ES2902888T3

ES2902888T3 - Proteína Rep mejorada para su uso en un ensayo diagnóstico

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Publication number: ES2902888T3
Application number: ES18734832T
Authority: ES
Inventors: Timo Bund; Villiers Ethel-Michele De; Hausen Harald Zur
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2022-03-30
Anticipated expiration: 2038-07-04
Also published as: JP2020526496A; EP3424942A1; KR20200026282A; JP7159229B2; DK3649145T3; CN111278850B; KR102245938B1; CN111278850A; US10907141B2; WO2019008052A1; RU2736275C1; AU2018296527A1; EP3649145A1; AU2018296527B2; EP3649145B1; US20200123520A1; CA3069035C; CA3069035A1

Abstract

Una proteína asociada a la replicación de ADN (Rep) que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en las SEQ ID NO: 11 o 12.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína Rep mejorada para su uso en un ensayo diagnóstico

La invención se relaciona con la detección y cuantificación de una proteína asociada a la replicación del ADN (Rep) para su uso en el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa tal como, por ejemplo, la esclerosis múltiple (MS). En particular, la invención se relaciona con una proteína Rep codificada por el genoma de MSBI1 mutante.

La etiología de la esclerosis múltiple (MS) no se ha resuelto. Por tanto, existe una necesidad de un biomarcador para la MS que pueda usarse para diagnosticar la MS y/o monitorizar la MS o un tratamiento de la MS y/o evaluar una predisposición a la MS.

La esclerosis múltiple (MS) se caracteriza por la desmielinización de las lesiones de la MS que dañan las células nerviosas del cerebro y la médula espinal. Los síntomas de la MS se presentan como episodios de empeoramiento repentino (recaídas, exacerbaciones, episodios, ataques) o como un empeoramiento gradual con el tiempo (formas progresivas). La desmielinización inicia procesos inflamatorios que desencadenan las células T y la liberación de citocinas y anticuerpos. Para el diagnóstico de la MS se usan, entre otros, la neuroimagen, el análisis del líquido cefalorraquídeo y los potenciales evocados.

Un espectro de 17 moléculas de ADN diferentes, pero parcialmente relacionadas, se aislaron a partir de diferentes materiales de análisis (tejido cerebral de esclerosis múltiple (MS), suero bovino, leche) (Funk, Gunst y otros 2014, Gunst, Zur Hausen y otros 2014, Lamberto, Gunst y otros 2014, Whitley, Gunst y otros 2014).

Entre estos aislamientos, dos moléculas de ADN estrechamente relacionadas con el aislamiento de Esfinge 1.76 que se asocia a la encefalopatía espongiforme transmisible (TSE) (1,758 pb; número de acceso HQ444404, (Manuelidis L. 2011)) se aislaron a partir de tejido cerebral de pacientes con MS. Estos aislamientos fueron MSBI1.176 (MSBI, aislado de cerebro de esclerosis múltiple) (1,766 pb) y MSBI2.176 (1,766 pb) que se designan como "genoma de MSBI1" y "genoma de MSBI2", respectivamente. MSBI1.176 comparte un 98 % de similitud de nucleótidos con la secuencia de Esfinge 1.76. Los grandes marcos de lectura abiertos (ORF) de los aislamientos codifican para una proteína de replicación del ADN putativo que comparte una gran similitud entre ellos. Otra característica común es la presencia de repeticiones en tándem de tipo iterón. El alineamiento de esta región repetida indica una variación en el núcleo de nucleótidos individuales. Estas repeticiones de tipo iterón pueden constituir los sitios de unión para las proteínas Rep. Las secuencias de los aislamientos se han depositado en el banco de datos EMBL con los números de acceso LK931491 (MSBI1.176) y LK931492 (MSBI2.176) (Whitley C. y otros 2014) y se han alineado y descrito en el documento WO 2016/005064 y EP 2966 176 A1.

