其他多糖，优选的，其尺寸在溶解后处于能从人的肾脏中清除的阈值中，例如，所述藻酸盐或者多糖的分子量减少到1000到80,000道尔顿。优选的，所述分子量是1000到60,000道尔顿，尤其优选的是1000 到50,000道尔顿。使用具有高古罗糖醛酸含量的藻酸盐材料，而不是高甘露糖醛酸含量的藻酸盐材料也是有效的，这是由于古罗糖醛酸能通过二价阳离子提供更多的凝胶聚合物离子交联位点。美国专利第6,642,363号通过引证在此全部并入本文，该专利公开了用于制造和使用包括多糖(例如藻酸盐或者修饰藻酸盐)的聚合物的方法，所述多糖尤其有效的用于细胞移植和组织工程应用。
除了藻酸盐之外有效的多糖包括琼脂糖和微生物多糖，如下表中所列出的。
多糖脚手架组合物
aN-天然的，A＝阴离子和C＝阳离子.
本发明的脚手架是多孔的或者是无孔的。例如，所述脚手架是纳米孔的，所述纳米孔的直径小于大约10纳米；所述脚手架是微孔的，所述微孔的直径在大约100微米到20微米范围内；或者所述脚手架是大孔的，所述大孔的直径大于大约20微米(优选的，大于大约100微米或更优选的大于大约400微米)。在一个实施例中，所述脚手架是大孔的，并且具有直径为400-500微米的定位孔。实施例中描述了如何制备具有需要孔径和孔排列的聚合基质。其他制备多孔水凝胶产物的方法在本领域内是已知的 (美国专利号6,511,650，通过引证在此全部并入本文)。
生物活性组合物
所述装置包括一种或者一种以上的生物活性组合物。所述生物活性组合物是天然存在的、合成的或者重组的化合物，例如，多肽、核酸、小分子或者其他试剂。例如，所述组合物包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和肿瘤抗原或者其他抗原。在这里描述的组合物是纯化的。纯化后的化合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。可以通过任何适当的标准方法来测量纯度，例如，通过柱形色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或者高效液相色谱(HPLC)分析。
使用本领域普通技术人员已知的方法将多肽和聚合基质耦合在一起。将肽和聚合物耦合在一起的方法描述在Hirano and Mooney，Advanced Materials，p.17-25(2004).其他有效的化学键合作用包括Hermanson，Bioconjugate Techniques，p.152-185 (1996)中描述的，尤其是通过使用二亚胺碳偶合剂、DCC和 DIC(Woodward试剂K)。多肽包括适用于这种二亚胺碳键的末端胺基。优选的，通过使用1-乙-3-(3-二甲基氨基丙基)二亚胺碳(EDC)催化形成氨键，EDC是一种水溶性酶，通常被用于肽合成。
生物活性组合物释放动力学的控制
使用多种不同的技术，例如，包覆、在脚手架上的附着/连接性质、脚手架的多孔性和生物活性组合物的颗粒尺寸来控制生物活性组合物(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)) 的释放曲线。
例如，通过一种方式包覆粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，以此将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 整合入脚手架中。收件将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)包覆如聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体中，然后用气体发泡法处理装载GM-CSF的微球体，产生大孔聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架。将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)整合入微球体会造成粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)更深的包覆在聚合物中，使装置在1-5天内维持粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的初始脉冲。其他的整合方法可选择性的用于根据需要改变或者适度调整粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲的持续时间，因此改变DC 募集的动力学。例如，泡沫状的PLG颗粒与冷冻干燥的粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)混合在一起使粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)更多的结合到聚合物脚手架的表面，并且蛋白质扩散的更快。
作为选择的制备脚手架的方法可以修改释放动力学，所述方法包括修饰脚手架孔径的物理结构，从而获得不同的降解时间和释放动力学(改变作为体积百分比的孔径或者总孔隙率)，例如， Riddle et al.，Role of poly(lactide-co-glycolide)particle sizeon gas-foamed scaffolds.(聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒尺寸在发泡形成的脚手架中的作用)，J Biomater Sci Polym Ed.2004；15 (12)：1561-70中的描述。另一种改变释放动力学的方法是修饰这种组合物，即，修饰制备脚手架的原材料，从而改变释放性质。例如，使用不同的聚合物，例如，藻酸盐、PLA、PGA或者使用PLGA。同样，使用具有不同乙二醇和乳酸比例的聚合物也会产生不同的释放曲线。例如，使用已知的双重乳化(水/油/水)技术，具有不同组合物(丙交酯对乙交酯比例)和分子量的PLG 被用于制备微球体(5-50微米)，随后利用聚-丙交酯-共-乙交酯 (PLG)微粒和聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体，通过气体发泡/颗粒挤出技术制备脚手架。(Ennett et al.，Temporally regulated delivery of VEGF invitro and invivo(体内和体外VEGF 短时间调节的传递).JBiomed Mater ResA.2006Oct；79(1).另一个技术包括将蛋白质整合入不同的隔间(例如，在发泡前，用聚合物包覆蛋白质PLG微球体或者将聚合物和微球体简单混合或者冷冻干燥)。
对装置进行充满和/或再充满
将一种生物活性组合物(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))整合到装置的不同层/隔间中，从而传递多个粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲。每个脉冲用树突状细胞(DC)流充满(或者再充满)装置。使用各种方法制造脚手架，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(或者其他生物活性试剂)的多个脉冲。例如，通过将蛋白质整合入不同的隔间(例如，用聚合物包覆蛋白质PLG微球体或者在发泡前与聚合物简单混合并冷冻干燥)制备这种装置，从而产生2个或者更多个不同的蛋白质释放曲线(即，脉冲)(例如， Richardson et al.，Polymeric system for dual growth factor delivery (双重生长因子传递的聚合基质).Nat Biotechnol.2001 Nov；19 (11)中所述)。
做为选择，所述蛋白质被包覆在快速降解的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(例如低分子量，50∶50)和缓慢降解的聚- 丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(高分子量，85∶15)中。然后，这些微球体混合在一起，随后用于制备脚手架。因此，所述蛋白质被包覆在快速降解聚合物和缓慢降解聚合物中，产生至少两种不同的释放动力学和传递脉冲。使用这种方法制备3种、4种、5 种或者更多不同种类的微球体，这种比例计是不同的，从而产生 3种、4种、5种或者更多生物活性组合物(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的释放脉冲。
另一种制备能够传递超过一个脉冲的装置的方法是制造分层的脚手架。通过在不同配方的脚手架上压缩制模另一个不同配方的脚手架来制备分层的脚手架。例如，在模具中压缩原材料(蔗糖+PLG1+蛋白质)然后稍微改变制剂配方(蔗糖+PLG2+蛋白质) 同样在模具中压缩。然后将这两层一起压缩，发泡，产生双层脚手架，对蛋白质具有不同的空间控制，例如Chen et al.，Pharm Res. Spatio-temporal VEGF and PDGF delivery patternsblood vessel formationand maturation.2007Feb；24(2)：258-64)中所述.
装置构建物
从多种不同刚性组合物、半刚性组合物、柔软的组合物、凝胶组合物、自组装组合物、液态晶体组合物或者流体组合物(例如肽聚合物、多糖、合成聚合物、水凝胶材料、陶瓷(例如，磷酸钙或者羟基磷灰石)、蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖金属和金属合金)中构建脚手架结构。使用本领域内已知的方法将所述组合物组装进入细胞脚手架结构中，所述方法例如，注模法、预定结构的冻干法、印刷、自组装、相逆变、溶剂烧注、融化加工、气体发泡、纤维定型/加工、微粒浸出或者这种方法的结合。然后将组装的装置移植入或者向被治疗的个体给药。
所述装置以多种方式在体内组装。所述脚手架由凝胶材料制成，在其未成凝胶时就被引入体内，在体内原位成胶。将装置组分传递到发生装配的位点的示范性方法包括通过针头或者其他挤出工具注射、喷雾、涂布，或者在组织位点沉降，例如使用插管***传递应用装置。在一个实施例中，在引入身体之前或者在引入时，所述未成胶的或者未形成的脚手架材料与生物活性物质和细胞相混合。所得到体内/原位组装的脚手架包括这些物质和细胞的混合物。
脚手架的原位组装作为聚合物自发作用或者协同性的或者化学催化聚合的结果而发生。由多种内源性的因素或者情况、或者操作器向组装位点提供的外源性因素或者情况在组装位点或者组装位点附近引发协同性催化或者化学催化，所述内源性的因素或者情况例如，体温、体内离子或者pH值，外源性因素或者情况例如，光子、加热、电场、声场、或者其他在引入后直接使用在未成胶材料商的其他辐射。通过辐射束或者通过加热或者光导体(例如线、纤维光缆)或者使用超声波传感器使能量应用到脚手架材料上。作为选择，使用一 种剪切稀化的材料，例如ampliphile，这种材料在剪切力作用(例如通过针缝)后的重新相 互交联已经被减轻。
适用于体内、体外组装脚手架装置的水凝胶是本领域内已知的，例如Lee et al.，2001，Chem.Rev.7：1869-1879中的描述.肽 amphiphile自组装装配方法记载在，例如Hartgerink et al.，2002， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：5133-5138中。在剪切稀释后可逆成胶的方法例举在Lee et al.，2003，Adv.Mat.15：1828-1832 中.
通过向目标位点使用连续的相同或者不同的涂料凝胶或者其他脚手架材料，在体内组装成具有多个隔间的装置。例如，用针向预先注射的材料中心依次注射贴近的内层，形成同心圆行的装置。通过将材料注射入预先注射层的不同位置形成非同轴隔间。多头注射装置平行且同时挤出隔间。各个层由相似的或者不同的脚手架组合物制成，用不同的生物活性物质和不同的细胞型涂布。做为选择，根据其疏水/亲水性或者各个隔间内二级相互作用，隔间完成自组装。
隔间化的装置
在一些情况下，使用一种包括隔间的装置，各个隔间具有不同的化学和/或物理性能。设计并建造隔间化的装置并使各个隔间使用不同的组合物或者具有不同的组合物浓度。
作为选择，分别制备各个隔间，然后彼此粘附在一起(例如，象“三明治”似的在中间有一个内隔间，其在一个侧面或者所有侧面被第二隔间包围)。后一种制造方法是使用各个层之间固有的粘连性、使用各个层之间扩散的相互渗透的聚合物链、通过聚合作用或者第一层和第二层之间的交联作用、使用粘合剂(例如，纤维蛋白胶)、或者一个隔间与另一个隔间的物理捕获完成的。根据适当的前体(例如，对温度敏感的低聚肽、对离子强度敏感的低聚肽、块状聚合物、交联剂和聚合体链，或者这些物质的结合)存在的情况下，这些隔间在体内或者体外自组装并适当的对接，并且这些前体包括能够控制细胞组装的细胞粘着分子。
做为选择，使用印刷技术形成所述隔间化的装置。用生物活性物质涂布脚手架前体的连续的邻接层，将这种连续的邻接层放置在底物上，然后交联，例如通过自组装化学作用交联。当使用化学催化的、光催化的或者热催化的聚合反应控制交联时，各个层的厚度和类型被一种面具控制，当各个催化之后未交联的前体材料被冲走时，产生一种复合的三维模型。(WT Brinkman et al.， Photo-cross-linking of type 1 collagen gels in thepresence of smooth muscle cells：mechanical properties，cell viability，andfunction.Biomacromolecules，2003 Jul-Aug；4(4)：890-895.；W. Ryu et al.，Theconstruction of three-dimensional micro-fluidic scaffolds of biodegradablepolymers by solvent vapor based bonding of micro-molded layers.Biomaterials，2007Feb；28(6)：1174-1184； Wright，Paul K.(2001).21st Century manufacturing.NewJersey： Prentice-Hall Inc.)复合物，多隔间层还可以使用喷墨装置制备，所述喷墨装置将不同涂布的脚手架前体“涂”在底物的不同区域。 Julie Phillippi(Carnegie Mellon大学)在2006年12月10目的美国细胞生物学年会上发表的内容；Print me a heart and aset of arteries，Aldhouse P.，New Scientist 13 April 2006 Issue 2547 p 19. (为我打印一个心脏和一组动脉，New Scientist(科学工作者) Aldhouse P.，2006年4月13日发行的第19页)；Replacement organs， hot off the press，C.Choi，New Scientist，25Jan 2003，v2379.将这些层放入复合的三维隔间中。还可以使用下面方法制备该装置：喷光致聚合物，选择性激光烧结，分层物体制造，熔融沉积造型，单喷嘴的喷墨印刷，三维印刷，或分层物体制造。
因子扩散和聚合物降解作用、***中装载的因子剂量和聚合物的组成控制生物活性物质从脚手架装置中释放的释放曲线。相似的，在这些变量中，作用范围(组织分布)和作用持续时间，或者释放因子的空间与时间梯度是可调的。在所关心的组织中，这些因子的扩散和降解作用可以被这些因子的化学修饰任选的调节(例如聚乙二醇化的生长因子)。在这两种情况下，释放的时间范围决定了细胞被这种装置有效传递所需的时间。
使用已知的方法将生物活性物质添加到脚手架组合物上，所述方法包括表面吸收、物理固定，例如，使用相变将物质俘获在脚手架材料中。例如，在生长因子处于水相或者液相中时将其与脚手架组合物相混合，然后改变环境条件(例如，pH、温度、离子浓度)，使液体凝胶化或者固化，从而捕获生物活性物质。或者，使用共价偶联，例如，通过烷基化试剂或者酰化试剂进行共价偶联来使生物活性物质在脚手架上以预定的形态稳定的，长时间的呈递。用于使这些物质共价偶联的示范性的试剂被提供在下表中。
将聚合物与肽/蛋白共价耦合的方法
[a]EDC：1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐；DCC：二环己基碳二亚胺
适合于本发明应用的生物活性物质包括，但是不局限于：干扰素、白介素、趋化因子、细胞因子、集落刺激因子、趋化因子、粒性白细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。可以有效的使用上面提到的任何蛋白质的拼接变体或其小分子激动剂或者拮抗剂来活化树突状细胞，这也被包括在本发明中。
如上所述，示例性的细胞因子包括，但是不局限于IL-1，IL-2， IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12 1L-15，1L-17，1L-18，粒性白细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(γ-IFN)，IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-b，FLT-3配体和CD40配体。
本发明的脚手架选择性的包括至少一个非病毒性基因治疗载体，从而在植入位点附近的植入细胞或者宿主细胞会吸收并表达基因，在需要的时间段产生需要的因子的局部有效性。这种非病毒性载体包括，但是不局限于，阳离子性脂类、聚合物、目标蛋白质和磷酸钙。
脚手架的制备
在气体发泡过程中使用85∶15，120kD的D，L-丙交酯和乙交酯共聚物(PLG)(Alkermes公司，剑桥，麻省)形成具有开放的，相互连通的小孔的脚手架(Cohen S.，Yoshioka T.，Lucarelli，M.， Hwang L.H.，and Langer R.Pharm.Res.8，713-720(1991)；通过引证在此并入本文)。使用标准双乳液方法制备封装粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(Harris，L.D.，Kim，B.S.，and Mooney，D.J.J.Biomed.Mater. Res.42，396-402(1998)；通过引证在此并入本文)。然后将16 毫克的PLG微球体和150毫克的制孔剂、NaCl或者蔗糖相混合 (过筛，使其颗粒大小在250微米和425微米之间)，然后压膜。所得的圆盘在高压的二氧化碳环境中被平衡，然后快速降压，使颗粒展开，并融合成相互连接的结构。通过在水中浸泡使NaCl 从脚手架中浸出，产生90％多孔的脚手架。为了将肿瘤溶解产物整合入PLG脚手架中，将已经在C57BL/6J小鼠背部皮下生长过的B16-F10肿瘤活组织切片(杰克逊实验室，Bar Harbor，缅因州)消化在胶原酶中(250U/毫升)(Worthington公司，Lakewood，新泽西)，并在用40微米过滤器过滤后，将细胞悬浮使细胞浓度为107个细胞/毫升。在液氮中快速冷冻肿瘤细胞悬浮液4个循环，解冻(37℃)并在400转/分的离心机中离心10 分钟。收集包含肿瘤溶解产物的上清液(1毫升)然后与PLG微球体一起冷冻干燥，使用所得混合物制备基于PLG脚手架的癌症疫苗。为了将CpG-ODNs整合入PLG脚手架，聚(氮丙啶) (PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩溶液与60 微升50％(重量/体积)蔗糖溶液一起涡流，冷冻干燥，然后与干燥的蔗糖混合，使最终重量为150毫克。然后将包括聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的蔗糖与空白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或装载肿瘤溶解产物的PLG微球体一起混合，制备PLG癌症疫苗。
本发明的脚手架组合物包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。可以预计各个成分的浓度在一个很大的范围内。在一种优选的实施方案中，所述脚手架组合物包括PLG。对于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，每40毫克聚合脚手架组合物，0-100 微克的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽被整合或者被涂布在所述脚手架组合物上。做为选择，被整合在所述脚手架组合物上的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的剂量包括0-50微克、0-25微克、0-10微克、0-5微克和0-3微克。在一种优选的实施方案中，0-3微克的GM-CSF被整合入脚手架组合物中。对于胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列或者 PEI-CpG-ODN浓缩物，每40毫克聚合脚手架组合物，0-1000微聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被整合或者被涂布在所述脚手架组合物上。做为选择，被整合在所述脚手架组合物上的PEI-CpG-ODN的剂量包括0-500微克、 0-250微克、0-100微克、0-50微克、0-10微克和0-5微克。在一种优选的实施方案中，0-50微克的聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被整合到脚手架组合物中。
胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)整合和体外释放研究
为了确定胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)整合作用的整合效果，使用50微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 制备PLG脚手架并且在1毫升氯仿(Sigma Aldrich公司)中消化，用2毫升水相缓冲液洗涤。分离水相，使用Nanodrop仪、 ND1000(Nanodrop技术公司，威明顿，DE)，通过吸光度读数确定整合的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)述(在0.2mm 光程长度下计算得到260/280和260/230的比例)。同样，为了确定胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的释放动力学，装载有胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的脚手架被放置在含有1毫升的磷酸盐缓冲液(PBS)的孵卵器中(37℃).在各个时间点，收集PBS释放的培养基，并将其替换为新鲜的培养基。分析并记录整合入PLG脚手架的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)和随时间变化被释放入PBS中的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)总量。
