CN110029118B - 一种合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法 - Google Patents

一种合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法 Download PDF

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    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01013—Sucrose synthase (2.4.1.13)

Abstract

本发明公开一种合成槲皮素‑4’‑葡萄糖苷的方法,将糖基转移酶UGT88A1或者其突变体的基因与蔗糖合酶基因构建含双酶体系的重组菌;将重组菌使用IPTG作为诱导剂，在16~37℃诱导12~24 h，离心收集菌泥，利用超声破碎法破碎菌体，离心收集上清，得到粗酶液；将槲皮素溶于DMSO中，加入粗酶液、蔗糖，在20‑40℃条件下反应8‑30h，使用甲醇终止反应，离心得到槲皮素‑4’‑葡萄糖糖苷。所述糖基转移酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示氨基酸序列发生突变，突变的氨基酸位点选自V18，I118，G181，S271中的一个或多个。该突变体制备简单，实现了槲皮素‑4’‑葡萄糖糖苷产量的提高。

Description

一种合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种槲皮素糖苷的生物合成方法。
背景技术
槲皮素是一种天然黄酮类化合物，多以糖苷类形式，广泛存在于植物的花、叶、果实等组织中。槲皮素及其衍生物具有抗氧化、抗炎、抗癌的效果，同时也具备糖尿病预防和血脂，血压降低的作用。槲皮素的含量因素与其生长环境和组织部位有关，其分布多处于果蔬表皮。槲皮素不溶于水，考虑到吸收问题，需要增强其水溶性，使得它更好的作用于人体。可利用糖基化的方法，增加其亲水基团，使得溶解度增加。但是，现今，利用糖苷酶转化合成的槲皮素衍生物转化率及产量相对较低，且水溶性的问题限制了研究发展。槲皮素-4’-葡萄糖苷是槲皮素糖基化的产物，比槲皮素有更好的水溶性和药理作用。槲皮素-4’-葡萄糖苷，又叫绣线菊苷，它存在于洋葱中，在干重质量在0.036-23.92g/kg，含量较少，不易被提取。由于但是槲皮素成分天然来源广泛，利用基因工程，利用新型糖苷酶，通过一步转化法生产槲皮素-4’-葡萄糖苷，有极大的工艺优势和原料优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法,采用新型槲皮素糖苷酶的突变体实现槲皮素的糖基化修饰，制备得到槲皮素-4’-葡萄糖苷。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种适用于槲皮素糖苷合成的糖基转移酶突变体，糖基转移酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点选自V18，I118，G181，S271中的一个或多个。
进一步地，突变的氨基酸位点发生的突变包括如下任意一种或多种：V18R/K/N，I118G，G181N，S271K其中，“/”表示“或”。
V18R/K/N为SEQ ID NO.1序列中第18位氨基酸由缬氨酸（V）突变为精氨酸（R）或赖氨酸（K）或天冬酰胺（N）；I118G为ID NO.1序列中第118位氨基酸由异亮氨酸（I）突变为甘氨酸（G），G181N为ID NO.1序列中第181位氨基酸由甘氨酸（G）突变为天冬酰胺（N），S271K为ID NO.1序列中第271位氨基酸由丝氨酸（S）突变为赖氨酸（K）。
一种表达基因，该基因编码上述任一种糖基转移酶突变体。
一种重组质粒，该重组质粒连接有上述表达基因和蔗糖合酶基因SUS。
一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或上述糖基转移酶突变体的表达基因。
上述糖基转移酶突变体在制备槲皮素-4’-葡萄糖苷的应用。
槲皮素-4’-葡萄糖苷的生物合成方法：
1）构建具有双酶体系的重组菌：将糖基转移酶UGT88A1或其突变体的基因与蔗糖合酶基因连接得到重组质粒，采用热激法将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，得到含双酶体系的重组菌；
2) 重组菌的诱导产酶：将重组菌接种于LB液体培养基中，25~40℃，取样，使OD600处于0.4～0.5时，使用IPTG作为诱导剂，在16~37℃，150~300r/min的条件下进行诱导12~24h，离心收集菌泥，利用超声破碎法破碎菌体，8000r/min条件下离心收集上清，得到粗酶液；
3）将槲皮素溶于DMSO中，加入粗酶液、蔗糖，在20-40℃条件下反应8-30h，使用甲醇终止反应，离心得到槲皮素-4’-葡萄糖苷。