Los presentes inventores han descubierto recientemente que el genoma MSBI1 natural muestra una producción significativa de ARN transcrito y la proteína Rep codificada por el genoma MSBI1 se expresa en las células humanas. Han descubierto que la proteína Rep codificada por el genoma MSBI1 y MSBI2 natural (MSBI1 Rep y MSBI2 Rep) representan un biomarcador para los ensayos de detección de patogenicidad. Como proteína asociada a la replicación del ADN (RepB), la proteína Rep tiene actividad de unión al ADN y puede ser esencial para el inicio de la replicación de moléculas de ADN episomales o virales. Sin embargo, las proteínas Rep que son estructuralmente similares a las Rep codificadas por el genoma MSBI1 y 2 natural muestran un marcado potencial de autooligomerización y agregación.

Para los ensayos de cribado de diagnóstico, los antígenos de la proteína Rep natural de MSBI1 Rep y MSBI2 Rep se purificaron y almacenaron en condiciones de desnaturalización, así como también de reducción para minimizar los efectos de agregación o degradación de la proteína. Desafortunadamente, los inventores observaron que las purificaciones previas de la proteína Rep de MSBI1 natural en condiciones no desnaturalizantes mostraban de hecho una agregación de proteína visible y enorme que obviamente hacía que la proteína Rep fuera inaccesible para la purificación por afinidad. Cantidades residuales muy pequeñas de la proteína Rep purificada se agregaron en escalas de tiempo muy cortas (varias horas) lo que hizo que la proteína fuera inadecuada para otros ensayos de diagnóstico. Esto coincide con estudios anteriores que describen la agregación de proteínas Rep comparables a la MSBI1 Rep (Giraldo 2007, Torreira, Moreno-Del Alamo y otros 2015).

Para los ensayos de cribado de diagnóstico, la estabilidad e integridad del antígeno proteico, que se usa para la detección de anticuerpos que se unen al antígeno en muestras de sangre, es de suma importancia para la reproducibilidad y confiabilidad de dichos experimentos sensibles. A este respecto, tanto la vida útil del antígeno proteico durante el almacenamiento a largo plazo como el comportamiento biofísico durante los ensayos de detección diagnóstica en sí (etapas de recubrimiento, bloqueo, lavado, incubación de anticuerpos de detección) son fundamentales para el éxito de los ensayos. Sin embargo, en vista del comportamiento de agregación observado en las proteínas Rep naturales (MSBI1 Rep y MSBI2 Rep), se necesita una proteína Rep mejorada que no tenga las propiedades de agregación y autooligomerización de las Reps naturales.

Los inventores descubrieron que las propiedades negativas anteriores pueden evitarse mediante una proteína mutante. La presente invención proporciona proteínas mutantes MSBI1 Rep y MSBI2 Rep que tienen al menos dos mutaciones puntuales en comparación con las respectivas proteínas naturales y representan un biomarcador para ensayos de cribado de patogenicidad. Las proteínas MSBI1 y MSBI2 Rep sintetizadas son mutantes que se obtienen de las proteínas Rep naturales (wt) codificadas por el genoma MSBI1 y MSBI2 como se muestra en SEQ ID. NO: 1 (MSBI1.176) y SEQ ID NO: 8 (Ms B i 2.176). Las proteínas mutantes MSBI1 y MSBI2 Rep sintetizadas proporcionan una mayor estabilidad de la proteína REP y una menor agregación en condiciones in vitro y también en tampón de almacenamiento de urea. Las proteínas mutantes MSBI1 y MSBI2 Rep sintetizadas son antígenos más estables que las proteínas MSBI1 y MSBI2 Rep naturales para su uso en ensayos de detección de diagnóstico.

Los anticuerpos anti-Rep se usan como marcadores patógenos debido al vínculo de la actividad patógena del agente de ADN aislado (por ejemplo, MSBI1) con la expresión de la proteína Rep. Los sueros de los pacientes que contienen mayores cantidades de anticuerpos anti-Rep indican que el paciente correspondiente estuvo definitivamente expuesto a proteínas relacionadas con Rep o que él mismo expresó Rep durante un periodo de tiempo lo suficientemente largo como para iniciar una respuesta inmune específica de Rep. Como objetivo para los anticuerpos humanos, se usa la proteína Rep como antígeno. En base a la cuantificación de la cantidad de anticuerpos anti-Rep puede diagnosticarse o monitorizarse la MS aguda, así como también la predisposición a la misma. Dado que se ha reconocido que el aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep inducidos o de la proteína Rep expresada en una muestra indica el inicio y/o el estado de la MS, el aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep y de la proteína Rep, respectivamente, puede usarse como biomarcador patogénico para el diagnóstico de la MS.

