KR101340079B1

KR101340079B1 - 테라박터 속 유래 β―글루코시다제를 이용한 ＰＰＴ 타입 진세노사이드의 생물전환

Info

Publication number: KR101340079B1
Application number: KR1020120097394A
Authority: KR
Inventors: 김성건; 안동선; 임완택; 김선창
Original assignee: 한국과학기술원; 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2014-01-24

Abstract

본 발명은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법, 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물, 및 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제에 관한 것이다.

Description

테라박터 속 유래 β―글루코시다제를 이용한 ＰＰＴ 타입 진세노사이드의 생물전환{Biotransformation of PPT-type ginsenoside using Terrabacter sp.-derived β-glucosidase}

본 발명은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물, 및 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체 중 당을 제외한 부분이 여러 개의 고리화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 한편, 인삼 또는 홍삼의 주요 생리 활성 성분을 포함하는 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과 화학 구조가 상이한 바, 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위하여 특별히 인삼(ginseng) 배당체(glycoside)란 의미로 진세노사이드(ginsenoside)라고 칭한다.

상기 진세노사이드는 아글리콘(aglycon)의 구조에 따라 프로토파낙사다이올계 진세노사이드(protopanaxadiol-type ginsenoside), 프로토파낙사트리올계 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside) 및 올레아놀린산계 진세노사이드(oleanolic acid-type ginsenoside)의 세 가지 형태로 분류될 수 있다. 상기 세 가지 그룹의 화합물은 다시 화합물 구조 중 C-3, C-6 및 C-20 위치에 글리코시딕 결합(glycosidic bond)에 의해 부착되는 아글리콘 상에 도입된 당 모이어티(sugar moiety)의 위치 및 수에 따라 분류되는데, 그 중 Rg1, Re, Rb1, Rc 및 Rb2가 전체 진세노사이드의 90%를 차지하는 메이저 진세노사이드(major ginsenoside)이다(Park, J. H., Food Ind . Nutr., 2004, 9:23-27). 그러나, 이들 메이저 진세노사이드들은 큰 사이즈로 인하여 인체에 경구투여되는 경우, 직접 흡수되기 어렵다고 알려져 있다. 따라서, 이러한 인삼에 다량 함유된 메이저 진세노사이드들은 생체 내에서 효과적으로 생리활성을 나타내기 위하여 당 모이어티를 제거하는 전환과정(deglycosylation)을 필요로 한다(Tawab, M. A. et al., Drug Metab . Dispos., 2003, 31: 1065-1071; Akao, T. et al., J. Pharm . Pharmacol., 1998, 50: 1155-1160).

한편, 최근 수십 년간 진세노사이드 F1, PPTA 및 화합물 K(compound K)와 같은 인삼에 미량 함유된 마이너 형태(minor form)의 진세노사이드들의 뛰어난 약리효능이 밝혀지고 있다. 이러한 연구결과가 발표됨에 따라 보다 우수한 약리 작용을 갖는 진세노사이드 F1, F2, Rg3, Rh1, Rh2, PPTA 및 화합물 K 등의 마이너 진세노사이드(minor ginsenoside)에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 마이너 형태를 갖는 특정 진세노사이드의 함량 비율을 증가시킬 수 있는 방법이 요구되고 있는 실정이다.

이 중, 진세노사이드 F1은 항암활성 및 UVB 조사된 피부의 노화 억제에 의한 화장효과 등의 이로운 효과가 알려진 바 있으나, 상기 본 발명의 생산물인 진세노사이드 F1과 같이 인삼의 자연적 구성요소가 아닌 희귀 진세노사이드로의 전환은 산 가수분해 및 훈증(steaming)과 같은 일반적인 물리화학적 방법에 의해서는 성취되기 매우 어렵다. 단지 Rg3 및 Rh2만이 열처리된 인삼생성물의 주된 구성요소로 나타나며, 상기 Rg3 및 Rh2로의 전환도 완전하지 않다(Popovich, D. G. and Kitts, D. D., Phytochemistry, 2004, 65(3): 337-344). 고안된 방식으로 주요 진세노사이드를 효소 가수분해하여 C-K 및 F1과 같은 희귀 진세노사이드를 생산할 수 있다(Park, C. S. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 87(1): 9-19). F1의 생산은 상업적 원천의 몇몇 효소(Ko, S. R. et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 51(4): 404-408), 진균류(fungus)(Kim, Y. S. et al., Biotechnology Letters, 2011, 33(12): 2457-2461) 및 세균(bacterium)(Bae, E. A. et al., Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(10): 1903-1908)으로부터 정제된 β-글루코시다제를 이용하여 수행되었으나, 천연형 미생물로부터 효소생산이 제한적이어서 천연형 효소에 의한 F1의 대량생산방법은 아직 확립되지 못하였다.