糖基转移酶UGT88A1的基因序列如SEQ ID.3所示，蔗糖合酶基因的序列如SEQID.4所示。
槲皮素溶于DMSO中终浓度为20~40mM；蔗糖终浓度为300~500mM；粗酶液加入量为5～10g/L。
本发明以来源于Arabidopsis thaliana糖基转移酶UGT88A1为基础，利用生物信息学方法分析，对其活性中心关键氨基酸进行饱和突变，筛选突变菌株后，获得了糖基转移酶突变体。将该糖基转移酶突变体与蔗糖合成酶进行双酶偶连，以槲皮素为底物，添加适量蔗糖，催化生成槲皮素-4’-葡萄糖苷。该突变体制备简单，产量大，实现了槲皮素-4’-葡萄糖糖苷的产量的提高，相同条件下，突变体活性较原始酶提高了2.5倍，产槲皮素-4’-葡萄糖苷的转化率较原始酶有显著的提高。
本发明通过突变提高了糖基转移酶UGT88A1的酶活，利用该突变体实现了槲皮素-4’-葡萄糖苷的一步法转化。
附图说明
图1反应体系底物产物检测液相色谱图谱。
具体实施方式
以下实施例中所采用的检测方法如下：
HPLC测定方法：色谱柱：Agilent TC-C18 (4 .6mm×250mm)；流动相(A)：水+1‰的三氟乙酸，(B)：乙腈+1‰的三氟乙酸;
以流速为1.0mL/min，检测波长为350nm，进样量20μL，柱温40℃的条件下，进行梯度洗脱。
以下实施例中所采用的确认突变体的方法：
本研究采用NCBI的BLASTP方法，根据保守位点进行筛选，获得多条与同源性相似UGT88A1的已知晶型结构序列，经过分析，同源建模。利用pymol同源建模，并与底物UDPG的对接，采用amber插件进行能量计算并优化。挑选得到靠近活性中心位点的第18位氨基酸缬氨酸（V），与活性位点距离为5Å，与底物能够存在氢键作用。对第18位的缬氨酸（V）进行饱和突变，有效突变为精氨酸（R）或赖氨酸（K）或天冬酰胺（N）。其他的氨基酸位点突变与该方法类似。
实施例1
糖基转移酶突变体的制备：来源于拟南芥的糖基转移酶UGT88A1突变体V18R，V18N，V18K,根据糖基转移酶UGT88A1的基因序列，进行饱和突变，测定DNA编码序列，并导入大肠杆菌中进行表达，得到突变糖基转移酶，单突变V18R，V18N，V18K均由金斯瑞生物科技有限公司合成构建到pRSFDuet载体上。
V18R的突变引物为：
正向引物：GGTCACCTGCGCTCGATGGTGGAACTGGGTAAAACCA
反向引物：CGAGCGCAGGTGACCGATCGGCGG
V18K的突变引物为：
正向引物：GGTCACCTGAAATCGATGGTGGAACTGGGTAAAACCA
反向引物：CGATTTCAGGTGACCGATCGGCGG
V18N的突变引物为：
正向引物：GGTCACCTGAACTCGATGGTGGAACTGGGTAAAACCA
反向引物：CGAGTTCAGGTGACCGATCGGCGG
将构建好的质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，利用50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，进行筛选，37℃过夜培养。100mL LB固体培养基配方为：1g酵母浸粉，1g蛋白胨，1g NaCl，2g琼脂糖，溶解于100mL 去离子水中，灭菌过后倒入培养皿。随机挑取单菌落至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基的摇管中，过夜培养，测序验证序列正确。
将突变体与蔗糖合酶偶连构建双酶体系
将UGT88A1直接克隆到pRSFDuet的NdeI和Xho I酶切位点间，得到重组质粒pRSFDuet-88a1（pRSFDuet质粒来源于金斯瑞公司）。
将重组质粒pRSFDuet-88a1用Nco I和EcoR I酶切，得到线性化载体，对带有蔗糖合酶的质粒pETDuet_SUS (来自金斯瑞公司)用Nco I和EcoR I酶切处理，得到SUS基因片段。对SUS基因片段和线性化载体进行胶回收，将突变后的UGT片段和SUS基因片段，于16℃过夜连接。将连接产物利用热激法转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，筛选得到阳性克隆，得到新的重组质粒sus_pRSFDuet-88a1_6HIS，然后导入到感受态细胞BL21（DE3）中，得到含双酶体系的重组菌。
实施例2 突变菌株诱导
将含有重组质粒的sus_pRSFDuet-88a1_6HIS的BL21（DE3）100mL LB液体培养基中，37℃，取样，使OD600处于0.4～0.5时，使用IPTG作为诱导剂，在16℃，200r/min的条件下进行诱导22h。100mL LB液体培养基配方为：1g酵母浸粉，1g蛋白胨，1g NaCl，2g琼脂糖，溶解于100mL 去离子水中。利用100mM 磷酸钾缓冲(pH8 .0)重悬菌体后，对其进行离心，收集菌体。离心条件：4℃，6000 /min，3min。