Ventajosamente, el biomarcador patogénico de la MS puede detectarse en muestras de sangre, tales como muestras de suero o plasma, y no es necesario obtener muestras del líquido cefalorraquídeo.

Por tanto, la invención proporciona una proteína asociada a la replicación de ADN (Rep) que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en las SEQ ID NO: 11 o 12.

La presente descripción proporciona una proteína asociada a la replicación de ADN (Rep) que comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO:11;

(ii) un fragmento de SEQ ID NO: 11 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 11; o

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 11.

Adicionalmente, la descripción proporciona una proteína (Rep) asociada a la replicación de ADN que comprende (i) una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:12;

(ii) un fragmento de SEQ ID NO: 12 que es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en SEQ ID NO: 12; o

(iii) una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 % o más de homología con la secuencia de aminoácidos de (i) o (ii) y es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO: 12.

La proteína Rep de la presente invención puede emplearse en prácticamente cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos o respuestas inmunes mediadas por células. Por tanto, la presente invención también abarca la detección de respuestas inmunes mediadas por células, por ejemplo, de células T contra la proteína Rep.

En ciertas modalidades, la invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto que comprende las etapas de

(a) incubar una muestra de un sujeto con una proteína Rep como se define anteriormente;

(b) detectar la cantidad de anticuerpos en la muestra del sujeto queforma un complejo inmunológico con la proteína Rep; y

(c) correlacionar la cantidad de anticuerpo unido a la proteína Rep, en comparación con una cantidad en una muestra de control, con un diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa.

En modalidades particulares, la invención proporciona un método para diagnosticar la MS en un sujeto que comprende las etapas de

(a) incubar una muestra de un sujeto con la proteína Rep;

(c) correlacionar la cantidad de anticuerpo unido a la proteína Rep, en comparación con una cantidad en una muestra de control, con un diagnóstico de MS.

Una mayor cantidad de anticuerpos anti-Rep en una muestra de un sujeto en comparación con la cantidad de anticuerpos anti-Rep en una muestra de control se correlaciona con un diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, MS, es decir, es indicativo de MS. En ciertas modalidades, el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, MS o una predisposición a una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, MS, se indica por una mayor cantidad de anticuerpos anti-Rep de al menos 2 veces en comparación con una muestra de control.

En modalidades particulares, la proteína Rep se inmoviliza, por ejemplo, se une a un soporte o portador, seguido de la incubación de la proteína Rep inmovilizada con la muestra del sujeto.

En otras modalidades, la proteína Rep se expresa en células seguido de la incubación de las células con la muestra del sujeto.

En ciertas modalidades, la cantidad de anticuerpos que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep se cuantifica mediante un agente de unión adicional acoplado a un compuesto generador de señales que es capaz de unirse a los anticuerpos anti-Rep del complejo inmunológico, por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado de forma detectable, preferentemente anticuerpo antihumano.

En otras modalidades, los anticuerpos de la muestra del sujeto se inmovilizan y se sigue con la incubación con una cantidad definida de proteína Rep.

Preferentemente, la muestra del sujeto y la muestra de control es una muestra de sangre tal como una muestra de suero o plasma.

Adicionalmente, los inventores han generado un anticuerpo anti-Rep que se une a un epítopo que se encuentra dentro de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1 a 136, 137 a 229 y 230 a 324 de SEQ ID NO:1 o 11. Por ejemplo, el anticuerpo se une a un epítopo que se comprende por SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3.

