CN103146592B - 一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌及其应用。所述酵母菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GWYS01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M2013038，保藏日期：2013年1月22日。本发明同时公开了一种酵母菌在转化人参皂苷Rb1生成Rd方面的应用。本发明利用酵母菌代谢产物糖苷酶将人参皂苷Rb1转化为Rd，提高了人参中有效成分的生物利用率，24小时Rb1的转化率达到97.5%，转化形成Rd的比率为62%。本发明的成本较低，操作简单，转化周期短，促进了中药人参皂苷现代化和产业化的发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌，同时还涉及该酵母菌的应用，属于中药技术领域。
背景技术
人参（Panax ginseng G.A.Meyer）是我国珍贵的传统中药，应用于中医临床已有两千多年的历史。人参的主要活性成分是人参皂苷(ginsenoside)，其中，原人参二醇类皂苷属于达玛烷型四环三萜皂苷，主要包括Rb1、Rc、Rd、Rg3以及Rh2等。以上单体的结构差异仅在于C3和C20位上的糖基侧链不同，但显示出的药理活性却有不同。如Rb1表现出良好的抗心律失常和抗衰老作用（人参皂苷Rb1的药理活性研究进展，中国中药杂志，2008，33(12)：1371-1377）；Rc可减弱由辣椒碱和P物质诱导的疼痛（Effects of ginsenosides on vanilloid receptor(VR1)channels expressed in Xenopus oocytes，Mol Cells，2001，12：342-346；Antinociceptive effects ginsenosides injected intracerebroventricularly or intrathecally in substance P-induced pain model，Planta Med，2003，69：1001-1004）及延长溶血发生的滞后时间（Can ginsenosides protect human erythrocytes against free-radical-induced hemolysis，Biochim Biophys Acta，2002，1572(1)：58-66）；Rd具有促进神经干细胞分化（Ginsenoside-Rd from Panax notoginseng enhances astrocyte differentiation from neural stem cells，Life Sci，2005，76(9)：983-995）、选择性拮抗卡因酸引起的致死性兴奋性中毒（Effects of ginsenoside Rd and decursinol on the neurotoxic responses induced by kainic acid in mice，Planta Med，2003，69(3)：230-234）、减弱由辣椒碱和P物质诱导的疼痛（Effects of ginsenosides on vanilloid receptor(VR1)channels expressed in Xenopus oocytes，Mol Cells，2001，12：342-346；Antinociceptive effects ginsenosides injected intracerebroventricularly or intrathecally in substance P-induced pain model，Planta Med，2003，69：1001-1004）以及抗衰老（Ginsenoside-Rd attenuates oxidative damage related to aging in senescence-accelerated mice，J Pharm Pharmacol，2004，56(1)：107-113）等作用；Rg3在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞侵袭和转移及增强机体免疫力等方面具有显著的效果（人参皂苷Rg3抗肿瘤作用机制研究进展，现代肿瘤医学，2008，16(4)：648-652）；Rh2对多种肿瘤均有一定的抑制作用，具有较强的抗肿瘤增效作用（Rh2synergistically enhances paclitaxel or mitoxantrone in prostate cancer models，J Urol，2006，175(5)： 1926-1931），此外，还具有降血糖的作用（Mediation of β-endorphin by ginsenoside Rh2to lower plasma glucose in streptozotocin-induced diabetic rats，Planta Med，2006，72(1)：9-13）。上述皂苷中，Rb1、Rc和其它三种皂苷单体Rb2、Re和Rg1在人参根中的含量超过80%，而Rd、Rg3和Rh2含量却极低，但它们有着更强的药理活性（Microbial conversion of major ginsenoside Rb1to pharmaceutically active minor ginsenoside Rd，Journal of Microbiology，2005，43(5)：456-462）。此外，天然高含量苷类成分在肠道难以吸收，分子结构不是最佳活性状态，难以直接发挥药效，因此，稀有皂苷成为国内外主要研究开发对象。