利用超声破碎法破碎菌体，破碎条件：300W，工作时间1s，间歇2s，全程20min。
破碎结束后，离心收集上清液。离心条件：8000r/min，25min。
实施例3 测定方法
糖基转移酶突变体与蔗糖合酶偶连双酶的转化率测定方法和糖基转移酶酶活测定方法为：反应液总体系为220μl，含0.5 mM槲皮素（可溶解于15%DMSO）、5 mM UDPG、pH 6.8磷酸钾缓冲，蛋白终浓度为0.1 mg/mL。于37℃反应30 min后，180μl甲醇终止反应。
离心条件：室温，12000 r/min，1 min。定量方法：HPLC进行分析上清液。
酶活力单位定义为：1 min催化形成1μmol槲皮素-4’-葡萄糖苷所需要的酶量为1个活力单位（U）。
蔗糖合酶的酶活测定方法：反应液总体系为3mL，含500mM蔗糖，10mM UDP , pH7.2磷酸钾缓冲，加入6mg蛋白。于30℃反应1 h后，取1mL反应液，95℃下煮沸10分钟。
离心条件：室温，12000 r/min，1 min。定量方法：DNS法测定上清液。
酶活力单位定义为：每分钟释放1μmol还原糖的酶量为一个活力单位(U）。
槲皮素-4’-葡萄糖苷含量检测方法：
在10ml体系中，加入终浓度为5mg/mL的酶液，转化底物终浓度32mM的槲皮素(溶解于5%DMSO )，pH 7.2的蔗糖终浓度320mM，在30°C条件下反应12 h。
取100μl反应液，加入900μl甲醇终止反应。
离心条件：室温，12000 r/min，1 min。定量方法：HPLC检测转化体系中槲皮素，槲皮素-4’-葡萄糖苷含量。定义原始酶的产量为100%。
将上述突变体表达获得的突变酶与原始酶相比，突变体酶活大幅提高，同时，突变体实现了槲皮素到槲皮素-4’-葡萄糖苷产量的提高，与化学提取法相比，具有环保绿色生产，低能耗，高含量等优势。突变酶以槲皮素为底物槲皮素-4’-葡萄糖苷产量相对于原始酶提高至243%，200%，169%。测定结果如表1所示。
表1
样品名 酶活（mU/mg） 产量（mg/L）
原始酶 227.6 100%(290.2)
V18R 552.3 208%(630.1)
V18K 454.7 130%(380.5)
V18N 384.6 153%(450)
实施例3 其他突变位点
按照上述方法，将同样位于活性中心附近I118G，G181N，S271K进行突变，按照上述方法进行筛选培养，利用相同方法进行检测。这些突变点均提高槲皮素-4’-葡萄糖产量110-150%。测定结果如表2所示。
表2
样品名 酶活（mU/mg） 产量（mg/L）
原始酶 227.6 100% (290.2)
I118G 319.3 145% (421)
G181N 257.2 130% (377.8)
S271K 279.9 128% (371.2)
实施例4 槲皮素-4’-葡萄糖苷的生产
将槲皮素溶解于5%DMSO水溶液中，蔗糖终浓度为320mM，槲皮素终浓度为32mM，加入粗酶液终浓度为5mg/mL，在30℃条件下反应12h，使用甲醇终止反应，离心得到槲皮素-4’-葡萄糖糖苷。取100μl反应液，加入900μl甲醇终止反应。利用底物产物利用HPLC进行检测。
测定方法：色谱柱：Agilent TC-C18 (4 .6mm×250mm)；流动相(A)：水+1‰的三氟乙酸，(B)：乙腈+1‰的三氟乙酸;
以流速为1.0mL/min，检测波长为350nm，进样量20μL，柱温40℃的条件下，进行梯度洗脱。
离心条件：室温，12000 r/min，1 min。
反应体系底物产物检测液相色谱图如图1所示，槲皮素的保留时间在20.5min前后，槲皮素-4’-葡萄糖苷保留时间在14min前后。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法
<141> 2019-04-19
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Glu Glu Ala Ile Val Leu Tyr Pro Ala Pro Pro Ile Gly His
1 5 10 15
Leu Val Ser Met Val Glu Leu Gly Lys Thr Ile Leu Ser Lys Asn Pro
20 25 30
Ser Leu Ser Ile His Ile Ile Leu Val Pro Pro Pro Tyr Gln Pro Glu
35 40 45
Ser Thr Ala Thr Tyr Ile Ser Ser Val Ser Ser Ser Phe Pro Ser Ile
50 55 60
Thr Phe His His Leu Pro Ala Val Thr Pro Tyr Ser Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Ser Arg His His His Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ile Leu Cys Phe Ser
