JP5122474B2 - 両性リポソーム製剤 - Google Patents

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Description

本出願は2005年12月1日出願の米国仮出願第60/741,229号および2006年3月2日出願の米国仮出願第号60/778,304からの優先権を主張し、その両方は引用により本明細書に含める。
発明の簡単な説明
本発明は、癌の治療のための組成物およびそれを用いる方法に関する。具体的には、本発明は、癌の治療のための、両性リポソームにより捕捉されたDNAi オリゴヌクレオチドに関する。
背景
癌遺伝子は癌生物学の理解における中心概念となっており、治療薬のための価値ある標的を提供しうる。多くのタイプのヒト腫瘍、例えば、リンパ腫および白血病において、癌遺伝子が過剰発現しており、腫瘍形成能と関連しうる(Tsujimoto et al.、Science 228:1440-1443 [1985])。例えば、高レベルのヒトbcl-2遺伝子の発現がt(14; 18) 染色体転座を伴うすべてのリンパ腫においてみられており、ほとんどのろ胞性の B細胞リンパ腫および多くの大細胞型非ホジキンリンパ腫が含まれる。高レベルの bcl-2 遺伝子発現はt(14; 18) 染色体転座を有さない特定の白血病においてもみられており、例えば、多くの場合の慢性リンパ球性白血病急性、多くのプレB細胞型リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、上咽頭癌、多くの前立腺、***および結腸腺癌が含まれる (Reed et al.、Cancer Res. 51:6529 [1991]; Yunis et al.、New England J. Med. 320:1047; Campos et al.、Blood 81:3091-3096 [1993]; McDonnell et al.、Cancer Res. 52:6940-6944 [1992); Lu et al.、Int. J Cancer 53:29-35 [1993]; Bonner et al.、Lab Invest. 68:43A [1993]。その他の癌遺伝子としてはTGF-α、c-ki-ras、ras、her-2 およびc-mycが挙げられる。
癌遺伝子の発現は、一本鎖 DNAi オリゴヌクレオチドにより阻害されうる。しかし核酸治療は、体液中での不安定性または細胞への不十分な取り込みによりしばしば治療効力を欠く。
それゆえ癌の治療のためのかかるDNAi オリゴヌクレオチドの体液および細胞中での安定かつ有効な送達に対する要求がある。
発明の概要
本発明は、癌の治療のためのDNAi オリゴヌクレオチドの送達のための両性リポソームを調製および使用するための組成物および方法を提供する。かかる両性リポソームは、例えば、生理的 pHではアニオン性または中性の電荷を有し、約 4の酸性pHではカチオン性の電荷を有しうる。有利なことに、本発明の組成物は、脂質濃度約 10〜100 mMまたはそれ以下にて約 1 〜4 mg/ml (例えば、約 2 mg/ml)の多量の DNAi オリゴヌクレオチドを捕捉する;コロイドおよび血清安定性を示す;平均リポソームサイズが200 nm未満であることから細胞および腫瘍への取り込みが増強している;そして、常套のトランスフェクション試薬に用いられるカチオン性脂質により形成されるリポソームと比べて低い毒性を示す。
第一の側面において、本発明は両性リポソームおよびDNAi オリゴヌクレオチドを含む混合物を提供する。第一の側面のある態様において、両性リポソームは4〜8の等電点を有する。 さらなる態様において、両性リポソームはpH 7.4において負に荷電しているか中性であり、pH 4において正に荷電している。
第一の側面の別の態様において、両性リポソームは両性脂質を含む。さらなる態様において、両性脂質は、HistChol、HistDG、isoHistSucc DG、アシルカルノシン、HCChol またはそれらの組合せであり得る。別の態様において、両性リポソームは１以上のカチオン性脂質および１以上のアニオン性脂質の混合物を含む。さらに別の態様において、カチオン性脂質は、DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoCholまたは HisChol、またはそれらの組合せであり得、アニオン性脂質は、CHEMS、DGSucc、Cet-P、DMGSucc、DOGSucc、POGSucc、DPGSucc、DG Succ、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA またはそれらの組合せであり得る。
さらに別の態様において、リポソームは中性脂質も含む。さらなる態様において、中性脂質はステロールおよびその誘導体を含む。さらに別の態様において、ステロールはコレステロールおよびその誘導体を含む。中性脂質は中性リン脂質も含みうる。一つの態様において、リン脂質はホスファチジルコリンまたはホスファチジルコリンおよびホスホエタノールアミンを含む。別の態様において、ホスファチジルコリンは、 POPC、OPPC、天然または水添ダイズ PC、天然または水添卵 PC、DMPC、DPPCまたはDOPC およびそれらの誘導体であり、ホスファチジルエタノールアミンはDOPE、DMPE、DPPEまたはそれらの誘導体および組合せである。さらなる態様において、ホスファチジルコリンは、POPC、OPPC、ダイズ PCまたは卵 PCであり、ホスファチジルエタノールアミンはDOPEである。
さらに別の態様において、両性リポソームの脂質は、DOPE、POPC、CHEMS および MoChol; POPC、Chol、CHEMS およびDOTAP; POPC、Chol、Cet-P およびMoChol、または POPC、DOPE、MoChol および DMGSuccを含む。
第二の側面において、本発明の混合物の両性リポソームは、両性の性質を有する脂質成分の混合物を含む脂質相およびDNAi オリゴヌクレオチドから形成することが出来、リポソーム中の荷電した脂質の総量は5 mole%から70 mole%の間で変動し得、中性脂質の総量は20 mole%から70 mole%の間で変動し得る。第一の側面のある態様において、両性リポソームは3 〜 20 mole%のPOPC、10 〜 60 mole%の DOPE、10 〜 60 mole%の MoCholおよび10 〜 50 mole%のCHEMSを含む。さらなる態様において、リポソームはPOPC、DOPE、MoCholおよび CHEMSをPOPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比約 6/24/47/23または15/45/20/20にて含む。さらに別の態様において、リポソームは3 〜 20 mole% の POPC、10 〜 40 mole% のDOPE、15 〜 60 mole% の MoCholおよび15 〜 60 mole%のDMGSuccを含む。さらなる態様において、リポソームは POPC、DOPE、DMGSucc および MoCholをPOPC/DOPE/DMGSucc/MoCholのモル比約 6/24/47/23または 6/24/23/47にて含む。さらに別の態様において、リポソームは10 〜 50 mole%の POPC、20 〜 60 mole%のChol、10 〜 40 mole% の CHEMS および 5 〜 20 mole% の DOTAPを含む。さらなる態様において、リポソームはPOPC、Chol、CHEMS および DOTAPをPOPC/Chol/CHEMS/DOTAPのモル比 約 30/40/20/10にて含む。さらに別の態様において、リポソームは10 〜 40 mole% のPOPC、20 〜 50 mole%のChol、5 〜 30 mole% の Cet-P および 10 〜 40 mole%のMoCholを含む。さらなる態様において、POPC/Chol/Cet-P/MoCholのモル比は約 35/35/10/20である。
第三の側面において、両性リポソーム混合物に含まれるDNAi オリゴヌクレオチドは配列番号1249 またはその部分にハイブリダイズするDNAi オリゴヌクレオチドを含む。別の態様において、DNAi オリゴヌクレオチドは配列番号1250、1251、1252、1253、1267-1447 またはそれらの相補鎖であり得る。さらに別の態様において、DNAi オリゴヌクレオチドは配列番号1250 または 1251 またはそれらの相補鎖であり得る。
本発明の両性リポソーム混合物はさらに、さらなるDNAi オリゴヌクレオチド、例えば、配列番号1250-1253および1270-1477、または配列番号2-281、283-461、463-935、937-1080、1082-1248 およびそれらの相補鎖からなる群から選択されるものを含むいずれかを含みうる。
別の態様において、リポソーム混合物に含まれるDNAi オリゴヌクレオチドは15から35 塩基対の長さである。
第四の側面において、両性リポソーム-DNAi オリゴヌクレオチド混合物は配列番号1250 または1251のDNAi オリゴヌクレオチドおよびPOPC、DOPE、MoCholおよびCHEMSをPOPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比約 6/24/47/23にて含む両性リポソームを含む。
第五の側面において、両性リポソーム-DNAi オリゴヌクレオチド混合物はDNAi オリゴヌクレオチド、PNT-100 ( 配列番号1251)、およびPOPC、DOPE、MoChol および CHEMSをPOPC/DOPE/MoChol/CHEMSのモル比約 15/45/20/20にて含む両性リポソームを含む。
第六の側面において、混合物の両性リポソームは50〜500 nmのサイズを含みうる。一つの態様において、サイズは 80 〜 300 nmであり、別の態様において、サイズは 90〜 200 nmである。
第七の側面において、両性リポソームは4 〜 8の等電点を有しうる。第六の側面のある態様において、両性リポソームはpH 7.4で負に荷電または中性であり得、pH 4で正に荷電しうる。
第八の側面において、両性リポソームは脂質濃度 10 〜 100 mM またはそれ以下にて少なくとも 約 2 mg/mlのDNAi オリゴヌクレオチド濃度を有する。
第九の側面において、本発明は、DNAi オリゴヌクレオチドを含む両性リポソームの調製方法を提供する。一つの態様において、方法は能動的搭載手順(active loading procedure)の使用を含み、別の態様において受動的搭載手順(passive loading procedure)を含む。さらなる態様において、方法は手動押出(extrusion)、機械押出、均質化(homogenization)、顕微溶液化またはエタノール注入を用いてリポソームを産生する。さらに別の態様において、方法は少なくとも 35%の封入効率を有する。
第十の側面において、本発明は、 DNAi オリゴヌクレオチド-両性リポソーム混合物を細胞または動物に導入する方法を提供する。 一つの態様において、方法は癌を治療するために哺乳類に混合物を投与することを含む。投与された混合物は哺乳類における腫瘍増殖を低下または停止しうる。別の態様において、混合物の導入の結果、細胞増殖の低下が導かれる。別の態様において、混合物は、癌細胞、非ヒト 動物またはヒトに投与される。さらなる態様において、混合物は動物に用量0.01 mg 〜 100 mg /kg体重にて導入される。さらに別の態様において、混合物は動物に１日１回以上または連続的に導入される。さらに別の態様において、混合物は動物に局所、肺または非経口投与または医療機器を介して導入される。さらに別の態様において、動物または細胞に投与される混合物はさらに化学療法薬、および/または細胞標的化成分を含む。
図面の簡単な説明
図 1は、SCIDマウスにおける非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片からの腫瘍サイズに対する、両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。
図 2は、SCIDマウスにおける非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片からの腫瘍サイズに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の異なるロットの効果を示す。
図 3は、両性リポソーム中に捕捉された配列番号1251で処理された非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片を担持するマウスにおける腫瘍負荷を示す。
図 4は、WSU-DLCL2 異種移植片担持マウスに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の２つの製剤の用量応答評価を示す。
図 5は、 WSU-DLCL2 異種移植片担持マウスに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の２つの製剤の用量応答評価の拡大図を示す。
図 6は、両性リポソームに捕捉された配列番号1251の２つの製剤により処理されたWSU-DLCL2 異種移植片担持マウスにおける用量応答動物体重評価を示す。
図 7は、ヌードマウスにおけるPC-3 異種移植片からの腫瘍サイズに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。
図 8は、ヌードマウスにおけるPC-3 異種移植片からの腫瘍の増殖速度に対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。
本発明のその他の特徴および利点は以下の詳細な説明、および請求項から明らかであろう。
配列の簡単な説明
配列番号1：c-erb-2 (her-2) 上流領域
配列番号2-281：c-erb-2 (her-2) DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号282：c-ki-ras 上流領域
配列番号283-461：c-ki-ras DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号462：c-Ha-ras 上流領域
配列番号463-935：c-Ha-ras DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号936：c-myc 上流領域
配列番号937-1080：c-myc DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号1081：TGF-α 上流領域
配列番号1082-1248：TGF-α DNAi オリゴヌクレオチド
配列番号1249：bcl-2 上流領域
配列番号1250：PNT-100 DNAi オリゴマー メチル化
配列番号1251：PNT-100 DNAi オリゴマー
配列番号1252：DNAi オリゴマー メチル化
配列番号1253：DNAi オリゴマー
配列番号1255：bcl-2 第２プロモーター配列
配列番号1256-1266：bcl-2 配列
配列番号1267-1477および1250-1254：bcl-2 DNAi オリゴマー
詳細な説明
I.定義
本発明の理解を助けるため、多数の用語を以下に定義する。
本明細書において用いる場合、「両性の」または「両性」特性とは、単一の物質 (例えば化合物)または物質の混合物 (例えば、２以上の化合物の混合物)または超分子複合体 (例えば、リポソーム)のいずれであれ、アニオン性とカチオン性特性の両方の荷電した基を含む構造をいい、ここで、
(i) 荷電した基の少なくとも１のpK が4〜8であり、
(ii)カチオン性電荷がpH 4にて優勢であり、
(iii)アニオン性電荷がpH 8にて優勢であり、
その結果、中性の正味の電荷pH 4〜 pH 8の等電点を有する。この定義による両性の特性は双性イオンの特性とは異なり、双性イオンは上記範囲の pKを有さない。その結果、双性イオンはpH値の範囲に渡って本質的に中性に荷電している。ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンは双性イオンの性質を有する中性脂質である。
本明細書において用いる場合、「両性の脂質対 I」とは安定なカチオンおよび荷電可能アニオンを含む脂質対をいう。例としては、限定されないが、 DDAB/CHEMS、DOTAP/CHEMSおよびDOTAP/DOPSが挙げられる。ある側面において、カチオン性脂質のアニオン性脂質に対するパーセント比は1未満である。
本明細書において用いる場合、「両性の脂質対 II」とは、 荷電可能カチオンおよび荷電可能アニオンを含む脂質対をいう。例としては、限定されないが Mo-Chol/CHEMS、DPIM/CHEMSまたはDPIM/DG-Succが挙げられる。ある側面において、カチオン性脂質のアニオン性脂質に対するパーセントの比は、約 5〜 0.2である。
本明細書において用いる場合、「両性の脂質対III」とは、荷電可能カチオンおよび安定なアニオンを含む脂質対をいう。例としては、限定されないが Mo-Chol/DOPGまたはMo-Chol/Chol-SO4が挙げられる。一つの態様において、カチオン性脂質のアニオン性脂質に対するパーセントの比は1を超える。
本明細書において用いる場合、「リポソーム」とは、通常水溶液に囲まれた複合体を形成する１以上の脂質をいう。リポソームは一般に、脂質、脂肪酸、脂質二層型構造、単層ベシクルおよび無定形脂質ベシクルを含む球状構造である。一般に、リポソームは水性体積を封入して含む完全に閉じた脂質二層膜である。リポソームは単層ベシクル(単一の二層膜を有する)、数重膜(oligolamellar)または多重膜 (複数の膜二重層を特徴とするタマネギ様構造であり、それぞれ隣の層と水層により隔てられている) であり得る。本発明のリポソームはまた下記に定義するDNAi オリゴヌクレオチドも含み、それはリポソームに結合しているか、リポソーム中またはリポソーム上に捕捉されている。分子としては、限定されないが、DNAi オリゴヌクレオチドおよび/または癌などの疾患を治療するのに用いられるその他の薬剤が挙げられる。
本明細書において用いる場合、「両性リポソーム」とは上記のような両性の特性を有するリポソームである。
本明細書において用いる場合、捕捉され、捕捉する、または捕捉、とはリポソームの脂質によるDNAi オリゴヌクレオチドの封入、組込み、または会合をいう。DNAi オリゴヌクレオチドは脂質二重層と会合していてもよいし、またはリポソームの内側の水層に存在していてもよいし、その両方でもよい。それはリポソームの水性コア中の封入も含む。それはまた、DNAi オリゴヌクレオチドの一部または全部がリポソームの水性コアに位置し、一部がリポソーム懸濁液の水相におけるリポソームの外側にある状況、DNAi オリゴヌクレオチドの一部がリポソームの水性コア内に位置し、一部がリポソームの脂質部分にあるか、一部がリポソーム外部に固着する状況も含み、ここでDNAi オリゴヌクレオチドがリポソームの脂質部分に部分的または完全に封入され、また、DNAi オリゴヌクレオチドの一部または全部がリポソームの外側に会合しているリポソームに会合するDNAi オリゴヌクレオチドを含む。
本明細書において用いる場合、受動的搭載手順 (PLP)は脂質の電荷がオリゴヌクレオチドの結合に有用でない場合にリポソームが DNAi オリゴヌクレオチドおよび/またはその他の分子により荷電するプロセスをいう。
進行型(Advanced)搭載手順 (ALP)はDNAi オリゴヌクレオチドに結合するために酸性 pHにて１つの脂質の正の電荷を利用するイオン交換プロセスである。
本明細書において用いる場合、「非ヒト動物」という用語はすべての非ヒト動物をいい、これらに限定されないが、脊椎動物、例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類等が挙げられる。
本明細書において用いる場合、「核酸分子」、「核酸配列」または「ポリヌクレオチド」という用語はあらゆる核酸含有分子をいい、これらに限定されないが、DNA または RNAが含まれる。ポリヌクレオチドという用語は、一般にポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、非修飾 RNAまたは DNA あるいは修飾 RNAまたはDNAであってもよい。したがって例えば、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドはとりわけ、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、および一本鎖および二本鎖領域の混合物である RNA、一本鎖またはより典型的には、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物でありうるDNA および RNAを含むハイブリッド分子である。
さらに、本明細書において用いる場合、「ポリヌクレオチド」は RNAまたは DNAあるいは RNA とDNAとの両方を含む三本鎖領域もいう。かかる領域における鎖は、同一の分子由来でも異なる分子由来でもよい。領域は１以上の分子のすべてを含むものでもよいが、典型的にはいくつかの分子の領域のみを含む。三重ヘリックス領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」または「核酸配列」という用語は１以上の修飾塩基を含むDNAまたはRNAを含む。したがって、安定性またはその他の理由で修飾されたバックボーンを有するDNAまたはRNA は本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」または「核酸配列」である。これらの用語はDNA およびRNAの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列も含む。
当業者に知られた多くの有用な目的を果たす多種多様な修飾が DNAおよび RNAになされてきたことが理解される。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で用いられる場合、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なDNA および RNAの化学的形態を含み、例えばとりわけ、単細胞および多細胞のものが含まれる。
「単離核酸配列」とは、それが由来する生物の天然のゲノムにそれが(一方は5′末端および一方は3’末端)直近に隣接しているコード配列のいずれかに直近していないポリヌクレオチドをいう。この用語はそれゆえ、例えば、ベクター; 自律複製プラスミド またはウイルス;あるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換え DNA、あるいはその他の配列と独立している別の分子 (例えば cDNA)として存在するDNAを含む。
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体 またはRNA(例えば、rRNA、tRNA)の産生に必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNA) 配列をいう。ポリペプチドは全長コード配列によってコードされてもよいし、全長または断片の所望の活性または機能的性質(例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性等) が保持される限りコード配列のいずれかの部分によってコードされてもよい。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域およびコード領域に先行または後続する配列 (リーダーおよびテーラー) 、および個々のコードセグメント(エキソン)の間の介在配列(イントロン)も含む。コード領域の5’ に位置し、mRNAの上に存在する配列は5’ 非翻訳配列と称される。コード領域の3’または下流に位置しmRNAの上に存在する配列は3’ 非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は遺伝子のcDNAとゲノム形態の両方を含む。遺伝子のゲノム形態またはクローンは「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列に分断されたコード領域を含む。イントロンは核内RNA (hnRNA)に転写される遺伝子のセグメントである; イントロンは調節要素、例えば、エンハンサーを含みうる。イントロンは核内または一次転写産物から除去または「スプライスアウト」される; イントロンはそれゆえメッセンジャー RNA (mRNA) 転写産物には存在しない。翻訳の際にmRNAは新生ポリペプチドにおける配列即ちアミノ酸の順序を特定するよう機能する。
本明細書において用いる場合、「遺伝子発現」という用語は、遺伝子にコードされる遺伝情報をRNA (例えば、mRNA、rRNA、tRNA、シクロRNAまたは snRNA)に遺伝子の「転写」を介して (即ち、RNA ポリメラーゼの酵素作用を介して)、および、タンパク質をコードする遺伝子を、mRNAの「翻訳」を介してタンパク質に変換する過程をいう。遺伝子発現はかかる過程の多くの段階で調節されうる。「上方制御」または「活性化」は遺伝子発現産物(即ち、RNA またはタンパク質)の産生を上昇させる調節をいい、「下方制御」または「抑制」は産生を低下させる調節をいう。上方制御または下方制御に関与する分子(例えば、転写因子)はしばしば「活性化因子」および「抑制因子」とそれぞれ称される。
イントロンを含むのに加えて、ゲノム形態の遺伝子は、RNA 転写産物に存在する配列の5’および3’末端の両方の上に位置する配列を含みうる。かかる配列は「隣接」配列または領域と称される(これら隣接配列はmRNA 転写産物の上に存在する非翻訳配列に対して5’または3’に位置する)。5’ 隣接領域(または上流領域)は遺伝子の転写を制御または影響する調節配列、例えば、プロモーターおよびエンハンサーを含みうる。3’ 隣接領域は、転写終結、転写後切断およびポリアデニル化を導く配列を含みうる。
本明細書において用いる場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA 配列」および「をコードするDNA」とは、デオキシリボ核酸の鎖にそったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序はポリペプチド (タンパク質) 鎖にそったアミノ酸の順序を決定する。DNA 配列 はしたがってアミノ酸配列をコードする。