상기 프로토파낙사트리올-타입 희귀 진세노사이드(protopanaxatriol-type rare ginsenoside)의 일종인 진세노사이드 F1은 PPT 타입 아글리콘 담마란(dammarane)의 C20 위치에 하나의 글루코피라노실(glucopyranosyl) 치환기만을 갖는다. 이는 인삼 중량의 3 내지 5%을 차지하는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol; PPD)-타입 진세노사이드 및 PPT-타입 진세노사이드 중 PPT-타입 진세노사이드에 속하는 각각 Re 및 Rg1의 C6에 위치한 이당류 글루코스-람노스 모이어티 또는 글루코스 모이어티를 가수분해하여 생산할 수 있다(도 2). 이에 글리코시다제를 이용하여 0.5 g의 PPT 타입 혼합물로부터 수백 mg의 F1, Rh1, Rg2 및 Rg1을 생물학적으로 생산하거나, 진균류로부터 분리한 β-글루코시다제를 이용하여 Rg1으로부터 F1을 생산한 경우가 보고되었으나, F1을 그램단위로 생산하는 대량생산에 성공한 사례는 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 진세노사이드에 주로 존재하는 형태인 메이저 진세노사이드 Re 및 Rg1을 가수분해하여 희귀 진세노사이드인 F1을 대량으로 생산할 수 있는 효소를 찾기 위해 예의 연구노력한 결과로서, PPD 타입 진세노사이드를 가수분해하는 것으로 알려진 테라박터 속 유래 β-글루코시다제가 이와는 다른 메커니즘을 통하여 PPT 타입 진세노사이드를 가수분해하여 F1을 생산할 수 있음을 확인하였으며, 특히, 본 발명의 재조합 β-글루코시다제를 이용한 생물전환을 통해 F1을 그램단위로 대량생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서, PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법을 제공한다.

"PPT 타입의 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)"는 예컨대 하기 화학식 1의 일반식을 갖는 화합물이다. 각각 6번 및 20번 탄소에 당류 모이어티가 치환될 수 있고, 상기 당류 치환기의 갯수, 위치 및 종류에 따라 다른 화합물을 제공한다. 이때, 당류가 치환되지 않은 자리는 히드록시기(hydroxy; -OH)로 치환된다. 바람직하게, 본 발명의 PPT 타입의 진세노사이드는 3번 탄소에는 히드록시기를 가지며, 6번 탄소 및/또는 20번 탄소에 당류 치환기를 갖는 화합물 및 이의 가수분해물을 포함한다. 바람직하게, 6번 탄소에 람노스로 치환된 글루코스 모이어티를 가지고 20번 탄소에 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Re, 6번 탄소 및 20번 탄소에 각각 치환된 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Rg1, 상기 진세노사이드 Re 또는 Rg1의 가수분해물인 20번 탄소에 글루코스 모이어티를 갖는 진세노사이드 F1, 6번 위치에 람노스로 치환된 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Rg2, 6번 위치에 글루코스 모이어티를 가지는 진세노사이드 Rh1 및 상기 진세노사이드 F1, Rg2 또는 Rh1의 가수분해물인 상기 모든 당류로 치환가능한 자리에 히드록시기가 치환된 PPTA(protopanaxatriol aglacon)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 PPT 타입의 진세노사이드들의 구조는 후술할 것이다.

이와 달리 "PPD 타입(protopanaxadiol-type)의 진세노사이드"는 예컨대 하기 화학식 2의 일반식을 갖는 화합물로, 각각 3번 및 20번 탄소에 당류 모이어티가 치환될 수 있고, 상기 당류 치환기의 갯수, 위치 및 종류에 따라 다른 화합물을 제공한다. 이때, 당류가 치환되지 않은 자리는 히드록시기로 치환된다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본 발명의 용어 "탈글라이코실화"는 천연의 DNA, RNA, 단백질, 화합물 등의 히드록시기 또는 다른 작용기가 치환된 위치에 대신 결합된 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류 등)을 제거하는 과정이다. 바람직하게, 본 발명에서 탈글라이코실화는 메이저 진세노사이드들에 치환된 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 제거하는 과정일 수 있다.

"β-글루코시다제(β-glucosidase)"는 두 개의 글루코스 또는 글루코스-치환 분자(예를 들어, 이당 셀로비오스(disaccharide cellobiose))를 연결하는 β1→4 결합에 작용하는 포도당분해효소이다. 본 발명은 테라박터 속 미생물로부터 유래된 β-글루코시다제가 메이저 형태의 PPT 타입의 진세노사이드를 마이너 형태로 전환시킬 수 있다는 것을 최초로 발견하였다. 이는 상기 효소가 갖는 PPT 타입의 진세노사이드의 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티 나아가, 20번 탄소에 위치한 글루코스 모이어티를 선택적으로 가수분해할 수 있는 능력에 기인한다. 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물로부터 분리된 β-글루코시다제의 구체적인 활성에 대해서는 규명된 바 없다. 다만, 본 발명자들은 선행특허(한국공개공보 제10-2011-0044669)에서 테라박터 속 유래 β-글루코시다제를 최초로 동정하고 PPD 타입의 진세노사이드에 대한 가수분해 활성을 확인하였다. 바람직하게 상기 테라박터 속 미생물은 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082^T(Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082^T)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 상기 본 발명의 β-글루코시다제가 PPT 타입 진세노사이드를 기질로 하여 가수분해반응을 일으킴에 있어, PPD 타입 진세노사이드를 기질로 하여 가수분해를 일으키는 기전과는 다른 기전에 의해 수행됨을 최초로 규명하였다. β-글루코시다제의 공지된 활성인 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해하는 PPD 타입 진세노사이드에 대한 작용 모드와는 달리, PPT 타입 진세노사이드에 대하여 6번 및 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, β-글루코시다제는 PPD 타입 진세노사이드에 대해서, 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해 함에 있어서, 두 개의 글루코스가 연달아 치환된 경우 말단에 위치한 모이어티부터 하나씩 차례로 가수분해시킬 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 3번 및 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티가 치환된 진세노사이드 Rb1을 본 발명의 β-글루코시다제로 가수분해시키는 경우, 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티는 손상되지 않은 채로 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 2개의 글루코스 모이어티가 말단으로부터 차례로 가수분해 됨으로써 각각 지페노사이드 XVII 및 LXXV를 생산하고, 최종적으로 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티 중 말단에 위치한 하나의 글루코스 모이어티를 가수분해하여 컴파운드 K를 생산한다(An, D. S. et al ., Appl . Environ. Microbiol ., 2010, 76: 5827-5836). 그러나 본 발명에서 β-글루코시다제를 PPT 타입 진세노사이드의 가수분해에 적용한 결과, Rg1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Re의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rg1 및 Re 모두로부터 F1을 생산할 수 있다. 나아가 상기 F1의 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 추가로 가수분해하여 PPTA를 제조할 수 있다. 또한 유사한 메커니즘에 의하여 Rh1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Rg2의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rh1 및 Rg2 모두로부터 직접 PPTA를 생산할 수 있다. 상기 본 발명의 β-글루코시다제는 람노시다제 활성을 갖지 않으므로, 상기 Re 및 Rg2를 가수분해하여 각각 F1 및 PPTA로 전환하는 것은 외부의 람노스로부터 내부의 글루코스를 순차적으로 가수분해하는 것이 아니라, 직접 내부의 글루코스를 가수분해하는 것이다. 이로써 본 발명의 β-글루코시다제가 직접 이당(disaccharide)을 가수분해할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 β-글루코시다제는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열로 구성되는 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제의 활성을 갖는 서열도 본 발명의 범위 내에 속한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 β-글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함된다.