85 90 95
Asn Pro Ser Val His Arg Thr Leu Phe Ser Leu Ser Arg Asn Phe Asn
100 105 110
Val Arg Ala Met Ile Ile Asp Phe Phe Cys Thr Ala Val Leu Asp Ile
115 120 125
Thr Ala Asp Phe Thr Phe Pro Val Tyr Phe Phe Tyr Thr Ser Gly Ala
130 135 140
Ala Cys Leu Ala Phe Ser Phe Tyr Leu Pro Thr Ile Asp Glu Thr Thr
145 150 155 160
Pro Gly Lys Asn Leu Lys Asp Ile Pro Thr Val His Ile Pro Gly Val
165 170 175
Pro Pro Met Lys Gly Ser Asp Met Pro Lys Ala Val Leu Glu Arg Asp
180 185 190
Asp Glu Val Tyr Asp Val Phe Ile Met Phe Gly Lys Gln Leu Ser Lys
195 200 205
Ser Ser Gly Ile Ile Ile Asn Thr Phe Asp Ala Leu Glu Asn Arg Ala
210 215 220
Ile Lys Ala Ile Thr Glu Glu Leu Cys Phe Arg Asn Ile Tyr Pro Ile
225 230 235 240
Gly Pro Leu Ile Val Asn Gly Arg Ile Glu Asp Arg Asn Asp Asn Lys
245 250 255
Ala Val Ser Cys Leu Asn Trp Leu Asp Ser Gln Pro Glu Lys Ser Val
260 265 270
Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser Leu Gly Leu Phe Ser Lys Glu Gln Val
275 280 285
Ile Glu Ile Ala Val Gly Leu Glu Lys Ser Gly Gln Arg Phe Leu Trp
290 295 300
Val Val Arg Asn Pro Pro Glu Leu Glu Lys Thr Glu Leu Asp Leu Lys
305 310 315 320
Ser Leu Leu Pro Glu Gly Phe Leu Ser Arg Thr Glu Asp Lys Gly Met
325 330 335
Val Val Lys Ser Trp Ala Pro Gln Val Pro Val Leu Asn His Lys Ala
340 345 350
Val Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu Ala
355 360 365
Val Cys Ala Gly Val Pro Met Val Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln
370 375 380
Arg Phe Asn Arg Val Met Ile Val Asp Glu Ile Lys Ile Ala Ile Ser
385 390 395 400
Met Asn Glu Ser Glu Thr Gly Phe Val Ser Ser Thr Glu Val Glu Lys
405 410 415
Arg Val Gln Glu Ile Ile Gly Glu Cys Pro Val Arg Glu Arg Thr Met
420 425 430
Ala Met Lys Asn Ala Ala Glu Leu Ala Leu Thr Glu Thr Gly Ser Ser
435 440 445
His Thr Ala Leu Thr Thr Leu Leu Gln Ser Trp Ser Pro Lys
450 455 460
<210> 2
<211> 806
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Pro Glu Leu Ile Gln Thr Leu Leu Asp Ser Glu Glu Lys Ser Asp
1 5 10 15
Leu Arg Ser Phe Val Ser Glu Leu Arg Gln Gln Glu Lys Lys Tyr Leu
20 25 30
Leu Arg Asn Asp Ile Val Asn Val Tyr Ser Glu Tyr Cys Ser Lys Tyr
35 40 45