本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、しばしば３より多い、通常１０より多い２以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを有する分子と定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは 多くの因子に依存し、例えば、オリゴヌクレオチドの最終的機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、あらゆる好適な方法、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限および方法、例えばNarang et al.、1979、Meth. Enzymol.、68:90-99の ホスホトリエステル方法; Brown et al.、1979、Method Enzymol.、68:109-151の ホスホジエステル方法、Beaucage et al.、1981、Tetrahedron Lett.、22:1859-1862のジエチルホスホラミダイト方法 ; Matteucci et al.、1981、J. Am. Chem. Soc.、103:3185-3191のトリエステル方法または自動合成方法および米国特許4,458,066号の固体支持体方法による直接化学合成により調製できる。
本明細書において用いる場合、「DNAi オリゴヌクレオチド」または「DNAi」とは、一本鎖核酸オリゴヌクレオチドまたはその誘導体であって、その配列が、そのなかのオリゴヌクレオチドが間接的または直接的に同じまたは異なる遺伝子の発現、制御 または産生に影響する、最も長い遺伝子の非転写領域の一部に部分的には相補的であるものであり、ここで最も長い非転写領域は、転写開始部位が翻訳開始部位にもっとも近い部位である場合、転写されない遺伝子のあらゆる部分を含む。 DNAiは mRNAまたはプレ-mRNAとのみ塩基対形成し、RNA プロセシング および/またはメッセンジャー翻訳と干渉するRNAiおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない。
メチル化 DNAi オリゴヌクレオチドを使用するある態様において、本発明の教示のように ヌクレオチド、dCが適宜5-メチル-dCに置換される。
DNAi オリゴヌクレオチドは、限定されないが、以下に記載するようなオリゴヌクレオチド模倣体を含みうる。本発明によるDNAi オリゴヌクレオチド 化合物は約 15 〜 約 35 核酸塩基 (即ち、約 15 〜 約 35の結合した塩基)を含みうるが、より長いおよびより短い配列も本発明に有用である。
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基 (当該技術分野において単に「塩基」としばしば称される) 修飾または置換も含みうる。本明細書において用いる場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン (A)およびグアニン (G)、およびピリミジン塩基であるチミン (T)、シトシン (C)およびウラシル (U)が含まれる。修飾核酸塩基には、その他の合成および天然核酸塩基が含まれる。
ある態様において、DNAi オリゴヌクレオチドは遺伝子のプロモーター領域にハイブリダイズしうる。ある態様において、プロモーターへのDNAi オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは遺伝子発現を阻害する。
「プロモーター」とは、転写を引き起こすのに十分な配列を意味し、プロモーター-依存的遺伝子発現を細胞-型特異的、組織特異的に制御可能な、または外部シグナルまたは薬剤によって誘導可能なものとするのに十分なプロモーター要素が含まれ;かかる要素は遺伝子の5′または3′領域に位置しうる。構成的および誘導可能プロモーターの両方がこの定義に含まれる (例えば、Bitter et al.、Methods in Enzymology 153:516-544、1987参照)。例えば、細菌系におけるクローニングにおいては、誘導可能プロモーター、例えば、バクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac (ptrp-lac ハイブリッドプロモーター) 等が有用であり得る。哺乳類細胞系におけるクローニングにおいては、哺乳類細胞ゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネイン プロモーター) または哺乳類ウイルス由来プロモーター(例えば、レトロウイルス 末端反復配列; アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス 7.5K プロモーター)が有用であり得る。組換え DNAまたは合成技術により作られたプロモーターもプロモーターとして定義される。
本明細書において用いる場合、遺伝子の「調節領域」は遺伝子の発現を調節する遺伝子のあらゆる部分であり、これらに限定されないが、転写調節および翻訳調節が含まれる。かかる領域にはこれらに限定されないが、遺伝子の 5’および3’ 領域、調節因子の結合部位、例えば、これらに限定されないが転写因子結合部位が含まれる。かかる領域にはまた、領域が遺伝子発現の調節になんらかの様式で関与する限り、翻訳開始部位の上流または下流の20,000またはそれ以上の塩基対である領域が含まれる。かかる領域は20 塩基対といった短いものでありうるし、数千塩基対といった長いものであることもある。
「形質転換」または「形質移入」とは、新しい DNA(即ち、細胞にとって異種のDNA)の組込みの後に細胞に誘導される永続的または一過性の遺伝的変化をいう。細胞が哺乳類細胞である場合、永続的遺伝的変化は一般にDNAの細胞のゲノムへの導入により達成される。
「形質転換細胞」または「宿主細胞」は、本発明のポリペプチド(即ち、 Methuselah ポリペプチド)をコードするDNA 分子またはその断片が組換え DNA技術によって細胞に (またはその祖先に) 導入されている細胞 (例えば、原核細胞または真核細胞)をいう。
宿主細胞の組換え DNAによる形質転換は当業者に周知の常套技術によって行うことが出来る。宿主が原核細胞、例えば大腸菌である場合、DNA 取り込みが可能なコンピテント細胞を対数増殖期の後に回収した細胞をCaCl2法によって当該技術分野で周知の手順によって処理することから調製することができる。 あるいは、MgCl2または RbClも利用できる。形質転換は宿主細胞のプロトプラストの形成後、またはエレクトロポーレーションによっても行うことが出来る。
本明細書において用いる場合、「相補的」または「相補性」という用語は塩基対形成則によって関連するポリヌクレオチド (即ちヌクレオチド配列)に言及する場合に用いられる。例えば、配列「A-G-T」は配列 「T-C-A」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、この場合、核酸塩基のいくつかのみが塩基対形成則にしたがってマッチする。あるいはそれは核酸間の「完全」または「トータル」な相補性であってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を有する。
本明細書において用いる場合、「完全に相補的」という用語は、 例えば本発明のDNAiオリゴヌクレオチドについて用いる場合、ヌクレオチドのすべてが標的配列(例えば、遺伝子)に相補的であるオリゴヌクレオチドをいう。
本明細書において用いる場合、「部分的に相補的」という用語は、少なくとも１つのヌクレオチドが標的配列に相補的ではない配列をいう。好ましい部分的に相補的な配列は生理条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるものである。「部分的に相補的」という用語は配列の内部またはいずれかの末端に１以上の非相補的ヌクレオチドの領域を有する配列をいう。末端にミスマッチを有する配列は標的配列にハイブリダイズすることが可能である。
「相同性」という用語は相補性の程度を言う。部分的相同性または完全相同性 (即ち、同一性)があり得る。部分的に相補的な配列は完全に相補的な核酸分子が標的核酸へハイブリダイズを少なくとも部分的に阻害する核酸分子であって、「実質的に相同的」である。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害はハイブリダイゼーションアッセイ (サザンまたはノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等)を用いて低いストリンジェンシーの条件下で調べることが出来る。実質的に相同的な配列またはプローブは完全に相同的な核酸分子の標的への結合(即ちハイブリダイゼーション) について低いストリンジェンシーの条件下で競合および阻害する。同様に実質的に相補的な配列またはプローブは完全に相同的な核酸分子の標的への結合(即ちハイブリダイゼーション) について低いストリンジェンシーの条件下で競合および阻害する。これは低いストリンジェンシーの条件が非特異的結合を許容するという意味ではない; 低いストリンジェンシーの条件は２つの配列の互いへの結合が特異的(即ち、選択的) 相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は実質的に非相補的(例えば、約 30%未満の同一性)である第二の標的の使用により試験できる; 非特異的結合の非存在下では、プローブは第二の非相補的標的にハイブリダイズしない。
二本鎖核酸配列、例えば、cDNAまたはゲノムクローンについて用いる場合、「実質的に相同的」という用語は、上記のように低いストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができるプローブをいう。
一本鎖核酸配列について用いる場合、「実質的に相同的」という用語は、上記のように低いストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸配列にハイブリダイズできる(即ちそれが相補鎖である)プローブをいう。
本明細書において用いる場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は相補的核酸の対形成について用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(即ち、核酸の間の結合強度)は核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、および核酸内の G:C比などの因子に影響される。その構造内に相補的核酸の対形成を含む一分子は「自己ハイブリダイズしている」といわれる。
本明細書において用いる場合、「Tm」という用語は「融解温度」について用いられる。融解温度は二本鎖核酸分子の集団の半分が解離して一本鎖となる温度である。核酸のTmの計算式は当該技術分野で周知である。標準的参考文献に示されるように、Tm値の簡単な評価はTm= 81.5 + 0.41(% G + C)という式により計算でき、ここで核酸は1 M NaCl水溶液中にある (例えば、Anderson and Young、Quantitative Filter Hybridization、in Nucleic Acid Hybridization [1985]参照)。その他の参考文献はTmの計算に構造および配列特性を考慮するより洗練された式を含む。
完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害はハイブリダイゼーションアッセイ (サザンまたはノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等)を用いて低いストリンジェンシーの条件下で調べることが出来る。実質的に相同的な配列またはプローブは完全に相同的な核酸分子の標的への結合(即ちハイブリダイゼーション) について低いストリンジェンシーの条件下で競合および阻害する。これは低いストリンジェンシーの条件が非特異的結合を許容するという意味ではない; 低いストリンジェンシーの条件は２つの配列の互いへの結合が特異的(即ち、選択的) 相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は実質的に非相補的(例えば、約 30%未満の同一性)である第二の標的の使用により試験できる; 非特異的結合の非存在下では、プローブは第二の非相補的標的にハイブリダイズしない。
二本鎖核酸配列、例えば、cDNAまたはゲノムクローンについて用いる場合、「実質的に相同的」という用語は、上記のように低いストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができるプローブをいう。
本明細書において用いる場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、およびその他の化合物、例えば、 有機溶媒の存在といった条件について用いられる。「低いストリンジェンシーの条件」下では、目的核酸配列はその正確な相補鎖、一塩基ミスマッチを有する配列、非常に近い配列 (例えば、90% またはそれ以上の相同性を有する配列)、および部分的相同性のみを有する配列(例えば、50-90% 相同性の配列)にハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントな条件」下では、目的核酸配列は、その正確な相補鎖、一塩基ミスマッチを有する配列、および非常に近い配列(例えば、90% またはそれ以上の相同性)にのみハイブリダイズする。「高度にストリンジェントな条件」下では、目的核酸配列はその正確な相補鎖および (温度などの条件に応じて)一塩基ミスマッチを有する配列のみにハイブリダイズする。換言すると、高度にストリンジェントな条件下では一塩基ミスマッチを有する配列へのハイブリダイゼーションを避けるために温度を上げるとよい。
本明細書において用いる場合、「生理的条件」という用語は動物(例えば、ヒト)の内部に近いまたは同じの特定のストリンジェンシーの条件をいう。インビトロに使用する例示的な生理的条件としては、これらに限定されないが、37℃、95% 空気、5% CO2、哺乳類細胞培養のための市販培地(例えば、Gibco、MD から入手可能なDMEM 培地)、5-10% 血清 (例えば、ウシ血清またはウマ血清)、さらなるバッファーそして所望により、ホルモン(例えば、インスリンおよび上皮増殖因子)が挙げられる。
「単離」という用語は、その天然状態から「人間の手により」改変されていることをいう。即ちそれが天然に存在する場合、それはその元の環境から改変または取り出されているかあるいはその両方である。例えば、「単離オリゴヌクレオチド」または「単離ポリヌクレオチド」というように核酸について用いる場合、その天然源においては通常付随している少なくとも１つの成分または汚染物質から同定および分離されている核酸配列をいう。単離核酸はそれが天然でみられるものとは異なる形態または設定において存在する。一方、例えば、 DNA や RNA等の核酸といった非単離核酸はそれが天然に存在する状態でみられる。例えば、所与の DNA 配列 (例えば、遺伝子)は宿主細胞染色体上に隣接遺伝子に近接してみられ; RNA 配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA 配列は多数のタンパク質をコードする多数のその他のmRNAとの混合物として細胞中にみられる。しかし、所与のタンパク質をコードする単離核酸には、例えば、所与のタンパク質を通常発現する細胞中の核酸であって、その核酸が天然細胞とは異なる染色***置にある、または天然に見られるものとは異なる核酸配列に隣接されているものが含まれる。単離核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖形態で存在しうる。単離核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをタンパク質の発現に用いる場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは最小限センスまたはコード鎖 (即ちオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であり得る)を含むが、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含み得る(即ち、 オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であり得る)。
本明細書において用いる場合、「精製」または「精製する」という用語はサンプルからの成分(例えば、汚染物質)の除去をいう。例えば、組換えポリペプチドは細菌宿主細胞で発現され、ポリペプチドは宿主細胞タンパク質の除去により精製される; 組換えポリペプチドのパーセントはそれゆえサンプルにおいて上昇する。
本明細書において用いる場合、「細胞培養」という用語はあらゆるインビトロ細胞培養をいう。この用語には、 連続細胞株 (例えば、不死表現型のもの)、初代細胞培養、形質転換細胞株、有限細胞株 (例えば、非形質転換細胞)、およびあらゆるその他のインビトロで維持されている細胞集団が含まれる。
本明細書で用いる場合、「真核生物」という用語は「原核生物」と区別される生物をいう。この用語は真核生物の通常の特徴、例えば、核膜によって結合された真の核の存在、その中に存在する染色体、膜結合オルガネラの存在、およびその他の真核生物に通常観察される特徴を示す細胞を有するあらゆる生物を含む意図である。したがってこの用語は、これらに限定されないが、真菌、原生動物、および動物 (例えば、ヒト)などの生物を含む。
本明細書において用いる場合、「インビトロ」という用語は、人工環境および人工環境内で起こる過程または反応をいう。インビトロ環境は、これらに限定されないが、試験管および細胞培養からなりうる。「インビボ」という用語は天然環境 (例えば、動物または細胞)および天然環境内で起こる過程または反応をいう。
本明細書において用いる場合、「遺伝子の発現が阻害される条件下」という用語は、本発明のDNAi オリゴヌクレオチドが遺伝子(例えば、遺伝子のプロモーター領域)にハイブリダイズし、遺伝子の転写をオリゴヌクレオチドの非存在下での転写レベルと比較して少なくとも 10%、少なくとも 25%、少なくとも 50%、または少なくとも 90%阻害する条件をいう。
本明細書において用いる場合、「細胞の成長が低下する条件下」という用語は、本発明のDNAi オリゴヌクレオチドを細胞 (例えば、癌)に投与した場合に細胞の成長速度をオリゴヌクレオチドの非存在下での細胞の成長速度と比較して少なくとも 10%、少なくとも 25%、少なくとも 50% または 少なくとも 90%低下させる条件をいう。
「被験化合物」および「候補化合物」という用語は疾患、病気、不調、または身体機能の障害 (例えば、癌)の治療または予防に使用するための候補であるあらゆる化学的実体、医薬、薬物等をいう。被験化合物は既知のおよび潜在的な治療化合物の両方を含む。被験化合物は本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングにより治療薬であるかどうか判定されうる。本発明のある態様において、混合物は被験化合物としてDNAi オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンス化合物または化学療法薬を含む。
本明細書において用いる場合、「化学治療薬」という用語は、疾患(例えば、癌)の治療に有用な化合物をいう。癌に対して有効な例示的な化学治療薬としては、これらに限定されないが、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン 、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロフォスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン (CA)、5-フルオロウラシル (5-FU)、フロクスウリジン (5-FUdR)、メトトレキサート (MTX)、コルヒチン、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール (DES)が挙げられる。
本発明の目的では、化学元素は、 Periodic Table of the Elements、CAS version、Handbook of Chemistry and Physics、75th Edにしたがって同定される。さらに、有機化学の一般原理は、"Organic Chemistry"、Thomas Sorrell、University Science Books、Sausalito: 1999、および"March’s Advanced Organic Chemistry "、5th Ed.、Ed.: Smith、M.B. and March、J.、John Wiley & Sons、New York: 2001に記載されている。
本明細書において用いる場合、「脂肪族」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニルという用語を含み、そのそれぞれは以下に記載のように置換されていてもよい。
本明細書において用いる場合、「アルキル」基は、1-8 (例えば、1-6または1-4)の炭素原子を含む飽和脂肪族炭化水素基をいう。アルキル基は直鎖状であっても分枝状であってもよい。アルキル基の例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、n-ヘプチルまたは2-エチルヘキシルが挙げられる。アルキル基は１以上の例えば以下のような置換基によって置換されていてもよい(即ち、任意に置換されている）： ハロ、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アロイル、ヘテロアロイル、シクロ脂肪族カルボニル、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル、ニトロ、シアノ、アミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルフィニル、スルファニル、スルフォキシ、ウレア、チオウレア、スルファモイル、スルファミド、オキソ、カルボキシ、カルバモイル、シクロ脂肪族オキシ、ヘテロシクロ脂肪族オキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアリールアルコキシ、またはヒドロキシ。これらに限定されないが、置換アルキルの例としては、カルボキシアルキル (例えば、 HOOC-アルキル、アルコキシカルボニルアルキルおよびアルキルカルボニルオキシアルキル)、シアノアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アシルアルキル、ヒドロキシアルキル、アラルキル、(アルコキシアリール)アルキル、(スルホニルアミノ)アルキル (例えば、 (アルキルスルホニルアミノ)アルキル)、アミノアルキル、アミドアルキル、(シクロ脂肪族)アルキル、シアノアルキル、またはハロアルキルが挙げられる。
本明細書において用いる場合、「アルケニル」基とは、2-8(例えば、2-6 または2-4)の炭素原子を含み、少なくとも１つの二重結合を含む脂肪族炭素基をいう。アルキル基と同様に、アルケニル基は直鎖状であっても分枝状であってもよい。アルケニル基の例としては、これらに限定されないが、アリル、イソプレニル、2-ブテニルおよび2-ヘキセニルが挙げられる。 アルケニル基は例えば、以下のような１以上の置換基によって置換されていてもよい：ハロ、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アロイル、ヘテロアロイル、(シクロ脂肪族)カルボニル、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル、ニトロ、シアノ、アミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルフィニル、スルファニル、スルフォキシ、ウレア、チオウレア、スルファモイル、スルファミド、オキソ、カルボキシ、カルバモイル、(シクロ脂肪族)オキシ、(ヘテロシクロ脂肪族)オキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、(ヘテロアリール)アルコキシ、またはヒドロキシ。
本明細書において用いる場合、「アルキニル」基は、2-8 (例えば、2-6または2-4)の炭素原子を含み、少なくとも１つの三重結合を有する脂肪族炭素基をいう。アルキニル基は直鎖状であっても分枝状であってもよい。アルキニル基の例としては、これらに限定されないが、プロパルギルおよびブチニルが挙げられる。アルキニル基は例えば、以下のような１以上の置換基によって置換されていてもよい：ハロ、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アロイル、ヘテロアロイル、(シクロ脂肪族)カルボニル、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル、ニトロ、シアノ、アミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルフィニル、スルファニル、スルフォキシ、ウレア、チオウレア、スルファモイル、スルファミド、オキソ、カルボキシ、カルバモイル、(シクロ脂肪族)オキシ、(ヘテロシクロ脂肪族)オキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、(ヘテロアリール)アルコキシ、またはヒドロキシ。
本明細書において用いる場合、「アミド」には「アミノカルボニル」と「カルボニルアミノ」の両方が含まれる。これらの用語は単独でまたは別の基と組み合わせて用いられて、末端に用いられる場合、アミド基、例えば、 N(RX)2-C(O)- またはRYC(O)-N(RX)2-を意味し、内部に用いられる場合-C(O)-N(RX)-または-N(RX)-C(O)- を意味し、ここでRXおよび RY は以下に定義する。アミド基の例としては、アルキルアミド (例えば、アルキルカルボニルアミノおよびアルキルカルボニルアミノ)、(ヘテロシクロ脂肪族) アミド、(ヘテロアラルキル) アミド、(ヘテロアリール) アミド、(ヘテロシクロアルキル)アルキルアミド、アリールアミド、アラルキルアミド、(シクロアルキル)アルキルアミド、およびシクロアルキルアミドが挙げられる。
本明細書において用いる場合、「アミノ」基は-NRXRY をいい、ここで RXおよび RY のそれぞれは独立に、水素、アルキル、シクロ脂肪族、(シクロ脂肪族)脂肪族、アリール、アラリファティック、ヘテロシクロ脂肪族、(ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族、ヘテロアリール、カルボキシ、スルファニル、スルフィニル、スルホニル、(脂肪族)カルボニル、(シクロ脂肪族)カルボニル、((シクロ脂肪族)脂肪族)カルボニル、アリールカルボニル、(アラリファティック)カルボニル、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル、((ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族)カルボニル、(ヘテロアリール)カルボニル、または(ヘテロアラリファティック)カルボニルを意味し、これらはそれぞれ本明細書に定義される通りであり、置換されていてもよい。アミノ基の例としては、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびアリールアミノが挙げられる。
