CN110157697A - 一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备绞股蓝皂苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备绞股蓝皂苷的方法，属于生物工程技术领域。本发明酶为(a)或(b)：(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的酶；(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列衍生的酶且衍生酶的活性不变；或由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶；本发明提供了所述酶编码基因，含有该基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及以该酶作为活性成分的组合物，及其在降解糖苷类化合物中的应用，并且提供了一种制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C‑O、C‑MX1、C‑MC1或F2的方法。

Description

一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备绞股蓝皂苷的 方法

技术领域

本发明涉及一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

人参皂苷是人参的主要活性成分，已有大量相关文献研究表明，发挥药效的低极性人参皂苷，其在神经***有治疗神经退行性疾病、改善记忆功能、保护脑组织等作用，在心血管***有抗心律失常、抗心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌细胞凋亡等作用，在抗肿瘤方面具有诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、调控信号通路、调节免疫功能等作用，具有较好的临床应用价值。

绞股蓝皂苷(Gypenosides，GYP)是葫芦科植物绞股蓝的主要药效成分。其中绞股蓝皂苷Gyp XVII(gypenoside XVII，GP-17，结构式如下式I所示)由于其抗氧化特性，可减轻动脉粥样硬化引起的心血管疾病。且已有文献报道了GP-17对淀粉样蛋白-β(Aβ)诱导的神经毒性具有保护作用，并且被认为是阿尔兹海默症(AD)药物开发的候选化合物。以及C-Mx1(Ginsenoside C-Mx1，C-Mx1，结构式如下式Ⅱ所示)具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用，其脂溶性较强，口服吸收良好。因此，C-Mx1具有作为天然抗肿瘤药物的候选化合物的开发潜力。

由于低极性人参皂苷在人参中的含量很低，所以通过转化人参皂苷获得低极性人参皂苷是一个有效手段，主要包括化学转化法和生物转化法。

其中，生物转化法是利用有机体(细胞、细胞器)或酶作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系(包括细菌、真菌和植物组织等)对外源性底物进行结构修饰的化学反应。其本质是利用生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。生物转化具有反应条件温和、不易破坏皂苷结构、副产物少、后处理简单及对环境友好等优点。利用生物转化的方法实现目标产物的大量制备为一个优选。现有的用于人参皂苷生物转化的酶大部分具有高度专一性，即仅可以特异性作用于某一种底物，而无法满足同时作用于一种以上底物的要求，从而导致转化率较低。因此，急需得到可以同时作用于一种以上底物的酶，以提高生成绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的生物转化率。

发明内容

针对现有技术中的技术问题，本发明一种新型的具有β-葡萄糖苷酶功能的酶及其编码基因和它们的应用以及制备Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法。

本发明提供的酶，该酶为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的酶；或由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

本发明提供编码本发明所述的酶的基因。

本发明所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明提供含有本发明所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

本发明提供一种组合物，该组合物含有所述的酶作为活性成分。

本发明所述的酶，编码本发明所述的酶的基因，含有本发明所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及含有所述的酶作为活性成分的组合物中的任意一项在降解糖苷类化合物中的应用。

所述降解糖苷类化合物中的应用，其中，所述糖苷类化合物选自含有β-1,2-葡萄糖残基的化合物；

优选的，糖苷类化合物为二醇型人参皂苷。

本发明提供一种制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，该方法包括：在酶解条件下，将含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应；所述酶由所述的酶和/或所述含有所述的酶作为活性成分的组合物提供。

所述制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，以所述原料的总重量为基准，所述与含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应的酶的用量为10-20U/mg；所述酶解条件包括：酶解的温度为30-45℃，pH值为6-8，酶解的时间为20-60h。

所述制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，所述糖苷类化合物选自β-1,2-葡萄糖残基的化合物；

优选的，所述糖苷类化合物为二醇型人参皂苷。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的酶具有能够水解5种人参皂苷的优势，且都有较高的转化效率。可用于降解人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3及Rc，获得相应的绞股蓝皂苷Gyp XVII、F2、人参皂苷C-O、C-MX1及C-MC1等具潜在生物活性的稀有人参皂苷产物。在此过程中，绞股蓝皂苷GypXVII的转化率在高达98.2％以上(并可进一步水解得到F2)；C-O、C-MX1和C-MC1的转化率分别可以达到92.6％，91.8％及81.7％；