人参皂苷在人参代谢过程中的机理还不明确，无法在生长过程中予以控制以定向积累稀有人参皂苷。研究者常通过将含量较高的多糖基人参皂苷如Rb1及Rc水解以获得低糖基的Rd、Rg3或Rh2等稀有皂苷。人参皂苷糖基改造的方法有化学法、酶法和微生物转化法，其中酶法和微生物转化法操作简单，能最大限度保护中药化学成分免遭破坏，同时有利于环境保护，降低生产成本，是以人参总皂苷为原料转化生产稀有皂苷的理想生产方式。目前，已有利用微生物或动植物代谢过程中所产能水解人参皂苷糖苷键的糖基水解酶为催化剂，定向转化生成稀有皂苷的技术方法。研究中涉及的微生物类型主要是细菌和霉菌（高产人参皂苷β-葡萄糖苷酶菌种的筛选，大连轻工业学院学报，2000，19(3)：195-198；从一种新筛选的菌中找出人参皂苷酶，大连轻工业学院学报，2003，22(3)：164-166；Microbial conversion of major ginsenoside Rb1 to pharmaceutically active minor ginsenoside Rd，Journal of Microbiology，2005，43(5)：456-462；把人参二醇类皂苷转化为Rg3的特种人参皂苷糖苷酶生成的细菌筛选，大连工业大学学报，2008，27(2)：97-101），也有从人参中分离出人参皂苷水解酶以及使用动物消化酶进行研究的报道（Purification and characterization of ginsenoside-β-glucosidase from ginseng，Chem.Pharm.Bull，2001，49(7)：795-798；Purification and characterization of ginsenoside-α-arabinofuranase hydrolyzing ginsenoside Rc into Rd from the fresh root of Panax ginseng，Process Biochemistry，2002，37：793-798；蜗牛酶中一种人参皂苷Rb1酶的分离纯化，生物工程学报，2005，11：929-933），此外，还有使用真菌（真菌对人参皂昔Rb1及人参二醇系皂苷的代谢作用，药学学报，2001，3(18)：603-605）或大型药用真菌采用固体发酵进行微生物转化的研究报道（人参皂苷微生物转化的研究，吉林：吉林农业大学，2004）。研究中获得较多的酶为人参皂苷Rb1水解酶，其水解产物主要为Rd，此外还有可将Rg3水解生成Rh2的人参皂苷糖苷酶，以及从人参根中分离纯化出能将Rc水解生成Rd的人参皂苷-α-***糖苷酶。
这些转化方法中，大都采用到斜面种子活化，制备液体种子进行微生物转化，在进行生物转化时，除人参皂苷原料外，同时还添加其它辅料如葡萄糖，无机盐等，且转化效率低，大多约为15%～20%。也有利用活性干酵母转化人参皂苷Rb1的报道，转化率仅为30%～36%。
发明内容
本发明的目的是提供一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌，所述酵母菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GWYS01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M2013038，保藏日期：2013年1月22日。
酵母菌是一种单细胞真菌，具有多种活性强大的酶系，如淀粉酶、糖化酶、糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶等，特别是糖苷酶活性强，而人参皂苷由苷元和糖链组成，利用酵母菌所产糖苷酶，降解人参皂苷分子上的糖基，使其转化为皂苷苷元，可提高人参皂苷的生物利用度。
本发明酵母菌代谢产物中含有能强烈水解人参皂苷Rb1的人参皂苷糖苷酶，24小时Rb1的转化率达到97.5%，转化形成Rd的比率为62%。
本发明的目的还在于提供一种酵母菌在转化人参皂苷Rb1生成Rd方面的应用。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种酵母菌在转化人参皂苷Rb1生成Rd方面的应用。
本发明的目的还在于提供一种酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，包括以下步骤：
1）酶液的制备：
将酵母菌发酵培养，然后将发酵液过滤，第一次离心，去除菌体沉淀，收集上清液；在20-30℃条件下，加入硫酸铵至60-80%饱和度，4-6℃静置过夜；然后第二次离心，弃上清液，收集蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀用0.02mol/L、pH4.5-5.5的醋酸钠缓冲液6-10mL溶解后装入透析袋，用相同的醋酸钠缓冲液透析22-26h；透析后，第三次离心，上清液即为酶液；
2）酶液的转化反应：
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH4.5-5.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与酶液按照体积比1:5-9混合，在35-45℃条件下反应，得到人参皂苷Rd。
所述酵母菌发酵培养的具体方法为：将酵母菌接种到PDA培养基上，在28-32℃条件下培养35-45h，然后将酵母菌接种于YPD培养基中，在34-38℃条件下，振荡培养45-51h，得到酵母菌发酵液。
所述PDA培养基包括以下组分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水定容至1000mL，自然pH。
所述YPD培养基包括以下质量分数的组分：1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。
所述第一次离心的条件为：离心温度15-17℃、转速10000-12000r/min、离心时间15-20min。
所述第二次离心的条件为：离心温度4-6℃、转速12000-14000r/min、离心时间15-20min。
所述第三次离心的条件为：离心温度15-17℃、转速12000-14000r/min、离心时间8-12min。
本发明利用酵母菌代谢产物糖苷酶将人参皂苷Rb1转化为Rd，提高了人参中有效成分的生物利用率。本发明的成本较低，操作简单，转化周期短，促进了中药人参皂苷现代化和产业化的发展。