体外树突状细胞(DC)迁移试验和树突状细胞(DC)活化作用
使用树突状细胞(DC)系、JAWSII(ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州)进行体外实验，并在补充有20％FBS(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和5ng/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的MEM(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)中维持。为了确定富含CpG的低聚核苷酸 (胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))对树突状细胞体外活化的作用，用5微克/毫升胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 1826，5’-tcc atg acgttc ctg acg tt-3’(SEQ ID NO：10； Invivogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)与JAWSII细胞一起培养24小时，在0、50、500ng/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下，培养12小时。为了评价浓缩的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)对树突状细胞活化的影响，通过将ODN-1826滴入聚(氮丙啶)(PEI)溶液并搅动混合物，实现用聚(氮丙啶)(PEI)分子浓缩CpG-ODN(Huang YC， Riddle F，Rice KG，and Mooney DJ.Hum GeneTher.5，609-17. (2005)；通过引证在此并入本文)。在冷凝过程中，聚(氮丙啶) (PEI)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(NH3+：PO4-) 之间的比值维持在7。作为树突状细胞活化的阳性参照，将树突状细胞与刺激性因子TNF-a(10纳克/毫升)(Peprotech公司， RockyHill，新泽西)和脂多糖(LPS)(10纳克/毫升)(Sigma -Aldrich公司，圣路易斯，美国密苏里州)一起培养。然后收获树突状细胞并用初级抗体(BD Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚州)：PE-共轭的CD86(B7，共刺激分子)、FITC-共轭的 CCR7和FITC共轭的MHCII染色。用荧光激活细胞分类技术分析细胞并根据阳性FITC和PE，使用同型体参照分类，记录各个表面抗原细胞染色阳性百分比。
用孔径为5微米，6.5毫米的transwell盘子(Costar公司，剑桥，麻省)进行迁移实验。为了检测胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)刺激是否可以影响树突状细胞(DC)向着CCL19 (Peprotech公司，Rocky Hill，新泽西)的化学传递，在粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下，用5微克/ 毫升的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者聚(氮丙啶) (PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(装填比为7) 刺激5x105个树突状细胞(DC)，并将0、50和500纳克/毫升粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)放置于上部小孔中，将30纳克/毫升的CCL19放置在下部小孔中。12小时之后，收获迁移入下部小孔中的细胞，并使用库尔特计数器计数。将5、 50和500微克的浓缩物整合入PLG脚手架(13毫米直径，2mm 厚，四等分的)中，接种1x106树突状细胞(DC)并用牛胶原蛋白(BD生物科学公司，圣约瑟，加利福尼亚州)固定在transwells 上，以此来评价树突状细胞(DC)从装载有PEI-CpG-ODN的 PLG基质中向CCL19的分散作用。为了检测CpG刺激的作用，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下，向上部小孔中补充500纳克/毫升的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和包括25微克的PEI-CpG-ODN的脚手架。在各个时间点，收获迁移入下部小孔中的细胞，并使用库尔特计数器计数。
体内树突状细胞(DC)迁移和活化作用试验
向7-9周大的雄性C57BL/6J小鼠的后背皮下口袋中植入空白脚手架，包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、包括或者不包括10微克聚(氮丙啶)(PEI)-ODN参照(5’-tcc atg agc ttc ctg agc tt-3’)(SEQ ID NO：6)或者10微克聚(氮丙啶) (PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的脚手架。为了进行组织学检查，隔开脚手架并将其固定在Z-固定液中，嵌入石蜡中，并用苏木精和曙红色染料染色。为了分析树突状细胞的募集，切割脚手架并用胶原酶溶液(Worthingtion公司，250 U/毫升)将其中生长的组织消化进入单细胞悬浮液中，并在37 摄氏度下搅拌45分钟。然后将细胞悬浮液倒入40微米的细胞过滤器中，从脚手架颗粒中分离细胞，并将细胞压成丸并用冷PBS 洗涤，用库尔特计数器(Beckman Coulter公司)计数。然后用初级抗体(BD Pharmingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚)共轭的荧光标记物染色所得细胞群落，用流式细胞仪分析。进行APC- 共轭的CD11c(树突状细胞标记物)和PE-共轭的CD86(B7，共刺激分子)染色，用于树突状细胞募集分析，进行APC-共轭的CD11c、FITC-共轭CCR7和PE-共轭的MHCII染色，用于树突状细胞编程分析。根据阳性FITC、APC和PE，使用同型体参照分类，记录各个表面抗原细胞染色阳性百分比。为了追踪体内树突状细胞从脚手架中向腹股沟***的迁移，在脚手架制备前，通过与PLG微球体混合将250微克的冷冻干燥的荧光素异硫氰酸盐(FITC)(Molecular Probes公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚)整合到脚手架上，还可以通过将脚手架与330微升3％的 FITC溶液一起培养30分来使用FITC。然后将FITC染色的脚手架皮下植入到C57BL/6J小鼠的左侧，然后在脚手架植入后各个时间点收获腹股沟***(LNs)。通过在胶原酶中消化30分钟并施压使这些组织通过70微米的细胞过滤器来制备从LNs中获得的细胞悬浮液，并使用流式细胞仪检测CD11c(+)FITC(+) 细胞数。
肿瘤生长试验
在C57BL/6J小鼠左下侧面皮下植入PLG脚手架，所述PLG 脚手架含有黑素瘤肿瘤溶解产物和各种剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或10微克的聚(氮丙啶)(PEI)- 胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物。14天后，在后颈处对动物皮下注射105个B16-F10黑素瘤细胞(ATCC，马纳萨斯，新泽西)。监视动物体内是否开始生长肿瘤(大约1立方毫米)，当肿瘤长到20-25毫米(最长直径)时，人道致死。在注射后第20-25天，将肿瘤进行活组织切片，并固定在Z-固定液 (Anatech公司，Battle Creek，MI)中，被苏木精和曙红色染料染色，用于组织学检查。为了检查肿瘤组织的T细胞渗入，使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶Vectastain Elite ABC试剂盒 (Vector Laboratories公司)进行免疫过氧化酶染色。所使用的初级抗体是GK 1.5(CD4)和53-6.72(CD8)，并使用DAB+底物生色团(DAKO公司，Carpinteria，加利福尼亚州)染色。用尼康光学显微镜(印第安纳波利斯，印第安纳州)在40倍和100 倍下目测肿瘤样品薄片(n＝3或者4)，并人工计数阳性染色的T 细胞。将PLG癌症疫苗与普通基于细胞的疫苗相比较，使用经过基因修饰从而表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 的B16-F10黑素瘤细胞，然后如在前的公开，进行照射(3500rad) (Dranoff G.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90，3539-3543 (1993)；通过引证在此并入本文).在用105个B16-F10黑素瘤细胞攻击14天后，向C57BL/6J小鼠皮下注射被照射的肿瘤细胞 (5x105个细胞)。
统计分析
在研究中获得的所有的数据都表示为平均值±标准偏差。通过Student’s t实验分析各个组之间的显著区别，小于0.05的p 值被认为是重要的。
疫苗装置
生物相容性脚手架被用作癌症疫苗的传递工具。癌症疫苗刺激抵抗癌症细胞的内源性免疫反应。目前生产的疫苗显著活化人体免疫***(即，抗体依赖性免疫反应)。其他目前正在研发的疫苗主要集中在活化细胞调节的免疫***方面，包括细胞毒淋巴细胞，这种细胞能够致死肿瘤细胞。通常，癌症疫苗能够增加癌症抗原在抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞和树突状细胞)上的呈递，和/或在其他免疫细胞上的呈递，例如T细胞、B细胞和NK 细胞。虽然癌症疫苗可以以任意形式存在，但是他们的目的都是将癌症抗原和/或癌症相关的抗原传递到抗原递呈细胞(APC)，从而加速这些抗原在抗原递呈细胞上的内源性过程并最终在 MHC 1类分子的细胞表面上呈递这些细胞。癌症疫苗的一种形式是全细胞疫苗，这种疫苗是通过从主体中移出的癌细胞、体外处理，然后作为全细胞重新引入主体而制备的。这些疗法选择性的包括细胞因子，暴露这些细胞因子来活化细胞，从基因上操控细胞过表达细胞因子，或者用肿瘤特异抗原或者抗原混合物激发，并在培养基中扩散。树突状细胞疫苗能够直接活化抗原递呈细胞，使用脚手架组合物调节抗原递呈细胞的增殖、活化和向***的迁移，从而增加其引发免疫反应的能力。被治疗的癌症种类包括中枢神经***(CNS)癌症、中枢神经***(CNS)生殖细胞肿瘤、肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、恶性的神经胶质瘤、成神经管细胞瘤和黑素瘤。
为了引起抗原特异性免疫反应，向哺乳动物体内植入一种脚手架装置。定制所述装置来活化免疫细胞并用一种特异性抗原引发细胞，从而增加免疫预防能力并破坏不需要的组织和目标微生物，例如细菌或者病毒病原体。所述装置通过包含和/或释放信号物质，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来吸引适当的免疫细胞，比如巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞，和树突状细胞。使用本领域惯常用于将其他生物活性化合物整合入脚手架组合物中的技术，将这些信号物质整合在脚手架组合物中，整合方式使其释放可以在时间上和空间上被控制。
一旦免疫细胞进入装置，该装置编程免疫细胞来攻击或者产生其他方面的免疫***，用于攻击不需要的组织(例如，癌症、脂肪沉淀、或者感染病毒的细胞或者相反的，患病细胞)或者微生物。免疫细胞活化作用伴随着居住的免疫细胞与目标特异性组合物的制备，所述目标特异性组合物例如，在不需要的组织或有机体表面发现的配体，例如癌细胞表面标记物、病毒蛋白质、低聚核苷酸、肽序列或者其他特异性抗原。例如，有效的癌细胞- 特异性抗原及其他组织或者有机体-特异性蛋白质列在下表中。
所述装置选择性的包括多重配体或者抗原，用于产生多价疫苗。所述组合物被嵌入或者涂布在脚手架组合物的一个或者一个以上隔间中，从而使免疫细胞迁移穿过装置，在横穿该装置过程中，所述装置与组合物相接触。当脚手架组合物降解时，抗原或者其他免疫刺激性分子暴露于或者将要暴露于细胞中。该装置可能还包括疫苗助剂，所述疫苗助剂能够编程免疫细胞使其识别配体并增加抗原呈递。示范性的疫苗助剂包括趋化因子/细胞因子、富含CpG的低聚核苷酸或者与靶细胞特异性抗原或者配体同时暴露的抗体。
该装置吸引免疫细胞向着脚手架迁移，在脚手架中，细胞以抗原特异性方式被驯化和活化。然后诱导被编程的免疫细胞以多种方式向着***流出。在一个或者一个以上脉冲中释放所述募集组合物和调配信号/组合物(例如，诱导向着***迁移的物质)，用整合和/或释放脚手架材料的方法编程，或者通过连续脚手架隔间(包括诱引剂的脚手架隔间)的降解作用控制。当脉冲小时时，细胞迁移开来。设计包括排异物质的隔间来降解并释放所述排异物质，所述释放可以是在一个或者更多个脉冲中释放，或者随着时间稳定释放。排异物质的相对浓度使免疫细胞从装置中迁移出来。做为选择，已经被放入或者已经迁移进入装置中的细胞被编程，从而释放排异物质，或者改变其自身行为。例如，通过将细胞暴露于附着在脚手架上的质粒DNA来进行定位基因治疗。有效的排异物质包括趋化因子和细胞因子。做为选择，所述装置可以通过降解或者释放免疫细胞使免疫细胞流出。
下面列出了在疫苗装置中有效的目标疾病状态，刺激性分子和抗原。
促进免疫反应的生物活性因子
a.白介素：IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10， IL-12 1L-15，1L-17，1L-18等等。
b.TNF-α
c.IFN-γ
d.IFN-α
e.GM-CSF
f.G-CSF
g.Ftl-3配体
h.MIP-3β(CCL19)
i.CCL21
j.M-CSF
k.MIF
l.CD40L
m.CD3
n.ICAM
o.抗CTLA-4抗体
p.TGF-β
q.富含CPG的DNA或者低聚核苷酸
r.与细菌有关的糖部分：例如脂聚糖(LPS)
s.Fas配体
t.示踪剂
u.淋巴细胞趋化因子
v.Mannan(M-FP)
w.热休克蛋白(例如apg-2，Hsp70和Hsp 90)
疾病和抗原-疫苗接种目标
a.癌症：抗原及其来源
i.从活组织检查中提取的肿瘤溶解产物
ii.照射的肿瘤细胞
iii.黑素瘤
1.MAGE系列抗原(例如，MAGE-1)
2.MART-1/melana
3.酪氨酸酶
4.神经节苷酯
5.gp100
6.GD-2
7.O-乙酰化GD-3
8.GM-2
iv.乳腺癌
1.MUC-1
2.Sos1
3.蛋白激酶C-结合蛋白
4.逆转录酶蛋白
5.AKAP蛋白
6.VRK1
7.KIAA1735
8.T7-1，T11-3，T11-9
v.其他通用和特异性癌症抗原
1.现代人端粒酶酵素(hTRT)
2.角蛋白-19(CYFRA21-1)
3.鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)，(PROTEINT4-A)
4.鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)
5.卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)
6.粘蛋白1(肿瘤相关粘蛋白)，(癌相关粘蛋白)，(多肽性上皮粘蛋白)，(PEM)，(PEMT)，(上皮唾蛋白)，(肿瘤- 相关的上皮细胞膜抗原)，(EMA)，(H23AG)，(花生-反应性尿粘蛋白)，(PUM)，(乳腺癌相关抗原DF3)
7.CTCL肿瘤抗原se1-1
8.CTCL肿瘤抗原se14-3
9.CTCL肿瘤抗原se20-4
10.CTCL肿瘤抗原se20-9
11.CTCL肿瘤抗原se33-1
12.CTCL肿瘤抗原se37-2
13.CTCL肿瘤抗原se57-1
14.CTCL肿瘤抗原se89-1
15.***-特异性膜抗原
16.5T4癌胚滋养层糖蛋白
17.Orf73卡波济肉瘤相关疱疹病毒
18.MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)
19.MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)
20.MAGE-B2抗原(DAM6)
21.MAGE-2抗原
22.MAGE-4a抗原
23.MAGE-4b抗原
24.结肠癌抗原NY-CO-45
25.肺癌抗原NY-LU-12变体A
26.癌相关表面抗原
27.腺癌抗原ART1
28.伴癌相关的脑-睾丸-癌抗原(旁瘤抗原MA2；肿瘤伴随神经元抗原)
29.神经肿瘤抗原2(NOVA2)
30.原发性干细胞癌抗原基因520
31.肿瘤相关抗原CO-029
32.肿瘤相关抗原MAGE-X2
33.滑膜肉瘤，X断点2
34.T细胞识别的鳞状细胞癌抗原
35.血清学方法测出的结肠癌抗原1
36.血清学方法测出的乳腺癌抗原NY-BR-15
37.血清学方法测出的乳腺癌抗原NY-BR-16
38.嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌蛋白1
39.DUPAN-2
40.CA 19-9
41.CA 72-4
42.CA 195
43.癌胚抗原(CEA)
b.AIDS(HIV相关抗原)
i.Gp120
ii.SIV229
iii.SIVE660
iv.SHIV89.6P
v.E92
vi.HC1
vii.OKM5
viii.FVIIIRAg
ix.HLA-DR(Ia)抗原
x.OKM1
xi.LFA-3
c.常见的感染性基本及相关抗原
i.肺结核
1.结核杆菌抗原5
2.结核杆菌抗原85
3.ESAT-6
4.CFP-10
5.Rv3871
6.GLU-S
ii.疟疾
1.CRA
2RAP-2
3.MSP-2
4.AMA-1
iii.可能突变的流行性感冒和脑膜炎菌株
d.神经保护-防止神经疾病(例如，阿尔兹海默氏病、帕金森病、朊蛋白病)
1.自CNS抗原种类
2.人α-突触核蛋白(帕金森病)
3.β-淀粉样斑块(阿尔兹海默氏病)
e.自体免疫性疾病(多发性硬化，类风湿性关节炎，等等)
i.疾病连接的MHC抗原
ii.不同种类的自体抗原
iii.胰岛素
iv.胰岛素肽B9-23
v.谷氨酸
vi.脱羧酶65(GAD 65)
vii.HSP60
疾病连接的T细胞受体(TCR)
在老鼠中原位调节的树突状细胞子集和体细胞调节的肿瘤退化
现有的疫苗对于已经产生的癌症通常没有任何效果，这是由于先进的疾病需要更有力并且更持续的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化作用来致死肿瘤细胞并消除疾病。树突状细胞 (DC)的子集专门进行抗原交叉呈递并产生细胞因子，这种子集调节CTL和T调节性(Treg)细胞，降低效应子T细胞反应。树突状细胞网(尤其是浆样树突状细胞(pDC)和CD8+树突状细胞)的协同调节作用能够提高老鼠的宿主免疫力。将功能性的生物材料与炎症性细胞因子、免疫危险信号和肿瘤溶解产物的多种形式的结合相整合，用于控制宿主树突状细胞群落原位活化和定位。浆样树突状细胞和CD8+树突状细胞的数目以及白介素-12的内源生产，都与预防性抗肿瘤免疫幅度和潜在的CD8+CTL的产生密切相关。经此方法进行的疫苗接种能够在更长的时间里维持局部或者***性CTL反应，并在抗原清除时间内抑制FoxP3 Treg，从而使较远的已有黑素瘤肿瘤完全退化。这种疫苗作为单治疗剂治疗大侵入性肿瘤的效果是pDC和CD8+DC局部活化作用的结果，所述局部活化作用是通过在接种位点进行持续的危险信号传导和抗原信号传导而诱导产生的。这些结果显示树突状细胞子集与治疗性抗肿瘤反应相关的一种至关重要的方式。为肿瘤抗原呈递作用提供次级免疫调节位点使本领域技术人员能够操控可以诱导CTL的异源树突状细胞网络原位产生，并活化针对已有肿瘤的鲁棒的CD8 T细胞效应子作用。
这里描述了通过为肿瘤抗原呈递作用提供次级免疫调节位点造成的异源树突状细胞网的原位产生，所述异源树突状细胞网能够通过CTL诱导活化针对已有肿瘤的鲁棒的CD8+T细胞效应子反应。发炎或者感染会产生在稳定状态下不会被发现的树突状细胞群((K.Shortman，S.H.Naik，Steady-state and inflammatory dendritic-celldevelopment(稳定状态和炎症性树突状细胞发展).Nat.Rev.Immunol.7，19-30(2007))，这说明微环境中的刺激物从树突状细胞网中激发反应。在发炎过程，细胞因子粒细胞 -巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)以增加的浓度存在(J.A. Hamilton，GM-CSF in inflammationand autoimmunity(发炎和自体免疫中的细胞因子粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子 (GM-CSF)).Trends Immunol.23，403-408(2002)；M.C.Dieu， B.Vanbervliet，A.Vicari，J.M.Bridon，E.Oldham，S.F. Brière，A.Zlotnik，S.Lebecque，C.Caux，Selective recruitment of immature and mature dendritic cells by distinctchemokines expressed in different anatomic sites(在不同解剖部位表达的不同趋化因子选择性募集的未成熟和成熟的树突状细胞).J.Exp. Med.188，373-386(1988))，这能同时募集单核细胞和树突状细胞，同时诱导局部单核细胞分化为树突状细胞(G.Dranoff，E. Jaffee，A.Lazenby，P.Golumbek，H.Levitsky，K.Brose，V.Jackson， H.Hamada，D.Pardoll，R.C.Mulligan，Vaccination with irradiated tumor cells engineered tosecrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulatespotent，specific，and long-lasting anti-tumor immunity.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90， 3539-3543(1993)；B.Pulendran，J.Banchereau，S.Burkeholder，E. Kraus，E.Guinet，C.Chalouni，D.Caron，C.Maliszewski，J. Davoust，J.Fay，K.Palucka，Flt3-ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distinct humandendritic cell subsets in vivo.J.Immunol.165，566-572(2000)).