(2)本发明提供的酶具有耐受葡萄糖的优势；

(3)本发明提供构建的载体，在表达宿主BL21(DE3)中表达量高且稳定，粗酶即可直接进行酶促反应。

附图说明

图1为实施例1获得的酶基因PCR凝胶电泳图结果，其中，M为DNA标记物，1～3为酶基因；

图2为实施例1获得的重组酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为蛋白标记物，1为粗酶液，2为纯化的酶液，3为脱盐的纯蛋白；

图3为实施例1中酶活力测定的标准曲线图；

图4为实施例2中重组大肠杆菌水解Rb1反应结果的TLC分析图，其中，1为Rb1(对照)Rd(对照)，2为Gyp XVII(对照)，3为F2(对照)，4，5为重组大肠杆菌转化Rb1；

图5为实施例3～5中重组大肠杆菌水解Rb2、Rb3、Rc反应结果的TLC分析图，其中1为C-O(对照)，2为C-MX1(对照)，3为C-MC1(对照)，4为重组大肠杆菌转化Rb2，5为不含酶基因的大肠杆菌转化Rb2，6为重组大肠杆菌转化Rb3，7为不含酶基因的大肠杆菌转化Rb3，8为重组大肠杆菌转化Rc,9为不含酶基因的重组大肠杆菌转化Rc；

图6为实施例2中绞股蓝皂苷Gyp XVII和F2的HPLC色谱图，其中，A为转化前，B为转化后；

图7为实施例3中C-O的HPLC色谱图，其中，A为转化前，B为转化后；

图8为实施例4中C-MX1的HPLC色谱图，其中，A为转化前，B为转化后；

图9为实施例5中C-MC1的HPLC色谱图，其中，A为转化前，B为转化后。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本发明中具体公开。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位(U)表示，本发明中酶活力单位的定义是：在pH7.5和40℃的条件下，以对-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷为底物，每分钟水解产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。

本发明提供的酶，该酶为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的酶；或由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶；其中，酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的蛋白质的底物转化率与(a)的底物转化率之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述酶的任意一个氨基酸残基位置上。

本发明提供的酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明提供的酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

标签	残基数	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR(SEQ ID NO：3)
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH(SEQ ID NO：4)
			FLAG	8	DYKDDDDK(SEQ ID NO：5)
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK(SEQ ID NO：6)
			c-myc	10	EQKLISEEDL(SEQ ID NO：7)

上述酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

本发明提供编码本发明所述的酶的基因。

相应地，所述基因可以为如下的(1)或(2)：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码的酶的酶活性不变的DNA分子。其中，所述严格条件可以为：在6×SCC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SCC，0.1％SDS和1×SCC，0.1％SDS各洗膜一次。酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(2)编码的蛋白质的底物转化率与(1)编码的蛋白质的底物转化率之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述酶的活性一致的氨基酸序列。

优选地，本发明所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

本发明提供含有本发明所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

在本发明中，所述重组载体可以含有本发明提供的基因。重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选PET-32a质粒。重组载体的构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用SalⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ等；对于PET-30a，可用NdeⅠ、NotⅠ、EcoRⅠ、BamH、HindⅢ等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切PET-32a及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到重组载体。

在本发明中，所述表达盒可以通过将本领域常用的报道基因与本发明所述基因相连获得。优选地，所述表达盒还包括启动子和/或增强子。

在本发明中，所述转基因细胞系可以为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可以通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。

本发明提供的重组菌可以含有本发明提供的重组载体。本发明提供的酶还可以通过以下方法制得：培养本发明提供的重组菌，诱导编码所述酶的基因的表达；分离提纯所表达的酶。

在本发明中，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中以获得重组菌，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选化学转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌。

本发明提供一种组合物，该组合物含有所述的酶作为活性成分。

在本发明中，以所述组合物的总重量为基准，所述酶的含量为10-90重量％。优选地，所述组合物中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)、激动剂等。

本发明所述的酶，编码本发明所述的酶的基因，含有本发明所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及含有所述的酶作为活性成分的组合物中的任意一项在降解糖苷类化合物中的应用。

在本发明中，所述降解的过程可以是使糖苷类化合物中的糖苷键发生水解而断裂的过程。

所述降解糖苷类化合物中的应用，其中，所述糖苷类化合物选自含有β-葡萄糖残基的化合物；

更优选地，所述糖苷类化合物为人参皂苷类化合物，进一步优选为Rb₂、Rb₃、Rc，最优选为人参皂苷Rb₁。

本发明提供一种制备绞股蓝皂苷Gyp XVII，人参皂苷C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，该方法包括：在酶解条件下，将含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应；所述酶由所述的酶和/或所述含有所述的酶作为活性成分的组合物提供。

