KR20210035776A - 주사가능한 기성품 연골, 힘줄 및 인대 복구 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

주사가능한 기성품 연골, 힘줄 및 인대 복구 조성물 및 사용 방법 Download PDF

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KR20210035776A
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cells
bmp
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사린드르 부미라타나
테리-안 켈리
에릭 미드 제프리스
올리비아 스펜서 빈
안젤라 하이 황
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에피본, 인크.
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Abstract

응축된 중간엽 세포체 및 히드로겔을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 약물 또는 성장 인자를 추가로 포함할 수 있다. 응축된 중간엽 세포체는 결합 조직 세포, 또는 심지어 결합 조직 세포외 매트릭스, 예컨대 콜라겐 및 글리코사미노글리칸을 생성할 수 있는 전구 세포를 포함할 수 있다. 결합 조직 결함, 연골 손상 및 연골 분해를 치료하는 방법이 또한 제공된다.

Description

주사가능한 기성품 연골, 힘줄 및 인대 복구 조성물 및 사용 방법
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 2018년 3월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/639,322를 우선권 주장하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연골 손상은 매년 대략 1백만 명의 미국인에게 영향을 미치며, 500,000건 초과의 연골-관련 시술을 초래한다 [1]. 현재 연골 손상을 치료하는 방법은 데브리망 및 미세골절 [2], 골수 자극, 자가 연골세포 이식 (ACI) [3], 매트릭스-유도 자가 연골세포 이식 (MACI) [4], 모자이크 성형술 [5], 골연골 자가이식 및 골연골 동종이식 [6-8]을 포함한다. 매년 적어도 350,000 건의 무릎 관절성형술이 시행되며, 사례의 >60%에서 연골 병변이 존재한다 [9]. 이러한 시술 횟수는 인구 성장, 장수 및 진단 도구의 발전으로 인해 증가할 것으로 예측된다.
연골 병변은 흔히 다른 관절 손상과 연관이 있으며, 관절 퇴행 및 골관절염 (OA)으로 진행될 수 있다 [10]. OA는 미국인의 약 20%에 영향을 미치며, OA를 갖는 사람들의 10%는 활동 제한이 있다. OA로부터의 연간 비용은 1,300억 달러를 초과하는 것으로 추정된다. 세계 보건 기구는 무병 생애 및 장애에 대한 영향 측면에서, OA를 네번째 상태로 평가하였지만, 미국 질병통제예방센터는 관절염이 미국에서 장애의 첫번째 원인이라고 결정하였다 [11]. 골관절염은 심지어 외상후 골관절염 (PTOA)으로서 젊은 사람들에게도 영향을 미친다 [12]. PTOA는 엉덩이 및 무릎의 증상성 관절염의 12%를 유발하는 것으로 추정되며, 연관 비용은 연간 30억 달러 초과이다. PTOA 및 다른 흔한 연골 손상은 특히 현역 군인 인구에 영향을 미치며, 이는 민간인에 비해 모든 흔한 연골 손상의 발생률의 약 10배이다. 한 예로서, ACL 및 반월연골 손상은 각각 매년 군인 1000명 중 3.65명 및 ~6.5명에게 영향을 미친다. 민간인의 해당 비율은 1000명 중 ~0.34명 및 ~0.45명이다 [13]. 군인 인구 및 젊은 사람들에서 PTOA 및 연골 손상을 치료할 필요가 크다.
골연골 결함을 치료하는 가장 흔한 시술은 미세골절, 모자이크 성형술, 동종이식편 또는 자가이식편 골연골 그라프팅, ACI이며, 좀 더 최근에는 MACI이다. 모든 기술은 크기 제한, 환자의 나이 및 둘러싸는 연골의 품질에 영향을 받는 여러 단점을 갖는다. 단점은 감소된 생체역학적 특성, 긴 회복, 이중 수술 및 공여자 조직에 대한 필요성을 포함한다. 성공률은 낮은 경향이 있으며, 수술후 1-5년에 실패할 위험이 높다.
연골 손상을 치료하기 위해 자가이식편 및 동종이식편 이식이 사용되어 왔다. 자가이식편은 직경이 최대 3 cm인 병변에서 효과적인 것으로 나타났으며, 심지어 운동선수들 사이에서도 양호한 내지 우수한(good-to-excellent) 결과가 보고되었다 [14]. 동종이식편 골연골 이식은 이전에 전투 군인들에서 사용되어, 이들이 군사적 위치로 돌아갈 수 있도록 하였다 [15]. 그러나, 동종이식편 골연골 이식은 민간인에 비해 현역 군인 인구에서 덜 성공적인 것으로 입증되었다. 후향적 검토는 현역 인구에서 무릎에서의 동종이식편 골연골 이식의 효과를 분석하였으며, 환자들이 시술 후 그들의 지위로 돌아갈 수 있는 능력에 초점을 맞추었다 [16]. 무릎의 큰 병변을 위한 이러한 수술 방법은 민간인 환자들 사이에서 우수한 성공률을 갖지만, 부상당한 군인들이 특히 육체적으로 힘든 군사적 위치를 맡을 때 현역 근무를 유지하는 것을 보장하는데 실패하였다. 동종이식편 골연골 이식에 의해 치료된 많은 환자들은 이전 역할에서 현역 근무를 유지할 수 없었다. 군대에서 달리 대안적인 옵션이 거의 없는 군대 내의 군인을 위한 개선된 이식 요법에 대한 필요성이 있다. 또한, 동등하게 신체적으로 활동적인 라이프스타일을 선도하는 사람들, 예컨대 프로 및 아마추어 운동선수, 소방관 및 경찰관을 위한 개선된 이식 요법에 대한 필요성이 있다.
이식을 위한 연골을 제조하는데 여전히 개선이 필요하다. 오랜 기간 동안, 연골은 강한 임상적 요구, 이 조직의 무혈관 성질 및 낮은 세포 밀도 모두로 인해 조직 공학 분야의 주요 초점이었다. 연골 조직 공학은 주로 천연 연골로부터 추출된 일차 연골세포를 활용하여 진행되었다. 이들 고도로 활성이지만 표현형적으로 안정하고 성숙한 세포는 연골성 매트릭스를 생성할 수 있었다. 심지어 단순한 배양 시스템도 두께가 몇 밀리미터인 일차 연골세포로부터 생존가능한 연골성 조직 구축물의 조작을 가능하게 하였다. 또한, 동적 유동 환경을 갖는 생물반응기에서의 배양은 모 연골과 유사한 생화학적 조성 및 기계적 강성을 갖는 연골을 수득하였다. 연골 조직 공학에서, 어린 소 연골세포는 천연 조직과 유사한 기계적 특성을 갖는 연골을 조작하기 위해 스캐폴딩 재료와 함께 사용되어 왔다 [17, 18]. 그러나 이들 방법은 제한된 이용가능성, 및 성체 연골세포로부터 기능적 연골을 생성하는 제한된 능력을 겪는다.
연골 손상 이외에, 결합 조직 손상은 지속적인 임상적 도전이다. 미국에서, 손상된 힘줄, 인대, 및 관절낭은 매년 보고된 3천2백만 건의 근골격 손상 중 45%를 차지한다. 더욱이, 이들 발생률은 증가된 스포츠 참여 및 고령 인구로 인해 증가하고 있다. 결합 조직은 복구하기가 매우 어렵다. 현재 치료 전략은 종종 뼈-힘줄-뼈 자가이식편, 예컨대 슬개골 힘줄을 사용한 외과적 재건을 포함한다. 이러한 다조직 조성물은 숙주 조직에 대한 고정 및 통합을 개선시킨다. 그러나, 이들 자가이식편은 원래 조직을 적절히 모방하지 않고, 손상전 조직 기능, 복잡한 생화학적 특성, 및 인공물사용 구조를 복원하지 못한다. 결과적으로, 자가이식편 시술은 높은 실패율과 연관이 있고, 교정 수술을 필요로 하며, 환자의 삶의 질을 저하시킨다.
전구 줄기 세포는 연골 및 결합 조직을 형성할 잠재력을 갖는다. 줄기 세포로부터 연골 및 결합 조직을 조작하려는 많은 시도가 천연 형태 및 기능을 갖는 연골을 완전히 재생하는 것을 목표로 조사되어 왔다. 연골-유사 조직은 중간엽 줄기 세포 [19] 또는 연골세포, 예컨대 네오카트(Neocart) 및 MACI로부터 시작하여 시험관내에서 성장될 수 있다. 그러나, 이들 제품의 사용은 투여를 위한 침습적 수술을 필요로 한다. 최소 침습적 시술, 예컨대 관절경 수술로 연골 및 결합 조직을 재생하는 것을 목표로 하거나 쉽게 입수가능한 기성품인 성공적인 제품은 아직 없다.
상기에 비추어 볼 때, 천연-유사 조직을 재생함으로써 연골 및/또는 골연골 결함을 치료하기 위한 개선된 제품의 조성물을 제공할 필요가 있다.
<발명의 요약>
다중 범위의 결함, 예컨대 연골/골연골 결함, 다양한 원인, 예컨대 외상으로 인해 발생한 연골, 반월연골 조직, 인대, 힘줄 및 근육의 인열 또는 파열, 조직 퇴행, 외상후 골관절염, 관절염 등에 대한 치료 양식으로서 사용되는 골격 및 결합 조직, 예컨대 연골, 힘줄 및 인대를 재생하기 위한 개선된 조성물 및 방법이 본원에 기재되어 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 결합 조직 결함, 예컨대 관절 또는 비관절 연골 결함, 힘줄 결함, 및 인대 결함의 치료를 위한 신규하고 개선된 접근법을 포함한다. 장점은 다음을 포함한다: (1) 광범위하게 다양한 결함 크기 및 기하구조에 이식을 허용하는 주사가능한 플랫폼; (2) 사용 용이성 및 결함의 정밀한 충전; (3) 연골발생, 건발생, 조직발생을 겪을 수 있고 내구성 기능에 중요한 천연 조직-유사 구조를 형성할 수 있는 전구 세포; (4) 생체역학적 특성 (압축 모듈러스, 마찰 계수, 인장 강도 및 전단 강도)을 갖는 천연-유사 조직으로 발달하는 세포의 능력; (5) 숙주 조직과 원활하고 기계적으로 적격인 인터페이스의 형성을 허용하기 위한 세포로부터 생성된 응축된 중간엽 체의 생체내 성숙; 및 (6) 외상성 연골 및 결합 조직 손상의 주문형(on-demand) 치료에 쉽게 입수가능할 수 있는 기성품 세포-기반 조직 제품. 세포는 배양 전반에 걸쳐 및 주사 또는 이식 전후에 생존가능하다. 숙주에 대한 조직 통합이 촉진된다. 임상 결과의 개선 및 회복 시간 감소와 함께 반복되는 수술 및 조직 이환이 회피될 수 있다.
한 측면에서, 응축된 중간엽 세포체(condensed mesenchymal cell body)(CMB) 및 히드로겔을 포함하는 조성물이 제공된다. CMB는 연골발생을 겪을 수 있는 세포로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, CMB는 결합 조직을 형성하는 세포로부터 생성될 수 있다. 결합 조직은 콜라겐, 프로테오글리칸, 히알루론산 또는 엘라스틴을 포함할 수 있다. 콜라겐은 타입 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X 또는 XI 콜라겐을 포함할 수 있다. 프로테오글리칸은 글리코사미노글리칸, 헤파란 술페이트 또는 콘드로이틴 술페이트를 포함할 수 있다. CMB는 다양한 타입의 세포외 매트릭스 (ECM)를 포함하는 조직으로 발달할 수 있다. ECM은 예를 들어, 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 엘라스틴, 피브로넥틴 및/또는 라미닌을 포함할 수 있다. 조성물은 생성될 결합 타입에 따라 하나 이상의 약물 또는 성장 인자를 임의로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 중합체 미소구를 추가로 포함하며, 여기서 성장 인자 중 하나 이상이 중합체 미소구에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 중합체 미소구는 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(락트산) (PLA), 또는 PLGA 및 PLA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, CMB는 연골 세포, 힘줄 세포, 인대 세포 또는 반월연골 세포를 형성할 수 있는 전구 세포 및 결합 조직 세포로부터 선택된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CMB는 연골, 힘줄, 인대 또는 반월연골로부터 단리된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 건세포, 건모세포, 섬유세포 또는 섬유모세포이다. 일부 실시양태에서, CMB는 연골세포, 중간엽 줄기 세포 (MSC), 배아 줄기 세포 (ESC), 유도된 만능성 줄기 세포 (iPS)로부터 선택된 전구 세포, 또는 건세포, 건모세포, 섬유세포, 섬유모세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 천연 조직, 예컨대 연골, 힘줄, 인대 및 반월연골로부터 추출된 세포이다. 일부 실시양태에서, CMB는 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 지방-유래 줄기 세포 (ADSC), 골수 유래 줄기 세포 (BMSC), 제대혈 줄기 세포 (UB-MSC), 신경능선 줄기 세포, 유도된 만능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 일차 연골세포 및 신경능선 줄기 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 줄기 세포 (예를 들어, MSC, ADSC, BMSC 또는 UB-MSC)는 동종이계 공급원 또는 자가 공급원으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 줄기 세포 (예를 들어, MSC, ADSC, BMSC 또는 UB-MSC)는 항면역원성 및/또는 면역억제성이다 (예를 들어, 문헌 [Gimble, J.M. et al., "Adipose-Derived Stromal/Stem Cells: A Primer" Organogenesis, 2013, 9(1):3-10] 참조). 일부 실시양태에서, CMB 및/또는 세포는 약 -80℃ 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 적어도 약 1일 동안 동결보존되거나 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB 및/또는 세포는 약 -196℃ 또는 약 -196℃ 미만의 온도에서 적어도 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 동결보존되거나 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB 및/또는 세포는 -1℃ 내지 -25℃, 또는 약 -1℃ 미만의 영하의 온도에서 적어도 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 동결보존되거나 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB는 약 -20℃, -20℃, 또는 약 -20℃ 미만에서, 적어도 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB는 약 -10℃, -10℃, 또는 약 -10℃ 미만에서, 적어도 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB 및/또는 세포는 1℃ 내지 30℃, 또는 약 30℃ 미만의 영하의 온도에서 적어도 약 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 저체온적으로 보존되거나 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB는 약 4℃, 4℃, 또는 약 4℃ 미만에서 적어도 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 저장된다. 일부 실시양태에서, CMB는 약 25℃, 25℃, 또는 약 25℃ 미만에서 적어도 1일, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 1주 동안 저장된다.