En modalidades adicionales, la invención proporciona un kit para su uso en el diagnóstico de MS que comprende (a) proteína Rep MSBI1 Rep 27/154E o MSBI2 Rep 27/154E, (b) un agente de unión adicional acoplado a un compuesto generador de señales, por ejemplo, un anticuerpo antihumano acoplado a un marcador detectable y capaz de unirse al anticuerpo anti-Rep de acuerdo con la invención, y (c) una matriz sólida adecuada para inmovilizar una proteína Rep de acuerdo con (a) o anticuerpos anti-Rep, en donde se sospecha la presencia de anticuerpos de ayuda en una muestra, en particular una muestra de suero o de plasma.

En modalidades particulares, el kit se prepara para su uso en un inmunoensayo, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), luminiscencia inmunoensayo (LIA) y ensayo de tira.

Breve descripción de los dibujos:

Figura 1 La proteína Rep se sobreexpresó mediante transfección transitoria de HEK293TT con un plásmido pcDNA3.1(-) que codifica para Rep MSBI1 natural (WT) o Rep MSBI1 27/154E mutante durante 72 horas. Las células se tripsinizaron, se lavaron en PBS y se sometieron a ultrasonidos en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 7,6, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1,5 %, imidazol 5 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM, mezcla de inhibidor de proteinasa 1 x). Después de incubación (30 min, 4 °C) y centrifugación (30 min, 10000 g, 4 °C), se llevó a cabo la purificación de la proteína no desnaturalizante mediante la unión de la proteína a 1 ml de perlas de Ni-NTA equilibradas (Clontech), que se lava con 10 volúmenes de columna de tampón de lavado (tampón de lisis que contiene imidazol 55 mM) y elución (tampón de lisis que contiene imidazol 300 mM). Después de la cuantificación de proteínas mediante NanoDrop y Bradford, se hirvieron cantidades iguales de proteínas (500 ng por carril) en tampón Lammli con (reducido) o sin (oxidado) 5 mM de beta-mercaptoetanol y se analizaron mediante electroforesis SDS-PAGE y transferencia western con anticuerpos anti-Rep.

Figura 2 La proteína Rep se purificó en condiciones no desnaturalizantes como anteriormente. Se sometieron 2000 ng de proteína Rep a BN-PAGE (Serva) y se tiñeron mediante inmunodetección anti-Rep o tinción de proteína con plata.

Figura 3 La proteína Rep se purificó a partir de E. coli en condiciones desnaturalizantes (véase el protocolo más abajo). Se caracterizaron 2 pg (transferencia western) o 5 pg (tinción de Coomassie) de MSBI1 Rep wt purificado o MSBI1 Rep 27/154E mutante mediante inmunodetección anti-Rep o tinción de proteína Coomassie después de la electroforesis SDS-PAGE.

Figura 4 La proteína Rep se purificó a partir de E. coli en condiciones desnaturalizantes (véase el protocolo más abajo). Se usaron 5 pg de MSBI1 Rep wt o MSBI1 Rep 27/154E mutante para la inmunodetección de BN-PAGE y anti-Rep.

Figura 5 Las placas de ELISA (Maxisorp, Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con MSBI1 Rep wt desnaturalizado purificado o MSBI1 Rep 27/154E mutante a 4 °C durante la noche en una dilución 1:1 de 1*PBS/urea 8 M (200 ng de proteína por pocillo) por triplicado. El bloqueo se realizó en diferentes tampones de ensayo (caseína, superblock, BSA al 1 % en PBS) durante 2 h a RT. La proteína recubierta se cuantificó con un conjunto de tres anticuerpos monoclonales anti-Rep de ratón (dilución 1:500, con epítopos en el dominio Rep N, central y C terminal) como anticuerpos primarios seguido por la incubación con un anticuerpo secundario antirratón de cabra acoplado a HRP (dilución 1:5000, cada 1 h a 37 °C, que se lava con p Bs 0,1 % Tween, sustrato de ELISA TMB de Thermo Fisher Scientific, lectura a 450 nm). Se muestran las intensidades de la señal sin procesar.