所述制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，以所述原料的总重量为基准，所述与含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应的酶的用量为10-20U/mg；所述酶解条件包括：酶解的温度为30-45℃，pH值为6-8，酶解的时间为20-60h；

优选的，所述与含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应的酶的用量为10-15U/mg；

优选的，酶解的温度为40℃，pH值为7.5，酶解的时间为20-40h；

所述制备绞股蓝皂苷Gyp XVII、C-O、C-MX1、C-MC1或F2的方法，所述糖苷类化合物选自β-1,2-葡萄糖残基的化合物；

优选的，所述糖苷类化合物为人参皂苷类化合物，更优选为Rb₂、Rb₃、Rc，最优选为人参皂苷Rb₁；

所述含有糖苷类化合物的原料可以由人参、西洋参和三七中的至少一种提供。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施2为例，绞股蓝皂苷Gyp XVII的转化率＝(转化产物中Gyp XVII的摩尔数)÷(人参皂苷Rb1的摩尔数)×100％。

实施例1：本实施例用于说明酶的制备；

(1)基因的获得

根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列通过聚合酶链式反应(PCR)扩增法获得相应的基因结果如图1；

(2)表达载体和重组菌株的构建

对由步骤(1)获得的基因以及毕赤酵母表达载体PET32a(购于美国Invitrogen公司)均进行EcoR I和HindⅢ双酶切，然后使用T4连接酶(购于宝生物工程(大连)有限公司)将上述两个经酶切后的产物连接，获得重组质粒，该重组质粒的双酶切验证结果如图2所示，其中，1为DNA标记物，2-5为重组质粒；

将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Invitrogen，货号为C18100)获得重组大肠杆菌；

(3)酶的制备

将得到的重组大肠杆菌接种于培养基LB(将5g酵母提取物、10g蛋白胨、10gNaCL溶解到1000mL ddH2O中，在温度为121℃下灭菌20min；置于温度为37℃培养2-3h至OD600A值在0.6-0.8之间，添加IPTG过夜诱导培养，离心收集菌体加入适量PBS重悬菌体，再次离心收集菌体加入适量PBS重悬菌体；通过超声细胞破碎仪破解菌体，在温度为4℃下离心半小时收集上清即为粗酶；

根据表达出的重组酶含有His标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化：磷酸缓冲液(pH7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样；继续使用含10mM咪唑的磷酸缓冲液1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；以磷酸缓冲液(pH7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液；纯化的酶液用10％SDS蛋白凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，M为蛋白标记物，1为对照，2为粗酶液，3为纯化的酶液；

(4)酶活力测定

分别吸取0.1mmol/L pNP溶液(对硝基苯酚，配制方法：准确称取对硝基苯酚13.9mg，用蒸馏水定容至1000mL)0.1mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL至10mL容量瓶中，用2mol/L碳酸钠溶液(配制方法：称取碳酸钠211.98g，定容至1000mL)定容后混匀。以蒸馏水作为空白，于405nm处比色，测定其吸光值，以对硝基酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示；

将5.5μL上述纯化的酶液和74.5μL的PBS缓冲液于40℃水浴锅平衡10min，加入20μL平衡后的10mMol/L的pNPG(4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷溶液：准确称取pNPG6mg，溶于2mL PBS缓冲液)，反应10min后，加入100μL2mol/L碳酸钠溶液终止反应，测定405nm处的吸收值；经测定，纯化的酶液的活力为104.7 U/mg。

实施例2：本实施例用于说明酶在制备人参皂苷C-O中的应用；

参照文献报道(李海舟，张颖君，杨崇仁。三七叶化学成分的进一步研究。天然产物研究与开发，2006，18(4)：549-554)的方法从人参叶总皂苷中分离和纯化人参皂苷Rb2(含量：HPLC≥99％；分子量、1H及13C NMR的化学位移值与文献报道的一致)；取100μL由实施例1获得的纯化的酶液，加入人参皂苷Rb2纯品，使其终浓度为1.0mg/mL，于温度为40℃且pH为7.5条件下酶解40h，取处理好的样品进行TLC分析，酶液能水解Rb2为人参皂苷C-O(如图5所示，其中，1为C-O(对照)，4为重组大肠杆菌转化Rb2，5为不含酶基因的大肠杆菌转化Rb2；取处理好的样品20μL进高效液相色谱检测人参皂苷C-O的生成量，检测方法为：采用汉邦C18HPLC分析柱进行定量检测分析，分析流动相为水:乙腈＝70:30；流动相流速为1.0mL/min；检测时柱温为30℃；检测波长203nm，检测结果如图5所示，其中，A为转化前，B为转化后；