또한, 본 발명의 β-글루코시다제는 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 유전자 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 상기 서열 뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 β-글리코시다제의 활성을 갖는 서열도 본 발명의 범위 내에 속한다. 바람직하게 본 발명의 유전자는 유전자는 1947bp 길이의 핵산을 포함하며 648개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.

본 발명의 용어 "유사성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 유사성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 유사성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 일정 수준 이상의 유사성이 유지되는 동시에 본 발명에서 목적하는 단백질의 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 β-글리코시다제는 야생형의 아미노산 서열 변이체 또는 핵산 서열 변이체를 포함하는데, "변이체"란 천연 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 또는 핵산 서열이 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 갖는 단백질 또는 상이한 서열을 갖는 핵산을 의미한다.

상기 본 발명의 β-글루코시다제는 이를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp.) 미생물로부터 천연형 β-글루코시다제 단백질로 제조되거나 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체로부터 재조합 단백질로 제조된 것을 이용할 수 있다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환 (transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 β-글리코시다제를 수득할 수 있게 된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재조합 β-글리코시다제의 제조를 위하여 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082로부터 β-글리코시다제를 코딩하는 유전자를 획득하여 pGEX-4T-1 플라스미드를 이용하여 재조합 벡터를 제작하였다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주세포로는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 β-글리코시다제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입효율이 우수하고, 상기 도입된 유전자의 발현효율이 높은, 바람직하게 β-글리코시다제의 발현율이 높은 숙주세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아, 곰팡이(예컨대, 효모), 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기와 같은 방법으로 제조된 재조합 벡터를 대장균(E. coli)과 같은 숙주세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있는데, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 E. coli C41(DE3) 세포에 상기 재조합 벡터를 형질전환함으로써 β-글리코시다제의 발현을 유도하였다.

본 발명에 따라 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물로 처리하는 것일 수 있다.

예를 들어, PPT 타입의 진세노사이드를 포함하는 반응물에 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질를 직접 첨가하여 반응시키거나, β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속 미생물, 예를 들어 본 발명의 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082, 또는 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체와 함께 배양하거나, 상기 미생물 또는 형질전환체의 배양물과 혼합하여 반응시킬 수 있다.

상기 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 삼, 삼 추출물 또는 삼 또는 이의 추출물을 포함하는 식품의 형태로 제공될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 구체적인 실시예에서는 건조삼 분말로부터 조 PPT 타입 진세노사이드 혼합물(crude mixture)을 에탄올 용액으로 추출하고 컬럼으로 정제하여 사용하였다. 이후 β-글루코시다제에 의한 가수분해 반응을 용액 상에서 실시하였다. 이때, 조 PPT 타입 진세노사이드 혼합물은 물에 대한 용해도가 낮으므로, 반응성을 높이기 위하여 NaCl 용액을 첨가하여 용해도를 높였다.

본 발명에서 β-글루코시다제를 처리하는 단계는 PPT 타입 제1 진세노사이드, 바람직하게는 β-글루코시다제가 작용하는 기질의 총 중량과 1:0.6 내지 1:1의 중량비로 β-글루코시다제를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 80%의 농도로 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 25 mg/ml 농도의 PPT 타입 진세노사이드 혼합물을 가수분해 하는 경우, 20 mg/ml 농도의 β-글루코시다제를 사용하여 가수분해할 수 있다. 특히, 진세노사이드 F1을 생산하고자 하는 경우 상기 β-글루코시다제의 양을 조절하는 것이 중요하다. 예를 들어, 가수분해하고자 하는 기질의 농도에 비해 과량의 효소를 사용하였을 경우, 생산된 F1이 PPT 타입 진세노사이드의 최종 가수분해 산물인 PPTA로 전환될 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 β-글루코시다제를 처리하는 단계는 100 내지 500 mM 농도로 NaCl를 첨가하여 수행될 수 있다. 메이저 형태의 PPT 타입 진세노사이드인 Re 및 Rg1 등은 난용성 화합물인 반면, 효소 반응은 용액 상에서 효과적으로 수행될 수 있다. 따라서, 상기 본 발명의 β-글루코시다제의 기질로 작용하는 난용성 메이저 형태의 PPT 타입 진세노사이드 Re 및 Rg1의 수용액에 대한 용해도를 증가시켜 수용액 상에서의 효소반응 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서, 상기 난용성 화합물의 용해를 돕기 위하여 NaCl을 첨가하여 효소반응을 수행할 수 있다. 상기 효소반응에 첨가되는 NaCl은 바람직하게 100 내지 500 mM의 농도로 첨가될 수 있으며, 보다 바람직하게는 200 mM 농도로 첨가될 수 있다. 500 mM을 초과하는 농도로 첨가될 수 있으나, 이로 인한 더 이상의 효율증가를 나타내지는 않는다(도 4).