Figura 6 Las placas de ELISA (Maxisorp, Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con MSBI1 Rep wt desnaturalizado purificado o MSBI1 Rep 27/154E mutante a 4 °C durante la noche en una dilución 1:1 de 1*PBS/urea 8 M (200 ng de proteína por pocillo). El bloqueo se realizó en tampón de ensayo de superblock durante 2 h a RT. La incubación del suero (1:500 en tampón superblock) se realizó durante 1 h a 37 °C. Los anticuerpos IgG humanos unidos a Rep se cuantificaron con un anticuerpo secundario antihumano de cabra acoplado a HRP (dilución 1:5000, 1 h a 37 °C) en análisis por duplicado (lavados con PBS 0,1 % Tween, sustrato de ELISA TMB de Thermo Fisher Scientific, lectura a 450 nm, señal normalizada al control de BSA).

La invención proporciona proteínas Rep mutantes y ensayos de cribado de diagnóstico para la presencia de anticuerpos anti-Rep como marcadores patógenos. Las muestras que contienen cantidades mayores de anticuerpos anti-Rep indican que el sujeto correspondiente estuvo definitivamente expuesto a la proteína relacionada con Rep o expresó él mismo la proteína Rep durante un período de tiempo suficientemente largo para inducir una respuesta inmune específica de la proteína Rep. Con dichos ensayos de cribado puede realizarse un diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la MS basado en la cuantificación de anticuerpos anti-Rep.

La "proteína Rep", como se usa en la presente descripción, se refiere a una proteína asociada a la replicación del ADN (RepB). La proteína Rep comprende actividad de unión al ADN y podría ser esencial para el inicio de la replicación de moléculas de ADN episomal/viral. En general, la proteína Rep se refiere a una proteína Rep del grupo del Genoma de Esfinge Pequeña (Whitley y otros, 2014). En particular, la proteína Rep es una proteína Rep sintetizada codificada en el genoma MSBI1 Rep 27/154E y una proteína Rep 27/154E codificada en el genoma MSBI2. Preferentemente, la proteína Rep de MSBI1 sintetizada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:11 y se obtiene de MSBI1.176 depositado en el banco de datos EMBL bajo el número de acceso LK931491 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:1, o la proteína Rep sintetizada tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:12 y se obtiene de MSBI2.176 depositado en el banco de datos EMBL bajo el número de acceso LK931492 que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8.

En una modalidad preferida particular, la proteína Rep comprende una región N terminal conservada entre los genomas de Esfinge pequeña que consiste esencialmente en los aminoácidos del 1 al 229 de la SEQ ID NO: 11 o 12 y una región variable C terminal específica para MSBI1.176 que consiste esencialmente en los aminoácidos 230 a 324 de SEQ ID NO: 11, o región variable C terminal específica para MSBI2.176 que consiste esencialmente en los aminoácidos 230 a 324 de SEQ ID NO: 12. La región conservada N terminal comprende un primer dominio de unión a ADN putativo que consiste esencialmente en los aminoácidos del 1 al 136 de las SEQ ID NO: 1, 8, 11 y 12 y un segundo dominio de unión a ADN putativo que consiste esencialmente en los aminoácidos 137 a 229 de las SEQ ID NO:1, 8, 11 y 12.

"Proteína Rep" significa una proteína asociada a la replicación del ADN (Rep) que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en las SEQ ID NO: 11 o 12. Dentro de la descripción también se encuentran fragmentos y variantes de la proteína que son capaces de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para la proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12. Preferentemente, dicho fragmento es un fragmento inmunogénico de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12 que abarca al menos un epítopo para un anticuerpo antiproteína Rep contra la proteína Rep de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12 y, preferentemente, comprende al menos 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o 50 aminoácidos contiguos. Particularmente, el fragmento comprende o consiste esencialmente en un dominio de la proteína Rep, por ejemplo, la región conservada N terminal, la región variable C terminal, el primer o segundo dominio de unión al ADN. Una variante de la proteína con SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12 comprende una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NO:11 o SEQ iD NO 12 y tiene una homología de al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO: 12, en donde la variante es capaz de unirse a un anticuerpo anti-Rep específico para una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12. Se incluyen dentro de la definición de variante, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, ácido peptídico nucleico (PNA), etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural. El término proteína Rep incluye proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, con una secuencia líder o con una secuencia de etiqueta y similares. Por ejemplo, la proteína Rep puede fusionarse con una secuencia de etiqueta, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en Etiqueta His6 (SEQ ID NO:4), Etiqueta T7 (SEQ ID NO:5), Etiqueta FLa G (SEQ ID NO:6) y Etiqueta Strep-II (SEQ ID NO:7).