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Tyr Tyr Thr Gln Glu Ile Ile Gln Glu Asp Ser Asn Leu Tyr Phe Ile
65 70 75 80
Ile Arg Ser Lys Ile Ala Ser Gln Gln Val Tyr Arg Leu Thr Asp Asp
85 90 95
Leu Ser Ile Glu Ser Ile Thr Ile Gln Glu Leu Leu Asp Val Arg Asp
100 105 110
Arg Phe Val Asn Arg Tyr Gln Pro Asn Glu Gly Asp Leu Leu Glu Leu
115 120 125
Asp Phe Gly Pro Phe Tyr Asp Tyr Ser Pro Val Ile Arg Asp Pro Lys
130 135 140
Asn Ile Gly Lys Gly Val Gln Tyr Leu Asn Arg Tyr Leu Ser Ser Lys
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Leu Phe Gln Asp Ala Lys Gln Trp Leu Glu Ser Leu Phe Gly Phe Leu
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Arg Leu His Gln Tyr Asn Gly Ile Gln Leu Leu Ile Asn Asp Arg Ile
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Glu Ile Val Gly Thr Pro Asp Ser Ile Gly Gln Tyr Glu Ser Tyr Lys
485 490 495
Cys Phe Thr Met Pro Asp Leu Tyr His Val Val Asn Gly Ile Glu Leu
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Phe Ser Pro Lys Phe Asn Val Val Pro Pro Gly Val Ser Glu Asn Tyr
515 520 525
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Arg Ile Thr Glu Leu Leu Phe Thr Leu Asp Asp Pro Thr Gln Ile Phe
545 550 555 560
Gly Gln Leu Asp Asn Pro Asn Lys Arg Pro Ile Phe Ser Met Ala Arg
565 570 575
Leu Asp Arg Ile Lys Asn Leu Thr Gly Leu Ala Glu Cys Phe Gly Lys
580 585 590
Ser Gln Glu Leu Gln Glu His Cys Asn Leu Ile Leu Val Ala Gly Lys
595 600 605
Leu Arg Val Glu Glu Ser Gly Asp Asn Glu Glu Arg Asp Glu Ile Val
610 615 620
Lys Leu Tyr Gln Ala Ile Glu Gln Tyr Asn Leu His Gly Lys Ile Arg
625 630 635 640
Trp Leu Gly Val Arg Leu Ser Lys Asn Asp Ser Gly Glu Ile Tyr Arg
645 650 655
Val Ile Ala Asp His Lys Gly Val Phe Val Gln Pro Ala Leu Phe Glu
660 665 670
Ala Phe Gly Leu Thr Ile Leu Glu Ala Met Ile Ser Gly Leu Pro Thr
675 680 685
Phe Gly Thr Gln Phe Gly Gly Pro Leu Glu Ile Ile Gln Asp Arg Val
690 695 700
Asn Gly Phe Tyr Ile Asn Pro Thr Asn Leu Glu Glu Thr Ala Ala Lys
705 710 715 720
Ile Leu Asp Phe Val Ile Lys Cys Glu Glu Arg Pro Asn Ser Trp Asn
725 730 735
Glu Ile Ser Gln Gln Gly Ile Asp Arg Val Tyr Ser Thr Tyr Thr Trp
740 745 750
Lys Ile His Thr Thr Lys Leu Leu Ser Leu Ala Arg Ile Tyr Gly Phe
755 760 765