这里使用了可植入性合成聚合物基质(装载抗原的多孔生物材料装置)，所述基质可以在时间、空间上控制细胞因子、肿瘤抗原和危险信号的体内呈递。GM-CSF从这些聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)(一种食品药品管理局(FDA)-认证的生物材料)基质中释放到周围组织，从而募集树突状细胞前体和树突状细胞。富含CpG的低聚核苷酸被固定在基质上作为危险信号，并且抗原(肿瘤溶解产物)被释放到居住在基质上的树突状细胞中，编程树突状细胞的发展的成熟。这些基质定量调节树突状细胞的活化和原位运输，并诱导针对小鼠B16-F10黑素瘤细胞接种的预防性免疫作用(P.Schnorrer，G.M.Behrens，N.S.Wilson，J.L.Pooley， C.M.Smith，D.El-Sukkari，G.Davey，F.Kupresanin，M.Li，E. Maraskovsky，G.T.Belz，F.R.Carbone，K.Shortman，W.R.Heath， J.A.Villadangos，The dominant roleof CD8+dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigencapture.Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.103，10729-10734(2006))。如这里所述，在一定时间内重复施用本***从而控制多种树突状细胞和T细胞子集的募集和活化，这是一种针对已有肿瘤的有效的治疗性疫苗。
下列基质和方法被用于产生这里描述的数据。
基质制备
在气体发泡过程中使用85∶15，120kD的D，L-丙交酯和乙交酯共聚物(PLG)(Alkermes公司)形成多孔的聚-丙交酯-共-乙交酯 (PLG)基质(L.D.Harris，B.S.Kim，D.J.Mooney，Open pore biodegradable matrices formed with gasfoaming.J.Biomed.Mater. Res.42，396-402(1998)).简单地说，使用标准双乳液技术制备聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体包覆的GM-CSF(S.Cohen， T.Yoshioka，M.Lucarelli，L.H.Hwang，R.Langer，Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid) microspheres.Pharm.Res.8，713-720(1991)).然后将PLG微球和150毫克的制孔剂、蔗糖相混合(过筛，使其颗粒大小在250微米和425微米之间)，然后压膜。所得的圆盘在高压的二氧化碳环境中被平衡，然后快速降压，使颗粒展开，并融合成相互连接的结构。通过在水中浸泡使蔗糖从脚手架中浸出，产生90％多孔的脚手架。为了将肿瘤溶解产物整合入PLG脚手架中，将已经在 C57BL/6J小鼠背部皮下生长过的B16-F10肿瘤活组织切片(杰克逊实验室)消化在胶原酶中(250U/毫升)(Worthington公司)，并在用40微米过滤器过滤后，将细胞悬浮使细胞浓度为107个细胞/毫升。在液氮中快速冷冻肿瘤细胞悬浮液四个循环，解冻 (37℃)并在400转/分的离心机中离心10分钟。收集包含肿瘤溶液产物的上清液(1毫升)，与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体一起培养，并冷冻干燥，在高压二氧化碳中使所得混合物发泡产生整合有肿瘤溶解产物的大孔聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质。为了将CpG-ODN整合到聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中，使用PEI(分子量大约为60,000)分子，通过将ODN 1826溶液滴入PEI溶液中同时搅拌混合物来浓缩胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)1826，5-tccatgacgttcctgacgtt-3′(SEQ ID NO：10)(Invivogen公司)(L.D.Harris，B.S.Kim，D.J.Mooney，Open pore biodegradablematrices formed with gas foaming.J.Biomed. Mater.Res.42，396-402(1998)；S.Cohen，T.Yoshioka，M. Lucarelli，L.H.Hwang，R.Langer，Controlled deliverysystems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid)microspheres.Pharm.Res.8，713-720(1991)；Y.C.Huang，M.Connell，Y.Park，D.J. Mooney，K.G.Rice，Fabrication and in vitro testing of polymeric delivery system for condensedDNA.J.Biomed.Mater.Res.A 67， 1384-1392(2003)).在冷凝过程中，聚(氮丙啶)(PEI)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(NH3+：PO4-)之间的比值维持在7。然后，聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)浓缩溶液与60微升50％(重量/体积)蔗糖溶液一起涡流，冷冻干燥，然后与干燥的蔗糖混合，使最终重量为150 毫克。然后将包括聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的蔗糖与空白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或装载肿瘤溶解产物的PLG微球体一起混合，制备PLG癌症疫苗。
树突状细胞(DC)子集和T细胞的原位识别
向7-到9-周大的雄性C57BL/6J小鼠的皮下口袋中植入空白聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质和只包含3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基质或者包含3000ng粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与1、10、50或者100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的结合的基质(同样对分别结合3000纳克的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 或者100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的肿瘤溶解产物、或者三者的结合进行相同的研究)。切割脚手架并将其固定在Z-固定溶液(Anatech公司)中，侵入石蜡并用苏木精和曙红色染料(H&E)染色，用于组织学检查。为了分析树突状细胞的募集，在各个时间点切割脚手架并具有胶原酶溶液(Worthingtion公司，250U/毫升)将其中生长的组织消化进入单室电解槽悬浮液中，并在37摄氏度下搅拌45分。然后将细胞悬浮液倒入40微米的细胞过滤器中，从脚手架颗粒中分离细胞，并将该细胞压制成丸，然后用冷磷酸缓冲液洗涤，并用Z2库尔特计数器(Beckman Coulter公司)计数。为了评价树突状细胞的渗入和活化，用与荧光标记物共轭的初级抗体(BD Pharmingen 公司)对从聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中分离的总细胞群落子集进行染色，进行流式细胞计分析。进行别藻蓝蛋白的 (APC)共轭的CD11c(树突状细胞标记物)和藻蓝蛋白(PE) 共轭的的CD86(B7共刺激分子)染色，用于树突状细胞(DC) 募集分析，进行别藻蓝蛋白(APC)共轭的CD11c、异硫氰酸荧光素(FITC)共轭CCR7和藻红蛋白(PE)共轭的MHCII染色，用于树突状细胞编程分析。为了进一步描绘特异性树突状细胞子集的存在，用APC-共轭CD11c和PE共轭的PDCA-1(pDC标记物)、APC-共轭的CD11c和PE-共轭CD8(CD8树突状细胞 (DC))、或者APC-共轭的CD11c和FITC-共轭CD11b(CD11b 树突状细胞(DC))染色。为了评价T细胞渗透，与APC-共轭的CD8a(CD8 T细胞)、FITC-共轭CD4(CD4 T细胞)和PE 共轭的FoxP3(Treg)一起进行PE-Cy7共轭的CD3染色，并用流式细胞计分析。根据阳性FITC、APC和PE，使用同型体参照分类，记录各个表面抗原细胞染色阳性百分比。
肿瘤生长试验、保护性细胞因子，和TRP2五聚物分析
在C57BL/6J小鼠左下侧面皮下植入PLG脚手架，所述PLG 脚手架含有黑素瘤肿瘤溶解产物和各种剂量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或各种质量的聚(氮丙啶)(PEI) -胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物。14天后，在后颈处对动物皮下注射105个B16-F10黑素瘤细胞(美国分类菌株保藏中心(ATCC))，用于预防接种。监视动物体内是否开始生长肿瘤(～1立方毫米)，当肿瘤长到20-25毫米(最长直径)时，人道致死。
为了评价聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)在治疗组中的效果，通过在后颈部皮下注射5×105个B16-F10黑素瘤细胞(ATCC) 攻击C57BL/6J小鼠。在肿瘤攻击第9天或者第13天后，将装载有3000纳克粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和肿瘤溶解产物的聚- 丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗皮下植入C57BL/6J小鼠的左下侧。在最初接种10天后(第19天和第23天)对一部分小鼠再次接种。
为了确定基质植入位点处的IL-12p70、IFN-α、IFN-γ和 TGF-β的浓度，切出邻近的组织并用组织蛋白提取试剂(Pierce 公司)消化。离心之后，使用酶联免疫吸附试验(R&DSystems 公司)，根据使用说明书分析上清液中IL-12p70、IFN-α、IFN-γ和TGF-β的浓度。
为了确定TRP2-特异性CTL的产生，在各个时间点，从接种 PLG疫苗(溶解产物+3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)+100微克CpG)的小鼠的脾中制备单细胞悬浮液。首先用APC-H-2Kb-TRP2五聚物(Proimmune公司)对这些细胞染色，然后用PE-共轭的单克隆抗体对CD8(BD Pharmingen 公司)染色，随后进行流式细胞仪分析。
数据显示植入的共聚物基质(装载抗原的多孔生物材料装置)能够整合炎症性细胞因子、免疫危险信号和肿瘤抗原，这种基质可以引发免疫反应网络，消除体内产生的肿瘤。
统计分析
在研究中获得的所有的数据都表示为平均值±标准偏差。通过Student’s t实验分析各个组之间的显著区别，小于0.05的p 值被认为是重要的。
局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的传递促进CD11b+树突状细胞(DC) 的募集
制备大孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质用于释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，募集树突状细胞(DC)，所述基质具有相互连接的多孔结构促进细胞渗入。将基质装载0、 3000纳克和7000纳克的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，然后植入C57BL/6J小鼠的皮下口袋中。在植入装载有3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的PLG基质 14天后进行组织分析显示与空白参照相比具有增加的细胞渗出对CD11c树突状细胞(DC)进行荧光激活细胞分类术(FACS) 分析显示粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的传递能够比空白PLG基质募集更多的树突状细胞(DC)(增加8倍)。居住在基质中的树突状细胞(DC)几乎全都是CD11b+(大约87％)，根据其他针对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对树突状细胞(DC)体内募集的作用的研究(N.Mach，S.Gillessen，S.B.Wilson，C.Sheehan，M.Mihm，G.Dranoff，Differences in dendritic cells stimulatedin vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophagecolonystimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res.60，3239-3246(2000)；E.Daro，B.Pulendran，K. Brasel，M.Teepe，D.Pettit，D.H.Lynch，D.Vremec，L.Robb，K.Shortman，H.J.McKenna，C.R.Maliszewski，E.MaraskovSky， Polyethyleneglycolmodified GM-CSF expands CD11bhighCD11chigh but not CD11bloWCD11chighmurine dendritic cells in vivo：A comparative analvsis with Flt3 ligand.J.Immunol.165，49-58(2000))。募集的树突状细胞(DC)的总数及其在共刺激分子CD86上的表达以一种剂量依赖的方式随着粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的传递而增加。然而，在移植后14天，最高剂量(7000纳克)的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)减少了植入位点处活化的树突状细胞(DC) 的数目，如减少的II类主要组织相容性复合体(MHCII)和CCR7 表达所示。由于当粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的剂量为3000纳克时，树突状细胞的募集和活化都出现峰值，所以使用这一剂量募集并产生树突状细胞(DC)。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的传递促进更多的细胞渗透，并与PLG 材料相连，如组织学分析和树突状细胞(DC)数测量结果所示，并允许随后对居住在其中的树突状细胞前体和树突状细胞进行编程。
CpG-低聚脱氧核苷酸的原位传递促进pDC募集和IFN产生
随后，通过将Toll样受体(TLR)活化的聚(氮丙啶)(PEI) -浓缩的CpG-低聚脱氧核苷酸(ODN)分子固定如基质中来检验危险信号局部传递调节不同树突状细胞亚类的比例的能力。用聚阳离子聚合物聚(氮丙啶)(PEI)浓缩低聚核苷酸，会产生带正电的颗粒，这种颗粒可以与阴离子型聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG) 基质静电结合。单独结合胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质将CD11c+-PDCA-1+-pDCs 募集到PLG基质中。当与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)共同施用时，这一作用会被增加。改变与3000纳克粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)结合的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的剂量来调整居住的pDC数目，当胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的剂量为0、10、100微克时，分别得到190,000、520,000和1,200,000个细胞。胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的共呈递对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)增加CD11c+CD11b+cDC的能力有微弱的影响。高剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)促进 IFN-α(大约1010pg/毫升)和IFN-γ(～600pg/毫升)的局部产生，与是否存在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 无关。这些结果显示，从合成的细胞外基质中受控制的GM-CSF 和CpG-ODN危险信号传导相互合作，调节居住于此的pDC和 CD11c+CD1 1b+cDC数目，以及保护性细胞因子的产生，所述保护性细胞因子通常与TH1和CTL免疫性有关。
与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM- CSF)一起传递细胞溶解产物，刺激CD8+产生和IL-12产生
进行试验确定居住在基质上的树突状细胞是否将癌症抗原与CpG-ODNs一起共同呈递，这回促进树突状细胞(DC)的进一步发展、活化和CTL抗原敏感性。在这一方面，坏死的肿瘤细胞尤其可能是免疫刺激性的，这是由于他们能释放各种内源性调节因子(例如，热休克蛋白和受损伤的核酸)，这些内源性调节因子能够触发先天免疫识别作用(C.Fonseca，G.Dranoff， Capitalizing on the immunogenicity of dying tumor cells.Clin.Cancer Res.14，1603-1608(2008))。因此，制备B16黑素瘤的冻融溶解产物，通过将这些溶解产物封装入聚-丙交酯-共-乙交酯 (PLG)材料中来制备抗原呈递基质，使渗透的细胞群体产生定位的局部的抗原呈递(O.A.Ali，N.Huebsch，L.Cao，G.Dranoff，D. J.Mooney，Infection-mimicking materials to program dendritic cells in situ.Nat.Mater.8，151-158(2009))。这些抗原呈递基质出乎意料的刺激CD8+树突状细胞原位产生。当病毒侵入时， CD8+CD11c+cDC尤其有效的用于在MHCII分子上交叉呈递外原性抗原(J.D.Farrar，H.Asnagli，K.M.Murphy，T helper subset development：Roles of instruction，selection，and transcription.J. Clin.Invest.109，431-435(2002)；D.Skokos，M.C.Nussenzweig， CD8 DCs induce IL-12-independent Th1 differentiation throughDelta 4 Notch-like ligand in response to bacterial LPS.J.Exp.Med. 204，1525-1531(2007)；J.M.den Haan，S.M.Lehar，M.J.Bevan， CD8+but not CD8-dendritic cellscross-prime cytotoxic T cells in vivo.J.Exp.Med.192，1685-1696(2000))并且有效用于产生TH1- 促进的细胞因子IL-12(M.Moser，K.M.Murphy，Dendritic cell regulationof TH1-TH2 development.Nat.Immunol.1，199-205 (2000)；D.Jankovic，M.C.Kullberg，S.Hieny，P.Caspar，C.M. Collazo，A.Sher，In the absence of IL-12，CD4+T cellresponses to intracellular pathogens fail to default to a Th2 pattern and arehost protective in an IL-10-/-setting.Immunity 16，429-439(2002)；V.E. Schijns，B.L.Haagmans，C.M.Wierda，B.Kruithof，I.A.Heijnen， G.Alber，M.C.Horzinek，Micelacking IL-1 2 develop polarized Th1 cells during viralinfection.J.Immunol.160，3958-3964(1998)； J.Magram，J.Sfarra，S.Connaughton，D.Faherty，R.Warrier，D. Carvajal，C.Y.Wu，C.Stewart，U.Sarmiento，M.K.Gately， IL-12-deficient mice are defective but not devoid of type l cytokineresponses.Ann.N.Y.Acad.Sci.795，60-70(1996))，这两个机制的目的在于激发CTL针对病毒和肿瘤的免疫性。但是这种活性通常与淋巴组织有关。肿瘤溶解产物与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的共同呈递导致200,000个CD8+树突状细胞(DC) 的存在，当加入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激募集作用时，这一数值增加到大约670,000(大约是空白基质的9 倍)。另外，在植入10天后，肿瘤溶解产物与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和CpG的结合能够增加募集的pDC 的数目，与不含有肿瘤溶解产物的基质相比，此数目增加2倍，与空白基质相比，此数目增加10倍。对于肿瘤溶解产物只与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)结合或者只与CpG信号结合的情况下，没有观察到pDC的数目有明显变化。在接种位点的CD11c+CD11b+DC群体只取决于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，这是由于当只有肿瘤溶解产物或者只有CpG 信号、或者二者的结合时，这种树突状细胞的募集和扩散没有发生显著的变化。