La proteína MSBI1 Rep sintetizada (MSBI1 Rep 27/154E) o la proteína MSBI2 Rep (MSBI2 Rep 27/154E) de la invención, incluidos los fragmentos Rep y las variantes Rep como se definen anteriormente, pueden prepararse mediante síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución homogénea o en fase sólida. Los polipéptidos de acuerdo con esta invención también pueden prepararse por medio de técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se diseñó la MSBI1 Rep 27/154Een la que el potencial de agregación de dos secuencias de aminoácidos entre los residuos 25-31 (LLILLAII) y los residuos 151-155 (LLICW) se minimizó mediante dos mutaciones puntuales. La base para la clonación fue una secuencia de ADN de Rep de MSBI1 que tenía un codón optimizado para la expresión de Rep en el sistema humano que codifica la secuencia de aminoácidos primaria de Rep de MSBI1 original. Los nucleótidos que codifican el aminoácido 27 (L, leucina, codón de ADN CTA) así como también los nucleótidos que codifican el aminoácido 154 (C, cisteína, codón de ADN TGT) fueron sustituidos por nucleótidos que codifican el aminoácido ácido glutámico (E, ADN codón GAG) que equivale a la secuencia de ADN final SEQ ID NO: 11. El potencial de agregación neto de este doble mutante Rep se minimizó a una puntuación de 141 que se ubica en el intervalo de proteínas propensas a la no agregación.

Como se muestra en los Ejemplos (Figura 2, 3), el mutante Rep 27/154E mostró una reducción significativa (> 50 %) de oligómeros Rep y agregados más grandes en comparación con la proteína Rep natural. La transferencia Western también mostró significativamente menos oligómeros Rep, así como también menos agregados de alto peso molecular (Figura 4). Se detectó una especie adicional de la proteína Rep monomérica más obviamente en condiciones de PAGE nativas solo para el mutante Rep. Claramente, la intensidad de los agregados de alto peso molecular se reduce significativamente para el doble mutante 27/154E Rep. En general, la presencia de agregados de Rep es mayor para las proteínas que se purificaron en condiciones no desnaturalizantes. De todos modos, también las proteínas purificadas y almacenadas en condiciones de desnaturalización muestran una agregación muy fuerte, que se reduce significativamente para el doble mutante Rep. Esto es de especial interés, ya que las configuraciones experimentales de ELISA se basan en la renaturalización de los antígenos proteicos unidos a la superficie, porque la unión del antígeno con el anticuerpo requiere condiciones nativas.

Las proteínas Rep naturales pueden prepararse mediante síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución homogénea o en fase sólida. Los polipéptidos de acuerdo con esta invención también pueden prepararse por medio de técnicas de ADN recombinante. En el Ejemplo 1 se muestra un ejemplo para producir y purificar una proteína Rep natural.

"Sujeto", como se usa en la presente descripción, se refiere a un mamífero individual o paciente, incluidos ratones, ganado, por ejemplo, bovinos, simios y humanos. Preferentemente, el sujeto es un paciente humano.

"Muestra", como se usa en la presente descripción, se refiere a una muestra biológica que incluye muestras líquidas y sólidas. Las muestras líquidas comprenden líquidos sanguíneos tales como, por ejemplo, suero o plasma y líquido cefalorraquídeo (CSF). Las muestras sólidas abarcan muestras de tejido, tales como cultivos de tejido o espécimen de biopsia.