具体实施方式
培养基的配制：
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水定容至1000mL，自然pH，115℃，0.1MPa高压灭菌20min。
YPD培养基：1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖，115℃，0.1MPa高压灭菌20min。YPD琼脂培养基即在YPD培养基中2%的琼脂。
麦芽汁液体培养基：将干麦芽粉碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3-4h，将糖化液煮沸后用纱布过滤至澄清，稀释至5-6波美度，pH6.4，121℃，0.1MPa，高压灭菌20min。
葡萄糖发酵培养基：黄豆芽125g，酵母膏6g，葡萄糖20g，水1000mL，115℃灭菌，20min。
氮源同化培养基：葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母膏0.2g，琼脂20g，水1000mL，过滤后分装试管，115℃灭菌20min。
实施例1、
1、酵母菌的筛选
将酒厂窖泥接种于麦芽汁液体培养基中进行增菌培养，然后采用YPD培养基，以平板稀释法分离菌株，分别于25℃和37℃两个温度条件下培养2d，以菌落外观形态为主，配合镜检观察菌体形态，获得符合酵母菌菌落特征的菌株若干，然后进行多次纯化得到5个菌株，分别接入YPD琼脂培养基斜面，置于冰箱4℃保存备用。分离纯化得到的5个菌株分别命名为GWYS01、GWYS02、GWYS03、GWYS04、GWYS05。
2、酶液的制备
分别制备实施例1筛选的5个菌株相应的酶液，具体步骤如下：
1）菌株的培养与发酵
将实施例1分离纯化的菌株接种于PDA培养基中，30℃培养40h后，再按照体积分数5%的比例转入YPD培养基发酵，在36℃、160r/min条件下，振荡培养48h，得到发酵液；
2）酶液的制备：
将发酵液过滤，在15℃、10000r/min条件下，离心20min，去除菌体沉淀，收集上清液；在25℃条件下，加入硫酸铵至70%饱和度，4℃静置过夜；然后在4℃、13000r/min条件下，离心20min，弃上清液，收集蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀用0.02mol/L、pH5.0的醋酸钠缓冲液8mL溶解后装入透析袋，用相同的醋酸钠缓冲液透析24h；透析后，在15℃，13000r/min条件下，离心10min，上清液即为酶液。
3、转化反应
将5个菌株相应的酶液在相同条件下与人参皂苷Rb1反应，筛选得到1个能够有效转化人参皂苷Rb1生成Rd的菌株，为GWYS01。
将GWYS01划线接种于YPD培养基中，于37℃下培养2d，肉眼观察其菌落形态特征，镜检观察细胞形态。选用葡萄糖发酵培养基，接种后37℃培养，每隔12h观察发酵情况，同时选用氮源同化培养基，接种后37℃培养2d观察。观察菌株GWYS01的菌落形态、细胞形态，以及生理生化培养特性，如表1所示。
表1形态观察及生理生化特性测试结果
18S rDNA片段扩增及测序：
提取其基因组，采用EF3、EF4通用引物进行18S rDNA片段扩增及测序，其中，
EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'（SEQ ID NO:1）
EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'（SEQ ID NO:2）
其中，R代表A或G。
18S rDNA扩增片段测序结果：
gatggagttg cccccttctc taagcagatc ctgaggcctc actaagccat tcaatcggta ctagcgacgg gcggtgtgta
caaagggcag ggacgtaatc aacgcaagct gatgacttgc gcttactagg aattcctcgt tgaagagcaa taattacaat gctctatccc
cagcacgacg gagtttcaca agattaccaa gacctctcgg ccaaggttag actcgctggc tccgtcagtg tagcgcgcgt
gcggcccaga acgtctaagg gcatcacaga cctgttattg cctcaaactt ccatcggctt gaaaccgata gtccctctaa gaagtggata
accagcaaat gctagcacca ctatttagta ggttaaggtc tcgttcgtta tcgcaattaa gcagacaaat cactccacca actaagaacg
gccatgcacc accacccaca aaatcaagaa agagctctca atctgtcaat ccttattgtg tctggacctg gtgagtttcc ccgtgttgag
tcaaattaag ccgcaggctc cactcctggt ggtgcccttc cgtcaattcc tttaagtttc agccttgcga ccatactccc cccagaaccc
aaagactttg atttctcgta aggtgccgag tgggtcatta aaaaaacacc acccgatccc tagtcggcat agtttatggt taagactacg
acggtatctg atcatcttcg atcccctaac tttcgttctt gattaatgaa aacgtccttg gcaaatgctt tcgcagtagt tagtcttcaa
taaatccaag aatttcacct ctgacaattg aatactgatg cccccgaccg tccctattaa tcattacgat ggtcctagaa accaacaaaa
tagaaccaaa cgtcctattc tattattcca tgctaatata ttcgagcaat acgcctgctt tgaacactct aattttttca aagtaaaagt