在能够将肿瘤溶解产物和CpG-ODN传递到使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集的细胞群落中的基质上原位产生的T细胞生长因子IL-12比在空白基质上原位产生的T细胞生长因子IL-12多大约4倍，比所有其他基质配方多至少2倍。但是，基质的肿瘤溶解产物不会增加只由胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)诱导的IFN-α和IFN-γ的高浓度。这些结果显示工程设计的基质操控特异性树突状细胞子集的数目和功能，并且伴随有CTL-极化活性。
共传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)和肿瘤溶解产物的PLG基质刺激有效的局部和***性CD8+细胞毒性T细胞
为了解释传递肿瘤溶解产物、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的PLG 疫苗诱导的适应性免疫机制，检测局部和***性CTL活性。疫苗位点渗透的细胞的流式细胞分析显示在第5天由显著的 CD3+CD8+T细胞反应(代表性样品：大约1.9×105个细胞)，在第12天出现峰值，此时相当大部分的居住在基质中的细胞是 CTL(代表性样品：细胞的8.5％；大约8.5×105个细胞)。由于抗原清除作用，在第16天，局部CD8+T细胞数目快速下降，并在第21天可以忽略不计。与其他缺少CpG的基质配方相比，包括肿瘤溶解产物、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的聚-丙交酯-共-乙交酯 (PLG)疫苗优先协调促进CD8+细胞毒性免疫反应。进一步的，通过用MHCII-酪氨酸激酶-相关蛋白2(TRP2)肽五聚物染色脾细胞，利用CTLs对TRP2的专一性来监视***性CTL反应的活化和持续性，其中TRP2是老鼠和人黑素瘤疫苗的一种主要抗原目标。第5天，在接种小鼠的脾中观察到TRP2-特异性CTL的显著扩散，这一扩散继续并在第7和第16天之间出现峰值，在第 21天-28天开始下降，这说明***性抗黑素瘤反应被产生并持续延长的时间。
PLG基质诱导的肿瘤预防与树突状细胞(DC)子集和IL-12产生有关
这一***可以对缺乏免疫原性的B16-F10黑素瘤产生预防免疫性(O.A.Ali，N.Huebsch，L.Cao，G.Dranoff，D.J.Mooney， Infection-mimicking materials toprogram dendritic cells in situ.Nat. Mater.8，151-158(2009)).研究抗癌效果与各种的疫苗制剂调用的特异性树突状细胞网之间的关系。对C57BL/6J小鼠接种整合有不同结合方式的B16肿瘤溶解产物、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质，然后在接种14天后用活 B16-F10黑素瘤肿瘤细胞攻击。在致命剂量的细胞攻击后，含有 B16-F10肿瘤溶解产物和1毫克、10毫克、50毫克或者100毫克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)危险信号的PLG疫苗使 10-30％的接种小鼠存活，不含有肿瘤，而100％的未接种小鼠由于肿瘤负担，在23天致死。当GM-CSF调节的树突状细胞募集与溶解产物和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)传递相结合时，小鼠对肿瘤诱导的致死力显示重要的保护作用。胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的剂量分别为10、50、100微克时，分别获得50％、60％和90％的存活率。
疫苗***建造异源树突状细胞(DC)群体的能力与抗癌效果的显著增加有关。与只传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的抗原基质相比，共传递CpG和GM-CSF的装载抗原基质产生更高比例的pDCs(大约31％对7％)和CD8+cDCs (大约14％对5.5％)，这与小鼠存活率的显著增加有关(90％对 20％)，尽管统计的原位树突状细胞的总数是相似的(3.0±0.6对 4.2±0.9百万树突状细胞(DC)；双尾Student’s t检验，n＝5)。存活率与第10天PLG疫苗位点处产生的pDCs和CD8+cDCs的数目(而不是CD11b+树突状细胞(DC)的数目)成正比。另外， IL-12的内源性产生与动物存活率有关，说明交叉呈递和TH1促进的细胞因子对疫苗效力的重要性。
工程化的PLG基质整合的CpG-ODN通过FoxP3 Treg数和免疫抑制性细胞因子减轻 免疫调节作用
尽管在老鼠癌症模型中已经设计了一些能够体内或者体外编程树突状细胞的疫苗并实现了显著的、长期的预防性保护作用，但是在缺少适用性T细胞转移或者***性治疗剂的情况下，还没有疫苗能够消除侵入性强的、已经产生的肿瘤(W.W. Overwijk，M.R.Theoret，S.E.Finkelstein，D.R.Surman，L.A.de Jong，F.A.Vyth-Dreese，T.A.Dellemijn，P.A.Antony，P.J.Spiess， D.C.Palmer，D.M.Heimann，C.A.Klebanoff，Z.Yu，L.N.Hwang， L.Feigenbaum，A.M.Kruisbeek，S.A.Rosenberg，N.P.Restifo， Tumorregression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant stateof self-reactive CD8+T cells.J.Exp.Med.198， 569-580(2003)；Y.Tamura，P.Peng，K.Liu，M.Daou，P.K. Srivastava，Immunotherapy of tumors with autologous tumor-derived heat shock protein preparations.Science 278， 117-120(1997))。这一限制会影响，至少部分影响基于树突状细胞的疫苗刺激Treg细胞的能力(S.A.Quezada，K.S.Peggs，M. A.Curran，J.P.Allison，CTLA4 blockade and GM-CSF combinationimmunotherapy alters the intratumor balance of effector and regulatory Tcells.J.Clin.Invest.116，1935-1945(2006)；M. Jinushi，Y.Nakazaki，M.Dougan，D.R.Carrasco，M.Mihm，G. Dranoff，MFG-E8-mediated uptake of apoptotic cells byAPCs links the pro-and antiinflammatory activities of GM-CSF.J.Clin.Invest.117，1902-1 913(2007))减少适应性免疫反应的细胞毒性活性。因此，检验工程化的基质在诱导免疫抑制途径方面的影响。使用 GM-CSF和CpG检测CD4+T细胞对抗原呈递基质的反应，结果显示在植入后第5天和第7天出现峰值活性，然后在第12天减少到可以忽略不计的浓度。相反，含有GM-CSF和肿瘤溶解产物的基质在第12天产生CD4 T细胞渗透的显著提高，并且这些细胞可能有助于调节CTL反应。将GM-CSF和肿瘤溶解产物整合到疫苗基质中，使接种位点TGFβ的浓度增加十倍，并且使IL-10 显著增加；这些细胞因子通常与Treg活性和免疫抑制作用有关。进一步的，如之前在基于GM-CSF的疫苗中所观察到的，GM-CSF 与肿瘤抗原共信号传递，在接种位点产生相对于其他所有基质配方更为显著的CD3+FoxP3+反应，产生几乎所有比例的CD8+效应子和FoxP3 Treg细胞。CpG-ODN的呈递与肿瘤溶解产物和 GM-CSF的交叉反应一起构成免疫抑制机制，由于在参照基质中，TGFβ和IL-10浓度以及Treg活性没有提高，并且在植入第 12天后，CD8CTLs的数目比FoxP3 T细胞的数目多大约25倍。这些发现说明疫苗***促进并延长在pDC和CD8+DC诱导的天然T细胞分化过程中的CTL反应(1型IFN和IL-12的相应产物) 和负反馈调节机制的抑制作用。
实施例
实施例1：装载GM-CSF的PLG装置
装载有3微升GM-CSF的PLG基质被植入C57BL/6J小鼠的皮下口袋中。大孔PLG基质以明确的时间空间方式体内呈递 GM-CSF、危险信号和癌症抗原，并且居住于此募集其所编程的树突状细胞。这些基质在头五天释放大约60％的生物活性GM-CSF装载量，随后在下一个10天内缓慢的、持续的释放生物活性GM-CSF(图11A)从而有效的募集居住于此的树突状细胞。
按照如下步骤制备基质。在一种气体产生过程中使用85∶15， 120kD的D，L-丙交酯和乙交酯(PLG)(Alkermers，剑桥，马萨诸塞)形成大孔PLG基质(Harris，L.D.，Kim，B.S.，and Mooney， D.J.Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming(气体发泡形成的开孔生物可降解基质).J.Biomed.Mater.Res. 42，396-402(1998))。使用高压CO2发泡过程将GM-CSF包覆进入PLG脚手架中。利用标准双重乳化技术制备包覆GM-CSF的PLG微球(Cohen S.，Yoshioka T.，Lucarelli，M.，Hwang L.H.，and Langer R.Controlleddelivery systems for proteins based on poly (lactic/glycolic acid)microspheres.(基于聚(丙交酯/乙交酯) 微球的蛋白质控制释放***)Pharm.Res.8，713-720(1991))。为了整合肿瘤溶解产物，用胶原蛋白酶(250U/毫升)(沃兴顿生物技术公司，Lakewood，新泽西)消化在C57BL/6J小鼠背部皮下生长的B16-F10肿瘤活组织检查物(Jackson实验室，巴港，缅因州)，然后在液氮中进行4轮快速冷冻，并回暖(37℃)，在400 转每分的条件下离心10分钟。收集包含肿瘤溶解产物的上清液，然后与PLG微球一起冷冻干燥，所得混合物用于制备PLG脚手架-基癌症疫苗。为了将CpG-ODN整合入PLG脚手架，首先将CpG-ODN 1826，5’-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3’，(SEQ ID NO：10； Invivogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)与聚(乙胺)(PEI，分子量大约为25000克/摩，Sigma Aldrich公司)分子一起浓缩 (将CpG-ODN 1826滴入PEI溶液中)，同时旋涡式震荡混合物。在浓缩过程中，PEI和CpG-ODN的装填比((NH3+：PO4-))恒定维持为7。然后与60微升50％(wt/vol)的蔗糖溶液一起旋涡式震荡PEI-CpG-ODN浓缩溶液，然后冷冻干燥再与干燥的蔗糖混合直到最终质量为150毫克。将包含蔗糖的浓缩产物与装载空白、GM-CSF和肿瘤溶解产物的PLG微球混合，制备PLG癌症抗原。
在对动物施用之后，在第14天进行组织分析。分析证明，与参照(没有整合GM-CSF)相比，渗入脚手架中的总细胞数显著提高(图11B)。对树突状细胞(对细胞表面抗原CD11c和CD86 呈阳性的细胞)进行分析显示，GM-CSF不仅增加了居住于此的总细胞数，还增加了这些细胞中树突状细胞的百分比(图11C)。居住于材料中的树突状细胞的数目是GM-CSF传递的结果，这一数目与通常被编程和被体外施用的树突状细胞数目(106个细胞) 相同或者更多，并且，随着时间，更多的树突状细胞被保留在材料中。GM-CSF对体内树突状细胞募集的作用是时间和剂量依赖性的(图11D)。
从PLG脚手架中传递出来的GM-CSF的剂量是可以改变的，从而在周围组织中提供不同的体内浓度曲线，并调节树突状细胞突变和居住的树突状细胞的分散(图11E)。植入不含有 GM-CSF的脚手架来调节局部浓度，在植入后1-2天内，浓度降低，然后在第5天重新出现峰值，这可能是由于手术和植入的PLG 产生的炎症性反应。GM-CSF从PLG脚手架中的传递产生相似的GM-CSF浓度-时间曲线，但是具有更高的局部浓度。所述***能够使初始GM-CSF剂量加倍，通过使初始剂量加倍，该***使体内GM-CSF峰值浓度出现数量级上的变化，这可能是由于居住于此的树突状细胞核白细胞产生的内源性的GM-CSF。对于3000纳克的剂量，在第5天发现GM-CSF的二级峰值，对于7000 纳克的剂量，在第7天发现二级峰值(图11E)。无论GM-CSF 的剂量是3000纳克还是7000纳克，当GM-CSF浓度开始减弱(分别在第10天和第28天)并进入时树突状细胞的活化状态进入峰值，并进入树突状细胞编程最优的浓度范围。
检测GM-CSF脉冲募集树突状细胞和随后将活化的树突状细胞释放并居住于***的能力。将异硫氰酸荧光素(FITC)整合并涂在PLG脚手架上，使被此脚手架募集的树突状细胞摄取这种标记物。这种标记物可以在随后当树突状细胞移动到腹股沟***后用于识别这些细胞。在第2天，3000纳克的GM-CSF 抑制***归巢，可能是由于在脚手架位点捕获树突状细胞的 GM-CSF的初始浓度过高(图11F)。但是，随着GM-CSF浓度的下降，一批被募集的FITC阳性的树突状细胞从基质中释放，在***产生更高级的持续的DC存在量。
随着短时间控制局部GM-CSF在树突状细胞募集和分散中的浓度，将黑素瘤肿瘤溶解产物固定在基质中装载存留的树突状细胞和肿瘤抗原，以此来评价这些细胞作为癌症抗原的实用性。向C57BL/6J小鼠注射高侵入性和转移性的B16-F10黑素瘤细胞， 14天之后，将这些PLG癌症疫苗移植入C57BL/6J小鼠体内。所有单独植入PLG脚手架的小鼠在第18天出现可观的肿瘤并且由于肿瘤细胞超强的侵入性，不得不在第23天安乐死。只含有抗原的PLG脚手架能够轻微的改善这些老鼠的命运，在此组中，小鼠存活时间超过40天。出人意料的是，共给药GM-CSF和抗原能够显著降低肿瘤形成，并且优选的GM-CSF剂量在50％的动物中延迟癌症形成40天，并且治愈23％的动物。而且局部肿瘤抗原呈递和最优GM-CSF暴露(400ng)的结合与单独使用抗原相比，将肿瘤产生时间增加了3倍，并且与非最优GM-CSf暴露相比，肿瘤产生时间增加了2倍。
下一步分析免疫组织化学作用完成的T细胞向肿瘤组织中的渗入，从而确定编程的树突状细胞是否能够诱导T细胞活化和居住在肿瘤中。单独接种抗原使CD4(+)T细胞渗透。显著性的，原位募集并编程一批树突状细胞，结合合适的GM-CSF呈递能够使CD8(+)细胞毒性T细胞的数目与空白参照相比增加2倍。在CD8和CD4 T细胞敲除小鼠中，疫苗作用被减弱，这证明CD4 和CD8 T细胞在免疫预防中的特异性作用。
通过呈递其他的能够使树突状细胞，一旦居住在基质中就可从GM-CSF抑制作用中释放的线索实现树突状细胞编程的持续原位处理。具体的，合成CpG-ODN与异源GM-CSF的呈递能够模拟细菌感染，在此过程中，被感染性细胞因子募集的细胞被局部toll-样受体活化的“危险信号”刺激，例如细菌中存在的 CpG-ODN。首先将核酸与聚乙烯亚胺(PEI)一起浓缩产生阳离子性纳米颗粒，从而将CpG-ODN固定在PLG基质上。随后使 CpG-ODN与PLG颗粒一起发泡，由于与阴离子性PLG基质的静电作用，CpG-ODN大量存留在基质中(在25天内超过80％)。 CpG-ODN的固定化允许宿主树突状细胞(GM-CSF募集的)吸收其所居住的基质处的核酸。出乎意料的是，这种方法在脚手架中产生的活化的树突状细胞(对MHCII和CCR7呈阳性)数目分别比单独使用GM-CSF或者CpG-ODN传递的高大约2.5倍和 4.5倍。在原位抑制性GM-CSF水平(＞40纳克/毫升)存在的情况下，CpG-ODN呈递提高了树突状细胞活化作用，这说明树突状细胞的募集和活化存在更连续的过程。模拟感染的***可靠的产生活化树突状细胞。这种感染模拟物的免疫反应增幅离谱，这是由于这些动物的***被显著增大了。更重要的是，使用该***后，被募集到基质并随后分散到***的树突状细胞的数目增加6倍。
随后在黑素瘤模型上检测连续的树突状细胞募集并编程产生免疫反应的能力。这种疫苗提供了显著的预防作用和与CpG 剂量有关的预防水平。当CpG的剂量为0微克、10微克和100 微克时，动物的存活率分别为23％、50％和90％。与现有的基于细胞的治疗剂相比，这种材料感染模拟物诱导相同的或者更好的免疫预防作用。只含有CpG-ODN和溶解产物的材料得到的存活率为20％，这说明使用GM-CSF才能起到募集树突状细胞的优势。分别使用具有肿瘤溶解产物、CpG-ODN和具有或者不具有 3000纳克CM-CSF注射剂的疫苗配方来验证募集的树突状细胞在编程时居住于脚手架的优势。而且，注射装载有GM-CSF的 PLG微球以提供持续的GM-CSF传递，同时被募集的细胞不居住于此，在这种情况下，CpG-ODN和肿瘤溶解产物传递只起到有限的预防作用，并且动物不会存活超过35天。
在单独只含有GM-CSF和CpG-ODN，或者二者皆含有的材料中，为了进一步检验使用这种材料***阐述的免疫预防机制，随着其免疫反应专一性分析树突状细胞亚群和这些细胞的细胞因子外源产物。单独传递GM-CSF能够提高CD11c(+)CD11b (+)骨髓树突状细胞的募集，而单独传递CpG-ODN对这一亚群的数目影响很小。但是CpG-ODN传递的确可以增加此位点浆样树突状细胞的数目，这已经被描述为显著的产生Th-1细胞因子，尤其是1类干扰素和白介素(IL)-12，这些因子能够促进 CD8(+)、细胞毒性T细胞响应CpG-ODN呈递抗原的免疫性。因此，CpG信号传导不但能够上调树突状细胞上活化标记物的表达，还能够诱导接种位点产生IFN-和IL-12，如增加的浆样树突状细胞存在量所预计的。而且，渗入未完全预防的动物亚组(感染模拟物；10微克CpG-ODN剂量)中形成的肿瘤中的T细胞被分析，结果证实，即使在这些动物中，用CpG-ODN编程的树突状细胞比参照多产生将近3倍的CD8(+)T细胞渗入。进一步的，在小鼠(包括B16全细胞疫苗)和人中，酪氨酸酶-相关蛋白质(TRP-2)是黑素瘤疫苗产生的免疫反应的抗原靶点，并且，从脾中分离出来的染色细胞中含有MHC类I/TRP2肽/五连体，这说明在接种疫苗的小鼠中TRP-2特异性CD8 T细胞急剧膨胀。肿瘤细胞致死过程涉及这些抗原特异性T细胞，并且在接种后，这些抗原特异性T细胞产生免疫预防作用。另外，33％的存活小鼠从肿瘤接种位点(脖子后面)开始产生皮肤白斑和毛发脱落。脱发可能涉及T细胞对黑素细胞抗原的T细胞反应，已经被认为与人类黑素瘤患者中改善的临床效果有关，并且，在此研究中，只在用感染模拟物治疗的小鼠中发现。