"Se correlaciona con", como se usa en la presente, se refiere a una cantidad, es decir, nivel o título, de anticuerpos anti-Rep y proteína Rep, respectivamente, con una correlación significativa con un estado de enfermedad de, por ejemplo, m S. La correlación se determina mediante la detección del grado de diferencia en la cantidad presente en una muestra de un sujeto a analizar y una muestra de control. "Muestra de control" significa una sola muestra o un promedio de varias, es decir, más de dos, muestras de control. El control se toma de una persona sana a la que no se le ha diagnosticado MS. Alternativamente, la correlación puede determinarse teóricamente mediante la detección del grado de diferencia en la cantidad presente en una muestra para un sujeto que se va a analizar con un valor de corte predeterminado. Un valor de corte es un valor de referencia con una separación estadísticamente significativa entre diferentes estados de enfermedad, por ejemplo, entre estado sano y enfermo. El valor de corte puede determinarse mediante el análisis estadístico de un panel suficientemente grande de muestras de análisis de pacientes con antecedentes de enfermedad y muestras de un grupo de análisis sano mediante pruebas estadísticas conocidas en la técnica.

En ciertas modalidades, un diagnóstico, por ejemplo, de MS, se indica mediante un aumento de al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces la cantidad de proteína, es decir Rep proteína y anticuerpos anti-Rep, respectivamente, en la muestra del sujeto en comparación con una muestra de control.

"Anticuerpo anti-Rep" como se usa en la presente descripción se refiere a un anticuerpo que se une a un nivel detectable a la proteína Rep en los métodos de la invención cuya afinidad es más fuerte por la proteína Rep de la invención que por una proteína que no es Rep. Preferentemente, la afinidad del antígeno por la proteína Rep es al menos 2 veces mayor que la unión de fondo. En particular, el anticuerpo anti-Rep es específico para MSBI1 Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o 11 o MSBI2 Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 8 o 12. En modalidades particulares, el anticuerpo tiene reactividad cruzada para MSBI1 Rep o MSBI2 Rep.

Una característica común de todos los ensayos es que la proteína Rep se pone en contacto con una muestra sospechosa de contener anticuerpos antiproteína Rep en condiciones que permiten que la proteína Rep se una a cualquiera de dichos anticuerpos presentes en la muestra. Dichas condiciones serán típicamente temperatura fisiológica, pH y fuerza iónica mediante el uso de un exceso de proteína Rep. La incubación de la proteína Rep con la muestra se sigue por la detección de inmunocomplejos comprendidos en el antígeno. En ciertas modalidades, la proteína Rep se acopla a un compuesto generador de señales, por ejemplo, un marcador detectable, o se usa un agente de unión adicional, por ejemplo, un anticuerpo antihumano secundario, acoplado a un compuesto generador de señales para detectar el complejo inmune.

Los anticuerpos anti-Rep pueden detectarse y cuantificarse en ensayos basados en la proteína Rep como antígeno proteico, que sirve como objetivo para los anticuerpos de mamíferos, por ejemplo, los seres humanos, sospechosos en la muestra. Preferentemente, la proteína Rep se purifica (por ejemplo, véase el Ejemplo 1) y las muestras pueden ser, por ejemplo, muestras de suero o plasma. Los métodos incluyen la inmovilización de la proteína Rep en una matriz seguido por la incubación de la proteína Rep inmovilizada con las muestras. Finalmente, los anticuerpos unidos a Rep del complejo inmunológico formado entre la proteína Rep y los anticuerpos de las muestras se cuantifican mediante un agente de unión a la detección acoplado a un compuesto generador de señales, por ejemplo, un anticuerpo de detección secundario acoplado a HRP (peroxidasa de rábano picante) que permite la cuantificación basada en el sustrato HRP. Este compuesto o marcador generador de señal es en sí mismo detectable o puede reaccionar con un compuesto adicional para generar un producto detectable.

