KR20230095539A - 패니바실러스 무실라지노서스 유래 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 배당체를 효과적으로 분해하여 효율적인 생물 전환을 일으킬 수 있는 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) 유래 신규한 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도에 관한 것이다.
본원 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 배당체를 효과적으로 분해할 수 있으며, 수크로오스, 말토오스와 같은 다양한 탄소원을 지닌 인삼 같은 작물에서 효율적인 생물전환을 일으킬 수 있는 우수한 효과를 나타낸다. 이에 따라, 공정이 매우 간단하며 제조 효율이 매우 뛰어나 산업적인 용도로 대량 생산이 가능한 신규의 효소 및 이의 용도를 제공하는 점에 우수한 효과를 가진다.

Description

패니바실러스 무실라지노서스 유래 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도 {Endo-1,4-beta glucosidase derived from Paenibacillus mucilaginosus, and use thereof}

본원 발명은 배당체를 효과적으로 분해하여 효율적인 생물 전환을 일으킬 수 있는 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) 유래 신규한 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계(Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(sugar moieties)의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 180여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 예를 들어 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), F2, 화합물 Y(Compound Y), 화합물 Mc(Compound Mc), Rg3, Rh2, C-K가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1, F1 등이 포함된다.

또한, 건삼에서의 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 각 화합물들의 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮은 문제점이 있다. 이에 따라, 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 F2, Rg3, Rk1, Rg5, Rh1, Rh2, Rk2, Rh3, 지페노사이드(gypenoside, Gyp) XVII, 지페노사이드 LXXV 및 화합물 K, Mc, Mc1(compound K, Mc, Mc1) 등의 마이너 진세노사이드로 전환시키기 위한 연구 개발이 진행되고 있다. 예를 들어, 위와 같은 전환을 위해 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc 및 Rd 등의 메이저 진세노사이드에서 당을 구성하는 글루코스, 아라비노스, 람노스, 자일로스 등을 제거(deglycosylated)하는 전환 과정에 대한 연구가 진행되고 있으나, 일반적으로 이러한 전환 과정에서 손실이 상당히 크게 발생되며 목적하는 마이너 진세노사이드를 얻었을시에 이의 순도가 매우 낮은 문제점이 있다.

또한, 현재 농산 및 임산 폐자원으로부터 단당류를 회수하기 위해서는 대부분의 경우 황산을 첨가하여 고온에서 가압 및 분해 방법을 사용하고 있다. 이 경우 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산 장비가 필요하며, 분해산물도 각종 부반응으로 인해 다양하므로 분리 공정이 어렵고, 폐기물 처리 등의 비용으로 인해 생산단가가 높으며 환경 비친화적이라는 문제점을 안고 있다.

이러한 배경 하에, 효율적인 생물전환을 통하여 마이너한 진세노사이드를 다량 얻거나 또는 효과적으로 배당체나 기타의 당류를 분류 및 분해할 수 있는 신규의 소재 및 이를 이용한 방법에 대해 많은 연구 개발이 요구되는 상황이다.

대한민국 등록특허 제10-0759772호 대한민국 등록특허 제10-0329259호 대한민국 등록특허 제10-0688425호

구체적으로, 본원 발명의 목적은 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus)로부터 유래된 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 이를 코딩하는 핵산, 이를 포함하는 벡터와 이러한 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 상기 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 이용하여 배당체를 생물 전환하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 이용하여 이당류를 분해하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 포함하는 배당체의 생물 전환용 조성물을 제공한다.

본원 발명자들은 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus)로부터 유래될 수 있는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 배당체 등에 처리하는 경우 우수한 생물전환능을 나타냄을 확인하고 본원 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 대량 생산 공정에서의 처리에도 우수한 효과를 나타낼 수 있다는 점에서 장점을 가진다.

본원 발명에서 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈란 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소를 의미한다. 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈의 활성 정도 및 기능은 효소 종류마다 차이가 있다. 구체적으로, 본원 발명에 따르는 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus)로부터 유래될 수 있는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 베타-글루코시다제로써 우수한 특징을 가진다.

본원 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 배당체의 생물 전환 활성이 우수한 효소이다. 본원 발명에 있어서, 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) 로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) KNP414로부터 유래된 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈일 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈일 수 있다. 상기 서열번호 2 의 아미노산 서열을 가지는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 뿐만 아니라 상기 서열과 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 본원 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈의 활성과 동일활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본원 발명의 범위 내에 포함된다.

상기 서열번호 2로 표시되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 배당체, 예를 들어 조사포닌을 생물 전환하는데 현저한 효과를 가진다. 배당체의 전환 후 추가로 더 진행되는 반응 진행 없이 목적하는 주요 성분을 높은 농도로 대량 생산할 수 있어 높은 효율을 나타낼 뿐만 아니라 정제 등을 위한 추가 공정을 거칠 필요도 없다는 점에서 우수한 효과를 나타낸다.

본원 발명에서 벡터는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물, 바람직하게 본원 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈가 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물, 예를 들어 재조합 벡터를 말한다. 본원 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈의 염기 서열은 바람직하게 서열번호 1의 염기 서열을 가진다.

본원 발명의 일실시예에 따르면, 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) KNP414로부터 codon optimization를 수행하여 확보한 서열번호 1의 염기서열을 가지는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 플라스미드 벡터 pBT7 vector에 삽입하여, 재조합 발현 벡터 pBT-N-His_bglB를 제조하였다.

이에 따라, 본 발명은 상기 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다

이에 본 발명은 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus) 로부터 유래된 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 보다 구체적으로, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 이러한 재조합 벡터는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 제공할 수 있게 한다.

용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질 전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)”및 벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pBT7, pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 대장균에서 단백질 베타-글루코시다아제 유전자를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다.

바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

발현 벡터에는 pBT7, pBluescript, pGEX2T, pUC, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli, Bacillus subtilis 등에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다

본원 발명에서 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 본원 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 상기의 방법으로 형질전환된 본원 발명의 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 배당체의 생물전환 전환 측면에서 우수한 활성을 지닌다.

본원 발명에서 숙주는 본원 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본원 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다. 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)이다.

본원 발명에서 배양물은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 이 산물은 배양된 미생물을 수거하여 이를 파쇄한 후 파쇄물로부터 분리되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈일 수 있다. 상기 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 배당체를 생물전환시키는데 우수한 활성을 나타낸다.

배당체란 단당이 고리 모양의 헤미아세탈 구조를 취하고 그 히드록실기가 다른 알코올 혹은 페놀성 화합물의 히드록실기 사이에서 물을 상실하고 축합하여 생긴 화합물. 히드록실기를 갖는 천연물이 당과 이 형태의 글리코시드 결합을 이루어 배당체 형태로 존재하는 것이 많다. 단당의 2분자 이상이 글리코시드 결합한 것이 이당 기타 다당이며, 다당이 다시 다른 비당성분과 글리코시드 결합하여 천연으로 배당체로 존재하고 있는 것이 많다.

예를 들어, 배당체의 생물 전환의 일 예시는 인삼으로부터의 생물 전환 공정을 들 수 있다. 이러한 생물 전환 공정에 사용될 수 있는 배당체의 일예시는 인삼 조사포닌이다. 인삼 조사포닌(crude saponin)은 성분별로 나뉘기 전의 미정제 상태의 사포닌을 말하는 것으로 일반적으로 인삼시료를 에탄올 등의 용매로 추출하거나 다공성 수지를 이용하여 고농도로 Rb1, Rb2, Rc 또는 Rd 등을 포함하게 한 것을 말한다. 이러한 조사포닌은 고려인삼, 화기삼, 죽절삼을 포함한 여타인삼의 잎 및 뿌리로부터 주정을 사용하여 추출하는 방법으로 얻을 수 있다. 조사포닌은 예를 들어 0.1 내지 2% (w/v)의 phosphate 버퍼 0.1M에 용해하여 사용가능하다.

엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 생물전환에 사용할 수 있다. 보다 바람직하게 배양된 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus)을 수거하여 이를 파쇄한 후 파쇄물로부터 분리되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 모아서 사용할 수 있으며, 1 U 내지 100 U로 사용하는 것이 바람직하다. 배양 pH는 6.0 내지 8.0, 보다 바람직하게는 6.5 내지 7.5에서 배양될 수 있다. 배양온도는 28 내지 40 ℃ 바람직하게 30 내지 37℃이다. 배양 시간은 12 내지 72 시간이며, 보다 바람직하게 24 내지 48 시간이다.

상기 반응 후 통상적으로 알려진 추가의 정제 공정 (예컨대, 침전, 다시 녹임, 컬럼 크로마토그래피 등)을 통해 원하는 물질의 순도를 높힐 수 있다.

본원 발명은 (a) 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 배당체와 혼합하여 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액으로부터 생물 전환을 통해 배당체를 생물 전환하는 단계;를 포함하는 배당체를 생물 전환하는 방법을 제공한다.

본원 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 배당체의 생물 전환용 조성물을 제공한다.

또한, 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 이용하여 이당류를 분해하는 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이당류와 혼합하여 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액으로부터 생물 전환을 통해 이당류를 분해하는 단계;를 포함하는 이당류의 분해방법을 제공한다.

본 발명에서 베타-글루코시다아제가 기질로 사용하는 이당류로는 4-nitophenyl β-D-glucophyranoside, 4-Methylumbelliferyl β-D-glucopyranoside β-glucosidase substraTE, Indoxyl β-D-glucoside, Fluorescein Di-β-D-Glucopyranoside (FDGlu), PFB-FDGlu (5-(Pentafluorobenzoylamino)Fluorescein Di-β-DGlucopyranoside) 등을 들 수 있다. 이외에도, 라미나린, 라미나리바이오스, 셀로바이오스, 젠티오바이오스, 락토오스 또는 아가로바이오스 등을 사용할 수도 있다.

본원 발명에 따른 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 배당체를 효과적으로 분해할 수 있으며, 수크로오스, 말토오스와 같은 다양한 탄소원을 지닌 인삼 같은 작물에서 효율적인 생물전환을 일으킬 수 있는 우수한 효과를 나타낸다. 이에 따라, 공정이 매우 간단하며 제조 효율이 매우 뛰어나 산업적인 용도로 대량 생산이 가능한 신규의 효소 및 이의 용도를 제공하는 점에 우수한 효과를 가진다.

도 1은 pBT-N-His와 pBT-N-His-bglB에 EcoRI를 처리한 결과로서 bglB(엔도-1,4-베타 글루코시데이즈)를 포함하는 재조합 벡터를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 형질전환체에서 bglB의 발현을 확인하기 위한 PCR 수행 조건을 나타내는 결과이다.
도 3은 bglB가 삽인된 형질전환체에서 bglB가 발현되는 것을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본원 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본원 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본원 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 재조합 발현벡터 및 형질전환체의 제조

Paenibacillus mucilaginosus 유래의 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 코딩하는 재조합 발현벡터를 제작하였다.

(1) 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 DNA 합성

Paenibacillus mucilaginosus 유래의 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 서열(서열번호 1)을 이용하여 IDT에 DNA 합성을 의뢰하여 재조합 발현 벡터 제작에 사용할 DNA를 합성하였다.

합성한 DNA를 pBT7-N-His 벡터에 클로닝하여 pBT-N-His_bglB를 제작하였다.

wild type인 pBT-N-His가 삽입된 대장균 DH5알파를 준비하였다. LBA(amp. final conc. 50ug/ml)에서 해당 대장균을 37도 24시간 배양 후에 해당 벡터를 추출하였다.