这些结果显示，使用聚合材料***模拟感染能够有效的募集、活化树突状细胞并使树突状细胞居住在***处，从而显著的影响肿瘤进程。第一种方法只利用GM-CSF脉冲将树突状细胞募集到肿瘤抗原呈递材料中。随后，树突状细胞居住在材料中并被捕获，直至GM-CSF水平下降并且细胞被活化和分散。GM-CSF 具体的浓度和持续时间对其作用是至关重要的。随后使用一种持续过程，通过GM-CSF的募集将树突状细胞摆渡通过感染样微环境，然后使用CpG-ODN呈递作用活化居住的树突状细胞，随后释放。PEI浓缩的CpG-ODN从材料中的呈递作用不仅急剧的增加了居住在此材料中的活化的宿主树突状细胞的数目，还增加了移动到***的编程的树突状细胞的百分比和总数目。进一步的，针对具体的树突状细胞亚群和与预防性免疫反应有关的树突状细胞功能选择CpG-ODN信号传导。
该***定量控制树突状细胞的运输和活化，将其翻译成对癌症疫苗效率的调节作用。随着被编程并且分散到***的树突状细胞的数目的增加，存活率从0增加到25，最后为90％。已经发现，在肿瘤中形成的T细胞数目和疫苗功效之间存在明确的关系，T细胞调节免疫预防作用，免疫模拟诱导产生黑素瘤抗原特异性T细胞。由于以丸剂形式传递的疫苗在没有细胞存在的情况下持续释放不能产生显著的预防性免疫作用，因此需要调节基质结构产生长期的免疫力。尽管有报道论证细胞移植或者多重***性注射都能促进临床相关肿瘤模型中的预防性免疫，但是数据显示，包括功能性聚合居住材料的装置能够提供更为显著的和特异性的免疫预防作用，即使以极低的总药剂量单独使用时，这种免疫预防作用也大于等于之前的***(例如，在脚手架***中3微克，相对于之前的***中重复***性注射总剂量100微克)。
这些数据具有显著的临床相关性，由于材料***原位编程树突状细胞，并且避免了体外细胞操作和翻译的混乱和损失，还密切控制了募集、活化和分散到***的树突状细胞的数量。患者可被治疗，并且该装置可以替换现有的癌症疫苗，或者被用于与这样的或者那样的方法结合使用。
该***可以用于需要促进破坏性免疫反应(例如，根除感染性疾病)或者需要促进耐受性(例如破坏自身免疫疾病)的其他情况中。使用聚合物作为原位细胞编程的临时居住地，这是对现有细胞治疗剂的一种有效替换，现有细胞治疗剂取决于体外细胞操作(例如，干细胞治疗剂)。
实施例2：合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)分子浓缩物增加细胞吸收
用PEI浓缩合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)分子，产生带正电荷的小PEI-CpG-ODN浓缩物，该浓缩物能够通过促进与细胞膜的关系和增加横跨膜运输来简化细胞内化作用(图 2)。在PEI的胺基和低聚核苷酸(ODNs)磷酸基的装载比为7和 15时，ODN冷凝作用产生最佳的颗粒尺寸和阳性装载(图2B和 C)，但是由于PEI剂量较高时会产生毒性，在实验中使用的装载比为7。
胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的聚(氮丙啶)(PEI) 凝结作用显著的增加树突状细胞体外吸收核苷(图3A-C)。对树突状细胞(DC)吸收的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 的定量分析显示ODN浓缩物和赤裸的ODN之间存在数量级的差异(高达大约100倍)，这一现象在体外维持延长的时间(大约80 小时)(图3C)。随后对复合物去浓缩(图3D)，使CpG-ODN定位到其细胞内受体Toll样受体(TLR)-9中，之前已经证明，Toll样受体(TLR)-9存在于内涵体中。
实施例3：CDG-ODN诱导的DC活化和DC迁移
由于CpG对树突状细胞的有效刺激需要细胞内定位，评价 PEI-浓缩对树突状细胞活化的影响。与被裸露的CpG-ODN刺激的树突状细胞相比，被PEI-CpG-ODN体外刺激的树突状细胞具有更高的CD86、MHCII和CCR7表达水平，这与树突状细胞吸收浓缩物密切相关(图4A和B)。随着细胞吸收PEI-CpG-ODN，树突状细胞显示了活化的形态，包括产生细针样树突状细胞和更大的膜扩张，这允许成熟的树突状细胞“总结”T细胞促进的强烈的细胞-细胞相互作用。PEI-CpG-ODN刺激的树突状细胞的活化状态反射或者超过用TNF-和LPS(图3C)刺激的阳性参照的活化状态，并且，与为刺激的树突状细胞相比，PEI-CpG-ODN浓缩物促进树突状细胞向CCL19的体外迁移增加3倍(图4D)。
PEI-CpG-ODN浓缩物还从GM-CSF抑制作用中释放树突状细胞，由于在暴露于浓缩的低聚核苷酸和高水平的GM-CSF时，都能在细胞中发现显著的树突状细胞活化作用(图5A)。另外， PEI-CpG-ODN刺激作用还促进树突状细胞从高GM-CSF源(500 纳克/毫升)迁移到CCL19(图5B)。
开发一种PLG***，从而有效的固定并呈递PEI-CpG-ODN浓缩物(图6A)到居住的树突状细胞上，来刺激树突状细胞活化和迁移。局部PEI-CpG-ODN呈递促进树突状细胞的体外迁移(图 6)。有趣的，PEI-CpG-ODN存在能够提高树突状细胞从PLG基质向着CCL19迁移的最佳剂量范围，5-50微克，高剂量(500微克) 不会对树突状细胞的迁移产生作用(图6B和C)。在此模型中(图 6C)，25微克的PEI-CpG-ODN还能抵消高GM-CSF浓度对树突状细胞迁移的抑制作用。这些结果显示，适当的CpG-ODN呈递作用提供了一种持续编程并分散宿主树突状细胞(该树突状细胞被高浓度的GM-CSF原位募集或者捕获)的途径。
实施例4：感染模拟物在体内持续编程并分散树突状细胞
通过同时释放GM-CSF将宿主树突状细胞吸引到PLG基质上来制备一种感染模拟***，这种感染模拟***能持续的募集并编程树突状细胞，而PEI-CpG-ODN浓缩物极大的存留在基质上 (在25天的时间内超过80％)(图6)，同样的，通过静电作用对质粒DNA进行实验显示，募集的树突状细胞局部吸收复合物。令人吃惊的是，当优化时，该方法能够增加基质上原位居住的、能够表达MHCII和CCR7的树突状细胞的数目，分别增加2.5和4.5倍 (相比单独传递GM-CSF或者CpG-ODN)(图7A和B)。有趣的是，高剂量的PEI-CpG-ODN(＞50微克)会产生相对低的MHCII 表达和提高的CCR7表达，这说明与低剂量相比，树突状细胞功能经历不同的调节(图7A)。在抑制性GM-CSF原位水平(大于 40纳克/毫升)存在的情况下，优化的CpG-ODN信号传导(大约 10-25微克)提高了树突状细胞的活化作用，并且这种感染模拟***产生大量的活化的树突状细胞(大于106)(图7A和B)，这是体外施用方案中常用的剂量。
最重要的是，此***能够使树突状细胞的数目增加6倍，所述树突状细胞是首先募集到基质上，随后又被分散到***上的树突状细胞(图8A)。随着这些动物***的显著增大，感染模拟物的免疫反应幅度甚至可以被确定增加(图8B和C)。由感染反应所确定的，这些肿胀的***含有较多数量的免疫细胞，这些免疫细胞包括树突状细胞(图8C和D)。
实施例5：模拟感染的微环境赋予潜在的抗肿瘤免疫力
随后在黑素瘤模型中检测连续的树突状细胞募集并编程产生免疫反应的能力。该疫苗提供显著的预防作用，因此在接种 80天之后，50％的动物不形成肿瘤(图9)，这一结果与使用广泛研究的基于细胞的治疗剂得到的结果非常相似(图9)。接收 Lys+CpG的动物在140天治疗并产生预防性免疫力之后，37.％的动物不含有肿瘤。
而且，对T细胞渗透通过肿瘤组织进行分析，所述肿瘤是在没有完全预防的动物小组中形成的，该分析显示，即使在这些动物中，使用CpG-ODN进行树突状细胞编程与参照相比，能够使 CD8(+)T细胞过滤增加三倍(图10)。因此，所有被Lys-GM-CpG 治疗的动物都显示出治疗优势。
实施例6：胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)呈递和浆样树突状细胞(DC)(pDC) 富集调节的肿瘤预防
骨髓系和淋巴系的造血前体细胞能够分化成两种主要的树突状细胞种类(浆样树突状细胞(pDC)和常规树突状细胞 (cDC))，这两种细胞分别装配有特异性预防机制，能够增加对侵入性病原体的特异性反应。这种适应性很可能允许树突状细胞子集的募集和产生更有效的刺激理想的免疫反应。cDC包括 CD11c+CD11b+和CD11c+CD8α+细胞，显示典型的树突状细胞形态学，具有长的、突出的树突，使其尤其适于抗原处理和T细胞上的抗原呈递。pDC是圆形的非树突状细胞，能够响应于“危险信号”产生大量的1型干扰素，所述危险信号例如病毒或者细菌DNA 中未甲基化的CpG二核苷序列。
通过引发CD8+T细胞上的抗原交叉呈递和cDC的白介素 (例如IL-12)生产(促进细胞毒性T细胞的克隆扩增)，pDC衍生的1型干扰素(IFN)将天然和适应性免疫力与病毒感染相连。1 型IFN还直接用于诱导天然T细胞分化成T辅助因子1细胞。除了产生有效的IFN之外，炎症性刺激物和微生物感染刺激的pDC分化成树突状细胞形式，能够处理并呈递抗原，引发T细胞反应。 pDC和cDC合作完成专门的功能，产生不同的细胞事件和分子事件，导致预防性免疫力。
许多基于细胞的癌症疫苗不能整合不同的树突状细胞网组分。通常，使用方便利用的、病人衍生的血液单核细胞开发癌症疫苗，所述单核细胞被细胞因子混合物体外转化成树突状细胞并施用肿瘤抗原脉冲，促进抗原呈递。这些装载抗原的树突状细胞随后注入癌症病人中，用于诱导最初由Th1细胞核CTL调节的抗肿瘤免疫反应。虽然最初的实验事先体外施用树突状疫苗，癌症病人产生抗原特异性T细胞扩张并产生保护性细胞因子，但是相比于传统疗法(例如化疗方法)，许多疫苗不能显示更好的存活率，并且不能获得FDA的许可。这些基于细胞的疫苗不能控制移植的树突状细胞的体内功能，并且只整合一种树突状细胞进入疫苗，不会十分有效。因此，限制速度的步骤可能是不能全面的体外概括以及免疫组分树突状细胞的开发，尤其是在产生免疫反应时树突状细胞活化和专门化过程中。这里描述的装置和方法克服了早期方法的缺陷，并且因此，与早期方法相比更具优势。
该装置包括一种可植入的、合成性细胞外基质(ECM)，这种细胞外基质能够控制异源树突状细胞网的原位募集和产生，引发针对癌症的预防性免疫反应。GM-CSF被整合到聚丙交酯-共- 乙交酯(一种FDA认证的生物材料)基质中募集树突状细胞前体和树突状细胞，随着细胞因子从材料中释放到周围组织中。这种大孔基质存在固定的肿瘤抗原，并且使用富含CpG的低聚核苷酸作为危险信号，随着细胞居住在材料上，能够编程树突状细胞的发展和成熟。通过调节材料上癌症抗原的呈递作用和危险信号的剂量来调节接种位点处产生的树突状细胞的分配，当在本领域已知的B16-F10肿瘤模型中检测时，这显著影响了肿瘤预防性免疫反应的幅度。
制备基质，释放GM-CSF脉冲来募集树突状细胞，并且所述基质装载有0、3000和7000纳克的GM-CSF，将基质植入C57BL/6J 小鼠的皮下小袋中。周围组织中形成GM-CSF梯度，在植入后12 小时，GM-CSF浓度出现峰值，在距离接种位点分别为1-3毫米和 3-5毫米的地方，浓度分别达到100微克/毫升和30微克/毫升(相比于没有整合GM-CSF的基质来讲＞30倍)。在因子从PLG中释放到邻近组织时，提高的GM-CS浓度被维持更长的时间(大约10 天)。在移植后14天对装载有3000纳克GM-CSF的PLG基质进行组织学分析显示，与空白参照相比，具有提高的细胞内渗透，并且对CD11c(+)DC细胞群进行FACS分析显示，GM-CSF传递能够募集更多的树突状细胞，与空白参照相比增加大约8倍。募集的树突状细胞的总数及其在共刺激分子CD86上的表达以一种剂量依赖的方式随着GM-CSF的传递增加。
然后修饰PLG基质以固定TLR-活化的、PEI浓缩的CpG-ODN 分子，并使其作为由GM-CSF募集的树突状细胞的危险信号存在。在植入后第10天进行组织学分析说明，与GM-CSF一起提供 CpG-ODN信号能几句的提高PLG基质的细胞渗透。重要的是， CpG-ODN从PLG基质中呈递能够调节局部特异性树突状细胞亚群的存在，并产生预防性细胞因子。用CpG-ODN刺激GM-CSF募集的树突状细胞浸出物提高了PLG基质上的CD11c(+)PDCA-1 (+)浆样树突状细胞(pDC)，这种细胞是一种树突状细胞亚群，表现出提高的1型IFN产量，1型IFN产量与t-辅助因子1(Th1)免疫力有关。
CpG-ODN在肿瘤位点优先募集和扩张pDC。控制CpG-ODN 的剂量来调节居住的pDC数量，当CpG-ODN的剂量分别为0、10 和100微克时，细胞数目从190000分别增加到520,000，和1,100,000。GM-CSF单独传递能够显著的提高募集到基质上的 CD11c(+)CD11b(+)cDC数目，但是将GM-CSF与CpG-ODN 共呈递对mDC群体或者Cd11c(+)CD8(+)DC的数目具有很少的影响。高剂量的CpG-ODN促进植入位点处IFN-(大约)、IFN-(～600pg/ml)以及较少程度的IL-12(150pg/ml) 的局部产生，这与此情况下增加的pDC数目有关。通过GM-CSF进行的树突状细胞的募集是CpG-ODN信号传导所需要的，用于实现显著的效果，依据pDC群落的扩张和Th1的产量。这些结果说明，随着Th1细胞因子的产生，控制的GM-CSF和CpG-ODN信号从合成的细胞外基质中的传导可以有效的调节居住的pDC和 CD11c(+)CD11b(+)cDC数目。
进行研究确定居住在基质上的树突状细胞将癌症抗原与 CpG-ODNs一起共同呈递是否会促进树突状细胞(DC)的进一步发展、活化和抗原敏感性，导致预防性的肿瘤免疫力和细胞毒性 T细胞反应。通过将B16-F10黑素瘤肿瘤溶解产物封装入聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中来制备抗原呈递基质。在移植10天后，受控制的抗原呈递与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)和CpG信号的结合能够使居住的pDC的数目与不含有抗原的基质相比增加两倍，与空白对照相比，增加10倍(图 12A)。抗原呈递分别与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 或者CpG信号传导单独结合时，没有观察到pDC数目的显著变化，这说明居住于基质中的树突状细胞的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)调解的募集和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)活化均具有优势。在疫苗接种位点处的CD11c(+) CD11b(+)树突状细胞群落仅仅取决于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的传递(图12B)，这是由于单独的抗原或者 CpG信号传导或者二者的结合没有显著影响这些cDC的募集和扩散(图12B)。呈递抗原和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 的基质中存在200,000个CD11c(+)CD8(+)cDC，随着粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)调节的募集作用，细胞数目增加到大约670,000(与空白基质相比增加9倍)(图12c)。对内源产生的IFN和IL-12进行分析显示，抗原刺激作用与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的结合能促进内源性IFN-a和IFN-g 的产生，这与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的诱导作用相似(图12D-E)。另外，在能够使粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集的细胞群体呈递抗原和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的基质上原位产生的T细胞生长因子(IL-12) 比空白基质上产生的多大约4倍，比其他所有基质配方高至少2倍 (图12F)。值得注意的是，在抗原呈递基质位点总细胞中重要的一部分(10.3％)是CD8(+)(cDC亚群和细胞毒素T细胞)(图12G)，这与CD11c(+)CD8(+)cDCs数目和IL-12浓度均有关系(图12C，F，G)。这些结果说明，通过操控原位特异性树突状细胞亚群(包括CD8(+)树突状细胞(DC))的数目和功能能够产生对癌症抗原呈递作用敏感的免疫反应，这伴随有CD8+T细胞活性。
使用PLG基疫苗呈递的黑色素瘤抗原(例如，B16-F10肿瘤溶解产物)接种C57BL/6J小鼠，所述疫苗差异化调节特异性树突状细胞亚群的原位产生和功能(改变粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)结合)，然后在接种14天后，用B16-F10黑素瘤肿瘤细胞攻击小鼠。在致命剂量的细胞攻击后，含有B16-F10肿瘤溶解产物和1毫克、10毫克、50毫克或者100毫克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 危险信号的PLG疫苗使大约10-30％的接种小鼠存活，不含有肿瘤 (图13A)，而100％的未接种小鼠由于肿瘤负担，在23天致死。令人吃惊地是，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)调解的树突状细胞(DC)募集作用与抗原和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的呈递相结合，产生显著的肿瘤预防作用。10、50和100毫克的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)剂量导致50％、60％和90％的存活率(图13B)。存活率与接种10天后PLG 疫苗接种位点处产生的pDC数目有关，但是与募集的CD11c(+) CD11b(+)树突状细胞(DC)总数无关。另外，产生相对较多的CD11c(+)CD8(+)树突状细胞(DC)(大约2x105个细胞) 的PLG***(图13E)和具有增加的IFN-a、IFN-g和IL-12原位产量的PLG***能够产生更高的存活率(60％和90％)。
疫苗***募集异源树突状细胞网的能力同样对疫苗效力具有深远影响，这是由于，装载CpG和GM-CSF的脚手架所产生的树突状细胞群体与装载GM-CSF的脚手架产生的树突状细胞相比具有更高的pDCs比例(大约38％对7％)和CD8+cDCs比例(大约 9.4％对5.5％)(图13F)，使小鼠存活率显著增加(90％对20％)，即使统计的原位树突状细胞总数是相似的(3.05+0.55对2.67 +0.64百万树突状细胞(DC))。而且，在小鼠(包括B16全细胞疫苗)和人体内，酪氨酸酶相关蛋白质(TRP)-2是由黑素瘤疫苗引发的免疫反应的主要抗原目标，用I类MHC/TRP2肽五聚物染色脾细胞显示，与接种呈递较少CpG剂量或者0、50微克(0.2％和0.3％脾细胞)的基质相比，在接种粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、抗原和100微克的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)(0.55％脾细胞、1.80x105+0.6x104细胞)的小鼠体内，TRP2-特异性CD8 T细胞有显著扩增。通过促进pDC活化及相应1类IFN的产生来诱导这些抗原-特异性T细胞的发展与扩散。这些细胞毒性T细胞依次被包括在肿瘤细胞致死过程中，在接种疫苗后促进免疫保护作用。这些结果显示，这里描述的装置(PLG 基质)精确调节专门化树突状细胞(DC)亚群的原位募集和扩张。与之前的疫苗方式相比，pDC的优先募集、扩增能够显著的改善针对癌症抗原的免疫反应并且减少肿瘤进程，并改善癌症病人的存活率。
图14A-B显示了在一种治疗模型中，接种PLG疫苗的小鼠相对于参照物的存活率。用5x105个肿瘤细胞接种小鼠，然后允许肿瘤在小鼠体内生长7天直到可触知(1-3立方毫米)。对小鼠接种(在第7天)包含3微克粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、肿瘤溶解产物和100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)的PLG脚手架。获得具有成形肿瘤(肿瘤接种7天后)的小鼠(n＝10)的存活率。包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、溶解产物和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)的PLG疫苗被用于进行疫苗接种。
[02]这里描述的大孔、合成的细胞外基质控制炎症性和传染性信号传导试剂的呈递，产生能够产生不同原位树突状细胞网的微环境。在B16黑素瘤模型中，这些树突状细胞网的总细胞数目和非均匀性与癌症抗原免疫反应的幅度有关。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从PLG-基ECM中快速释放，在其大孔结构中募集并收容宿主树突状细胞前体和树突状细胞。然后在分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基质中固定CpG-ODN，以原位指导pDC的发展，并且，事实上，CpG信号传导不仅增加了植入位点的CD11c(+)PDCA-1 (+)pDC数目，而且以剂量依赖的方式在位点处富集pDC。当肿瘤抗原被整合入PLG基质中时，可以观察到在接种位点处 CD11c+CD8+cDC的活性和富集程度增加。提供癌症抗原能够产生更多的CD8+细胞群体，这说明Cd8+树突状细胞(DC)和 Cd8+T细胞对抗原呈递材料的原位应答以及所述免疫应答具有细胞毒性组分。在疫苗植入位点进行细胞因子分析显示，树突状细胞(DC)亚群以相互合作的方式发挥作用，产生有效的免疫反应。pDC数目与1型IFN的存在密切相关，这会帮助 CD11c(+)CD11b(+)cDC抗原交叉呈递的活化作用，增加细胞激发的CTL。另外，pDC和CD8+cDC的数目与IL-12产生有关，从而促进居住在基质中的树突状细胞的抗原表达和交叉呈递以及CTL的发展和生长。
