CN105255970A - 一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法 - Google Patents
一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105255970A CN105255970A CN201510658194.9A CN201510658194A CN105255970A CN 105255970 A CN105255970 A CN 105255970A CN 201510658194 A CN201510658194 A CN 201510658194A CN 105255970 A CN105255970 A CN 105255970A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- compoundk
- bgy1
- beta
- acid bacteria
- glucosidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，包括下列步骤：构建泡菜乳酸菌基因组Fosmid文库、筛选产β-葡萄糖苷酶阳性克隆子、分离转化成稀有皂苷compoundK糖苷酶基因、IPTG诱导过表达、研究重组酶Bgy1的特性、分析gypenosideXVII转化途径。在最适条件下，6h内可将1.0mgmL1gypenosideXVII与0.1mgmL1Bgy1生成0.58mgmL1compoundK，转化率为89%。本发明反应条件温和，时间短，对环境污染少，转化率高，可实现人参皂苷compoundK的工业化生产，满足医疗保健等行业对人参皂苷compoundK的需要。（图3）。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学研究领域，涉及一种制备稀有人参皂苷compoundK的方法，尤其涉及利用基因工程技术从泡菜乳酸菌中重组的一种全新的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法。
背景技术
人参皂苷compoundK是二醇型人参皂苷，在天然人参中并不存在，而是人参中其他原二醇型人参皂苷在人体肠道内的主要代谢产物，是人参在人体发挥作用的主要活性成分之一。它具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移、抑制肿瘤细胞侵袭、抗过敏、抗炎和抗老化等作用，因此，制备稀有人参皂苷compoundK是十分必要的。
目前，制备稀有人参皂苷compoundK常用的方法有：化学法、微生物转化法和酶转化法等。化学法专一性差，反应条件剧烈，糖苷键断裂彻底，水解产物处理复杂且更易带来环境污染问题，并且转化率低；微生物转化法反应周期长，高浓度人参皂苷对菌株有抑制作用，导致工业生产中人参皂苷的投料量不高，无法扩大生产；酶转化法的优点在于条件温和，利于产物的分离纯化，环境污染小和专一性强，但此方法存在一些缺点，成本较高、酶消耗量较大、转化速率达不到工业化要求等。因此，为获得更多人参皂苷转化糖苷酶，选择分子生物技术，将人参皂苷转化酶基因转入大肠杆菌中，获得更加大量表达的糖苷酶。
发明内容
本发明的目的提供一种制备人参皂苷compoundK的方法，从朝鲜族传统发酵食品——泡菜乳酸菌中分离转化稀有皂苷compoundK糖苷酶基因，利用基因工程技术重组一种全新的β-葡萄糖苷酶，生物转化gypenosideXVII制备稀有人参皂苷compoundK的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，包括下列步骤：
①构建泡菜乳酸菌基因组Fosmid文库；
②筛选产β-葡萄糖苷酶阳性克隆子；
③分离转化成稀有皂苷compoundK糖苷酶基因；
④PCR扩增推测的糖苷酶基因bgy1，纯化和限制性内切酶处理，与表达载体pMAL-c5X连接，转入到大肠杆菌后，经IPTG诱导过表达；
⑤研究重组酶Bgy1的特性；
⑥分析gypenosideXVII转化途径，与重组酶Bgy1反应生成稀有人参皂苷compoundK。
进一步地，所述的糖苷酶基因是从朝鲜族传统发酵食品泡菜乳酸菌中分离转化稀有皂苷compoundK糖苷酶基因bgy1。
进一步地，所述的IPTG诱导过表达：在37℃条件下，重组酶Bgy1在含有氨苄的LB液体培养基中培养，当菌密度（OD600）达到0.6时，加入浓度为0.2mMIPTG进行诱导，并在20℃条件下培养10h，使其在大肠杆菌BL21中过度表达。
进一步地，研究重组酶Bgy1的特性过程中，重组酶Bgy1的适宜温度在20℃~40℃之间，对酶的活性无明显影响，当温度高于40℃，酶的活性明显下降，当温度达到60℃时，酶完全失活。其中最适宜温度在30℃。pH为6.0，金属离子(Na+、K+、Mn2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+)对酶的活性无明显抑制作用。
进一步地，所述的分析gypenosideXVII转化途径过程中，来自绞股蓝中的GypenosideXVII为转化底物。
进一步地，所述的分析gypenosideXVII转化途径过程中，转化途径：gypenosideXVII→gypenosideLXXV→compoundK。
进一步地，所述的分析gypenosideXVII转化途径过程中，1.0mgmL?1gypenosideXVII与0.1mgmL?1Bgy1在30℃、pH6.0条件下，6h内反应生成0.58mgmL?1compoundK，转化率为89%。