「アミノ」という用語が末端基(例えば、アルキルカルボニルアミノ)ではない場合、それは-NRX-によって表される。 RXは上記と同義である。
本明細書において用いる場合、「アリール」基は単独でまたはより大きな部分、例えば「アラルキル」、「アラルコキシ」または「アリールオキシアルキル」の一部として用いられて、単環式(例えば、フェニル); 二環式(例えば、インデニル、ナフタレニル、テトラヒドロナフチル、テトラヒドロインデニル);および三環式 (例えば、フルオレニル、テトラヒドロフルオレニル、またはテトラヒドロアントラセニル、アントラセニル)を意味する。二環式 および三環式基には、ベンゾ縮合 2-3 員環炭素環が含まれる。例えば、ベンゾ縮合基には、２以上の C4-8 炭素環部分と縮合したフェニルが含まれる。アリールは 以下を含む１以上の置換基により置換されていてもよい：脂肪族 [例えば、アルキル、アルケニルまたはアルキニル]; シクロ脂肪族; (シクロ脂肪族)脂肪族; ヘテロシクロ脂肪族; (ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族; アリール; ヘテロアリール; アルコキシ; (シクロ脂肪族)オキシ; (ヘテロシクロ脂肪族)オキシ; アリールオキシ; ヘテロアリールオキシ; (アラリファティック)オキシ; (ヘテロアラリファティック)オキシ; アロイル; ヘテロアロイル; アミノ; オキソ (ベンゾ縮合二環式または三環式アリールの非芳香族炭素環上); ニトロ; カルボキシ; アミド; アシル [例えば、脂肪族カルボニル; (シクロ脂肪族)カルボニル; ((シクロ脂肪族)脂肪族)カルボニル; (アラリファティック)カルボニル; (ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル; ((ヘテロシクロ脂肪族) 脂肪族)カルボニル;および(ヘテロアラリファティック)カルボニル]; スルホニル [例えば、脂肪族スルホニルおよびアミノスルホニル]; スルフィニル [例えば、脂肪族スルフィニル]; スルファニル [例えば、脂肪族スルファニル]; ニトロ; シアノ; ハロ; ヒドロキシル; メルカプト; スルフォキシ; ウレア; チオウレア; スルファモイル; スルファミド;およびカルバモイル。あるいは アリールは非置換でもよい。
置換アリールの非限定的な例としては、以下が挙げられる：ハロアリール [例えば、モノ-、ジ( 例えば、p,m-ジハロアリール)、および(トリハロ)アリール]; (カルボキシ)アリール [例えば、(アルコキシカルボニル)アリール、((アリールアルキル)カルボニルオキシ)アリール、および(アルコキシカルボニル)アリール]; (アミド)アリール [例えば、(アミノカルボニル)アリール、(((アルキルアミノ)アルキル)アミノカルボニル)アリール、(アルキルカルボニル)アミノアリール、(アリールアミノカルボニル)アリール、および (((ヘテロアリール)アミノ)カルボニル)アリール]; アミノアリール [例えば、((アルキルスルホニル)アミノ)アリールおよび ((ジアルキル)アミノ)アリール]; (シアノアルキル)アリール; (アルコキシ)アリール; (スルファモイル)アリール [例えば、(アミノスルホニル)アリール]; (アルキルスルホニル)アリール; (シアノ)アリール; (ヒドロキシアルキル)アリール; ((アルコキシ)アルキル)アリール; (ヒドロキシル)アリール、((カルボキシ)アルキル)アリール; (((ジアルキル)アミノ)アルキル)アリール; (ニトロアルキル)アリール; (((アルキルスルホニル)アミノ)アルキル)アリール; ((ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル)アリール; ((アルキルスルホニル)アルキル)アリール; (シアノアルキル)アリール; (ヒドロキシアルキル)アリール; (アルキルカルボニル)アリール; アルキルアリール; (トリハロアルキル)アリール; p-アミノ-m-アルコキシカルボニルアリール; p-アミノ-m-シアノアリール; p-ハロ-m-アミノアリール;および(m-(ヘテロシクロ脂肪族)-o-(アルキル))アリール。
本明細書において用いる場合、「アラリファティック」、例えば、「アラルキル」基は、アリール基で置換された脂肪族基(例えば、C1-4 アルキル 基)をいう。「脂肪族」、「アルキル」および「アリール」は上記定義の通りである。アラリファティック、例えば、アラルキル基の例は、ベンジルである。
本明細書において用いる場合、「二環系」は、２つの環を形成する8-12(例えば、9、10、または11)員環構造を含み、ここで２つの環は少なくとも１原子を共有する (例えば、、2原子を共有する）。二環系にはビシクロ脂肪族(例えば、ビシクロアルキルまたはビシクロアルケニル)、ビシクロヘテロ脂肪族、二環式アリールおよび二環式ヘテロアリールが含まれる。
本明細書において用いる場合、「シクロ脂肪族」基には、「シクロアルキル」基と「シクロアルケニル」基が含まれ、そのそれぞれは以下に示すように置換されていてもよい。
本明細書において用いる場合、「シクロアルキル」基は3-10 (例えば、5-10) 炭素原子の飽和炭素環単環または二環式 (縮合または架橋) 環をいう。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、アダマンチル、ノルボニル、キュビル、オクタヒドロ-インデニル、デカヒドロ-ナフチル、ビシクロ[3.2.1]オクチル、ビシクロ[2.2.2]オクチル、ビシクロ[3.3.1]ノニル、ビシクロ[3.3.2.]デシル、ビシクロ[2.2.2]オクチル、アダマンチル、アザシクロアルキル、または((アミノカルボニル)シクロアルキル)シクロアルキルが挙げられる。本明細書において用いる場合、「シクロアルケニル」基は、１以上の二重結合を有する3-10(例えば、4-8) 炭素原子の非芳香族炭素環をいう。シクロアルケニル基の例としては、シクロペンテニル、1,4-シクロヘキサ-ジ-エニル、シクロへプテニル、シクロオクテニル、ヘキサヒドロ-インデニル、オクタヒドロ-ナフチル、シクロヘキセニル、シクロペンテニル、ビシクロ[2.2.2]オクテニル、およびビシクロ[3.3.1]ノネニルが挙げられる。
シクロアルキルまたはシクロアルケニル基は１以上の置換基によって置換されていてもよく、置換基としては、例えば、 以下が挙げられる：脂肪族 [例えば、アルキル、アルケニル、またはアルキニル]、シクロ脂肪族、(シクロ脂肪族) 脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、(ヘテロシクロ脂肪族) 脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、(シクロ脂肪族)オキシ、(ヘテロシクロ脂肪族)オキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(アラリファティック)オキシ、(ヘテロアラリファティック)オキシ、アロイル、ヘテロアロイル、アミノ、アミド [例えば、(脂肪族)カルボニルアミノ、(シクロ脂肪族)カルボニルアミノ、((シクロ脂肪族)脂肪族)カルボニルアミノ、(アリール)カルボニルアミノ、(アラリファティック)カルボニルアミノ、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニルアミノ、((ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族)カルボニルアミノ、(ヘテロアリール)カルボニルアミノ、および(ヘテロアラリファティック)カルボニルアミノ]、ニトロ、カルボキシ [例えば、HOOC-、アルコキシカルボニル、およびアルキルカルボニルオキシ]、アシル [例えば、(シクロ脂肪族)カルボニル、((シクロ脂肪族) 脂肪族)カルボニル、(アラリファティック)カルボニル、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル、((ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族)カルボニル、および(ヘテロアラリファティック)カルボニル]、ニトロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、スルホニル[例えば、アルキルスルホニルおよびアリールスルホニル]、スルフィニル [例えば、アルキルスルフィニル]、スルファニル [例えば、アルキルスルファニル]、スルフォキシ、ウレア、チオウレア、スルファモイル、スルファミド、オキソ、またはカルバモイル。
本明細書において用いる場合、「環状部分」には、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、またはヘテロアリールが含まれ、そのそれぞれは上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「ヘテロシクロ脂肪族」という用語は、ヘテロシクロアルキル基とヘテロシクロアルケニル基とを含み、そのそれぞれは以下に示すように置換されていてもよい。
本明細書において用いる場合、「ヘテロシクロアルキル」基は、3-10 員環の単環または二環(縮合または架橋)(例えば、5-10-員環単環式または二環式) 飽和環構造であって、１以上の環原子がヘテロ原子 (例えば、N、O、S、またはそれらの組合せ)である構造をいう。ヘテロシクロアルキル基の例としては、ピペリジル、ピペラジル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフリル、1,4-ジオキソラニル、1,4-ジチアニル、1,3-ジオキソラニル、オキサゾリジル、イソキサゾリジル、モルホリニル、チオモルホリル、オクタヒドロ-ベンゾフリル、オクタヒドロ-クロメニル、オクタヒドロ-チオクロメニル、オクタヒドロ-インドリル、オクタヒドロ-ピリジニル、デカヒドロ-キノリニル、オクタヒドロ-ベンゾ[b]チオフェネイル、2-オキサ-ビシクロ[2.2.2]オクチル、1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクチル、3-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクチル、および2,6-ジオキサ-トリシクロ[3.3.1.03,7]ノニルが挙げられる。単環式ヘテロシクロアルキル基はフェニル部分、例えば、テトラヒドロイソキノリンと縮合していてもよい。本明細書において用いる場合、「ヘテロシクロアルケニル」基は、１以上の二重結合を有する単環または二環(例えば、5- 10-員環単環式または二環式) 非芳香族環構造であって、１以上の環原子がヘテロ原子(例えば、N、O、またはS)である構造をいう。単環式およびビシクロヘテロ脂肪族は標準化学命名法にしたがって番号付けする。
ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルケニル基は例えば、以下のような１以上の置換基によって置換されていてもよい：脂肪族 [例えば、アルキル、アルケニル、またはアルキニル]、シクロ脂肪族、(シクロ脂肪族) 脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、(ヘテロシクロ脂肪族) 脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、(シクロ脂肪族)オキシ、(ヘテロシクロ脂肪族)オキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、(アラリファティック)オキシ、(ヘテロアラリファティック)オキシ、アロイル、ヘテロアロイル、アミノ、アミド [例えば、(脂肪族)カルボニルアミノ、(シクロ脂肪族)カルボニルアミノ、((シクロ脂肪族) 脂肪族)カルボニルアミノ、(アリール)カルボニルアミノ、(アラリファティック)カルボニルアミノ、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニルアミノ、((ヘテロシクロ脂肪族) 脂肪族)カルボニルアミノ、(ヘテロアリール)カルボニルアミノ、および(ヘテロアラリファティック)カルボニルアミノ]、ニトロ、カルボキシ [例えば、HOOC-、アルコキシカルボニル、およびアルキルカルボニルオキシ]、アシル [例えば、(シクロ脂肪族)カルボニル、((シクロ脂肪族) 脂肪族)カルボニル、(アラリファティック)カルボニル、(ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル、((ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族)カルボニル、および (ヘテロアラリファティック)カルボニル]、ニトロ、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、スルホニル [例えば、アルキルスルホニルおよび アリールスルホニル]、スルフィニル[例えば、アルキルスルフィニル]、スルファニル [例えば、アルキルスルファニル]、スルフォキシ、ウレア、チオウレア、スルファモイル、スルファミド、オキソ、または カルバモイル。
本明細書において用いる場合、「ヘテロアリール」基は、4-15の環原子を有する単環式、二環式、または三環式環構造であって、１以上の環原子がヘテロ原子(例えば、N、O、S、またはそれらの組合せ) であり、二環式または三環式環構造の１以上の環が芳香族である構造をいう。ヘテロアリール基には2〜3の環を有するベンゾ縮合環系が含まれる。例えば、ベンゾ縮合基としては、１または２の 4〜 8 員環ヘテロシクロ脂肪族部分(例えば、インドリジル、インドリル、イソインドリル、3H-インドリル、インドリニル、ベンゾ[b]フリル、ベンゾ[b]チオフェニル、キノリニル、またはイソキノリニル)とのベンゾ縮合が挙げられる。ヘテロアリールの例としては、アゼチジニル、ピリジル、1H-インダゾリル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、 テトラゾリル、ベンゾフリル、イソキノリニル、ベンズチアゾリル、キサンテン、チオキサンテン、フェノチアジン、ジヒドロインドール、ベンゾ[1,3]ジオキソール、ベンゾ[b]フリル、ベンゾ[b]チオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、 プリル、シンノリル、キノリル、キナゾリル、シンノリル、フタラジル、キナゾリル、キノキサリル、イソキノリル、4H-キノリジル、ベンゾ-1,2,5-チアジアゾリルまたは1,8-ナフチリジルが挙げられる。
これらに限定されないが、単環式ヘテロアリールとしては、フリル、チオフェニル、2H-ピロリル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、2H-ピラニル、4-H-プラニル、ピリジル、ピリダジル、ピリミジル、ピラゾリル、ピラジル、または1,3,5-トリアジルが挙げられる。単環式ヘテロアリールは標準化学命名法にしたがって番号付けされる。
これらに限定されないが、二環式ヘテロアリールとしては、インドリジル、インドリル、イソインドリル、3H-インドリル、インドリニル、ベンゾ[b]フリル、ベンゾ[b]チオフェニル、キノリニル、イソキノリニル、インダゾリル、ベンズイミダジル、ベンズチアゾリル、プリニル、4H-キノリジル、キノリル、イソキノリル、シンノリル、フタラジル、キナゾリル、キノキサリル、1,8-ナフチリジル、またはプテリジルが挙げられる。二環式ヘテロアリールは標準化学命名法にしたがって番号付けされる。
ヘテロアリールは例えば以下のような１以上の置換基によって置換されていてもよい：脂肪族 [例えば、アルキル、アルケニル、またはアルキニル]; シクロ脂肪族; (シクロ脂肪族)脂肪族; ヘテロシクロ脂肪族; (ヘテロシクロ脂肪族)脂肪族; アリール; ヘテロアリール; アルコキシ; (シクロ脂肪族)オキシ; (ヘテロシクロ脂肪族)オキシ; アリールオキシ; ヘテロアリールオキシ; (アラリファティック)オキシ; (ヘテロアラリファティック)オキシ; アロイル; ヘテロアロイル; アミノ; オキソ (二環式または三環式ヘテロアリールの非芳香族炭素環または複素環上); ニトロ; カルボキシ; アミド; アシル [例えば、脂肪族カルボニル; (シクロ脂肪族)カルボニル; ((シクロ脂肪族)脂肪族)カルボニル; (アラリファティック)カルボニル; (ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル; ((ヘテロシクロ脂肪族) 脂肪族)カルボニル;および(ヘテロアラリファティック)カルボニル]; スルホニル [例えば、脂肪族スルホニルおよびアミノスルホニル]; スルフィニル [例えば、脂肪族スルフィニル]; スルファニル [例えば、脂肪族スルファニル]; ニトロ; シアノ; ハロ; ヒドロキシル; メルカプト; スルフォキシ; ウレア; チオウレア; スルファモイル; スルファミド;またはカルバモイル。あるいは、ヘテロアリールは非置換であってもよい。
置換ヘテロアリールの非限定的な例としては、(ハロ)ヘテロアリール [例えば、モノ-およびジ-(ハロ)ヘテロアリール]; (カルボキシ)ヘテロアリール [例えば、(アルコキシカルボニル)ヘテロアリール]; シアノヘテロアリール; アミノヘテロアリール [例えば、((アルキルスルホニル)アミノ)ヘテロアリールおよび((ジアルキル)アミノ)ヘテロアリール]; (アミド)ヘテロアリール [例えば、アミノカルボニルヘテロアリール、((アルキルカルボニル)アミノ)ヘテロアリール、((((アルキル)アミノ)アルキル)アミノカルボニル)ヘテロアリール、(((ヘテロアリール)アミノ)カルボニル)ヘテロアリール、((ヘテロシクロ脂肪族)カルボニル)ヘテロアリール、および ((アルキルカルボニル)アミノ)ヘテロアリール]; (シアノアルキル)ヘテロアリール; (アルコキシ)ヘテロアリール; (スルファモイル)ヘテロアリール [例えば、(アミノスルホニル)ヘテロアリール]; (スルホニル)ヘテロアリール [例えば、(アルキルスルホニル)ヘテロアリール]; (ヒドロキシアルキル)ヘテロアリール; (アルコキシアルキル)ヘテロアリール; (ヒドロキシル)ヘテロアリール; ((カルボキシ)アルキル)ヘテロアリール; [((ジアルキル)アミノ)アルキル]ヘテロアリール; (ヘテロシクロ脂肪族)ヘテロアリール; (シクロ脂肪族)ヘテロアリール; (ニトロアルキル)ヘテロアリール; (((アルキルスルホニル)アミノ)アルキル)ヘテロアリール; ((アルキルスルホニル)アルキル)ヘテロアリール; (シアノアルキル)ヘテロアリール; (アシル)ヘテロアリール [例えば、(アルキルカルボニル)ヘテロアリール]; (アルキル)ヘテロアリール、および (ハロアルキル)ヘテロアリール [例えば、トリハロアルキルヘテロアリール]が挙げられる。
本明細書において用いる場合、「ヘテロアラリファティック」(例えば、ヘテロアラルキル基)とは、ヘテロアリール基で置換された脂肪族基(例えば、C1-4 アルキル 基)をいう。「脂肪族」、「アルキル」および「ヘテロアリール」は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「アシル」基とは、ホルミル基またはRX-C(O)- (例えば、-アルキル-C(O)-、「アルキルカルボニル」とも称される)をいい、ここでRX および「アルキル」は上記の通りである。アセチルおよびピバロイルはアシル基の例である。
本明細書において用いる場合、「アルコキシ」基は、アルキル-O- 基をいい、ここで「アルキル」は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「カルバモイル」基は構造 -O-CO-NRXRYまたは -NRX-CO-O-RZ を有する基であり、ここでRX および RY は上記の通りであり、 RZ は脂肪族、アリール、アラリファティック、ヘテロシクロ脂肪族、ヘテロアリール、またはヘテロアラリファティックであり得る。
本明細書において用いる場合、「カルボキシ」基とは、末端基として用いる場合、-COOH、-COORX、-OC(O)H、-OC(O)RX をいい、内部基として用いる場合、-OC(O)- または-C(O)O-をいう。
本明細書において用いる場合、「ハロ脂肪族」基は1-3のハロゲンにより置換された脂肪族基をいう。例えば、ハロアルキルという用語には、基 -CF3が含まれる。
本明細書において用いる場合、「メルカプト」基は -SHをいう。
本明細書において用いる場合、「スルホ」基は末端に用いられる場合 -SO3Hまたは-SO3RX をいい、内部に用いられる場合、-S(O) 3- をいう。
本明細書において用いる場合、「スルファミド」基とは、末端に用いられる場合、構造 -NRX-S(O)2-NRYRZ をいい、内部に用いられる場合-NRX-S(O)2-NRY-をいい、ここで RX、RYおよび RZ は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「スルファモイル」基は末端に用いられる場合、構造 -S(O)2-NRXRYまたは -NRX -S(O)2-RZ をいい、内部に用いられる場合、-S(O)2-NRX- または-NRX -S(O)2-をいい、ここでRX、RY、およびRZ は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「スルファニル」基は末端に用いられる場合- S-RXをいい、内部に用いられる場合-S-をいい、ここで RX は上記の通りである。 スルファニルの例としては、アルキルスルファニルが挙げられる。
本明細書において用いる場合、「スルフィニル」 基は末端に用いられる場合-S(O)-RXをいい、内部に用いられる場合-S(O)-をいい、ここでRX は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「スルホニル」基は末端に用いられる場合-S(O)2-RX をいい、内部に用いられる場合、-S(O)2-をいい、ここでRX は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「スルフォキシ」基は末端に用いられる場合-O-SO-RXまたは-SO-O-RXをいい、内部に用いられる場合-O-S(O)-または-S(O)-O-をいい、ここで RX は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「ハロゲン」または「ハロ」基は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素をいう。
本明細書において用いる場合、「アルコキシカルボニル」は、カルボキシの用語に含まれるが、単独でまたは他の基と組み合わせて用いられて、例えば、 アルキル-O-C(O)-といった基をいう。
本明細書において用いる場合、「アルコキシアルキル」は、 例えば、アルキル-O-アルキル-といったアルキル基であり、ここでアルキルは上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「カルボニル」は-C(O)-をいう。
本明細書において用いる場合、「オキソ」は=Oをいう。
本明細書において用いる場合、「アミノアルキル」とは、構造 (RX)2N-アルキル-をいう。
本明細書において用いる場合、「シアノアルキル」とは、構造 (NC)-アルキル-をいう。
本明細書において用いる場合、「ウレア」基とは構造 -NRX-CO-NRYRZ をいい、「チオウレア」基とは末端に用いられる場合構造 -NRX-CS-NRYRZをいい、内部に用いられる場合-NRX-CO-NRY- または-NRX-CS-NRY-をいい、ここでRX、RY、およびRZ は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「グアニジノ」基は構造 -N=C(N (RX RY))N(RXRY)をいい、ここで、RX および RY は上記の通りである。
本明細書において用いる場合、「アミジノ」基という用語は、構造-C=(NRX)N(RXRY)をいい、ここでRXおよびRY は上記の通りである。
「末端」および「内部」という用語は置換基内にある基の位置をさす。基が置換基の終端に存在し、残りの化学構造にさらに結合していない場合、その基は末端基である。カルボキシアルキル、即ち、RXO(O)C-アルキルは末端に用いられるカルボキシ基の例である。基が残りの化学構造に結合する置換基の終端に対して置換基の中央部に存在する場合、その基は内部基である。アルキルカルボキシ(例えば、アルキル-C(O)O- またはアルキル-OC(O)-)およびアルキルカルボキシアリール(例えば、アルキル-C(O)O-アリール-またはアルキル-O(CO)-アリール-)は内部に用いられるカルボキシ基の例である。
「置換されていてもよい」という表現は「置換または非置換」という表現と互換的に用いられる。本明細書に記載する場合、本発明の化合物は例えば、上に一般に示したような、または本発明の特定のクラス、サブクラス、および種によって例示されるような１以上の置換基によって置換されていてもよい。本明細書に記載する場合、本明細書に含まれる可変基は、特定の基、例えば、 アルキルおよびアリールを包含する。特に断りのない限り、本明細書に含まれる可変基についての具体的な基のそれぞれは、本明細書に記載する１以上の置換基によって置換されていてもよい。具体的な基の各置換基はさらにハロ、シアノ、オキソアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、アリール、ハロアルキル、およびアルキルから選ばれる１から３つの置換基によって置換されていてもよい。例えば、アルキル基はアルキルスルファニルによって置換されていてもよく、そのアルキルスルファニルはハロ、シアノ、オキソアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、アリール、ハロアルキル、およびアルキルから選ばれる１から３つの置換基によって置換されていてもよい。さらなる例として、 (シクロアルキル)カルボニルアミノのシクロアルキル部分は、ハロ、シアノ、アルコキシ、ヒドロキシル、ニトロ、ハロアルキルおよびアルキルから選ばれる１から３つの置換基によって置換されていてもよい。２つのアルコキシ基が同じ原子または隣接原子に結合している場合、その２つのアルコキシ基はそれらが結合している原子と共に環を形成していてもよい。
一般に、「置換されて」という用語は「いてもよい」という用語と共に用いられるか否かに拘わらず、所与の構造における水素ラジカルの、特定の置換基のラジカルによる交換をいう。特定の置換基は上記の定義、下記の化合物の説明およびその実施例に記載したとおりである。特に断りのない限り、置換されていてもよい基は、基の置換可能な位置のそれぞれに置換基を有し得、所与の構造における２以上の位置が特定の基から選択される２以上の置換基によって置換されていてもよい場合、置換基は各位置について同じであっても異なっていてもよい。環置換基、例えば、ヘテロシクロアルキルは別の環、例えば、 シクロアルキルに結合して、例えば、両方の環が共通の１つの原子を共有するスピロ-二環系を形成していてもよい。当業者が認識するように、本発明で考えられる置換基の組合せは安定または化学的に可能な化合物の形成を導く組合せである。
本明細書において用いる場合、「安定または化学的に可能な」という表現は、生成、検出、および好ましくは その回収、精製、および本明細書に開示する１以上の目的のための使用を可能とする条件に供された場合、実質的に変化しない化合物をいう。
本明細書において用いる場合、有効量とは、処置された患者に対して治療効果を付与するのに必要な量と定義され、典型的には患者の年齢、表面積、体重および症状に基づいて決定される。動物およびヒトのための用量の相互関係(体表面積１平方メートル当たりmgに基づく)はFreireich et al.、Cancer Chemother. Rep..、50: 219 (1966)に記載されている。体表面積は患者の身長および体重から概算できる。例えば、Scientific Tables、Geigy Pharmaceuticals、Ardsley、New York、537 (1970)参照。
特に断りのない限り、本明細書中に示す構造はその構造のすべての異性体 (例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何異性体(または配座異性体)) 形態; 例えば、各不斉中心のRおよび S 配置、(Z) および(E) 二重結合異性体および (Z) および (E) 配座異性体を含む意図である。それゆえ本発明の化合物の一つの立体化学的異性体ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何 (または配座) 混合物は本発明の範囲に含まれる。特に断りのない限り、本発明の化合物のすべての互変異性体形態が本発明の範囲に含まれる。さらに、特に断りのない限り、本明細書中に示す構造は１以上の同位体的に富んだ原子の存在においてのみ異なる化合物も含む意図である。例えば、水素が重水素またはトリチウムによって置換されている以外は同一の構造を有する化合物または炭素が 13C-または14C-に富む炭素で置換されている以外は同一の構造を有する化合物は本発明に含まれる。かかる化合物は例えば、生物学的アッセイにおいて、分析ツールまたは プローブとして有用である。
II. 癌遺伝子標的
ある態様において、本発明は癌遺伝子のアンチジーン阻害剤を提供する。本発明は特定の癌遺伝子の阻害に限定されない。実際、本発明は多数の癌遺伝子、例えばこれらに限定されないが以下に記載するものを含むものに対するアンチジーン阻害剤を包含する。
A. Ras
多くの科学者に注目された１つの遺伝子は、ヒト癌原遺伝子、c-Ha-rasである。この遺伝子は中心的司令塔として作用し、化学シグナルを細胞に伝え、細胞***を制御する。Ras 遺伝子変化は遺伝子を「オン」位置に置かせうる。ras 癌遺伝子は30%の癌の基礎となっていると考えられ、結腸癌、肺癌、膀胱癌および乳癌 (Bos、Cancer Res. 49:4682-4689 [1989])が含まれる。ras 癌遺伝子はそれゆえ治療薬の標的となっている。
ras mRNAの様々な部位に相補的なオリゴヌクレオチドがras タンパク質 (p21)の合成を阻害し得、細胞培養における細胞増殖速度を低下させるということを示す報告がいくつかある(米国特許第5,576,208号; 米国特許第5,582,986号; Daska et al.、Oncogene Res. 5:267-275 [1990]; Brown et al.、Oncogene Res. 4:243-252 [1989]; Saison-Behmoaras et al.、EMBO J. 10:1111-1116 [1991)]。c-Ha-ras RNA 転写産物の5’ 隣接領域に相補的なオリゴヌクレオチドがヌードマウスにおける腫瘍増殖 を14日間阻害したことが示されている (Gray et al.、Cancer Res. 53:577-580 [1993])。c-Ha-ras mRNAのコドン 12 における点突然変異 (G>C)に向けたアンチセンスオリゴヌクレオチドが皮下に注入した場合ヌードマウスにおける細胞増殖ならびに腫瘍増殖を阻害したことが最近報告されている (米国特許第5,576,208号; 米国特許第5,582,986号; Schwab et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10460-10464 [1994]; これらはそれぞれ引用により本明細書にその内容を含める)。 研究者らはアンチセンス薬が小規模臨床試験において卵巣腫瘍を収縮させたことを報告している (Roush et al.、Science 276:1192-1194 [1997])。
B. Her-2
her-2 (neu 癌遺伝子またはerbB-2としても知られる) 癌遺伝子はいくつかのヒト癌(Hynes and Stern、Biochim. et Biophy. Acta 1198:165-184 [1994]; Dougall et al.、Oncogene 9:2109-2123 [1994])および哺乳類発生(Lee et al.、Nature 378:394-398 [1995]).におけるその役割のためによく調べられている受容体-様チロシンキナーゼ (RTK) をコードする。Her-2 は癌においてもっとも頻繁に変化している遺伝子の１つである。それはチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通受容体 (p185としても知られる)をコードし、上皮増殖因子(EGF) ファミリーのメンバーであるため、上皮増殖因子受容体(EGFRまたは HER-1)と関連している。異常な her-2 遺伝子発現は多種多様な癌でみられ乳癌、卵巣癌および胃癌でもっとも一般的である。 HER-2はすべてのヒト乳癌および卵巣癌の25-30%で過剰発現している。HER-2過剰発現のレベルは乳癌の臨床段階、予後および転移能とよく相関している。HER-2の過剰発現はより低い生存率、高い再発率および高い転移能と相関している。Tan et al.、(Cancer Res.、57:1199 [1997]) は、HER-2遺伝子の過剰発現は形質転換能を上昇させることなく乳癌細胞の転移能を上昇させることを示している。
HER-2の異常な発現は正常 HER-2の発現上昇および突然変異 HER-2発現の両方を含む。 her-2 癌原遺伝子の活性化は点突然変異、遺伝子増幅および過剰発現の３つの機構のいずれによっても起こりうる。遺伝子増幅はもっとも一般的な機構である。リガンド活性化が形質転換の促進に必要であるEGF ファミリーのその他のメンバーと異なり、HER-2のみの過剰発現が形質転換に十分である(Cohen、et al.、J. Biol. Chem.、271:30897 [1996])。
いくつかの治療アプローチがher-2 遺伝子産物のレベルの低下に用いられてきた。アデノウイルス5型遺伝子産物 E1Aがヌードマウスにおける乳癌モデルを用いて潜在的治療薬として研究された。この遺伝子産物はher-2/neu過剰発現をher-2/neu プロモーター活性を抑制することによって抑制し得、her-2/neu-過剰発現の卵巣癌細胞の腫瘍形成能を抑制する。her-2/neu過剰発現乳癌異種移植片を担持するマウスにおいて、アデノウイルスまたはリポソームによって送達されたE1Aは対照と比較して顕著に腫瘍増殖を阻害し、マウスの生存を延長した (Chang et al.、Oncogene 14:561 [1997])。HER-2/neu タンパク質産物とFc ガンマ RIII (CD16)との両方の細胞外ドメインを標的とする二重特異性抗体を評価するための臨床試験が行われ、Fc ガンマ 受容体はヒトナチュラルキラー細胞、好中球および分化した単核食細胞によって発現される(Weiner et al.、J. Hematotherapy、4:471 [1995])。
HER-2の過剰発現は化学療法に対する耐性の上昇とも関連していることが見いだされた。したがって、HER-2レベルが上昇した患者は多くの薬剤に対する応答が乏しい。HER-2 発現の阻害に用いた方法を一般的に用いられている化学治療薬とが組み合わせられた (Ueno et al.、Oncogone 15:953 [1997])。アデノウイルス5型 遺伝子産物、E1Aとタキソールとを組み合わせることにより、ヒト乳癌細胞において相乗効果が示された。Zhang et al.、(Oncogene、12:571 [1996])は、チロシン特異的阻害剤であるエモジンが、非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞を様々な化学治療薬、例えば、シスプラチン、ドキソルビシンおよびエトポシドに対して感作したことを示した。HER-2 抗体はヒト乳癌細胞においてタモキシフェンの効力を上昇させることが見いだされた (Witters et al.、Breast Cancer Res. and Treatment、42:1 [1997])。
オリゴヌクレオチドはまた、her-2機能の研究にも用いられてきた。mRNA 転写開始部位の42〜69 ヌクレオチド上流のher-2 プロモーターを標的とした三重鎖形成オリゴヌクレオチドはHER-2 発現をインビトロで阻害することが見いだされた (Ebbinghaus et al.、J. Clin. Invest.、92:2433 [1993])。Porumb et al. (Cancer Res.、56:515 [1996]) も、同じher-2 プロモーター領域を標的とした三重鎖形成オリゴヌクレオチドを用いた。her-2 mRNAおよびタンパク質レベルの低下が培養細胞においてみられた。Juhl et al. (J. Biol. Chem.、272:29482 [1997])はタンパク質の膜貫通領域のすぐ下流のher-2 RNAの中心領域を標的とした抗- her-2 リボザイムを用いてヒト卵巣癌細胞におけるher-2 mRNAおよびタンパク質レベルの低下を示した。ヌードマウスにおける腫瘍増殖の低下もみられた。
アンチセンスアプローチがHER-2を過剰発現する癌の潜在的治療薬として用いられてきた。Pegues et al. (Cancer Lett.、117:73 [1997])は、発現ベクターにアンチセンス方向にてher-2の1.5 kb 断片をクローニングし; このコンストラクトを卵巣癌細胞にトランスフェクトした結果、足場非依存増殖が低下した。Casalini et al. (Int. J. Cancer 72:631 [1997])は、151 bp〜415 bp の長さのher-2 断片を含むいくつかのヒト her-2アンチセンスベクターコンストラクトを用いて、肺腺癌細胞におけるHER-2 タンパク質レベルおよび足場非依存増殖の低下を示した。Colomer et al. (Br. J. Cancer、70:819 [1994])は翻訳開始コドンまたはそのすぐに下流を標的としたホスホジエステルアンチセンスオリゴヌクレオチドがヒト乳癌細胞増殖を60%も阻害することを示した。Wiechen et al. (Int. J. Cancer 63:604 [1995])は、her-2の翻訳開始コドンの33 ヌクレオチド下流のコード領域を標的とした18-ヌクレオチドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、卵巣癌細胞の足場非依存増殖を低下させることを示した。Bertram et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun.、200:661 [1994])は、翻訳開始領域およびチロシンキナーゼコンセンサス配列と高い相同性を示すmRNAの翻訳領域の3’ 部分の配列を標的としたアンチセンス ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドを用い、ヒト乳癌細胞におけるHER-2 タンパク質レベルが75%低下することを示した。Liu et al.、(Antisense and Nucleic Acid Drug Develop.、6:9 [1996]) は5’キャップ部位およびコード領域を標的としたアンチセンス ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いた。5’ キャップ部位を標的としたもっとも有効な オリゴヌクレオチドは、HER-2 タンパク質発現を90%低下させた。細胞増殖もそれに匹敵する量低下した。Vaughn et al. (Nuc. Acids. Res.、24:4558 [1996])は、her-2の翻訳開始領域、またはそれに隣接した領域を(いずれの側も) 標的としたホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた。翻訳開始領域を標的としたジチオエート/ジエステルが交互に並ぶオリゴヌクレオチドは、すべてがホスホロチオエートであるオリゴヌクレオチドよりもわずかに良好に作用した。Brysch et al. (Cancer Gene Ther.、1: 99 [1994])はHER-2の翻訳開始コドンを標的とした化学修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてタンパク質レベルを低下させ、ヒト乳癌細胞株の増殖停止を導いた。
C. C-Myc
c-myc 遺伝子産物は最初期応答遺伝子によってコードされ、その発現は様々な***促進因子によって誘導されうる。C-myc 発現は細胞***を導くシグナル伝達経路に関与している。研究により、増殖中の細胞は静止状態の細胞よりも高いレベルのc-myc mRNA およびc-myc タンパク質を有することが示された。ヒト c-myc タンパク質に対して作成された抗体はヒト細胞から単離された核におけるDNA 合成を阻害することが知られている。逆に、遺伝子導入により生じるc-mycの構成的発現はいくつかの細胞株の誘導性の分化を阻害する。c-mycの構成的発現はトランスジェニックマウスの腫瘍の発達の素因になる。
いくつかの研究によりc-myc 遺伝子産物が平滑筋細胞(SMC)において増殖の役割を果たしている可能性があることが示唆された。ラット大動脈のバルーン脱上皮化（de-endothelialization）および損傷は、続いて起こる増殖および遊走に先だって血管 SMCのc-myc mRNA 発現を上昇させることが知られている。また、培養中のSMCはいくつかの***促進因子、例えばPDGF、FGF、EGF、IGF-1、および血清に曝されると増殖する。これら***促進因子のそれぞれはc-myc タンパク質、c-myc mRNAのいずれかまたはその両方のその他の細胞株における発現を上昇させることができることが見いだされている。さらに、血清はSMCにおけるc-myc mRNA レベルを上昇させることが見いだされた。
Harel-Bellan et al. (J. Immun. 140; 2431-2435 (1988))はc-myc mRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが有効にヒトT細胞におけるその翻訳を阻害することを示した。これらT細胞は細胞***のS期に入ることを阻害された。c-myc 癌原遺伝子配列はMarcu et al.、Ann. Rev. Biochem.、61:809-860 [1992]; Watt et al.、Nature、303:725-728 [1983)]; Battey et al.、Cell、34:779-787 (1983);および Epstein et al、NTIS publication PB93-100576に記載されている。
D. Bcl-2
多くのタイプのヒト腫瘍、例えば、リンパ腫および白血病において、ヒト bcl-2 遺伝子が過剰発現しており、腫瘍形成能と関連している可能性がある (Tsujimoto et al.、Science 228:1440-1443 [1985])。bcl-2 遺伝子の高レベルの発現がt (14; 18) 染色体転座を伴うすべてのリンパ腫、例えば、ほとんどのろ胞性 B細胞 リンパ腫および多くの大細胞型 非ホジキンリンパ腫において見いだされた。bcl-2 遺伝子の高レベルの発現は、 t(14; 18) 染色体転座を有さない特定の白血病、例えばほとんどのケースの慢性リンパ球性白血病急性、多くのプレB細胞型リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、上咽頭癌および多くの前立腺、***および結腸の腺癌においても見いだされた(Reed et al.、Cancer Res. 51:6529 [1991]; Yunis et al.、New England J. Med. 320:1047; Campos et al.、Blood 81:3091-3096 [1993]; McDonnell et al.、Cancer Res. 52:6940-6944 [1992); Lu et al.、Int. J Cancer 53:29-35 [1993]; Bonner et al.、Lab Invest. 68:43A [1993])。
E. TGF-α
トランスフォーミング増殖因子アルファ (TGF-α)は、50 アミノ酸のポリペプチドである。それは最初、レトロウイルス-形質転換マウス細胞株から単離され、次いで、ヒト腫瘍細胞、初期ラット胚細胞およびヒト脳下垂体由来細胞培養において同定された。TGF-αは構造および機能の両方で上皮増殖因子(EGF) に密接に関連しており、両者は同じ受容体、即ち、上皮増殖因子受容体(EGFR)に結合する。EGFおよびTGF-αの両方の配列および三次元構造が決定されている(Campbell et al.、Prog. Growth Factor Res. 1:13 [1989])。TGF-αはEGFと残基の約 40%の相同性を有する50 アミノ酸ポリペプチドである。両ペプチドは３つのよく規定されたループ(A、BおよびCと称される) を特徴とし、３つの分子内ジスルフィド結合を有する。
いくつかの 増殖因子、例えば、TGF-αおよびEGFは、上皮増殖因子受容体(EGF 受容体)との相互作用を介してその生物学的効果を発揮すると考えられている。EGF 受容体は1型受容体チロシンキナーゼである。EGF 受容体およびそのリガンドは正常生理的過程ならびに増殖過剰および腫瘍性疾患におけるその役割が興味深い。
TGF-αのインビボ前駆体は160 アミノ酸残基の膜結合型タンパク質 (プロ-TGF-アルファ)であり、切断されると可溶性化合物を生じる(Massague、J. Biol. Chem.、265:21393-21396 [1990])。この切断により50アミノ酸からなる分子量6 Kdの細胞外部分が切り離され、タンパク質キナーゼ Cを介して作用するホルボールエステルによって刺激されうる(Pandiella et al.、J. Biol. Chem.、266:5769-5773 [1991])重要な調節現象であると考えられている(Pandiella et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、88:1726-1730 [1990])。
培養ヒト前立腺腫瘍株ではTGF-α mRNAレベルが上昇しており、 TGF-αに応答して増殖する(Wilding et al.、The Prostate、15:1-12 [1989])。TGF-αは自己分泌と傍分泌機能との両方を有しているようであり、生理活性、例えば、細胞***および血管新生を刺激する。トランスジェニックマウスにおいて誘導されると、TGF-αはインサイチュで癌と類似した上皮過形成および異形成変化をもたらす(Sandgren et al.、Cell、61:1121-1135 [1990])。
F. c-ki-Ras
c-Ki- Ras (KRAS) 癌遺伝子は遍在的に発現している。30 kbを超える長さであるKRASは、HRASまたはNRASよりもかなり大きい。3つのras 遺伝子、HRAS、KRAS、およびNRASは異なる遺伝子構造を有するが、それらすべては189 アミノ酸残基のp21と総称されるタンパク質をコードする。これら遺伝子は対応するp21の第12または第61アミノ酸残基の組込みに影響する単一の点突然変異により悪性特性を獲得する。KRASはHRASよりもかなり高頻度に悪性腫瘍に関与している。NIH 3T3 形質転換系における96のヒト腫瘍または腫瘍細胞株の研究において、Pulciani et al.(Nature 300: 539 (1982)は T24 膀胱癌細胞においてのみ突然変異したHRAS座を見いだしたが、形質転換KRAS遺伝子は8 種類の癌および肉腫において同定された。
卵巣の重篤な嚢胞腺癌において、Feig et al. (Science 223: 698 (1984))は同じ患者の正常細胞において活性化されていない活性化 KRAS 癌遺伝子の存在を示した。形質転換遺伝子産物は、その他の腫瘍におけるKRAS 形質転換タンパク質の移動度とは異なる電気泳動移動度をSDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて示した。したがって、以前には記載されていない突然変異がこの卵巣癌におけるKRASの活性化の原因であった。肺癌における癌遺伝子の役割を研究するために、Rodenhuis et al. (New Eng. J. Med. 317: 929 (1987))はインビトロ増幅工程の後にオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが行われることに基づくアッセイを用いた。ゲノム DNAを開胸において得られた39の腫瘍標本から調べた。KRAS 遺伝子は10のうち5の腺癌におけるコドン 12の点突然変異によって活性化することが見いだされた。これら腫瘍のうち２つは2 cm未満の大きさであり、転移していなかった。 HRAS、KRAS またはNRAS 突然変異は15の扁平上皮細胞癌、10の大細胞型癌、1のカルチノイド、肺の外側の原発腫瘍からの2の転移腺癌および 1の小細胞癌においては観察されなかった。非突然変異KRAS遺伝子のおよそ 20-倍の増幅が直腸癌の孤立性肺転移であることが判明した腫瘍において観察された。Yanez et al. (Oncogene 1:315 (1987))は16のうち4の結腸癌、27のうち2の肺癌および8のうち1の乳癌におけるKRAS遺伝子のコドン 12の突然変異を見いだし;位置 61には突然変異はみられなかった。コドン 12における6の可能性のあるアミノ酸置換のうち、１つ以外が同定された7つの突然変異において表されていた。
G. その他の癌遺伝子標的
本発明は上記の癌遺伝子に限定されない。本発明の方法は既知のプロモーター領域を有するあらゆる癌遺伝子との使用に好適なものである。例示的な癌遺伝子としては、これらに限定されないが、BCR/ABL、ABL1/BCR、ABL、BCL1、CD24、CDK4、EGFR/ERBB-1、HSTF1、INT1/WNT1、INT2、MDM2、MET、MYB、MYC、MYCN、MYCL1、RAF1、NRAS、REL、AKT2、APC、BCL2-ALPHA、BCL2-BETA、BCL3、BCR、BRCA1、BRCA2、CBL、CCND1、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CRK、CRK-II、CSF1R/FMS、DBL、DDOST、DCC、DPC4/SMAD4、E-CAD、E2F1/RBAP、ELK1、ELK3、EPH、EPHA1、E2F1、EPHA3、ERG、ETS1、ETS2、FER、FGR、FLI1/ERGB2、FOS、FPS/FES、FRA1、FRA2、FYN、HCK、HEK、HER3/ERBB-2、ERBB-3、HER4/ERBB-4、HST2、INK4A、INK4B、JUN、JUNB、JUND、KIP2、KIT、KRAS2A、KRAS2B、LCK、LYN、MAS、MAX、MCC、MLH1、MOS、MSH2、MYBA、MYBB、NF1、NF2、P53、PDGFB、PIM1、PTC、RB1、RET、ROS1、SKI、SRC1、TAL1、TGFBR2、THRA1、THRB、TIAM1、TRK、VAV、VHL、WAF1、WNT2、WT1、YES1、ALK/NPM1、AMI1、AXL、FMS、GIP、GLI、GSP、HOX11、HST、IL3、INT2、KS3、K-SAM、LBC、LMO-1、LMO-2、L-MYC、LYL1、LYT-10、MDM-2、MLH1、MLL、MLM、N-MYC、OST、PAX-5、PMS-1、PMS-2、PRAD-1、RAF、RHOM-1、RHOM-2、SIS、TAL2、TAN1、TIAM1、TSC2、TRK、TSC1、STK11、PTCH、MEN1、MEN2、P57/KIP2、PTEN、HPC1、ATM、XPA/XPG、BCL6、DEK、AKAP13、CDH1、BLM、EWSR1/FLI1、FES、FGF3、FGF4、FGF6、FANCA、FLI1/ERGB2、FOSL1、FOSL2、GLI、HRAS1、HRX/MLLT1、HRX/MLLT2、KRAS2、MADH4、MAS1、MCF2、MLLT1/MLL、MLLT2/HRX、MTG8/RUNX1、MYCLK1、MYH11/CBFB、NFKB2、NOTCH1、NPM1/ALK、NRG/REL、NTRK1、PBX1/TCF3、PML/RARA、PRCA1、RUNX1、RUNX1/CBFA2T1、SET、TCF3/PBX1、TGFB1、TLX1、P53、WNT1、WNT2、 WT1、αv-β3、PKCα、TNFα、クラスタリン、サバイビン、TGFβ、c-fos、c-SRC、およびINT-1が挙げられる。
III.非-癌遺伝子標的
本発明は癌遺伝子の標的化に限定されない。本発明の方法および組成物はその発現の下方制御が望ましいあらゆる遺伝子 の標的化に有用である。例えば、ある態様において、標的とすべき遺伝子としては、これらに限定されないが、免疫グロブリンまたは抗体遺伝子、凝固因子遺伝子、プロテアーゼ、下垂体ホルモン、プロテアーゼ阻害剤、増殖因子、ソマトメジン、ゴナドトロピン、走化性因子(chemotactin)、ケモカイン、血漿タンパク質、血漿プロテアーゼ阻害剤、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、転写因子、または病原体標的 (例えば、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、微生物遺伝子、真菌遺伝子)が挙げられる。
具体的な遺伝子の例としては、これらに限定されないが、ADAMTS4、ADAMTS5、APOA1、APOE、APP、B2M、COX2、CRP、DDX25、DMC1、FKBP8、GH1、GHR、IAPP、IFNA1、IFNG、IL1、Il10、IL12、IL13、IL2、IL4、IL7、IL8、IPW、MAPK14、Mei1、MMP13、MYD88、NDN、PACE4、PRNP、PSEN1、PSEN2、RAD51、RAD51C、SAP、SNRPN、TLR4、TLR9、TTR、UBE3A、VLA-4、およびPTP-1B、c-RAF、m-TOR、LDL、VLDL、ApoB-100、HDL、VEGF、rhPDGF-BB、NAD、ICAM-1、MUC1、2-dG、CTL、PSGL-1、E2F、NF-kB、HIFおよびGCPRが挙げられる。
別の態様において病原体由来の遺伝子が標的とされる。例示的な病原体としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、重篤な急性呼吸器症候群に関与する病原体、西ナイルウイルスおよび食物由来病原体(例えば、大腸菌)が挙げられる。
IV. 略語