cctggttcgc caagagccac aaggactcaa ggttagccag aaggaaaggc cccgttggaa atccagtaca cgaaaaaatc
ggaccggcca accgggccca aagttcaact acgagctttt taactgcaac aactttaata tacgctattg gagctggaat taccgcggct
gctggcacca gacttgccct ccaattgttc ctcgttaagg tatttacatt gtactcattc caattacaag acccgaatgg gccctgtatc
gttatttatt gtcactacct ccctgaatta ggattgggta atttgcgcgc ctgctgcctt ccttggatgt ggtagccgtt tctcaggctc
cctctccgga atcgaaccct tattccccgt tacccgttga aaccatggta ggccactatc ctaccatcga aagttgatag ggcagaaatt
tgaatgaacc atcgccagca caaggccatg cgattcgaaa agttattatg aatcatcaaa gagtccga
测序结果在GenBank数据库中进行同源性序列比对分析，结果显示GWYS01与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相关基因片段在序列上具有100%相似值。结合形态观察、生理生化特性以及分子鉴定，鉴定GWYS01为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
实施例2
1）酵母菌的培养与发酵
将GWYS01接种于PDA培养基中，32℃培养35h后，再按照体积分数5%的比例转入YPD培养基发酵，在38℃、160r/min条件下，振荡培养45h，得到发酵液；
2）酶液的制备：
将发酵液过滤，在16℃、12000r/min条件下，离心17min，去除菌体沉淀，收集上清液；在30℃条件下，加入硫酸铵至80%饱和度，5℃静置过夜；然后在5℃、12000r/min条件下，离心15min，弃上清液，收集蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀用0.02mol/L、pH5.5的醋酸钠缓冲液6mL溶解后装入透析袋，用相同的醋酸钠缓冲液透析22h；透析后，在16℃，12000r/min 条件下，离心12min，上清液即为酶液。
实施例3
1）酵母菌的培养与发酵
将GWYS01接种于PDA培养基中，28℃培养45h后，再按照体积分数5%的比例转入YPD培养基发酵，在34℃、160r/min条件下，振荡培养51h，得到发酵液；
2）酶液的制备：
将发酵液过滤，在17℃、11000r/min条件下，离心15min，去除菌体沉淀，收集上清液；在20℃条件下，加入硫酸铵至60%饱和度，6℃静置过夜；然后在6℃、14000r/min条件下，离心17min，弃上清液，收集蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀用0.02mol/L、pH4.5的醋酸钠缓冲液10mL溶解后装入透析袋，用相同的醋酸钠缓冲液透析26h；透析后，在17℃，14000r/min条件下，离心8min，上清液即为酶液。
实施例4
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH4.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例1中GWYS01制得的酶液按照体积比1:5混合，在45℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例5
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH4.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例1中GWYS01制得的酶液按照体积比7:50混合，在40℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例6
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH4.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例1中GWYS01制得的酶液按照体积比1:9混合，在35℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例7
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH5.0的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例1中GWYS01制得的酶液按照体积比7:50混合，在40℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min， 得到人参皂苷Rd。
实施例8
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH5.0的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例2中GWYS01制得的酶液按照体积比1:5混合，在35℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例9
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH5.0的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例2中GWYS01制得的酶液按照体积比1:9混合，在45℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例10
