KR101200571B1 - 테라박터 속 유래의 신규한 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 신규한 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질에 관한 것으로서, 상기 단백질은 진세노시드의 특정 위치 결합 본드를 선택적으로 가수분해하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌을 체내 흡수 가능한 고활성 물질로 전환하는 활성을 가지고 있다. 구체적으로, 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이며, 상기 형질전환체를 배양하여 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제(이하 진세노시드 글리코시다제로 용어 통일)를 제조하는 방법, 상기 단백질을 이용하여 PPD 타입의 메이저 사포닌을 체내 흡수가 가능한 마이너 사포닌 형태로 전환하는 방법 및 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 PPD 타입 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌 전환으로 전환하기 위한 조성물에 대한 것이다.

테라박터, 사포닌, 진세노사이드, 진세노시드 글리코시다제

Description

테라박터 속 유래의 신규한 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도{GINSENOSIDE GLYCOSIDASE FROM TERRABACTER SP．AND USE THEREOF}

본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 신규한 진세노시드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질에 관한 것으로서, 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 테라박터 속 진세노시드 글리코시다제를 제조하는 방법, 상기 단백질을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수 가능한 형태의 가용성 사포닌으로 전환하기 위한 조성물에 대한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미하며, 인삼 또는 홍삼의 주요 생리 활성 성분이 포함된 사포닌 성분은 타 식물에서 발견되는 사포닌과 화학 구조가 상이한바, 이를 특별히 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(ginsenoside)라 명명되고 있다.

이러한 진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계 진세노사이드(Protopanaxadiol-type ginsenosides), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드(Protopanaxatriol-type ginsenosides), 및 올레아놀린산계 진세노사이드(Oleanolic acid-type ginsenosides)의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 C-3, C-6 및 C-20 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류되는데, 그 중 Rg1, Re, Rb1, Rc 및 Rb2는 전체 사포닌의 90% 이상을 차지하는 메이저 진세노사이드(major ginsenoside)이고(Park, 2004), 이들은 큰 사이즈로 인하여 인체에 경구 투여되는 경우, 직접 흡수하기 어렵다고 알려져 있다. 따라서 이러한 메이저 진세노사이드들은 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 생리적 활성을 나타내기 위하여 글루코스를 제거(deglycosylated)하는 전환과정이 요구된다(Tawab et al., 2003; Akao et al., 1998).

한편, 최근 수십 년간 Rg3, Rh2 및 화합물 K(compound K)등 마이너 형태(minor form)를 갖는 진세노사이드의 뛰어난 약리효능이 밝혀지고 있다. 이러한 연구결과가 발표됨에 따라 보다 우수한 약리 작용을 갖는 진세노사이드 F2, Rg3, Rh1, Rh2 및 화합물 K(compound K, C-K) 등의 마이너 진세노사이드(minor ginsenoside)에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 마이너 형태를 갖는 특정 진세노사이드의 함량 비율을 증가시킬 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다.

그 중 프로토파낙사다이올계의 진세노사이드인 Rh1 및 Rh2는 F9 기형암 세포(F9 teratocarcinoma) 배양시험에서 강력한 종양 세포 재분화 유도 작용이 보고 되었으며(Lee 등, Proc. 6th, Intl. Ginseng symp., 127, 1993), 그 밖에 B16 흑색종세포, MK-1(위암세포) (Matsunaga 등, Chem, Pharm. Bull., 38, 3480, 1990) 및 난소암 세포(HRA) (Kikuchi 등, Anticancer Drugs. England., 2, 63, 1991) 등 여러 종의 암세포에서 강력한 증식 억제활성을 나타내는 것으로 보고 되었다. 그러나 Rh2 등은 홍삼에 존재하는 미량의 사포닌으로서, 상기와 같이 우수한 약리 활성을 나타내어 이의 대량 생산 방법에 대해 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 현재까지 효과적인 대량생산 방법에 대해서는 정립되지 못하고 있다.

진세노사이드 F2와 관련하여, F2는 종양세포에 대한 증식 억제, 종양세포 및 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며(한국생약학회지 28(1), 35, 성종환 등 , 1997), 인삼 사포닌의 경구 투여 시, 프레보텔라리스(Prevotellaris)와 같은 장내 세균에 의해 대사되어 흡수되며, 이들의 대사산물인 F2가 약효를 나타낸다고 알려져 있다. 그러나 이처럼 유용한 F2도 역시 일부 인삼의 종류에 미량으로만 존재하여 다량의 시료를 수득하기 어려우며, 대사 과정에서 여러 가지 2차 대사산물과 함께 생성되기 때문에 F2만을 고순도로 정제하는 데 어려움이 존재하여 왔다.

미량의 사포닌인 마이너 진세노사이드를 생산하기 위한 방법으로 화학적 분해 방법(De Mayo 등, canad. J. Chem., 43, 2033, 1965), 효소적 방법(Kitagawa 등, Terahedron Letters, 30, 2283, 1974), 및 배당체 합성을 이용한 방법(제10-2005-0007250호) 등이 제시되어 왔으나, 상기와 같은 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 존재하여 왔다.

특히 효소적 방법 중, 사용될 수 있는 효소의 종류로 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase), α-L-아라비노피라노시다제 (α-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제 (α-L-arabinofuranosidase), α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)와 같은 효소가 Rb1, Rb2, Rc 및 Re와 같은 메이저 진세노사이드의 생전환(biotransformation)됨이 보고되고 있다. 그러나 이들 역시 대량 생산 방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제가 있다.

뿐만 아니라, 베타-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), 및 α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)에 속한다고 해도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명자들은 Arthrobacter chlorophenolicus A6에서 유래한 것으로 알려진 베타 글루코시다제에는 진세노사이드의 생전환 활성이 없음을 확인한 바 있다. 또한, 기존의 알려진 효소들, 예컨대, Rb1으로의 전환능력이 있다고 알려진 효소인 베타-글리코시다제 A는 진세노사이드의 생전환 활성이 있다 하여도 그 활성이 미미하였다.

또한, 한국 특허출원 제10-1999-0045180호는 사포닌 알파-글루코시다제로 PPD 타입 진세노사이드의 사포닌 당기를 분해하여 진세노사이드 Rh2를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 사포닌 알파-글루코시다제는 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시키고, 진세노사이드 F2를 진세노사이드 Rh2로 전환시킨다. 또한, 진세노사이드 Rb1과 Rc로부터 Rh2를 제조할 수도 있다. 그러나 실시예 3에 기재된 바에 따르면 상기 사포닌 알파-글루코시다제는 맥부와 인삼분말이 포함되어 있는 배지에 국균을 넣어서 배양하고 균체를 제거하여 생산해야 한다. 따라서, 낮은 수율을 나타내어 대량생산방법으로 효과적이지 못하며 제조원가가 많이 들며, 제조과정 중 목적하는 성분이 소실된다는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 진세노사이드를 용이하게 다량으로 수득하기 위한 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 테라박터 속 균주로부터 메이저 형태의 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 생전환시킬 수 있는 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 유전자를 수득하는 한편, 상기 유전자를 클로닝하여 발현시킨 재조합 효소가 메이저 진세노사이드의 특정 분자 결합을 선택적으로 가수분해하여 생리활성 및 생흡수율이 높은 마이너 진세노사이드로 생전환 시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 진세노시드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; 상기 배양된 형질전환체로부터 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 진세노시드 글리코시다제를 회수하는 단계를 포함하는 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 테라박터 속 진세노시드 글리코시다제를 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 가용성 사포닌으로 전환하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 진세노시드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase)(이하, '진세노시드 글리코시다제 단백질' 및 본 발명의 단백질'과 혼 용) 단백질을 제공한다.