본 발명의 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 각각 하기 화학식 3 내지 7의 구조식을 갖는 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1 또는 F1 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으며, PPT 타입의 제2 진세노사이드는 각각 하기 화학식 7 및 8의 구조식을 갖는 진세노사이드 F1 또는 PPTA 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

[화학식 3] 진세노사이드 Re

[화학식 4] 진세노사이드 Rg1

[화학식 5] 진세노사이드 Rg2

[화학식 6] 진세노사이드 Rh1

[화학식 7] 진세노사이드 F1

[화학식 8] PPTA

본 발명의 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있다. 상기 가수분해를 통하여 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 제거함으로써, 바람직하게 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg2로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환 또는 진세노사이드 Rh1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있다. 상기 가수분해를 통하여 20번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 제거함으로써, 바람직하게 진세노사이드 F1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환반응을 수행할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물을 제공한다.

바람직하게 상기 본 발명의 조성물은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물을 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체를 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제를 제공하기 위하여 숙주세포로서 식품과 사료에 적합한 유산균을 사용할 수 있다. 상기 유산균의 예로는 락토코커스 속, 스트렙토코커스 속, 락토바실러스 속, 류코노스톡 속, 페디오코커스 속, 브레비박테리움 속 및 프로피오니박테리움 속이 있다. 식품 발효 배양물로서 단독으로 또는 유산균과 함께 사용되기도 하는, 엄밀하게는 혐기성 균인 비피더스균(즉, 비피도박테리움 속(Bifidobacterium spp.)에 속하는 유산 생성 박테리아도 유산균 부류에 포함된다.

상기 식품은 건강기능식품 뿐만 아니라, 인간이 널리 통상적으로 매일 섭취하는 일반적인 식품을 포함하는 것이다. 건강기능식품으로서 이용될 경우 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제와 함께 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다.　 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.

상기 식품은 발효식품일 수 있으며, 발효식품의 예로는 김치, 채소발효물, 된장, 간장, 청국장, 젓갈, 발효된 유제품(발효유, 요구르트, 치즈) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제에서, PPT 타입의 진세노사이드 또는 삼내 PPT 타입의 진세노사이드는 β-글루코시다제에 의해 가수분해된 것일 수 있고, 가수분해되지 않은 것일 수 있다.

사료 첨가제로서 이용될 경우, 본 발명의 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp.) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp.) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물은 20 내지 90wt% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.

상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.

또한, 상기 사료 첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제는 침투, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 또는 사료 첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 및 실험용 설치 동물 뿐만 아니라, 애완 동물(예: 개,고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따라 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래 β-글루코시다제를 사용하여 최적화된 기질 및 NaCl 농도에서 PPTx로부터 희귀 PPT 타입 진세노사이드 F1을 대량으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 효소를 이용하면 희귀 진세노사이드의 대량 생산이 가능해져, 본 발명에서는 최초로 그램단위로 F1을 생산하였다.

도 1은 본 발명에 따른 β-글루코시다제의 PPT 타입 진세노사이드 생물전환 활성을 나타낸 도이다. 레인 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 표준 진세노사이드 Re, Rg2, Rg1, Rh1, F1 및 PPTA를; 레인 7, 9, 11, 13 및 15는 효소 처리 하지 않은 진세노사이드 Re, Rg2, Rg1, Rh1 및 F1을; 레인 8, 10, 12, 14 및 16은 진세노사이드 Re, Rg2, Rg1, Rh1 및 F1을 β-글루코시다제와 24시간 동안 인큐베이션 후의 결과물을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 PPT 타입 진세노사이드의 탈글리코실화 생물전환 경로를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 진세노사이드 F1 생산시 PPTx 농도의 영향을 나타낸 도이다. 40mg/ml 농도의 β-글루코시다제(BgpA)를 표시된 농도의 같은 부피의 기질(PPTx) 용액과 혼합하여 반응시켰다. 도면에서 각각의 기호가 나타내는 농도는 동일한 부피의 β-글루코시다제와 혼합한 혼합물에서 기질의 최종농도에 상응한다; 5 (●), 10 (▽), 15 (■), 20 (◇), 25 (○) 및 50 (▲) mg/ml.
도 4는 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 진세노사이드 Re 및 Rg1로부터 F1으로의 생물전환시 NaCl의 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 β-글루코시다제에 의한 생물전환 시간에 따른 각각의 PPTx의 생산 또는 잔존량을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 효소에 의한 생물전환에 의해 생산된 F1 정제에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 각각의 진세노 사이드 성분에 대한 농도를 HPLC로 정량 분석하였다. (A)는 기질, (B)는 에탄올 추출물, (C)는 컬럼을 통해 정제된 F1에 대한 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화합물, 박테리아 균주 및 플라스미드