结果表明，人参皂苷C-O的转化率为92.6％。

实施例3：本实施例用于说明酶在制备绞股蓝皂苷Gyp XVII中的应用；

参照文献报道(李海舟，张颖君，杨崇仁。三七叶化学成分的进一步研究。天然产物研究与开发，2006，18(4)：549-554)的方法从三七总皂苷中分离和纯化人参皂苷Rb1(含量：HPLC≥99％；分子量、1H及13C NMR的化学位移值与文献报道的一致)；取100μL由实施例1获得的纯化的酶液，加入人参皂苷Rb1纯品(使其终浓度为1.0mg/mL，于温度为40℃且pH为7.5条件下酶解25h，取处理好的样品进行TLC分析，酶液能水解Rb1为绞股蓝皂苷Gyp XVII和人参皂苷F2(如图4所示，其中，1为Rb1，Rd(对照)，2为绞股蓝皂苷Gyp XVII(对照)，3为F2(对照)，4，5为重组大肠杆菌菌转化Rb1；取处理好的样品20μL进高效液相色谱检测绞股蓝皂苷Gyp XVII的生成量，检测方法为：采用汉邦C18 HPLC分析柱进行定量检测分析，分析流动相为甲醇:水＝92:8；流动相流速为1.0mL/min；检测时柱温为30℃；检测波长203nm，检测结果如图7所示，其中，A为转化前，B为转化后；

结果表明，绞股蓝皂苷Gyp XVII的转化率为98.2％。

实施例4：本实施例用于说明酶在制备人参皂苷C-Mx1中的应用；

参照文献报道(李海舟，张颖君，杨崇仁。三七叶化学成分的进一步研究。天然产物研究与开发，2006，18(4)：549-554)的方法从三七叶总皂苷中分离和纯化人参皂苷Rb3(含量：HPLC≥99％；分子量、1H及13C NMR的化学位移值与文献报道的一致)；取100μL由实施例1获得的纯化的酶液，加入人参皂苷Rb3纯品，使其终浓度为1.0mg/mL，于温度为40℃且pH为7.5条件下酶解40h，取处理好的样品进行TLC分析，酶液能水解Rb3为人参皂苷C-Mx1(如图5所示，其中，2为C-Mx1(对照)，6为重组大肠杆菌转化Rb3，7为不含酶基因的大肠杆菌转化Rb3；取处理好的样品20μL进高效液相色谱检测人参皂苷C-Mx1的生成量，检测方法为：采用汉邦C18 HPLC分析柱进行定量检测分析，分析流动相为水:乙腈＝70:30；流动相流速为1.0mL/min；检测时柱温为30℃；检测波长203nm，检测结果如图8所示，其中，A为转化前，B为转化后；

结果表明，人参皂苷C-Mx1的转化率为91.8％。

实施例5：本实施例用于说明本发明提供的酶在制备人参皂苷C-Mc1中的应用；

参照文献报道(李海舟，张颖君，杨崇仁。三七叶化学成分的进一步研究。天然产物研究与开发，2006，18(4)：549-554)的方法从人参叶总皂苷中分离和纯化人参皂苷Rc(含量：HPLC≥99％；分子量、1H及13C NMR的化学位移值与文献报道的一致)；取100μL由实施例1获得的纯化的酶液，加入人参皂苷Rc纯品，使其终浓度为1.0mg/mL，于温度为40℃且pH为7.5条件下酶解40h，取处理好的样品进行TLC分析，酶液能水解Rc为人参皂苷C-Mc1(如图5所示，其中，3为C-Mc1(对照)，8为重组大肠杆菌转化Rc，8为不含酶基因的大肠杆菌转化Rc；取处理好的样品20μL进高效液相色谱检测人参皂苷C-Mc1的生成量，检测方法为：采用汉邦C18 HPLC分析柱进行定量检测分析，分析流动相为水:乙腈＝70:30；流动相流速为1.0mL/min；检测时柱温为30℃；检测波长203nm；检测结果如图9所示，其中，A为转化前，B为转化后；