추출한 DNA를 EcoRI처리하고 0.7% 아가로즈젤에 전기영동 후 gel extraction을 진행하여 pBT-N-His를 확보하였다.

확보한 pBT-N-His에 합성한 DNA를 ligation하여 pBT-N-His_BglB 벡터를 제작하였다. 제조가 완료된 재조합 벡터를 EcoRI를 처리하여 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 목적하는 서열의 삽입이 이루어졌음을 알 수 있었다.

(2) 재조합 발현벡터의 형질전환

제작한 재조합 발현벡터를 Bacillus subtilis에 형질전환하여 형질전환체를 제작하였다.

재조합 발현벡터의 DNA를 염기서열 분석을 통해 정상적인 클로닝이 이루어졌는지를 확인하고 Bacillus subtilis내로 형질전환 시켰다. 이를 위해 형질전환 시키기 위해 10의 재조합 DNA를 제한효소 EcoRI을 처리하여 linear DNA 형태로 만든 뒤 전기충격 (electrophoration) 방법으로 형질전환 한 뒤 형질전환된 세포를 100 ug/ml 의 ampicillin이 포함된 LBA 배지에 도말하여 30도에서 2-3일 배양한 뒤 나타나는 형질전환체를 선별하였다.

(3) 형질전환체에서 bglB의 발현 확인

pBT-N-His_BglB가 삽입된 바실러스 서브틸리스에서 bglB가 발현하는지 여부를 확인하는 실험을 진행하였다. Promega Cat. Z6011 RNA추출 키트를 사용하여 형질전환체에서 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 사용하여 cDNA를 합성을 진행하였다. 합성한 cDNA를 이용하여 PCR를 수행하였다.

구체적인 RT-PCR 조건은 도 2에 구체적으로 기재한 바와 같다.

위 조건 하에서 RT PCR을 수행하고 이의 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 재조합 벡터 삽입이 이루어진 형질전환체 (Recombinant- b.subtilis)에서 bglB가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 형질전환체가 잘 제조되었음을 확인하였다.

실시예 2. 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈의 대량 생산

형질전환체들로부터 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 대량 생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 배지 100 ㎖가 들어있는 삼각플라스크에 접종하여 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 200 rpm으로 종균 배양을 실시하였다. 가용성 단백질의 발현여부를 여러 온도(18, 22, 25, 30 및 37℃)에 따라 확인하기 위하여 여기에 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactoside)를 최종 0.1 mM 농도가 되도록 첨가하여 위 각 균주로부터 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈의 대량 발현을 유도하였다.

균주가 정체기(stationary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 6,000xg로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 100mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가하여 현탁한 후, 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg로 4℃에서 15분 동안 원심분리한 다음, 수용성인 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 배당체 등의 생물 전환에 사용될 수 있는 상등액으로부터 획득하였다.

분리정제된 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 SDS-PAGE로 분석하였다.

상기 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 아미노산 개수가 757개이며, 이의 아미노산 서열을 서열번호 2로 표시하였다.

실시예 3. 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈의 생물 전환능 확인

고려인삼의 잎 및 뿌리를 20 배 체적의 알코올 함량 70%(v/v)의 주정으로 상온에서 1-2시간 동안 2회 이상 반복하여 추출하고 건조하여 추출물을 수득하였다. 이 추출물을 물에 다시 용해시켜서 HP-20 수지에 흡착시킨 후, 물로 세정하여 당을 제거하고 알코올 함량 40%(v/v)의 주정으로 1차 세정하여 protopanaxatriol (PPT) 계열인 진세노사이드 Re와 Rg1을 우선적으로 제거한 후, 알코올 함량 80%(v/v)의 주정으로 세정하여 protopanaxadiol (PPD) 계열인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd가 용출되어 나온 것을 획득하여 건조하여, 조사포닌 추출물을 제조하였다.

상기 제조한 조사포닌을 50 mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v)에 용해한 후, 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 0.2U을 첨가하여 pH 7.0 및 37℃ 조건 하에서 24 시간동안 배양하였다.

<110> Chromach.co.,Ltd <120> Endo-1,4-beta glucosidase derived from Paenibacillus mucilaginosus, and use thereof <130> 1 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2274 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Paenibacillus mucilaginosus KNP414, bglB <400> 1 atgcagcgtg atatacagga attgatctcg cagatgacac tcgaagagaa ggcgggaatg 60 tgctcgggcc tcgacttctg gcacctgaag ggcgtggagc gcctcggcat tccgtcggtg 120 atggtgaccg acgggccgca cggactccgg aagcagaagg cttccgccga tcacctcggc 180 ctgttcgaca gcgtgccggc cacctgcttc ccgtcggcgg ccggactggc ttgctcgtgg 240 gaccgggagc tgatccgccg ggtgggcgtc gcccttggcg aggagtgcca ggctgagaac 300 gtcgctgttc tgctggggcc aggggcgaat attaagcgct cgccgctgtg cggacgcaat 360 ttcgaatatt tctcggagga tccgtatctg tcctccgaga tggcggccag ccacattgcg 420 ggcgtgcaga gccagggtgt cgggacgtcg ttgaagcact ttgccgtgaa taaccaggag 480 caccggcgca tgtcggtgga tgccgtggtc gacgagcgga cgctgcgcga gatctacctc 540 gcctccttcg aaggggcggt gaagcagtcg cagccgtgga ccgtgatgag ctcgtacaac 600 cgggtgaacg gcacgtatgc ctccgagaac gagtttctgc tgacggatat tctcaagaac 660 gagtggggcc atgaaggctt cgtcgtgtcc gactgggggg cggtcgatga gcgggcggat 720 gcgctggcag cgggcctgga gctggagatg ccggcgtcgg gcggtgtcgg ggagcgcaag 780 gtggttgagg ccgtgcagag cggccggctg tccatggaag cgctggaccg ggccgtggag 840 cggctgctga ccatcatttt ccgggctgtg gatcaccgga agcccggtgc ggcctacgat 900 ccggcggagc atcaccgtct cgccagagag gtggcgcggg agagcatggt gctcctcaag 960 aacgagcgca gcctgctgcc gctgagcaag ggcagccatc tcgccgtgat cggggcgttc 1020 gccgacaagc cgcgatacca gggcggaggc agctcgcata tcgtcccgac gcagctcgac 1080 cagccggtgg aagagatccg gaagctggcg gacgcttcgg ccgtggtgac gtatgcgcag 1140 ggctaccggc tcgagagcga tatggcggat gaagcgctga cggaggaggc gaagcgggcg 1200 gcgtcggcgg ccgacacggc cgtgatcttc gccgggctgc ccgaccgcta cgagtcggaa 1260 ggctacgacc ggacgcacct gagcctgccg gccaaccaga tccggctcat cgaagaggtg 1320 gccgccgtgc agccgaaggt cgtggtcgtc ctgctgaacg gctcgccggt ggagatgccc 1380 tggatcggca gcgcccaagc cgtgctggaa ggctacctcg gcgggcaggc ggtcggcggc 1440 gcggtggcgg atcttctcta cggtgaagcg aatccgtgcg gcaagcttgc cgagacgttc 1500 ccggagcagc tgagcgacaa cccatcgtat ctgttcttcc caggcgaagg cgaccgggtg 1560 gagtaccggg aggggatctt cgtgggctac cggtactacg acacgaagaa cgtgaagccg 1620 ctgttcccgt tcggctacgg actcagctat acgacgttcg agtacacgag tctgaccctc 1680 gacaagaagc gaattcagga taccgagtcg gttaccgtcc gggtgacggt gaagaacacc 1740 ggcgcggcag ccggcaagga gattgtgcag ctgtacgtga aggatgcgga gagcaccgtc 1800 atccggccgg ccaaggagct gaagggcttt gccaaggtgt tcctgcagcc gggagaagag 1860 cggacggtct cgttcgtgct cgacaagcgt gcttttgcct actacaacgt ggacttgaag 1920 gactggcacg tggagaccgg cgagttccac atcctggcgg gatcttcttc gcagcacatc 1980 gtcctgcagg attccgtggt tgtagagtcg acggccgcgc tcagaaagac ctatacccgc 2040 aatacgacgc tcggcgatct gcttcaggat gcggccgcgc gggagaaggc gcagggactg 2100 ctgcaggcgt tccaggaagc aagcggcttc gcggccggac cggaggatga ccatgcggac 2160 atgatggcgg ctatgatgaa gtatatgccg ctgcgtgcgc ttgtcggctt cagtcaaggg 2220 gccttgacgg aacagacgct cgaggatttg ctgaaggaac tgaaccacaa ctag 2274 <210> 2 <211> 757 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Paenibacillus mucilaginosus KNP414, bglB <400> 2 Met Gln Arg Asp Ile Gln Glu Leu Ile Ser Gln Met Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Ala Gly Met Cys Ser Gly Leu Asp Phe Trp His Leu Lys Gly Val 20 25 30 Glu Arg Leu Gly Ile Pro Ser Val Met Val Thr Asp Gly Pro His Gly 35 40 45 Leu Arg Lys Gln Lys Ala Ser Ala Asp His Leu Gly Leu Phe Asp Ser 50 55 60 Val Pro Ala Thr Cys Phe Pro Ser Ala Ala Gly Leu Ala Cys Ser Trp 65 70 75 80 Asp Arg Glu Leu Ile Arg Arg Val Gly Val Ala Leu Gly Glu Glu Cys 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Val Ala Val Leu Leu Gly Pro Gly Ala Asn Ile Lys 100 105 110 Arg Ser Pro Leu Cys Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Phe Ser Glu Asp Pro 115 120 125 Tyr Leu Ser Ser Glu Met Ala Ala Ser His Ile Ala Gly Val Gln Ser 130 135 140 Gln Gly Val Gly Thr Ser Leu Lys His Phe Ala Val Asn Asn Gln Glu 145 150 155 160 His Arg Arg Met Ser Val Asp Ala Val Val Asp Glu Arg Thr Leu Arg 165 170 175 Glu Ile Tyr Leu Ala Ser Phe Glu Gly Ala Val Lys Gln Ser Gln Pro 180 185 190 Trp Thr Val Met Ser Ser Tyr Asn Arg Val Asn Gly Thr Tyr Ala Ser 195 200 205 Glu Asn Glu Phe Leu Leu Thr Asp Ile Leu Lys Asn Glu Trp Gly His 210 215 220 Glu Gly Phe Val Val Ser Asp Trp Gly Ala Val Asp Glu Arg Ala Asp 225 230 235 240 Ala Leu Ala Ala Gly Leu Glu Leu Glu Met Pro Ala Ser Gly Gly Val 245 250 255 Gly Glu Arg Lys Val Val Glu Ala Val Gln Ser Gly Arg Leu Ser Met 260 265 270 Glu Ala Leu Asp Arg Ala Val Glu Arg Leu Leu Thr Ile Ile Phe Arg 275 280 285 Ala Val Asp His Arg Lys Pro Gly Ala Ala Tyr Asp Pro Ala Glu His 290 295 300 His Arg Leu Ala Arg Glu Val Ala Arg Glu Ser Met Val Leu Leu Lys 305 310 315 320 Asn Glu Arg Ser Leu Leu Pro Leu Ser Lys Gly Ser His Leu Ala Val 325 330 335 Ile Gly Ala Phe Ala Asp Lys Pro Arg Tyr Gln Gly Gly Gly Ser Ser 340 345 350 His Ile Val Pro Thr Gln Leu Asp Gln Pro Val Glu Glu Ile Arg Lys 355 360 365 Leu Ala Asp Ala Ser Ala Val Val Thr Tyr Ala Gln Gly Tyr Arg Leu 370 375 380 Glu Ser Asp Met Ala Asp Glu Ala Leu Thr Glu Glu Ala Lys Arg Ala 385 390 395 400 Ala Ser Ala Ala Asp Thr Ala Val Ile Phe Ala Gly Leu Pro Asp Arg 405 410 415 Tyr Glu Ser Glu Gly Tyr Asp Arg Thr His Leu Ser Leu Pro Ala Asn 420 425 430 Gln Ile Arg Leu Ile Glu Glu Val Ala Ala Val Gln Pro Lys Val Val 435 440 445 Val Val Leu Leu Asn Gly Ser Pro Val Glu Met Pro Trp Ile Gly Ser 450 455 460 Ala Gln Ala Val Leu Glu Gly Tyr Leu Gly Gly Gln Ala Val Gly Gly 465 470 475 480 Ala Val Ala Asp Leu Leu Tyr Gly Glu Ala Asn Pro Cys Gly Lys Leu 485 490 495 Ala Glu Thr Phe Pro Glu Gln Leu Ser Asp Asn Pro Ser Tyr Leu Phe 500 505 510 Phe Pro Gly Glu Gly Asp Arg Val Glu Tyr Arg Glu Gly Ile Phe Val 515 520 525 Gly Tyr Arg Tyr Tyr Asp Thr Lys Asn Val Lys Pro Leu Phe Pro Phe 530 535 540 Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Leu 545 550 555 560 Asp Lys Lys Arg Ile Gln Asp Thr Glu Ser Val Thr Val Arg Val Thr 565 570 575 Val Lys Asn Thr Gly Ala Ala Ala Gly Lys Glu Ile Val Gln Leu Tyr 580 585 590 Val Lys Asp Ala Glu Ser Thr Val Ile Arg Pro Ala Lys Glu Leu Lys 595 600 605 Gly Phe Ala Lys Val Phe Leu Gln Pro Gly Glu Glu Arg Thr Val Ser 610 615 620 Phe Val Leu Asp Lys Arg Ala Phe Ala Tyr Tyr Asn Val Asp Leu Lys 625 630 635 640 Asp Trp His Val Glu Thr Gly Glu Phe His Ile Leu Ala Gly Ser Ser 645 650 655 Ser Gln His Ile Val Leu Gln Asp Ser Val Val Val Glu Ser Thr Ala 660 665 670 Ala Leu Arg Lys Thr Tyr Thr Arg Asn Thr Thr Leu Gly Asp Leu Leu 675 680 685 Gln Asp Ala Ala Ala Arg Glu Lys Ala Gln Gly Leu Leu Gln Ala Phe 690 695 700 Gln Glu Ala Ser Gly Phe Ala Ala Gly Pro Glu Asp Asp His Ala Asp 705 710 715 720 Met Met Ala Ala Met Met Lys Tyr Met Pro Leu Arg Ala Leu Val Gly 725 730 735 Phe Ser Gln Gly Ala Leu Thr Glu Gln Thr Leu Glu Asp Leu Leu Lys 740 745 750 Glu Leu Asn His Asn 755

Claims (7)

1. 패니바실러스 무실라지노서스(Paenibacillus mucilaginosus)로부터 유래된 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 코딩하는 서열을 포함하는 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서, 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈를 코딩하는 서열은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것인, 재조합 벡터.
3. 제1항에 있어서, 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈인, 재조합 벡터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
5. (a) 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 배당체와 혼합하여 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액으로부터 생물 전환을 통해 배당체를 생물 전환하는 단계;를 포함하는 배당체를 생물 전환하는 방법.
6. (a) 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이당류와 혼합하여 반응액 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 반응액으로부터 생물 전환을 통해 이당류를 분해하는 단계;를 포함하는 이당류의 분해방법.
7. 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 포함하는, 배당체의 생물 전환용 조성물.
   

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