肿瘤生长和T细胞分析说明，由于树突状网的非均匀性原位增加，疫苗效力也增加。虽然统计的树突状细胞总数与粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号相似，但是CpG-ODN危险信号的存在能够以一种剂量依赖的方式增加pDC数目，这与 B16-F10肿瘤攻击后的动物存活率密切相关。从PLG疫苗中与黑素瘤抗原一起呈递10、50和100微克剂量的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(在分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的基质中)会使小鼠的存活率分别为45％、60％和 90％。从PLG疫苗中除去粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)信号会急剧降低原位产生的树突状细胞总数，这会使存活率跌至10％，而除去胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)信号会减少原位pDC数目，因此大多数树突状细胞 (DC)(87.4％)是CD11b+CDCs。确定每种树突状细胞亚群诱导预防性免疫所需的最少树突状细胞(DC)数目，大约需要 600,000个pDCs和200,000个CD8+cDCs(大约总树突状细胞的 30％)与大约2,000,0000个CD11b+cDCs协同作用，在肿瘤攻击后实现大于50％的存活率。
该结果具有重要的临床意义，说明本装置和方法能够定量靶向同时利用体内树突状细胞亚群用于产生免疫力，造成明显的保护性免疫反应。
实施例7：结构聚合装置中Toll样受体(TLR)激动剂的呈递
材料和方法
小鼠
在实施例7中描述的研究中，使用C57BL/6小鼠和Batf3-/-敲出小鼠(6-8周大的雌性小鼠，杰克逊实验室)
基质制备
在气体发泡过程中使用85∶15，120kD的D，L-丙交酯和乙交酯共聚物(PLG)(Alkermes公司，剑桥，麻省)形成多孔PLG基质(Harris et al.，1998J.Biomed.Mater.Res.，42：396-402).使用标准双乳液方法制备封装粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(Cohen et al.， 1991Pharm.Res.，8：713-720).同样使用双乳液方法制备包含单磷酸脂A(MPLA)作为助剂的PLG微球体(Avanti Polar Lipids， Alabaster，AL)。然后使PLG微球体与150毫克制孔剂、蔗糖(过筛，使颗粒尺寸在250微米到425微米之间)混合物，并压模，从而产生具有开放的、相互连接空气的圆盘装置，所述小孔的尺寸与成孔剂尺寸范围相近。所得的圆盘在高压的二氧化碳环境中被平衡，然后快速降压，使颗粒展开，并融合成相互连接的结构 (Harris etal.，1998 J.Biomed.Mater.Res.，42：396-402)。通过在水中浸泡使蔗糖从脚手架中浸出，产生90％多孔的脚手架。
为了将肿瘤溶解产物整合入PLG脚手架中，将已经在 C57BL/6J小鼠背部皮下生长过的B16-F10肿瘤活组织切片(杰克逊实验室，Bar Harbor，缅因州)消化在胶原酶中(250U/毫升) (Worthington公司，Lakewood，新泽西)，并在用40微米过滤器过滤后，将细胞悬浮使细胞浓度为107个细胞/毫升。在液氮中快速冷冻肿瘤细胞悬浮液4个循环，解冻(37℃)并在400转/分的离心机中离心10分钟。收集包含肿瘤溶解产物的上清液(1毫升) 然后与PLG微球体一起培养并冷冻干燥，使用所得混合物制备基于PLG脚手架的癌症疫苗。
为了将CpG-ODN和P(I：C)整合入PLG脚手架中，首先将 CpG-ODN 1826，5′-tcc atgacg ttc ctg acg tt-3′，(SEQ ID NO：10； Invivogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)或者P(I：C)(高分子量；Invivogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)与聚(氮丙啶) (PEI，分子量大约为60,000，Sigma Aldrich公司)分子一起浓缩 (将CpG-ODN 1826滴入PEI溶液中)，同时旋涡式震荡混合物 (Huang，et al.，2003 J.Biomed.Mater.Res.，A 67：1384-1392). 在冷凝过程中，聚(氮丙啶)(PEI)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(NH3+：PO4-)之间的比值维持在7。在浓缩过程中，聚(氮丙啶)(PEI)和P(I：C)(NH3+：PO4-)之间的比值维持在3。然后将浓缩溶液与60微升50％(质量/体积)的蔗糖溶液涡流混合，冷冻干燥并且与干燥蔗糖一起混合，最终质量为 150毫克。然后将包括PEI-CpG-OND浓缩物的蔗糖与空白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或装载PLG微球体的肿瘤溶解产物一起混合，制备PLG癌症疫苗。
树突状细胞(DC)和T细胞的原位识别
向7-到9-周大的雄性C57BL/6J小鼠的皮下口袋中植入装载粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚-丙交酯-共-乙交酯 (PLG)基质和包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 与100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A (MPLA)或者P(I：C)的结合的PLG基质。为了分析树突状细胞的募集，在不同的时间点切割脚手架并用胶原酶溶液 (Worthingtion公司，250U/毫升)将其中生长的组织消化进入单细胞悬浮液中，并在37摄氏度下搅拌45分钟。然后将细胞悬浮液倒入40微米的细胞过滤器中，从脚手架颗粒中分离细胞，并将细胞压成丸并用冷PBS洗涤，用库尔特计数器(Beckman Coulter 公司)计数。为了评价树突状细胞的渗入和活化，用与荧光标记物共轭的初级抗体(BDPharmingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)对从聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中分离的总细胞群落亚群染色，然后进行流式细胞计分析。对APC-共轭的CD11c (树突状细胞标记物)、FITC-共轭的MHCII和PE-共轭的CD86 (B7，共刺激分子)染色用于进行树突状细胞(DC)募集和活性分析。为了进一步描绘特异性树突状细胞亚群的存在，用APC- 共轭CD11c和PE共轭的PDCA-1(浆样树突状细胞(DC)标记物)、 APC-共轭的CD11c和PE-共轭CD8(CD8树突状细胞(DC))染色细胞。为了评价T细胞渗透，与APC-共轭的CD8a(CD8 T细胞) 和PE共轭的FoxP3(Treg)一起进行PE-Cy7共轭的CD3染色，并用流式细胞计分析。根据单阳性FITC、APC和PE染色分类细胞并使用同型体参照。记录各个表面抗原细胞染色阳性百分比。
肿瘤生长试验、保护性细胞因子，和TRP2五聚物分析
在C57BL/6J小鼠左下侧面皮下植入PLG脚手架，所述PLG脚手架含有黑素瘤肿瘤溶解产物和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A(MPLA)或者P(I：C)的结合。14天后，在后颈处对动物皮下注射105个B16-F10黑素瘤细胞(美国分类菌株保藏中心 (ATCC)，马纳萨斯，新泽西)，用于预防接种。监视动物体内是否开始生长肿瘤(大约1立方毫米)，当肿瘤长到20-25毫米(最长直径)时，人道致死。
为了评价聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗在治疗组中的效果，通过在后颈部皮下注射5x105个B16-F10黑素瘤细胞(ATCC，马纳萨斯，新泽西)攻击C57BL/6J小鼠。在肿瘤攻击第9天后，将装载有3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、100 微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A(MPLA) 或者P(I：C)和肿瘤溶解产物的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗皮下植入C57BL/6J小鼠的左下侧。在最初接种10天后(第19 天和第23天)对一部分小鼠再次接种。
为了确定基质植入位点处的IL-12p70的浓度，切出邻近的组织并用组织蛋白提取试剂消化。离心之后，使用酶联免疫吸附试验(R&D Systems公司)，根据使用说明书分析上清液中IL-12p70 的浓度。
为了确定TRP2-特异性细胞毒淋巴细胞的产生，在各个时间点，从接种PLG疫苗(抗原+3000ng粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)+100微克CpG或者单磷酸脂A(MPLA)或者P(I：C)) 的小鼠的脾中制备单细胞悬浮液。首先用PE-H-2Kb/TRP2五聚物(SigmaAldrich公司)对这些细胞染色，然后用FITC-抗-CD8和 PE-CY7CD3单克隆抗体(BDPharmingen公司)对细胞染色，随后进行流式细胞仪分析。
肿瘤渗透白血球(TIL)特性鉴定
在指定的几天，从小鼠中除去B16-F10肿瘤，并37℃下，在 1微克/毫升胶原酶II(250U/毫升)(沃兴顿，Lakewood，新泽西) 和0.1毫克/毫升DNase中消化1小时。在40-微米过滤器中分离细胞，用抗体直接染色，使用荧光激活细胞分类术(FACS)分析进行表型定性。使用APC-抗-CD8和PE-Cy7-抗CD3识别从B16F10 肿瘤中分离的T细胞。还将这些TIL与FITC-抗IFNγ和PE-抗 CD107a共染色。所有抗体来自圣地亚哥，加利福尼亚州的 eBioscience公司。
统计分析
在研究中获得的所有的数据都表示为平均值±标准偏差。通过Student氏t测验分析各个组之间的显著区别，小于0.05的p值被认为是重要的。
控制的GM-CSF和Toll样受体(TLR)激动剂的呈递
设计大孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质(图15F)用于快速释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Ali et al.， 2009Nat Mater，2：151-8)，在第10天释放大约60％的蛋白质(图 15A、15B和15E)，从而诱导树突状细胞(DC)或其前体的募集。装载粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的PLG脚手架还可以被修饰用于呈递Toll样受体(TLR)-活化的CpG-ODN、MPLA 和P(I：C)分子，作为危险信号。在所有情况下，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的体外释放动力学是相似的(图15A、 15B和15E)。Toll样受体(TLR)激动剂与脚手架密切相关，在头 10天，有大约20-30％的整合的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)、P(I：C)和单磷酸脂A(MPLA)被体外释放，随后在另外14天中缓慢持续释放危险信号。呈递Toll样受体(TLR) 激动剂以提供长期的局部信号，活化树突状细胞(DC)。重要的是，选择相对高分子量和组成的PLG用于制备脚手架，导致缓慢的脚手架降解作用，允许对疫苗接种位点的长期分析和其对树突状细胞活化的T细胞免疫性的调节。
受控制的树突状细胞产生和体内活化
为了检验PLG基质体内募集并活化树突状细胞的能力，将能够传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和危险信号结合的基质皮下植入C57BL/6J小鼠的背部。7天后通过对从聚合材料中分离的细胞群体进行FACS分析来确定树突状细胞(DC)渗入和活化进入基质的幅度。单独传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的参照基质包括2.41+0.24x105个CD11c(+)(图16E和16F)细胞，具有相对低的活化标记物表达水平，所述活化标记是MHCII(总CD11c(+)细胞的2.57％)和CD86(CD11c(+) 细胞的4.58％)。其中包含Toll样受体(TLR)-活化危险信号的PLG 基质能够显著增加树突状细胞的产生和原位活化。与单独传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)相比，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A(MPLA)和P(I：C)的呈递能使募集的树突状细胞总数分别增加2.5倍、1.9倍和2.2倍。分析居住在基质中的树突状细胞的活化状态显示，局部诱导Toll样受体(TLR)能够产生更多百分比的活化的树突状细胞(DC)、例如，对MHCII(+)和CD86(+)呈阳性的CD11c(+)细胞，分别占被装载CpG、单磷酸脂A(MPLA)和P(I：C)的基质募集的细胞总数的30％、19％和28％。呈递Toll样受体(TLR)激动剂的基质使植入位点处活化的树突状细胞(DC)总数与缺少这些信号的参照基质相比增加了15倍(单磷酸脂A(MPLA))、20倍 (P(I：C))和23倍(胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))(图 16F)。
与参照相比，用CpG-ODN、单磷酸脂A(MPLA)或者P(I：C) 刺激渗透PLG基质的细胞能够增加CD11c(+)PDCA-1(+)pDCs 和CD11c(+)CD8(+)cDCs的数目(图16G)。与参照基质相比，危险信号将植入位点处的pDCs数目增加大约4倍，在呈递任何一种Toll样受体(TLR)激动剂的脚手架中居住的pDC平均数目为 140,000个细胞。当呈递单磷酸脂A(MPLA)和P(I：C)时，植入位点处的CD8(+)树突状细胞(DC)的水平提高大约5倍，当使用胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)作为刺激剂时，CD8 (+)树突状细胞(DC)的数目提高9倍。惊人的是，Toll样受体 (TLR)活化剂的局部传递能够促进植入位点处IL-12的局部产生 (200-400纳克/毫升)(图16H)，使用CpG和P(I：C)得到最高的水平。在这些情况下，IL-12的浓度与增加的活化树突状细胞和树突状细胞亚群数目有关(图16H)。另外，在疫苗接种位点检测一组候选炎症性细胞因子的浓度。胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸 (CpG-ODN)和P(I：C)诱导使IFN-α的浓度提高相似的水平，而单磷酸脂A(MPLA)对IFN-α的浓度没有作用。但是，单磷酸脂A(MPLA)使TNF-α的浓度提高4倍(图21B)。与装载胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和P(I：C)的基质相比，装载单磷酸脂A(MPLA)的基质中的IL-12浓度要低2倍。TNF- α抑制单核细胞和树突状细胞(DC)导出的干扰素γ(IFN-γ)、 IL-12和T细胞激发(Hodge-Dufour et al.，1998Proc.Natl.Acad. Sci.USA，95：13806-13811)和前述的细胞因子曲线，说明与整合胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和P(I：C)信号的基质相比，装载单磷酸脂A(MPLA)的基质在几次抗肿瘤特异性反应方面具有较少效果。
预防性的疫苗接种及其功效的关系
由于呈递TLR激动剂的PLG基质原位产生不同的活化树突状细胞群体和有效的细胞因子，在缺乏免疫力的B16-F10黑素瘤模型中检测这些***的抗肿瘤效力。使用B16肿瘤溶解产物作为疫苗配方中肿瘤抗原的来源。预防性的PLG-基疫苗呈递B16-F10肿瘤溶解产物和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，在接种后使用致命的细胞攻击小树，该疫苗能使10％的接种小鼠存活，不再患有肿瘤(图17A)。重要的是，装载抗原和GM-CSF的基质与Toll样受体激动剂结合产生显著地、长效肿瘤预防作用。 CpG-ODN，MPLA和P(I：C)在PLG上的呈递会产生90、80和70％的存活率(图19B)。随后进行退行性分析来确定长时间存活率的产生是否与接种位点pDC、CD8(+)和IL-12的水平有关：此实验包括之前公开的使用不同剂量的CpG-ODN所得的数据。令人吃惊的是，动物存活率与pDC、CD8(+)DC的数量和PLG疫苗产生的内源性IL-12有关(图17A-C)。这一发现显示了CD8(+) DC和Th1-促进的细胞因子、IL-12的抗原交叉呈递对疫苗功效的重要性。
治疗性疫苗接种和抗肿瘤T细胞活性
由于包括不同Toll样受体激动剂的具体的疫苗配方产生大量活化的树突状细胞并赋予预防性免疫力，进行研究确定这种疫苗是否产生高级的治疗反应和细胞毒性T反应。用5x 105个 B16-F10黑素瘤细胞攻击小鼠，在肿瘤产生后，在第9天和第19天先后接种疫苗。所有植入参照PLG基质的患有肿瘤的老鼠都显示快速的肿瘤生长并在第24天人道致死，如期望的一样，(图19A、 B)呈递MPLA作为辅剂的PLG基质能够降低肿瘤发展速率(图 19A)，并且与参照相比能稍微增加平均存活时间(大约增加1.5 倍)(图19A和B)。在接种使用P(I：C)和CpG-ODN作为辅剂的 PLG疫苗的小鼠亚组中可以实现完全的肿瘤退化(肿瘤＜36mm2)和长时间的小鼠存活(33％存活)。
使用FACS分析确定被不同疫苗诱导的B16-F10肿瘤渗透性白细胞(TIL)数目。与参照动物相比，在使用装载TLR-激动剂的疫苗治疗的动物体内，每1×106个肿瘤细胞中存在明显更多的 CD8(+)CTL数目(图19C-D)。对CD8(+)T细胞进行进一步定性，确定IFNγ表达和CD107a的表达，CD107a是细胞毒性相关的细胞脱粒标记物。在用疫苗治疗过的动物体内这些细胞群落显著增加(图19C-D)。与参照相比，具有CpGODN，P(I：C)和MPLA 信号特点的疫苗能够使IFNγ(+)，CD107a(+)TIL增加大约6.1， 3.1和1.4倍。而且，与其P(I：C)和MPLA对等物相比，装载CpG 的疫苗能够产生更多数目的活化的TIL(图19D)。
通过用1类MHC/TRP2肽五聚体染色脾细胞，识别对酪氨酸酶 -有关蛋白(TRP)-2具有特异性的CTL，从而监控***性CTL反应的活化作用。在小鼠和人体中，这是黑素瘤疫苗的主要抗原目标。与不含有TLR拮抗剂的参照相比，使用装载有CpG-ODN、 MPLA和P(I：C)的疫苗接种的小鼠的脾内能够观察到显著扩增的TRP2特异性CTL(图19E)。综合在一起，这些数据显示包括不同TLR激动剂的疫苗配方产生显著性的***性抗-黑素瘤CTL，这与特异性树突状细胞亚群的活化和肿瘤负担的减少有关。
在缺少CD8(+)树突状细胞的小鼠中疫苗效力受损
由于整合TLR激动剂的PLG疫苗能够原位产生CD8(+)树突状细胞群落，这与有效的抗肿瘤CTL反应和存活率有关(图17和图19)，因此已经进行了一些研究检测这些细胞是否是赋予体内抗肿瘤免疫力所必须的。在这些实验中使用Batf3-/-转基因小鼠，该小鼠缺少CD8(+)树突状细胞，在其他造血细胞类型或者组织结构上不显示异常(Hildner et al.，2008 Science，322： 1097-1100)。用装载CpG-ODN的PLG疫苗接种野生型小鼠和 Batf3-/-小鼠，14天后用B16-F10细胞攻击。野生型小鼠的接种促进完全的保护作用，遏制肿瘤生长，实现长时间的存活(100％存活率)，这与预期的相同，但是，接种的Batf3-/-小鼠没有任何保护作用，并且其肿瘤生长速率与未治疗的野生型动物相似(图 20A)。而且，接种的Batf3-/-小鼠不能产生在野生型小鼠体内观察到的局部CTL反应，并且TRP2特异性细胞毒性T细胞数降低3 倍，这与此条件下接种位点处较高的FoxP3(+)T调节(Treg) 细胞一致(图20B)。这些结果显示缺失CD8(+)树突状细胞会导致有限的细胞毒性，并且允许被Treg介导的调节途径有效的消除疫苗介导的免疫反应。