진세노시드 글리코시다제 단백질은 이당류의 일종인 말토오즈(maltose), 수크로오즈(sucrose) 및 튜라노오즈(turanose)와 같은 글루코시드를 분해하는 효소로 알려져 있다. 이러한 진세노시드 글리코시다제는 서로 다른 다양한 생물종에서 다양한 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 그 활성의 정도 및 기능은 효소마다 차이가 있다. 바람직하게 본 발명의 진세노시드 글리코시다제는 테라박터 속 미생물로부터 유래된 효소로서, 메이저 형태의 진세노사이드를 마이너 형태로 전환시킬 수 있는데, 이는 상기 효소가 갖는 진세노사이드의 3번 탄소에 결합된 포도당(glucose)을 선택적으로 가수분해할 수 있는 능력에 기인한다. 진세노시드 글리코시다제에 대해서는 널리 알려져 있으나, 테라박터 속(Terrabacter sp.) 미생물로부터 분리된 진세노시드 글리코시다제의 구체적인 활성 및 기능에 대해서는 규명된 바 없으며, 특히 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제가 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc를 다양한 마이너 형태의 화합물로 전환시킬 수 있다는 사실은 본 발명이 최초이다. 더욱 바람직하게 본 발명의 진세노시드 글리코시다제는 테라박터 속 신종으로 추정되는 Gsoil3082로부터 분리할 수 있으며, 상기 균주는 국제기탁기관인 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 기탁하고 기탁번호 KCTC19421T로 기탁하였고, 그 서열은 서열번호 1로 나타내었다.

본 발명의 신규 유전자를 동정하기 위한 미생물은 테라박터 속 미생물로서, 본 발명자들이 최초로 분리한 신종인 테라박터 Gsoil3082 균주는 대한민국 포천 지역에 있는 인삼밭에서 동정하였다. 상기 균주를 이용하여 16S rRNA 유전자 서열 분석 및 표현형 분석에 의거한 계통발생 분석(phylogenetic analysis)을 수행한 결과, 상기 동정된 균주는 악티노박테리아 문(Actinobacteria Phylum) 테라박터 속의 신규한 종인 것으로 확인되었으며, 상기 균주는 Rb1을 지페노사이드 XVII(gypenoside XVII, gyp XVII)으로의 전환능을 가지며, 나아가 지페노사이드 LXXV(gypenoside LXXV, gyp LXXV)로 전환할 수 있는 능력을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 진세노사이드 Rb2를 화합물 Y(compound Y)로, 화합물 O(compound O)를 화합물 Y로전환 시키는 능력을 가지며, 진세노사이드 Rc를 화합물 Mc(compound Mc)로, 화합물 Mc1(compound Mc1)을 화합물 Mc로 전환시키는 능력을 가짐을 확인하였다. 본 발명자들은 상기와 같은 활성을 가지는 효소를 동정하기 위해, 포스미드 라이브러리 키트(fosmid library kit)를 이용하여 상기 신균주를 탐색함으로써 Bgl-gyp17을 클로닝하였다.

본 발명의 단백질은 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제를 구성하는 아미노산 서열(폴리펩타이드 서열)을 의미하며, 바람직하게 상기 테라박터는 본 발명자들이 밝힌 신규 종인 Gsoil3082일 수 있다. 상기 균주로부터 분리된 진세노시드 글리코시다제 아미노산 서열은 서열번호 1로 구성된 서열로서, 바람직하게 상기 서열 뿐 만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제의 활성을 갖는 서열을 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

다른 하나의 양태로서 본 발명은 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 핵산은 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산이며, 바람직하게 상기 테라박터는 본 발명자들이 밝힌 신규 종인 Gsoil3082로부터 분리될 수 있다. 상기 균주로부터 분리된 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2로 구성된 핵산서열이며, 바람직하게 상기 서열 뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제의 활성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직하게 본 발명의 유전자는 본 발명자들에 의해 bgl-gyp17로 명명되었고, 상기 유전자는 1770bp 길이의 핵산을 포함하며 589개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.

본 발명의 용어 "유사성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 유사성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 유사성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 일정 수준 이상의 유사성이 유지되는 동시에 본 발명에서 목적하는 단백질의 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진세노시드 글리코시다제는 야생형의 아미노산 서열 변이체를 포함하는데, "변이체"란 천연 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 또는 핵산 서열이 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 갖는 단백질 또는 상이한 서열을 갖는 핵산을 의미한다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명은 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환 (transformation) 또는 형질감염 (transfection) 시킴으로써, 본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 수득할 수 있게 된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 포스미드 라이브러리(fosmid library)를 통하여 스크리닝하는 한편, 진세노시드 글리코시다제를 코딩할 수 있는 ORF를 동정하여 이를 pHis-Parallell 발현 벡터에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제조하였다(도 8).

또한 상기와 같은 방법으로 제조된 재조합 벡터를 대장균과 같은 숙주세포에 형질전환함으로써 형질전환체를 제조할 수 있는데, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 El.coli C41(DE3) 세포에 상기 재조합 벡터를 형질전환함으로써 진세노시드 글리코시다제의 발현을 유도하였다.

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 유전자를 적당한 벡터에 연결 (삽입)하여 획득할 수 있다. 본 발명의 유전자가 삽입될 벡터는 그것이 숙주 안에서 복제될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pCDNA3.1+ (Invitrogen) 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용된 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드 (pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)-유래 플라스미드 (pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 -파아지 (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, gt10, gt11 및 ZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus) 또는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스 (baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pHis-Parallel1 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다.

아울러 본 발명의 벡터로서, 유전자 발현 활성화 단백질 (예를 들어, B42 같은)이 연결된 융합 플라스미드 (fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있으며, 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 발현된 진세노시드 글리코시다제를 용이하게 정제 및 회수하기 위하여 6개의 히스티딘 서열을 부가한 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag, 6x his tag, His₆ tag)를 사용하였다.

본 발명의 유전자를 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자는 벡터에 작동가능하게 연결되어 있어야 한다. 이를 위해서, 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 유전자 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "형질전환 (transformation)"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

목적 유전자인 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다. 숙주는 본 발명의 유전자를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균 (E. coli)과 같은 에스케리키아 (Escherichia) 세균; 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)같은 바실러스 (Bacillus) 세균; 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)같은 슈도모나스 (Pseudomonas) 세균; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), JM109 및 HB101이 있으며, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 및 LKS87이 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 대장균 세포 CL41(DE3)을 숙주세포로 하여 진세노시드 글리코시다제를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하였다.

대장균과 같은 세균이 숙주로서 사용될 때, 본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 숙주 내에서 자율적인 복제를 할 수 있을 뿐만 아니라 프로모터, 라이보좀 결합서열, 본 발명의 유전자 및 전사 종료 서열 (transcription termination sequence)로 구성되어 있다. 본 발명의 프로모터는, 본 발명의 유전자를 대장균과 같은 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.

본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 헥사히스티딘(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 헥사히스티딘(hexahistidine)일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 헥사히스티딘 태그을 사용하여 정제를 용이하게 하였다.

또한 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게 상기 제조 방법은, (a) 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 형질전환체로부터 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생산된 진세노시드 글리코시다제를 회수하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 발현시키는 방법은 상기 서술된 바와 같으며, 상기의 방법으로 형질전환된 숙주세포는 당업계에서 사용되는 통상적인 방법으로 배양할 수 있다. 예를 들면, 상기 진세노시드 글리코시다제를 발현하는 형질전환체는 다양한 배지에서 배양할 수 있으며, 페드-배치(fed-batch) 배양 및 연속 배양 등을 수행할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 형질전환체의 배양방법이 제한되는 것은 아니다. 또한 숙주세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

적절한 숙주세포를 선택하여, 배지 조건을 조성하여 주면 목적 단백질이 성공적으로 형질전환된 형질전환체는 진세노시드 글리코시다제를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 숙주세포의 세포질 내, 페리플라즈믹 스페이 스(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다. 또한 목적 단백질은 가용성 형태 또는 불용성 형태로 발현될 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 bgl-gyp17 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 불용성 형태로 발현되는 것을 확인하였다.