本发明从泡菜乳酸菌中筛选β-葡萄糖苷酶的基因，利用基因工程技术对其进行重组，得到重组的β-葡萄糖苷酶，生物转化来自绞股蓝中gypenosideXVII从而实现稀有人参皂苷compoundK的制备。本方法反应条件温和，时间短，对环境污染少，转化率高，可实现人参皂苷compoundK的工业化生产，满足医疗保健等行业对人参皂苷compoundK的需要。
附图说明
图1是bgy1的基因序列。
图2是gypenosideXVII转化的LC-MS检测结果，
其中，A是人参皂苷标准品，
B是重组酶Bgy1与gypenosideXVII反应0h，
C是重组酶Bgy1与gypenosideXVII反应2h，
D是重组酶Bgy1与gypenosideXVII反应6h；
1是人参皂苷Rb1，2是人参皂苷Rd，
3是gypenosideXVII，4是人参皂gypenosideLXXV。
图3是gypenosideXVII转化的途径，
其中，a是gypenosideXVII，
b是gypenosideLXXV，
c是compoundK。
图4是研究重组酶Bgy1的特性PH选择反应。
图5是研究重组酶Bgy1的特性温度选择反应。
图6是研究重组酶Bgy1的热稳定性选择反应。
图7是研究重组酶Bgy1的特性金属离子对酶作用反应。
具体实施方式：
一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，包括下列步骤：
①构建泡菜乳酸菌基因组Fosmid文库：从从朝鲜族传统发酵食品泡菜乳酸菌中提取总DNA，脉冲场凝胶电泳分离基因组DNA，切割40kb左右的DNA片段，经电洗脱后利用透析膜浓缩。浓缩后的DNA经末端修复后连接至载体pCC1FOSTM，利用包装蛋白包装成噬菌体微粒后转染至宿主菌EPI300-T1R。
②筛选产β-葡萄糖苷酶阳性克隆子：感染噬菌体的宿主菌EPI300-T1R涂布到含有氯霉素和X-Glu的LB平板培养基，被蓝色包围的区域即产β-葡萄糖苷酶阳性克隆子。
③分离转化成稀有皂苷compoundK糖苷酶基因：挑取筛选的阳性克隆经诱导及液体培养后，和原人参二醇皂苷反应，通过TLC分析筛选转化人参皂苷的阳性克隆子。提取质粒后，使用载体pCC1FOS上自带的M13引物序列进行双末端测序，并进一步设计引物进行步移，直至序列测通。使用开放阅读框在线预测软件ORFfinder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html?)和BLASTP程序检索预测蛋白的同源序列（www.ncbi.nlm.nih.gov/），推测糖苷酶基因（bgy1）。
④PCR扩增推测的糖苷酶基因bgy1，纯化和限制性内切酶处理，与表达载体pMAL-c5X连接，转入到大肠杆菌后，IPTG诱导过表达。IPTG诱导过表达：在37℃条件下，重组酶Bgy1在含有氨苄的LB液体培养基中培养，当菌密度（OD600）达到0.6时，加入浓度为0.2mMIPTG进行诱导，并在20℃条件下培养10h，使其在大肠杆菌BL21中过度表达。
⑤研究重组酶Bgy1的特性：
a．最适pH：将适当稀释10倍纯化的酶液0.1mL与0.1mL10mMpH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷在30℃反应30min；
b．最适温度：将适当稀释10倍纯化的酶液0.1mL与0.1mL对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM、pH6.0）分别在20、30、40、50、60℃环境下反应30min；
c．热稳定性：将适当稀释10倍纯化的酶液分别在20、30、40、50、60℃环境下保温30min，取0.1mL与0.1mL对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM、pH6.0）混合，于30℃环境下反应30min；
d．金属离子：纯化酶液用含10mM的NaCl,KCl,CaCO3,MnSO4，Fe2(SO4)3和MgSO4稀释10倍，以不加金属离子的缓冲液为空白对照。取0.1mL与0.1mL对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM、pH6.0）在30℃反应10min；
以上试验研究得出的结论是：重组酶Bgy1的适宜温度在20℃~40℃之间，对酶的活性无明显影响，当温度高于40℃，酶的活性明显下降，当温度达到60℃时，酶完全失活。其中最适宜温度在30℃。pH为6.0，金属离子Na+、K+、Mn2+、Fe3+、Ca2+、Mg2+对酶的活性无明显抑制作用。
⑥分析gypenosideXVII转化途径：来自绞股蓝中的gypenosideXVII为转化底物；1.0mgmL?1gypenosideXVII与0.1mgmL?1Bgy1在温度为30℃、pH为6.0的条件下分别反应1h、2h、3h、4h、5h、6h，用LC-MS分析其转化途径。gypenosideXVII转化到compoundK有以下途径：gypenosideXVII→F2→compoundK；gypenosideXVII→gypenosideLXXV→compoundK。但由于中间产物的保留时间与人参皂苷F2的保留时间不同，所以中间产物为gypenosideLXXV（图2）。其中的6h内反应生成0.58mgmL?1compoundK，转化率为89%。
Claims (8)
1.一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，包括下列步骤：
①构建泡菜乳酸菌基因组Fosmid文库；
②筛选产β-葡萄糖苷酶阳性克隆子；
③分离转化成稀有皂苷compoundK糖苷酶基因；
④PCR扩增推测的糖苷酶基因bgy1，纯化和限制性内切酶处理，与表达载体pMAL-c5X连接，转入到大肠杆菌后，经IPTG诱导过表达；
⑤研究重组酶Bgy1的特性；
⑥分析gypenosideXVII转化途径，与重组酶Bgy1反应生成稀有人参皂苷compoundK。