脂質についての略語は主に文献における標準的使用であり、参考として本明細書に記載する:
DMPC：ジミリストイルホスファチジルコリン
DPPC：ジパルミトイルホスファチジルコリン
DSPC：ジステアロイルホスファチジルコリン
POPC：パルミトイル-オレオイルホスファチジルコリン
OPPC：1-オレオイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DOPC：ジオレオイルホスファチジルコリン
DOPE：ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
DMPE：ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
DPPE：ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
DOPG：ジオレオイルホスファチジルグリセロール
POPG：パルミトイル-オレオイルホスファチジルグリセロール
DMPG：ジミリストイルホスファチジルグリセロール
DPPG：ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
DLPG：ジラウリルホスファチジルグリセロール
DSPG：ジストラロイルホスファチジルグリセロール
DMPS：ジミリストイルホスファチジルセリン
DPPS：ジパルミトイルホスファチジルセリン
DOPS：ジオレオイルホスファチジルセリン
POPS：パルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン
DMPA：ジミリストイルホスファチジン酸
DPPA：ジパルミトイルホスファチジン酸
DOPA：ジオレオイルホスファチジン酸
POPA：パルミトイル-オレオイルホスファチジン酸
DSPA：ジステアロイルホスファチジン酸
DLPA：ジラウリルホスファチジン酸
CHEMS：コレステロールヘミスクシナート
DC-Chol：3-β-[N-(N´,N´-ジメチルエタン) カルバモイル]コレステロール
Cet-P：セチルホスファート
DODAP：(1,2)-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N-ジメチルアンモニウム クロリド
DOEPC：1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
DAC-Chol：3-β-[N-(N,N´-ジメチルエタン) カルバモイル]コレステロール
TC-Chol：3-β-[N-(N´,N´、N´-トリメチルアミノエタン) カルバモイル] コレステロール
DOTMA：(1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド) (Lipofectin（登録商標）)
DOGS：((C18)2GlySper3+) N,N-ジオクタデシルアミド-グリシル-スペルミン (Transfectam（登録商標）)
CTAB：セチル-トリメチルアンモニウムブロミド
CPyC：セチル-ピリジニウムクロリド
DOTAP：(1,2-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DMTAP：(1,2-ジミリストイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DPTAP：(1,2-ジパルミトイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウム塩
DOTMA：(1,2-ジオレイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド)
DORIE：(1,2-ジオレイルオキシプロピル)-3 ジメチルヒドロキシエチル アンモニウムブロミド)
DDAB：ジメチルジオクタデシルアンモニウム ブロミド
DPIM：4-(2,3-ビス-パルミトイルオキシプロピル)-1-メチル-1H-イミダゾール
CHIM：ヒスタミニル-コレステロールカルバメート
MoChol：4-(2-アミノエチル)-モルホリノ-コレステロールヘミスクシナート
HisChol：ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシナート
HCChol：Nα-ヒスチジニル-コレステロールカルバメート
HistChol：Nα-ヒスチジニル-コレステロール-ヘミスクシナート
AC ：アシルカルノシン、ステアリル- & パルミトイルカルノシン
HistDG：1,2-ジパルミトイルグリセロール-ヘミスクシナット-N-ヒスチジニル-ヘミスクシナート、& ジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
IsoHistSuccDG：1,2-イパルミトイルグリセロール-O-ヒスチジニル-Nα-ヘミスクシナット、& ジステアロイル-、ジミリストイル、ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
DGSucc：1,2-ジパルミトイルグリセロール-3-ヘミスクシナート & ジステアロイル-、ジミリストイル- ジオレオイルまたはパルミトイル-オレオイル誘導体
EDTA-Chol：エチレンジアミンテトラ酢酸のコレステロール エステル
Hist-PS：Nα-ヒスチジニル-ホスファチジルセリン
BGSC：ビスグアニジニウム-スペルミジン-コレステロール
BGTC：ビスグアニジニウム-tren-コレステロール
DOSPER：(1.3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシ-スペルミル)-プロピルアルニド
DOSC：(1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセリル コリン エステル)
DOGSDO：(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-スクシニル-2-ヒドロキシエチル ジスルフィド オルニチン)
DOGSucc：1,2-ジオレオイルグリセロール-3-ヘミスクシネート
POGSucc：パルミトリル-オレオイルグリセロール-オレオイル-3-ヘミスクシナート
DMGSucc：1,2-ジミリストイルグリセロール-3-ヘミスクシナート
DPGSucc：1,2-ジパルミトイルグリセロール-3-ヘミスクシナート
以下の表は、本発明による組成物における使用に好適な脂質の非限定的な例を提供する。脂質の膜アンカーは例示的に示され、本発明の脂質を例示する目的であり限定する意図ではない。
Figure 0005122474
V. 両性リポソーム送達系
両性リポソームは約 pH 7.5でアニオン性または中性の電荷を有し pH 4でカチオン性電荷を有する最近記載されたリポソームのクラスを表す。PCT 国際公開 WO 02/066490、WO 02/066120 および WO 03/070220（これらはそれぞれ引用により本明細書に含める）は、両性リポソームおよびそれに好適な脂質を詳細に記載している。本発明によるDNAi オリゴヌクレオチドの担体として両性リポソームを使用して、例えば腫瘍増殖の阻害および/または低下により、細胞および哺乳類における癌を治療することは、リポソームが血流および組織において安定であることを必要とする。特に、全身適用の後、DNAI オリゴヌクレオチドは標的組織または細胞に最終的に取り込まれるまで安定にリポソームに捕捉されなければならない。したがって、FDAのリポソーム製剤についてのガイドラインはリポソーム薬のための特定の前臨床試験を管理している(http://www.fda.gov/cder/guidance/2191dft.pdf）。例えば、封入された薬剤の遊離の薬剤に対する比を血流における循環時間にわたって測定しなければならない。
リポソームの血流への注入の後、血清成分がリポソームと相互作用し、リポソームの透過処理を導きうる。しかし、リポソームに封入された薬剤または分子の放出は、薬剤または分子の分子の大きさに依存する。その結果、数千塩基対のプラスミドはより小さいオリゴヌクレオチドまたはその他の低分子よりもかなりゆっくりと遊離する。薬剤または分子のリポソーム送達のためには血流中のリポソームの循環中の薬剤の放出をできるだけ低くすることが必須である。
本発明による混合物の両性リポソームは、１以上の両性脂質あるいは両性の性質を有するアニオン性およびカチオン性脂質成分の混合物を含む。好適な両性脂質は PCT 国際公開 WO02/066489および PCT 国際公開 WO03/070735に開示されており、それら両方の内容は引用により本明細書に含める。あるいは脂質相はPCT 国際公開 WO02/066012（その内容は引用により本明細書に含める）に開示のように、pH-応答性アニオン性および/またはカチオン性成分を用いて処方してもよい。pHに感受性のカチオン性脂質はPCT 国際公開 WO02/066490 および WO03/070220、Budker、et al. 1996、Nat. Biotechnol. 14(6):760-4、ならびに 米国特許 6,258,792（その内容は引用により本明細書に含める）に開示されており、構成的に荷電したアニオン性脂質またはpHに感受性のアニオン性脂質と組み合わせて利用できる。したがって、カチオン性電荷は 当業者に知られた構成的に荷電した脂質と pH感受性アニオン性脂質とを組み合わせてそれらから導入することもできる(PCT 国際公開 WO05/094783、WO03/070735、WO04/100928、WO06/48329、WO06/053646および米国特許出願2003/0099697、2005/0164963、2004/0120997、2006/002991、2006/159737、2006/0216343も参照、そのそれぞれは引用により全体を本明細書に含める)。
本発明の混合物は、1) 両性脂質または両性の性質を有する脂質成分の混合物、 2) 中性脂質;および、3) １以上の DNAi オリゴヌクレオチドを上記のように含む。
A. 両性リポソームに用いられる脂質
1.両性脂質
両性脂質はPCT 国際公開 WO02/066489 およびWO03/070735に開示されており、それら両方の内容は引用により本明細書に含める。分子全体は「両性物質」分子部分におけるカチオン性およびアニオン性基の同時存在によりそのpH-依存的電荷特性をもつ。より具体的には、両性物質はその電荷成分の和が特定の pH値において正確にゼロとなる事実を特徴とする。この点は等電点 (IP)と称される。IPより上では、化合物は負の電荷を有し、IPより下では正のカチオンとみなされ、両性脂質のIP の範囲は4.5から8.5である。
媒体の特定のpH値における分子の総電荷は以下のように計算できる:
z = Σni×（（qi-1) + (10(pK-pH)/(1+10(pK-pH)））
qi:そのpKより下でのイオン性基の絶対電荷(例えば、カルボキシル = 0、一窒素塩基 = 1、ジ-エステル化ホスファート基 = -1)
ni: 分子におけるかかる基の数。
例えば、化合物はヒスチジンのアミノ基のコレステロールヘミスクシナートとのカップリングにより形成される。中性 pH 値の7において、生成物はそれに存在するカルボキシル官能基が完全に解離形態であり、イミダゾール官能基が低い電荷しか有さないために、負の電荷を有する。酸性pH 値の約 4では、状況は逆となる:カルボキシル官能基は大きく電荷を失い、イミダゾール基は本質的に完全にプロトン化され、分子の総電荷はそれゆえ、正になる。
一つの態様において、両性脂質はHistChol、HistDG、isoHistSuccDG、アシルカルノシンおよびHCCholからなる群から選択される。別の態様において、両性脂質はHistCholである。
両性脂質は、限定されないが、アニオン性置換基を含むカチオン性脂質の誘導体を含み得る。両性脂質は、限定されないが、下記式の構造を有する化合物を含む:
Z-X-W1-Y-W2-HET
［式中:
Zは、ステロールまたは脂肪族;
ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステリル、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
各W1は、独立に、非置換脂肪族;
各W2は、独立に、HO(O)C-脂肪族-アミノまたはカルボキシにより置換されていてもよい脂肪族;
XおよびYはそれぞれ独立に、非存在、-(C=O) -O-、- (C=O) -NH-、- (C=O) -S-、-O-、-NH-、-S-、-CH=N-、-O- (O=C) -、-S- (O=C) -、-NH- (O=C) -、および-N=CH-;そして、
HETは、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または置換されていてもよいヘテロアリール］。
ある側面において、HETは少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロアリールである。別の側面において、HETは、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、またはピリジニルである。別の側面において、カチオン性脂質は次の構造を有する：
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または、
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
別の態様において、両性脂質は、限定されないが、下記式の構造を有する化合物を含む:
Z-X-W1-Y-W2-HET
［式中:
Z は下記一般式の構造
Figure 0005122474
 ここでR1およびR2は、独立に、C8-C30 アルキルまたはアシル鎖(0、1、または2のエチレン性(ethyleneically）不飽和結合を有する）およびMは、-O-(C=O); -NH-(C=O)-; -S-(C=O)-; -O-; -NH-; -S-; -N=CH-; -(O=C)-O-; -S-(O=C)-; NH (O=C)-; -N=CH- および/または -S-S-からなる群から選択される;
ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステリル、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
各W1は、独立に8までの炭素原子を有する非置換脂肪族;
各W2は、独立に、8までの炭素原子および0、1、または2のエチレン性(ethyleneically）不飽和結合を有する脂肪族 、カルボン酸;
Xは、非存在 およびYは、 -(C=O)-O-; -(C=O)-NH-; -NH-(C=O)-O-; -O-; NH-; -CH=N-; -O-(O=C)-; -S-; -(O=C)-; -NH-(O=C)-; -O-(O=C)-NH-、-N=CH- および/または -S-S-; そして、
HET は、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または、置換されていてもよいヘテロアリール］。
ある側面において、HETは少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロアリールである。別の側面において、HETはモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、またはピリジニルである。別の側面において、カチオン性脂質は次の構造を有する：
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
2.両性特性を有する脂質成分の混合物
あるいは、脂質相はPCT 国際公開 WO02/066012（その内容は引用により本明細書に含める）に開示のようにpH-応答性アニオン性および/またはカチオン性成分を用いて製剤することができる。pH感受性のカチオン性脂質はPCT 国際公開 WO02/066490 およびWO03/070220、Budker、et al. (1996)、Nat Biotechnol. 14(6):760-4、および米国特許 6,258,792に開示されており、それらの内容はすべて引用により本明細書に含まれる。あるいは、カチオン性電荷はpH 感受性アニオン性脂質と組み合わせて当業者に知られた構成的に荷電した脂質から導入してもよい。構成的に荷電 (例えば、特定のpH範囲、例えばpH約 4〜9にわたって安定に荷電)したアニオン性およびカチオン性脂質の組合せ、例えば DOTAP および DPPGは好ましくない。したがって、ある態様において、脂質成分の混合物は、(i)安定なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質、(ii)荷電可能なカチオン性脂質および荷電可能なアニオン性脂質または(iii)安定なアニオン性脂質および荷電可能なカチオン性脂質を含みうる。
荷電した基は以下の4 群に分けることが出来る。
(1)強く (例えば、構成的に荷電した)カチオン性、pKa > 9、正味の正の電荷: その化学的性質に基づき、これらは、例えば、アンモニウム、アミジニウム、グアニジウムまたはピリジニウム基または適時、二級または三級アミノ官能基。
(2) 弱くカチオン性、pKa < 9、正味の正の電荷: その化学的性質に基づき、これらは特に、窒素塩基、例えば ピペラジン、イミダゾールおよびモルホリン、プリンまたはピリミジン。生物学的系に生じるかかる分子断片は、例えば、4-イミダゾール(ヒスタミン)、2-、6-、または9-プリン(アデニン、グアニン、アデノシンまたはグアノシン)、1-、2-または4-ピリミジン(ウラシル、チミン、シトシン、ウリジン、チミジン、シチジン) またはピリジン-3-カルボン酸 (ニコチンエステルまたはアミド)である。好ましい pKa 値を有する窒素塩基はまた、窒素原子を１回以上、低分子量アルカンヒドロキシル、例えば、ヒドロキシメチルまたはヒドロキシエチル基で置換することにより形成される。例えば、アミノジヒドロキシプロパン、トリエタノールアミン、トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミン、ビス-(ヒドロキシメチル)メチルアミン、トリス-(ヒドロキシエチル)メチルアミン、ビス-(ヒドロキシエチル)メチルアミンまたは対応する置換エチルアミンが挙げられる。
(3) 弱くアニオン性、pKa > 4、正味の負の電荷: その化学的性質に基づき、これらは、特にカルボン酸である。これらには、12までの炭素原子および0、1 または2 エチレン性不飽和結合を有する脂肪族、直鎖状または分枝状 モノ、ジまたはトリカルボン酸が含まれる。好適な挙動のカルボン酸は芳香族系の置換基としてもみられる。その他の弱くアニオン性の基は、アスコルビン酸、N-置換アロキサン、N-置換バルビツール酸、ベロナール、フェノールにおいて解離し、生じうる、ヒドロキシルまたはチオールであり、またはチオール基として存在しうる。
(4) 強く (例えば、構成的に荷電した) アニオン性、pKa < 4、正味の負の電荷：その化学的性質に基づき、それらは、例えば スルホナートまたはホスファートエステルなどの官能基である。
両性リポソームは両性の特性を有するように様々な量のかかる膜形成または膜に基づく両親媒性物質を含む。これはリポソームが電荷の表示を完全に変化させうることを意味する。所与の媒体のpHにて存在するリポソームの電荷担体の量は、下記式を用いて計算できる:
Figure 0005122474
式中、qiはその pKより下での個々のイオン性基の絶対電荷(例えば、カルボキシル = 0、一窒素塩基 = 1、第二解離段階のホスファート基= -1等)
niはリポソームにおけるこれらの基の数。
等電点において、リポソームの正味の電荷は0である。大きく選択可能な等電点を有する構造はアニオン性とカチオン性部分との混合により作ることが出来る。
一つの態様において、カチオン性成分は、 DPIM、CHIM、DORIE、DDAB、DAC-Chol、TC-Chol、DOTMA、DOGS、(C18)2Gly+ N,N-ジオクタデシルアミド-グリシン、CTAB、CPyC、DODAP DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoChol、HisChol およびDOEPCを含む。別の態様において、カチオン性脂質は、DMTAP、DPTAP、DOTAP、DC-Chol、MoCholおよびHisCholを含む。
pH 感受性カチオン性脂質はPCT 国際公開 WO 02/066490およびWO 03/070220に開示されており、それら両方の内容は引用により本明細書に含める。
pH 感受性カチオン性脂質は下記式の構造を有する化合物であり得る：
L-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-HET
［式中:
Lは、ステロールまたは[脂肪族(C(O)O)-]2アルキル-;
ステロールは、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステリル、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
スペーサー 1 およびスペーサー 2はそれぞれ独立に、非置換脂肪族;
XおよびYはそれぞれ独立に、非存在、-(C=O) -O-、- (C=O) -NH、- (C=O) -S-、-O-、-NH-、-S-、-CH=N-、-O- (O=C) -、-S- (O=C) -、-NH- (O=C) -、=CH-、-CH2-、=N-O-、 =N-NH-、=N-NH-(C=O)-、NH-SO2-、S(O) n-、S(O)2-NH-または-N=CH-; そして、
HET は、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または置換されていてもよいヘテロアリール］。
ある側面において、HETは少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロアリールである。別の側面において、 HETは、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリミジニルまたはピリジニルである。別の側面において、カチオン性脂質は次の構造を有する。
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または、
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
一つの態様において、Xは-O-、スペーサー 1およびスペーサー 2は (CH2)2、Yは-(C=O) -NH-、およびHETはモルホリニルである。別の態様において、Xは、=CH-、スペーサー 1 およびスペーサー 2は(CH2)2、Y は- (C=O)NH、およびHETはモルホリニルである。さらに別の態様において、Xは-CH2-、スペーサー 1およびスペーサー 2は(CH2)2、Yは- (C=O) -NH-、およびHETはモルホリニルである。さらに別の態様において、Xは =N-O-、スペーサー 1は -CH2-、Yは- (C=O) -NH-、スペーサー 2は (CH2)2、HETはモルホリニルである。さらに別の態様において、Xは=N-NH-、スペーサー 1は-CH2-、Yは- (C=O) -NH-、スペーサー 2は(CH2)2および HETはモルホリニルである。さらなる態様において、X は =N-NH-(C=O)-、スペーサー 1 は-CH2-、Yは- (C=O) -NH-、スペーサー 2 は(CH2)2およびHETはモルホリニルである。さらに別の態様において、Xは-NH-(C=O)-、スペーサー 1は -CH2-、Yは-(C=O) -NH-、スペーサー 2は(CH2)2および HETはモルホリニルである。さらに別の態様において、Xは-NH-、スペーサー 1およびスペーサー 2は(CH2)2、Yは- (C=O) -NH-、およびHETはモルホリニルである。別の態様において、Xは-NH-(SO2) n-、スペーサー 1は-CH2-、Y は-(C=O) -NH-、スペーサー 2は(CH2)2およびHETはモルホリニルであり、nは1または2である。さらに別の態様において、Xは-S(O2)-NH-、スペーサー 1は -CH2-、Yは- (C=O) -NH-、スペーサー 2 は(CH2)2およびHETはモルホリニルである。上記化合物は1以上の工程の合成を用いて合成でき、当業者によって調製できる。
別の態様において、pH 感受性カチオン性脂質は下記式の構造を有する化合物であり得る：
L-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-HET
［式中:
Lは下記一般式による構造、
Figure 0005122474
 ここでR1 および R2は独立に C8-C30 アルキルまたは 0、1または 2のエチレン性不飽和結合を有するアシル鎖および Mは 非存在、-O-(C=O); -NH-(C=O)-; -S-(C=O)-; -O-; -NH-; -S-; -N=CH-; -(O=C)-O-; -S-(O=C)-; NH (O=C)-; -N=CH- および/または -S-S-;
ステロールはコレステロール、シトステロール、カンペステロール、デスモステロール、フコステロール、22-ケトステロール、20-ヒドロキシステロール、シグマステロール、22-ヒドロキシコレステロール、25 ヒドロキシコレステロール、ラノステロール、7-デヒドロコレステロール、ジヒドロコレステロール、19-ヒドロキシコレステロール、5αコレスト-7-エン-3β-オール、7-ヒドロキシコレステロール、エピコレステロール、エルゴステロール、デヒドロエルゴステロール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される;
スペーサー 1およびスペーサー 2はそれぞれ独立に1-8 炭素原子を有する非置換脂肪族;
Xは非存在およびYは非存在、-(C=O)-O-; -(C=O)-NH-;-NH-(C=O)-O-; -O-; -NH-; -CH=N-; -O-(O=C)-; -S-; -(O=C)-; -NH-(O=C)-; -O-(O=C)-NH-、-N=CH- および/または -S-S-;そして、
HETは、アミノ、置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または置換されていてもよいヘテロアリール］。
ある側面において、HETは少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロシクロ脂肪族または少なくとも１つの窒素環原子を含む置換されていてもよいヘテロアリールである。別の側面において、HETはモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリミジニルまたはピリジニルである。別の側面において、カチオン性脂質は次の構造を有する：
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-モルホリニル
または、
ステロール-X-スペーサー1-Y-スペーサー2-イミダゾリル。
さらに別の側面において、ステロールはコレステロールである。
両性混合物はさらに、構成的にまたは条件的にpHに応答して荷電するアニオン性脂質を含み、かかる脂質は当業者に知られている。一つの態様において、本発明に使用される脂質としては、 DOGSucc、POGSucc、DMGSucc、DPGSucc、DMPS、DPPS、DOPS、POPS、DMPG、DPPG、DOPG、POPG、DMPA、DPPA、DOPA、POPA、CHEMS、CetylP、DGSucc、およびそれらの組合せが挙げられる。
3.中性脂質
中性脂質は pH約 4 〜 9にて中性に荷電したままであるあらゆる脂質を含む。中性脂質としては、限定されないが、コレステロール、その他のステロールおよびその誘導体、リン脂質およびそれらの組合せおよびその他の中性脂質が挙げられる。リン脂質はリポソームを形成できるいずれかのリン脂質またはリン脂質の組合せを含む。それらには、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、レシチンおよびそれらのフラクション、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、プラスマロゲンおよびスフィンゴミエリンが含まれる。ホスファチジルコリンとしては、限定されないが、卵、ダイズまたはその他の植物源から得られるものまたは部分的または完全に合成のものまたは様々な脂質鎖長 および不飽和のもの、POPC、OPPC、天然または水添 ダイズ PC、天然または水添卵 PC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC およびそれらの誘導体が挙げられる。一つの態様において、ホスファチジルコリンはPOPC、非水添ダイズ PC および 非水添卵 PCである。ホスファチジルエタノールアミンとしては、限定されないが、DOPE、DMPE およびDPPE およびそれらの誘導体が挙げられる。ホスファチジルグリセロールとしては、限定されないが、DMPG、DLPG、DPPG、およびDSPGが挙げられる。ホスファチジン酸としては、限定されないが、DSPA、DMPA、DLPA および DPPAが挙げられる。
ステロールには、コレステロール誘導体が含まれ、例えば 3-ヒドロキシ-5.6-コレステンおよび関連アナログ、例えば 3-アミノ-5.6-コレステンおよび5,6-コレステン、コレスタン、コレスタノールおよび関連アナログ、例えば 3-ヒドロキシ-コレスタン; および荷電したコレステロール誘導体、例えば、コレステリル-ベータ-アラニンおよびコレステロール ヘミスクシナートが挙げられる。
その他の中性脂質にはα-トコフェロールおよび誘導体、例えば α-酢酸トコフェロールが含まれる。
別の態様において、中性脂質には、限定されないが、DOPE、POPC、ダイズ PC または卵 PC およびコレステロールが含まれる。
B. DNAi オリゴヌクレオチド
1. bcl-2遺伝子の調節領域
bcl-2 遺伝子はP1およびP2と称される２つのプロモーターを有する。ほとんどのbcl-2 mRNAがそこから転写されるP1は翻訳開始部位のおよそ 1.4 kb 上流に位置し、P2はP1の1.3 kb 下流である ( Seto、M. et al. EMBO J. 7、123-131 (1988)参照)。P1はGC-リッチであり、TATAボックスを欠き、多くの転写開始部位を有し、SP1 転写因子についての７つのコンセンサス結合部位を含む。P2は CCAAT ボックスおよびTATA ボックスを含み、２種類の転写開始部位を有する。複数のNF-KB 認識部位および１つのSV40 エンハンサー-様オクタマーモチーフがP2内に存在する(Heckman、C.A.、et al. Oncogene 21、3898-3908 (2002) を参照)(配列番号1254を参照)。ほとんどのヒトろ胞性リンパ腫はt(14;18) 染色体転座を含み、それは3’-bcl-2 遺伝子領域限界点に起因する(Tsujimoto、Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84、1329-1331 (1987) を参照)。これらの転座は bcl-2 発現を免疫グロブリン重鎖 (IgH) 座位エンハンサーの制御下に置き、その結果、bcl-2 発現の上方制御が起こる。あるいは、IgH 座位またはいくつかのDLCL リンパ腫患者単離株においてみられる２種類の免疫グロブリン軽鎖 (IgL) 座位との融合に起因する5’-bcl-2 限界点 領域が存在する(Yonetani、N. et al. Jpn. J. Cancer Res. 92、933-940 (2001) を参照)。これら5’-bcl-2 限界点は翻訳開始部位の378〜2312 bp 上流に広がる領域に対して異なる異種患者単離株においてマッピングされている (配列番号1255-1266を参照)。限界点付近の領域はbcl-2 DNAiオリゴヌクレオチド設計について使用できる配列でありうる。
TGF-α、c-ki-ras、c-myc、c-erb-2 (Her-2)、およびc-Ha-rasの上流領域も好ましい設計基準に基づきDNAi オリゴヌクレオチドが結合する領域を見いだすために調べることが出来る。
2. DNAi オリゴヌクレオチド設計
ある態様においてDNAi オリゴヌクレオチドは、二本鎖DNAのプラス鎖またはマイナス鎖のいずれかに相補的なDNA オリゴマーである。DNAi オリゴヌクレオチドは c-ki-ras、c-Ha-ras、c-myc、her-2、TGF-α、またはbcl-2遺伝子の調節領域にハイブリダイズしうる。本発明の目的のため、これら上流領域は、配列番号1 (her-2、またはc-erb-2について)、配列番号282 (c-ki-rasについて)、配列番号462 (c-Ha-rasについて)、配列番号936 (c-mycについて)、配列番号1081 (TGF-αについて) および配列番号1249 および1254 (bcl-2について)として規定される。ただし、DNAi オリゴヌクレオチドは 一本鎖核酸オリゴヌクレオチドまたはその誘導体であり、その配列は部分的にはオリゴヌクレオチドが間接的または直接的に同じまたは異なる遺伝子の発現、制御または産生に影響を与える遺伝子の最も長い非転写領域の部分に相補的であり、ここで最も長い非転写領域は転写開始部位が翻訳開始部位に非常に近くに位置している場合転写されない遺伝子の部分を含む。DNAi オリゴヌクレオチドはmRNAまたはプレ-mRNAとのみ塩基対形成し、RNA プロセシング および/または メッセンジャー翻訳を干渉するRNAiおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない。
ある態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは好ましい設計基準に基づいて設計されうる。かかるDNAiオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示する方法を用いて効力について試験できる。例えば、ある態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは少なくとも１、２またはすべてのCpG島においてメチル化されている。別の態様において、DNAiオリゴヌクレオチドはメチル化を含まない。本発明は特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は本発明の実施に必須ではない。にもかかわらず、DNAiオリゴヌクレオチドは、ある態様において、少なくとも50% GC含量を有し、少なくとも２つのGCジヌクレオチドを有するものであると考えられる。また、ある態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは自己ハイブリダイズしない。さらなる態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは自己ハイブリダイゼーションを最小化するために少なくとも 1のAまたはTを有するよう設計される。さらに別の態様において、DNAiオリゴヌクレオチドが自己ハイブリダイズする能力について調査するのに市販のコンピュータプログラムが用いられる。さらに別の態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは少なくとも 10、または15 ヌクレオチドであって100 ヌクレオチドを超えない長さである。さらなる態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは18-26 ヌクレオチドの長さである。さらなる態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは普遍的タンパク質結合配列である CGCCC および CGCGまたはそれらの相補鎖を含む。
ある態様において、DNAiオリゴヌクレオチドはプロモーターのTATAボックスの上流の遺伝子の調節領域にハイブリダイズする。さらなる態様において、DNAiオリゴヌクレオチドはタンパク質 (例えば、転写因子)が結合することが知られている癌遺伝子の調節領域の領域にハイブリダイズするように設計される。ある態様において、DNAiオリゴヌクレオチド化合物はヒトゲノムのその他の領域に対して完全に相同的ではない。本発明のDNAiオリゴヌクレオチドのゲノムのその他の領域との相同性は利用可能な検索ツール (例えば、BLAST、NCBIのインターネットサイトにて利用可能)を用いて決定できる。
本発明は本明細書に記載する特定のDNAiオリゴヌクレオチド配列に限定されない。その他の好適なDNAiオリゴヌクレオチドを (例えば、上記の基準またはその他の基準を用いて) 同定することができる。候補DNAiオリゴヌクレオチドはいずれかの好適な方法を用いて効力について試験されうる。例えば、候補DNAiオリゴヌクレオチドは様々な濃度で細胞増殖を阻止する能力について評価されうる。ある態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは遺伝子発現または細胞増殖を低濃度にて阻害する(例えば、インビトロアッセイにおいて20μM、または10 μM未満)。
3. DNAiオリゴヌクレオチドゾーン
ある態様において、癌遺伝子の調節領域内にある領域がDNAiオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのための領域としてさらに規定される。ある態様において、これら領域は「ホットゾーン」と称される。
ある態様において、ホットゾーンは、上記のDNAiオリゴヌクレオチドについての基準に基づいて有効であると考えられる、有効であることが示されたDNAiオリゴヌクレオチド化合物に基づいて規定される(DNAiオリゴヌクレオチドについての上記のセクションを参照)。ある態様において、ホットゾーンは各ホットゾーンに含まれる各化合物の上流および下流10 bp を含み、各化合物の上流または下流さらに40 bp内に少なくとも１またはそれ以上のCGを有する。さらなる態様において、ホットゾーンはホットゾーンに含まれる各オリゴヌクレオチド化合物の上流 および下流の最大100 bpを含む。さらなる態様において、ホットゾーンは各プロモーターの開始領域にて規定される。これらホットゾーンは有効配列または予測(contemplated)配列に基づき規定され、好ましい最大長さ200 bpを有する。上記の基準に基づいて、例示的なホットゾーンを設計した。これらホットゾーンを表1に示す。
表1
例示的なホットゾーン
Figure 0005122474
4.DNAiオリゴマー
一つの側面において、DNAiオリゴヌクレオチドは生理条件下で以下の配列にハイブリダイズするあらゆるDNAiオリゴマーであり得る: 配列番号1、配列番号282、配列番号462、配列番号936、配列番号1081、配列番号1249 および/または 1254。別の側面において、DNAiオリゴヌクレオチドは、配列番号1、配列番号282、配列番号462、配列番号936、配列番号1081および配列番号1249における例示的なホットゾーンに生理条件下でハイブリダイズするあらゆるDNAiオリゴマーであり得る。DNAiオリゴマーの例としては、これらに限定されないが、配列番号2-281、283-461、463-935、937-1080、1082-1248、1250-1253 および 1267-1447 およびそれらの相補鎖のDNAiオリゴマーが挙げられる。別の側面において、DNAiオリゴヌクレオチドは配列番号 2-22、283-301、463-503、937-958、1082-1109、1250-1254 および1270-1447 およびそれらの相補鎖である。これらの側面の１つの態様において、DNAiオリゴヌクレオチドは15-35 塩基対の長さである。
bcl-2 遺伝子について、DNAiオリゴマーは配列番号1249または1254にハイブリダイズするあらゆるDNAiオリゴマーであり得る。別の側面において、DNAiオリゴマーは配列番号1249のヌクレオチド500-2026、ヌクレオチド500-1525、ヌクレオチド800-1225、ヌクレオチド 900-1125、ヌクレオチド950-1075 またはヌクレオチド970-1045またはそれらの相補鎖にハイブリダイズするあらゆるオリゴマーであり得る。別の側面において、DNAi オリゴヌクレオチドは生理的条件下で配列番号1249における例示的なホットゾーンにハイブリダイズするあらゆるDNAi オリゴマー でありうる。DNAi オリゴマーの例としては、限定されないが、配列番号1250-1253および1267-1447 およびそれらの相補鎖に示すDNai オリゴマーが挙げられる。かかる側面のある態様において、DNAi オリゴヌクレオチドは15-35 塩基対の長さである。
別の態様において、DNAiオリゴマーは、配列番号1250、1251、1252、1253、1267-1447 またはそれらの相補鎖でありうる。さらに別の態様において、DNAiオリゴマーは、配列番号1250、1251、1267、1268、1276、1277、1285、1286 またはそれらの相補鎖であり得る。さらに別の態様において、DNAiオリゴマーは配列番号1250、1251、1289-1358 またはそれらの相補鎖であり得る。さらに別の態様において、DNAiオリゴマーは配列番号1250 または1251であり得る。
かかる側面のさらなる態様において、DNAiオリゴマーはbcl-2 配列の正の鎖の配列を有し、したがって、その配列の負の鎖に結合する。
その他の側面において、DNAiオリゴマーはDNAi オリゴヌクレオチドの混合物を含みうる。例えば、DNAiオリゴマーはそのそれぞれが配列番号1249および1254の異なる部分にハイブリダイズする複数のDNAiオリゴヌクレオチドを含みうる。DNAiオリゴマーはこれらの配列のオーバーラップ領域にハイブリダイズすることができるか、または、DNAiオリゴマーは非オーバーラップ領域にハイブリダイズしうる。別の態様において、DNAiオリゴマーは配列番号1250、1251、1252、1253、1267-1447 またはそれらの相補鎖であり得、ここでDNAiオリゴマーの混合物は、少なくとも2つの異なる配列のDNAiオリゴマーを含む。
別の態様において、DNAiオリゴマーは、そのそれぞれが異なる遺伝子の調節領域にハイブリダイズするDNAiオリゴマーの混合物を含みうる。例えば、DNAiオリゴマーは、配列番号1249または1254にハイブリダイズする第一のDNAiのオリゴマーおよび第二の遺伝子の調節領域にハイブリダイズする第二のDNAiオリゴマーを含みうる。ある態様において、DNAiオリゴマーは、配列番号1250-1254または1267-1447のDNAiオリゴマーまたはそれらの相補鎖、および配列番号1、配列番号282、配列番号462、配列番号936、または配列番号1081またはそれらの相補鎖にハイブリダイズするDNAiオリゴマーを含む。別の態様において、DNAiオリゴマーは、配列番号 1250 または1251 またはそれらの相補鎖および、配列番号1、配列番号282、配列番号462、配列番号936、または 配列番号1081 またはそれらの相補鎖にハイブリダイズするDNAiオリゴマーを含む。さらに他の態様において、DNAiオリゴマーは、配列番号号1250または 1251 またはそれらの相補鎖および配列番号2-281、283-461、463-935、937-1080および082-1248、またはそれらの相補鎖のいずれかを含む。
ある態様において、本発明は、特定の部位でメチル化されたDNAiオリゴヌクレオチド治療薬を提供する。本発明は特定の機構に限定されない。実際、機構の理解は本発明の実施に必須ではない。にもかかわらず、遺伝子活性の調節の１つの機構はDNA におけるシトシン残基のメチル化であると考えられる。5-メチルシトシン (5-MeC)はDNAにおいて検出される唯一の天然の修飾塩基である (Ehrlick et al.、Science 212:1350-1357 (1981))。 すべての遺伝子がメチル化によって調節されているわけではないが、多数の遺伝子の特定の部位または特定の領域での低メチル化が活動的な転写と相関している (Doerfler、Annu. Rev. Biochem. 52:93-124 [1984]; Christman、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 108:49-78 [1988]; Cedar、Cell 34:5503-5513 [1988])。DNA メチル化はインビトロでは無細胞系における遺伝子の効率的な転写またはトランスフェクトされた遺伝子の一過性発現を防止しうる。いくつかの特定のシス調節領域におけるC 残基のメチル化はまた、転写因子または抑制因子の結合を阻害または促進しうる(Doerfler、前掲; Christman、前掲; Cedar、Cell 34:5503-5513 (1988); Tate et al.、Curr. Opin. Genet. Dev. 3:225-231 [1993]; Christman et al.、Virus Strategies、eds. Doerfler、W. & Bohm、P. (VCH、Weinheim、N.Y.) pp. 319-333 [1993])。
DNA メチル化の正常パターンの破壊は癌の発症と関連づけられてきた(Christman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7347-7351 [1995])。腫瘍および腫瘍由来細胞株からのDNAの5-MeC含量は一般に正常組織よりも低い (Jones et al.、Adv. Cancer Res 40:1-30 [1983])。特定の癌遺伝子、例えば、 c-myc、c-Ki-ras およびc-Ha-rasの低メチル化が様々なヒトおよび動物腫瘍において検出されてきた (Nambu et al.、Jpn. J. Cancer (Gann) 78:696-704 [1987]; Feinberg et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun. 111:47-54 [1983]; Cheah et al.、JNCI73:1057-1063 [1984]; Bhave et al.、Carcinogenesis (Lond) 9:343-348 [1988]。ヒト腫瘍進行のもっともよく研究された例の一つでは、DNAの低メチル化が結腸癌の発症における初期現象であることが示されている(Goetz et al.、Science 228:187-290 [1985])。メチル化による干渉はインビボで腫瘍形成を導きうる。メチル化阻害剤、例えば、 L-メチオニンまたは5-アザシトジンの供給、あるいはリポトロープ(lipotrope)を枯渇した食餌の供給による5-アデノシンメチオニンの重篤な欠損はラットにおいて肝臓腫瘍の形成を誘導することが報告されている(Wainfan et al.、Cancer Res. 52:2071s-2077s [1992])。研究により極端なリポトロープ欠損食は、遺伝子、例えば、 c-myc、ras およびc-fosの特定の部位におけるメチル基の欠失を導きうることが示されている(Dizik et al.、Carcinogenesis 12:1307-1312 [1991])。低メチル化はDNA MTase 活性の高いレベルの存在にもかかわらず起こる(Wainfan et al.、Cancer Res. 49:4094-4097 [1989])。持続的に活性の増殖に必要な遺伝子は分化の際にメチル化されると不活性になり、組織特異的遺伝子は低メチル化されて活性となる。低メチル化は２つの段階の間の均衡をシフトさせうる。ある態様において、本発明の混合物はしたがってこの天然の現象を利用して、特定の遺伝子プロモーターの部位特異的メチル化に適応され得、それによって特定の遺伝子の転写、そして翻訳を妨げる。別の態様において、本発明の混合物は、目的遺伝子(例えば、 腫瘍抑制遺伝子)の発現を遺伝子のメチル化パターンを変化させることによって上方制御するために適応されうる。
本発明はメチル化DNAiオリゴヌクレオチドの使用に限定されない。実際、非メチル化DNAiオリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害のための使用が本発明により具体的に考慮される。
DNAi オリゴヌクレオチドは天然の状態であるものもあり、核酸塩基、糖部分および/またはヌクレオシド間結合に修飾または置換を含むものもある。
核酸塩基には天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基が含まれる。かかる核酸塩基の例としては、限定されないが アデニン、シトシン、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、グアニン、チミン、ウラシル、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、5-プロピニルシトシン、5-プロピニ-6-フルオロウラシル、5-メチルチアゾールウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、7-デアザグアニン、7-デアザアデニン、3-デアザグアニン、3-デアザアデニン、8-アザグアニン、8-アザアデニン、7-プロピン-7-デアザアデニン、7-プロピン-7-デアザグアニン、2-クロロ-6-アミノプリン、4-アセチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシル-メチル) ウラシル、5-フルオロウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルシュードウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニンおよびその他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、2-プロピル アデニンおよびその他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、2-アミノアデニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルクエオシン、5’-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、2-チオチミン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アゾ ウラシル、シトシン およびチミン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-ヒドロキシルおよびその他の 8-置換アデニンおよびグアニン、5-トリフルオロメチル ウラシルおよびシトシン、N-ウラシル-5-オキシ酢酸 メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、クエオシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-チオシトシン、2,6-ジアミノプリン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6 置換プリン、例えば、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンが挙げられる。
DNAiオリゴヌクレオチドは、リボースおよびデオキシリボース以外の糖を有し得、例えば、アラビノフラノース (国際公表第WO 99/67378号に記載、これは引用により本明細書に含める)、キシロアラビノフラノース (米国特許第6,316,612 および 6,489465号に記載、これらは引用により本明細書に含める)、α-スレオフラノース (Schoening、et al. (2000) Science、290、1347-51、これは引用により本明細書に含める) および L-リボフラノースが挙げられる。糖模倣体はヌクレオチド中の糖と置換できる。これらには、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロヘキサン (Wang et al.(2000) J. Am. Chem. Soc. 122、8595-8602; Vebeure et al. Nucl. Acids Res. (2001) 29、4941-4947、これらは引用により本明細書に含める)、トリシクロ基 (Steffens、et al. J. Am. Chem. Soc. (1997) 119、11548-11549、これは引用により本明細書に含める)、シクロブチル基、ヘキシトール基 (Maurinsh、et al. (1997) J. Org. Chem、62、2861-71; J. Am. Chem. Soc. (1998) 120、5381-94、これらは引用により本明細書に含める)、アルトリトール基 (Allart、et al.、Tetrahedron (1999) 6527-46、これは引用により本明細書に含める)、ピロリジン基 (Scharer、et al.、J. Am. Chem. Soc.、117、6623-24、これは引用により本明細書に含める)、フラノース環の酸素をメチレン基に置換することにより得られる炭素環基(Froehler and Ricca、J. Am. Chem. Soc. 114、8230-32、これは引用により本明細書に含める) またはSと置換することにより得られる4’-チオフラノース (Hancock、et al.、Nucl. Acids Res. 21、3485-91、これは引用により本明細書に含める)、および/またはモルホリノ基 (Heasman、(2002) Dev. Biol.、243、209-214、これは引用により本明細書に含める)が含まれる。モルホリノオリゴヌクレオチドはGene Tools、LLC (Corvallis Oregon、USA)から市販されている。
DNAiオリゴヌクレオチドは「ロックされた(locked)核酸」または「LNA」も含みうる。LNAは二環式、三環式または多環式でありうる。LNAには多数の種類のモノマーが含まれ、その１つを式 Iに示す。
Figure 0005122474
 I
［式中：
Bは核酸塩基を構成する;
Z* はヌクレオシド間結合および末端基から選択される;
Z は先行するヌクレオチド/ヌクレオシドのヌクレオシド間結合に対する結合および末端基から選択され、ただし、Zと Z*との一方のみが末端基であり得る;