숙주 세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산 나트륨 침전 등), 용매 침전(예를 들어, 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 컬럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용하여 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다.

상기의 방법으로 분리된 진세노시드 글리코시다제를 이용하여 진세노사이드가 존재하는 인 비트로(in-vitro) 또는 인 비보(in vivo) 시스템에서 용이 흡수가 가능한 마이너 형태의 진세노사이드를 생산할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 테라박터 속 진세노시드 글리코시다제를 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 출발물질로 이용되는 PPD 타입의 사포닌으로는, 분리 및 정제된 형태의 사포닌을 이용할 수도 있고, 또는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 사포닌을 이용할 수도 있다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.(사용 가능한 대상 물질의 종류에 대한 기재를 추가하였습니다)

배경기술에서 언급한 바와 같이 사포닌은 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계 진세노사이드(Protopanaxadiol-type ginsenosides), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드(Protopanaxatriol-type ginsenosides), 및 올레아놀린산계 진세노사이드(Oleanolic acid-type ginsenosides)의 세 가지로 분류될 수 있으며, 본 발명의 PPD 타입의 사포닌이란 프로토파낙사다이올계의 진세노사이드를 의미한다. 본 발명의 테라박터 속 유래 진세노시드 글리코시다제를 이용하는 경우, 가용성 사포닌으로 전환시킬 수 있는데, 본 발명에서 사용된 용어, "가용성 사포닌"이란 진세노사이드의 3번째 탄소를 순차적으로 가수분해함으로써 체내 흡수가 어려운 메이저 형태(major form)의 진세노사이드(Rb1, Rb2, Rc, Rg1 및 Re)를 상대적으로 체내 흡수가 용이한 마이너 형태(minor form)의 진세노사이드(F2, Rg3 및 Rh1), 화합물 O, 화합물 Y, 화합물 Mc1, 화합물 Mc, 화합물, K 지페노사이드 XVII 또는 지페노사이드 LXXV로 전환시킬 수 있음을 의미한다.

바람직하게 이러한 전환은 생전환(bioconversion)을 통해 이루어지며, 연속 또는 비연속적으로 진세노사이드의 3번 탄소를 선택적으로 가수분해함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 단백질은 당업계에 알려진 모든 PPD 타입의 진세노사이드를 흡수가 용이한 마이너 형태(minor form)으로 전환시킬 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 단백질에 의한 생전환의 예로는 진세노사이드 Rb1을 지페노사이드 XVII로 전환, 지페노사이드 XVII을 지페노사이드 LXXV로 전환, 진세노사이드 Rb2를 화합물 Y(compound Y)로 전환, 화합물 O(compound O)를 화합물 Y(compound Y)로 전환, 진세노사이드 Rc를 화합물 Mc(compound Mc)로 전환, 및 화합물 Mc1(compound Mc1)을 화합물 Mc(compound Mc)로 전환하는 방법이 모두 포함된다. 추가적으로 이러한 생전환은 출발물질이 진세노사이드 Rd인 경우 화합물 K로 전환, 출발물질인 진세노사이드 F2인 경우 화합물 K로 전환할 수 있고, 출발물질이 진세노사이드 Rg3인 경우, PPD로 전환시키며, 진세노사이드 Rh2인 경우에도 PPD로 전환시킬 수 있다.

보다 상세하게 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물을 진세노사이드 Rb1에 투여하는 경우, 지페노사이드 LXXV를 생산하였으며, 중간 물질로서 지페노사이드 XVII를 생산하는 것을 확인하였다. 또한 진세노사이드 Rd를 출발물질로하여 본 발 명의 단백질을 처리하는 경우, 화합물 K를 생산하였고, 중간 물질로서 F2를 생산하는 것을 확인하였다. 또한 Rg3를 출발물질로 하여 본 발명의 단백질을 처리하는 경우, PPD를 생산하는 한편, 그 중간 물질로서 진세노사이드 Rh2를 생산하는 것을 확인하였다. 출발물질을 Rb2로 하는 경우, 본 발명의 단백질의 처리로 인하여 화합물 O(Notoginsenoside L)를 거쳐 화합물 Y(Notoginsenoside)를 생산하는 것을 확인하 였고, 출발물질이 진세노사이드 Rc인 경우 화합물 Mc1(Notoginsenoside L)을 거쳐 화합물 Mc(Notoginsenoside)를 생산하는 것을 확인하였다. 이들은 모두 본 발명의 단백질이 진세노사이드 관련 화합물의 3번 탄소를 가수분해함으써 수행될 수 있으며, 상기와 같은 가수분해를 통해 생성된 생성물질(진세노사이드 유도체)은 반응물질에 비해 체내 흡수가 용이하다.

또한 이러한 생전환은 반응 물질 또는 효소의 농도의 의존적으로 최종 생성물의 양을 조절할 수 있다. 바람직하게 효소 농도가 0.01 mg/ml인 경우 대부분의 Rb1이 gyp XVII로 전환되는 반면, 0.1 mg/ml의 효소 농도를 처리하는 경우 gyp LXXV까지 반응을 진행시킬 수 있다.

본 발명의 테라박터 속 유래의 진세노시드 글리코시다제는 진세노사이드를 체내 흡수가 용이한 형태로 전환시키는 우수한 활성을 나타내며, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 진세노사이드의 마이너 형태를 대량으로 생산 및 제조할 수 있다.

또한 상기 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양함으로써 대량생산이 가능하여 산업적으로 다양하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신종 균주 Gsoil3082의 분류학적 특성 분석

R2A 상에서 30℃ Gsoil3082를 배양하였다. 3일 동안 세포를 배양하여 Nikon light 현미경으로 세포의 형태를 관찰하였다. 또한 Systematic Bacteriology의 Bergey's Manual에 기재된 바와 같은 그람 염색(gram stain), 혐기성 배양(anaerobic growth) 및 촉매 활성(catalase activity)과 같은 통상적인 생리학적 및 생화학적 특성 분석을 수행하였다. API 20 NE, API ID 32 GN 및 API ZYM 테스트 키트(bioMerieux)를 사용하여 탄소-에너지원 사용 및 효소 활성을 분석하였다. 서로 다른 온도 조건(4, 15, 20, 25, 30, 37, 42 및 45℃) 및 다양한 pH 값(pH 4.5 - 10.0의 범위에서 pH 0.5씩 변화)서 균주를 키우고, 배양 후 5일 단위로 측정하였다.

뉴트리언트 아가(nutrient agar) 및 TSA(trypticase soy agar) 상의 성장을 30℃에서 측정하였다. 화학적 분류 분석(Chemotaxonomic analysis)을 Montero-Barrientos 등의 방법을 이용하여 수행하였다.