2.根据权利要求1所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于所述的糖苷酶基因bgy1是从朝鲜族传统发酵食品泡菜乳酸菌中分离转化稀有皂苷compoundK糖苷酶基因bgy1。
3.根据权利要求1所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于所述的IPTG诱导过表达：在37℃条件下，重组酶Bgy1在含有氨苄的LB液体培养基中培养，当菌密度（OD600）达到0.6时，加入浓度为0.2mMIPTG进行诱导，并在20℃条件下培养10h，使其在大肠杆菌BL21中过度表达。
4.根据权利要求1所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于研究重组酶Bgy1的特性过程中，重组酶Bgy1的适宜温度在20℃~40℃之间，pH为6.0。
5.根据权利要求1所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于所述的分析gypenosideXVII转化途径过程中，来自绞股蓝中的gypenosideXVII为转化底物。
6.根据权利要求1所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于所述的分析GypenosideXVII转化途径过程中，转化途径：gypenosideXVII→gypenosideLXXV→compoundK。
7.根据权利要求1所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于所述的分析gypenosideXVII转化途径过程中，1.0mgmL?1gypenosideXVII与0.1mgmL?1Bgy1在30℃、pH6.0条件下，6h内反应生成0.58mgmL?1compoundK，转化率为89%。
8.根据权利要求4所述的一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compoundK的方法，其特征在于研究重组酶Bgy1的特性过程中，重组酶Bgy1的适宜温度30℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510658194.9A CN105255970A (zh) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | 一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510658194.9A CN105255970A (zh) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | 一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105255970A true CN105255970A (zh) | 2016-01-20 |
Family
ID=55095897
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510658194.9A Pending CN105255970A (zh) | 2015-10-14 | 2015-10-14 | 一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105255970A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106367371A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-01 | 中南民族大学 | 一株产重楼皂苷I的阴沟肠杆菌clx‑14菌株及其用途 |
| CN106520891A (zh) * | 2016-10-27 | 2017-03-22 | 辽宁中医药大学 | 一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷‑Rb1制备人参皂苷‑Rd的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1570133A (zh) * | 2004-04-27 | 2005-01-26 | 复旦大学 | 一种制备人参皂甙Compound－K的方法 |
| CN102782125A (zh) * | 2009-10-23 | 2012-11-14 | 韩国生命工学研究院 | 源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶及其用途 |
| CN104480127A (zh) * | 2014-12-14 | 2015-04-01 | 长春中医药大学 | 超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷ck制备中的应用 |
-
2015
- 2015-10-14 CN CN201510658194.9A patent/CN105255970A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1570133A (zh) * | 2004-04-27 | 2005-01-26 | 复旦大学 | 一种制备人参皂甙Compound－K的方法 |
| CN102782125A (zh) * | 2009-10-23 | 2012-11-14 | 韩国生命工学研究院 | 源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶及其用途 |