Trp Asn Phe Thr Ser Gln Glu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Tyr Ile
770 775 780
Glu Ala Leu Phe Tyr Leu Ile Tyr Lys Pro Arg Ala Gln Gln Leu Leu
785 790 795 800
Glu Gln His Lys Tyr Arg
805
<210> 3
<211> 1386
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggcgaag aagcaattgt gctgtatccg gctccgccga tcggtcacct ggtctcgatg 60
gtggaactgg gtaaaaccat tctgagcaaa aacccgtccc tgtcaatcca tattatcctg 120
gttccgccgc cgtatcagcc ggaatctacc gcaacgtaca ttagctctgt gagttcctca 180
tttccgagta tcaccttcca tcacctgccg gctgttaccc cgtatagcag cagcagcacg 240
tcgcgtcatc accatgaaag cctgctgctg gaaattctgt gcttttccaa tccgtcagtc 300
caccgcaccc tgttttcgct gagccgtaac ttcaatgtgc gcgcaatgat tatcgatttc 360
ttttgcaccg cggtgctgga tattaccgcc gactttacgt tcccggttta tttcttttat 420
acctctggcg cggcctgtct ggcttttagt ttctatctgc cgacgatcga tgaaaccacg 480
ccgggtaaaa acctgaaaga cattccgacc gtccatatcc cgggtgtgcc gccgatgaaa 540
ggttctgata tgccgaaagc ggtgctggaa cgtgatgacg aagtttatga cgtctttatt 600
atgttcggca aacagctgag taaatcctca ggtattatca ttaacacctt tgatgccctg 660
gaaaatcgtg cgattaaagc catcacggaa gaactgtgtt tccgcaacat ttacccgatc 720
ggcccgctga ttgttaatgg tcgtatcgaa gatcgcaacg acaataaagc ggtcagctgc 780
ctgaactggc tggattctca accggaaaaa agtgtggttt ttctgtgttt cggctccctg 840
ggtctgtttt caaaagaaca ggttatcgaa attgccgtcg gcctggaaaa aagcggtcaa 900
cgtttcctgt gggtcgtgcg caatccgccg gaactggaaa aaaccgaact ggatctgaaa 960
tccctgctgc cggaaggctt tctgtcacgt acggaagaca agggtatggt tgtcaaatcc 1020
tgggcaccgc aggtgccggt tctgaaccac aaagccgttg gcggttttgt cacccattgc 1080
ggctggaata gcattctgga agcagtgtgt gctggtgtgc cgatggttgc gtggccgctg 1140
tacgccgaac agcgttttaa ccgcgtcatg atcgtggatg aaatcaaaat cgcaatctcg 1200
atgaacgaaa gcgaaaccgg cttcgtgtcg agcacggaag tggaaaaacg cgttcaagaa 1260
atcattggtg aatgcccggt tcgtgaacgc accatggcaa tgaaaaatgc agctgaactg 1320
gctctgaccg aaacgggttc tagtcacacg gccctgacca cgctgctgca atcttggagt 1380
ccgaaa 1386
<210> 4
<211> 2418
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccgaac gtgtcctgac ccgtgtccat agtctgcgtg aacgtgttga tgctaccctg 60
gctgcccacc gtaatgaaat cctgctgttt ctgagtcgta ttgaaagcca cggcaaaggt 120
atcctgaaac cgcacgaact gctggcagaa tttgatgcta ttcgccagga tgacaaaaac 180