野生型小鼠也可以在疫苗接种位点诱导T细胞生长因子 IL-12的产生，产生的量比接种的Batf3-/-小鼠中发现的量高5倍 (图20C)。CD8(+)树突状细胞敲除小鼠中IL-12产量的部分损失说明这些细胞是Th1-极化细胞因子的重要生产因子或者调节银子。CD8(+)T细胞敲除小鼠的接种位点还显示IL-12和IFN-γ的水平降低(图21C和D)。IL-12-IFN-γ路径是一种正反馈机制，其对应每种细胞因子产生的扩增。Batf3-/--小鼠和CD8(+)T细胞敲除小鼠的数据说明，树突状细胞和CTL之间的细胞因子调节的交叉通话能够扩增对正常小鼠接种疫苗时所产生的免疫反应。最终，在Batf3-/-小鼠中，抗肿瘤CTL的***性产生受到影响，与野生型参照相比，在这些小鼠的脾细胞中测定的Trp2特异性CTL 减少3倍(图20D)。这一结果证实，在该***中的疫苗效力主要由CD8树突状细胞调节，所述CD8树突状细胞能够交叉呈递肿瘤抗原，产生Th-1诱导因子，例如，IL-12，从而产生并与CTL相互作用。
为了解决之前癌症疫苗的局限性，使用一种PLG基质，该基质能够控制肿瘤溶解产物、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)和TLR激动剂的呈递从而产生一种疫苗，所述疫苗能够原位募集并活化多重树突状细胞亚群。分析树突状细胞亚群对疫苗效力的贡献，结果显示，有效的肿瘤细胞致死作用需要 CD8(+)树突状细胞的参与，并与pDC和IL-12的密切相关。无论整合入脚手架中的刺激物的类型和剂量是什么，这些成分位于免疫结果是至关重要的。
通常，活化树突状细胞需要包括TLR激动剂，增加其MHCII 和共刺激性分析的表面表达，CD86(图16)显示具有增加的呈递抗原和活化T细胞群落的能力。尤其是，适当的TLR信号能够提高接种位点处CD8(+)和pDC亚群的产生，并刺激IFN的产生和有效的T细胞生长因子(IL-12)的产生。而且，从***中除去 TLR激动剂会降低接种位点处的局部Trp2特异性、细胞毒性CD8 (+)T细胞的数目以及脾和肿瘤中的***性Trp2特异性、细胞毒性CD8(+)T细胞数目，这与疫苗研究中降低的存活率相一致。呈递P(I：C)或者CpG-ODN的PLG疫苗能够诱导B16-F10黑素瘤治疗模型中有效的肿瘤排异，在超过三分之一的接种动物体内造成完全的肿瘤退化，根除直径达到35mm2的肿瘤。分析接种的动物体内的肿瘤位点显示密集的活化CD8(+)、细胞毒性T细胞渗出物可能影响肿瘤细胞致死作用。这些***优于已经在临床中彻底研究过的现有疫苗接种方式的临床前效果，包括放射性肿瘤细胞疫苗和基于树突状细胞的疫苗(Gilboa E，2007 J Clin Invest， 117：1195-1203；Banchereau J.and SteinmanR.M.2007 Nature，49： 419-426；Ali et al.，2009 Sci Transl Med，1：8-19；Rosenberget al.，2004 Nat Med，10：909-915；Klebanoff et al.，2006 Immunol Rev， 211：214-224)。呈递MPLA信号的疫苗还能够减缓肿瘤生长速率，但是不能使肿瘤完全退化。这一现象可以通过以下事实来解释：在促进树突状细胞上细胞表面活化标记物更高的平均水平和促进Th-1极化作用和CTL反应的细胞因子曲线方面，CpG-ODN和P (I：C)信号优于MPLA。另外，与CpG-ODN和P(I：C)相比， MPLA是TNF-α的一种有力的诱导剂，可以抑制IL-12，并且是IFN途径激发的CTL反应的有力诱导剂(Hodge-Dufour et al.，1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13806_13811)。因此，TLR激动剂对存活率的不同的作用与接种位点产生的活化的树突状细胞的数量和亚群以及细胞毒性T细胞活性相一致。TLR激动剂的结合，例如，poly(I：C)和CpG或者聚(I：C)和MPLA，可以产生协同的抗肿瘤效果。
所有不含有CD8(+)DC隔间的接种小鼠(Batf3-/-小鼠)在预防模型中产生肿瘤，而在野生型小鼠中接种，会产生90％的不含肿瘤的存活率。对这些动物接种位点进行细胞因子分析显示，局部IL-12水平和CTL反应显著的减少，说明CD8(+)树突状细胞是一种重要的IL-12和Th-1极化作用来源。没有CD8(+)树突状细胞的参与，疫苗接种不仅获得减少的细胞毒性CD8(+)T细胞活性(在肿瘤位点和脾中)，还使Treg活性进一步发展。较高的FoxP3(+)Treg与CD8(+)T细胞的比例显示不平衡的免疫抑制作用，所述免疫抑制作用能够区分免疫效力并促进肿瘤生长 (Quezada et al.，2006 J.Clin.Invest.，116：1935-1945；Hodi etal.， 2008 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，105：3005-3010)。CD8(+)树突状细胞和IL-12会造成Treg抑制作用或者将其转化为IFNγ产生效应因子T细胞(Wei et al.，2009Immunity，30：155-167；Zhou et al.，2009 Nat Immunol.，10：1000-1007；Oldenhove etal.，2009 Immunity，31：772-786)，并且这些机制对于材料基癌症疫苗的效力是至关重要的。
该***一个有趣的方面是由于长时间的抗原呈递，CTL居住在疫苗位点，并且敲除CD8(+)T细胞会导致局部IFNγ和IL-12 (S3和S4)水平的显著降低。T细胞衍生的IFNγ能够提高IL-12和共刺激分子的树突状细胞表达，产生一种能够扩增CTL-介导的感染反应的反馈环。在此设置下，激发疫苗后，居住在抗原呈递疫苗位点处的T细胞本身是重要的疫苗成分，其可以通过IFNγ-介导的树突状细胞活化和IL-12产生来维持并扩大CTL反应。这些发现证实CD8(+)DCs、pDC和IL-12，或其功能等价物(即，适当的抗原呈递，和Th1极化)能够产生改善的基于材料的癌症疫苗。这里描述的方法和装置能够有效用于其他临床现象，例如感染疾病或者自身免疫疾病。
如上所述，三种不同类型的病原体相关分子模型(PAMP) 被整合入或者整合到结构聚合装置(例如PLG圆盘结构/脚手架) 上，用作疫苗中的辅剂(3种；一种短低聚核苷酸(CpG-ODN)；一种合成的RNA-(聚(I：C)；P(I：C))，一种合成的脂类(单磷酸脂A(MPLA))(图15A-D)。这种疫苗配方募集和原位活化树突状细胞，对此过程进行定量评价(图16A-D)。
在侵略性黑素瘤癌症模型中，依赖于疫苗的存活率与该疫苗特异性活化2种树突状细胞(CD8(+)树突状细胞和浆样树突状细胞)的能力密切相关，无论该疫苗***中使用了那些辅剂(图 17A-C)。在PLG疫苗中利用4种不同的疫苗辅剂能够证明这种相关性。在黑素瘤治疗模型中，这些疫苗通过活化在疫苗接种位点或者肿瘤上检测到的特异性T细胞反应诱导有效的肿瘤排斥(图 18A-D和图19A-D)。这些发现说明，PLG疫苗在整合不同类型激动剂方面的多样性，所述激动剂能够刺激不同途径的天然和适应性免疫反应(图15A-D)。
识别对抗肿瘤免疫反应至关重要的树突状细胞亚群。树突状细胞的亚群包括髓树突状细胞(mDC)、浆样树突状细胞和CD8 (+)树突状细胞。mDC与单核细胞最为相似。mDC由至少两个亚群组成：(1)更常见的mDC-1，这是一种T细胞主要刺激因子；和(2)非常稀少的mDC-2，其具有抵抗伤口感染的功效。mDC 分泌IL-12，并且其特点在于TLR2和TLR4。浆样树突状细胞看上去像浆细胞，但是浆样树突状细胞具有与髓树突状细胞相似的一些特点，能够产生大量的干扰素-α，并且其特点在于TLR7和 TLR9。TLR激动剂(CpG)结合TLR9。小鼠体内的CD8+树突状细胞与CD141+树突状细胞相等。
CD141+树突状细胞可以被发现在人***、骨髓、扁条体和血液中。当与通常研究较多的CD1c+树突状细胞亚群相比时， CD141+树突状细胞的特点在于能够高表达toll-样受体3(TLR3)、产生IL-12p70和IFN-β，并且具有更好的能力诱导T辅助因子1细胞反应。与聚肌苷胞苷酸(聚I：C)-活化的CD1+树突状细胞相比，聚肌苷胞苷酸(聚I：C)-活化的CD141+树突状细胞具有更好的交叉呈递抗原到CD8+细胞毒性T淋巴细胞上的能力。因此，CD141+树突状细胞代表一种重要的功能性不同的人类树突状细胞亚类型，其特点与鼠CD8α+树突状细胞亚群相类似。 CD141+树突状细胞在诱导细胞毒性T淋巴细胞反应方面发挥重要作用，并且，他们的活化对于癌症疫苗、病毒疫苗和其他病原体疫苗接种是非常重要的。
CD141+树突状细胞和浆样树突状细胞对于成功的癌症疫苗接种(预防性和治疗性)是至关重要的。这里描述的结果证实，疫苗装置中的p(I：C)能够刺激人体中CD141+树突状细胞(老鼠体内CD8+树突状细胞)，CpG刺激浆样树突状细胞。具有一个或者两个这些toll样受体激动剂的装置能够产生有效的树突状细胞活化作用，并产生显著的预防性和治疗性抗肿瘤免疫反应。装置中不同的toll样受体激动剂的结合，例如，p(I：C)和CpG 的结合，在活化针对肿瘤的树突状细胞免疫反应方面能够实现协同效果。在目前的临床研究中，CD141+树突状细胞和浆样树突状细胞没有明确被使用或者被研究。使用本实验中获得的数据设计癌症疫苗***并且提供从老鼠到人类的更为有效的免疫反应数据翻译。
P(I：C)+CpG ODN在肿瘤抑制作用中的协同作用
图22显示了疫苗试验的结果，其中，将P(I：C)和CpG-ODN 的结合与单独使用CpG-ODN或者P(I：C)对比检测。如图22中所示的结果，toll样受体激动剂P(I：C)和CpG-ODN结合的表现优于单独整合P(I：C)或者CpG-ODN的疫苗。具体的说，整合P(I：C) 和CpG-ODN的PLG疫苗发挥协同作用，产生显著的肿瘤抑制效果，降低了肿瘤负荷，并且产生改善的抗-肿瘤免疫反应。
图22显示了用空白基质[Blank]治疗的患有黑素瘤肿瘤的小鼠、和用单独装载有P(I：C)或者CpG-ODN的基质治疗的患有黑素瘤肿瘤的小鼠、或者用装载P(I：C)和CpG-ODN结合[CpG-ODN +P(I：C)](n＝8)治疗的患有黑素瘤肿瘤的小鼠的全面存活率。用5x105个B16-F10细胞攻击小鼠并在三天后用PLG疫苗接种。在所有疫苗中Toll样受体激动剂的总剂量大约是100微克。
实施例8：炎症性细胞因子从聚合物基质中的呈递差异化的原位产生并活化树突 状细胞
在感染过程中，炎症性细胞因子移动并活化树突状细胞 (DC)，这对于有效的T细胞激发和清楚感染的免疫反应是必不可少的。这里描述的是，设计一种大孔聚(丙交酯-共-乙交酯) (PLG)基质，这种基质能够释放炎症性细胞因子GM-CSF、 Flt3L和CCL20，从而模拟感染诱导的树突状细胞募集。通过诱导特异性的抗肿瘤T细胞反应来检测这些感染模拟物起到癌症抗原作用的能力。如下面详细描述的，在治疗性B16-F10黑素瘤模型中，所有被检测的疫苗***能够产生特异性抗肿瘤T细胞反应和长期的存活率。但是，GM-CSF和Flt3L疫苗也能产生相似的存活率，并且比装载CCL20的脚手架更好，即使他们对树突状细胞募集和产生具有不同的作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)信号被认为是常规树突状细胞最有效的趋化因子，并且，显著的提高MHC(II)和CD86(+)的表面表达，其中MHC (II)和CD86(+)用于激发T细胞免疫力。相反，Flt3L疫苗导致更多的浆样树突状细胞(pDCs)，这与增加的T细胞激发的细胞因子的水平有关，所述细胞因子扩大T细胞反应。这些结果说明，被修饰以呈递炎症性细胞因子的3D聚合物基质被用于有效的体内移动并活化不同的树突状细胞亚群，用于免疫治疗。
下面提供了人Flt3示例性的氨基酸序列(Genbank编目号： P49771.1(GI：1706818)，通过引用在此全部并入本文；SEQ ID NO： 12)：
下面提供了人CCL20示例性的氨基酸序列(Genbank编目号： AAH20698.1(GI：18088857)，通过引用在此全部并入本文；SEQ ID NO：11)：
材料&方法
小鼠
在实施例8中描述的实验使用C57BL/6老鼠(6-8-周大的雌鼠，Jackson实验室)
初始细胞(树突状细胞)的分离和培养
从C57BL/6小鼠的股骨上冲下初始骨髓-衍生的树突状细胞(BMDC)，然后在100-mm细菌皮氏培养皿(Falcon号1029/Becton Dickinson公司)中培养。细胞培养基RPMI-1640(R10)(Sigma 公司)中补充有1％的青霉素-链霉素(Invitrogen公司)、2mM的 1-谷氨酰胺(Invitrogen公司)、50微摩2-巯基乙醇(Sigma公司) 和10％的热-失活胎牛血清(FBS，Invitrogen公司)。
在第0天，接种骨髓白细胞，每100-mm平皿接种在10毫升包含20ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Peprotech 公司)的R10培养基中的2×106个细胞。在第3天，向平皿中加入另外10毫升包含20ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的R10培养基。在第6和第8天，各收集一半的培养基上清液然后离心，将所得细胞丸重新悬浮在10毫升包含 20ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的新鲜R10培养基中，重新放回原平板。在所有实验中使用第8-12天之间的培养基上清液中的非粘着细胞群。
趋化因子和化学激活作用的Transwell迁移研究
通过将骨髓衍生的树突状细胞画在孔径为5微米，6.5毫米的 transwell盘子(Costar公司，剑桥，麻省)的顶端小孔中，进行 Transwell迁移实验。通过将500纳克/毫升的重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FL或者CCL20(Peprotech公司， RockyHill，新泽西)防止在底部小孔中，将3x105个树突状细胞 (DC)防止在顶部小孔中来评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FL(Flt3)和CCL20对BMDCs迁移的趋化性作用。对于化学激活作用研究，在各个隔间中的细胞因子浓度是相等的，都是500纳克/毫升，并且向顶部小孔中放入3x105个树突状细胞(DC)。12小时之后，对通过多孔膜从顶部小孔迁移入到下部小孔中的细胞计数来定量迁移作用。用0.25％胰蛋白酶-0.03％乙二胺四乙酸(EDTA，Invitrogen公司)处理，收集迁移到下部小孔中的细胞，并使用Z2库尔特计数器(BeckmanCoulter公司)计数。
基质制备
在气体发泡过程中使用85∶15，120kD的D，L-丙交酯和乙交酯共聚物(PLG)(Alkermes公司，剑桥，麻省)形成多孔PLG基质。首先使用标准双乳液方法制备封装有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FLt3L或者CCL20的PLG微球体，整合大约170 纳克/毫克的蛋白质PLG微球体。然后将PLG微球体和150毫克的制孔剂、蔗糖(过筛，使其颗粒大小在250微米和425微米之间) 相混合，然后压膜。所得的圆盘在高压的二氧化碳环境中被平衡，然后快速降压，使颗粒展开，并融合成相互连接的结构。通过在水中浸泡使蔗糖从脚手架中浸出，产生90％多孔的脚手架。
为了将肿瘤溶解产物整合入PLG脚手架中，将已经在 C57BL/6J小鼠背部皮下生长过的B16-F10肿瘤活组织切片(杰克逊实验室，Bar Harbor，缅因州)消化在胶原酶中(250U/毫升) (Worthington公司，Lakewood，新泽西)，并在用40微米过滤器过滤后，将细胞悬浮使细胞浓度为107个细胞/毫升。在液氮中快速冷冻肿瘤细胞悬浮液4个循环，解冻(37℃)并在400转/分的离心机中离心10分钟。收集包含肿瘤溶解产物的上清液(1毫升) 然后与PLG微球体一起培养并冷冻干燥，使用所得混合物制备基于PLG脚手架的癌症疫苗。
为了将CpG-ODN整合入PLG脚手架中，首先将CpG-ODN 1826，5′-tcc atg acg ttcctg acg tt-3′，(SEQ ID NO：10；Invivogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)与聚(氮丙啶)(PEI，分子量大约为60,000，Sigma Aldrich公司)分子一起浓缩(将CpG-ODN 1826 滴入PEI溶液中)，同时旋涡式震荡混合物。在冷凝过程中，聚(氮丙啶)(PEI)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) (NH3+：PO4-)之间的比值维持在7。然后将浓缩溶液与60微升 50％(重量/体积)蔗糖溶液一起涡流，冷冻干燥，然后与干燥的蔗糖混合，使最终重量为150毫克。然后将包括聚(氮丙啶)(PEI) -胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的蔗糖与空白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或装载PLG微球体的肿瘤溶解产物一起混合，制备PLG癌症疫苗。
树突状细胞(DC)和T细胞的原位识别
向7-到9-周大的雄性C57BL/6J小鼠的皮下口袋中植入装载粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质，该基质包含大约3微克的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L、或者CCL20与100微克胞嘧啶- 鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的结合。为了通过FACS研究分析树突状细胞的募集，切割脚手架并用胶原酶溶液(Worthingtion 公司，250U/毫升)将其中生长的组织消化进入单细胞悬浮液中，并在37摄氏度下搅拌45分钟。然后将细胞悬浮液倒入40 微米的细胞过滤器中，从脚手架颗粒中分离细胞，并将细胞压成丸并用冷PBS洗涤，用库尔特计数器(Beckman Coulter公司) 计数。为了评价树突状细胞的渗入和活化，用与荧光标记物共轭的初级抗体(BD Pharmingen公司，圣地亚哥，加利福尼亚州) 对从聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中分离的总细胞群落亚群染色，然后进行流式细胞计分析。对APC-共轭的CD11c(树突状细胞标记物)、FITC-共轭的MHCII和PE-共轭的CD86(B7，共刺激分子)染色用于进行树突状细胞(DC)募集和活性分析。为了进一步描述浆样树突状细胞(DC)亚群的存在，用APC-共轭CD11c和PE共轭的PDCA-1(浆样树突状细胞(DC)标记物)、染色细胞。根据单阳性FITC、APC和PE染色分类细胞并使用同型体参照。记录各个表面抗原细胞染色阳性百分比。
为了在脚手架的石蜡切片中免疫染色树突状细胞渗出物，制备样品并按照标准步骤再水合。在高压锅中，使用柠檬酸缓冲液进行抗原回收(10mM柠檬酸钠、0.05％吐温20，pH6.0，在95℃下进行5分钟)。在用PBST缓冲液(0.01％吐温20)中进行快速洗涤之后，在室温条件下，用含有5％羊血清的染色缓冲液(5％BSA、在PBST中2％的胎牛血清、pH7.4)封闭样品1小时。
用染色缓冲液稀释抗-CD11c亚美尼亚仓鼠IgG(20毫克/毫升，Abcam公司，剑桥，马萨诸塞州)并在40℃下在加湿室中结合过夜。在用PBST洗涤三次之后，用染色缓冲液稀释594 羊抗鼠(5毫克/毫升，生命技术公司，格兰岛，纽约)二级IgG 并在室温下应用1小时。在用PBS洗涤三次后，空气干燥，然后用延长的黄金抗热衰退试剂固定，用DAPI进行核酸染色(生命技术公司，格兰岛，纽约)。共聚焦tile扫描通过捆绑软件的蔡司LSM710激光扫描显微镜(蔡司，索恩伍德，纽约州)获得并处理。
肿瘤生长试验、保护性细胞因子，和TRP2五聚物分析
包括B16-F10黑素瘤肿瘤溶解产物、100微克胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)与3微克粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、Flt3L或者CCL20的结合的聚-丙交酯-共-乙交酯 (PLG)脚手架被用作癌症疫苗皮下植入C57BL/6J小鼠的左下侧。为了评价聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗在治疗组中的效果，通过在后颈部皮下注射5x105个B16-F10黑素瘤细胞(ATCC，马纳萨斯，新泽西)攻击C57BL/6J小鼠，在肿瘤攻击3天后，在左下侧皮下植入PLG疫苗。监视动物体内是否开始生长肿瘤(大约1立方毫米)，当肿瘤长到20-25毫米(最长直径)时，人道致死。
为了确定基质植入位点处的IL-12p70和IFN-γ的体内浓度，在移植10天后切出邻近的组织并用组织蛋白提取试剂消化(Pierce 公司)。离心之后，按照厂家的使用说明书，利用酶联免疫吸附测定(R&D systems公司)分析上清液中IL-12和IFN-γ的浓度。为了确定TRP-2-特异性细胞毒性T细胞的产生，在第10天从用PLG 疫苗免疫的小鼠的脾中制备单细胞悬浮液。首先用 PE-H-2Kb/TRP2五聚物(Sigma Aldrich公司)染色这些细胞，随后用FITC-抗-CD8和PE-CY7 CD3单克隆抗体(单克隆抗体(BD Pharmingen公司，圣地亚哥))染色，然后用流式细胞仪分析。
树突状细胞在免疫反应中的作用
树突状细胞通过激发并传播特异性、细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)反应来合理的安排针对感染或者肿瘤的免疫反应。居住在外周组织中的不成熟的树突状细胞检测对侵入性病原体独特的外源物质(即，抗原)，并被刺激物(例如病原体相关的分子模型(PAMP)或者凋亡细胞产生(即，“危险信号”))活化，所述刺激物是在病原体诱导的炎症性反应过程中产生的。成熟的树突状细胞处理并在主要组织相容性复合物(MHC)受体上呈递抗原，并且表达共刺激分子CD80和CD86，这两种共刺激分子是效应子T细胞刺激作用所必须的。“危险信号传导”刺激的树突状细胞成熟的另一个重要结果是树突状细胞获得居住在***处的能力，从而吸引并活化天然T细胞，使T细胞识别抗原的树突状细胞被呈递。
特定树突状细胞(DC)引发和控制免疫反应的能力来源于其组织内定位能力及其专门的移动能力。树突状细胞(DC)来自骨髓中的多功能干细胞，进入血液流并定位于基本上所有的器官中。根据一系列表面标记物的相对表达，在外周血液中可以识别出不同亚群的树突状细胞或者树突状细胞前体，包括浆样树突状细胞(pDCs)和传统的树突状细胞(cDCs)。pDC是主要的1类干扰素(IFN)生产者，并且专门活化适应性免疫反应，所述适应性免疫反应是针对通过细胞因子信号传导引发的病毒攻击的。 CD11c(+)cDC，例如表皮树突状细胞(DC)，尤其适用于抗原呈递和共刺激T细胞。
随着微生物的入侵和感染，树突状细胞快速迁移进入***和原始感染位点，其数量源源超过其他APC，例如巨噬细胞。在稳定状态下，使用细胞因子Fms-有关的酪氨酸激酶3配体，配体 (FL)控制最多树突状细胞(DC)亚群的产生，包括(pDCs)。损伤或者感染细胞释放的其他细胞因子，比如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和CCL20，在发炎位点主动募集并定位cDC。在炎症性模型中，无论是体内还是体外，这些炎症性细胞因子以及显示出能够增加树突状细胞的迁移和增殖作用，并且可以调节树突状细胞(DC)的活化状态。在感染期间活化的树突状细胞(DC)的数量或者在肿瘤内活化的树突状细胞(DC) 的数量与随后免疫反应的强度和疾病预后有关。
为了产生足够数量的树突状细胞(DC)进行免疫治疗，通常使用树突状细胞(DC)前体和炎症性细胞因子的基于实验室的培养物，所述炎症性细胞因子例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FL(Flt3)。体外修饰用于呈递肿瘤抗原的树突状细胞(DC)能够随着移植，在小鼠模型中激发抗癌作用。体外基于树突状细胞(DC)的疫苗的临床试验证明能够在癌症病人亚群中诱导肿瘤退化，但是几乎没有改善存活率。涉及树突状细胞体外操作的方案通过产生的树突状细胞的数量和种类、不好的移植功效和LN定位以及注射入体内环境之后树突状细胞 (DC)活化作用的损失而被限制。
为了解决这些显示，开发一种感染模拟材料，使炎症性细胞因子与一种危险信号一起呈递，从而体内募集并活化树突状细胞 (DC)。如下所述，检测当从大孔可移植性聚合物脚手架中释放出来后，多个炎症性细胞因子(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、FL(Flt3)和CCL20)募集并活化树突状细胞(DC) 的能力。同样，包括富集胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 序列的纳米颗粒被固定在脚手架上，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被表示为细菌DNA，并且是有效的危险信号，可以刺激基质中居住的树突状细胞(DC)的活化。最后，检验这些***激发抗肿瘤T细胞反应的能力和通过呈递癌症抗原赋与肿瘤保护作用的能力。
细胞因子的体外趋化作用和化学激活作用
进行体外transwell研究来调查骨髓衍生的树突状细胞(DC) 相应于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FL和CCL20 的趋化作用和化学激活作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)梯度促进重要的树突状细胞(DC)趋化作用，在这种情况下迁移的树突状细胞比参照情况多大约50％(图23A)。对化学激活作用可以观察到相似的作用，相似的，与同质水平的细胞因子相比，GM-CSF的接触能促进迁移的树突状细胞的数量增加50％(图23B)。相反，在这些实验中，FL和CCL20对树突状细胞(DC)的趋化作用或者化学激活作用没有效果。这些结果证明与FL和CCL20相比，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)对树突状细胞(DC)的迁移和募集具有更好的效果。
细胞因子的控制释放和体内树突状细胞(DC)募集
涉及大孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质用于提供粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FL和CCL20长时间的持续释放(图23A)，并收容树突状细胞(DC)用于活化。这些PLG 脚手架是80-90％多孔的，其平均孔径在125-200微米之间，用于促进树突状细胞的渗入。这三种细胞因子的体外释放动力学是相似的，在头五天，基质快速释放蛋白质脉冲，随后在几乎几周的时间内持续释放(图24A)。在第4天，脚手架分别释放43％、36％和26％的整合的GM-CSF、FL和CCL20，随后，在接近23天的时间内，每天大约释放0.9％的蛋白质(图24A)。
为了检验装载炎症性细胞因子的PLG基质募集并体内活化树突状细胞的能力，将能够传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、FL和CCL20的PLG基质皮下植入C57BL/6J小鼠的背部，在移植7天之后除去。免疫组织化学研究显示，在所有的脚手架释放的细胞因子中均有强烈的CD11c(+)树突状细胞 (DC)渗入物穿透多孔网络，并且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)调节最密集的树突状细胞(DC)群(图24B)。7 天后通过对从聚合材料中分离的细胞群体进行FACS分析来定量树突状细胞(DC)渗入和活化进入基质的幅度。空白PLG基质募集大约190,000个CD11c(+)树突状细胞(DC)，而传递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的脚手架募集大约960,000 个树突状细胞(DC)，在细胞募集方面的差异超过5倍(图24C)。呈递FL和CCL20的脚手架募集的树突状细胞与参照相比多2.5 倍，但是显著的小于呈递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)的脚手架(图24C)。这些结果与体外结果相一致，体外结果也确定与FL和CCL20相比，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是最有效的树突状细胞(DC)迁移和趋化因子试剂。
树突状细胞(DC)的体内活化
修饰PLG脚手架来呈递纳米颗粒，所述纳米颗粒包括Toll 样受体(TLR)活化的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN) 作为一种感染模拟危险信号，与炎症性细胞因子一起传递。与缺乏细胞因子信号传导的参照情况相比，这显著的增加了树突状细胞的原位活化(图25A)。对居住在基质上的树突状细胞(DC) 的活化状态进行研究，结果显示粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)诱导的募集作用产生显著百分比的活化树突状细胞(DC)，在脚手架募集的总树突状细胞中，大约54-66％是MHCII(+)和CD86(+) 树突状细胞(DC)。与缺少细胞因子的参照基质相比，含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的情况下，在植入位点能发现活化的树突状细胞(DC)的总数增加大约8-倍、4倍和4 倍(图25B)
FL与CpG-ODN的共同呈递使PLG基质富集最高平均数目的CD11c(+)PDCA-1(+)pDCs(图25C)，产生超过160,000 个居住的pDCs。令人吃惊的是，在这些脚手架上居住的大约22％的细胞由这种树突状细胞(DC)亚群组成(图25A)。这说明FL 是一种有效的pDC迁移试剂。呈递粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和CCL20的脚手架还可以显著增加pDC的产生，使居住的pDCs达到大约110,000个。pDC亚群通过其诱导IL-12 和1型干扰素(IFN)的能力，与t辅助因子1(Th1)免疫性的诱导相关，这对于传播针对感染和肿瘤的CTL反应是至关重要的。这些数据显示，尽管这三种被检测的细胞因子都能增加树突状细胞的募集和活化，但是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的结合产生最大量的活化cDC，而FL产生最大量的居住的pDC。
T细胞免疫性的诱导和治疗性疫苗接种
将B16-F10肿瘤溶解产物整合入PLG基质中作为肿瘤抗原。活化的树突状细胞(DC)分泌的IL-12和IFN-γ可以激发CTL-介导的免疫反应和肿瘤细胞死亡。因此，定量脚手架植入位点存在的 Th-1诱导物的量。与参照脚手架相比，共同呈递FL和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的PLG疫苗能够使IL-12和IFN-g的局部浓度分别增加8倍和13倍(图26A和26B)。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的释放使IL-12和IFN-g的局部浓度分别增加大约3倍和6倍(图26A和26B)。PLG基质中释放的CCL20 使IL-12浓度增加2倍，对IFN-gIFN-g的浓度(在疫苗接种位点) 则没有影响(图26A和26B)。
通过用1类MHC/TRP2肽五聚体染色分离的脾细胞来监视***性CTL反应的活化作用。这可以识别对酪氨酸酶-有关蛋白 (TRP)-2具有特异性的CTL。在小鼠和人体中，酪氨酸酶-有关蛋白(TRP)-2是黑素瘤疫苗的主要抗原目标。使用整合全部三种细胞因子的脚手架接种的小鼠的脾，能够观察到显著扩增的 TRP2特异性CTL(图26C)。与参照疫苗相比，整合FL和粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的疫苗能够使TRP2特异性CTL的数目增加大约5倍和4倍，这些数据显示与包括CCL20的疫苗相比，这些疫苗具有显著增加的作用。综合在一起，这些数据显示包括不同炎症性试剂的疫苗配方产生显著性的***性抗-黑素瘤CTL和局部Th1细胞因子的产生。
然后在缺乏免疫原性的B16-F10黑素瘤模型中检测这些疫苗的抗肿瘤效力。用105个肿瘤细胞攻击C57BL/6J小鼠，然后在三天后接种PLG疫苗。由于疾病的发展，使用参照脚手架治疗的动物在30天后需要人道致死。装载细胞因子的PLG疫苗在大部分动物亚群中可以诱导长期的肿瘤保护作用(图26D)。从PLG疫苗中呈递GM-CSF、FL和CCL20会产生88％、75％和62％的长时间存活率(图26D)。
树突状细胞(DC)和树突状细胞(DC)前体受控制的移动和活化对于体外开发基于树突状细胞的疫苗是非常重要的，并且对于设计能够体内活化免疫***的材料通常也是非常重要的。如这里所述，模拟微生物感染关键方面的聚合物能够有效的募集树突状细胞(DC)用于癌症疫苗接种。工程设计PLG脚手架从而释放GM-CSF、FL和CCL20，这能使居住的树突状细胞的数量显著增加，并且，与危险信号一起共呈递能够导致树突状细胞的成熟。即使所有的疫苗配方都能够在B16-F10黑素瘤治疗模型中诱导肿瘤保护作用，与CCL20相比，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)和FL疫苗能够产生更多的抗原特异性CTL，较高水平的Th1激发的细胞因子和更高的存活率(图26D)。
尽管释放GM和FL的PLG疫苗产生统计学上相似的T细胞和抗肿瘤反应，但是他们对于树突状细胞的募集和活化具有不同的作用。体外实现显示，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 是cDC最有效的趋化因子(图23)。该发现与释放GM-CSF的基质比FL脚手架募集显著多的树突状细胞(DC)(～106，在体外基于DC的方案中)的能力和活化树突状细胞的能力相一致(图 24-25)。相反，根据其他报道，当与CpG-ODN危险信号相结合时， FL疫苗产生更多的居住于基质中的pDC。pDCs是一种重要的Th1 激发的细胞因子的来源，所述Th1激发的细胞因子能够放大CTL 反应，并且，增加的pDC数目可以促进IL-12和IFN-g在疫苗接种位点的局部产生。如这里所述，GM和FL在材料***中结合，开发GM-CSF介导的cDC活化和FL介导的pDC的产生。这回产生更高级的树突状细胞(DC)网，用于癌症疫苗接种和免疫治疗。
这里的结果显示，pDC及其cDC对应物被靶向从而开发其调节抗肿瘤T细胞反应的能力。与纳米颗粒靶向***相反，这里描述的聚合物***不但能够作为一种抗原传递装置募集并活化树突状细胞(DC)，还可以作为一种物理结构，在此结构中，树突状细胞短时间居住于此同时被活化。
这里描述的***显示重要的抗肿瘤活性。除了所述聚合物 (例如，这里描述的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG))之外，基质可选的由其他更多的炎症性聚合物制备，从而促进免疫反应和树突状细胞的迁移。随后T细胞激发的另一个重要方面是LN复位。通过将不同的助剂整合到材料中活化迁移功能来最优化与抗原接触后树突状细胞的离去或者分散。做为选择，改变其他基质性质(包括降解动力学和多孔性)来促进对树突状细胞运输的进一步控制。
总之，这些发现证明，在生物材料***中使用FL、CCL20和 GM-CSF模拟感染诱导树突状细胞(DC)的原位募集。如这里所述，模拟感染的多孔装置可有效用作治疗性癌症疫苗。
其他实施方案
尽管本发明已经结合具体实施方式进行了描述，但之前的描述只起到解释作用并不能限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书定义。其他的方面、优势和修饰也被包括在所附权利要求书记载的范围内。
这里所涉及的所有专利和科技文献构成了本领域普通技术人员能够获得的知识。这里引用的所有美国专利和公开的或者未公开的美国专利申请通过引证在此并入本文。这里引用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。 GENBANK和NCBI指明的登记号码也通过引证在此并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此并入本文。
尽管本发明已经参照其优选的实施方案进行了具体的显示和表述，但是本领域普通技术人员应该理解，在不脱离本发明范围的情况下，在形式和细节上可以存在各种各样的变化，本发明的范围由所附的权利要求书概括。

Claims (27)

1.一种装置，该装置包括一种多孔聚合结构组合物，一种疾病相关抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂，其中，所述TLR激动剂优先结合TLR3。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述疾病相关抗原包括肿瘤抗原。
3.根据权利要求1所述的装置，其中，所述聚合结构组合物包括聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)。
4.根据权利要求1所述的装置，其中，所述TLR激动剂包括TLR3激动剂。
5.根据权利要求1所述的装置，其中，所述TLR3激动剂包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚I：C)或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I：C)。
6.根据权利要求1所述的装置，其中，所述TLR激动剂进一步包括病原体相关的分子类型(PAMPs)。
7.根据权利要求1所述的装置，其中，所述TLR激动剂包括一种核酸。
8.根据权利要求1所述的装置，其中，所述TLR激动剂进一步包括一种TLR9激动剂。
9.根据权利要求8所述的装置，其中，所述TLR9激动剂包括一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者一种聚(氮丙啶)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(PEI-CpG-ODN)。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置进一步包括一种募集组合物。
11.根据权利要求11所述的装置，其中，所述募集组合物包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L或者CCL20。
12.根据权利要求10所述的装置，其中所述募集组合物包括封装的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
13.根据权利要求2所述的装置，其中，所述肿瘤抗原包括一种肿瘤溶解产物、纯化的蛋白肿瘤抗原，或者合成的肿瘤抗原。
14.根据权利要求6所述的装置，其中，所述病原体相关的分子类型(PAMPs)包括一种单磷酸脂A(MPLA)。
15.根据权利要求1所述的装置，其中，所述装置包括TLR激动剂的结合，所述结合包括TLR3激动剂和TLR9激动剂。
16.根据权利要求15所述的装置，其中，所述TLR3激动剂包括聚(I：C)，并且TLR9激动剂包括胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
17.根据权利要求1所述的装置，其中，所述装置包括TLR激动剂的结合，所述结合包括TLR3激动剂和TLR4激动剂。
18.根据权利要求17所述的装置，其中，所述TLR3激动剂包括聚(I：C)，并且所述TLR4激动剂包括MPLA。
19.根据权利要求1所述的装置，其中，所述TLR3激动剂以优选刺激CD8+树突状细胞或者CD141+树突状细胞的量存在。
20.一种装置，所述装置包括一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和Toll样受体(TLR)激动剂的结合，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂选自由Toll样受体(TLR)1、Toll样受体(TLR)2、Toll样受体(TLR)3、Toll样受体(TLR)4、Toll样受体(TLR)5、Toll样受体(TLR)6、Toll样受体(TLR)7、Toll样受体(TLR)8、Toll样受体(TLR)9、Toll样受体(TLR)10、Toll样受体(TLR)11、Toll样受体(TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。
21.一种引发抗肿瘤免疫反应的方法，包括将一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和TLR激动剂与主体相接触或者植入主体内，其中，所述TLR激动剂优先结合TLR3。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述TLR激动剂包括TLR3激动剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述TLR激动剂包括TLR3激动剂和TLR9激动剂。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，所述抗肿瘤免疫反应包括CD8+树突状细胞或者CD141+树突状细胞的活化。
25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述抗肿瘤免疫反应包括浆样树突状细胞或者CD141+树突状细胞的活化。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗肿瘤免疫反应包括肿瘤装载的减少。
27.根据权利要求21所述的方法，其中，所述TLR激动剂以有效诱导树突状细胞产生白介素-12(IL-12)的浓度存在。
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