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH5.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例3中GWYS01制得的酶液按照体积比1:5混合，在35℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例11
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH5.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例3中GWYS01制得的酶液按照体积比7:50混合，在45℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实施例12
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH5.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与实施例3中GWYS01制得的酶液按照体积比1:9混合，在40℃条件下反应24h，然后于100℃水浴中放置15min，得到人参皂苷Rd。
实验例、酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的转化率分析
将实施例4-12的酶反应液与未加入酶液的底物反应液在60℃下烘干，然后分别溶于95%甲醇700μL中，8000rmp离心10min。用注射器吸取上清液，经0.45μm针式滤器过滤后存储于样品瓶中待测。
酶反应液通过HPLC进行检测分析，HPLC色谱条件：检测器为UV/VIS，检测波长203nm；色谱柱：ODS C18（150mm×4.6mm，5μm）；进样量10μL，柱温35℃，流速1mL/min，流动相：0-23min，乙腈：0.05%磷酸水=32：68；23-80min，乙腈：0.05%磷酸水=47：53。根据标准曲线测得反应前后各种成分的含量，根据反应底物和产物摩尔比例关系计算人参皂苷转化率，结果如表2所示。
表2酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的转化率分析
| 人参皂苷Rb1转化率% | 转化形成人参皂苷Rd的比率% | |
| 实施例4 | 94 | 51 |
| 实施例5 | 95 | 54 |
| 实施例6 | 97 | 55 |
| 实施例7 | 97.5 | 62 |
| 实施例8 | 97 | 60 |
| 实施例9 | 98 | 57 |
| 实施例10 | 92 | 55 |
| 实施例11 | 98 | 58 |
| 实施例12 | 96 | 53 |
Claims (9)
1.一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GWYS01，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏号：CCTCC NO：M2013038，保藏日期：2013年1月22日。
2.一种如权利要求1所述的酵母菌在转化人参皂苷Rb1生成Rd方面的应用。
3.一种如权利要求1所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）酶液的制备：
将酵母菌发酵培养，然后将发酵液过滤，第一次离心，去除菌体沉淀，收集上清液；在20-30℃条件下，加入硫酸铵至60-80%饱和度，4-6℃静置过夜；然后第二次离心，弃上清液，收集蛋白质沉淀；将蛋白质沉淀用0.02mol/L、pH 4.5-5.5的醋酸钠缓冲液6-10mL溶解后装入透析袋，用相同的醋酸钠缓冲液透析22-26h；透析后，第三次离心，上清液即为酶液；
2）酶液的转化反应：
称取人参皂苷Rb1，将人参皂苷Rb1与0.02mol/L、pH 4.5-5.5的醋酸钠缓冲液混合，配制成人参皂苷Rb1浓度为1.70mg/mL的底物反应液，然后将底物反应液与酶液按照体积比1:5-9混合，在35-45℃条件下反应，得到人参皂苷Rd。
4.根据权利要求3所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述酵母菌发酵培养的具体方法为：将酵母菌接种到PDA培养基上，在28-32℃条件下培养35-45h，然后将酵母菌接种于YPD培养基中，在34-38℃条件下，振荡培养45-51h，得到酵母菌发酵液。
5.根据权利要求4所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述PDA培养基包括以下组分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水定容至1000mL，自然pH。
6.根据权利要求4所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述YPD培养基包括以下质量分数的组分：1%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。
7.根据权利要求3所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述第一次离心的条件为：离心温度15-17℃、转速10000-12000r/min、离心时间15-20min。
8.根据权利要求3所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述第二次离心的条件为：离心温度4-6℃、转速12000-14000r/min、离心时间15-20min。
9.根据权利要求3所述的酵母菌转化人参皂苷Rb1生成Rd的方法，其特征在于，所述第三次离心的条件为：离心温度15-17℃、转速12000-14000r/min、离心时间8-12min。
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