Xおよび Yは独立に、-O-、-S-、-N(H)-、-N(R)-、-CH2- または-C(H)=、 CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2- または-CH2-C(H)=、-CH=CH- から選択される;
ただし、XおよびYは両方がOであることはない］。
式 XVIII で示すLNA [2’-Y,4’-C-メチレン-β-D-リボフラノシル] モノマー ([2,2,1] ビシクロヌクレオシド)に加えて、LNAまたはLNA*ヌクレオチドには、その他のフラノースまたはその他の 5 または6-員環を有するおよび/または 異なるモノマー形、例えば、2’-Y,3’ 結合および 3’-Y,4’ 結合、1’-Y,3結合、1’-Y,4’ 結合、3’-Y,5’ 結合、2’-Y、5’ 結合、1’-Y,2’ 結合ビシクロヌクレオシドなどの「ロックされた核酸」も含まれうる。上記LNAはすべて異なる不斉中心を用いて得ることが出来、その結果、例えば、 LNA [3’-Y-4’-C-メチレン (またはエチレン)-β (またはα)-アラビノ-、キシロ-またはL-リボ-フラノシル] モノマーが生じる。LNA オリゴヌクレオチドおよびLNA ヌクレオチドは国際公開第WO 99/14226号および以下の出願に一般に記載されている; 国際公開第WO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 02/094250、WO 03/006475号; 米国特許第6,043,060、6268490、6770748、6639051号、および 米国特許公開第2002/0125241、2003/0105309、2003/0125241、2002/0147332、2004/0244840 および 2005/0203042号、これらはすべて引用により本明細書に含める。LNA オリゴヌクレオチドおよび LNA アナログオリゴヌクレオチドは、例えば、Proligo LLC、6200 Lookout Road、Boulder、CO 80301 USAから市販されている。
DNAi オリゴヌクレオチドのヌクレオチド誘導体は２’糖位置に以下のいずれかを含むヌクレオチドを含みうる: OH; F; O-、S-、または N アルキル; O-、S-、またはN-アルケニル; O-、S- またはN-アルキニル;または O-アルキル-O-アルキル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換 C1〜C10 アルキルまたはC2〜C10 アルケニルおよびアルキニル、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2) nOCH3、O(CH2) nNH2、O(CH2) nCH3、O(CH2) nONH2、およびO(CH2) nON[(CH2) nCH3)] 2、ここでnおよびm は1から約 10、 C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、2’-メトキシエトキシ (2’-O-CH2CH2OCH3、2’-O-(2-メトキシエチル) または2’-MOEとしても知られる) (Martin et al.、Helv. Chim. Acta 78:486 [1995]) 即ち、アルコキシアルコキシ 基、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ (即ち、O(CH2)2ON(CH3)2 基)、’ DMAOEとも称される、および2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ (2’-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’-DMAEOEとも称される)、即ち、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH2) 2、2’-メトキシ (2’-O-CH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)および 2’-フルオロ (2’-F) であり得る。同様の修飾を DNAi オリゴヌクレオチドのその他に位置、特に3’ 末端ヌクレオチドまたは2’-5’連結DNAi オリゴヌクレオチドの糖の3’位置および5’末端ヌクレオチドの5’位置に行うことが出来る。
ある態様において、DNAi オリゴヌクレオチドは非天然 ヌクレオシド間結合(internucleoside linkage)を有する。本明細書に規定されるように、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーンにリン原子を保持するものとバックボーンにリン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のために、ヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。
修飾DNAiオリゴヌクレオチドバックボーンとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレナート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキル ホスホネート、例えば、3’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホラミデート、例えば、3’-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常 3’-5’結合を有するボラノホスホネート、これらの2’-5’結合アナログ、および逆の極性を有するものであって、ヌクレオシド単位の隣接する対が3’-5’から 5’-3’ または2’-5’ から 5’-2’に連結しているものが挙げられる。さまざまな塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
リン原子を含まない修飾DNAiオリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合 (ヌクレオシドの糖部分から一部形成される); シロキサンバックボーン; スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン; ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン; メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン; アルケン含有バックボーン; スルファメートバックボーン; メチルレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン; スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン; アミドバックボーン; および混合N、O、S およびCH2 構成部分を有するその他のものが含まれる。
その他のDNAiオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方(即ちバックボーン)が新しい基と置換される。塩基単位は適当な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー性化合物であって、優れたハイブリダイゼーション特性を示すオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸 (PNA)と称される。PNA 化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、具体的には、アミノエチルグリシンバックボーンに置換されている。核酸塩基は保持されており、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。PNA 化合物の調製を教示する代表的な特許としては、これらに限定されないが、米国特許第5,539,082; 5,714,331;および 5,719,262号が挙げられ、これらはそれぞれ引用により本明細書にその内容を含める。PNA 化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.、Science 254:1497 (1991)に見ることが出来る。
ある態様において、本発明のDMAiオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリゴヌクレオチドおよび、ヘテロ原子バックボーン、具体的には、上記引用 米国特許第5,489,677号の、 -CH2、-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2- [メチレン (メチルイミノ) または MMI バックボーンとして知られる]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2、および -O-N(CH3)-CH2-CH2- [ここでネイティブなホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として表される]、および上記引用 米国特許第5,602,240号のアミド バックボーンを有するオリゴヌクレオシドである。また、オリゴヌクレオチドは、上記引用米国特許第5,034,506号のモルホリノバックボーン構造を有するものもある。
ある態様においてDNAiオリゴヌクレオチドは下記一般構造を有するホスホロチオエートバックボーンを有する。
Figure 0005122474
本発明のDNAi オリゴヌクレオチドのさらなる修飾は、DNAi オリゴヌクレオチドの3’ および/または 5’ 末端のさらなるヌクレオチドの追加を含む。3’ および 5’テイルはいかなるヌクレオチドを含んでもよく、１ヌクレオチドの短さであっても、 20 ヌクレオチドの長さであってもよい。
本発明のDNAiオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの１以上の部分への化学結合またはオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞の取り込みを増強するコンジュゲートが含まれる。かかる部分としては、これらに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、(例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール)、チオコレステロール、脂肪族鎖、(例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基)、リン脂質、(例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム-1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分が挙げられる。
当業者であれば上記の修飾を含むオリゴヌクレオチドの作成方法には精通している。本発明は上記のDNAiオリゴヌクレオチドに限定されない。あらゆる好適な修飾または置換を利用できる。ただし、DNAiオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸オリゴヌクレオチドまたはその誘導体であって、その配列が、ある遺伝子の最も長い非転写領域の一部に部分的には相補的であって、そのなかのオリゴヌクレオチドが間接的または直接的に同じまたは異なる遺伝子の発現、制御 または産生に影響し、もっとも長い非転写領域は転写開始部位が翻訳開始部位に非常に近い部位である場合、転写されない遺伝子のいずれかの部分を含む。DNAiオリゴヌクレオチドは mRNAまたはプレ-mRNAとのみ塩基対形成し、RNA プロセシング および/またはメッセンジャー翻訳と干渉するRNAiおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含まない。
所与の化合物のすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際２以上の上記修飾を単一の化合物に組み込むことが出来るし、DNAiオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むことも出来る。本発明は下記のように本発明のDNAi オリゴヌクレオチド化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。
5.DNAiオリゴヌクレオチドの調製および処方
オリゴヌクレオチド合成の既知のあらゆる方法を本発明の修飾DNAiオリゴマーの調製に用いることが出来る。ある態様において本発明の教示に従い、メチル化DNAiオリゴヌクレオチドを用いて、ヌクレオチド、dCが適宜5-メチル-dCに置換される。本発明の修飾または非修飾DNAi オリゴヌクレオチドはもっとも便宜にはいずれかの市販の自動核酸合成機を用いて調製される。それらは顧客の指示にしたがってオリゴヌクレオチドを注文合成する市販源から得ることが出来る。
さらなる態様において、ドセタキセルおよびその他を含む化学療法薬は、リポソームに捕捉される前または最中にDNAi オリゴマーと一緒にされうる。
C.両性リポソーム製剤
1.説明
有利なことに、本発明の混合物の両性リポソーム製剤は、(1)低い毒性を示し; (2) 高濃度のDNAi オリゴマーを捕捉することができ、例えば、両性リポソームに会合するDNAi オリゴヌクレオチドの捕捉効率は少なくとも約 35%であり; (3)例えば、オリゴヌクレオチドおよび/またはその他の薬剤が標的組織または細胞に最終的に取り込まれるまでリポソーム中に安定に捕捉されるよう全身投与した場合、血流中で安定であり; (4) 動物への送達について、例えば、約 10 〜 100 mM またはそれ以下の脂質濃度について捕捉されたDNAi オリゴヌクレオチドの濃度を約 1〜4 mg/ml (例えば 約 2 mg/ml)に調整することにより最適化でき、かかる濃度は、200 μlの注入体積において10 mg/kgの投与量を提供する; および (5) 200 nmより小さい平均両性リポソームサイズ、例えば 約 100 nmにて産生でき、腫瘍への浸透が最大化できる。
上記のように、両性リポソームは、１以上の DNAi オリゴヌクレオチド、１以上の両性脂質または両性の性質を有するアニオン性およびカチオン性脂質成分の混合物および１以上の中性脂質を含む。
一般に、カチオン性脂質または両性脂質上の正の電荷はDNAi オリゴヌクレオチドに結合する作用をする。アニオン性脂質、例えば CHEMS、または両性脂質および中性脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミン上のアニオン性電荷は両性リポソームの融合の性質を可能とする。
本発明のある態様において、両性リポソームは両性脂質を含む脂質相から形成されうる。脂質相は 5 〜 30 mole%または10 〜 25 mole%の両性脂質を含みうる。あるいは、両性リポソームは、両性の性質を有する脂質成分の混合物を含む脂質相から形成されうる。荷電した脂質の総量は脂質混合物の5 〜 95 mole%、20 〜 80 mole% または30 〜 70 mole%で変動しうる。
カチオン性脂質のアニオン性脂質に対するパーセントの比は約 3 〜0.5 または約 2〜 0.5でありうる。 ある態様において、カチオン性脂質のアニオン性脂質に対する比は約 2である。別の態様において、カチオン性脂質のアニオン性脂質に対する比は約 1である。別の態様において、カチオン性脂質のアニオン性脂質に対する比は約 0.5である。
カチオン性およびアニオン性脂質の具体的対としては、限定されないが、MoChol および CHEMS、DOTAPおよびCHEMS、MoCholおよびCet-P、ならびに MoCholおよびDMGSuccが挙げられる。荷電した脂質対の例としてはさらに、限定されないが、約 10 〜 60 mole% の MoCholおよび 約 10 〜 30 mole%のCHEMS; 約 5 〜 30 mole% のDOTAP および約 10 〜 30 mole% の CHEMS; 約 10 〜 40 mole%のMoCholおよび約 5 〜 30 mole%のCet-P;ならびに約 20 〜 60 mole%のMoCholおよび 約 20 〜 60 mole%のDMGSuccが挙げられる。
両性リポソームは、ステロールまたはリン脂質およびそれらの混合物であり得る中性脂質も含む。 両性リポソームは中性脂質を脂質混合物の約 5 〜 95 mole%、約 20 〜 80 mole%、または 30 〜70 mole%の量にて含む。
多数の中性脂質の組合せが両性リポソームの形成に有用であり、例えば POPCおよびDOPE; およびPOPC およびコレステロールが挙げられる。一方、中性脂質である DOPE とコレステロールとの組合せは好ましくない。ある態様において、中性脂質の混合物は 5 〜 40 mole%のPOPCおよび20 〜 50 mole%のDOPE;あるいは10 〜 50 mole%の POPC および 30 〜 50 mole%の コレステロールを含む。荷電した脂質の中性脂質に対するパーセンテージの比は約 3〜0.2でありうる。ある態様において、荷電した脂質の中性脂質に対するパーセンテージの比は約 2である。別の態様において、荷電した脂質の中性脂質に対するパーセンテージの比は約 0.5である。
DNAi オリゴマー、例えば PNT-100 (配列番号1251)を捕捉するための荷電脂質および中性脂質の具体的な組合せの例としては、POPC、DOPE、MoChol および CHEMS; POPC、DOPE、DMGSuccおよび MoChol; POPC、DOTAP、CHEMS およびコレステロール; およびPOPC、MoChol、Cet-P およびコレステロールが挙げられる。ある態様において、DNAi オリゴマー、例えば 配列番号1251を捕捉するための両性リポソームは、3-20 mole%の POPC、10 〜 60 mole%の DOPE、10 〜 60 mole%の MoChol および10 〜 60 mole%の CHEMSを含む。両性リポソームは、POPC/DOPE/MoChol/CHEMSをモル比約 6/24/47/23および約 15/45/20/20で含みうる。別の態様において、両性リポソーは3-20 mole%の POPC、10 〜 40 mole%の DOPE、15 〜 60 mole%の MoCholおよび15 〜 60 mole%の DMGSuccを含む。両性リポソームは POPC/DOPE/DMGSucc/MoCholをモル比約 6/24/23/47 および約 6/24/47/23にて含みうる。さらに別の態様において、両性リポソームは10 〜 50 mole%の POPC、20 〜 60 mole%の Chol、10 〜 40 mole%の CHEMSおよび5 〜 20 mole%の DOTAPを含む。両性リポソームは POPC/Chol/CHEMS/DOTAPをモル比約 30/40/20/10にて含みうる。さらに別の態様において、両性リポソームは10 〜 40 mole%の POPC、20 〜 50 mole%の Chol、5 〜 30 mole%の Cet-P および 10 〜 40 mole%の MoCholを含む。両性リポソームはPOPC/Chol/Cet-P/MoCholをモル比約 35/35/10/20にて含みうる。
一般に、中性脂質とともにカチオン性およびアニオン性脂質の両性I、II、またはIII 脂質対はリポソームの形成に使用でき、ただし、結果として得られるリポソームは両性であり、血清安定性を示し、低い毒性を有し、十分な量のDNAi オリゴヌクレオチドを、例えば、効率約 35%、(約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%またはそれ以上) で捕捉し、脂質濃度100 mM またはそれ以下についてDNAi オリゴヌクレオチド濃度を少なくとも 2 mg/mlとする調整を提供するものとする。
2. 両性リポソームの調製
本発明のDNAi-両性リポソームは当業者に知られたリポソームの調製およびサイズ調整のための標準的方法により調製できる。これらには、脂質フィルムおよび粉末の水和、溶媒注入および逆相蒸発が含まれる。しばしば、多重膜ベシクルは両親媒性脂質が水和すると自然に形成するが、小単層ベシクルの形成には通常、実質的なエネルギー入力を伴うプロセス、例えば、超音波処理、高圧均質化、エタノール中の脂質 溶液の捕捉すべきDNAi オリゴヌクレオチドを含む水相への注入、および/または所定の孔サイズのフィルターまたはメンブレンを通る押出が要求される。リポソームの調製および特徴決定の方法は、例えば、S. Vemuri et al. (Preparation and characterization of liposomes as therapeutic delivery systems: a review. Pharm Acta Helv. 1995、70(2):95-111.)に記載されている。
DNAi オリゴヌクレオチドの溶液は中性 pHにて賦形剤と接触され得、その結果、特定のパーセンテージの溶液の受動的搭載手順が起こる。約 50 mM〜約 150 mMの高濃度の賦形剤の使用は、活性薬剤の実質的な封入を達成するための１つの方法である。賦形剤には DNAi オリゴヌクレオチドの搭載を開始または促進しうる物質が含まれる。賦形剤の例としては、限定されないが、一価のアニオン、例えば、クロリド、酢酸イオン、ラクトビオン酸イオンおよびギ酸イオン; 二価のアニオン、例えば、アスパラギン酸イオン、コハク酸イオンおよび硫酸イオン; および三価のイオン、例えば、クエン酸イオン、リン酸イオンの、酸、ナトリウムまたはアンモニウムの形態が含まれる。
本発明に用いられる両性リポソームはオリゴヌクレオチドが等電点以下で結合し、リポソーム表面に活性薬剤を濃縮させるという顕著な利点を提供する。進行型(advanced)搭載手順はPCT 国際公開 WO02/066012により詳細に記載されている。
単層リポソームを形成するために、剪断力がDNAi-オリゴヌクレオチド脂質混合物の水性分散液に適用される。剪断力は、超音波処理により、微少溶液化装置、 例えば、ホモジナイザーまたはフレンチプレス、注入、凍結および解凍、界面活性剤溶液の脂質からの透析、限外ろ過、フィルターを介する押出またはその他のリポソームの調製に用いられることが知られている方法を用いて適用されうる。リポソームのサイズは様々な既知の技術を用いて、例えば剪断力の持続時間により制御しうる。
捕捉されていない DNAi オリゴマーは透析を用いるバッファー交換、サイズ排除クロマトグラフィー (例えば、Sephadex G-50 樹脂)、限外ろ過 (100,000-300,000 分子量カットオフ)、または遠心分離により両性リポソーム分散液から除くことが出来る。
一つの態様において、DNAi オリゴヌクレオチドを搭載した両性リポソームは機械押出により製造できる。いったん脂質がオリゴヌクレオチドと混合されると、機械押出を用いて押出し出来、用いる機械は米国特許 6843942号および米国特許出願2004/0032037号に記載されている。リポソームはリポソームの直径が50 nm から200 nmとなるように搭載およびろ過され、オリゴヌクレオチドの封入効率は少なくとも 約 35%であり、結果として得られるリポソームは、脂質濃度10 〜 100 mM またはそれ以下にて少なくとも 2 mg/mlのDNAi オリゴヌクレオチド濃度を有する。
VII. 動物または細胞のDNAi オリゴマーを捕捉する両性リポソームによる治療
本発明の組成物は癌を治療するための動物、例えばヒトまたは細胞の処理に有用であり、例えばこれは腫瘍増殖の阻害または低下による。動物は非ヒト動物であってよく、マウス、ウマ、ネコ、イヌ、またはその他の動物が含まれ、あるいはヒトであってもよい。 一つの態様において、混合物を動物に 用量1 mg 〜100 mg/kg体重にて導入する。 別の態様において、両性リポソームは動物に１日１回以上または連続的に導入してもよい。
混合物は様々な経路で動物に投与されうる。投与 は局所 (例えば、眼、粘膜、 例えば膣、直腸送達)、肺 (例えば、粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入、例えばネブライザによる;気管内、鼻腔内、経上皮および経皮)、経口または非経口でありうる。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注入または注射; あるいは脳内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与が挙げられる。投与は医療機器を介して行ってもよい。
リポソームは様々な癌由来の培養細胞に投与してもよく、例えば、膵臓癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、卵巣癌または黒色腫が挙げられる。
リポソームはDNAi オリゴヌクレオチドを選択された組織に様々な技術を用いて標的化するのに利用できる。この手順にはリポソームのサイズ 、その正味の表面電荷ならびに投与経路の操作が含まれる。 より具体的な操作は、受容体リガンドでリポソームを標識することであり、例えば、膜と核内受容体リガンドまたは特定の組織または細胞に対する抗体が挙げられる。抗体またはリガンドはリポソームの表面に結合させることが出来る。
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に説明するが、請求項に記載の本発明の範囲を限定する意図ではない。
実施例１.材料
MoCholおよびHisCholの合成は米国特許出願2004/0131666 (WO 02/066490)に記載のものとした。その他の脂質は市販源から得られる。例えば、DOTAPおよびコレステロールはMerckから得られ、DMG-Succ は Chiroblock GmbHから得られ、CHEMSはSigma Chemical Companyから入手でき、DPPG、DOPE およびPOPCは GenzymeまたはLipoid GMBHから得られ、卵ホスファチジルコリンは Lipoid GMBHから入手できる。
実施例２.DNAiオリゴヌクレオチドを搭載(charged)した両性リポソームの産生
リポソームの脂質組成ならびにその調製方法は腫瘍浸透を最大化するために、封入効率が約 35%以上となり、リポソームサイズが200 nm未満、最適には100-120 nm付近になるように選択する。動物への投与のために、DNAi オリゴヌクレオチド濃度は脂質濃度100 mM またはそれ以下にて好ましくは少なくとも 2 mg/mlである。これにより200 μlの注入体積において10 mg/kgの投与が可能となる。
リポソームは改変脂質フィルム/水和/押出方法により生産される。脂質をクロロホルムまたはクロロホルム/メタノールに溶解し、ロータリーエバポレーターにおいて完全に乾燥させる。脂質フィルムを次いで、バッファー中に水和した様々な量の DNAi オリゴヌクレオチド配列番号1251 (PNT100)または PNT-100の相補鎖(PNT-100R)により水和する。