| CN104480127A (zh) * | 2014-12-14 | 2015-04-01 | 长春中医药大学 | 超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷ck制备中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DONG-SHAN AN: "Identification and Characterization of a Novel Terrabacter ginsenosidimutans sp. nov.β-Glucosidase That Transforms Ginsenoside Rb1 into the Rare Gypenosides XVII and LXXV", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| HONG SHEN: "Biotransformation of ginsenoside Rb1 via the gypenoside pathway by human gut bacteria", 《CHINESE MEDICINE》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106367371A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-01 | 中南民族大学 | 一株产重楼皂苷I的阴沟肠杆菌clx‑14菌株及其用途 |
| CN106520891A (zh) * | 2016-10-27 | 2017-03-22 | 辽宁中医药大学 | 一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷‑Rb1制备人参皂苷‑Rd的方法 |
| CN106520891B (zh) * | 2016-10-27 | 2019-06-04 | 辽宁中医药大学 | 一种共价交联法固定纤维素酶酶解人参皂苷-Rb1制备人参皂苷-Rd的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106190937B (zh) | 一种构建重组大肠杆菌生物合成2"-岩藻乳糖的方法 | |
| CN104059872B (zh) | 高产n-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN107267578A (zh) | 微生物发酵生产n‑乙酰‑d‑氨基葡萄糖和/或d‑氨基葡萄糖盐的方法 | |
| CN108060114B (zh) | 一种发酵生产l-丙氨酸的大肠杆菌及其应用 | |
| CN107916283B (zh) | 一种烟酰胺的生产工艺 | |
| CN103937734B (zh) | 一种生产透明质酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN107099545A (zh) | 一种褐藻胶裂解酶基因及其应用 | |
| WO2023011576A1 (zh) | 一种高产乳酰-n-四糖的微生物的构建方法及应用 | |
| CN108753808A (zh) | 一种重组表达载体、重组表达宿主及其用于合成腺苷三磷酸的方法 | |
| CN103881995A (zh) | 一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶 | |
| CN104726478A (zh) | 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN105255970A (zh) | 一种来自乳酸菌重组的β-葡萄糖苷酶制备稀有人参皂苷compound K的方法 | |
| CN105886573B (zh) | 一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法 | |
| CN105695551B (zh) | 一种制备去氢表雄酮的生物方法 | |
| CN105385700A (zh) | 一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN102690795B (zh) | 一种灰产色链霉菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用 | |
| CN104673734B (zh) | 用于生产β-丙氨酸的工程菌及生产β-丙氨酸的方法 | |
| CN103160483B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用 | |
| CN104130967A (zh) | 一株共表达l-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN109576239A (zh) | 耐热磷酸化酶及其应用 | |
| CN104805144A (zh) | 一种高效生产l-瓜氨酸的方法 | |
| CN105255844A (zh) | 一种利用高温破壁制备重组酶的方法 | |
| CN101985614A (zh) | 一种快速制备重组耐热锰超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN112920984A (zh) | 一种构建基于甲酸和co2生长的重组菌株的方法与应用 | |
| CN103589756B (zh) | 利用l-乳酸生物合成s-1,2-丙二醇的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |