KR101159626B1

KR101159626B1 - 크론병 항체 에피토프 펩티드 및 크론병의 검사시약

Info

Publication number: KR101159626B1
Application number: KR1020077002725A
Authority: KR
Inventors: 미키오 니와; 카츠히코 마츠오; 케이이치 미츠야마; 미치오 사타
Original assignee: 구루메 다이가쿠; 도아고세이가부시키가이샤
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2012-07-19
Also published as: JPWO2006013661A1; ES2328261T3; EP1780215A4; WO2006013661A1; DE602005014990D1; KR20070037635A; CN101654474B; CN101654474A; EP1780215A1; US20090170115A1; ATE433991T1; EP1780215B1; JP4597132B2; CN101031581A; US7985831B2

Abstract

크론병 환자에게 특이적으로 확인되는 크론병 특유의 항체에 대하여 특이적인 결합성을 갖는 에피토프 펩티드 및 이것을 이용하여 크론병의 이환의 유무를 간편하고 또한 신속하게 검출하는 검사방법을 제공한다.

배열번호 1~3으로 나타내어지는 어느 하나의 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그 염으로 구성되는 크론병 항체 에피토프 펩티드, 및 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 크론병의 검사시약 및 검사방법.

Description

크론병 항체 에피토프 펩티드 및 크론병의 검사시약{CROHN'S DISEASE ANTIBODY EPITOPE PEPTIDE AND REAGENT FOR TESTING CROHN'S DISEASE}

본 발명은, 크론병의 진단에 유효한 펩티드 및 그것을 유효성분으로 하는 검사시약에 관한 것이다. 본 검사시약은, 혈액 등의 생체시료를 이용하여 면역학적 방법에 의해 간편하고, 신속하게 실시할 수 있는 크론병의 검사방법에 사용할 수 있다.

크론병은 원인 불명이며, 궤양성 대장염과 함께 염증성 장질환이라고 불린다. 젊은 사람(10대 후반~20대 초반)에게 복통, 설사, 체중 감소, 발열 등이 지속적으로 보여질 때에 의심해야 할 질환이지만, 진단은 임상증상, X선 조영, 및 내시경 검사 또는 병리학적 검사 등을 조합해서 행해지고 있다. 그러나, 이들 방법은 경험과 숙련된 기술을 요하기 때문에, 진단에 고려되는 증례도 보여진다. 특히 발병 초기에 있어서, 크론병과 궤양성 대장염의 감별이 곤란한 증례가 많다. 한편, 진단의 중심적 방법인 소화관 조영검사나 내시경 검사는, 환자의 육체적 혹은 정신적 고통을 준다고 하는 결점이 있고, 그러므로, 크론병을 간편하고 정밀도 좋게 판별할 수 있는 체외 진단약?방법이 요구되고 있다.

염증성 장질환의 병의 원인으로서, 예로부터 세균, 바이러스 및 식이성 항원 등의 외인성 인자가 장관염증에 관여한다라는 보고가 있다. 크론병에서는 특히 Mycobacterium paratuberculosis의 감염?검출예의 보고(비특허문헌1~4 등)나 빵효모 및 호중구에 대한 항체 검출예의 보고(비특허문헌5 및 6 등), 항돼지 아밀라아제 항체 검출예 또는 크론병 항체 결합성 펩티드에 대한 항체 검출예의 보고가 되어 있다(특허문헌1 및 2 참조). 이들 중에는 질환 특이적 항체로 보고되어 있는 것도 있지만, 단독으로 충분한 크론병 환자 양성율을 나타내는 것은 없고, 감별이 필요로 되는 궤양성 대장염의 위양성율이 높다는 등의 문제점도 존재한다. 이상과 같은 시점에서, 크론병에 특이적인 항원 펩티드를 응용하여, 크론병의 특이적인 진단을 간편하고, 신속하고 정밀도 좋게 실시할 수 있는 임상검사방법을 개발하는 것은, 매우 의미있는 일이라고 할 수 있다.

특허문헌1: 일본 특허공개 평11-190734호 공보(특허청구의 범위)

특허문헌2: 국제 공개 제02/088175호 팸플릿(발명의 개시)

비특허문헌1: Elsaghier A, et al. Clin Exp Immunol., 1992, 90, 503-508

비특허문헌2: El-Zaatari F.A. et al. Curr Microbiol., 1999, 39, 115-119

비특허문헌3: Naser S, et al. Vet Microbiol., 2000, 77, 497-504

비특허문헌4: Suenaga K, et al. Dig Dis Sci., 1999, 44, 1202-1207

비특허문헌5: Quinton J F, et al. Gut, 1998, 42, 788-791

비특허문헌6: Peeters M,et al. Am J Gastroenterol., 2001, 96, 730-734

발명의 목적은, 상술한 바와 같은 상황을 기초로 해서, 크론병 환자에게 특이적으로 확인되는 크론병 특유의 항체에 대하여 특이적인 결합성을 갖는 에피토프 펩티드, 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 검사시약 및 검사키트, 및 이들을 이용하여 크론병의 이환의 유무를 간편하고 또한 신속하게 검출하는 검사방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 면역학적, 분자 생물학적 연구를 반복한 결과, 특정의 펩티드가 크론병 환자 혈청중에 존재하는 특유의 항체를 특이적으로 인식해서 결합되는 것을 발견하고, 이들 에피토프 펩티드를 이용함으로써 크론병의 이환의 유무를 간편하고, 또한 정밀도 좋게 판별할 수 있는 것을 확인했다. 즉, 본 발명은 하기 [1]~[4]에 기재하는 것이다.

[1] 크론병 항체 에피토프로서의 성질을 갖는 하기 펩티드(a) 또는 (b)이다.

(a) 배열번호 1~3 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그 염.

(b) 배열번호 1~3중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 배열에 있어서의 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가에 의해 개변된 아미노산 배열을 갖고, 또한 크론병 환자 혈청중의 항체와 결합성을 갖는 펩티드 또는 그 염.

[2] 크론병 항체 에피토프로서의 성질을 갖는 상기 펩티드(a) 또는 (b)를 유효성분으로서 함유하는 크론병의 검사시약.

[3] 상기의 크론병 검사시약을 크론병 항체에 대한 항원물질로서 함유하는 크론병의 검사키트.

[4] 생체시료 중의 상기 펩티드(a) 또는 (b)에 결합성을 갖는 항체의 유무를 검출하는 공정을 포함하는 크론병의 검사방법.

이하, 본 명세서에 있어서의 아미노산, 펩티드, 염기 배열 등의 약호에 의한 표시는 IUPAC, IUB의 규정, 「염기 배열 또는 아미노산 배열을 포함하는 명세서 등에 작성을 위한 가이드 라인」(특허청 편) 및 상기 분야에 있어서의 관용기호에 따른다.

또한, 본 명세서에 있어서의 크론병 항체란, 상기와 같이 크론병의 이환에 의해 생체내에서 생성되는 크론병 특유의 항체이며, 원인이 되는 항원물질의 종별에 관계없이, 크론병 환자에게 특이적으로 확인되는 크론병 환자 특유의 항체를 의미하는 것이다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면, 크론병에 이환된 환자에게 특유하게 확인되는 크론병 항체에 특이적인 결합성을 갖는 크론병 항체 에피토프 펩티드가 크론병의 진단에 있어서의 검사시약 또는 검사키트가 되고, 크론병 이환의 유무를 간편하고, 또한 신속하고 정밀도 좋게 검출 및 측정가능하며, 유익한 크론병의 검사방법이 된다.

[도 1] 실시예1에서 얻어진 크론병 항체 에피토프 펩티드(TCP-47, TCP-336, TCP-353)에 대해서, 크론병(CD로 약기, 32예), 궤양성 대장염(UC로 약기, 32예)의 환자 혈청 및 건강인 혈청 32예에 대한 반응성을 ELISA에 의해 측정하고, 결과를 산포도로서 나타낸 도면이다. 도면 중, *, **, ***, ****은 각각의 펩티드와 크론병 환자 혈청의 반응성을 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강인 혈청과의 반응성과 비교했을 때의 통계학적 유의차를 나타낸다(*:p<0.05, **:p<0.01, ***:p<0.001, ****:p<0.0001; Mann-Whitney의 U검정). 또한 점선은 컷오프값을 나타낸다.