A.進行型（Advanced)搭載手順
2400 μmoleの脂質を48.8〜95.2 mgのDNAi オリゴヌクレオチドを含む10 mM NaOAc、150 mM NaCl (クエン酸を用いてpHを調整した)で40℃で30分間水和する。３回の凍結解凍工程の後、結果として得られた多重膜ベシクルを数回高圧ポンプを用いてポリカーボネートメンブレン (100 nm 孔サイズ)に通す。押出工程の直後、リポソーム懸濁液のpHはpH 7.5にシフトする。結果として得られた懸濁液をT865 (Sorvall Ultra Pro80) またはTLA 100.4ローター (Beckman Optima-MAX)を用いて25ｓで沈降させて非捕捉DNAi オリゴヌクレオチドを除き、バッファーをリン酸緩衝食塩水 (PBS)と交換する。
B. 受動的搭載手順
脂質フィルムを405 mgのDNAi オリゴヌクレオチドを含有するPBS で1時間40℃で最終脂質濃度 100 mMにて水和する。３回の凍結解凍工程の後、結果として得られたベシクルを押し出して100 〜800 nmの様々な孔サイズを有するポリカーボネートメンブレンスタックに通す。結果として得られた 懸濁液を25ｓで３回沈降させる(PBSはリン酸緩衝食塩水であり以下の処方を有する: 10.1 mM Na2PO4、1.76 mM KH2PO4、137 mM NaCl、2.68 mM KCl、pH 7.5)。
C. 機械押出
ベシクルを受動的または進行型搭載手順により調製し、脂質ベシクルの生産のための装置を用いて押し出す。
粒子特性をZetasizer 3000 HAS (Malvern)を用いて測定した。リポソームを適当なバッファーに希釈して最終脂質濃度0.2-0.6 mMとした。サイズの値はZ 平均として記録し、サイズ分布を Multimodal モードにて計算した。ゼータ電位の測定のために、リポソームも0.2-0.6 mM 濃度に希釈した。
表２：リポソーム製剤
Figure 0005122474
表2におけるすべての製剤について、手作業または機械押出を用いる能動的搭載は一般により良好な結果をもたらした。封入効率は37-77%の範囲であり、リポソームサイズは124-201 nmの範囲であり、脂質濃度100 mM でのDNAi オリゴヌクレオチド濃度は1.1〜3.5 mg/mlの範囲であった。機械押出も手動押出と同様の結果をもたらしたが、ただし、おそらく機械押出の結果より均一なリポソームサイズ、135-179 nmの範囲、が達成された。機械押出は大きい体積について好ましい。
受動的搭載手順の結果封入効率はより低く、11-21%の範囲であった。しかし、リポソームサイズは122-182 nmの範囲であり、脂質濃度100 mMでのオリゴヌクレオチド濃度は2.0-3.7 mg/mlの範囲であった。機械押出の試みにより高い背圧が生じたのですべての受動的搭載された製剤は手作業で押し出した。
進行型搭載手順は、20% 未満のカチオン性脂質を含む製剤の低い搭載能力によりすべての製剤に用いることは出来なかった。その結果、DOTAP を10%含む製剤 B は進行型搭載手順によっては効率的に搭載できず、受動的搭載手順を用いた。
低いpH (N/P) 3.3でのカチオン性脂質電荷のアニオン性ヌクレオチド電荷に対する比は、小さい粒子、高い封入効率 および脂質濃度に対する高いDNAi オリゴヌクレオチド濃度、即ち10 〜 100 mM 脂質濃度にて少なくとも 2.0 mg/ml のDNAi オリゴヌクレオチドを生じるためにもっともよい妥協案であることが判明した。
D. PNT 2254およびPNT 2253の調製
リポソームを改変エタノール注入方法により産生する。簡単に説明すると、脂質混合物 D (POPC/DOPE/MoChol/Chems 6:24:47:23) (133mM、55℃に加熱)を含む3 体積のエタノール、および、PNT2254またはPNT2254R 産生の場合2.71 mg/ml PNT100 (配列番号1251)またはPNT100-R (配列番号1288) あるいはPNT2253 産生の場合1.36 mg/ml PNT100を含む8 体積の20mM NaAc/300mM スクロース/pH 4を、米国特許 6843942号および米国特許出願 2004/0032037号に開示のような注入装置を用いて連続的に混合した。酸性混合物を32 体積の100mM NaCl / 136mM ホスファート / pH 9によるさらなる連続混合工程によりpH 7.5 とした。その結果得られたリポソーム懸濁液を 10倍濃縮し、PBS、pH 7.4に対して透析して未封入PNT100 またはPNT100-R および過剰のエタノールを洗い流した。
実施例３．両性リポソームからのDNAiオリゴヌクレオチドの血清抵抗性および漏出
脂質比をリポソームの血清中の安定性およびDNAi オリゴヌクレオチドの最小の漏出の両方について最適化しうる。上記製剤は血清中で安定であり、オリゴヌクレオチドの最小の漏出を示しうる。
実施例４．PNT-100に対するWSU-DLCL2腫瘍の応答
少なくとも 2 mg/mlの封入PNT-100 (配列番号1251)、40% より高い封入効率および200 nm未満の粒子サイズの規格を満たす３つの製剤(製剤 B、D、およびF、実施例 2参照) をヒトリンパ腫モデルにおいて試験した。リンパ腫細胞(WSU-DLCL2-Wayne State University Diffuse Large Cell Lymphoma)をDr. Ramzi Mohammad、Karmanos Cancer Institute、Wayne State Universityから得た。異種移植片をC17/SCIDマウスの皮下に移植した。移植の７日後、マウスの静脈内に10 mg/kgのPNT-100 (配列番号1251) 製剤および10 mg/kgのPNT-100R (配列番号1288) 製剤を注射した。注射は6匹のマウスに８日間毎日行った。腫瘍サイズを移植後30日まで測定した。すべての生存した動物は肉眼では毒性病状を示さなかった。
図 1における結果は、PNT-100が腫瘍増殖を遅延させたことを示す。340.9 および340.8はそれぞれPNT-100およびPNT-100Rによる製剤である。PNT-100を有する製剤 Dは製剤 Bおよび Fと比べて腫瘍増殖をより良好に遅延させ、毒性が低かった (データ示さず)。
PNT-100-リポソーム製剤 Dの別のロットを用いて行った実験も同様の結果を与え、これを図 2に示す。マウスに10 mg/kg PNT2253を毎日８日間、静脈内ボーラス注入で投与し、腫瘍体積応答をノギスで測定した(左パネル)。データは、異種移植片移植後28 日目、即ち薬剤治療の14日後に57% 腫瘍増殖阻害を示した(n =6; p = 0.004)。マウスに10 mg/kg PNT2253を毎日５日間静脈内ボーラス注入で投与し、腫瘍応答をノギスで測定した。データは、異種移植片移植の26日後、即ち薬剤治療の19 日後の46% 腫瘍増殖阻害を示す(n=8; p= 0.007)。研究は対照動物異種移植片が2000 mm3を超えたら終わらせた。
腫瘍負荷を腫瘍のサイズ測定から計算した。図3は、製剤 D 中のPNT-100であるPNT2253で処理されたマウスにおける腫瘍負荷は、PNT2253R (製剤 D 中のPNT-100R) または PBSで処理されたマウスにおける腫瘍負荷よりも劇的に低かったことを示す。
用量応答実験を製剤 D中のPNT-100、PNT-100 濃度 4 mg/ml (PNT2254)および 2 mg/ml (PNT2253)を用いてWSU-DLCL2 異種移植片担持マウスにおいて行った。6-8 週齡のC.B.-17 ACID マウスをTaconic (Hudson、NY)から得た。腫瘍がおよそ100 mm3の体積に達すると、PNT2253または PNT2254による処理を開始した。マウスには0、0.3、3、10、または 20 mg/kg のPNT2254を毎日５日間、30 mg/kg のPNT2254を毎日２日間、60 mg/kgのPNT2254を１回、0.3、3、または10 mg/kgの PNT2253を毎日５日間、20 mg/kgのPNT2253を毎日２日間または30 mg/kg のPNT2253を静脈内ボーラス注入で１回与えた (n=7 (PNT2254)または8 (PNT2255))。動物を少なくとも週に３回ノギス測定により腫瘍増殖についてチェックし、動物の体重を少なくとも週に３回測定した。すべての処理群の腫瘍体積を GraphPad（商標） 統計ソフトウェアを用いて分析した。
20 mg/kg/日の PNT2254 および10 mg/kg/日のPNT2253 の最大許容用量を確立した(図4 および5)。毒性はPNT2254について30 mg/kg/日、PNT2253について20 mg/kg/日にて達成され、動物の有効性により２日後に投与を停止した。急勾配の用量応答が１回の投与サイクルの後の延長された期間について強い抗腫瘍効力をもって観察された。様々な用量での２つの製剤のマウス体重に対する効果を測定し、図6に示す。両方の製剤について、10 mg/kg/日の用量は体重減少を最小にしつつ有効であった。
各用量の数学的測定を計算し、PNT2254およびPNT2253 薬剤処理対対照非薬剤処理腫瘍において750 mg サイズまで腫瘍増殖速度を低下させることにおける薬剤応答を判定した(表3 および4)。
表3. WSU-DLCL2-担持SCIDマウスにおけるPNT2254の抗腫瘍活性
Figure 0005122474
表4. WSU-DLCL2担持SCIDマウスにおけるPNT2253の抗腫瘍活性
Figure 0005122474
Tおよび Cは処理群 (T)および対照群 (C) 腫瘍についてのあらかじめ決められた重量 (750 mg)に達するまでの日数の中央値 (median times) である。T-Cは腫瘍増殖遅延の尺度であり、 処理(T)および対照(C)群の間で750 mgまでの日数の中央値の相違である。Log10 全殺傷(kill gross)= 日数で表すT-C 値/3.32 X Tdである。Td は対数増殖期において増殖している対照腫瘍の対数線形増殖プロットから評価した平均腫瘍倍加時間 (日数) である。Log10 全殺傷(kill gross) 値が高いほど、薬剤の効力は高く、2.8 を超える値は非常に有効であると考えられる(Corbett, T.H. et al., "Transplantable Syngeneic Rodent Tumors". Tumor Models in Cancer Research. Ed. Teicher B.A. Totowa, NJ: Humana Press Inc., 2002. 41-71)。体積および重量はCammisuli、S.、et al.、Int. J. Cancer、65、351-9、1996に記載の式にしたがって計算した。
PNT2253 処理の結果、 PNT2254と比較して毒性は高かった。PNT2253 と PNT2254との両方についてもっとも有効な用量は10 mg/kg/日であり、最大許容用量はPNT2254 について20 mg/kg/日でありPNT2253について10 mg/kg/日であった。
実施例５．PNT-100に対するPC-3腫瘍の応答
種々の製剤をPC-3 ヒト 前立腺癌モデルにおいて試験した。異種移植片を2 X 106 PC-3 細胞(ATCC CRL 1435) の ヌードマウスへの皮下注入により作成した。50-200 mm3の異種移植片を担持するマウスの静脈内に10 mg/kg の PNT-100 (配列番号1251)または PNT-100R (配列番号1288)を製剤B、DまたはFのいずれかにおいて1、2、および5日目に注射し、3 および4日目には7.5 mg/kg注射した。 結果はPNT-100による腫瘍増殖の低下を示す。PNT-100Rによっては腫瘍増殖は低下しなかった(図 7 および 8)。 N=5。
実施例６.サルにおける毒性
製剤 DにおけるPNT-100の毒性をカニクイザルにおいて調べた。２匹のこの霊長類を２時間PBS 対照、5 mg/kg PNT2254、25 mg/kg PNT2254の静脈内注入により処理し、１匹は 67 mg/kg PNT2254で処理した。各投与の間に１週間の「ウォッシュアウト」期間を設けた。肝臓酵素毒性分析、補体活性化、全体の挙動および生理測定値を各処理の前後に収集した。この研究の目的は最大許容用量閾値を確立し、PNT2254 脂質に対するCARPA 毒性応答がないことを確証することであった。CARPAは、極端な高血圧および死亡を導きうる非古典的補体経路活性化毒性応答に起因すると歴史的に知られている毒性応答である。霊長類はすべての用量に耐性で生存し、古典的補体活性化のみが検出され、非古典的 (生得的) 補体活性化は検出されなかった。肝臓酵素毒性分析はPNT2254に対する肝臓酵素応答のわずかな上昇を示した。
他の態様
本発明をその詳細な説明によって記載してきたが、上記の記載は本発明を説明する目的であって範囲を限定する意図ではなく、発明の範囲は添付の請求の範囲によって規定されることを理解されたい。その他の側面、利点および修飾は請求の範囲の範囲内である。
本明細書で引用するすべての文献は、その内容を引用により本明細書に含める。
図 1は、SCIDマウスにおける非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片からの腫瘍サイズに対する、両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。 図 2は、SCIDマウスにおける非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片からの腫瘍サイズに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の異なるロットの効果を示す。 図 3は、両性リポソーム中に捕捉された配列番号1251で処理された非ホジキンリンパ腫 WSU-DLCL2 異種移植片を担持するマウスにおける腫瘍負荷を示す。 図 4は、WSU-DLCL2 異種移植片担持マウスに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の２つの製剤の用量応答評価を示す。 図 5は、 WSU-DLCL2 異種移植片担持マウスに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の２つの製剤の用量応答評価の拡大図を示す。 図 6は、両性リポソームに捕捉された配列番号1251の２つの製剤により処理されたWSU-DLCL2 異種移植片担持マウスにおける用量応答動物体重評価を示す。 図 7は、ヌードマウスにおけるPC-3 異種移植片からの腫瘍サイズに対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。 図 8は、ヌードマウスにおけるPC-3 異種移植片からの腫瘍の増殖速度に対する両性リポソームに捕捉された配列番号1251の効果を示す。

Claims (61)

  1. 両性リポソームおよび配列番号１２５０または１２５１を含むオリゴヌクレオチドを含む混合物であり、
    両性リポソームが、
    アニオン性およびカチオン性脂質の少なくとも１つがｐＨ応答性である、少なくとも１つのアニオン性および少なくとも１つのカチオン性脂質、および、
    中性脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはステロールから独立して選択されるものである、少なくとも１つの中性脂質
    の脂質混合物を含み；
    ここで、脂質混合物が計５〜９５ｍｏｌｅ％のアニオン性およびカチオン性脂質および５〜９５ｍｏｌｅ％の中性脂質を含むものである、混合物。
  2. カチオン性脂質がＤＭＴＡＰ、ＤＰＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＴＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌ、ＨｉｓＣｈｏｌ、ＤＰＩＭ、ＣＨＩＭ、ＤＯＲＩＥ、ＤＤＡＢ、ＤＡＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＧＳ、（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミド−グリシン、ＣＴＡＢ、ＣＰｙＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＥＰＣおよびそれらの誘導体からなる群から選択され、アニオン性脂質がＤＯＧＳｕｃｃ、ＰＯＧＳｕｃｃ、ＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＰＧＳｕｃｃ、ＤＧＳｕｃｃ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＯＰＧ、ＰＯＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＯＰＡ、ＰＯＰＡ、ＣＨＥＭＳ、Ｃｅｔ−Ｐおよびそれらの誘導体からなる群から選択され、ここで、ホスファチジルコリンがＰＯＰＣ、ＯＰＰＣ、天然または水添ダイズＰＣ、天然または水添卵ＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＯＰＣおよびそれらの誘導体からなる群から選択され、ホスファチジルエタノールアミンがＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥおよびそれらの誘導体からなる群から選択され、ステロールがコレステロールまたはその誘導体である、請求項１の混合物。
  3. カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＭｏＣｈｏｌおよびＨｉｓＣｈｏｌからなる群から選択され、アニオン性脂質がＤＭＧＳｕｃｃ、ＤＯＰＡ、ＣＨＥＭＳおよびＣｅｔ−Ｐからなる群から選択される、請求項１の混合物。
  4. カチオン性脂質がＭｏＣｈｏｌであり、アニオン性脂質がＣＨＥＭＳである、請求項１の混合物。
  5. 脂質混合物が１０〜６０ｍｏｌｅ％のＭｏＣｈｏｌおよび１０〜３０ｍｏｌｅ％のＣＨＥＭＳを含む請求項４の混合物。
  6. カチオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、アニオン性脂質がＣＨＥＭＳである、請求項１の混合物。
  7. 脂質混合物が１０〜３０ｍｏｌｅ％のＣＨＥＭＳおよび５〜４０ｍｏｌｅ％のＤＯＴＡＰを含む請求項６の混合物。
  8. カチオン性脂質がＭｏＣｈｏｌであり、アニオン性脂質がＣｅｔ−Ｐである、請求項１の混合物。
  9. 脂質混合物が１０〜６０ｍｏｌｅ％のＭｏＣｈｏｌおよび５〜３０ｍｏｌｅ％のＣｅｔ−Ｐを含む請求項８の混合物。
  10. カチオン性脂質がＭｏＣｈｏｌであり、アニオン性脂質がＤＭＧＳｕｃｃである、請求項１の混合物。
  11. 脂質混合物が２０〜６０ｍｏｌｅ％のＭｏＣｈｏｌおよび２０〜６０ｍｏｌｅ％のＤＭＧＳｕｃｃを含む請求項１０の混合物。
  12. 中性脂質がＰＯＰＣおよびＤＯＰＥを含む請求項１の混合物。
  13. 脂質混合物が５〜４０ｍｏｌｅ％のＰＯＰＣおよび２０〜５０ｍｏｌｅ％のＤＯＰＥを含む請求項１２の混合物。
  14. 中性脂質がＰＯＰＣおよびＣｈｏｌを含む請求項１の混合物。
  15. 脂質混合物が１０〜５０ｍｏｌｅ％のＰＯＰＣおよび３０〜５０ｍｏｌｅ％のＣｈｏｌを含む請求項１４の混合物。
  16. 両性リポソームがＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳを含む請求項１の混合物。
  17. 脂質混合物が３〜２０ｍｏｌｅ％のＰＯＰＣ、１０〜６０ｍｏｌｅ％のＤＯＰＥ、１０〜６０ｍｏｌｅ％のＭｏＣｈｏｌおよび１０〜６０ｍｏｌｅ％のＣＨＥＭＳを含む請求項１６の混合物。
  18. ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳのモル比が約６／２４／４７／２３である請求項１６の混合物。
  19. ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳのモル比が１５／４５／２０／２０である請求項１６の混合物。
  20. 両性リポソームがＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＭＧＳｕｃｃおよびＭｏＣｈｏｌを含む請求項１の混合物。
  21. 脂質混合物が３〜２０ｍｏｌｅ％のＰＯＰＣ、１０〜４０ｍｏｌｅ％のＤＯＰＥ、１５〜６０ｍｏｌｅ％のＤＭＧＳｕｃｃおよび１５〜６０ｍｏｌｅ％のＭｏＣｈｏｌを含む請求項２０の混合物。
  22. ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧＳｕｃｃ／ＭｏＣｈｏｌのモル比が約６／２４／２３／４７である請求項２１の混合物。
  23. ＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＭＧＳｕｃｃ／ＭｏＣｈｏｌのモル比が約６／２４／４７／２３である請求項２１の混合物。
  24. 両性リポソームがＰＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＣＨＥＭＳおよびＤＯＴＡＰを含む請求項１の混合物。
  25. 脂質混合物が１０〜５０ｍｏｌｅ％のＰＯＰＣ、２０〜６０ｍｏｌｅ％のＣｈｏｌ、１０〜４０ｍｏｌｅ％のＣＨＥＭＳおよび５〜２０ｍｏｌｅ％のＤＯＴＡＰを含む請求項２４の混合物。
  26. ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＣＨＥＭＳ／ＤＯＴＡＰのモル比が約３０／４０／２０／１０である請求項２５の混合物。
  27. 両性リポソームがＰＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、Ｃｅｔ−ＰおよびＭｏＣｈｏｌを含む請求項１の混合物。
  28. 脂質混合物が１０〜４０ｍｏｌｅ％のＰＯＰＣ、２０〜５０ｍｏｌｅ％のＣｈｏｌ、５〜３０ｍｏｌｅ％のＣｅｔ−Ｐおよび１０〜４０ｍｏｌｅ％のＭｏＣｈｏｌを含む請求項２４の混合物。
  29. ＰＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／Ｃｅｔ−Ｐ／ＭｏＣｈｏｌのモル比が約３５／３５／１０／２０である請求項２８の混合物。
  30. 両性リポソームが５０〜５００ｎｍのサイズを含む請求項１−２９のいずれかの混合物。
  31. 両性リポソームが８０〜３００ｎｍのサイズを含む請求項１−３０のいずれかの混合物。
  32. 両性リポソームが９０〜２００ｎｍのサイズを含む請求項１−３０のいずれかの混合物。
  33. 両性リポソームが脂質濃度約１０〜１００ｍＭまたはそれ以下において少なくとも２ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド濃度を有する請求項１−３２のいずれかの混合物。
  34. オリゴヌクレオチドが配列番号１２５１を含む請求項１−３３のいずれかの混合物。
  35. 脂質混合物が計２０〜８０ｍｏｌｅ％のアニオン性およびカチオン性脂質および２０〜８０ｍｏｌｅ％の中性脂質を含む請求項１−３４のいずれかの混合物。
  36. 脂質混合物が計３０〜７０ｍｏｌｅ％のアニオン性およびカチオン性脂質および３０〜７０ｍｏｌｅ％の中性脂質を含む請求項１−３５のいずれかの混合物。
  37. 以下の工程を含む方法：
    （ａ）請求項１−３６のいずれかの混合物およびｂｃｌ−２遺伝子を発現することが出来るインビトロの細胞または非ヒト動物を提供する工程、および、
    （ｂ）混合物をインビトロの細胞または非ヒト動物に導入する工程。
  38. 混合物の導入の結果、細胞の増殖の低下、または細胞死の誘導が起こる、請求項３７の方法。
  39. 細胞が癌細胞である請求項３７の方法。
  40. 混合物が非ヒト動物に０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で導入される請求項３７の方法。
  41. 混合物が非ヒト動物に１日１回以上導入される請求項３７の方法。
  42. 混合物が非ヒト動物に連続的に導入される請求項３７の方法。
  43. 混合物が非ヒト動物に、局所、肺、眼内、鼻腔内、非経口および医療機器からなる群から選択される１以上の投与経路により導入される請求項３７の方法。
  44. 細胞が細胞培養物である請求項３７の方法。
  45. 被験化合物をインビトロの細胞または非ヒト動物に導入する工程をさらに含む請求項３７の方法。
  46. 被験化合物が化学療法薬である請求項４５の方法。
  47. 非ヒト動物が膵臓癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、卵巣癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する請求項４６の方法。
  48. ｂｃｌ−２遺伝子を発現することが出来る細胞または動物に導入するための、請求項１−３６のいずれかの混合物を含む組成物。
  49. 組成物の導入の結果、細胞の増殖の低下、または細胞死の誘導が起こる、請求項４８の組成物。
  50. 細胞が癌細胞である請求項４８の組成物。
  51. 動物に０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で導入される請求項４８の組成物。
  52. 動物に１日１回以上導入される請求項４８の組成物。
  53. 動物に連続的に導入される請求項４８の組成物。
  54. 動物に、局所、肺、眼内、鼻腔内、非経口および医療機器からなる群から選択される１以上の投与経路により導入される請求項４８の組成物。
  55. 細胞が細胞培養物である請求項４８の組成物。
  56. 細胞または動物への被験化合物の導入と併用される請求項４８の組成物。
  57. 被験化合物が化学療法薬である請求項５６の組成物。
  58. 動物が膵臓癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、白血病、前立腺癌、リンパ腫、卵巣癌および黒色腫からなる群から選択される癌を有する請求項５７の組成物。
  59. 請求項１〜３６のいずれかの混合物を含む医薬組成物。
  60. 両性リポソームおよび配列番号１２５１または１２５０を含むオリゴヌクレオチドを含む混合物であり、リポソームがＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳをＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳのモル比１５／４５／２０／２０にて含む混合物。
  61. 両性リポソームおよび配列番号１２５１または１２５０を含むオリゴヌクレオチドを含む混合物であり、リポソームがＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＭｏＣｈｏｌおよびＣＨＥＭＳをＰＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＭｏＣｈｏｌ／ＣＨＥＭＳのモル比６／２４／４７／２３にて含む混合物。
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