结果表明，人参皂苷C-Mc1的转化率为81.7％。

以上实施例的结果表明，将本发明提供的酶分别用于降解三七叶总皂苷中的人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc时，其分别作用于人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc中C3位的β-1,2-葡萄糖苷键，将C3位葡萄糖水解下来，从而获得绞股蓝皂苷Gyp XVII、人参皂苷F2、C-O、C-MX1和C-MC1，并且绞股蓝皂苷Gyp XVII的转化率在高达98.2％以上，并进一步水解得到F2。C-O、C-MX1和C-MC1的转化率分别可以达到92.6％，91.8％，81.7％；

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备绞股蓝皂苷的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gtgaccaccg acaccaccgc tcccgtcgcc gtcgacgcgc aggccgcgcc cgcgtcgtcg 60

ggccgccgca cgttcccgac cgacttcctc tggggctccg cgaccgccgc ctaccagatc 120

gagggcgccg ccgccgaggg cggccgcacg ccgtccatct gggacacgta ctcccacacc 180

ccgggccgca cgctcaacgg cgacacgggc gacgtcgcgg acgaccacta ccaccggtgg 240

caggaggacg tgcagcacat cgccgacctc ggcctcggcg cgtaccggtt ctccatctcg 300

tggtcgcgcg tccagccggg cggtaccggc ccgctcaacc ccgagggcgt cgcgttctac 360

tcgcgcctcg tcgacgcgct cctcgagaag ggcgtcaagc ccgtcgtcac gctctaccac 420

tgggacctcc cgcaggagct ggaggacgcc gggggctggg cgaaccgcga caccgcgtac 480

gcgttcgccg agtacgcccg ccacatggcg cgcgagctcg gggaccggat cgacacctgg 540

acgacgctca acgagccgtg gtgctccgcc tacctcggct acggttccgg cgtgcacgcg 600

cccggccgca ccgagcccgc cgcggcgctc gcggccgtgc accacctcaa cctcgcgcac 660

ggcctcgccg tccaggcgat ccgcgacgag ctcggcgagg acgcgaagac gtccgtcacg 720

ctcaacctgc acgtcatccg gcccgacgac ccgtcgtcgg cggcggacct cgacgcggtg 780

cgcaagatcg acgcgctcgc caaccgcgcg ttcctcgcgc ccatgctcga cggcgagtac 840

cccgccgacc tgctcgccga caccgcgcac gtgagcgact ggtcgttcgt gcgggagggc 900

gacctcgaga cggtgcgcca gccgctgtcg atcctcggcg tcaactacta ctcgaccgtg 960

cgcgtgcgcc acttctccgg cgagggcgag cggtccgaga acgacggcca cggcgcgtcg 1020

agccacagcc cgtggatcgg cgtcgacgac gtggagttcg tccagcagcc cggcccgtac 1080

accgcgatgg gctggaacat cgagcccgcc ggcatgaccg agctgctcgt gtcggtggcg 1140

acgacgtacc cgcaccagcc gatgatggtc accgagaacg gcgccgcgtt cgccgacgag 1200

gtcacggtcg acgccgacgg gaccccccgc gtgcacgacg accgccgcgt cgcctacctg 1260

cacgaccacg tcgacgccgt gggcgccgcg atcgacgcgg gcgccgacgt gcgcgggtac 1320

ttcgcgtggt ccctgctcga caacttcgag tggggctacg ggtacgagcg ccgcttcggg 1380

atcatccgcg tcgactacga cactctcgag cgcacgtgga aggactccgc gcactggtac 1440

cgccggctcg cgacgtcgaa cgcgctcccc acggtcgacg agaccgcctg a 1491

<210> 2

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Val Thr Thr Asp Thr Thr Ala Pro Val Ala Val Asp Ala Gln Ala Ala