다른 박테리아에 대한 Gsoil3082 균주의 계통발생학적 연관성를 확인하기 위하여 16S rRNA 유전자의 비율을 분석하였으며, 상기 분석은 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')(서열번호 3) 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')(서열번호 4) 유니버설 프라이머(universal primers)를 사용하여 PCR 증폭을 통 해 수행되었고, Solgent로 시퀀싱하였다(대전, 대한민국). 16S rRNA 유전자 전장 서열을 SeqMan 소프트웨어(DNASTAR)를 사용하여 수집하였고, NCBI 데이터베이스에서 블라스팅 하였다(Accession number: EU332827). 분류학적으로 연관성 있는 16S rRNA 유전자 서열을 GenBank로부터 수득하였다. 유전자 서열에 따른 균주의 계통학적 위치를 Kimura two-parameter 모델을 이용하여 계통학적 트리로 판단하였다. 1000 레플리케이션에 기초한 bootstrap 값을 갖는 MEGA 3 프로그램을 사용하여 neighbor-joining 방법을 사용함으로써 계통학적 트리를 구축하였다. photobiotin-표지된 DNA 프로브 및 마이크로-희석 웰(micro-dilution well)을 사용하여, DNA-DNA 혼성화를 Ezaki 등의 방법에 의해 형광광도(fluorometrically)를 측정함으로써 수행하였다. 각 샘플에서의 최고값과 최저값을 제외하고 나머지 값을 이용하여 유사성을 계산하였다.

Gsoil3082 특성

4회의 스크리닝을 통하여, 포천 인삼 밭으로부터 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환하는 20개의 신규한 박테리아 균주(Rhodanobacter ref. 60)를 동정하였다. 상기 동정된 균주들 중 하나를 Gsoil3082로 명명하였으며, 본 균주가 진세노사이드 Rb1을 gyp XVII 및 gyp LXXV으로 가수분해할 수 있음을 최초로 확인하였다. HPLC 및 NMR 분석을 통한 진세노사이드 Rb1의 생전환 경로 연구 결과, Gsoil3082 균주는 진세노사이드 Rb1의 C-3 위치의 말단 글루코스 및 내부 글루코스를 연속적으로 가수분해함으로써 진세노사이드 Rb1을 gyp XVII 및 gyp LXXV로 전환시킬 수 있음을 밝혀내었다. 또한 Gsoil3082 균주의 분류학적 위치를 규명하기 위하여 다상적 접근(polyphasic approach)을 통해 특성을 분석하였고, 진세노시드 글루코스 유전자 클로닝을 수행하였다.

동정된 균주는 그람-양성(gram-positive), 호기성(aerobic), 비-운동성(non-motile), 비-포자-형성(non-spore-forming), 및 단막대형(short-rod-shaped)를 나타내었다. 16S RNA에 기초한 계통학적 분석은 악티노박테리아 문(phylum) 내 테라박터 속에 속하는 것으로 확인되었고, T.tumescens DSM20308^T(98.4 유사성)와 가장 높은 유사성을 나타내었고, 그 다음으로 T.terrae PPLB^T(98.2) 및 T.aerolatum 5516J-36^T(98.0)(도 8 참고). 게놈 DNA의 G+C 양은 68.2 mol%였다. 화학분류 데이터(chemotaxonomic data)[major menaquinone - MK-8(H4), main polar lipids(phosphatidylethanolamine, diphosphatidylglycerol and phophatidylinositol) and major fatty acid - iso-C_15:0, anteiso-C_15:0 and iso-C_16:0]는 Gsoil3082가 테라박터 속에 속한다는 것을 뒷받침하여 준다(표 1). 그러나 DNA-DNA 혼성화 분석 결과, Gsoil3082^T, 및 T.tumescens DSM20308^T, T.terrae PPLB^T 및 T.aerolatum 5516J-36^T 균주 간의 혼성화 값은 각각 43, 34 및 31임에 비추어 볼 때, Gsoil3082는 신규 종으로 분류되어야 할 것이다(Wayne et al., 1987). 아울러 생리학적 및 생화학적 테스트를 통하여 다른 테라박터 속의 균주와 형태학적으로 차이가 존재함을 확인하였다(표 2). 그러므로, 본 발명자들에 의해 최초로 동정된 테라박터 속 Gsoil3082은 신규 종인 균주로서 생물자원센터(KCTC)의 KCTC19421T로 기탁하였고, 테라박터 진세노시디무탄 속(Terrabacter ginsenosidimutans sp.)으로 명명하였다.

대사체의 구조 동정

Gypenoside XVII 대사체(1)

¹H NMR (500 MHz, pyridine-d₅) δ ppm 0.82 (3 H, s, H-19), 0.97 (3 H, s, H-18), 0.99 (3 H, br. s., H-30), 1.00 (3 H, s, H-29), 1.31 (3 H, s, H-28), 1.61 (3 H, s, H-26), 1.66 (6 H, s, H21, H27), 4.94 [1 H, d, J=7.79 Hz, H-20-glc (inner)-1H], 5.10 [1 H, d, J=7.80 Hz, H-20-glc (outer)-1H], 5.13 [1 H, d, J=7.79 Hz, H-20-glc (inner)1-H]. Among these signals, that of 3H in the H-21 methyl overlapped with that of the H-27 methyl.

¹³C NMR (pyridine-d₅, 100 MHz), (표 3 참조)

실시예 2. 포스미드 라이브러리 스크리닝 및 시퀀싱

CopyControl Fosmid Library Production Kit(Epicentre, U.S.A)를 제조사의 방법에 따라 수행하였다. 테라박터 속 Gsoil3082의 게놈 DNA(genomic DNA)를 약 40Kb 단편으로 임의적으로 절단하였다. Pulse Field Gel Electrophoresis에 의해 적은 양을 최초로 러닝(running)함으로써, 절단된 DNA 크기를 측정하고 DNA를 블런트 엔드(blunt end), 5'-인산화 말단(5'-phosphorylated end)으로 제조하기 위해 말단-회복(end-repair)시켰다. LMP(low melting point) 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 40Kb 이상인 말단-회복된 DNA 사이즈를 선별하였다. LMP 아가로즈 겔로부터 블런트-엔드 DNA를 정제하였고 pCC1FOS 벡터 내에 라이게이션(ligation)시켰다. MaxPlax lambda packaging extract kit(Epicentre, U.S.A.)로 인 비트로(in vitro) 패키징을 수행하였다. 마지막으로 생성물을 10mM MgSO₄를 포함하는 LB 브로스(broth)에서 O.D 값이 600nm일 때, 0.6이 될 때 까지 배양한 대장균(E.coli) EPI300-T1^R 내로 형질전환 시켰다. 감염된 박테리아를 37℃에서 20분 간 흡수시켰고, 클로람페니콜(chloramphenical) 12.5㎍/ml 및 27μl X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside)을 포함하는 LB 플레이트상에 도말하고, 37℃에서 배양하였다. 16-20시간 배양 후, 파란색을 나타내는 클론(진세노시드 글리코시다제 생산 추정 클론)을 선별하고, 동일한 플레이트 상에서 한 번 더 활성을 확인하였다. 확인 후, 추정되는 클론을 클로람페니콜 12.5/ml을 포함하는 0.2ml의 LB 브로스에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 진세노사이드-가수분해능을 분석하기 위하여 TLC 분석을 이용하였다.

진세노사이드 Rb1을 gypXVII로 전환시키는, pbgl-gin18 포스미드 클론으로 추정되는 Fosmid DNA를 세포 배양으로부터 동정하여, 제조사의 방법에 따라 FosmidMAX DNA purification 키트(Epicentre)를 이용하여 정제하였다. 정제된 포스미드 DNA를 전장 시퀀싱(full sequencing) 분석하였다. 트랜스포존(transposon) 반응의 삽입은 HyperMu^?lt;KAN-1> Insertion Kit(Epicentre, U.S.A)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용함으로써 수행하였다. MUKAN-1 FP-1 [5'-CTGGTCCACCTACAACAAAGG-3'] (서열번호 5) 및 RP-1 [5'-AGAGATTTTGAGACAGGATCCG-3'] (서열번호 6)인 두 프라이머를 양쪽 방향으로 사용하여 선택적 삽입 클론을 시퀀싱함으로써 완전한 서열을 수득하였는데, 이는 상기 키트 내에는 삽입되는 HyperMu 트랜스포존의 말단 유사성 영역을 포함하고 있다. 주형으로 ABI PRISM™ Bigdye™ Cycle Sequencing Ready Reaction Kit를 사용하여 DNA 시퀀싱 반응을 수행하였다. ABI 3730XL caillary DNA Sequencer로 데이터를 수집하고 분석하였다.