일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 세포 표면 상에서 실질적인 또는 검출가능한 양의 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II, CD40, CD80 또는 CD86을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 면역검정, 예를 들어 유동 세포계측법, ELISPOT, 정량 PCR 및 혼합 림프구 반응 검정 중 하나 이상을 포함하는 검정에 따라 세포 표면 상에서 실질적인 또는 검출가능한 양의 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II, CD40, CD80 또는 CD86을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 세포 표면 상에서 실질적인 양의 CD73, CD90, CD105 또는 CD146을 발현한다. 일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 세포 표면 상에서 검출가능한 양의 CD73, CD90, CD105 또는 CD146을 발현한다. 일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 면역검정, 예를 들어 유동 세포계측법, ELISPOT, 정량 PCR 및 혼합 림프구 반응 검정 중 하나 이상을 포함하는 검정에 따라 세포 표면 상에서 실질적인 양의 CD73, CD90, CD105 또는 CD146을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 면역검정, 예를 들어 유동 세포계측법, ELISPOT, 정량 PCR 및 혼합 림프구 반응 검정 중 하나 이상을 포함하는 검정에 따라 세포 표면 상에서 검출가능한 양의 CD73, CD90, CD105 또는 CD146을 발현하지 않는다.
일부 실시양태에서, 히드로겔은 피브린 글루, 혈소판-풍부 혈장 (PRP), 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 히알루론산, 및 피브린 글루, PRP, 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 및 히알루론산의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 성장 인자는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8을 포함하는 TGF-β 수퍼패밀리 구성원으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 성장 인자는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8을 포함하는 TGF-β 수퍼패밀리 구성원 및 상승작용적으로 작용하는 것으로 나타난 임의의 조합으로부터 선택된다 (문헌 [Choi, S. et al., Int. J. Oral. Sci., 2013, 5(1):7-13], 및 [Hildner, F. et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 2010, 94(3):978-87]).
일부 실시양태에서, 성장 인자는 TGF-β 수퍼패밀리 구성원이다. 일부 실시양태에서, 성장 인자는 OP-1, OP-2, OP-3, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, DPP, CTGF, Vg1, Vgr-1, 60A 단백질, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL로 이루어진 군으로부터 선택된 형태발생 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인슐린, 트랜스페린, 인간 혈청 알부민, 프롤린, 소 혈청 알부민, 셀렌산, 리놀레산, 덱사메타손 및 아스코르브산 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, CMB에서의 세포는 현탁액 중에 존재한다.
일부 실시양태에서, CMB는 적어도 1,000개의 세포로부터 생성된다. 일부 실시양태에서, CMB는 적어도 5,000개의 세포, 적어도 10,000개의 세포, 적어도 15,000개의 세포, 적어도 20,000개의 세포, 적어도 25,000개의 세포, 적어도 30,000개의 세포, 적어도 40,000개의 세포, 적어도 50,000개의 세포, 적어도 60,000개의 세포, 적어도 70,000개의 세포, 적어도 80,000개의 세포, 적어도 90,000개의 세포, 적어도 100,000개의 세포, 적어도 125,000개의 세포, 적어도 150,000개의 세포, 적어도 175,000개의 세포, 적어도 200,000개의 세포, 적어도 225,000개의 세포, 적어도 250,000개의 세포, 적어도 300,000개의 세포, 적어도 400,000개의 세포, 또는 적어도 500,000개의 세포로부터 생성된다.
일부 실시양태에서, CMB는 크기가 균일하다. 예를 들어, CMB는 약 200 μm, 약 300 μm, 약 400 μm, 약 500 μm, 약 600 μm, 약 800 μm, 약 1 mm, 약 1.2 mm, 약 1.4 mm, 약 1.6 mm, 약 1.8 mm, 약 2.0 mm, 약 2.2 mm, 약 2.4 mm, 약 2.6 mm, 약 2.8 mm, 또는 약 3 mm의 직경을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, CMB는 크기가 다양하다. CMB는 200 μm 내지 3.0 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 200 μm 내지 800 μm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 400 μm 내지 1.0 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 600 μm 내지 1.2 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 800 μm 내지 1.6 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 1.0 mm 내지 1.8 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 1.2 mm 내지 2.0 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 1.4 mm 내지 2.4 mm의 직경을 가질 수 있다. CMB는 2.0 mm 내지 3.0 mm의 직경을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 주사가능하다.
또 다른 측면에서, 상기 및 본원에 기재된 임의의 조성물을 연골에 또는 연골을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 결함을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 상기 및 본원에 기재된 임의의 조성물을 연골에 또는 연골을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 분해를 예방하거나 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애를 치료하는 방법이 제공된다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 연골은 관절 연골이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 연골은 비관절 연골이다. 일부 실시양태에서, 비관절 연골은 코 연골, 귀 연골, 기관기관지 연골, 늑연골, 반월연골 및 추간판으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 1-20 % (w/w) 글리코사미노글리칸 (GAG)을 포함하는 연골 조직을 형성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 0.5-20 % (w/w) 콜라겐을 포함하는 연골 조직을 형성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 적어도 1.2% (w/w), 1.3% (w/w), 1.4% (w/w), 1.5% (w/w), 또는 1.6% (w/w) 콜라겐을 포함하는 연골 조직을 형성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 적어도 100 kPa의 영률 및 최대 0.8의 마찰 계수를 갖는 연골을 형성하는데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 연골을 형성하는데 효과적이고, 여기서 연골은 임의의 인접한 연골 및 그 부위에 있거나 그 부위를 둘러싸는 연골하 골 조직과 통합된다.
일부 실시양태에서, 방법은 조직 인열 또는 파열, 조직 퇴행, 손상, 또는 퇴행성 장애의 부위에서 천연 조직을 함께 연결하는데 효과적이다. 다양한 실시양태에서, 조직, 예컨대 힘줄, 인대, 반월연골, 근육은 임의의 인접한 조직, 예컨대 연골, 뼈, 근육, 다른 결합 조직, 또는 동일한 타입의 조직과 통합된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 조성물을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 연골 조직을 형성하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 임의의 상기 조성물을 찢어지거나 파열된 결합 조직에 또는 찢어지거나 파열된 결합 조직을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 찢어지거나 파열된 결합 조직을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 결합 조직은 인대, 힘줄 또는 반월연골이다.
도 1은 ADSC-매개 연골발생에 대한 동결보존의 효과를 시험하기 위한 프로토콜을 나타낸다. "세포 (2-D)" 아래 왼쪽에는 CMB의 형성 전에 ADSC가 처리되는 방식을 나타내는 개략도가 있다. "신선한" ADSC는 어떠한 동결보존도 겪지 않는 반면, "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" ADSC는 동결보존 하에 및 적어도 1개월 동안 액체 질소에서 저장된다. "p1 Cryo" ADSC는 동결보존 전에 단일 계대를 겪는 반면, "SVF Cryo" ADSC는 동결보존 전에 계대되지 않는다. "펠렛 3-D" 아래 오른쪽에는 멀티웰 플레이트에서 CMB의 형성, 이어서 시험 샘플에서 또 다른 라운드의 동결보존에 대한 설명이 있다. CMB를 형성하기 위해, ADSC가 수확되고 250,000개의 세포/mL로 연골발생 배지에 재현탁될 때, 신선한 인간 지질흡인물로부터 수확된 간질 부피 분획 (SVF)은 플레이팅되고 P0에서 P10으로 계대된다. 후속적으로, 1 mL의 세포 현탁액이 96-웰 딥 웰 플레이트에 웰 당 분배되고, 5분 동안 300 g에서 원심분리된다. 원심분리 후, CMB가 연골발생 배지에서 유지된다.
도 2는 동결보존되지 않은 샘플 (신선한), 수확 직후 동결보존된 후 해동되고 1 내지 4회 계대된 샘플 (SVF Cryo), 및 1회 계대되고 동결보존되고 해동되고 1 내지 4회 계대된 ADSC (P1 Cryo)에서 지방세포-유래 줄기 세포 (ADSC)의 계대 수에 대한 집단 배가 시간의 그래프를 나타낸다.
도 3은 ADSC에 대한 동결보존의 효과를 시험하기 위한 프로토콜을 나타낸다. 프로토콜은 CMB가 동결보존되지 않은 것을 제외하고 도 1과 유사하다.
도 4a-4f는 신선한, SVF Cryo 및 P1 Cryo ADSC 집단에 대한 다양한 파라미터에 대한 시험 결과를 나타낸다. 직경 (도 4a), 습윤 중량 (도 4b), DNA 대 습윤 중량의 질량비 (도 4c), GAG 대 습윤 중량의 질량비 (도 4d), 콜라겐 대 습윤 중량의 질량비 (도 4e), 및 배양에서 신선한, SVF Cryo, 및 P1 Cryo 집단 각각의 외관 (도 4f)에 대한 시험 결과를 나타낸다. 도 4f에서 스케일 바는 0.5 mm이다.
도 5는 ADSC로부터 제조된 응축된 중간엽 세포체 (CMB)의 펠렛에 대한 동결보존의 효과를 시험하기 위한 프로토콜을 나타낸다.
도 6a-6f는 신선한, SVF Cryo 및 P1 Cryo ADSC 집단에 대한 다양한 파라미터에 대한 시험 결과를 나타낸다. 직경 (도 6a), 습윤 중량 (도 6b), DNA 대 습윤 중량의 질량비 (도 6c), GAG 대 습윤 중량의 질량비 (도 6d), 콜라겐 대 습윤 중량의 질량비 (도 6e), 및 배양에서 신선한, SVF Cryo, 및 P1 Cryo 집단 각각의 외관 (도 6f)에 대한 시험 결과를 나타낸다.
도 7a는 유동 세포계측법에 의해 연골발생 CMB에 대한 다양한 항원에 대한 검정 결과를 나타낸다. 음성 대조군으로 사용된 ISO 항체에서는 음성 발현이 나타난 반면, 양성 대조군으로 사용된 CD59 및 CD90에서는 양성 발현이 나타났다. 시험된 면역원성 마커 HLA 클래스 II, CD40, CD80 및 CD86의 발현은 음성이었다.
도 7b는 살아있는 ADSC 상의 다양한 항원의 발현 수준을 나타낸다.
도 8은 실리콘 외식편 결함 모델에서 히드로겔 및 CMB의 조합을 시험하는 실험 프로토콜을 나타낸다.
도 9a는 골연골 결함 모델에서 빈 결함의 사진이다. 도 9b는 콜라겐 겔-CMB 충전된 결함을 나타내는 사진이다. 도 9c는 콜라겐 겔-CMB 충전된 결함의 편측-절단을 나타내는 사진이며, 결함 내에 충전 구성성분이 체류된다.
도 10a는 시간 경과에 따른 약물 방출을 검사하기 위한 실험 프로토콜을 나타낸다. 도 10b는 시간 경과에 따른 성장 인자의 관찰된 방출을 나타낸다.
도 11a는 부하된 및 비부하된 대조군 연골 필러 둘 다에 대해 GAG 함량이 유사하였음을 나타낸다.
도 11b는 부하가 습윤 중량 기준으로 약 5% 콜라겐인 비부하된 대조군과 비교하여 습윤 중량의 10%로 콜라겐 함량을 개선시킴을 나타낸다.
도 12는 연골 필러 생성물의 개략적인 제조 및 전달 공정을 나타낸다. 개별 세포, 히드로겔, 및 성장 인자 구성성분을 제조하고, 필요할 때까지 저장한 다음, 결함 부위에 주사하기 위해 주사기에서 조합한다.
도 13은 소 연골 외식편 결함으로의 피브린 및 다양한 히알루로난/콜라겐 히드로겔 제형의 전달을 나타낸다. 조성물은 불투명도 및 체류가 상이하다.
도 14는 외식편 결함으로의 CMB를 갖는 하나의 히드로겔 조성물의 전달을 나타낸다. 생체외 배양 후, 새로-형성된 조직은 천연 연골에 통합되고, 천연 연골에 필적하는 글리코사미노글리칸 및 콜라겐 함량을 나타내었다.
도 15a는 다중 CMB, 히드로겔 및 성장 인자로 제작된 연골 구축물을 나타낸다. 조직은 50,000-250,000개의 세포/CMB 범위의 다양한 세포 양으로 다중 CMB로부터 제작될 수 있다.
도 15b는 다양한 CMB 크기로 제작된 연골 구축물의 조직학적 염색을 나타낸다. 결과는 실험군 중에 필적하는 글리코사미노글리칸 및 콜라겐 함량을 나타낸다.
도 15c는 다양한 CMB 크기로 제작된 연골 구축물의 정량적 특징화를 나타낸다. 결과는 실험군 중에 필적하는 습윤 중량 및 DNA, GAG 및 콜라겐 함량을 나타낸다.
<상세한 설명>
본 발명의 다양한 실시양태의 원리 및 특징의 이해를 용이하게 하기 위해, 다양한 예시적인 실시양태가 아래 설명된다. 본 발명의 예시적인 실시양태가 상세하게 설명되지만, 다른 실시양태가 고려된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 그의 범위가 하기 설명 또는 실시예에 기재된 구성성분의 구축 및 배열의 세부사항으로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고, 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 예시적인 실시양태의 설명에서, 명확성을 위해 특정 용어가 재분류될 것이다.
<정의>
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 언급대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 구성성분에 대한 언급은 또한 복수의 구성성분의 조성물을 포함하도록 의도된다. "하나의" 구성요소를 함유하는 조성물에 대한 언급은 명명된 구성요소 외에 다른 구성요소를 포함하도록 의도된다. 다시 말해서, 용어 "하나"는 수량의 제한을 의미하는 것이 아니라, 언급된 항목의 "적어도 하나"의 존재를 의미한다. 각 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 그의 가장 넓은 의미를 고려하고, 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작동하는 모든 기술적 등가물을 포함하도록 의도된다.
범위는 본원에서 "약", "대략" 또는 "실질적으로" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또는 "대략" 또는 "실질적으로" 또 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 예시적인 실시양태는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 또한, 용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같이 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 실행에 따라 허용되는 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 및 보다 바람직하게는 여전히 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어는 값의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 본원 및 청구항에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며, 이러한 문맥에서 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미한다.
"포함하는(comprising)", "함유하는" 또는 "포함하는(including)"은 적어도 명명된 화합물, 요소, 입자, 또는 방법 단계가 조성물 또는 물품 또는 방법에 존재하지만, 심지어 다른 이러한 화합물, 물질, 입자, 방법 단계가 명명된 것과 동일한 기능을 가지고 있는 경우에도 다른 화합물, 물질, 입자, 방법 단계의 존재를 배제하지 않음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 및 달리 명시되지 않는 한, 용어 "히드로겔" 및 "스캐폴드"는 이온성 수용성 다당류, 예를 들어 셀룰로스 (예를 들어, NaCS 또는 NaCP)를 포함하는 중합체의 네트워크를 포함하는 본원에 교시되고 기재된 히드로겔 조성물을 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "콜라겐"은 강도 및 가요성을 제공하는 결합 조직의 주요 구성성분으로서 발생하는 세포외 밀접하게 관련된 단백질의 임의의 패밀리를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 적어도 14개의 타입이 존재하며, 각 타입은 공통의 삼중-나선 형상을 공유하지만 타입 간에 조성이 다소 다르며, 타입이 상이한 조직, 단계, 또는 기능으로 국한된 트로포콜라겐 단위로 구성된다. 가장 흔한 타입 I을 포함하는 일부 타입에서, 트로포콜라겐 막대는 회합하여 원섬유 또는 섬유를 형성하며; 다른 타입에서, 막대는 원섬유성은 아니지만 원섬유성 콜라겐과 연관이 있는 반면, 다른 타입에서 비원섬유성, 비주기적이지만 구조화된 네트워크를 형성한다. 연골은 연골세포 또는 연골세포-유사 세포 및 세포내 물질, 프로테오글리칸, 및 다른 단백질을 함유할 수 있다. 연골은 관절 및 비관절 연골을 포함한다.