1 5 10 15

Pro Ala Ser Ser Gly Arg Arg Thr Phe Pro Thr Asp Phe Leu Trp Gly

20 25 30

Ser Ala Thr Ala Ala Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Gly

35 40 45

Arg Thr Pro Ser Ile Trp Asp Thr Tyr Ser His Thr Pro Gly Arg Thr

50 55 60

Leu Asn Gly Asp Thr Gly Asp Val Ala Asp Asp His Tyr His Arg Trp

65 70 75 80

Gln Glu Asp Val Gln His Ile Ala Asp Leu Gly Leu Gly Ala Tyr Arg

85 90 95

Phe Ser Ile Ser Trp Ser Arg Val Gln Pro Gly Gly Thr Gly Pro Leu

100 105 110

Asn Pro Glu Gly Val Ala Phe Tyr Ser Arg Leu Val Asp Ala Leu Leu

115 120 125

Glu Lys Gly Val Lys Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro

130 135 140

Gln Glu Leu Glu Asp Ala Gly Gly Trp Ala Asn Arg Asp Thr Ala Tyr

145 150 155 160

Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg His Met Ala Arg Glu Leu Gly Asp Arg

165 170 175

Ile Asp Thr Trp Thr Thr Leu Asn Glu Pro Trp Cys Ser Ala Tyr Leu

180 185 190

Gly Tyr Gly Ser Gly Val His Ala Pro Gly Arg Thr Glu Pro Ala Ala

195 200 205

Ala Leu Ala Ala Val His His Leu Asn Leu Ala His Gly Leu Ala Val

210 215 220

Gln Ala Ile Arg Asp Glu Leu Gly Glu Asp Ala Lys Thr Ser Val Thr

225 230 235 240

Leu Asn Leu His Val Ile Arg Pro Asp Asp Pro Ser Ser Ala Ala Asp

245 250 255

Leu Asp Ala Val Arg Lys Ile Asp Ala Leu Ala Asn Arg Ala Phe Leu

260 265 270

Ala Pro Met Leu Asp Gly Glu Tyr Pro Ala Asp Leu Leu Ala Asp Thr

275 280 285

Ala His Val Ser Asp Trp Ser Phe Val Arg Glu Gly Asp Leu Glu Thr

290 295 300

Val Arg Gln Pro Leu Ser Ile Leu Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Thr Val

305 310 315 320

Arg Val Arg His Phe Ser Gly Glu Gly Glu Arg Ser Glu Asn Asp Gly

325 330 335

His Gly Ala Ser Ser His Ser Pro Trp Ile Gly Val Asp Asp Val Glu

340 345 350

Phe Val Gln Gln Pro Gly Pro Tyr Thr Ala Met Gly Trp Asn Ile Glu

355 360 365

Pro Ala Gly Met Thr Glu Leu Leu Val Ser Val Ala Thr Thr Tyr Pro

370 375 380

His Gln Pro Met Met Val Thr Glu Asn Gly Ala Ala Phe Ala Asp Glu

385 390 395 400

Val Thr Val Asp Ala Asp Gly Thr Pro Arg Val His Asp Asp Arg Arg

405 410 415

Val Ala Tyr Leu His Asp His Val Asp Ala Val Gly Ala Ala Ile Asp

420 425 430

Ala Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Phe Ala Trp Ser Leu Leu Asp Asn

435 440 445

Phe Glu Trp Gly Tyr Gly Tyr Glu Arg Arg Phe Gly Ile Ile Arg Val

450 455 460

Asp Tyr Asp Thr Leu Glu Arg Thr Trp Lys Asp Ser Ala His Trp Tyr

465 470 475 480

Arg Arg Leu Ala Thr Ser Asn Ala Leu Pro Thr Val Asp Glu Thr Ala

485 490 495

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

Trp Ser His Pro Gln Phe Gln Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

Gln Gln Lys Leu Ile Ser Gln Gln Asp Leu

1 5 10

Claims (10)

1.一种酶，其特征在于，该酶为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列衍生的酶且衍生酶的活性不变；或由在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

2.编码权利要求1所述的酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的酶作为活性成分。

6.权利要求1所述的酶、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及权利要求5所述的组合物中的任意一项在降解糖苷类化合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述糖苷类化合物选自含有β-1,2-葡萄糖残基的化合物。

8.一种制备绞股蓝皂苷的方法，其特征在于，该方法包括：在酶解条件下，将含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应；所述酶由权利要求1所述的酶和/或权利要求5所述的组合物提供。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：以所述原料的总重量为基准，所述与含有糖苷类化合物的原料与酶接触进行酶解反应的酶的用量为10-20U/mg；所述酶解条件包括：酶解的温度为30-45℃，pH值为6-8，酶解的时间为20-60h。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述糖苷类化合物选自β-1,2-葡萄糖残基的化合物。