표준 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1, F1 및 PPTA(protopanaxatriol aglycon)을 Nanjing Zelang Medical Tehnological Co. Ltd.(Nanjing, China)로부터, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; pNPGlc)를 시그마로부터 구입하였다. Diaion HP-20 수지(resin)는 Mitsubishi Co. Ltd.(Japan)로부터 구입하였다. 재조합 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 한국의 인삼밭으로부터 분리한 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082^T(Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082^T)로부터 복제하였다. 상기 균주는 KCTC19421^T의 번호로 기탁되어 있다. β-글루코시다제를 코딩하는 유전자 β-글루코시다제를 복제하기 위하여 pGEX-4T-1(GE Healthcare)을 이용하여 상기 β-글루코시다제 유전자의 N-말단에 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase; GST)를 포함하는 pGEX-bgpA를 제조하였다. E.coli C41(DE3)(Lucigen Corporation, USA)에 상기 제조한 벡터를 형질전환시켜 유전자를 발현시켰다. 본 발명에 사용한 다른 화학물질은 적어도 분석시약 등급(analytical reagent grade)의 것을 사용하였으며, 출처는 방법 부분에 각각 표기하였다.

실시예 2: β- 글루코시다제의 제조

E. coli 배양을 위하여 앰피실린(ampicillin; 50 μg/ml)을 첨가한 LB(Luria-Bertani) 배지를 사용하였다. 배양물을 600 nm에서 흡광도가 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, 이후 온도를 20℃로 낮추었다. 배지의 pH는 50 mM 인산나트륨을 이용하여 7.5로 조절하였다. 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside; IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 25℃에서 12시간 더 배양하고 4℃에서 5,000×g로 20분간 원심분리하여 균체(bacterial cell)를 회수하였다. 상기 회수한 균체를 50 mM 인산염완충액(pH 7.5)으로 현탁시킨 후 초음파처리(Vibra-cell, Sonics & Materials, CT)하여 파쇄하였다. 조효소(crude enzyme)의 상등액을 회수하기 위하여 수득한 용해물을 20,000×g로 4℃에서 30분간 원심분리하였다. 수득한 조효소는 50 mM 인산염완충액으로 원하는 농도로 희석시켜 진세노사이드의 생물전환에 이용하였다.

본 발명자들은 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082^T로부터 β-글루코시다제 유전자(1947 bp; 서열번호 2)를 복제하여 과발현시키고 이를 특성화하는 방법을 보고한 바 있다(An, D. S. et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 2010, 76: 5827-5836). 활성형 및 가용성 β-글루코시다제를 생산하기 위한 최상의 조건을 찾기 위하여, 다양한 농도의 IPTG 및 온도 조건 하에서 실험하였다. 50 mM 인산나트륨 완충액으로 pH를 7.5로 조절하고 1%(w/v) 글루코스를 포함하는 배지에 배양온도를 20℃로 하여 배양하였을 때, 단백질 발현이 최대화되었다. 또한 β-글루코시다제 대부분이 가용성 형태로 발현되었다. β-글루코시다제를 과발현시킨 세포의 습윤 펠렛(wet pellet)을 10 부피(w/v)의 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5)에 재현탁시켜 세포를 초음파처리기로 파쇄하였다. 12,500×g로 30분간 원심분리하여 세포 파편(debris)을 제거하고, 상층액을 진세노사이드 생물전환을 위한 조효소로 사용하였다.

실시예 3: PPT 타입 진세노사이드 Re 및 Rg1 혼합물의 조혼합물( crude mixture)의 제조

건조 고려삼(Korean ginseng; Panax ginseng, C. A. Meyer) 및 회기삼(American ginseng; Panax quinquefolius) 뿌리 분말 혼합물(4:1, w/w)을 이용하여 진세노사이드를 추출하였다. 10 kg의 인삼 뿌리 분말을 100 L의 70% 에탄올로 2회 반복 추출하였다. 추출물은 거름종이로 여과하여 회전증발기(rotary evaporator)로 건조시켰다. 생성된 건조 분말을 물에 녹여 Diaion HP-20 수지를 채운 유리컬럼(400 mm 길이×100 mm 직경)에 로딩하였다. 비드에 흡착된 HP-20으로부터 자유 설탕 분자(free sugar molecule) 및 원하지 않는 친수성 화합물을 8 컬럼 부피의 물로 세척한 후, PPT 타입 진세노사이드를 4 컬럼 부피의 40% 에탄올로 용출시켰다. 에탄올 추출물을 진공에서 증발시키고 남은 건조 잔류물을 β-글루코시다제를 이용한 희귀 진세노사이드 F1 생산을 위한 기질 진세노사이드(substrate ginsenoside)로 사용하였다. HPLC 분석에 따르면, 혼합물은 32.4% Rg1, 31.9% Re, 6.6% Rb1, 6.2% Rd 및 6.0% Rc로 구성되었다. 상기 진세노사이드 조혼합물(crude ginsenoside mixture)을 PPTx라 명명하고 본 발명의 효소반응의 최적화 및 F1 생산에 사용하였다. 효소반응을 위하여 50 mM 인산염완충액에 녹인 PPTx는 최고 100 mg/ml의 용해도를 갖는다.

순수한 진세노사이드 Re는 소수성으로 인해 50 mM 인산완충액(pH7.5)에 용해되기 어렵다. 따라서, β-글루코시다제는 단지 낮은 농도(0.2 mg/ml 미만)의 순수한 Re만을 가수분해할 수 있다. 반면, 진세노사이드 Rg1은 50 mM 인산완충액에 쉽게 용해되므로, 고농도(100 mg/ml)에서도 β-글루코시다제에 의해 F1으로 쉽게 가수분해될 수 있다. 한편, 흥미롭게도, Re의 용해도는 Re와 Rg1이 공존할 때, 증가될 수 있다. 이에 따라, 진세노사이드 Re에 대한 β-글루코시다제의 가수분해활성 또한 향상될 수 있다.

본 발명에서는 상기 에탄올 추출 과정을 통해 10 kg의 인삼 혼합 분말로부터 2,894 g의 조인삼추출물(crude ginseng extract)을 수득하였다. 상기 수득한 조인삼추출물은 셋으로 균등하게 나누어 그 중 일 분획을 HP-20 수지를 채운 유리 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 물로 세척하여 원치않는 분획을 제거한 후, 40% 에탄올로 용출시켜 62 g의 PPTx를 수득하였다.

실시예 4: PPT 타입 진세노사이드에 대한 β-글루코시다제의 기질 특이성

효소의 생물전환 활성을 확인하기 위하여 37℃에서 40 mg/ml의 조효소를 동일한 부피의 50 mM 인산나트륨완충액(pH 7.5)을 이용하여 최종 농도 0.1%(w/v)로 제조한 표준 PPT 타입 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, F1 및 Rh1 용액과 반응시켰다. 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 시료를 회수하여 선처리 후 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였다.

본 발명의 β-글루코시다제의 PPT 타입 진세노사이드에 대한 생물전화 과정에서의 가수분해 경향을 찾기 위하여, 정제된 효소를 표준 PPT 타입 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1 및 F1과 반응시켰다. 상기 β-글루코시다제에 의한 상기 진세노사이드의 가수분해 산물은 TLC로 확인하였다(도 1). 도 1에 나타낸 바와 같이, 조 β-글루코시다제는 진세노사이드 Re 및 Rg1 모두를 각각 F1으로 가수분해 하였다. 상기 F1은 β-글루코시다제의 농도가 증가되거나 반응기간이 연장되었을 때, PPTA로 더 가수분해되었다. 나아가, Rg2 및 Rh1 역시 직접 PPTA로 가수분해되었다. 본 효소반응의 기질 및 반응 생성물의 관계를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, β-글루코시다제의 공지된 활성인 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해하는 PPD 타입 진세노사이드에 대한 작용 모드와는 달리, PPT 타입 진세노사이드에 대하여 6번 및 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, β-글루코시다제는 PPD 타입 진세노사이드에 대해서, 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 가수분해 함에 있어서, 두 개의 글루코스가 연달아 치환된 경우 말단에 위치한 모이어티부터 하나씩 차례로 가수분해시킬 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 3번 및 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티가 치환된 진세노사이드 Rb1을 본 발명의 β-글루코시다제로 가수분해시키는 경우, 20번 탄소의 히드록시기에 각각 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티는 손상되지 않은 채로 3번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 2개의 글루코스 모이어티가 말단으로부터 차례로 가수분해 됨으로써 각각 지페노사이드 XVII 및 LXXV를 생산하는 것이 관찰되었으며, 최종적으로 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 차례로 연결된 2개의 글루코스 모이어티 중 말단에 위치한 하나의 글루코스 모이어티를 가수분해하여 컴파운드 K를 생산할 수 있었다(An, D. S. et al ., Appl . Environ. Microbiol ., 2010, 76: 5827-5836). 그러나 본 발명에서 β-글루코시다제를 PPT 타입 진세노사이드의 가수분해에 적용한 결과, Rg1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Re의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rg1 및 Re 모두로부터 F1을 생산할 수 있음을 확인하였다. 나아가 상기 F1의 20번 탄소의 히드록시기에 치환된 글루코스 모이어티를 추가로 가수분해하여 PPTA를 제조할 수 있었다. 또한 유사한 메커니즘에 의하여 Rh1의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 단일 글루코스 모이어티를 가수분해시킬 뿐만 아니라, Rg2의 6번 탄소의 히드록시기에 치환된 말단에 위치한 람노스 모이어티에 의해 보호된 글루코스 모이어티를 직접 가수분해시켜 상기 진세노사이드 Rh1 및 Rg2 모두로부터 직접 PPTA를 생산할 수 있음을 확인하였다. 상기 본 발명의 β-글루코시다제는 람노시다제 활성을 갖지 않으므로, 상기 Re 및 Rg2를 가수분해하여 각각 F1 및 PPTA로 전환하는 것은 외부의 람노스로부터 내부의 글루코스를 순차적으로 가수분해하는 것이 아니라, 직접 내부의 글루코스를 가수분해하는 것이다. 이는 본 발명의 β-글루코시다제가 직접 이당(disaccharide)을 가수분해할 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: 반응조건의 최적화

PPTx를 F1으로 생물전환시키기 위한 최적의 조건을 찾기 위하여 반응에 사용한 PPTx의 기질 농도를 변화시키며 최적화하였다.

5.1. 기질 농도의 최적화

조 β-글루코시다제(crude β-글루코시다제) 농도를 40 mg/ml로 고정시키고 동일한 부피의 10, 20, 30, 40, 50 및 100 mg/ml(도 3에는 5, 10, 15, 20, 25, 50) 농도의 PPTx와 반응시켰다. 시료를 일정한 시간 간격으로 채취하여 HPLC로 분석하였다.