유리질 연골이라고도 하는 "관절 연골"은 관절에 있는 뼈의 관절형 표면을 덮고 2개의 대향하는 골 표면 사이에 마찰 감소 인터페이스로서 역할을 하는 무혈관의 비광물화된 결합 조직을 지칭한다. 관절 연골은 직접적인 뼈-대-뼈 접촉 없이 관절에서의 움직임을 허용한다. 연골 표면은 거시적으로 매끄럽고 진주처럼 보이며, 고배율에서 미세하게 과립형이다. 관절 연골은 타입 II 및 타입 IX 콜라겐 및 다양한 잘-특징화된 프로테오글리칸의 존재, 및 연골내 골 형성과 연관이 있는 타입 X 콜라겐의 부재와 연관이 있다.
"비관절 연골"은 관절형 표면을 덮지 않는 연골을 지칭하며, 섬유연골 (관절간 섬유연골, 섬유연골성 디스크, 연결 섬유연골 및 원주 섬유연골 포함) 및 탄성 연골을 포함한다. 섬유연골에서, 미세다당류 네트워크는 돌출된 콜라겐 다발과 얽혀 있고, 연골세포는 유리질 또는 관절 연골에서보다 더 광범위하게 산재되어 있다. 관절간 섬유연골은 뇌진탕에 노출되고 빈번한 움직임을 겪는 관절, 예를 들어 무릎의 반월연골에서 발견된다. 이러한 관절의 예는 측두-하악, 흉골-쇄골, 견봉-쇄골, 손목 및 무릎 관절을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이차 연골성 관절은 섬유연골의 디스크에 의해 형성된다.
용어 "세포"는 그의 일반적인 생물학적 의미를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않고, 전체 다세포 유기체를 지칭하지 않는다. 세포는 예를 들어, 생체내, 시험관내 또는 생체외, 예를 들어 세포 배양에 있을 수 있거나, 예를 들어, 조류, 식물 및 포유동물, 예컨대 인간, 소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개 및 고양이를 포함하는 다세포 유기체에 존재할 수 있다. 세포는 원핵생물 (예를 들어, 박테리아 세포) 또는 진핵생물 (예를 들어, 포유류 또는 식물 세포)일 수 있다.
용어 "셀룰로스"는 그의 일반적인 생물학적 의미를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 셀룰로스는 화학식 (C6H10O5)n을 갖는 유기 화합물로서, 예를 들어, 수백 내지 수만개 초과의 β(1→4) 연결된 D-글루코스 단위의 선형 쇄로 이루어진 다당류이다.
용어 "결함" 또는 "결함 부위"는 연골, 골연골 조직, 반월연골, 인대 또는 힘줄의 붕괴를 지칭한다. 결함은 "공극"의 구성을 가정할 수 있으며, 이는 연골 및/또는 골연골 조직, 반월연골, 인대 또는 힘줄의 구조적 무결성에서 3차원 결함, 예를 들어 갭, 공동, 구멍 또는 다른 실질적인 붕괴를 의미하는 것으로 이해된다. 결함은 또한 뼈 또는 인대에 대한 그의 부착 지점으로부터 연골의 박리일 수 있다. 특정 실시양태에서, 결함은 내인성 또는 자발적인 복구가 불가능한 정도이다. 결함은 사고, 질환, 및/또는 외과적 조작의 결과일 수 있다. 예를 들어, 연골 결함은 관절에 대한 외상, 예컨대 찢어진 반월연골 조직의 관절로의 변위의 결과일 수 있다. 연골 결함은 또한 퇴행성 관절 질환, 예컨대 골관절염으로부터 기인할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "성장 인자"는 세포 성장, 증식, 복구 및 세포 분화를 자극할 수 있는 성분을 포함할 수 있다. 성장 인자는 약물일 수 있다. 약물은 합성 성분 및 자연 발생 성분을 포함할 수 있다. 성장 인자는 골 형태발생 단백질, 섬유모세포 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "중합체"는 단량체라고 불리는 5개 이상의 동일한 조합 단위의 화학적 화합물에 의해 형성된 거대분자를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 대부분의 경우, 단량체의 수는 매우 많으며, 종종 정확하게 공지되어 있지 않다. 합성 중합체에서, 이 수는 미리 결정된 정도로 제어될 수 있다. 2, 3 또는 4개의 단량체의 조합은 각각 이량체, 삼량체 및 사량체라고 불리며, 총괄하여 올리고머라고 공지되어 있다. 중합체는 무기 (예를 들어, 실록산, 황 쇄, 흑색 인, 붕소-질소, 실리콘) 또는 유기 (탄소 함유를 의미함)일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단독중합체"는 단일 단량체로부터 유래된 자연 또는 합성 중합체를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "다당류"는 연결된 단당 (단당류), 예컨대 글루코스 및/또는 관련 분자 (예를 들어, 글루쿠로네이트, 갈락토스, 갈락토사민, 글루코사민, 아세틸 글루코사민)로 제조된 장쇄 자연 또는 합성 중합체를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 2개의 단당류 분자는 글리코시드 결합에 의해 연결되어 이당류를 형성할 수 있으며, 예를 들어 글루코스 및 프룩토스의 연결에서 수크로스를 생성한다. 보다 복잡한 다당류, 예컨대 전분, 글리코겐, 셀룰로스 또는 키틴은 글리코시드 결합에 의해 연결된 수많은 단당류 단위로 이루어진다.
용어 "복구"는 결함 부위에서의 공극 또는 구조적 불연속성을 적어도 부분적으로 충전하기에 충분한 새로운 조직 형성, 및 결함을 둘러싸는 천연 조직, 예컨대 관절 연골, 비관절 연골, 인대, 및 힘줄과 새로 형성된 조직의 임의의 통합을 지칭한다. 그러나, 복구는 완전한 치유 과정, 또는 결함을 그의 결함전 생리적/구조적/기계적 상태로 복원시키기에 100% 효과적인 치료를 의미하거나 달리 필요로 하지 않는다.
용어 "치료 유효량"은 연골 조직을 복구, 재생, 촉진, 가속화, 분해 방지 또는 형성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "환자"는 포유동물 (예를 들어, 인간)을 포함하는 동물을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 아쥬반트"는 숙련된 의사의 지식에 기초하여 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않고 허용되지 않는 면역 반응 (예를 들어, 중증 알레르기 또는 아나필락시스 쇼크)을 유발하지 않는 본 발명의 가용성 형태발생 단백질 복합체와 함께 환자에게 투여될 수 있는 무독성 담체 또는 아쥬반트를 지칭한다. 예는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스 (CMC), 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 유/수 에멀젼, 및 다양한 타입의 습윤제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 예시적인 희석제는 포스페이트 완충 염수 또는 생리 (0.9%) 염수이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "줄기 세포"는 손상 구역으로 이동할 수 있고 1개 초과의 별개의 세포 표현형으로 말단 분화를 겪을 수 있는 딸 세포를 생성할 수 있는 자가재생 능력과 함께 높은 증식성 잠재력을 갖는 미분화된 세포를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 이들 세포는 다양한 세포 타입으로 분화하며 그러므로 질환이 있는 또는 손상된 관심있는 조직의 재생 또는 복구를 촉진하는 것이 가능할 수 있다. 용어 "세포 분화"는 세포가 세포 타입을 획득하는 과정을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "전구 세포"는 연골세포, 골세포 및 지방세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 표적 세포 타입으로 분화하기 위해 가소성을 유지하는 임의의 계통의 단리가능한 세포를 지칭한다. 전구 세포는 콜로니-형성 단위 (CFU) 또는 콜로니-형성 세포 (CFC)라고 지칭된다. 전구 세포의 특정 계통은 접미사, 예컨대, CFU-F (섬유모세포) (그러나 이에 제한되지는 않음)로 표시된다. 전구 세포, 예컨대 줄기 세포는 특정 타입의 세포로 분화하는 것이 가능할 수 있으나, 이미 줄기 세포보다 더 특이적이고, 그의 "표적" 세포로 분화하도록 압박되거나 자극된다. 일반적으로, 줄기 세포는 무한정 복제할 수 있는 반면, 전구 세포는 오직 제한된 횟수만 분열할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "골전구 세포", "연골전구 세포", "골연골전구 세포", "중간엽 세포", "중간엽 줄기 세포 (MSC)", 또는 "골수 간질 세포"는 하나 또는 여러 계통 경로를 따라 골모세포, 연골세포, 근세포, 지방세포 및 건세포로 분화할 수 있는 CFU-F 세포로부터 분화하는 다능성 줄기 세포를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 골 또는 연골을 지칭할 때, MSC는 일반적으로 골연골발생, 골발생, 연골발생 또는 골전구 세포라고 공지되어 있으며, 이는 단일 MSC가 배지 및 주변 환경에 따라 연골세포 또는 골모세포로 분화하는 능력을 나타내기 때문이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "연골세포"는 연골성 매트릭스를 생성하고 유지하는 연골에서 발견되는 세포를 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 최소 분화에서 말단 분화까지, 연골세포 계통은 (i) 콜로니-형성 단위-섬유모세포 (CFU-F); (ii) 중간엽 줄기 세포/골수 간질 세포 (MSC); 또는 (iii) 연골세포이다. 용어 "연골발생"은 연골 형성 또는 연골적격 세포로부터 새로운 연골의 형성을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는" 또는 "약리학적으로 허용되는"은 적절하다면 동물 또는 인간에게 투여될 때 유해, 알레르기 또는 다른 바람직하지 않은 반응을 생성하지 않는 실체 및 조성물을 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "제약상 허용되는 담체" 또는 "약리학적으로 허용되는 담체"는 제약 투여와 상용성이 있는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등을 의미할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 담체는 관련 기술분야의 표준 참고서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. 이러한 담체 또는 희석제의 예는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
한 측면에서, 응축된 중간엽 세포체 (CMB) 및 히드로겔을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 임의로 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, CMB는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 예컨대 지방-유래 줄기 세포 (ADSC), 골수-유래 줄기 세포 (BMSC), 제대혈-유래 중간엽 줄기 세포 (UM-MSC), 윤활막-유래 중간엽 줄기 세포 (SMSC)를 포함한다. 줄기 세포, 예컨대 ADSC는 세포의 연골발생 분화 능력을 저하시키지 않고 풍부한 지방 조직으로부터 얻을 수 있고 많은 수로 확장될 수 있으므로 조직 공학을 위해 임상적으로 관련된 세포 공급원을 제공한다. 임상-등급 동종이계 BMSC는 저온냉동은행으로부터 수득될 수 있으며, 가장 강력한 수준의 연골발생을 나타내는 세포를 선택하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이들 MSC는 면역원성이 아닐 수 있거나 낮은 면역원성을 가질 수 있다. 자가-재생 및 장기간 성장 능력을 갖는 것 외에도, MSC는 지방세포, 골모세포, 연골세포, 간세포, 근세포, 심근세포, 뉴런 및 상피 세포를 포함하는 다양한 세포 타입으로 분화하는 것이 가능할 수 있다.
MSC는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,153,432를 참조한다. ADSC를 제조하는데 사용되는 지방 조직은 다양한 지방 조직 부위, 예컨대 그물막 지방 조직으로부터 유래될 수 있다. 지방 조직은 지방흡입에 의해 수득되거나 단리될 수 있으며, 단리되는 예시적인 양은 10 내지 300 mL의 범위이다. BMSC를 제조하는데 사용되는 골수 조직은 다양한 골수 조직 부위, 예컨대 장골 능선으로부터 유래될 수 있다. 골수 조직은 바늘 흡인에 의해 수득될 수 있으며, 단리되는 예시적인 양은 공여자의 체중 kg 당 약 20 mL의 범위이다.
MSC는 성장 인자, 호르몬 및 시토카인을 발현하는 유전자를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, ADSC는 유익한 유전자, 시토카인 또는 성장 인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 항염증성 시토카인 (예를 들어, IL-2)을 발현하도록 유전적으로 변형된 ADSC는 염증이 발생하는 위치 (예를 들어, 관절염 관절)에 이식될 수 있다. 그 후, 이식은 ADSC가 유익한 항염증성 시토카인을 발현하는 것 외에도 연골세포가 될 수 있기 때문에 대상체에게 이중 이점을 제공한다.
MSC-포함 조성물은 골관절염 (OA)에 대한 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. OA는 관절 연골의 퇴행, 매트릭스의 손실, 원섬유성 및 균열 형성을 특징으로 한다. OA는 연골 표면의 완전한 손실을 초래할 수 있다. 관절 연골의 유일한 세포인 연골세포는 거대분자 구성성분 (콜라겐, 글리코사미노글리칸 및 히알루론산)의 분비 및 세포외 매트릭스 턴오버의 조정을 통해 세포외 매트릭스의 항상성 합성 및 분해를 유지한다. OA에서, 파괴성 및 프로염증성 매개인자는 동화성 및 수복성 성분에 비해 과생성되어, 관절 연골의 진행성 파괴를 초래한다.
MSC는 항면역원성일 수 있다. 일부 실시양태에서, MSC는 동종이계 공급원으로부터 유래된다.
동종이계 세포는 여러 장점을 제공할 수 있다. 동종이계 세포는 쉽게 입수가능한 공여자 조직으로부터 단리될 수 있기 때문에, 기성품 조성물이 생성될 수 있다. 여러 공여자 세포 로트에서 연골발생 잠재성의 시험 및 비교는 임의의 최종 생성물의 품질을 개선시킬 수 있다. 대량의 세포 및 여러 생성물을 단일 배치(batch)로부터 생산할 수 있기 때문에 보편적인 공여자로부터의 세포는 비용 및 변동성을 감소시킬 것이다 [20].
확장된 미분화된 MSC는 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않을 수 있다. 연골발생-유도 MSC (예컨대, 성장 인자 TGF-β3 및 BMP-6의 적용에 의해)는 또한 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않을 수 있다. 동종이계 공급원으로부터의 MSC, 예컨대 MHC 클래스 II 분자를 발현하지 않는 것은 면역 반응의 유도 없이 공여자에게 이식될 수 있다. 이식된 ADSC가 면역 반응을 유도하지 않는지 확인하기 위해 다양한 동물 연구가 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물, CMB 및 MSC는 유동 세포계측법 및 혼합 림프구 반응 검정에 따라 세포 표면 상에서 실질적인 또는 검출가능한 양의 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II, CD40, CD80 또는 CD86을 발현하지 않는다. HLA 클래스 II, CD40, CD80 및 CD86의 발현이 없는 세포는 면역권한이 있는 것으로 간주될 수 있다.