aaactgaacg aacatgcatt cgaagaactg ctgaaaagca cccaagaagc tatcgtcctg 240
ccgccgtggg tggcactggc aattcgtctg cgcccgggcg tttgggaata catccgtgtt 300
aacgtcaatg cgctggttgt ggaagaactg agtgtgccgg aatatctgca gtttaaagaa 360
gaactggtcg atggcgcgtc caacggtaat ttcgtgctgg aactggactt tgaaccgttc 420
accgcctcat ttccgaaacc gaccctgacg aaatcgattg gcaacggtgt tgaatttctg 480
aatcgtcatc tgagcgccaa aatgttccac gataaagaat ctatgacccc gctgctggaa 540
tttctgcgcg cacatcacta taaaggtaaa accatgatgc tgaacgatcg tattcagaac 600
agcaatacgc tgcaaaatgt gctgcgcaaa gcggaagaat acctgatcat gctgccgccg 660
gaaaccccgt acttcgaatt tgaacataaa ttccaggaaa ttggcctgga aaaaggctgg 720
ggtgatacgg cagaacgtgt gctggaaatg gtttgcatgc tgctggatct gctggaagct 780
ccggacagct gtaccctgga aaaatttctg ggtcgcattc cgatggtttt caacgtcgtg 840
atcctgtctc cgcacggcta ttttgcgcag gaaaatgtcc tgggttaccc ggataccggc 900
ggtcaggttg tctatattct ggaccaagtg ccggccctgg aacgtgaaat gctgaaacgc 960
atcaaagaac agggcctgga tattatcccg cgtattctga tcgtcacccg tctgctgccg 1020
gacgcagtgg gcaccacgtg cggtcaacgt attgaaaaag tgtatggcgc tgaacattca 1080
cacatcctgc gtgttccgtt tcgcaccgaa aaaggtattg tccgtaaatg gatctcgcgc 1140
tttgaagtgt ggccgtacat ggaaacgttc attgaagatg ttgcaaaaga aatctcagcg 1200
gaactgcagg ccaaaccgga cctgattatc ggcaactata gcgaaggtaa tctggcggcc 1260
tctctgctgg cccataaact gggcgtgacc caatgtacga ttgcacacgc tctggaaaaa 1320
accaaatatc cggattcgga catctactgg aaaaaattcg atgaaaaata ccatttcagc 1380
tctcagttca ccgcagatct gattgctatg aaccacacgg actttattat caccagtacg 1440
ttccaggaaa tcgcgggctc caaagatacc gtgggtcaat acgaaagtca tatggccttt 1500
acgatgccgg gcctgtatcg cgtggttcac ggtatcaacg ttttcgatcc gaaattcaac 1560
attgtctccc cgggtgcaga catcaatctg tatttttcat actcggaaac cgaaaaacgt 1620
ctgacggctt tccatccgga aatcgatgaa ctgctgtata gcgatgtgga aaacgacgaa 1680
cacctgtgcg ttctgaaaga tcgcaccaaa ccgattctgt ttacgatggc gcgtctggac 1740
cgcgttaaaa atctgaccgg cctggtcgaa tggtacgcca aaaacccgcg tctgcgcggt 1800
ctggtgaatc tggtcgtggt tggcggtgat cgtcgcaaag aatctaaaga cctggaagaa 1860
caggcggaaa tgaagaaaat gtacgaactg atcgaaaccc ataacctgaa tggccagttc 1920
cgttggatca gttcccaaat gaaccgtgtt cgcaatggcg aactgtatcg ctacatcgca 1980
gatacgaaag gtgcttttgt ccagccggcg ttttacgaag ccttcggcct gaccgtcgtg 2040
gaagcgatga cgtgcggtct gccgaccttc gcaacgaatc atggcggccc ggcagaaatt 2100
atcgttcacg gcaaaagtgg ttttcatatt gatccgtatc acggcgaaca ggcagctgat 2160
ctgctggccg actttttcga aaaatgtaaa aaagacccgt cacattggga aaccatttcg 2220
atgggcggtc tgaaacgcat cgaagaaaaa tatacctggc aaatttacag cgaatctctg 2280
ctgacgctgg cggccgtgta cggtttctgg aaacacgttt ctaaactgga tcgtctggaa 2340
attcgtcgct atctggaaat gttttatgcg ctgaaatacc gcaaaatggc ggaagccgtg 2400
ccgctggcag ctgaataa 2418
<210> 5
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtcacctgc gctcgatggt ggaactgggt aaaacca 37
<210> 6
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgagcgcagg tgaccgatcg gcgg 24
<210> 7
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtcacctga aatcgatggt ggaactgggt aaaacca 37
<210> 8
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgatttcagg tgaccgatcg gcgg 24
<210> 9
<211> 37
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtcacctga actcgatggt ggaactgggt aaaacca 37
<210> 10
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgagttcagg tgaccgatcg gcgg 24

Claims (8)

1.一种合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于,包括如下步骤：
1）构建具有双酶体系的重组菌：将糖基转移酶UGT88A1的突变体的基因与蔗糖合酶基因连接得到重组质粒，采用热激法将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，得到含双酶体系的重组菌；
2）重组菌的诱导产酶：将重组菌接种于LB液体培养基中，25~40℃，取样，使OD600处于0.4～0.5时，使用IPTG作为诱导剂，在16~37℃，150~300r/min的条件下进行诱导12~24h，离心收集菌泥，利用超声破碎法破碎菌体，离心收集上清，得到粗酶液；
3）将槲皮素溶于DMSO中，加入粗酶液、蔗糖，在20-40℃条件下反应8-30h，使用甲醇终止反应，离心得到槲皮素-4’-葡萄糖糖苷；
所述糖基转移酶UGT88A1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其突变体由SEQ ID NO.1突变得到，所述突变选自V18R/K/N、I118G、G181N、S271K任一种，其中，“/”表示“或”。
2.根据权利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述蔗糖合酶序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，诱导剂IPTG的浓度为0.1mM，诱导时长为22h。
4.根据权利要求1所述的合成槲皮素-4’-葡萄糖苷的方法，其特征在于，槲皮素溶于DMSO中终浓度为20~40mM；蔗糖终浓度为300~500mM；粗酶液加入量为5～10g/L。
5.一种适用于槲皮素-4’-葡萄糖苷合成的糖基转移酶突变体，其特征在于，所述糖基转移酶突变体由SEQ ID NO.1突变得到，所述突变选自V18R/K/N、I118G、G181N、S271K任一种，其中，“/”表示“或”。
6.一种表达基因，其特征在于，该基因编码权利要求5所述的糖基转移酶突变体。
7.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒连接有权利要求6所述的表达基因和蔗糖合酶基因SUS。
8.一种重组细胞，其特征在于，该重组细胞包含权利要求6所述的表达基因或权利要求7所述的重组质粒。
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