상기 HPLC 분석 결과를 도 3에 나타내었다. HPLC 분석을 통해 생성된 F1을 정량한 결과, 동일한 부피의 효소와 기질용액을 혼합한 반응액에서 조 β-글루코시다제 농도를 20 mg/ml로 고정하였을 때, 최적 PPTx 농도는 25 mg/ml로 결정되었다. 즉, 40 mg/ml의 조 β-글루코시다제를 동일한 부피의 50 mg/ml PPTx 용액과 혼합하였을 때 최적의 효율로 F1을 생산할 수 있었다. 한편, 배양 2일째부터는 PPTA의 생산이 증가하기 시작하였다.

5.2. NaCl 농도의 최적화

수용액에서 난용성인 PPTx의 용해도를 증가시키기 위하여 사용하는 NaCl의 효과를 확인하였다. 200, 500 및 1000 mM NaCl을 포함하는 효소반응에서 20 mg/ml의 고정된 효소농도에서 PPTx로부터 F1으로의 전환을 시험하였다.

PPTx의 용해도 및 효소활성을 증가시키기 위한 최적의 NaCl 농도를 찾기 위하여, 고정농도 20 mg/ml의 효소를 이용하여 F1 생산에 대한 200, 500 및 1000 mM 농도의 NaCl의 영향을 확인하였다. 두 가지 기질(Re 및 Rg1) 및 생산물(F1 및 PPTA)의 시간대별 변화(time course change)를 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 반응 1일째부터 반응 일수에 따른 반응 기질 및 생산물의 비율을 나타낸 도이다. 반응 1일 후 Rg1은 더이상 검출되지 않았다. 즉, Rg1은 쉽고 빠르게 F1으로 전환되었음을 나타낸다. NaCl 농도에 따라 F1의 생산 속도가 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나, 500 mM 또는 그 이상의 농도에서 더이상 F1의 생산량이 크게 증가하지 않으므로 본 발명에서는 3일째에 F1 농도가 최대에 이르는 200 mM NaCl을 최적 조건으로 결정하였다.

실시예 6: 대규모( scale - up ) 생물전환에 의한 F1의 생산

대규모 생물전환을 위해 5 L 교반-탱크 반응기(KoBioTech Co., Korea)에서 2.4 L 작업부피로 37℃에서 72시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 상기 반응은 실시예 5에서 실험적으로 결정한 최적화된 기질 및 NaCl 농도 조건 하에서 수행되었다. 구체적으로, 반응 혼합물은 25 mg/ml 농도의 기질 PPTx, 20 mg/ml β-글루코시다제 및 200 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 인산염완충액(pH 7.5)으로 구성되었다. 일정한 시간 간격으로 시료를 채취하여 HPLC로 분석하면서 진세노사이드 PPTx로부터 F1으로의 생물전환을 확인하였다.

상기 실시예 5에서 결정한 최적의 반응조건 즉, 25 mg/ml 기질농도, 200 mM NaCl 및 20 mg/ml 효소농도에서 2.4 L 규모의 효소반응을 수행하였다. PPTx 중 주요 기질의 하나인 Rg1은 반응 6시간째부터 빠르게 반응물로부터 사라지면서 F1으로 전환된 반면, Re는 점차적으로 사라지면서 F1으로 전환되었다(도 5). 추가적인 반응은 β-글루코시다제에 의한 가수분해 최종 산물인 PPTA의 생산을 증가시키므로 F1의 생산을 원하는 경우 3일째에 반응을 중단시키고 상등액을 회수하였다.

실시예 7: 생산된 진세노사이드 F1의 정제

상기 실시예 6의 결과로 수득한 PPTx와 β-글루코시다제의 2.4 L 반응 혼합물을 4℃로 식히고 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 상층액과 침전 중의 대사물을 각각 분리하였다. 상층액 중의 진세노사이드의 조성은 동일한 부피의 수용액-포화 부탄올로 진세노사이드 추출 후 HPLC로 확인하였다. 침전물은 1.5 L의 70% 에탄올로 2회 용해시키고 거름종이(Advantec, Japan)를 통해 여과시켰다. 에탄올 추출물은 함께 모아 진공으로 증발시켰다. 그 결과로 수득한 분말을 50% 메탄올에 녹이고 ODS 수지(octadecylsilyl resin)(ZEOprep 60C₁₈ 40-63 μm, ZEOCHEM)를 채운 역상 실리카겔 컬럼(Biotage 180×70 φ mm)에 로딩하였다. 메탄올의 비율을 100%까지 증가시키면서 F1을 용출시켰다.

상기 상층액과 침전을 분리하여 HPLC로 진세노사이드 F1 함량을 확인한 결과, 상층액 중에는 매우 적은 양의 진세노사이드 F1만이 존재하므로 제거하고, 침전으로부터 진세노사이드 F1을 정제하였다. 상기 에탄올 추출 및 컬럼 정제과정을 통해 9.6 g의 진세노사이드 F1(HPLC 순도 95.3%)을 회수하였다.

본 발명에 따른 진세노사이드 F1 제조의 각 과정에서 얻어진 생산물의 중량, 순도 및 회수율을 표 1에 나타내었다.

실시예 8: 분석방법

상기 생물전환에 사용된 기질 및 반응 결과로 수득한 생성물 중의 진세노사이드의 조성을 분석하기 위하여, 반응 혼합물을 동일한 부피의 수용액-포화 n-부탄올로 추출하였다. 그 결과로 수득한 n-부탄올 분획을 건조시까지 증발시켰다. 잔여물(residual material)을 메탄올에 녹여 TLC 및/또는 HPLC로 분석하였다.