이들 마커를 검출하기 위해, 해동된 CMB는 타입 I 콜라게나제에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 단일 세포 현탁액으로 해리될 수 있다 [21]. 그 후, 소화물은 대략 동등한 부피의 연골발생 배지 및 세포 현탁액으로 중화되고, 20G 바늘을 통해 재현탁함으로써 추가로 해리될 것이다. 단일 세포는 유동 세포계측법을 위해 제조사의 프로토콜에 따라 표면 마커-특이적 항체 및 칼세인 AM으로 염색될 수 있다. 그 후, 유동 세포계측기를 사용하여 유동 세포계측법이 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, CMB는 저체온적으로 보존된다. 일부 실시양태에서, CMB는 실온에서 또는 0℃ 내지 10℃의 온도에서 저체온적으로 보존된다. 일부 실시양태에서, CMB는 예를 들어, 약 -20℃의 온도에서, 약 -80℃의 온도에서 또는 약 -80℃ 미만의 온도에서 동결보존된다. 다양한 실시양태에서, CMB는 적어도 약 1주 동안 저체온적으로 보존되거나 동결보존된다. 저체온적으로 보존되거나 동결보존된 CMB는 저체온적으로 보존되거나 동결보존되지 않은 필적하는 "신선한 CMB"와 유사한 성능 특징을 나타낼 수 있다. 저체온적으로 보존되거나 동결보존된 CMB는 신선한 CMB 또는 비저체온적으로 보존되거나 동결보존된 CMB에 필적하는 세포 생존율 (예를 들어, ORFLO 목시플로(MoxiFlo) 및 목시(Moxi) GO II를 사용하여 라이브/데드(LIVE/DEAD) 검정에 의해 시험될 수 있음)을 나타낼 수 있다. 저체온 보존 또는 동결보존은 안정화제, 예컨대 DMSO를 포함하는 배지 (예를 들어, 깁코(Gibco)로부터의 신스-에이-프리즈(Synth-a-Freeze)®)에 CMB를 도입함으로써 수행될 수 있다. CMB 및 CMB를 포함하는 조성물의 저체온 보존 또는 동결보존은 장기간 저장 및 기성품 사용을 위한 특징을 개선시키도록 최적화될 수 있다.
다양한 시험이 저체온적으로 보존되거나 동결보존된 CMB에 대해 수행될 수 있다. 저체온적으로 보존되거나 동결보존된 CMB는 연골발생 품질의 유지에 대해 평가하기 위해 연골발생 배지 (예를 들어, 아스코르브산, 덱사메타손, ITS+ 프리믹스(Premix) (코닝(Corning)), MSC 보충제, TGF-β3 (알&디 시스템스(R&D Systems)), 및 BMP6 (알&디 시스템스)으로 보충된 스템프로(StemPro) SFM 배지 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에서 배양될 수 있다. 그 후, 배양된 CMB는 조직학 및 면역조직화학 분석을 위해 10% (vol/vol) 포르말린에서 고정되거나 유전자 발현 분석을 위해 TRI 시약에서 저장될 수 있다. 고정 후, 샘플은 파라핀-포매되고, 5 μm 섹션으로 절단되고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), GAG를 위한 알시안 블루, 트리크롬, 콜라겐 I, II, X, 및 루브리신 (압캠(Abcam))으로 염색된다. RNA는 TRI 시약 방법 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 샘플로부터 정제될 수 있다.
다음 유전자 중 하나 이상의 발현이 평가될 수 있다: 아그레칸 (ACAN), 콜라겐 타입 I (COL1A1), 타입 II (COL2A1), 타입 X (COL10A1), 성 결정 영역 Y (SRY)-박스 9 (SOX9) 및 호메오박스 A2 (HOXA2) 중간엽 응축 전사 인자, 세포 부착 카드헤린 2 (CDH2), 응축 세포외 매트릭스 피브로넥틴 (FN1), 테나신 C (TNC), 신데칸 3 (SDC3), 매트릭스 메탈로프로테이나제 13 (MMP13), 트롬보스폰딘 모티프-5를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAMTS5), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β1 및 TGF-β3), 및 골 형태발생 단백질 6 (BMP6). TaqMan 프라이머 (라이프 테크놀로지스)를 사용한 실시간 PCR이 유전자 발현 분석을 위해 수행될 수 있다. 신선한 및 저체온적으로 보존된 CMB 사이의 상기 임의의 유전자의 발현의 비교는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH), S18, L37, EF1, EF2, 및 액틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하우스키핑 유전자로 수행될 수 있다.
CMB는 연골 형성을 위한 전구체 세포 구조이다. CMB는 인간 MSC, 예컨대 ADSC를 배양하고 응집체를 형성하도록 허용함으로써 제조될 수 있다. CMB는 예를 들어, 임의의 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일 또는 심지어 9일의 배양 후 형성될 수 있다. 적어도 6일 동안 배양된 CMB는 가장자리 또는 경계를 형성할 수 있으므로 "성숙 CMB"일 수 있다. CMB는 "성숙 CMB" 또는 연골-특이적 CMB임을 나타내는 다음 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다: 아그레칸 (ACAN), 콜라겐 타입 I (COL1A1), 콜라겐 타입 II (COL2A1), 콜라겐 타입 X (COL10A1), 중간엽 응축 전사 인자 성 결정 영역 Y (SRY)-박스 9 (SOX9), 호메오박스 A2 (HOXA2), 세포 부착 카드헤린 2 (CDH2), 응축 세포외 매트릭스 피브로넥틴 (FN1), 테나신 C (TNC), 신데칸 3 (SDC3), 매트릭스 메탈로프로테이나제 13 (MMP13), 트롬보스폰딘 모티프-5를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAMTS5), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β1 및 TGF-β3), 및 골 형태발생 단백질 6 (BMP6). 미성숙 CMB의 융합은 기존 연골을 복구하는데, 예컨대 CMB, 히드로겔 및 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 조성물에 존재할 때 효과적일 수 있다.
히드로겔은 세포외 매트릭스의 자연 겔-유사 배지를 모방할 수 있는 중합체 네트워크 또는 스캐폴드로 구성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 자연 겔-유사 배지는 콜라겐 또는 단편화된 콜라겐 또는 젤라틴이다. 특정 실시양태에서, 자연 겔-유사 배지는 히알루론산 또는 변형된 히알루론산이다. 히드로겔은 친수성 또는 수용성 다당류 화합물을 포함하는 중합체 또는 미세원섬유의 네트워크를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 가용성 다당류 화합물은 수용성 셀룰로스 화합물이다. 특정 실시양태에서, 수용성 셀룰로스 화합물은 음이온성, 수용성 셀룰로스이다.
히드로겔 또는 스캐폴드는 실질적으로 불용성인 섬유 또는 필라멘트의 매트릭스 또는 메쉬를 추가로 포함할 수 있다. (용어 "히드로겔" 및 "스캐폴드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.) 특정 실시양태에서, 히드로겔은 히드로겔 내에서 섬유성 또는 필라멘트성 메쉬 또는 매트릭스를 형성하기에 충분한 양으로 이온성, 수용성 셀룰로스 화합물, 및 다가이온성 다당류, 예를 들어, 다가양이온성 다당류, 예를 들어, 키토산의 중합체성 네트워크를 포함한다. 특정 실시양태에서, 다가양이온성 다당류는 키토산이다. 추가 실시양태에서, 포함된 키토산의 유효량은 히드로겔의 중량에 대해 약 0.01% 내지 약 20% (w/w)의 범위이다.
히드로겔 또는 스캐폴드는 착물화제 또는 안정화제, 예를 들어 반대-이온 (음이온 또는 양이온) 또는 화학적 가교제를 추가로 포함할 수 있다. 착물화제 또는 안정화제는 예를 들어, 소수성, 공유결합성, 이온성, 수소, 반 데르 발스 힘 또는 다른 화학적 결합을 통해 셀룰로스 중합체와 상호작용하거나 착물화함으로써 히드로겔에 추가적인 생화학적 및/또는 생체역학적 안정성 또는 둘 다를 부여한다. 특정 실시양태에서, 히드로겔 또는 스캐폴드는 음이온성 셀룰로스 화합물 및 양이온을 포함한다. 특정 실시양태에서, 양이온은 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 망가니즈 또는 철(II)과 같은 2가 양이온을 포함한다. 다양한 생체흡수성 중합체, 스캐폴드 및 그의 구성성분은 2017년 9월 8일에 WO2017/151619로서 공개된 국제 출원 번호 PCT/US2017/019956에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
추가 실시양태에서, 히드로겔 또는 스캐폴드는 이온성, 수용성 셀룰로스 화합물 및 화학적 가교제를 포함한다. 광범위하게 다양한 적합한 화학적 가교제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 히드로겔에 사용하기에 적합한 가교는 예를 들어, 아민, 술페이트 기, 히드록실 기, 티올 기, 디아크릴레이트, 글리코시드 결합, 예를 들어, 폴리디알릴 디메틸 암모늄 클로라이드 (PDADMAC) 및 비스에폭시드와 반응하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 가교제는 디글리시딜 에테르, 예를 들어, 디이소소르비드 비스에폭시드이다.
일부 실시양태에서, 히드로겔은 글리코사미노글리칸 (GAG)을 포함한다. 신체에서, 성체 줄기 세포는 종종 특정 화학적으로 및 위상적으로 복잡한 미세환경, 또는 함요(niche)로 국소화된다. 연골 발달 동안 미세환경의 특징을 모방하는 것은 생존가능한 접근법일 수 있다. 연골 발달 동안, 가장 초기의 사건 중 하나는 세포-세포 및 세포-매트릭스 부착 둘 다에 의해 매개되는 세포-세포 상호작용으로 인한 연골전 중간엽 세포 응집 및 응축이다. GAG, 특히 콘드로이틴-4-술페이트, 콘드로이틴-6-술페이트 및 헤파린 술페이트가 연골 발달 동안 존재한다. 성장 인자는 이들 GAG에 결합할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 히드로겔은 조성물의 질량의 약 1.0% 내지 약 95%를 차지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 1.0 내지 3.0% 히드로겔, 2.0 내지 4.0% 히드로겔, 3.0 내지 6.0% 히드로겔, 4.0 내지 8.0% 히드로겔, 5.0 내지 10.0% 히드로겔, 7.0 내지 12.0% 히드로겔, 10.0 내지 15.0% 히드로겔, 15 내지 25% 히드로겔, 20 내지 30% 히드로겔, 25 내지 40% 히드로겔, 30 내지 45% 히드로겔, 35 내지 50% 히드로겔, 40 내지 55% 히드로겔, 또는 50 내지 70% 히드로겔을 포함한다.
히드로겔은 세포가 부착할 수 있는 단백질 필라멘트로 구성된 나노-섬유성 네트워크 또는 프레임워크에 의해 지지될 수 있다. 가용성 영양소는 히드로겔을 통해 확산할 수 있다. 자연 ECM에서, 히드로겔은 압축 응력을 매개한다. 물은 GAG에 의해 강하게 흡수되어, GAG가 압력에 대한 그의 저항성을 연골에 제공하게 한다. 히드로겔 점조도는 GAG로 구성된 프로테오글리칸에 의해 유지된다. 또한, GAG는 성장 인자를 격리시킨다. GAG는 이들이 함유하는 헥소사민, 헥소스 또는 헥수론산 단위의 타입이 다양하다 (예를 들어, 글루쿠론산, 이두론산, 갈락토스, 갈락토사민, 글루코사민). 생리적으로 유의한 특정 GAG는 히알루론산, 더마탄 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 및 케라탄 술페이트이다.
히드로겔 또는 스캐폴드는 적어도 2종의 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 물질은 예를 들어, 2종의 수용성 셀룰로스 화합물과 같은 다당류이다. 특정 실시양태에서, 물질은 콜라겐 또는 콜라겐 기반 매트릭스이다. 특정 실시양태에서, 물질은 콜라겐 및 히알루론산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 화합물은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어 이온성 또는 화학적 상호작용에 의해 가교된다.
성장 인자는 세포 성장, 증식, 복구 및 세포 분화를 자극할 수 있는 자연 발생 성분을 포함한다. 일반적으로, 성장 인자는 단백질 또는 소분자, 예를 들어 스테로이드 호르몬이며, 이는 표적 세포 내/상에서 특정 수용체에 결합한다. 성장 인자는 다양한 세포 프로세스를 조절하는데 중요하며, 전형적으로 세포 사이의 신호전달 분자로서 작용한다. 성장 인자는 예를 들어, 골 형태발생 단백질을 포함하지만, 섬유모세포 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자는 혈관 분화 (혈관신생)를 자극한다.
본원에 교시되고 기재된 임의의 실시양태에서 사용될 수 있는 예시적인 성장 인자는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 자가분비 운동성 인자, 골 형태발생 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 에리트로포이에틴 (EPO), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 성장 분화 인자-9 (GDF9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간세포암 유래 성장 인자 (HDGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 이동-자극 인자, 미오스타틴 (GDF-8), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 다른 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 태반 성장 인자 (PLGF), 및/또는 소 태아 소마토트로핀 (FBS).
일부 실시양태에서, 성장 인자는 형태발생 단백질이다. 형태발생 단백질은 골 형태발생 단백질 (BMP) 패밀리의 구성원, 특히 BMP-6을 포함한다. 이 패밀리의 구성원은 TGF-β 수퍼패밀리 단백질의 서브클래스이다. 성장 인자로서 사용될 수 있는 예시적인 형태발생 단백질은 OP-1, OP-2, OP-3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, DPP, Vg1, Vgr-1, 60A 단백질, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, 및 NEURAL을 포함한다.
성장 인자 (또는 약물)는 계내에서 CMB에서의 ADSC의 연골세포로의 분화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 성장 인자는 TGF-β3, BMP-6, 또는 TGF-β3 및 BMP-6의 조합이다. TGF-β3 및 BMP-6이 조합되는 경우, 이들은 1:5, 1:4, 1:3, 1:2.5, 1:2, 1:1.5, 1:1.25, 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1, 5:1, 또는 1:5 내지 1:3, 1:4 내지 1:2.5, 1:3 내지 1:2, 1:2.5 내지 1:1.5, 1:2 내지 1:1.25, 1:1.5 내지 1:1, 1:1.25 내지 1.25:1, 1:1 내지 1.5:1, 1.25:1 내지 2:1, 1.5:1 내지 2.5:1, 2:1 내지 3:1, 2.5:1 내지 4:1, 또는 3:1 내지 5:1의 질량비 (TGF-β3 대 BMP-6)로 존재할 수 있다. 미소구가 조성물에 존재하고 TGF-β3 및 BMP-6이 조합되는 경우, 이들은 1:5, 1:4, 1:3, 1:2.5, 1:2, 1:1.5, 1:1.25, 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1, 5:1, 또는 1:5 내지 1:3, 1:4 내지 1:2.5, 1:3 내지 1:2, 1:2.5 내지 1:1.5, 1:2 내지 1:1.25, 1:1.5 내지 1:1, 1:1.25 내지 1.25:1, 1:1 내지 1.5:1, 1.25:1 내지 2:1, 1.5:1 내지 2.5:1, 2:1 내지 3:1, 2.5:1 내지 4:1, 또는 3:1 내지 5:1의 질량비 (TGF-β3 대 BMP-6)로 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, TGF-β3은 히드로겔 또는 스캐폴드 매트릭스에 포함될 수 있다. TGF-β3은 생체내에서 발달 동안 연골발생 동안 검출될 수 있다. 이러한 고정화는 이전에 보고된 프로토콜을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, BSA-PBS 중 다양한 농도의 TGF-β3을 밤새 4℃에서 가교된 NaCS 필름에 첨가한다. 웰을 BSA-PBS로 세척하고, 마우스 항-인간 TGF-β3 (에이빔, 인크.(Abeam, Inc.)), 이어서 FITC (비디 바이오사이언시스, 인크(BD Biosciences, Inc))와 접합된 이차, 항-마우스 IgG를 사용하여 면역형광 염색을 수행한다. 그 후, 형광 플레이트 판독기 (FLX800, 바이오텍, 인크.(Biotek, Inc.))를 사용하여 형광 세기를 검출하고, TGF-β3의 양과 상호 연관시킨다.