실시예 3. 재조합 BGL-GYP17의 분자 클로닝, 발현 및 정제

(3-1) 재조합 BGL-GYP17의 분자 클로닝, 발현

유전 코드 1(genetic code 1)을 사용하여 pbgl-gin18의 어셈블 DNA(assembled DNA) 서열을 National Center for Biotechnology Information's ORF FINDER로 분석하였다. 예상되는 ORF에 대해 BLASTP를 사용하여 진세노시드 글리코시다제로 추정되는 ORF를 찾아내고, 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 주형 pbgl-gin18 DNA를 PCR을 이용하여 증폭하였다.

정방향 프라이머:

5'- CG GAA TTC ATG GAT CCC TAC GAG GAC CCC-3' (서열번호 7)

역방향 프라이머:

5'- CCC AAGC TT ACC CCG GGA CGA CGA GGC-3'(서열번호 8)

(상기 프라이머 서열의 밑줄 친 부분은 각각 EcoRI 및 HindIII의 제한효소 절단 부위를 나타낸다)

상기 증폭된 단편을 pHis-Paralle1 발현 벡터(EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 도입하여 사용), 재조합 TEV 프로테아제(rTEV)를 포함하는 His₆(hexahistidine) 융합 단백질 발현 벡터에 순차적으로 클론하였다. 그 다음, 재조합 pHis-Parallel1을 E.coli C41(DE3) 세포에 도입하였다.

(3-2) bgl-gyp17의 클로닝 및 발현 결과

재조합 진세노시드 글리코시다제는 진세노사이드 Rb1를 gyp XVII로 전환하는 능력을 나타내었으며, 따라서 본 발명자들은 상기 ORF를 bgl-gyp17로 디자인하였다. bgl-gyp17의 추정 아미노산 서열은 589개의 잔기를 가지며, 68kDa의 분자량을 나타내었다.

(3-3) 재조합 BGL-GYP17의 정제

과발현 플라스미드를 함유하는 E.coli C41(DE3)를 LB-앰피실린 배지에 O.D 값이 600nm에서 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였고, 12시간 동안 아이소프로필-β-D-싸이오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 0.5mM로 처리함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 박테리아 세포를 4℃에서 20분 동안 5,000xg로 원심분리함으로써 수득하였다. 50mM 인산나트륨(sodium phosphate), 5mM EDTA, 및 1% Triton X-100(pH 7.0)(현탁 용액)으로 구성된 용액 세포 펠렛을 재현탁하였고, 초음파처리(ultrasonification)하였다. 재조합 진세노시드 글리코시다제는 불용성 형태인 봉입체(inclusion body)로 발현되기 때문에, 초음파 처리된 용해물을 4℃에서 30 분간 20,000xg에서 펠렛화하였으며, Triton X-100이 결여된 현탁 용액으로 두 번 세척하였다. 봉입체를 50mM 인산 나트륨, 5mM EDTA 및 8M 우레아(urea)(pH 8.0)을 포함하는 용액으로 실온에서 교반하며 밤새 가용화하였다. 원심분리(20,000xg, 30분, 4℃) 후, 가용화된 단백질을 pH 7.0에서 50mM 인산나트륨, 5% 글리세롤, 0.05% 폴리에틸렌 글라이콜 및 0.5mM 염화나트륨(sodium chloride)를 포함하는 리폴딩 버퍼(refolding buffer) 40 볼륨(volumes)으로 희석한 뒤, 4℃에서 24시간 동안 리폴딩하였다. 리폴딩된 재조합 진세노시드 글리코시다제를 50mM 인산나트륨 내에서 1mg/ml Rb1 용액과 반응시켰고, TLC 분석을 수행하였다. 그 결과, 진세노시드 글리코시다제는 진세노사이드 Rb1을 gyp XVII으로 전환시켰는데, 상기 진세노시드 글리코시다제 코딩 유전자는 bgl-gyp17로 디자인된 것이었다. 그러므로 리폴딩된 재조합 bgl-gyp17을 Nickel-charged HisTrap 컬럼(HisTrap HP, 5ml bed volume, Gel health) 상에 로딩하였고, 4℃에 버퍼 A(50mM 인산나트륨, pH 7.0)로 사전-평형(pre-equilibrated)을 맞추었다. 버퍼 A로 레진(resin)을 세척하였고, 결합된 단백질을 200mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 버퍼 A로 용출하였다. HisTrap 컬럼에 따른 rTEV로 배양함으로써 단백질로부터 His₆ 태그를 분리하였고, 30ml DEAE-셀룰로오즈 DE-52(Whatman)을 포함하는 컬럼 상에서 50mM 인산나트륨, pH 7.0 및 300mM NaCl로 추가적인 정제를 수행하였다. 정제 후, 단백질은 그의 N-말단에 7-잔기 클로닝 artifact(GAMDPEF)를 포함하였다. 단백질의 유사성은 10% SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색(Coomassie Blue staining)에 의해 측정되었다. 정제된 단백질을 10mg/ml 농도로 Amicon Ultra-15 필터(Millipore, U.S.A)를 사용하여 pH 7.0에서 50mM 인산나트륨으로 투석하였고, 사용시까지 -80℃에 저장하였다.

효소 분석 및 동역학 분석을 50mM 인산나트륨, pH 7.0에서 정제된 His₆-태그된 단백질을 사용하여 수행하였다. 겔-여과 분석(Gel-filtration analysis)을 Sepharose 6 10/300GL (GE Healthcare) 컬럼 상에서 수행하였다. Bio-Rad filtration standards(catalog no. 151-1901)를 사용하여 측정하였다(표 4).

재조합 BGL-GYP17의 정제 결과

재조합 BGL-GYP17은 봉입체로부터 17.3%를 회복시켜 42.7-fold가 정제되었다(표 4). Superose 6 10/300 GL(GE Healthcare) 상에서 겔 여과로써 측정된 천연 진세노시드 글리코시다제의 분자량은 56,000이었고, SDS-PAGE에 의한 분석은 64,000였다(도 2). 이러한 결과는 진세노시드 글리코시다제가 모노머 단백질이라는 것을 의미한다.

실시예 4. 효소 특성 분석

2.0mM pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)를 포함하는 pH 7.0, 인산 나트륨 버퍼 50mM 중 90 μl에 대해 특이 활성 측정을 수행하였고, 반응 개시 전 10 μl 희석 정제 효소와 37℃에서 20분 동안 반응시켜 배양하였다. Na₂CO₃ 1M 중 0.1ml로 5 분 동안 처리하여 반응을 종료시키고, 405nm에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 분비를 즉각적으로 측정하였다. 활성 유닛(one unit of activity)을 분당 p-니트로페놀 1 μmol의 분비량으로 정의하였다. 특이 활성은 단백질 밀리그램(milligram)당 유닛으로 발현되었다. Bio-Rad 단백질 분석 염색 시약 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 모든 분석을 적어도 세 번 이상 수행하였다.

하기의 버퍼(50 mM) 내에서 분석함으로써, 2.0 mM pNPGlc로 활성에 있어서 pH의 효과를 측정하였다.

pH 2 내지 10의 범위: KCl-HCl (pH 2), 글라이신-HCl (pH 3), 아세트산 나트륨(pH 4 및 5), 인산 나트륨(pH 6 및 7), Tris-HCl (pH 8 및 9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH 10)

4℃에서 상기 언급된 버퍼 각각에 24시간 동안 효소를 배양한 후, 50mM 칼륨(potassium) 버퍼 내 pHPGlc로 분석함으로써 pH 안정성을 측정하였다. 상기 언급된 방법에 의해 활성을 측정하였다.

최적 pH에서 수득된 활성 확률로서 결과를 나타내었다.

pNPGlc 2.0mM을 사용하여 5분 동안 최적 pH에서 4 및 90℃의 범위의 온도범위를 사용하여 50mM 인산 칼륨 버퍼 내 온도 의존적 활성을 분석하였다. 서로 다른 온도에서 30분 동안 인산 칼륨 버퍼 50mM 내 효소 당량을 배양함으로써 온도 안정성 분석을 수행하였다. 10 분간 얼음으로 샘플을 냉각한 후, pNPGlc 분석에 의해 측정된 잔존 활성을 확인하였다.

몇몇 가지 금속 및 화학 제제의 효과 또한 측정하였다. 진세노시드 글리코시다제를 실온에서 30분 동안 HgCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, SDS, ZnSO₄, DTT 및 머캅토에탄올 1 및 10mM(최종농도)에 배양하였고, pNPGlc를 기질로 사용하여 활성을 측정하였으며, 화합물이 결여된 경우에 수득된 활성에 대해 퍼센트로 나타내었다.

1분 당 o-니트로페놀(o-nitrophenol) 또는 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 방출로서 정의된 1 활성 유닛으로, 크로모게닉 ONP(chromogenic ONP) 및 PNP(p-nitrophenyl) 기질 2.0 mM을 사용하여 37℃ 에서 5분 후 기질 선호도를 분석하였다. 분석된 기질(Sigma)은 PNP-β-D-글루코피라노시드(PNP-β-D-glucopyranoside), PNP-β-D-갈락토피라노시드(PNP-β-D-galactopyranoside), PNP-β-D-퓨코피라노시드(PNP-β-D-fucopyranoside), PNP-β-D-글루코스아마이드(PNP-β-D-glucosaminide), PNP-β-L-아라비노피라노시드(PNP-β-L-arabinopyranoside), PNP-β-D-만노피라노시드(PNP-β-D-mannopyronoside), PNP-β-D-자일로피라노시드(PNP-β-D-xylopyranoside), PNP-α-D-글루코피라노시드(PNP-α-D-glucopyranoside), PNP-α-L-아라비노퓨라노시드 (PNP-α-L-arabinofuranoside), PNP-α-L-아라비노피라노시드 (PNP-α-L-arabinopyranoside), PNP-α-D-람노피라노시드 (PNP-α-D-rhamnopyranoside), PNP-α-D-만노피라노시드 (PNP-α-D-mannopyranoside), 및 PNP-α-D-자일로피라노시드 (PNP-α-D-xylopyranoside), 및 o-니트로페놀[ONP]-β-D-글루코피라노시드(o-nitrophenol[ONP]-β-D-glucopyranoside), ONP-β-D-갈락토피라노시드(ONP-β-D-galactopyranoside), ONP-β-D-퓨코피라노시드(ONP-β-D-fucopyranoside) 및 ONP-β-D-갈락토피라노시드(ONP-β-D-galactopyranoside) 였다.

0.1mM 부터 0.6mM까지의 pNPGlc 농도를 사용하여 새로 정제된 효소로 동역학 분석을 수행하였다. 405nm의 흡광도로 37℃ 에서 20분 동안 관찰하였다. 그 결과 데이터는 Cleland에 의해 보고된 Enzyme Kinetics Program을 사용하여 Km 및 Vmax를 확인하여 나타내었다.

결과

Bgl-gyp17은 인산 나트륨 버퍼에서 45℃, pH 7.0에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 효소는 37℃ 이하의 온도에서 안정화되고, 45℃에서 30분 동안 배양한 후에는 약 32%가 그 활성을 상실하였다(도 6).

Bgl-gyp17 활성 상의 다양한 화합물의 효과를 측정한 결과는 표 5에 나타내었다. 거의 모든 금속 이온 및 킬레이트 제제가 효소 활성에 거의 영향을 받지 않았지만, Hg²⁺ 이온은 활성을 강하게 억제하였고, SDS는 10mM 이상의 농도에서 억제 효과를 나타내었다. Bgl-gyp17의 기질 특이성을 조사하기 위하여, pH 7.0, 2.0mMβα 및 β형 p-NP(p-nitrophenyl) 및 ONP(O-nitrophenyl)-글리코시다제를 포함하는 50mM 인산 나트륨 버퍼에서 37℃ 로 배양하였다. 그 결과(표 6), 진세노시드 글리코시다제는 ONP-β-D-글루코피라노시다제 다음으로 PNP-β-D-글루코피라노시다제 대해 최대 활성을 나타내었고, pNP- 또는 ONP-β-D-퓨코피라노시다제를 제외하고는 대부분 다양한 pNP- 또는 ONP-글리코시다제에 활성을 나타내지 못하였다. 진세노시드 글리코시다제에 의한 pNPGlc의 가수분해에 대한 Km 및 Vmax는 Cleland에 의해 보고된 Enzyme Kinetic program 0-2 mM 기질을 사용하여 확인하였는데, 상기 프로그램에 의해 측정된 값은 각 pNpGlc에 대해 4.24 mM 및 0.10 mmol*min^-1*mg of protein^-1이었다.

실시예 5. 진세노사이드의 효소적 가수분해 활성 분석

PPD 타입 진세노사이드 C-3 및 C-20 부위에 부착된 글루코스 가수분해에 대한 재조합 효소 특이성 및 선택성을 분석하기 위하여, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rg3을 기질로 사용하였다. 효소 0.2U 및 50mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v) (pH 7.0) 기질을 포함하는 각 반응 혼합물을 37℃ 에서 배양하였다. 샘플을 적절한 간격으로 수거하여, 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH₃OH에 용해시켜 TLC HPLC 또는 NMR 분석을 수행하였다.

전환단계는 반응 용액의 농도 의존적인 것으로 나타났다. 0.01 mg/ml 보다 낮은 효소 농도에서는, 진세노사이드 Rb1 1mg/ml가 완전히 가수분해 되었고, 주요 생성물은 gyp XVII였다. 진세노사이드 Rb1이 0.1 mg/ml인 경우, gypVXII는 순차적으로 gyp LXXV로 전환될 수 있었다. 이러한 효소 농도는 pH 7.5, 50mM 인산 버퍼에 40mM의 가용화된 봉입체를 직접적으로 희석시킴으로써 리폴딩 단계를 통해 달성될 수 있었다.

진세노사이드 Rd의 경우, Rd의 C-3 위치에 말단 글루코스를 절단함으로써 F2로 전환시켰고, 그 후, F2는 F2의 C-3 위치의 내부 글루코스를 절단함으로써 C-K(compound K)로 더 전환되었다.

진세노사이드 Rg3를 기질로 사용하는 경우, 효소는 Rg3의 C-3 위치에 말단 글루코스를 가수분해하여 진세노사이드 Rh2를 형성하였고, 나아가 Rh2의 내부 글루코스 절단을 통하여 PPD로 전환시켰다.

또한 본 발명의 효소는 C-3 위치 말단 글루코스 및 내부 글루코스를 차례로 절단함으로써 진세노사이드 Rb2 및 Rc를 C-Y(compound Y) 및 C-Mc1(compound Mc1)을 거쳐 C-O(compound O) 및 C-Mc(compound Mc)로 전환시켰다.

결과적으로 재조합 Bgl-gyp17은 말단 및 내부에 부착된 PPD 타입 진세노사이드의 C-3 부위를 선택적으로 가수분해시킬 수 있고, 이에 따라 진세노사이드 Rb1 및 gyp XVII를 gyp LXXV로; Rd 및 F2를 C-K로; Rg3 및 Rh2를 PPD로; Rb2 및 C-O를 C-Y로; 및 Rc 및 C-Mc1을 C-Mc로 전환시킬 수 있었다.

도 1은 PPD 타입과 PPT 타입 진세노사이드의 종류를 나타낸 것이다.

도 2는 Bgl-gyp17 정제에 대한 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다.

M, 샘플 레인(분자량 기준); lane 1, 유도 전 전체 세포; lane 2, 유도 후 전체 세포; lane 3, 봉입체; lane 4, 가용화된 봉입체; lane 5, 리폴딩된 봉입체; lane 6, Nickel-charged His T rap column에 의해 정제된 단백질; lane 7, rTEV에 의해 제거된 His₆ 태그

도 3은 Bgl-gyp17을 이용한 메이저 타입 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc의 생물학적 전환에 대한 TLC 분석 결과를 나타낸 도이다.

도 4는 Bgl-gyp17을 이용한 메이저 타입 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc의 시간에 따른 생물학적 전환 산물에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 사진이다.

도 4는 Bgl-gyp17을 이용한 메이저 타입 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc의 생물학적 전환 경로에 대해 나타낸 도이다.

도 6은 E.coli로부터 정제된 재조합 BGL-GYP17의 안정성 및 활성에 있어서, pH(A) 및 온도(B)의 영향을 나타낸 것이다. 활성에 있어서 pH의 효과를 다음의 pH 2 내지 10의 버퍼(50mM) 범위 내에서 분석함으로써 pHPGlc 2.0mM 로 확인하였다.

버퍼: KCl-HCl(pH 2), 글라이신-HCl(pH 3), 아세트산나트륨(pH 4 및 5), 인산 나트륨(pH 6 및 7), Tris-HCl(pH 8 및 9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH 10).

안정성에 있어서 pH의 영향을 확인하기 위하여, 50mM 버퍼 내 효소 용액을 4℃ 에서 24시간 동안 배양하였고, 표준 분석 방법에 의해 잔기 활성을 분석하였다. 활성의 열의존성은 4 및 90℃의 온도 범위를 사용하여 50mM 인산칼륨 버퍼 내에서 분석하였다. 서로 다른 온도에서 30분 동안 50mM 인산 칼륨 버퍼에 효소 당량을 배양함으로써 열안정성 분석을 수행하였다. 10분 동안 얼음으로 샘플을 냉각한 후, 표준 분석 방법에 의해 잔존 활성을 확인하였다.

도 7은 계통발생학 근간에 기초하여, Gsoil3082^T 균주 및 관련성 있는 악티노박테리아 내 박테리아의 16S rRNA 서열을 분석한 결과를 나타내었다. 상기 트리는 Kimura(1983) two-parameter distance matrix 및 pairwise deletion과 함께 neighbor-joiing method (Saitou & Nei, 1987)을 사용하여 제작하였다. 70% 이상의 Bootstrap 값(1000개 레플리콘의 퍼센트로 나타냄)을 브랜치 포인트(branch points)로 나타내었다. 바(bar)는 1000개 뉴클레오티드 당 10개 뉴클레오티드 치환을 나타낸다.

도 8은 bgl-gyp17을 포함하는 플라스미드 벡터를 도시한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> GINSENOSIDE GLYCOSIDASE FROM TERRABACTER SP. AND USE THEREOF <130> PA090248/KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 589 <212> PRT <213> Terrebacter sp. <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(589) <223> amino acid sequence of Bgl-gyp17 <400> 1 Met Asp Pro Tyr Glu Asp Pro Arg Leu Pro Val Glu Val Arg Val Glu 1 5 10 15 Asp Leu Leu Gly Arg Leu Ser Leu Glu Glu Lys Val Gly Leu Met Phe 20 25 30 Gln Thr Val Ile Glu Ala Gly Ser Asp Gly Thr Val Leu Glu His Pro 35 40 45 Gly Ser Ile Ser Lys Ser Pro Thr Ser Thr Val Val Leu Asp Lys His 50 55 60 Leu Thr His Phe Asn Val His Ala Leu Asp Asp Pro Arg Met Ala Ala 65 70 75 80 Arg Trp Ser Asn Ala Leu Gln Ala Leu Ala Glu Arg Thr Pro His Gly 85 90 95 Ile Pro Val Thr Val Ser Thr Asp Pro Arg His Ala Phe Ile Glu Asn 100 105 110 Val Gly Val Ser Phe Ser Ala Gly Ala Phe Ser Gln Trp Pro Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Ala Ala Leu Arg Asp Ala Asp Ala Val Arg Arg Phe Ala 130 135 140 Asp Ile Ala Arg Gln Glu Tyr Val Ala Val Gly Ile Arg Ala Ala Leu 145 150 155 160 His Pro Thr Leu Asp Leu Ala Thr Glu Pro Arg Trp Ala Arg Gln Ala 165 170 175 Gly Thr Phe Gly Gln Asp Pro Asp Leu Val Thr Glu Leu Gly Val Ala 180 185 190 Tyr Leu Lys Gly Phe Gln Gly Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ser Val Ala 195 200 205 Cys Thr Ser Lys His Phe Pro Gly Gly Gly Pro Gln Lys Asp Gly Glu 210 215 220 Asp Ala His Phe Pro Tyr Gly Arg Glu Gln Val Tyr Pro Gly Gly Arg 225 230 235 240 Phe Ala Asp His Leu Lys Pro Phe Pro Pro Ile Ile Glu Ala Gly Thr 245 250 255 Ala Gly Ile Met Pro Tyr Tyr Gly Met Pro Val Asp Leu Val Val Asp 260 265 270 Gly Val Glu Ile Glu Pro Ile Gly Phe Gly Tyr Asn Lys Gln Val Val 275 280 285 Thr Gly Leu Leu Arg Glu Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Val Val Val Thr 290 295 300 Asp Trp Glu Leu Val Asn Asp Asn His Val Gly Asp Gln Val Leu Pro 305 310 315 320 Ala Arg Ala Trp Gly Val Glu His Leu Asp Pro His Gly Arg Met Glu 325 330 335 Leu Ile Leu Glu Ala Gly Ala Asp Gln Phe Gly Gly Glu Glu Cys Val 340 345 350 Glu Ile Leu Leu Asp Leu Val Ala Gln Gly Arg Val Thr Glu Ala Arg 355 360 365 Val Asp Glu Ser Ala Arg Arg Ile Leu Ala Val Lys Phe Arg Leu Gly 370 375 380 Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Val Asp Glu Asp Glu Ala Ala Ala Thr Val 385 390 395 400 Gly Arg Asp Asp Phe Arg Glu Glu Gly Tyr Ala Ala Gln Ala Arg Ser 405 410 415 Val Thr Val Leu His His Glu Gly Gly Arg Leu Pro Leu Glu His Gly 420 425 430 Leu Arg Ile Tyr Ala Glu Gln Val Ser Pro Glu Ala Val Ala Arg His 435 440 445 Gly Lys Leu Val Asp Arg Pro Glu Asp Ala Asp Val Ala Val Val Arg 450 455 460 Leu Thr Ala Pro Phe Asp Pro Arg Ser Asp Leu Phe Leu Glu Ser Trp 465 470 475 480 Phe His Gln Gly Ser Leu Asp Phe Pro Pro Gly Leu Val Ala Arg Leu 485 490 495 Glu Arg Ile Ala Ala Val Cys Pro Leu Val Val Asp Val Val Leu Asp 500 505 510 Arg Pro Ala Val Leu Thr Pro Leu Leu Arg Phe Ala Ser Ala Val Val 515 520 525 Gly Ser Phe Gly Ser Cys Asp Asp Ala Leu Leu Asp Ala Leu Thr Gly 530 535 540 Thr Ile Ala Pro Val Gly Arg Leu Pro Phe Asp Leu Pro Arg Ser Met 545 550 555 560 Asp Gln Val Arg Ala His Gly Glu Asp Val Pro Gly Tyr Asp Asp Pro 565 570 575 Leu Phe Pro Phe Gly His Gly Leu Arg Leu Asp Thr Glu 580 585 <210> 2 <211> 1770 <212> DNA <213> Terrebacter sp. <220> <221> gene <222> (1)..(1770) <223> DNA sequence of bgl-gyp17 <400> 2 atggatccct acgaggaccc ccggctcccc gtagaggtgc gcgtcgagga cctgctcggt 60 cggctctcgc tcgaggagaa ggtcggcctg atgttccaga ccgtcatcga ggccggctcg 120 gacggcacgg tgctcgagca ccccggcagc atcagcaagt cgccgacgag cacggtcgtg 180 ctcgacaagc acctcacgca cttcaacgtc cacgcgctcg acgacccgcg gatggcggcc 240 aggtggagca acgccctgca ggcactggcc gagcgcacgc cacacggcat acccgtgacg 300 gtgtcgacag acccgcgtca cgcgttcatc gagaacgtcg gggtgtcctt ctccgcaggc 360 gcgttctcgc agtggcccga gccgctcggc ctcgcggcgc tccgggacgc ggacgccgtg 420 cgacgcttcg ccgacatcgc ccgccaggag tacgtcgcgg tgggcatccg tgccgcactg 480 cacccgaccc tggacctcgc gaccgagccg cgctgggccc gccaggccgg caccttcggc 540 caggatcccg acctcgtgac cgagctcggt gtcgcctatc tcaagggttt ccaaggggat 600 tcgctcggct ccggcagcgt ggcgtgcacg agcaagcact tccccggcgg cggcccccag 660 aaggacggcg aggacgcgca cttcccctac ggccgcgagc aggtctatcc cggtgggcgt 720 ttcgccgacc acctcaagcc gttcccgccg atcatcgagg ccggcaccgc ggggatcatg 780 ccctactacg gcatgccggt cgacctcgtc gtcgacggcg tcgagatcga gccgatcggc 840 ttcggctaca acaagcaggt ggtcaccggg ctgctccgcg agaagctcgg ctacgacggc 900 gtcgtcgtca cggactggga gctcgtcaac gacaaccacg tcggagacca ggtgctgccc 960 gcccgcgcct ggggcgtcga gcacctcgac ccgcacggcc gcatggagct catcctcgag 1020 gccggcgccg accagttcgg tggcgaggag tgcgtcgaga tcctgctcga cctcgtcgcg 1080 caggggcgcg tcaccgaggc tcgcgtcgac gagtcggccc gccgcatcct ggcggtgaag 1140 ttccgtctcg gcctcttcga gaacccctac gtcgacgagg acgaggccgc ggcgacggtc 1200 gggcgcgacg acttccgcga ggaggggtat gccgcgcagg cccgttcggt gaccgtgctg 1260 caccacgagg gtggccggct gccgctcgag catggcctgc gcatctacgc cgagcaggtc 1320 tcacccgagg cggtcgcccg gcacggcaag ctcgtcgacc ggcccgagga cgccgacgtc 1380 gcggtcgtgc gcctgacggc gccgttcgac ccgcgctcgg acctcttcct cgagtcgtgg 1440 ttccaccagg gctcgctcga cttcccgccc ggcctcgtcg cccgcctcga gcggatcgcc 1500 gcggtgtgcc cgctcgtcgt cgacgtcgtg ctcgaccggc cggccgtcct caccccgctg 1560 ctgcgcttcg cgtccgcggt cgtcggcagc ttcggctcgt gcgacgacgc cctgctcgac 1620 gccctcaccg gcaccatcgc gcccgtgggc cgtctgccgt tcgacctgcc ccgttcgatg 1680 gatcaggtgc gcgcacacgg cgaggacgtc ccgggctacg acgacccgct cttccccttc 1740 ggccacgggc ttcgtctcga cacggagtga 1770 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F universal primer <400> 3 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R universal primer <400> 4 tacggytacc ttgttacgac tt 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for FP-1 <400> 5 ctggtccacc tacaacaaag g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for RP-1 <400> 6 agagattttg agacaggatc cg 22 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pbgl-gin18 <400> 7 cggaattcat ggatccctac gaggacccc 29 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pbgl-gin18 <400> 8 cccaagctta ccccgggacg acgaggc 27

Claims (16)

1. 서열번호 1로 구성된 아미노산 서열을 갖는 진세노시드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌의 3번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
4. 제1항의 단백질을 코딩하는 핵산.
5. 제4항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2로 구성된 서열을 갖는 핵산.
6. 삭제
7. 제4항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 pHis-Parallel1로서, 도 8에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 벡터.
9. 제7항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(E.coli)인 형질전환체.
11. (a) 제9항의 형질전환체를 배양하는 단계;

    (b) 상기 배양된 형질전환체로부터 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 단계; 및

    (c) 상기 생산된 진세노시드 글리코시다제를 회수하는 단계

    를 포함하는 제1항에 따른 진세노시드 글리코시다제의 제조방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. 제1항의 단백질을 이용하여 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소의 가수분해에 의해 진세노사이드 Rb1의 지페노사이드 XVII로의 전환, 지페노사이드 XVII의 지페노사이드 LXXV로의 전환, 진세노사이드 Rb2의 화합물 Y(compound Y)로의 전환, 화합물 O(compound O)의 화합물 Y(compound Y)로의 전환, 진세노사이드 Rc의 화합물 Mc(compound Mc)로의 전환, 및 화합물 Mc1(compound Mc1)의 화합물 Mc(compound Mc)로의 전환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 가용성 사포닌으로 전환하는 방법.
15. 제1항의 단백질을 이용하여 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소의 가수분해에 의해 진세노사이드 Rd의 화합물 K로의 전환, 진세노사이드 F2의 화합물 K로의 전환, 진세노사이드 Rg3의 PPD로의 전환 및 진세노사이드 Rh2의 PPD로의 전환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 가용성 사포닌으로 전환하는 방법.
16. 제1항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 PPD 타입의 사포닌의 3번 탄소의 가수분해에 의해 진세노사이드 Rb1의 지페노사이드 XVII로의 전환, 지페노사이드 XVII의 지페노사이드 LXXV로의 전환, 진세노사이드 Rb2의 화합물 Y(compound Y)로의 전환, 화합물 O(compound O)의 화합물 Y(compound Y)로의 전환, 진세노사이드 Rc의 화합물 Mc(compound Mc)로의 전환, 화합물 Mc1(compound Mc1)의 화합물 Mc(compound Mc)로의 전환, 진세노사이드 Rd의 화합물 K로의 전환, 진세노사이드 F2의 화합물 K로의 전환, 진세노사이드 Rg3의 PPD로의 전환 및 진세노사이드 Rh2의 PPD로의 전환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 전환에 의한 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물.

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