[도 2] TCP-47 또는 TCP-336을 이용한 ELISA에서의 ROC커브를 나타낸다. 크론병 환자 혈청 32예와, 건강인 혈청 32예를 사용한 ELISA 측정값으로부터 Sensitivity 및 1-specificity를 구하고, 각각 세로축 및 가로축에 플롯한 도면이다. 도면 중, 화살표는 컷오프값을 나타낸다.

[도 3] TCP-353에 대해서, 크론병(CD, 60예), 궤양성 대장염(UC, 109예), 급성장염(11예), 대장암(35예), 만성 간질환(49예)의 환자 혈청 및 건강인 혈청 71예에 대한 반응성을 ELISA에 의해 측정하고, 결과를 산포도로서 나타낸 도면이다. 도면 중, **, ****은 TCP-353과 크론병 환자 혈청의 반응성을 각종 환자 혈청 및 건강인 혈청과의 반응성과 비교했을 때의 통계학적 유의차를 나타낸다(**:p<0.01, ****:p<0.0001; Mann-Whitney의 U검정). 또한 점선은 컷오프값을 나타낸다.

[도 4] TCP-353을 이용한 ELISA와 ASCA-IgG ELISA의 비교 결과를 나타낸다. 크론병(CD, 60예), 궤양성 대장염(UC, 109예), 급성장염(11예), 대장암(35예), 만성 간질환(49예)의 환자 혈청 및 건강인 혈청 71예에 대한 반응성을 ELISA에 의해 측정하고, 결과를 산포도로서 나타낸 도면이다. 또한 점선은 컷오프값을 나타낸다.

[도 5] TCP-353을 이용한 ELISA와 ASCA-IgG ELISA의 상관을 나타내는 도면이다. 크론병 환자 혈청의 ASCA-IgG ELISA에 있어서의 측정값을 세로축에, TCP-353 ELISA의 측정값을 가로축에 플롯한 산포도이다. r은 상관계수를 나타낸다.

[도 6] TCP-353을 이용한 ELISA와 cocktail-MAP ELISA의 비교 결과를 나타낸 다. 크론병(CD, 60예), 궤양성 대장염(UC, 109예), 급성장염(11예), 대장암(35예), 만성 간질환(49예)의 환자 혈청 및 건강인 혈청 71예에 대한 반응성을 ELISA에 의해 측정하고, 결과를 산포도로서 나타낸 도면이다. 또한 점선은 컷오프값을 나타낸다.

[도 7] TCP-353을 이용한 ELISA와 cocktail-MAP ELISA의 상관을 나타내는 도면이다. 크론병 환자 혈청의 cocktail-MAP ELISA에 있어서의 측정값을 세로축에, T CP-353 ELISA의 측정값을 가로축에 플롯한 산포도이다. r은 상관계수를 나타낸다.

[도 8] 단백질 데이터 베이스로부터 BLAST검색에 의해 판명된, TCP-47과 아미노산 배열에 상동성이 있는 단백질을 나타낸 도면이다. 도면 중 │은 아미노산이 일치하는 것을, :은 유사성이 있는 것을 나타낸다.

[도 9] 단백질 데이터 베이스로부터 BLAST검색에 의해 판명된, TCP-336과 아미노 배열에 상동성이 있는 단백질을 나타낸 도면이다. 도면 중 │은 아미노산이 일치하는 것을, :은 유사성이 있는 것을 나타낸다.

[도 10] 단백질 데이터 베이스로부터 BLAST검색에 의해 판명된, TCP-353과 아미노산 배열에 상동성이 있는 단백질을 나타낸 도면이다. 도면 중, │은 아미노산이 일치하는 것을, :은 유사성이 있는 것을 나타낸다.

1. 크론병 항체 에피토프 펩티드

본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드로서, 구체적으로는 배열번호 1~3 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 배열인 펩티드를 예시할 수 있다.

또한 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드에는, 배열번호 1~3 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 외에, 배열번호 1~3의 각각의 아미노산 배열에 있어서, 그 아미노산 배열 중의 1 또는 복수개(2개 이상)의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환, 결실 또는 부가되어 있어도 좋다. 이들 각각의 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 개변된 아미노산 배열 또는 그들 아미노산 배열의 일부의 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 특이적인 결합성을 갖는 펩티드도 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드로서 포함된다.

상기의 펩티드는 모두 크론병 항체에 대하여 특이적인 결합성을 갖음으로써 특징지을 수 있다.

아미노산의 치환, 결실 혹은 부가의 정도 및 그들의 위치 등은, 개변된 펩티드가 배열번호 1~3으로 나타내어지는 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 펩티드와 마찬가지로, 크론병 항체에 대하여 특이적으로 결합성을 갖는 특징을 구비한 것이면 특별히 제한되지 않는다.

돌연변이나 번역후의 수식 등으로, 아미노산 배열의 개변(변이)은 발생하는 일도 있지만, 인위적으로 개변할 수 있다. 또한, 아미노산 배열의 개변(변이)방법은, 당업자에게 있어서 주지의 기술이다(사이트 스페시픽 뮤터제네시스 등의 유전자 공학적 방법 〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382(1987); 동100, 468(1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441(1984); 속생화학 실험 강좌1 「유전자 연구법II」〕, 인산트리에스테르법이나 인산아미다이트법 등의 화학 합성수단 〔 J.Am.Chem.Soc., 89, 4801(1967); 동91, 3350(1969); Science, 150, 178(1968); Tetrahedoron Lett., 22, 1859(1981); 동24, 245(1983)〕).

또한, 배열번호1, 배열번호2 또는 배열번호3으로 나타내어지는 아미노산 배열의 펩티드를 비롯한 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드는, C말단이 카르복실기(-COOH), 아미드기(-CONH₂) 또는 에스테르기(-COOR) 중 어느 것이여도 좋다. 여기에서 에스테르기에 있어서의 R로서는, 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸 등의 탄소수 1~6의 알킬기나, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 탄소수 3~8의 시클로알킬기나, 페닐, α-나프틸 등의 탄소수 6~12의 아릴기 등이 이용된다.

본 발명에서 이용되는 펩티드가 C말단 이외에 카르복실기를 갖고 있는 경우, 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 펩티드에 포함된다. 이 경우의 에스테르로서는, 예를 들면 상기와 같은 C말단의 에스테르 등이 이용된다.

또한 본 발명의 펩티드에는, N말단의 아미노산 잔기의 아미노기가 보호기(예를 들면, 포르밀기, 아세틸기 등의 탄소수 1~6의 아실기 등)로 보호되어 있는 것, 생체내에서 절단되어서 생성되는 N말단의 글루타민 잔기가 피로글루타민산화된 것, 분자내의 아미노산의 측쇄상의 치환기(예를 들면 수산기, 메르캅토기, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등)가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 혹은 당쇄가 결합된 소위 당펩티드 등의 복합 펩티드 등도 포함된다.

상기와 같은 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드는 면역학적으로, 항체의 인식성에 요하는 최소한의 아미노산 수가 4개라고 여겨지고 있다는 점에서, 크론병 환자에게 확인되는 크론병 항체에 대하여 특이적인 결합성 및 인식성을 갖는 한, 그 아미노산 수는 4개 이상이지만 상한은 특별히 제한되지 않는다. 통상, 펩티드 합성 등의 화학 합성의 관점에서, 4~500개 정도의 아미노산 수를 예시할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드의 염으로서는, 생리학적으로 허용되는 산이나 염기와의 염이 이용된다. 이러한 염으로서는, 예를 들면 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산 등의 무기산과의 염, 혹은 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레인산, 숙신산, 주석산, 구연산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산 등의 유기산과의 염 등이 이용된다. 그 밖에, 예를 들면 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속염, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토류 금속염, 모노메틸아민, 트리에틸아민 등의 아민염, 트리메틸에틸암모늄, 테트라메틸암모늄 등의 제4급 암모늄염 등의 염을 들 수 있다.

이하에, 배열번호 1~3 중 어느 하나로 나타내어지는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그 염, 및 배열번호 1~3의 각각에서 그 아미노산 배열 중의 1 혹은 복수개(2개 이상)의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가에 의해 개변된 아미노산 배열 또는 그들 아미노산 배열의 일부의 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 항체에 특이적인 결합성을 갖는 펩티드 또는 그 염 등의 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드 또는 그 염(이하, 총칭해서 크론병 항체 에피토프 펩티드라고도 한다)의 취득방법 또는 제조방법을 상세하게 서술한다.

2. 크론병 항체 에피토프 펩티드의 취득

본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드는, 디스플레이 파지의 라이브러리(게놈 라이브러리, cDNA 라이브러리 혹은 랜덤 펩티드 라이브러리)를 이용한 스크리닝 방법에 의해 취득할 수 있다. 이러한 스크리닝법은 파지 디스플레이법이라고 불리고, 많은 당업자에 의해, 외래성 항원 에피토프를 파지 표면 단백질에 융합시켜서 파지 표면에 발현 유도시키고, 항체 등의 프로브에 의해 선별하는 공지의 수단으로서 이용되고 있다(Scott J.K. and Smith G.P., Science, 249, 386-390(1990), Dybwad A., et al, Clin Exp Immunol, 102, 438-442(1995), Bluthner M., et al, J Immunol Methods, 198, 187-198(1996)).

라이브러리에 이용되는 파지로서는, 섬유상 파지(M13, fi, fd, lf1 등, Smith G.P., et al, Science, 228, 1315-1317(1985), Devlin J.J., et al, Science 249, 404-406(1990), Cwirla S.E., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378-6382(1990))나 λ파지(Maruyama I. N., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8273-8277(1994), Santi E., et al, J Mol Biol, 296, 497-508(2000)), T7파지(US patent 5, 766, 905, Novagen T7Select System Manual TB178(2000)) 등을 들 수 있다. 라이브러리로서 파지 표면에 발현 유도시키는 단백질은, 공지의 유전자 조작 기술을 이용하여 게놈, cDNA, 랜덤 올리고 뉴클레오티드를 파지 표면 단백질을 코드하는 유전자의 상류 또는 하류에 크론화함으로써, 캡시드 융합 단백질로서 발현되고, 각각 게놈 라이브러리, cDNA 라이브러리, 랜덤 펩티드 라이브러리로서 이용 될 수 있다.

이러한 스크리닝법을 이용하여, 크론병 항체 에피토프 펩티드를 취득하는 구체적인 방법으로서, 본 발명에서 바람직하게는, cDNA 라이브러리를 이용한 이하의 방법을 들 수 있다.

우선, 대장암 세포 등의 배양세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 올리고(dT) 칼럼을 이용하여 폴리(A)⁺RNA를 정제한다. 이것을 기초로, 랜덤 올리고 뉴클레오티드(바람직하게는 8염기 정도)와 역전사효소를 이용하여 1개쇄 cDNA를 합성한다. 이어서, RNase H와 대장균 DNA polymerase에 의해 2개쇄 cDNA를 합성해서 링커 배열을 결합시키고, 다시 제한효소로 절단해서 점착 말단을 갖는 2개쇄 cDNA로 한다. 마지막에, 같은 제한효소로 절단한 파지 DNA와 상기 cDNA를 DNA리가아제에 의해 연결하고, in vitro packaging법에 의해 cDNA 라이브러리를 구축할 수 있다.

얻어진 cDNA라이브러리를 미리 단백질G 등을 통해 크론병 환자의 혈청항체를 고정화한 마이크로 플레이트 혹은 마이크로 비드 등에 첨가하고, 크론병 환자 혈청중 항체와 특이적으로 결합하는 파지를 포착시킨다. 마이크로 플레이트 등에 고정화시키는 크론병 환자의 혈청항체는 적어도 항원결합능력을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 크론병에 이환된 환자로부터 채취한 혈청 그 자체로도, 또한 상기 혈청을 황산암모늄용액으로 침강처리한 것이나 단백질A로 정제한 것이여도 좋다.

복수회의 조작을 반복함으로써, 결합능력을 갖지 않거나 또는 결합능력이 약 한 무관계인 파지를 세정?제거한 후, 도데실황산나트륨(이하, SDS로 약기) 등에 의해 고정화된 크론병 환자 혈청중 항체와 파지의 결합을 분해시켜, 크론병 환자 혈청중의 크론병 항체에 결합능력을 갖는 파지를 용출할 수 있다.

또한 크론병 환자 혈청항체에 특이성을 나타내는 파지를 선택하기 위해서, 상기에서 용출된 파지 현탁액을 숙주 대장균에 감염시키고, 단백질 발현 유도제(이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노시드 등)를 함유하는 LB 한천배지상에서 단일 플라크를 형성시킨다. 이들 플라크를 니트로셀룰로오스 멤브레인 등에 전사시키고, 크론병 환자 혈청을 사용한 면역염색을 실시함으로써 크론병 환자 혈청중 항체 결합 파지를 특정하고, 단일화할 수 있다.

이렇게 해서 얻어진 파지를 항파지 항체를 통해 마이크로 플레이트 등에 고정화하고, 크론병 환자, 궤양성 대장염 환자 혈청 및 건강인 혈청을 반응시켜서, 그 반응성으로부터 크론병 환자의 혈청중 항체에 특이적으로 반응하는 파지를 선별할 수 있다(이하, 파지 ELISA라고도 한다). 구체적으로는, 상기에서 얻어진 파지를 마이크로 플레이트 등의 임의의 지지체에 고정화한 항파지 항체와 반응시켜서 고정화한다. 그 고정화 파지에 대하여, 크론병 환자의 혈청 및 대조 혈청으로서 건강인의 혈청이나 궤양성 대장염이나 그 밖의 자기면역질환, 대장암, 급성장염, 위궤양 또는 십이지장궤양 등의 이환된 환자의 혈청을 반응시켜서, 그 반응성으로부터 크론병 환자의 혈청에 특이적으로 반응하는 파지를 선택할 수 있다.

상기한 바와 같이, 파지 ELISA에 의한 스크리닝으로 선별된 파지로부터, DN A를 추출 정제하고, 다이데옥시법 등에 의해 삽입 cDNA염기 배열을 결정할 수 있 다. 결정된 염기 배열에 기초해서, 아미노산 배열을 결정하고, 액상법 및 고상법에 의한 펩티드 합성법 등을 포함하는 일반적인 화학 합성법 등에 의해 합성함으로써, 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드로서 취득할 수 있다.

즉, 결정된 아미노산 배열에 기초해서, 스텝와이즈에로게이션법이나 프래그먼트 컨덴세이션법 등에 의해 화학 합성이 가능하다. 펩티드 합성법에서 이용되는 아미노산의 보호기의 이탈방법이나 축합방법 등은 종래 공지의 방법을 채용할 수 있고, 원하는 펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들면 M.Bodanszky 및 M.A.Ondetti, 펩티드 신세시스 Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York 1966년, Schroeder 및 Luebke, 더 펩티드 The Peptide, Academic Press, NewYork 1965년, 이즈미야 시노부 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주) 1975년, 야지마 하루아키 및 사카키바라 순페이, 생화학 실험 강좌1, 단백질의 화학IV, 205, 1977년, 야지마 하루아키 감수, 속의약품의 개발, 제14권, 펩티드 합성, 히로카와 서점 등에 기재된 방법을 들 수 있다.

또한, 결정된 아미노산 배열을 기초로, 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가에 의해 인위적으로 개변된 펩티드를 제작할 수 있다. 구체적으로는 상기의 사이트 스페시픽 뮤터제네시스 등의 유전자 공학적 방법이나 인산아미다이트법 등의 종래 공지의 화학 합성법에 의해 제작할 수 있고, 이들 개변 펩티드도 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드로서 이용할 수 있다.

또한 결정된 아미노산 배열을 기초로, 상동성을 갖는 펩티드 배열을 데이터베이스로부터 검색할 수 있다. 상동성이 높은 펩티드 혹은 그것을 함유하는 단백질 은 공지의 분자 생물학적 방법에 의해 제작할 수 있고, 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드로서 이용할 수도 있다.

상기한 바와 같이 해서 취득된 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드는, 종래 공지의 단백질 또는 펩티드의 분리?정제방법을 조합해서, 단리?정제할 수 있다. 이들 공지의 분리?정제방법으로서는, 염석이나 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 및 겔여과법 등의 주로 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피나 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 하전의 차를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속액체크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등이 이용된다. 또한 정제된 펩티드의 아미노산 조성은, 아미노산 분석장치에 의해 용이하게 측정 및 해석할 수 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 펩티드가 유리체인 경우에는, 공지의 방법 또는 그것에 준한 방법에 의해 적당한 염으로 변환시킬 수 있고, 반대로 염으로 얻어진 경우에는, 공지의 방법 혹은 그것에 준하는 방법에 의해 유리체 또는 다른 염으로 변환시킬 수도 있다.

3. 크론병의 검사시약, 검사키트 및 검사방법

상기한 바와 같이 해서 얻어진 크론병 항체 에피토프 펩티드는, 크론병 환자 혈청중의 크론병 항체와 특이적으로 결합되는 것을 이용해서, 상기 펩티드를 유효성분으로 하는 크론병의 검사시약, 검사키트 및 검사방법을 제공할 수 있다.

즉, 1) 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 크론병의 검 사시약, 2) 상기 1)의 검사시약을 함유하는 크론병의 검사키트, 3) 생체시료 중의 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드의 적어도 1개의 펩티드 또는 그 염에 특이적인 결합성을 갖는 항체의 유무를 검출하는 공정을 포함하는 크론병의 검사방법, 및 4) 상기 검사시약 또는 검사키트를 사용하는 공정을 포함하는 크론병의 검사방법이다.

1) 크론병의 검사시약

상기 크론병 항체 에피토프 펩티드를 유효성분으로서 사용하는 경우, 구체적인 유효성분은 상술의 (a)배열번호 1~3으로 나타내어지는 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그 염, 및 (b)배열번호 1~3으로 나타내어지는 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가에 의해 개변된 아미노산 배열 또는 그들 아미노산 배열의 일부의 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 크론병 환자 혈청중의 항체와 특이적인 결합성을 갖는 펩티드 또는 그 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 펩티드 또는 그 염이다.

크론병의 검사시약의 유효성분으로서, 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드 중 어느 1종류를 단독으로 사용할 수 있지만, 2종 이상을 임의로 조합해서 사용할 수도 있다.

본 발명의 크론병의 검사시약은, 크론병 항체와 특이적으로 결합하는 항원물질로서, 크론병 항체의 검출이나 포착 등에 사용할 수 있다. 따라서, 이 목적의 범위내에 있어서, 유효성분으로서 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드 뿐만 아니라, 상기 펩티드가 임의의 표지 화합물로 표지된 표지체(표지 펩티드)도 포함된다. 또 한 그 밖의 성분을 함유하는 것이여도 좋다.

상기 펩티드의 표지 화합물로서는, 당업계에서 통상 이용되는 표지 화합물을 적용할 수 있지만, 예를 들면 구체적으로 예시하면, ³H, ¹⁴C, ¹³¹I 및 ^99mTc 등의 방사성 동위원소; β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산 탈수소효소 등의 효소; 플루오레스카민, 플루오레세인이소티오시아네이트 등의 형광물질; 루시페린, 루미놀 유도체, 이소루미놀 유도체 등의 발광물질 등을 들 수 있다.

효소 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 본 발명의 펩티드를 이용하여 크론병 항체의 검출 및 포착 등을 할 수 있다. 그 밖에, 이하에도 상세하게 서술하지만, 본 발명의 펩티드를 표지하지 않고, 방사면역측정법이나 효소면역측정법 등의 면역측정법 등을 이용한 검사시약으로서도 사용할 수 있다.

2) 크론병의 검사키트

피험자의 혈액(혈청 또는 혈장) 등의 생체시료를 이용하여, 크론병의 검사를행하기 위해서는, 상기의 크론병 항체 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 검사시약을 함유하는 검사키트를 이용하는 것이 용이하고 간편하다.

본 발명의 크론병의 검사키트는, 상술의 검사시약을 크론병 항체와 결합시키는 목적으로 포함하는 것이면, 상기한 바와 같이, 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드 뿐만 아니라, 상기 펩티드가 임의의 표지 화합물로 표지된 표지체(표지 펩티드)도 사용할 수 있다. 또한 상기 펩티드는 미리 임의의 지지체(고상)에 고정화 시켜서 고정화물로서도 사용할 수도 있다.

본 발명의 크론병의 검사키트에는, 상기의 검사시약 외, 후술하는 크론병의 검사에 이용하는 면역측정법의 종류나 적용되는 검출방법에 따라, 적당하게 선택해서 사용할 수 있다. 예를 들면 방사성 동위체로 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드를 표지한 표지체를 사용하는 경우, 액체 신틸레이션 카운터 등의 방사선 검출장치가 필요하며, 또한 효소, 형광물질이나 발광물질로 표지하는 경우, 각각의 검출장치가 필요하며, 그들을 위한 검출시약, 용매, 기재 등이 본 발명의 검사키트의 기타 성분으로서 함유된다.

그 중에서도 특히, 본 발명의 검사키트에는, 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 상기 검사시약 이외의 기타 성분으로서, 인간 면역 글로불린(인간 IgG라고도 한다)을 검출하기 위한 2차항체(항인간 IgG항체, 예를 들면, 항인간 IgG 마우스 항체 등)가 함유되는 것이 바람직하다. 또한, 항인간 IgG항체는, 상술의 표지 화합물로 표지되어 있어도 좋고, 또한 미리 임의의 지지체(고상)에 고정화되어 있어도 좋다.

그 밖에, 상기 검사키트에는 표지 화합물에 따른 효소기질이나 효소, 또는 표지 화합물과 효소기질의 반응을 검출하기 위한 검출시약이나, 측정실시의 편리성을 위해서, 적절한 각종 시료, 시약이나 2차항체 등의 희석액, 표준항체, 완충액, 세정액, 효소기질용액, 반응정지액 등이 함유되어 있어도 좋다. 상기의 검사시약 또는 항인간 IgG항체를 표지 또는 고정화하지 않고 있는 것을 사용하는 경우에는, 검사키트의 기타 성분으로서, 상술의 표지 화합물이나 지지체(고상)가 더 함유된 다.

본 발명의 크론병의 검사키트는, 상기의 크론병 항체 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 검사시약(상기 펩티드는 고정화 및/또는 표지되어 있어도 좋다), 항인간 IgG항체(상기 2차항체는 고정화 및/또는 표지되어 있어도 좋다), 표지 화합물에 따른 기질(효소를 표지 화합물로 한 경우에는 효소기질, 형광물질이나 발광물질을 표지 화합물로 한 경우에는 효소 등), 항체 희석액, 표준항체, 완충액, 세정액, 기질용해액, 반응정지액, 지지체(고상), 및 표지 화합물 중에서 임의로 선택되는 적어도 1개를 조합한 것이다. 본 발명의 크론병의 검사키트에서는, 조작의 간편성, 안전성, 측정감도나 정밀도 등의 관점에서, 효소를 표지 화합물로서 사용하는 것이 바람직하다.

3) 크론병의 검사방법

본 발명의 크론병의 검사방법은, 피험자의 생체시료를 피험시료로서 사용하고, 각각의 피험자에 대해서 크론병의 이환의 유무를 검출하는 것이다. 보다 구체적으로는, 크론병 환자의 생체시료에 특유하게 존재하는 특정의 항체를 지표로 해서, 각각의 피험자에 대해서 크론병의 이환의 유무를 검출하는 것이다. 피험시료로서는, 피험자(인간)의 혈액(혈청, 혈장), 소변, 땀, 타액, 정액 또는 수액 등의 각종의 생체시료, 그 중에서도 혈청 및 혈장을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 크론병의 검사방법은, 상기의 크론병 항체 에피토프 펩티드를 항원물질로서 이용하는 것이 특징이다. 즉, 항원인 크론병 항체 에피토프 펩티드에 대하여, 피험자의 생체시료 중에 크론병 항체가 존재하면, 항원항체반응에 의한 복 합체가 생성되고, 이 복합체를 검출 및 측정함으로써 크론병의 이환의 유무 등을 진단하는 것이다.

항원인 크론병 항체 에피토프 펩티드와, 크론병 환자에게 특유의 크론병 항체의 반응에 의해 발생하는 복합체의 검출방법은, 종래 공지의 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 방사면역측정법, 효소면역측정법, 면역크로마토그래피법 등을 들 수 있다. 이들 각각의 면역학적 측정법을 본 발명의 검사방법에 적용함에 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요로 하지 않는다. 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작방법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 추가해서 측정계를 구축하면 좋다. 이들 일반적인 기술수단의 상세한 것에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다. 예를 들면 이리에 히로시 편 「라디오이무노아세이」(고단샤, 쇼와49년 발행), 이리에 히로시 편 「속 라디오이무노아세이」(고단샤, 쇼와54년 발행), 이시카와 에이지 등 편 「효소면역측정법」(의학서원, 쇼와53년 발행), 이시카와 에이지 등 편 「효소면역측정법」(제2판)(의학서원, 쇼와57년 발행), 이시카와 에이지 등 편 「효소면역측정법」(제3판)(의학서원, 쇼와62년 발행) 등을 참조할 수 있다.

또한, 본 발명의 크론병의 검사방법에는, 상기의 크론병 항체 에피토프 펩티드를 유효성분으로 하는 검사시약 또는 검사키트를 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 크론병의 검사방법은, 항원물질로서 상술의 크론병 항체 에피토프 펩티드를 이용한 각종의 면역측정법을 채용할 수 있다. 예를 들면 인간 혈청을 피험시료로 하는 고상화 효소면역측정법(이하, ELISA라고도 한다)을 예시하면, 측정대상의 크론병 항체는, 이하의 방법으로 검출 및 측정할 수 있다.

우선, 항원물질로서 사용하는 상기 크론병 항체 에피토프 펩티드를 지지체 등에 고정화하고, 이것에 피험시료로서의 생체시료를 첨가한다. 피험시료 중에 크론병 항체가 존재하면 고정화된 상기 펩티드에 결합된다. 다음에, 인간 IgG와 특이적으로 결합할 수 있는 항인간 IgG항체(2차항체)(표지 화합물로 표지된 것도 포함한다) 등의 검출시약을 이용하여, 재차 항원항체반응 및 검출반응 등을 행함으로써 피험시료 중에 존재하는 크론병 항체를 검출해서 측정할 수 있다.

또한 그 외에도, 항인간 IgG항체 등의 검출시약을 미리 지지체에 고정화하고, 이것에 피험시료를 첨가해서 생체시료 중의 크론병 항체를 포착시키고, 이어서, 이것에 상기 항원물질인 크론병 항체 에피토프 펩티드를 첨가함으로써 피험시료 중에 존재하는 크론병 항체를 검출하고, 측정하는 것도 가능하다. 이들 측정방법에 있어서의 각종 수단의 선택이나 그들의 개변 등은 모두 당업자가 잘 아는 것이며, 본 발명에 있어서 그들 각 방법을 모두 채용할 수 있다(「임상검사법 제요」카네하라 출판, 1995년 등 참조).

크론병 항체를 검출하기 위한 항인간 IgG항체 등의 검출시약은 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 사용되고 있는 각종 시판의 시약을 사용할 수 있다. 예를 들면 바람직하게는, 인간 IgG에 특이적으로 결합되는 생쥐, 토끼, 염소나 돼지 등의 이종동물에 인간 IgG를 항원으로서 감작시켜서 얻은 항인간 IgG항체 등을 들 수 있다. 이들 항인간 IgG항체나 인간 IgG는 상기의 표지 화합물로 표지되어 있어도 좋고, 이러한 표지에 이용되는 표지 화합물은 상기와 동일한 것을 들 수 있고, 그 중에서도 효소 등의 표지 화합물로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 이들 표지된 항인간 IgG항체나 인간 IgG는 시판품으로서 입수할 수 있지만, 상법에 따라 조제할 수도 있다.

본 발명의 크론병의 검사방법에 있어서는, 조작의 간편성, 안전성, 측정감도 및 정밀도 등의 관점에서, 효소를 표지 화합물로서 사용하는 상기의 ELISA 등의 효소면역측정법이 바람직하게 채용된다. 효소표지를 위한 표지 화합물로서는, 상기와 동일한 것을 들 수 있다. 또한, 이들 효소표지 화합물에 의한 표지방법은, 종래 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다(「효소면역측정법」제2판, 이시카와 에이지 외 저, 의학서원, 1982년 등).

또한, 상기 측정방법에 있어서, 고상법을 채용하는 경우의 지지체로서는, 불용성, 불활성 담체이면 특별히 제한되지 않고, 통상 사용되고 있는 것이 널리 사용된다. 예를 들면 유리, 세파덱스, 세파로스, 플라스틱 수지(폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등) 등의 소재로 이루어지는 마이크로플레이트, 비드, 멤브레인, 스틱, 시험관 등을 들 수 있다.

또한, 항원물질로서의 본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드, 혹은 2차항체인 항인간 IgG항체의 불용화에 있어서는, 물리 흡착을 이용해도 좋고, 또한 통상 단백질 혹은 효소 등을 불용화, 고정화하는데에 이용되는 화학결합을 이용하는 방법이라도 좋다.

상기 ELISA에 있어서는, 고상화된 크론병 항체 에피토프 펩티드에 피검시료를 반응시키고(1차반응), 표지한 항인간 IgG항체를 더 반응시킨(2차반응) 후, 불용 화 담체상의 표지 화합물의 활성을 측정함으로써 피검액 중의 크론병 항체를 검출 또는 정량을 할 수 있다. 1차반응과 2차반응은 동시에 행해도 좋고 시간을 변위시켜서 행해도 좋다. 표지 화합물 및 불용화의 방법은 상기의 그들에 준할 수 있다. 또한 ELISA에 의한 면역측정법에 있어서, 고상용 항체 혹은 표지용 항체에 이용되는 항체는 반드시 1종류일 필요는 없고, 측정감도를 향상시키는 등의 목적으로 2종류 이상의 항체의 혼합물을 이용해도 좋다.

상기의 측정계에 있어서 사용하는 용매로서는, 반응에 악영향을 주지 않는 것이면 일반적으로 사용되고 있는 것이면 좋고, 예를 들면, 인산 완충액(이하, PBS로 약기), 붕산 완충액, 트리스염산 완충액, 구연산 완충액, 초산 완충액 등의 pH가 약 6~9정도의 완충액 및, Tween20, Triton X-100 등의 계면활성제 및 소혈청 알부민(이하, BSA로 약기)이나 우유 단백질 등의 안정화제, NaN₃ 등의 방부제를 함유한 상기 완충액 등을 들 수 있다.

면역반응의 조건도 특별히 제한은 없고, 일반적으로 면역측정법에서 이용되고 있는 통상의 조건이 적용된다. 통상, 4~40℃정도의 온도 조건하에서 0.5~24시간 정도를 설정할 수 있다.

상기의 공정에서, 항원항체반응의 복합체(표지 화합물에 의한 표지체가 포함된다)의 측정은 사용하는 표지 화합물의 종류에 따른 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 표지 화합물에 효소를 사용한 경우, 표지체의 효소활성을 측정하지만, 효소활성의 측정은, 사용하는 효소의 종류에 따라 공지의 방법에 따라서 행할 수 있다.

이들 효소활성을 측정하기 위해서는, 효소에 따른 기질, 예를 들면 퍼옥시다아제에서는 3,3',5',5-테트라메틸벤지딘(TMB로 약기)이나 o-페닐렌디아민(OPD로 약기)을, 알칼리포스파타아제에는 p-니트로페닐포스페이트(pNPP로 약기)를 첨가해서 일정시간 반응시킨 후, 분광광도계 등으로 발색을 측정하는 방법이 널리 이용되고 있다.

본 발명의 크론병의 검사방법의 개요를 이하에 요약한다.

<1> 항원물질로서 크론병 항체 에피토프 펩티드를 마이크로 플레이트의 각 웰내에 고상화한다. 통상, 웰내의 비특이적인 결합부위를 막기 위해서, BSA나 카제인 등의 단백질, Tween20 등의 계면활성제로 블로킹 조작을 행한다.

<2> 피험시료(혈청 혹은 혈장검체)를 필요하면 BSA나 카제인 등의 단백질, Tween20 등의 계면활성제를 함유하는 완충액(검체 희석액)으로 희석하고, 상기의 고상화된 마이크로 플레이트에 첨가해서, 항원항체반응을 행한다(1차반응).

<3> 마이크로 플레이트를 가능하면 Tween20 등의 계면활성제를 함유하는 완충액(세정액)으로 세정한 후, 표지된 항인간 IgG항체를 BSA나 카제인 등의 단백질, Tween20 등의 계면활성제를 함유하는 완충액(희석액)으로 희석해서 첨가하고, 항원항체반응을 행한다(2차반응).

<4> 마이크로 플레이트를 상기 세정액으로 세정한 후, 표지에 따른 방법, 즉, 방사성 표지이면 방사활성을, 효소 표지이면 효소활성을 측정한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해서, 실시예를 들지만, 이것에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예1

<크론병 항체 에피토프 펩티드의 선별 및 그 동정>

1) T7파지를 이용한 cDNA파지 디스플레이 라이브러리의 제작

Caco-2(Human colon carcinoma; RIKEN CELL BANK) 배양세포 약 10⁸개로부터, 퀴아겐사제 RNA 추출 키트를 이용하여 전체 RNA의 추출 정제를 행하고, 654㎍을 얻었다. 올리고(dT)-셀룰로오스 칼럼을 이용하여, 600㎍의 전체 RNA로부터 22.8㎍의 폴리(A)⁺RNA를 정제하고, 랜덤 올리고머(nnnnnnCG) 및 역전사효소(퀴아겐사제 Omni-RT)를 이용하여, 1개쇄 cDNA를 합성했다.

이어서, RNase H와 대장균 DNA 폴리메라아제I을 이용하여 2개쇄 cDNA를 합성한 후, T4 DNA 폴리메라아제에 의한 말단 평활화를 행했다. 메틸라제에 의한 cDNA의 메틸화를 행한 후, T4 DNA리가아제에 의해 링커 배열(18mer 올리고 DNA)을 연결하고, 다시 제한효소(EcoRI 및 NotI)에 의한 cDNA 말단의 절단을 행한 후, 겔여과 스핀 칼럼(크론테크사제)에 의해 미반응의 링커 및 소사이즈의 절단 단편을 제거했다.

T7파지 벡터(Novagen사제)를 같은 제한효소에 의해 절단하고, 상기에서 얻어진 cDNA단편을 T4 DNA리가아제에 의해 연결시켰다. 이 연결반응용액과 T7파지 인비트로 패키징키트(Novagen사제)를 이용하여 파지 입자를 형성시키고, 숙주 대장균 BLT5615주에 감염시켜서 증폭시켰다. 약 1.3×10⁷사이즈의 cDNA 라이브러리를 제작했다.

2) 크론병 환자 혈청 항체 결합성 항원 파지의 스크리닝

숙주 대장균 BLT5615주의 싱글 콜로니를 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB배지에 식균(植菌)하고, 37℃에서 60O㎚에 있어서의 탁도가 0.5가 될 때까지 배양했다. 이 대장균 배양액에 최종 농도 1mM로 되도록 이소프로필-β-D(-)-티오갈락토피라노시드(이하, IPTG로 약기)를 첨가하고, 37℃에서 30분간 배양한 후, 1)에서 제작했거나 혹은 시판의 대장암 유래 cDNA 라이브러리를 첨가해서 완전히 용균될 때까지 37℃에서 배양했다. 용균후 즉시, 빙상에서 냉각한 후, 원심분리를 행하여 용균 세포편을 제거한 상청을 얻었다. 이 상청에 등용의 밀크 버퍼(5% 스킴 밀크와 0.1% Tween20을 함유하는, 25mM Tris-HCl 버퍼[137mM NaCl, 2.68mM KCl 함유, pH7.4](이하, TBS로 약기))를 첨가한 것을 파지 용균액으로서 이하의 조작에 사용했다.

마이크로 플레이트(Dynatec Lab.사제)에 PBS로 20㎍/ml에 희석한 단백질G(SIGMA사제)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응후, 밀크 버퍼로 세정한 후, 동버퍼로 블로킹해서, 단백질G 결합 플레이트를 제작했다.

크론병 환자 21명으로부터 얻어진 혈청검체로부터 1명 내지 3명분의 혈청풀을 0.05% NaN₃을 함유하는 PBS로 희석하고, 단백질G 결합 플레이트에 첨가했다. 22℃에서 2시간 정치해서 혈청중의 항체를 플레이트에 결합시킨 후, 밀크 버퍼로 3회 세정하여, 크론병 환자 혈청중 항체 결합 플레이트를 제작했다.

크론병 환자 혈청중 항체 결합 플레이트에 상기의 파지 용균액(약 1×10¹¹pf u의 파지 타이터)을 첨가하고, 실온에서 3시간 느리게 진탕하면서 항원발현 파지를 결합시켰다. 밀크 버퍼 및 TBS로 플레이트를 세정해서 미결합의 파지 현탁액을 제거한 후, 0.5%의 SDS를 함유하는 PBS를 첨가하고, 실온에서 20분간 진탕해서 플레이트에 결합된 파지를 용출하여, 이것을 파지 용출액으로 했다.

3) 파지 플라크 면역염색 및 크론병 환자 혈청 항체 결합성 항원 파지의 단일화

이렇게 해서 얻어진 파지 용출액을 숙주 대장균 BLT5615에 감염시키고, 50㎍/ml의 암피실린 및 1mM IPTG를 함유하는 LB 한천배지에 도포하고, 37℃에서 3시간 배양해서 플라크를 형성시켰다. 4℃에서 1시간 정치한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인(OSMONICS사제)을 씌우고, 실온에서 5분간 정치해서 파지입자를 멤브레인상에 전사했다.

멤브레인을 밀크 버퍼로 블로킹한 후, 동버퍼로 희석한 크론병 환자 혈청액중에 담그고, 4℃에서 하룻밤 느리게 진탕했다. 이 멤브레인을 밀크 버퍼를 이용하여 3회 세정한 후, 동버퍼로 1/5000 희석한 알칼리포스파타아제 표지 항인간 IgG 모노클로널항체(SIGMA사제) 용액에 담그고, 실온에서 1시간 느리게 진탕했다.

이 멤브레인을 밀크 버퍼를 이용하여 3회 세정한 후, 100mM Tris-HCl[100mM NaCl, 5mM MgCl₂ 함유, pH9.5](이하, AP버퍼로 약기)로 세정하고, 발색용액[0.33mg/ml 니트로블루테트라졸륨(이하, NBT로 약기) 및 0.165mg/ml 브로모클로로인돌릴포스페이트(이하, BCIP로 약기)]를 함유하는 AP버퍼 중에 담그고 실온에서 발색시켰다.

면역염색된 단파지 플라크를 긁어내고, 50㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지에 현탁하고, 그 일부를 숙주 대장균 BLT5615 배양액에 첨가해서 37℃에서 완전히 용균될 때까지 배양했다. 이 용균액을 원심해서 용균세포편을 제거한 상청에 CHCl₃을 최종 농도 0.3%가 되도록 첨가하고, 이것을 크론화한 크론병 환자 혈청항체 결합성 항원 파지 용액으로서 4℃에서 보존했다.

4) 파지 ELISA

숙주 대장균 BLT5615 배양액에 상기 3)에서 얻어진 크론병 환자 혈청항체 결합성 항원 파지를 첨가해서 37℃에서 완전히 용균될 때까지 배양했다. 이 용균액을 원심해서 용균세포편을 제거한 상청에 4배량의 밀크 버퍼를 첨가한 것을 1차반응 액으로서 이후의 조작에 사용했다.

마이크로 플레이트에 PBS로 1㎍/ml로 희석한 항T7파지 항체(토끼 폴리클로널 항체)를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응후, 밀크 버퍼로 세정한 후, 동버퍼로 블로킹하고, 항T7파지 항체 결합 플레이트를 제작했다.

상기 1차반응액을 항T7파지 항체 결합 플레이트에 첨가하고, 22℃에서 2시간 느리게 진탕시켜서 파지를 플레이트에 결합시킨 후, 밀크 버퍼로 3회 세정했다. 동버퍼로 1/250 희석한 각종 혈청(크론병 환자, 궤양성 대장염 환자 또는 건강인 유래)을 첨가하고, 22℃에서 1시간 정치한 후, 동버퍼로 6회 세정했다. 동버퍼로 1/5000 희석한 알칼리포스파타아제 표지 항인간 IgG 모노클로널항체 용액을 첨가하고, 22℃에서 1시간 정치한 후, 동버퍼로 6회 세정했다. AP버퍼로 더 세정한 후, p-니트로페닐포스페이트용액(SIGMA사제)을 첨가하고, 22℃에서 40분간 반응시켰다. 정지액(2N NaOH)을 첨가해서 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더로 흡광도(405㎚)를 측정하고, 혈청중의 항체값을 비교했다. 반응성의 결과로부터 크론병 환자 혈청에 특이성이 높았던 3개의 크론(편의상, CD#47, CD#336, CD#353으로 약기)을 선택했다.

5) 항원 펩티드를 코드하는 DNA 염기 배열 및 아미노산 배열의 결정

상기 파지 ELISA에 의해 선택한 3개의 크론병 환자 혈청항체 결합성 항원 파지를 숙주 대장균 BLT5615에 감염시키고, 용균시켰다. 얻어진 용균액으로부터 퀴아겐람다키트(퀴아겐사제)를 이용하여 파지 DNA를 추출했다. 파지 DNA의 삽입 cDNA 염기 배열의 결정은 다이데옥시법에 따라 실시했다. 얻어진 삽입 cDNA 염기 배열로부터 결정된 각 크론의 아미노산 배열을 1문자 표기로 해서 표 1에 나타낸다.

각 크론의 아미노산 배열을 직쇄상 펩티드(편의상, TCP-47, TCP-336, TCP-353으로 약기한다)로 해서 합성 및 정제하고(SIGMA GENOSIS사에 합성 의뢰), 크론병 항체 에피토프 펩티드로서 이후의 실험에 사용했다. 표 2에 제작한 각 펩티드의 성질을 나타낸다.

표 2 중에서, 분자량의 단위는 kDa이며, 순도는 액체 크로마토그래피에 의한 분석(225㎚ 흡광도 측정) 결과로부터 얻어진 면적비율이다. 또한, 소수성도는 소수성 아미노산의 함유 비율이다.

실시예2

<TCP-47, TCP-336 및 TCP-353의 각종 혈청검체에 대한 반응성>

실시예1에서 얻어진 크론병 항체 에피토프 펩티드를 항원으로 해서 ELISA를 실시하고, 각종 혈청(크론병 환자, 궤양성 대장염 환자 또는 건강인 유래)에 대한 반응성을 조사했다.

마이크로 플레이트에 PBS로 2㎍/ml로 희석한 각 펩티드를 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 반응후, 블로킹 버퍼(2% BSA, 5% 슈크로스, 0.1% NaN₃을 함유하는 PBS)로 세정한 후, 동버퍼로 블로킹해서, 펩티드 고상화 플레이트를 제작했다.

검체 희석액(1% BSA, 0.1% Tween20을 함유하는 PBS)으로 1/100 희석한 각종 혈청(크론병 환자 혈청 32검체, 궤양성 대장염 환자 혈청 32검체, 건강인 혈청 32검체)을 첨가하고, 22℃에서 1시간 정치한 후, 세정 버퍼(0.1% Tween20을 함유하는 PBS)로 6회 세정했다. 동버퍼로 1/4000 희석한 HRP표지 항인간 IgG항체(DAKO)용액을 첨가하고, 22℃에서 1시간 정치한 후, 동세정 버퍼로 8회 세정했다. 발색기질로서 TMB용액(DAKO사제)을 첨가하고, 22℃에서 30분간 반응시킨 후, 정지액(2N H₂SO₄)을 첨가해서 반응을 정지시키고, 플레이트 리더로 흡광도(450-600㎚)를 측정했다. 측정결과를 산포도로서 도 1에 나타낸다.

이 결과에 기초해서 유의차 검정을 행한 결과, 3종의 펩티드는 모두 크론병 환자 혈청과의 반응성이 궤양성 대장염 환자 또는 건강인 혈청의 것보다 유의하게 높은 값을 나타냈다. 컷오프값을 이하와 같이 구하고, 이것을 이용하여 양성판정을 행하고, 각종 혈청에 대한 양성율을 구했다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

컷오프값

TCP-47 OD=0.40: Receiver operationg characteristic(ROC) 커브상에서 1-specificity가 0.1이하이며 가장 높은 Sensitivity를 주는 OD값(도 2)

TCP-336 OD=1.10: 위와 같음

TCP-353 OD=0.11: 건강인 혈청의 측정값 평균+2SD

표 3에 나타내는 바와 같이 크론병 환자 혈청에 대한 양성율은, TCP-47이 40.6%, TCP-336이 28.1%, TCP-353이 53.1%이었던 것에 대해, 궤양성 대장염 환자 또는 건강인 혈청에 대한 위양성율은 3.1~9.4%이었다. 이상의 점에서, 이들의 펩티드는 크론병 환자 혈청중의 항체와 특이적으로 결합되는 것이 나타내어졌다.

실시예3

<TCP-353을 이용한 ELISA에 의한 각종 다수 혈청검체 측정>

실시예2에 있어서, 가장 크론병 환자 혈청에 대한 양성율이 높고(53.1%) 또한 궤양성 대장염 환자 또는 건강인 혈청에 대한 위양성율이 낮은(각각, 6.3%, 3.1%) 결과였던 TCP-353을 이용하여, 각종 다수 혈청검체(크론병 환자 혈청 60검체, 궤양성 대장염 환자 혈청 109검체, 건강인 환자 혈청 71검체, 급성장염 환자 혈청 11검체, 대장암 환자 혈청 35검체, 만성 간질환 환자 혈청 49검체)의 측정을 실시했다.

또, 혈청 희석율을 1/400으로 한 이외는 실시예2의 방법과 마찬가지로 해서 행하고, 또한 양성환자 혈청을 풀(pool)해서 제작한 표준액에 의한 표준 곡선을 제작하고, 얻어진 흡광도를 Unit값으로 환산했다. 측정결과를 산포도로서 도 3에 나타낸다.

이 결과에 기초해서 유의차 검정을 행한 결과, TCP-353과 크론병 환자 혈청의 반응성은 궤양성 대장염 환자, 건강인, 급성장염 환자, 대장암 환자, 만성 간질환 환자 혈청 중 어느 것보다 유의하게 높은 값을 나타냈다.

또한, 건강인 혈청 71검체의 측정값 평균+3SD를 컷오프값으로 했을 때의 양성환자 혈청수 및 양성율을 표 4에 나타낸다.

표 4에 나타내는 바와 같이 크론병 환자 혈청에 대한 양성율은, 61.7%(37/60)이었던 것에 대해, 위양성율은 궤양성 대장염 환자가 7.3%(8/109), 건강인 혈청이 2.8%(2/71), 급성장염 환자 혈청이 0%(0/11), 대장암 환자 혈청이 11.4%(4/35), 만성 간질환 환자 혈청이 8.2%(4/49)이었다. 이상의 결과로부터, 본 측정법을 크론병의 이환의 유무 및 그 밖의 유연질환, 특히 궤양성 대장염과의 감별에 이용할 수 있는 것이 나타내어졌다.

실시예4

<TCP-353을 이용한 ELISA와 ASCA-IgG ELISA의 비교>

크론병과의 관련이 보고되어 있는 항빵효모 항체(ASCA-IgG로 약기;Gut, 1998, 42, 788-791, Am J Gastroenterol., 2000, 95, 359-367, Am J Gastroenterol., 2001, 96, 730-734)에 대해서 각종 혈청에 대한 반응성을 조사하고, 크론병 진단에 있어서의 유용성에 대해서 TCP-353을 이용한 ELISA(이하, TCP-353 ELISA라고도 한다)와의 비교를 행했다.

ASCA-IgG를 이용한 ELISA(이하, ASCA-IgG ELISA라고도 한다)의 측정은, GENESIS Diagnostics사제의 키트를 이용하여 조작 설명서에 따라서 실시했다. 측정결과를 산포도로서 도 4에 나타낸다. 또한 ASCA-IgG ELISA에서는 특이도가 90%로 되도록 컷오프값을 설정하고, 각 혈청에 대한 반응율을 구했다. ASCA-IgG ELISA 및 TCP-353 ELISA의 양성율의 비교 결과를 표 5에 나타낸다.

또한 크론병 환자 혈청의 ASCA-IgG ELISA에 있어서의 측정값을 세로축에, TC P-353 ELISA의 측정값을 가로축에 플롯해서 상관계수를 구하고, 양 측정계에 있어서의 상관의 유무를 확인했다. 도 5에 나타낸다.

표 5 중에서,

감도는 (크론병 환자에서의 양성 혈청수)/(측정한 크론병 환자 혈청수)×100으로부터 산출한 값이다.

특이도는 {1-(크론병 환자 이외에서의 양성 혈청수)/(측정한 크론병 이외의 환자 및 건강인 혈청수)}×100으로부터 산출한 값이다.

양성 반응 적중도(PPV)는 (크론병 환자에서의 양성 혈청수)/(전체 양성 혈청수)×100으로부터 산출한 값이다.

음성 반응 적중도(NPV)는 (크론병 환자 이외에서의 음성 혈청수)/(전체 음성 혈청수)×100으로부터 산출한 값이다.

도 4, 표 5의 결과로부터, TCP-353을 이용한 ELISA는 ASCA-IgG ELISA보다 감도 및 특이도 모두 우수하고, 또한 양성 반응 적중도, 음성 반응 적중도 모두 우수하며 진단의 정확성도 높다고 생각되었다. 또한 도 5으로부터 상관계수는 0.229이며, 양 측정계 사이에 상관성은 없다는 점에서, 혈청중의 다른 항체를 측정하고 있다고 추찰되었다.

실시예5

<공지 기재된 크론병 항체 결합성 분기상 펩티드와의 비교>

크론병 항체 결합성 펩티드인 4종의 분기상 펩티드(cocktail-MAP로 약기;WO 02/088175 A1)를 제작하고, 크론병 진단에 있어서의 유용성에 대해서 TCP-353을 이용한 ELISA와의 비교를 행했다.

cocktail-MAP를 이용한 ELISA(cocktail-MAP ELISA라고도 한다)는 국제공개 팸플릿(WO 02/088175 A1)에 따라서 실시했지만, 표준액으로서는 TCP-353 ELISA와 같은 것을 사용하고, 얻어진 흡광도를 Index값으로서 환산했다. 측정결과를 산포도로서 도 6에 나타낸다. 또한, 건강인 혈청 71검체의 측정값 평균+3SD를 컷오프값으로 해서, 각 혈청에 대한 반응율을 구했다.

cocktail-MAP ELISA 및 TCP-353 ELISA의 양성율의 비교 결과를 표 6에 나타낸다. 또한, 크론병 환자 혈청의 cocktail-MAP ELISA에 있어서의 측정값을 세로축에, TCP-353 ELISA의 측정값을 가로축에 플롯해서 상관계수를 구하고, 양 측정계에 있어서의 상관의 유무를 확인했다. 도 7에 나타낸다.

이상의 결과로부터, TCP-353을 이용한 ELISA는 cocktail-MAP ELISA와 감도, 특이도, 진단의 정확성에 있어서 동등 이상이라고 생각되었다. 또한, 도 7로부터 상관계수는 0.281이며, 양 측정계 사이에 상관성은 없다는 점에서, 혈청중의 다른 항체를 측정하고 있다고 추찰되었다.

실시예6

<크론병 항체 에피토프 펩티드의 호몰로지 검색>

얻어진 크론병 항체 에피토프 펩티드(TCP-47, TCP-336, TCP-353)의 아미노산 배열에 대해서, BLAST검색을 행하고, 아미노산 배열 상동성을 갖는 펩티드 혹은 단백질을 검색했다. 결과를 도 8, 9 및 10에 나타낸다. TCP-47은 초파리 또는 인간의 Titin 단백질의 C말 영역과 일치하고, 그 외에 바이러스, 세균, 곰팡이, 원충에서 상동성이 있는 단백질이 보여졌다. TCP-336은 주로, 인간 단백질과 매우 일치하고 있었다. TCP-353은 Oryza sativa의 단백질과 일치하고, 크론병과 식이성 항원의 관련을 시사하는 것이었다.

본 발명의 크론병 항체 에피토프 펩티드 및 상기 펩티드를 이용한 검사시약은 크론병 이환의 유무를 간편하고 또한 신속하고 정확한 측정이 가능하며, 크론병의 진단에 매우 유익한 진단약 및 검사방법으로서 이용할 수 있다.

<110> TOAGOSEI CO., LTD <120> CROHN'S DISEASE ANTIBODY EPITOPE PEPTIDE AND METHOD FOR DETECTING CROHN'S DISEASE <140> 10-2007-7002725 <141> 2007-02-02 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> phage library <400> 1 Asn Ser Val Lys Asn Glu Val Glu Glu Val Thr Phe Thr Lys His Thr 5 9 14 19 Gln Cys Leu Gly Cys Phe Lys Ser Gly Phe Ser 24 29 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> phage library <400> 2 Val Ile Pro Ala Leu Ser Glu Ala Glu Ala Gly Gly Ser Pro Glu Val 5 9 14 19 Arg Ser Ser Arg Pro Ala Trp Pro Ile Trp 24 29 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> phage library <400> 3 Met Ile Arg Gly Leu Phe Pro Asn 5 9

Claims

크론병 항체 에피토프로서의 성질을 갖는 배열번호 3으로 나타내어지는 아미노산 배열을 갖는 펩티드 또는 그 염.
제1항에 기재된 상기 펩티드 또는 그 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 크론병의 검사시약.
제2항에 기재된 검사시약을 크론병 항체에 대한 항원물질로서 함유하는 것을 특징으로 하는 크론병의 검사키트.
생체시료 중의 상기 제1항에 기재된 펩티드 또는 그 염에 결합성을 갖는 항체의 유무를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 크론병의 검사방법.