다양한 실시양태에서, 성장 인자는 조성물 cc 당 약 10 내지 약 10000 ng을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조성물 cc 당 1-15 ng 성장 인자, 10 내지 100 ng 성장 인자, 20 내지 200 ng 성장 인자, 50 내지 500 ng 성장 인자, 100 내지 1000 ng 성장 인자, 200 내지 2000 ng 성장 인자, 500 내지 3000 ng 성장 인자, 1000 내지 4000 ng 성장 인자, 2000 내지 5000 ng 성장 인자, 3000 내지 6000 ng 성장 인자, 4000 내지 7000 ng 성장 인자, 또는 5000 내지 8000 ng 성장 인자, 6000 내지 10000 ng 성장 인자를 포함한다.
조성물에 존재하는 성장 인자는 조성물이 주사되는 관절 또는 다른 부위에서 CMB의 연골세포로의 분화를 제공할 수 있다. 조성물에 존재하는 성장 인자는 글리코사미노글리칸 (GAG) 또는 콜라겐 또는 히알루론산을 생성하도록 CMB에 신호를 전달할 수 있다. 히드로겔 및 CMB와 함께 조성물에 존재하는 성장 인자는 이식 후 잠재적으로 연골을 형성하고 인접한 조직과 통합되는 중간엽 응축의 생리학적 발달 과정을 유리하게 제공할 수 있다. 성장 인자의 양 및 방출 속도는 이러한 발달 과정을 제공하도록 최적화될 수 있다. 성장 인자를 격리시키고 천천히 방출하기 위한 물질의 사용은 발달 과정 동안 성장 인자에 대한 CMB의 연장된 노출을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 중합체 미소구를 추가로 포함하며, 여기서 성장 인자 중 하나 이상은 중합체 미소구에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 중합체 미소구는 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA)을 포함한다. 중합체 미소구는 이러한 성장 인자가 수일 또는 수주에 걸쳐 계내에서 MSC의 연골발생 분화를 유도하는데 효과적이 되도록 성장 인자의 제어 방출을 제공할 수 있다. 이론에 얽매이는 것을 원치 않으나, 중합체 미소구, 예컨대 PLGA를 포함하는 히드로겔은 히드로겔 단독보다 우수한 장기간 성장 인자 방출을 제공할 수 있다. PLGA-기반 미소구는 성장 인자, 예컨대 VEGF, BMP6 및 TGF-β3의 제어-방출을 90일만큼 긴 기간 동안 지속시킬 수 있다. 실질적으로 일정한 방식으로 이러한 제어 방출은 골연골 복구를 위해 치밀하고 기능적인 세포 층의 형성을 허용할 수 있다.
또한, PLGA 및 다른 중합체 미소구는 동결건조가능하고 저장가능하며, 이는 조성물이 기성품으로 사용되도록 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 안정화제, 예컨대 피브린, 라미닌, 폴리-D-리신 및/또는 폴리-L-리신을 추가로 포함한다. 피브린은 트롬빈 및 피브리노겐으로부터 형성되기 때문에, 이들 구성성분은 별도로 존재하고 나중에 조합될 수 있다. 예를 들어, 트롬빈 및 피브리노겐은 조성물이 관절 또는 연골 복구가 필요한 다른 부위에 주사되기 직전에 조합될 수 있다. 라미닌 (LN)은 고분자량의 부착성 당단백질이다. 폴리-D-리신 및 폴리-L-리신은 비생물학적 공급원으로부터 제조될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 안정화제의 양은 조성물이 주사 부위에 CMB, 히드로겔 및 성장 인자를 유지하기에 적합한 겔-유사 점조도를 갖도록 다양할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 조성물은 CMB 및 히드로겔을 혼합함으로써 제조된다. 하나 이상의 약물이 조성물에 첨가될 수 있다. 하나 이상의 성장 인자가 조성물에 첨가될 수 있다. CMB 및 히드로겔을 포함하는 조성물은 액체 질소에서 적어도 5일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 3년, 5년 또는 심지어 10년 동안 동결보존되고 저장될 수 있다. 제조 동안, 조성물은 또한 기계적 부하 하에 혼합될 수 있다. 기계적 부하는 예를 들어, 수동으로, 진탕, 동적 부하 또는 정수압에 의해 적용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 대상체 또는 환자에게 투여될 때, 히드로겔 또는 스캐폴드는 조직의 성장, 재생 및/또는 복구를 지지, 촉진 및/또는 향상시키는데 효과적이다.
본원에 기재된 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다. 조성물은 적어도 하나의 추가의 생물학적으로 활성인 작용제 및/또는 치료제, 예컨대 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 화학적 화합물, 약물, 항체 등, 또는 이들의 조합과 조합될 수 있다. 예를 들어, 히드로겔 또는 스캐폴드 조성물은 적어도 하나의 추가의 생물학적으로 활성인 작용제 및/또는 치료제, 예컨대 아미노산, 펩티드, 폴리펩티드, 화학적 화합물, 약물, 항체 등, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합하여 활성 물질을 함유할 수 있다. 이러한 부형제는 현탁화제, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드로프로필-메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검을 포함한다. 예시적인 부형제는 또한 분산제 또는 습윤제, 예를 들어, 레시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트를 포함한다. 예시적인 부형제는 또한 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트를 포함한다.
수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
주사가능한 사용에 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제를 갖는 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다회 용량 컨테이너로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로서 형성될 수 있으며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모퍼(Cremophor)™ (바스프(BASF), 미국 뉴저지주 팔시파니) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 조성물은 용이하게 주사가능할 정도로 멸균성이고 유동적일 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
생물반응기가 조성물을 제조하는데 사용될 수 있으며, 예시적인 생물반응기는 2010년 9월 10일에 WO 2010/102059로서 공개된 국제 출원 번호 PCT/US10/026120 및 2014년 10월 23일에 WO 2014/172575로서 공개된 국제 출원 번호 PCT/US14/034559에 기재된 바와 같이 기재되어 있다. 제조 중에, 동종이계 공여자 세포를 사용하여 CMB를 생성할 수 있으며, 이는 그 후 이식을 위한 최적의 시점에 저체온적으로 보존되거나 동결보존된다. 유사하게, 성장 인자-주입 미세입자는 기성품 사용을 허용하기 위해 공여자 세포의 큰 동종이계 풀로부터 생성된 CMB와 함께 배송을 위해 쉽게 입수가능하도록 생산되고 동결건조될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 조성물 또는 그의 임의의 구성성분은 환자에게 투여하기 전에 또는 품질 관리 절차의 일부로서 시험관내에서 시험될 수 있다. 조성물은 시험 전에 저체온적으로 보존되거나 동결보존되었을 수 있다. 한 가지 시험 방식은 조성물 또는 그 안에 있는 CMB의 연골발생 특성을 검정하는 것이다. 조성물의 CMB는 해당되는 경우 해동된 다음 연골발생 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 해동 후 CMB는 1일 이상 동안 연골발생 분화 배지 (CDM)에서 배양된 다음, 이식 전에 히드로겔과 조합될 수 있다. 세포 생존율, 조직학 및 유전자 발현 중 하나 이상의 검정이 수행될 수 있다. 특정 검정은 실시예 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 배양된 CMB는 고정되고 염색될 수 있다. 다양한 염색, 예컨대 헤마톡실린, 에오신, 알시안 블루 및 트리크롬이 조직학적 분석에 사용될 수 있다. 유전자 발현의 경우, 아그레칸, 콜라겐, SOX9, HOXA2, 카드헤린 2, 피브로넥틴, 테나신 C, 신데칸 3, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 트롬보스폰딘 모티프를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAMTS), 형질전환 성장 인자 베타, 및 골 형태발생 단백질의 발현을 평가하기 위해 실시간 PCR이 수행될 수 있다. 이러한 시험은 조성물의 제제화, 저체온적 보존 또는 동결보존, 및/또는 저장의 방식을 최적화하거나 개선시키기 위해 수행될 수 있다.
조성물은 면역원성에 대해 시험될 수 있다. CMB에 존재하는 MSC의 면역원성의 마커는 예컨대 유동 세포계측법에 의해 시험될 수 있다. 예시적인 마커는 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II, CD40, CD80 및 CD86을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 시험의 예는 실시예 1에 기재되어 있다.
조성물은 생체내에서 연골 결함의 복구에서 효능에 대해 시험될 수 있다. 연골 결함은 동물-기반 연골 외식편에서 생성되거나, 인공 물질, 예컨대 실리콘 고무 링을 사용함으로써 모사될 수 있다. 대안적으로, 결합 조직 결함이 생성될 수 있다. 그 후, 조성물은 결함으로 가압되고 연골발생 배지에서 배양된다. 임의로, 기계적 힘이 조성물에 제공되어, 연골 세포의 발달을 촉진하거나, 달리 생체내, 예컨대 무릎 또는 어깨에서의 상태를 모사한다. 조성물은 기계적 강도를 결정하기 위해 (압축 영률의 측정에 의해) 나중에 시험될 수 있다. 또한, 기계적 힘이 예컨대 동적 부하에 의해 제공되는 경우, 연골 세포의 발달에 대한 기계적 힘의 효과를 평가하기 위해 상기 및 실시예 2에 기재된 조직학 연구가 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 및 본원에 기재된 임의의 조성물을 연골에 또는 연골을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 결함을 치료하는 방법이 제공된다. 조성물은 결함 부위에 주사될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 무릎의 반월연골에 주사될 수 있다. 대안적으로, 연골은 무릎의 반월연골 근처 부위에 주사될 수 있다. 또한, 조성물은 윤활액에 주사되거나 윤활액과 접촉할 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 및 본원에 기재된 임의의 조성물을 연골에 또는 연골을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 분해를 예방하거나 연골 손상 또는 퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 조성물은 연골 병변 또는 결함에 이식되고 고정될 수 있다. 연골 병변 및 결함은 다양한 형상, 크기 및 위치에서 발생할 수 있기 때문에, 조성물은 치료될 환자의 연골에서 특정 연골 결함 또는 병변에 부합하기에 충분한 형상 및 크기로 성형될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 시트 또는 매트릭스로서 성형될 수 있다. 시트 또는 매트릭스는 0.5 내지 10 mm, 1 내지 1.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 2.5 내지 4 mm, 3.5 내지 5 mm, 4 내지 6 mm, 5 내지 7 mm, 6 내지 8 mm, 또는 8 내지 10 mm의 두께를 가질 수 있다. 두께는 시트 또는 매트릭스 전반에 걸쳐 다양할 수 있다. 임플란트를 연골 결함에 고정하기 위해 필요에 따라 추가의 매트릭스, 메쉬 및 다른 구성성분이 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 상기 및 본원에 기재된 임의의 조성물을 결합 조직에 또는 결합 조직을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 결합 조직 분해를 예방하거나 결합 조직 손상 또는 퇴행성 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 조성물은 결합 조직 병변 또는 결함에 이식되고 고정될 수 있다. 결합 조직 병변 및 결함은 다양한 형상, 크기 및 위치에서 발생할 수 있기 때문에, 조성물은 치료될 환자의 결합 조직에서 특정 결합 조직 결함 또는 병변에 부합하기에 충분한 형상 및 크기로 성형될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 시트 또는 매트릭스로서 성형될 수 있다. 시트 또는 매트릭스는 0.5 내지 10 mm, 1 내지 1.5 mm, 1.5 내지 3 mm, 2.5 내지 4 mm, 3.5 내지 5 mm, 4 내지 6 mm, 5 내지 7 mm, 6 내지 8 mm, 또는 8 내지 10 mm의 두께를 가질 수 있다. 두께는 시트 또는 매트릭스 전반에 걸쳐 다양할 수 있다. 임플란트를 결합 조직 결함에 고정하기 위해 필요에 따라 추가의 매트릭스, 메쉬 및 다른 구성성분이 사용될 수 있다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 결합 조직은 반월연골, 인대 또는 힘줄이다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, 연골은 관절 및 비관절 연골로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비관절 연골은 반월연골 및 추간판으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 방법은 결합 조직 결함, 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 1-20 % (w/w) 글리코사미노글리칸 (GAG)을 포함하는 조직을 형성하는데 효과적이다. 조직은 1.0 내지 5.0% (w/w) GAG, 3.0 내지 6.0% (w/w) GAG, 4.0 내지 8.0% (w/w) GAG, 5.0 내지 10.0% (w/w) GAG, 6.0 내지 11.0% (w/w) GAG, 7.0 내지 12.0% (w/w) GAG, 8.0 내지 13.0% (w/w) GAG, 9.0 내지 14.0% (w/w) GAG, 10.0 내지 15.0% (w/w) GAG, 11.0 내지 16.0% (w/w) GAG, 12.0 내지 17.0% (w/w) GAG, 13.0 내지 18.0% (w/w) GAG, 14.0 내지 19.0% (w/w) GAG, 또는 15.0 내지 20.0% (w/w) GAG를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 결합 조직 결함, 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 0.5-20 % (w/w) 콜라겐을 포함하는 조직을 형성하는데 효과적이다. 조직은 0.5 내지 5.0% (w/w) 콜라겐, 1.0 내지 5.0% (w/w) 콜라겐, 2.0 내지 7.0% (w/w) 콜라겐, 3.0 내지 8.0% (w/w) 콜라겐, 4.0 내지 9.0% (w/w) 콜라겐, 5.0 내지 10.0% (w/w) 콜라겐, 6.0 내지 11.0% (w/w) 콜라겐, 7.0 내지 12.0% (w/w) 콜라겐, 8.0 내지 13.0% (w/w) 콜라겐, 9.0 내지 14.0% (w/w) 콜라겐, 10.0 내지 15.0% (w/w) 콜라겐, 10.0 내지 15.0% (w/w) 콜라겐, 12.0 내지 17.0% (w/w) 콜라겐, 14.0 내지 19.0% (w/w) 콜라겐, 또는 15.0 내지 20.0% (w/w) 콜라겐을 포함할 수 있다. 조직은 적어도 1.2% (w/w), 1.3% (w/w), 1.4% (w/w), 또는 1.6% (w/w) 콜라겐을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 적어도 1% (w/w) GAG를 포함하는 조직을 형성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 적어도 100 kPa의 영률 및 최대 0.8의 마찰 계수를 갖는 연골을 형성하는데 효과적이다. 영률은 적어도 20 kPa, 25 kPa, 30 kPa, 40 kPa, 50 kPa, 75 kPa, 100 kPa, 125 kPa, 150 kPa, 175 kPa, 200 kPa, 적어도 300 kPa, 적어도 400 kPa, 적어도 500 kPa, 적어도 600 kPa, 적어도 700 kPa, 적어도 800 kPa, 적어도 900 kPa, 적어도 950 kPa, 적어도 1000 kPa, 적어도 1100 kPa, 적어도 1200 kPa, 또는 적어도 1300 kPa일 수 있다. 마찰 계수는 0.8, 0.75, 0.7, 0.65, 0.6, 0.55, 0.5, 0.49, 0.48, 0.47, 0.46, 0.45, 0.44, 0.43, 0.42, 0.41, 0.40, 0.39, 0.38, 0.37, 0.36, 0.35, 0.34, 0.33, 0.32, 0.31, 0.30, 0.29, 0.28, 0.27, 0.26, 0.25, 0.24 또는 0.23 미만일 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 연골을 형성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 연골은 임의의 인접한 연골 및 그 부위에 있거나 그 부위를 둘러싸는 연골하 골 조직과 통합된다.