8.1. 박막크로마토그래피 ( thin - layer chromatography ; TLC ) 분석

용매로는 클로로포름(chloroform), 메탄올 및 물을 65:35:10의 부피비로 혼합한 용매를 사용하고, 60F₂₅₄ 실리카겔 플레이트(Merck, Germany)를 이용하여 TLC를 수행하였다. TLC 플레이트 상의 스팟은 10%(v/v) 황산을 분무하고 110℃에서 5분간 가열하여 가시화한 후 표준 진세노사이드의 것과 비교하여 동정하였다.

8.2. 고성능 액체 크로마토그래피( high - performance liquid chromatography ; HPLC) 분석

진세노사이드의 HPLC 분석은 4용매 펌프(quaternary pump), 자동주입기, 단일파장 UV 검출기(모델 730D) 및 피크 동정(identification) 및 통합(integration)을 위한 Younglin's Auto Chro 3000 소프트웨어를 구비한 HPLC 시스템(Younglin Co. Ltd., Korea)을 이용하여 수행하였다. 보호컬럼(guard column; Eclipse XDB C₁₈, 5 μm, 12.5×4.6 mm 내경)을 구비한 Prodigy ODS(2) C₁₈ 컬럼(5 μm, 150×4.6 mm 내경) 상에서 분리를 수행하였다. 이동상으로는 아세토니트릴(용매 A) 및 물(용매 B)을 혼합하여 사용하였다. 구배용리(gradient elution)를 17% 용매 A 및 83% 용매 B로부터 시작하여 하기와 같이 변화시켰다: 12 내지 20분에 걸쳐 용매 A를 17%로부터 25%로, 20 내지 30분에 걸쳐 25%로부터 32%로, 30 내지 35분에 걸쳐 32%로부터 55%로, 35 내지 40분에 걸쳐 55%로부터 60%로, 40분 내지 45분에 걸쳐 60%로부터 80%로, 45분 내지 50분에 걸쳐 80%로부터 100%로 증가시키고 50 내지 54분에는 100% 용매 A로, 54.0 내지 54.1분에 걸쳐 용매 A의 비율을 100%로부터 17%로 다시 감소시킨 후 54.1분으로부터 65분까지 17% 용매 A로. 유속은 1.0 ml/min으로 고정하였고, 203 nm에서 흡광도를 측정하여 검출하였다. 주입한 시료의 부피는 25 μl이다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC19421

20090915

서열목록 전자파일 첨부

Claims

PPT 타입의 제1 진세노사이드로부터 탈글라이코실화된 PPT 타입의 제2 진세노사이드를 제조하는 방법에 있어서,
PPT 타입의 제1 진세노사이드에 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 테라박터 속 미생물은 테라박터 진세노시디뮤탄스 Gsoil3082^T(Terrabacter ginsenosidimutans Gsoil3082^T)인 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제는 서열번호 1의 폴리펩티드 서열을 갖는 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 처리하는 단계는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물로 처리하는 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 삼, 삼 추출물 또는 삼 또는 이의 추출물을 포함하는 식품의 형태인 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제를 처리하는 단계는 PPT 타입 제1 진세노사이드의 총 중량과 1:0.6 내지 1:1의 중량비로 β-글루코시다제를 사용하는 것인 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 PPT 타입의 제1 진세노사이드는 각각 하기 화학식 3 내지 7의 구조식을 갖는 진세노사이드 Re, Rg1, Rg2, Rh1 또는 F1 또는 이들의 혼합물인 것인 제조방법.
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]
제1항에 있어서,
상기 PPT 타입의 제2 진세노사이드는 각각 하기 화학식 7 및 8의 구조식을 갖는 진세노사이드 F1 또는 PPTA 또는 이들의 혼합물인 것인 제조방법.
[화학식 7]

[화학식 8]
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 6번 탄소에 위치한 치환 또는 비치환된 글루코스 모이어티를 가수분해하는 것인 제조방법.
제9항에 있어서,
진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1로의 전환, 진세노사이드 Rg2로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환 및 진세노사이드 Rh1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환으로 이루어진 군에서 선택된 전환반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 β-글루코시다제는 PPT 타입의 제1 진세노사이드의 20번 탄소에 위치한 글루코스 모이어티를 가수분해하는 것인 제조방법.
제11항에 있어서,
진세노사이드 F1로부터 진세노사이드 PPTA로의 전환반응을 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는, PPT 타입 진세노사이드(protopanaxatriol-type ginsenoside)의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 진세노사이드로의 전환용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제(β-glucosidase)는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 또는 이들의 배양물인 것인 조성물.
테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 천연 또는 재조합 β-글루코시다제 단백질; β-글루코시다제(β-glucosidase)를 발현하는 테라박터 속(Terrabacter sp .) 미생물, 테라박터 속(Terrabacter sp .) 유래의 β-글루코시다제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 도입시킨 형질전환체; 이들의 배양물 또는 이들의 혼합물 및 PPT 타입 진세노사이드 또는 삼을 포함하는 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제.
제15항에 있어서,
상기 식품은 발효식품인 것이 특징인 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제.
제15항에 있어서,
PPT 타입 진세노사이드 또는 삼내 PPT 타입 진세노사이드가 β-글루코시다제에 의해 가수분해된 것이 특징인 식품, 식품첨가제, 사료 또는 사료첨가제.