<실시예>
본 발명은 또한 하기 실시예에 따라 설명되고 입증된다. 그러나, 명세서 어디에서나 이들 및 다른 실시예의 사용은 단지 예시일 뿐이며, 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범위 및 의미를 제한하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 여기에 설명된 임의의 특정 바람직한 실시양태에 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서를 읽으면 본 발명의 많은 변형 및 변경이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 수 있으며, 이러한 변경은 취지 및 범위 내에서 본 발명을 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 조건과 함께 청구범위가 부여되는 등가물의 전체 범위에 의해서만 제한되어야 한다.
실시예 1: 동결보존된 동종이계 CMB의 연골발생 특성의 입증
초기 계대, 확장된 지방-유래 줄기 세포 (ADSC)를 라쎌 엘엘씨(LaCell LLC)로부터 수득하고, 항원성에 대해 철저히 시험하였다. GMP-등급 구성성분을 사용하여 세포를 확장하고 계대하였다. 제4 계대 후, ADSC를 연골발생 배지에 도입하였으며, 여기서 CMB가 형성되었다.
CMB가 형성되면, 온도를 -1℃/분의 속도로 -80℃로 낮추어 신스-에이-프리즈 (깁코)에서 즉시 동결보존한 다음, -80℃에서 적어도 3일 후 액체 질소로 옮겼다. 동결보존 1 내지 5주 후, 동결된 CMB를 37℃ 수조에서 37℃로 빠르게 재가온하여 해동시켰다. 라이브/데드 생존율/세포독성 검정 키트 (인비트로젠(Invitrogen)) 또는 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다. 해동된 CMB에서 수득된 결과를 동결보존되지 않은 CMB와 비교함으로써 해동된 CMB에 대해 면역조직화학 및 유전자 발현 분석을 수행하였다.
또한, 연골발생 품질의 유지에 대해 평가하기 위해 동결보존된 CMB를 연골발생 배지, 즉, 아스코르브산, 덱사메타손, ITS+ 프리믹스 (코닝), MSC 보충제, TGFβ3 (알&디 시스템스) 및 BMP6 (알&디 시스템스)으로 보충된 스템프로 SFM 배지 (라이프 테크놀로지스)에서 배양하였다. 간단히 말해서, 배양된 CMB를 조직학 및 면역조직화학 분석을 위해 10% (vol/vol) 포르말린에서 고정시키거나 유전자 발현 분석을 위해 TRIzol에서 저장하였다. 고정 후, 샘플을 파라핀-포매하고, 5 μm 섹션으로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), GAG를 위한 알시안 블루, 트리크롬, 중간엽 응축 전사 인자 성 결정 영역 Y (SRY)-박스 9 (SOX9), 콜라겐 I, II, X, 및 루브리신 (압캠)으로 염색하였다. RNA를 TRIzol 방법 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 샘플로부터 정제하였다. TaqMan 프라이머 (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 실시간 PCR을 수행하여, 다음 유전자의 발현을 평가하였다: 아그레칸 (ACAN), 콜라겐 타입 I (COL1A1), 타입 II (COL2A1), 타입 X (COL10A1), 중간엽 응축 전사 인자 성 결정 영역 Y (SRY)-박스 9 (SOX9) 및 호메오박스 A2 (HOXA2), 세포 부착 카드헤린 2 (CDH2), 응축 세포외 매트릭스 피브로넥틴 (FN1), 테나신 C (TNC), 신데칸 3 (SDC3), 매트릭스 메탈로프로테이나제 13 (MMP13), 트롬보스폰딘 모티프-5를 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAMTS5), 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ1 및 TGFβ3), 및 골 형태발생 단백질 6 (BMP6). 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH)를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다.
CMB 형성 후 동종이계 ADSC의 항원성을 더 잘 이해하기 위해, 동결보존된 샘플을 유동 세포계측법에 의해 분석하여, 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II, CD40, CD80, 및 CD86 표면 마커 수준을 검출하였다. 상기 언급된 마커의 발현이 없는 세포는 면역권한이 있는 것으로 간주하였다 [22]. 간단히 말해서, CMB를 타입 I 콜라게나제에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여 임의의 펠렛을 분해함으로써 해동된 CMB를 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. 소화물을 동등한 부피의 연골발생 배지로 중화시켰다. 세포 현탁액을 20G 바늘을 통해 재현탁함으로써 추가로 해리시켰다. 단일 세포를 온-칩(On-Chip) 염색 (애질런트(Agilent))에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 표면 마커-특이적 항체 및 칼세인 AM으로 염색하였다. 애질런트 바이오애널라이저(Bioanalyzer), 구아바(Guava)® 이지사이트(easyCyte) 유동 세포계측기, 또는 또 다른 유동 세포계측기를 사용하여 유동 세포계측법을 수행하였다.
(i) 동결보존된/해동된 CMB 대 신선한 생성물의 필적하는 성능, (ii) ADSC의 중간엽 체로의 균일한 통합 및 융합 (균일한 글리코사미노글리칸 구조, 낮은 테나신 침착), 및 (iii) CMB 형성 후 세포 상의 면역원성 표면 마커의 부재를 달성하기 위해, CMB를 생산하는 방법을 필요에 따라 최적화하였다.
실시예 2: 히드로겔에서 투여된 동종이계 CMB의 시험관내 모델
시험관내 연골 결함 모델의 충전에서 CMB/히드로겔의 타당성 및 효능을 동결보존되고 신선하게-형성된 CMB를 사용하여 시험하였다. 생존불가능한 소 연골 외식편 (5 mm 직경 및 5 mm 높이)에서, 3 mm 직경 전체-두께 연골 결함이 생성되었다. 다양한 히드로겔 비히클을 사용하여 CMB를 결함에 삽입하였다. 각 비히클은 타입 I 콜라겐, 히알루론산 및 피브린 중 하나 이상을 포함하며, 비히클의 비교 분석을 최적의 히드로겔 조성물을 결정하기 위해 수행하였다. 그 후, 히드로겔 비히클을 결함으로 가압하였다 (도 4). 구축물을 상기 정의된 바와 같이 TGF-β3 및 BMP-6을 함유하는 연골발생 배지에서 최대 5주 동안 배양하고 분석하였다. 조직학적, 생화학적 및 기계적 분석을 수행하였다 [19]. DNA, GAG 및 히드록시프롤린 (콜라겐) 함량을 또한 측정하였다.
간단히 말해서, 내재하는 골의 표면을 따라 연골 및 연골하 영역을 분리하고, 습윤 중량을 결정하였다. 샘플을 소화시키고, 피코그린(PicoGreen) 검정 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))을 사용하여 DNA 함량을 결정하였다. 콘드로이틴-6-술페이트를 표준으로 사용하는 1,9-디메틸메틸렌 블루 염료 열량측정 검정을 사용하여 추출물의 황산화 GAG (s-GAG) 함량을 결정하였다. 산 가수분해를 사용하여, 1:7.64 히드록시프롤린-대-콜라겐 질량비 또는 대략 13.5%의 총 콜라겐 함량을 사용하여 히드록시프롤린의 함량을 기준으로 콜라겐의 양을 평가하였다.
그 후, 연골의 압축 영률을 일축 압축에 의해 측정하였다. 구축물을 압축함으로써 응력-변형률 곡선을 생성하고 (즉, 초 당 0.01% 변형률, 최대 150 μm 변형, 최대 3,000초 동안), 압축 부하를 측정하였다. 응력-변형률 곡선의 선형 기울기로부터 영률을 계산하였다. 또한, 연골 및 유리 사이의 수직항력, 마찰력, 축 변형 및 마찰 계수를 일축 압축 구성에서 측정하였다. 그 후, 푸시-아웃을 사용하여, 융합된 CMB 및 천연 연골 매트릭스 사이의 통합 강도를 시험하였다.
둘러싸는 연골 및 내재하는 골과의 통합에 대한 부하의 효과를 결정하고 시간 경과에 따른 "실패" 파라미터를 검사하기 위해 임플란트의 부하 보유 능력을 정량화하였다. 최대 4시간/일, 5-7일/주 동안 1 Hz에서 10-15% 표면-대-표면 변형을 사용하여 동적 부하를 수행하였다. 상기 요약된 바와 같이 얻어진 조직의 세포외 매트릭스 조성 및 분포 (생화학 및 조직학을 통해) 및 기능적 특성 (일축 압축 시험을 통해)에 대한 동적 부하의 효과를 평가하였다.
기계적 자극으로 얻어진 조직의 기계적 및 생화학적 특성에서 유의한 개선, 특히 (i) 결함을 충전하기 위해 치밀한 연골 조직 (3-6%w/w GAG 및 >5%w/w 콜라겐 함유)의 형성, (ii) 생리학적 기계적 특성 (영률 >800 kPa, 마찰 계수 <0.3), 및 (iii) 인접한 연골 및 연골하 골 조직과 개발된 생성물의 통합을 달성하기 위해 히드로겔에서 CMB를 제조하고 투여하는 방법을 필요에 따라 최적화하였다.
실시예 3: 전달 플랫폼으로서 PLGA 미소구를 사용한 성장 인자 (TGF β3 및 BMP6)의 장기간 방출 및 CMB 연골발생
골연골 이식편으로부터 성장 인자의 장기간 방출을 지속시키기 위해, 제어-방출 기술을 도입하고 시험하였다. 시험 샘플에서, 성장 인자를 전달하여 연골발생을 유도하고 향상시키는데 미소구를 사용하였다. 대조군 샘플에서, 미소구를 사용하지 않았다.
미소구를 PLGA-기반 중합체로 제조하였으며, 이를 생체적합성, 주사가능성 및 맞춤형 방출 프로파일을 위한 생존가능한 단백질 전달 비히클로서 사용하였다. 선택된 GF의 생화학적 특성을 포함한 많은 인자에 따라 이러한 프로파일로 성장 인자 (GF)의 제어 방출 프로파일을 최적화하였다.
공개된 프로토콜에 기초하여 유중수 (w/o/w) 에멀젼 방법을 사용하여 PLGA 미소구를 생성하였다. 간단히 말해서, PLGA (50:50 락트산 대 글리콜산 비율) 및 GF의 수용액을 디클로로메탄에서 혼합하였다. 혼합물을 균질화하여 유중수 에멀젼을 형성하고, 폴리비닐 알콜 (PVA)에 첨가하여 이중 에멀젼을 형성하였다. 연장된 교반 후, 내용물을 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 그 후, 미소구 펠렛을 세척하고 동결건조하였다.
상이한 미소구 군의 크기 분포 및 형태학적 특성에 기초하여 특징화함으로써 생성된 미소구의 품질을 평가하기 위해 주사 전자 현미경법을 사용하였다. 균일한 GF 방출을 위해 최적화하기 위해, 가장 균일한 입자 크기 및 별개의 개별 구체 형태를 나타내는 미소구를 선택하였다. 상이한 미소구의 GF 방출을 하기 공개된 프로토콜에 의해 분석하였다. 간단히 말해서, 10 mg의 미소구를 마이크로원심분리기 튜브에서 PBS에 현탁시켰다. GF 화물을 최적화하기 위해, 제조된 미소구를 BMP6 및 TGFβ3의 상이한 조합 (5 mg:5 mg, 3 mg:7 mg, 및 7 mg:3 mg)으로 부하하였다. GF 방출을 30분, 1시간, 5시간, 1일, 3일, 7일에 및 이후 7일마다 검사하였다. 모든 시점에 대해, 상등액을 수집하고, 동등한 부피의 신선한 PBS를 미소구에 첨가하였다. 샘플에 펠렛이 존재하지 않을 때까지 이 절차를 반복하였으며, 이는 미소구의 완전한 분해 및 성장 인자 방출을 나타낸다. 시간 경과에 따른 성장 인자 방출의 농도를 결정하기 위해 수집된 상등액에 대해 ELISA를 수행하였다. CMB 연골발생을 위해 최적의 농도 (10 ng/ml)에서 장기간 GF 방출을 지속시킬 수 있는 미소구를 선택하였다.
긴 저장 수명을 갖는 중합체 미소구를 제조하기 위해 조건을 최적화하였다. 생성된 미소구의 보관 수명을 4℃ 및 25℃ (실온) 둘 다에서 시험하고, GF 방출 프로파일을 상이한 저장 시간에 평가하였다. GF 미소구를 4℃ 및 25℃에서 1일, 7일, 14일 및 21일 동안 저장하고, GF 방출 프로파일을 평가하여 4℃ 및 25℃에서 저장을 위해 허용되는 범위를 결정하였다.
성장 인자 (GF)-주입 미소구를 시험관내에서 분석하여, 장기간 GF 방출을 지속시키고 따라서 CMB 성숙 및 연골발생을 향상시킬 수 있는지 결정하였다. 이 실험에서, 구성성분을 혼합하고 복합물을 맞춤형 몰드에 주사함으로써 히드로겔+CMB±GF 미소구 복합물을 제조하였다. 복합 구축물을 GF로 보충하지 않고 최적화된 배지 (실시예 1 및 2에 따름)에서 배양하였다. 복합 구축물에서 CMB 성숙, 연골발생 및 골연골 ECM 침착에서 GF 방출의 역할을 확인하기 위해 조직학 및 생화학 검정을 수행하였다. ELISA를 통해 5주에 걸쳐 GF 방출을 검사하기 위해 이들 구축물의 조건화된 배지를 30분, 1시간, 5시간, 1일, 3일, 5일, 7일에 및 7일마다 수집하였다. 복합 구축물 (히드로겔+CMB+GF 미소구)은 BMP6 및 TGF-β3으로 보충된 배지에서 배양된 히드로겔+CMB 구축물에 필적하는 CMB 성숙 및 연골발생의 정도를 나타낼 수 있었다.
실시예 4: 시험관내 연골 결함 모델에서 생성물 투여 및 효능의 모델
실시예 1-3으로부터의 프로토콜이 최적화되고 이에 적합한 조건 및 구성성분이 선택되면, CMB, 히드로겔 및 GF-주입 미세입자로부터 제조된 선택된 물질을 시험관내 연골 결함 모델에서 시험하였다. 선택된 물질을 외식편 연골 결함 모델에 주사하고, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 기계적 부하 하에 배양하였다. 외식편을 최대 5주 동안 외인성 GF 보충 없이 연골발생 배지에서 성장시켰다. 얻어진 조직을 실시예 1 및 2에 요약된 바와 같이 기능성에 대해 평가하였다. 또한, PTOA의 장기간 치료를 위한 이들 플랫폼의 효능을 추가로 결정하기 위해 각 배지 변경에서 배지로의 GF-방출을 평가하였다. 복합 구축물의 생물학적 및 기계적 특성을 평가하기 위해 조직학적, 생화학적 및 기계적 분석을 또한 수행하였다. 성공 기준을 결함에서 연골 조직의 형성 및 인접한 연골 및 연골하 골로의 조직의 통합에 의해 결정하였다.
실시예 5: 연골발생에 대한 동결보존 효과의 시험
ADSC-매개 연골발생에 대한 동결보존의 효과를 도 1에 요약된 바와 같이 시험하였다. 도 1에서, 세포를 CMB 배양의 2차원 (2-D) 또는 3차원 (3-D) 단계 동안 동결보존하였다. 2-D 조건의 경우, 세포를 (i) 동결보존 없이 P4로 계대하거나 (신선한), (ii) 간질 혈관 분획 (SVF)을 수확한 직후 동결보존하고 해동하고 P4로 계대하거나 (SVF Cryo), 또는 (iii) P1로 계대하고 동결보존하고 해동하고 P4로 계대하였다 (P1 Cryo). 3-D 조건의 경우, CMB를 형성 후 유지시키고 동결보존하지 않거나 (대조군), 또는 3일의 배양 후 동결보존하고 동결보존 후 1 내지 5주에 해동하였다.
지방 조직의 샘플을 원심분리하여 간질 혈관 분획 (SVF)을 단리함으로써 동결된 및 대조군 "신선한" 샘플을 제조하였다. SVF를 플라스크로 옮기고, TrypLE-Select로 4회 계대하였다. 그 후, 샘플을 (i) 동결보존하지 않은 대조군 샘플 및 (ii) 동결된 샘플로 분리하였으며, 여기서 동결된 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고 1 내지 5주 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, 동결보존된 샘플을 해동하여 동결된 샘플을 수득하였다. 그 후, 대조군 및 시험 샘플 둘 다에 대해 추가 검정을 수행하였다.
지방 조직의 샘플을 원심분리하여 간질 혈관 분획 (SVF)을 단리함으로써 시험 및 대조군 "SVF Cryo" 샘플을 제조하였다. SVF를 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고 적어도 1개월 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, SVF를 해동하고, 플라스크로 옮기고 4회 계대하였다. 그 후, 샘플을 대조군 및 동결된 샘플로 분리하였으며, 여기서 동결된 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하였다. 그 후, 샘플을 (i) 동결보존하지 않은 대조군 샘플 및 (ii) 동결된 샘플로 분리하였으며, 여기서 동결된 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고 1 내지 5주 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, 동결보존된 샘플을 해동하여 시험 샘플을 수득하였다. 그 후, 대조군 및 시험 샘플 둘 다에 대해 추가 검정을 수행하였다.
지방 조직의 샘플을 원심분리하여 간질 혈관 분획 (SVF)을 단리함으로써 시험 및 대조군 "p1 Cryo" 샘플을 제조하였다. SVF를 플라스크로 옮기고 1회 계대하였다. 계대된 SVF를 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고 적어도 1개월 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, SVF를 해동하고, 플라스크로 옮기고 4회 계대하였다. 그 후, 샘플을 대조군 및 동결된 샘플로 분리하였으며, 여기서 동결된 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하였다. 그 후, 샘플을 (i) 동결보존하지 않은 대조군 샘플 및 (ii) 동결된 샘플로 분리하였으며, 여기서 동결된 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고 1 내지 5주 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, 동결보존된 샘플을 해동하여 시험 샘플을 수득하였다. 그 후, 대조군 및 시험 샘플 둘 다에 대해 추가 검정을 수행하였다.
그 후, 집단 배가 시간에 대한 ADSC 동결보존의 효과를 검정하였다. (i) 동결보존 없이 P4로 계대한 ADSC (신선한), (ii) 간질 혈관 분획 (SVF)을 수확한 직후 동결보존하고 해동하고 P4로 계대한 ADSC (SVF Cryo), 및 (iii) P1로 계대하고 동결보존하고 해동하고 P4로 계대한 ADSC (P1 Cryo) 간에 비교를 수행하였다. 마지막 동결보존 단계 후 만들어진 4개의 계대 각각에서 샘플을 취한 다음, 집단 배가 시간에 대해 검정하였다. 결과는 도 2에 나타내며, 여기서 집단 배가 시간은 Y-축에 및 수행된 계대 횟수는 X-축에 표시된다.
집단 배가 시간 (PDT)의 분석은 신선한 및 P1 Cryo ADSC가 PDT가 계대에 따라 증가된 유사한 경향을 나타냄을 보여주었다. 대안적으로, SVF Cryo ADSC의 경우, PDT는 계대에 따라 감소하였다. "신선한" 샘플의 경우, 집단 배가 시간은 약 1.5일 (1회 계대)에서 4회 계대시 약 2일로 증가하였다. 대조적으로, SVF가 동결보존되고 해동된 "SVF Cryo" 샘플의 경우, 집단 배가 시간은 약 2일 (1회 계대)에서 4회 계대시 약 1.5일로 감소하였다. SVF가 동결보존되고 해동되기 전에 1회 계대된 "p1 Cryo" 샘플의 경우, 집단 배가 시간은 약 2.5일이었고, 계대 증가에 따라 약간 증가하였다.
실시예 6: 연골발생에 대한 ADSC 동결보존 효과의 시험
세포에 대한 동결보존의 효과의 추가 검정 (플라스크 내 2D)을 수행하였다. 대조군 "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" CMB를 상기 기재된 방식으로 및 도 3에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 배양에서 28일 후, "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" 샘플 각각에서 CMB의 직경을 측정하고, 도 4a에 나타내었다. 신선한 CMB는 대략 1.9 mm의 직경을 갖고, SVF Cryo CMB는 대략 1.7 mm의 직경을 갖고, P1 Cryo 세포는 대략 1.6 mm의 직경을 가졌다.
배양에서 28일 후, "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" 샘플 각각에서 CMB의 습윤 중량을 측정하고, 도 4b에 나타내었다. 신선한 CMB는 대략 4.0 mg의 습윤 중량을 가졌다. SVF Cryo CMB는 대략 2.5 mg의 습윤 중량을 갖고, P1 Cryo CMB는 대략 1.7 mg의 습윤 중량을 가졌다. (* p < 0.05, ** p < 0.005.)
배양에서 28일 후, "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" 샘플 각각에서 DNA 대 습윤 중량의 질량비 (ng DNA/mg 습윤 중량)를 측정하고, 도 4c에 나타내었다. 신선한 CMB는 대략 375 ng DNA / mg 습윤 중량의 질량비를 가졌다. SVF Cryo CMB는 대략 85 ng DNA / mg 습윤 중량의 질량비를 가졌다. P1 Cryo CMB는 대략 105 ng DNA / mg 습윤 중량의 질량비를 가졌다. (* p < 0.05, ** p < 0.005.)
배양에서 28일 후, "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" 샘플 각각에서 GAG 대 습윤 중량의 질량비 (w/w%)를 측정하고, 도 4d에 나타내었다. 신선한 CMB는 대략 5.5 w/w%의 비율을 가졌다. SVF Cryo CMB는 대략 2.0 w/w%의 비율을 가졌다. P1 Cryo CMB는 대략 4.8 w/w%의 비율을 가졌다. (* p < 0.05, ** p < 0.005.)
배양에서 28일 후, "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" 샘플 각각에서 콜라겐 대 습윤 중량의 질량비 (w/w%)를 측정하고, 도 4e에 나타내었다. 신선한 CMB는 대략 3.5 w/w%의 비율을 가졌다. SVF Cryo CMB는 대략 5.2 w/w% 비율을 가졌다. P1 Cryo CMB는 대략 3.1 w/w%의 비율을 가졌다. (* p < 0.05, ** p < 0.005.)
배양에서 28일 후, "신선한", "SVF Cryo" 및 "p1 Cryo" CMB 각각의 외관은 도 4f에 나타낸다. 스케일 바는 0.5 mm이다.
3개 군의 ADSC를 사용하여 CMB를 생성하고 연골발생 분화 배지 (CDM)에서 4주 동안 성장시켰을 때, 동결보존은 얻어진 샘플의 직경, 습윤 중량 및 DNA를 유의하게 감소시켰다 (p < 0.01). 동결보존은 또한 SVF Cryo CMB에서 GAG를 유의하게 감소시키고 [연골발생에 대한 (p < 0.01) 마커] 콜라겐 함량을 유의하게 증가시켰지만 (p < 0.05), P1 Cryo CMB는 신선한 CMB와 유사한 특성을 가졌다. 도 4f는 배양에서 28일 후 전형적인 CMB의 이미지를 나타낸다.
상기 결과는 1회 계대 후 동결보존된 ADSC ("p1 Cryo")가 기성품 주사가능한 생성물에 적합함을 시사한다.
실시예 7: 연골발생에 대한 CMB 동결보존 효과의 시험
CMB 펠렛에 대한 동결보존의 효과의 추가 검정 (웰에서 3-D)을 수행하였다.
대조군 "신선한" 및 "p1 Cryo" 샘플을 도 5에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 지방 조직의 샘플을 원심분리하여 간질 혈관 분획 (SVF)을 단리하였다. "p1 Cryo" 샘플에서, SVF를 플라스크에 넣고, 1회 계대한 후, 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고, 1 내지 5주 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, 동결보존된 샘플을 해동하고 4회 계대하였다. "신선한" 샘플에서, SVF를 플라스크에 넣고, 4회 계대하였다.
그 후, "신선한" 및 "p1 Cryo" 샘플 각각을 대조군 및 동결된 샘플로 분할하였다. 동결된 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이 동결보존하고 적어도 1주 동안 액체 질소에서 저장하였다. 그 후, 동결된 샘플을 해동하고, 멀티-웰 플레이트로 옮겼다. 그 후, 대조군 및 동결된 샘플 둘 다에 대해 추가 검정을 수행하였다.
멀티-웰 플레이트 (3-D 배양)에서 배양에서 3일 후 및 연골발생 분화 28일 후, "신선한-대조군", "p1 Cryo-대조군", "신선한-동결된" 및 "p1 Cryo-동결된" 샘플 각각에서 세포의 직경을 측정하고, 결과는 도 6a에 나타내었다. 신선한-대조군 CMB는 대략 1.87 mm의 직경을 갖고, 신선한-동결된 CMB는 대략 1.20 mm의 직경을 갖고, p1 Cryo-대조군 CMB는 대략 1.82 mm의 직경을 갖고, p1 Cryo-동결된 CMB는 대략 1.43 mm의 직경을 가졌다.
"신선한-대조군", "p1 Cryo-대조군", "신선한-동결된" 및 "p1 Cryo-동결된" 샘플 각각에서 세포의 습윤 중량을 또한 측정하고, 결과는 도 6b에 나타내었다. 신선한-대조군 CMB는 대략 3.15 mg의 습윤 중량을 갖고, 신선한-동결된 CMB는 대략 1.70 mg의 습윤 중량을 갖고, p1 Cryo-대조군 CMB는 대략 2.30 mg의 습윤 중량을 갖고, p1 Cryo-동결된 CMB는 대략 1.20 mg의 습윤 중량을 가졌다.
"신선한-대조군", "p1 Cryo-대조군", "신선한-동결된" 및 "p1 Cryo-동결된" 샘플 각각에서 DNA 대 습윤 중량의 질량비 (ng DNA/mg 습윤 중량)를 측정하고, 도 6c에 나타내었다. 장기간 연골발생 유도 전에, CMB는 대략 200 내지 5000 ng DNA/mg CMB의 DNA 대 습윤 중량 질량비를 가졌다. 5주 동안 연골발생 유도 후, 신선한-대조군 CMB는 대략 360 ng DNA/mg 습윤 중량의 DNA 대 습윤 중량 질량비를 갖고, 신선한-동결된 CMB는 대략 230 ng DNA/mg 습윤 중량의 질량비를 갖고, p1 Cryo-대조군 CMB는 대략 345 ng DNA/mg 습윤 중량의 질량비를 갖고, p1 Cryo-동결된 CMB는 대략 550 ng DNA/mg 습윤 중량의 질량비를 가졌다.
"신선한-대조군", "p1 Cryo-대조군", "신선한-동결된" 및 "p1 Cryo-동결된" 샘플 각각에서 GAG 대 습윤 중량의 질량비 (w/w%)를 측정하고, 도 6d에 나타내었다. 신선한-대조군 CMB는 대략 5.70 (w/w%)의 질량비를 갖고, 신선한-동결된 CMB는 대략 6.55 (w/w%)의 질량비를 갖고, p1 Cryo-대조군 CMB는 대략 4.45 (w/w%)의 질량비를 갖고, p1 Cryo-동결된 CMB는 대략 3.90 (w/w%)의 질량비를 가졌다.
"신선한-대조군", "p1 Cryo-대조군", "신선한-동결된" 및 "p1 Cryo-동결된" 샘플 각각에서 콜라겐 대 습윤 중량의 질량비 (w/w%)를 측정하고, 도 6e에 나타내었다. 신선한-대조군 CMB는 대략 3.65 (w/w%)의 질량비를 갖고, 신선한-동결된 CMB는 대략 4.95 (w/w%)의 질량비를 갖고, p1 Cryo-대조군 CMB는 대략 4.00 (w/w%)의 질량비를 갖고, p1 Cryo-동결된 CMB는 대략 2.40 (w/w%)의 질량비를 가졌다.
멀티-웰 플레이트에서 배양 (3-D 배양)에서 3일 후 및 연골발생 분화 28일 후 "신선한-대조군", "p1 Cryo-대조군", "신선한-동결된" 및 "p1 Cryo-동결된" CMB 각각의 외관은 도 6f에 나타낸다.
직경 (도 6a)은 CMB 동결보존으로 직경이 25-30% 감소하여 대조군 CMB에 대해 유사하였다. 이들 차이는 도 6f에서 육안 검사 데이터에서 확인하였다. 도 6b에서 습윤 중량 데이터는 모든 군 간에 유의한 차이를 보여주며, 유의한 감소가 ADSC 및 CMB 동결보존 둘 다에서 보였다.
DNA (도 6c), GAG (도 6d) 및 콜라겐 (도 6e) 함량의 생화학적 분석은 해당 주변부에 따라 이질적인 반응을 나타내었다. CMB의 DNA 함량은 신선한-대조군, 신선한-동결된 및 P1 Cryo-대조군 간에 유의하게 상이하지 않았다. 그러나, P1 Cryo-동결된 군에서, 다른 군, 특히 신선한-동결된 군과 비교하여 DNA 함량의 증가가 있었다. GAG 함량은 신선한 CMB와 비교하여 P1 Cryo CMB에 대해 더 낮았다. 이들 차이 중 일부는 도 6d에 요약된 바와 같이 유의하였다. 원섬유성 콜라겐 함량은 대조군 간에 유사하였으나, 각각의 대조군과 비교하여 P1 Cryo-동결된 군에서 콜라겐 함량의 수반되는 감소와 함께 신선한-동결된 군에서 콜라겐 함량의 증가가 있었다.
실시예 8: 연골발생 CMB의 유동 세포계측법 분석
연골발생 CMB의 세포 표면 마커의 분석을 유동 세포계측법에 의해 수행하였다. ISO에 대한 항체를 음성 대조군으로 사용하고, CD59 및 CD90에 대한 항체를 양성 대조군으로 사용하였다. HLA 클래스 II, CD40, CD80 또는 CD86의 발현을 시험하였다. 또한, CD34, CD45, CD73, CD90 및 CD105의 발현을 시험하였다. 도 7a에서, 유동 세포계측법 결과는 음성 HLA 클래스 II, CD40, CD80 및 CD86 발현을 통한 연골발생 CMB의 항원성을 나타낸다. 음성 발현이 또한 음성 대조군으로 사용된 ISO 항체에서 나타났으며, 양성 발현이 양성 대조군으로 사용된 CD59 및 CD90에서 나타났다.
도 7b는 표면 마커 특징의 분석을 유동 세포계측법에 의해 수행한 후 살아있는 ADSC 상의 다양한 항원의 발현 백분율을 나타낸다. ADSC를 4명의 인간 공여자로부터 취하였다. CD73, CD90 및 CD105의 수반되는 높은 발현과 함께 CD34 및 CD45의 낮은 발현이 있는 전형적인 중간엽 줄기 세포 (MSC) 프로파일이 나타났다. 또한, 동결보존된 CMB에서 항원 마커의 검사는 HLA 클래스 II, CD40, CD80 또는 CD86 발현의 결핍이 나타났으며, 이는 이러한 세포가 면역원성 반응을 유발할 가능성이 없음을 나타낸다.
실시예 9: 히드로겔 및 CMB의 조합을 시험하기 위한 실리콘 결함 모델
타입 I 콜라겐, 히알루론산, 및 타입 I 콜라겐:히알루로네이트 (4:1, 1:1 및 1:4의 비율)를 CMB 및 성장 인자-미세입자에 대한 전달 비히클로서 검사하였다. 히드로겔 전달 비히클 뿐만 아니라 CMB 및 미세입자 파라미터의 최적화를 위해, 외식편 결함 모델을 모방하는 실리콘 고무 링 방법 (5-mm 내부 직경, 2-mm 두께)을 도 8에 나타낸 바와 같이 사용하였다. 히드로겔 및 CMB를 실리콘 결함에 첨가하였다. 습윤 중량, DNA 질량비, GAG 질량비 및 콜라겐 질량비 파라미터를 도 8의 표에 나타내며, 모든 겔 제형은 CMB를 전달하기에 적합한 옵션이었다. 각 히드로겔에 대한 겔화 농도 및 시간의 최적화를 실리콘 결함 모델에서 수행하였다. 어떤 조건이 연골성 표현형의 최상의 조합 및 둘러싸는 연골과의 통합을 제공하는지 결정하기 위해, (i) 콜라겐 및 (ii) 콜라겐:히알루로네이트 (1:1, 4:1 및 1:4)로 전달된 CMB로 충전된 실리콘 및 연골 결함 모델 둘 다에서 추가 최적화를 수행하였다.
실리콘 결함 모델에서 최적화 후, 골연골 결함 모델을 사용하여 시험을 반복하였다. 도 9a는 골연골 결함 모델에서 빈 결함의 사진이다. 도 9b는 콜라겐 겔-CMB 충전된 결함을 나타내는 사진이다. 도 9c는 콜라겐 겔-CMB 충전된 결함의 편측-절단을 나타내는 사진이며, 결함 내에 충전 구성성분이 체류하였다. 상기 기재된 파라미터의 추가 최적화를 골연골 결함 모델에서 수행하였다.
실시예 10: 히드로겔 및 CMB의 조합을 시험하기 위한 실리콘 결함 모델
약물이 hADSC 연골발생을 유도할 수 있는지 시험하기 위해 약물을 CMB-히드로겔 조합에 혼입하였다. 약물이 연골발생 분화 배지에 직접 첨가되는 hADSC 연골발생을 유도하기 위해 이전에 사용된 약물 보충제 방법과 동등하게 약물 방출 제형을 설계하였다. 평균 1-10 μm 크기를 갖는 입자에 0.02% (w/w %) 약물을 부하하였다. 80 mg의 약물-부하된 미세입자를 제작하고, hADSC 연골발생을 성공적으로 유도하는데 필요한 최적의 미세입자 농도를 결정하기 위해 장기간 약물 방출 (최대 35일)에 대해 시험하였다. 도 10a에 기재된 실험 프로토콜의 사용에 대해 시간 경과에 따른 약물 방출을 검정하였다.
도 10b는 시간 경과에 따른 관찰된 약물 방출을 나타낸다. 10 mg의 미세입자는 6일에 걸쳐 약 10 pg/48시간 또는 5 pg/일의 방출 속도를 제공하였다.
5 mm 직경/1 mm 두께의 이식편 (20 μl 이식편 부피)으로 10 ng/ml 성장 인자 농도를 유지하기에 적합한 20 pg/일 방출 속도를 달성하기 위해, 40 mg의 미세입자를 각 이식편에 부하할 수 있었다.
실시예 11: 히드로겔, CMB 및 약물을 포함하는 조성물로부터 연골의 재생을 시험하기 위한 연골 외식편 결함 모델
두 약물, TGF-β3 및 BMP-6을 CMB-히드로겔 조합에 첨가하여, 이들이 생체외 모델에서 연골 결함을 충전하는지 여부 및 동적 변형 부하가 GAG 및 콜라겐의 함량에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다. 동적 변형 부하 (1% 테어(tare) 부하에 이어, 1일 당 3시간 동안 1 Hz에서 10% 표면-대-표면 변위, 5-7일/주 [Ng et al., Cell Mol. Bioeng., Sep. 1, 2009, 2(3):386-394])는 ADSC가 연골세포로 분화하는 것을 자극하고, 연골발생 분화 인자, 예컨대 글리코사미노글리칸, 연골 올리고머 단백질 (COMP), 링크 단백질, 히알루론산, 및 콜라겐 특히 타입 II 콜라겐, 타입 IX 콜라겐, 타입 XI 콜라겐의 생성을 증가시키는데 사용하였다. 동적 변형 부하를 받은 연골 필러 및 대조군 연골 필러의 GAG 함량 및 콜라겐 함량을 검정하였다. 결과는 도 11a 및 11b에 나타낸다.
도 11a는 GAG 함량이 부하된 및 비부하된 대조군 연골 필러 둘 다에서 유사하였음을 나타낸다.
도 11b는 부하가 습윤 중량 기준으로 약 5% 콜라겐인 비부하된 대조군과 비교하여 콜라겐 함량을 습윤 중량의 10%로 개선시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 다양한 히드로겔 조성물의 전달을 시험하기 위한 연골 외식편 결함 모델
전체-두께 연골 외식편 결함 모델에서 체류 및 겔화 시간에 대해 히드로겔의 상이한 조성물 및 농도를 시험하였다. 시험된 겔 구성성분은 오직 피브린, 및 콜라겐/히알루로난의 다양한 조합을 포함하였다. 다양한 히드로겔 조성물을 외식편 결함에 전달하고 경화시킨 다음 최대 5일 동안 PBS에서 37℃에서 진탕함으로써 겔 체류 능력을 시험하였다.
결과는 도 13에 나타낸다. 오직 피브린 및 높은 히알루로난 히드로겔 조성물은 높은 콜라겐 조성물 샘플과 비교하여 우수한 체류를 나타내었다.
또한, ADSC로부터 제작된 CMB를 갖는 히드로겔 조성물을 외식편 결함에 전달하였다. 10 mm 직경 및 10 mm 두께 (1-2 mm의 연골 두께)의 소 골연골 외식편을 골격적으로 성숙한 소 무릎으로부터 수확하였다. 생검 펀치를 사용하여 5 mm 직경 전체 두께 (뼈까지 아래로) 결함을 생성하였다. 그 후, 이들 결함을 CMB 및 콜라겐/히알루로난 히드로겔의 1:1 부피 혼합물로 충전하고, 부하 유무에 관계 없이 최대 5주 동안 TGF-β3 및 BMP-6 성장 인자를 함유하는 배지에서 배양하였다. 생체외 배양 후, 새로-형성된 조직은 천연 연골에 통합되고, 천연 연골에 필적하는 글리코사미노글리칸 및 콜라겐 함량을 나타내었다. 데이터는 도 14에 나타낸다.
실시예 13: 연골 구축물 품질에 대한 CMB 크기의 영향
연골 구축물 품질에 대한 CMB 크기의 효과를 평가하였다. CMB를 50K, 100K 및 250K 세포로부터 생성하였다. 그 후, 구축물을 각 CMB 크기로 제작하고, 4주 동안 배양하고, 육안 검사, 조직학 및 정량적 평가를 위해 수확하였다. 육안 검사는 모든 실험 조건에서 샘플이 잘-융합된 CMB를 나타내었음을 보여주었다. 데이터는 도 15a에 나타낸다. 더욱이, 구축물은 불투명하였으며, 이는 연골-유사 품질을 나타낸다. H&E에 대한 조직학적 염색은 도 15b에 나타낸 바와 같이 모든 군에서 융합된 CMB를 나타내는 육안 관찰을 확인하였다. 연골발생 마커, GAG 및 콜라겐에 대한 조직학적 염색은 실험 조건 간에 필적하는 분화를 나타내었다. CMB 크기가 구축물 품질에 미치는 영향을 확인하기 위해 군 간에 샘플 습윤 중량, DNA, GAG 및 콜라겐의 정량을 또한 비교하였다. 데이터는 도 15c에 나타낸다. 모든 파라미터에 대해, 값은 군 간에 상대적으로 일관되었다. 이들 결과는 50K, 100K, 및 250K CMB 크기가 모두 필적하는 연골 품질을 생성하고 연골 필러 생성물 제조에 고려될 수 있음을 나타낸다.
<참고문헌>
Figure pct00001
Figure pct00002
* * *
본 발명은 본원에 기재된 특정 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허, 출원, 간행물, 시험 방법, 문헌, 및 기타 자료는 본 명세서에 물리적으로 존재하는 것처럼 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

Claims (32)

  1. a) 응축된 중간엽 세포체 (CMB); 및
    b) 히드로겔
    을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    c) 하나 이상의 약물 또는 성장 인자
    를 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체 미소구를 추가로 포함하며, 여기서 약물 또는 성장 인자 중 하나 이상이 중합체 미소구에 캡슐화된 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 중합체 미소구가 폴리(락트-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(락트산) (PLA), 또는 PLGA 및 PLA의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CMB가 연골 세포, 힘줄 세포, 인대 세포 또는 반월연골 세포를 형성할 수 있는 전구 세포 및 결합 조직 세포로부터 선택된 세포를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CMB가 연골, 힘줄, 인대 또는 반월연골로부터 단리된 세포를 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 세포가 연골세포, 건세포, 건모세포, 섬유세포 또는 섬유모세포인 조성물.
  8. 제5항에 있어서, CMB가 중간엽 줄기 세포 (MSC), 지방-유래 줄기 세포 (ADSC), 골수 유래 줄기 세포 (BMSC), 제대혈 줄기 세포 (UB-MSC), 신경능선 줄기 세포, 유도된 만능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 일차 연골세포, 및 신경능선 줄기 세포로부터 선택된 줄기 세포를 포함하는 것인 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 세포가 동종이계 공급원 또는 자가 공급원으로부터 유래된 것인 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 세포가 항면역원성 및/또는 면역억제성인 조성물.
  11. 제5항에 있어서, CMB가 약 -1℃ 미만의 온도에서 적어도 1일 동안 동결보존되는 것인 조성물.
  12. 제5항에 있어서, CMB가 0℃ 내지 30℃의 온도에서 적어도 1일 동안 저체온적으로 보존되는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CMB에서의 세포가 세포 표면 상에서 실질적인 또는 검출가능한 양의 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II, CD40, CD80 또는 CD86을 발현하지 않는 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 히드로겔이 피브린 글루, 혈소판 풍부 혈장 (PRP), 타입 I 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 히알루론산, 및 피브린 글루, PRP, 타입 I 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 및 히알루론산의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 조성물.
  15. 제2항에 있어서, 성장 인자가 TGF-β 수퍼패밀리 구성원인 조성물.
  16. 제2항에 있어서, 성장 인자가 OP-1, OP-2, OP-3, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, DPP, Vg1, Vgr-1, 60A 단백질, GDF-1, GDF-2, GDF-3, GDF-5, GDF-6, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, CDMP-1, CDMP-2, CDMP-3, NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL로 이루어진 군으로부터 선택된 형태발생 단백질인 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린, 트랜스페린, 인간 혈청 알부민, 프롤린, 소 혈청 알부민, 셀렌산, 리놀레산, 덱사메타손 및 아스코르브산 중 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제1항에 있어서, CMB가 단일 세포로 현탁액 중에 존재하는 것인 조성물.
  19. 제1항에 있어서, CMB가 크기가 균일하거나 불균일한 것인 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 주사가능한 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 결합 조직에 또는 결합 조직을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 결합 조직 결함을 치료하는 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 연골에 또는 연골을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 연골 분해를 예방하거나 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애를 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 연골이 관절 연골인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 연골이 비관절 연골인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 연골이 코 연골, 귀 연골, 기관기관지 연골, 늑연골, 반월연골 및 추간판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 1-20% (w/w) 글리코사미노글리칸 (GAG)을 포함하는 조직을 형성하는데 효과적인 방법.
  27. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 적어도 0.5% (w/w) 콜라겐을 포함하는 조직을 형성하는데 효과적인 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 적어도 100 kPa의 영률 및 최대 0.8의 마찰 계수를 갖는 연골을 형성하는데 효과적인 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 연골 결함, 연골 분해, 연골 손상, 연골 퇴행성 질환 또는 연골 장애의 부위에서 연골을 형성하는데 효과적이며, 여기서 연골이 임의의 인접한 연골 및 그 부위에 있거나 그 부위를 둘러싸는 연골하 골 조직과 통합되는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 연골 조직을 형성하는 방법.
  31. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 찢어지거나 파열된 결합 조직에 또는 찢어지거나 파열된 결합 조직을 둘러싸는 구역에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 찢어지거나 파열된 결합 조직을 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 결합 조직이 인대, 힘줄 또는 반월연골인 방법.
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