En otras modalidades los anticuerpos anti-Rep se cuantifican indirectamente en el sentido de que primero los anticuerpos de la muestra se inmovilizan en una matriz, seguido por la incubación con una cantidad definida de proteína Rep, en donde los anticuerpos anti-Rep inmovilizados y presentes en la matriz capturan la proteína Rep de la mezcla líquida proteína y muestra, y después se cuantifica la proteína Rep unida.

En otras modalidades, la proteína Rep puede expresarse en células y estas células se incuban con la muestra. A continuación, se detectan y cuantifican los anticuerpos anti-Rep de la muestra unida a la proteína Rep expresada por las células.

El diseño del inmunoensayo está sujeto a una gran variación y se conocen muchos formatos en la técnica. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de agentes de unión acoplados a compuestos generadores de señales, por ejemplo, anticuerpo marcado o proteína Rep marcada; los marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o colorantes. También se conocen ensayos que amplifican las señales del complejo inmunológico; ejemplos de los cuales son ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoensayos mediados y marcados con enzimas, tales como ensayos ELISA.

El inmunoensayo puede tener un formato heterogéneo u homogéneo, y de tipo estándar o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido (proteína Rep o anticuerpo anti-Rep) se une típicamente a una matriz sólida o soporte o portador para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Ejemplos de soportes sólidos que pueden usarse son nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillo de microtitulación), cloruro de polivinilo (por ejemplo, en láminas o pocillos de microtitulación), látex de poliestireno (por ejemplo, en perlas o placas de microtitulación, fluoruro de polivinilidina (conocido como Immunolon), papel diazotizado, membranas de nailon, perlas activadas y perlas de Proteína A. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava típicamente después de separarlo de la muestra de análisis y antes de la detección de anticuerpos anti-Rep unidos. Se conocen en la técnica formatos tanto estándar como competitivos.

En un formato homogéneo, la muestra de análisis se incuba con la proteína Rep en solución. Por ejemplo, puede ser en condiciones que precipiten cualquier complejo de proteína Rep y anticuerpo que se forme. Se conocen en la técnica formatos tanto estándar como competitivos para estos ensayos.

En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos anti-Rep en los complejos anticuerpo y proteína Rep se controla directamente. Esto puede lograrse mediante la determinación de que si los anticuerpos antixenogénicos (por ejemplo, antihumanos) (marcados) que reconocen un epítopo en los anticuerpos anti-Rep se unirán debido a la formación del complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos anti-Rep en la muestra se deduce mediante el control del efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando competidor) en el complejo.

Los complejos formados que comprenden anticuerpo anti-Rep (o en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo competidor) se detectan mediante cualquiera de varias técnicas conocidas, en dependencia del formato. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Rep no marcados en el complejo pueden detectarse mediante el uso de un conjugado de Ig antixenogénica en forma de complejo con un marcador (por ejemplo, un marcador de enzima, tal como, por ejemplo, HRP).

En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre la proteína Rep y el anticuerpo anti-Rep forma una red que precipita de la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no hay ningún anticuerpo anti-Rep en la muestra, no se forma un precipitado visible.

La fase sólida seleccionada puede incluir perlas poliméricas o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, micropocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo y perlas magnéticas. El compuesto generador de señales puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radiactivo y un compuesto quimioluminiscente. Los ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y beta-galactosidasa. Los ejemplos de compuestos potenciadores incluyen biotina, antibiotina y avidina. Los ejemplos de miembros que se unen a compuestos potenciadores incluyen biotina, antibiotina y avidina.

En modalidades adicionales, la invención proporciona métodos en donde una cantidad mayor de proteína Rep en una muestra se correlaciona con un diagnóstico o predisposición de una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, MS, o se usa para monitorizar la enfermedad, por ejemplo, MS, o monitorizar el tratamiento de la enfermedad, por ejemplo, MS. En dichas modalidades, la proteína Rep en la muestra se detecta mediante anticuerpos anti-Rep.

Dichos métodos comprenden las etapas de

(a) detectar la cantidad de proteína Rep en una muestra de un sujeto mediante anticuerpos anti-Rep; y

(b) correlacionar la cantidad de proteína Rep detectada en la muestra de un sujeto en la etapa (a) en comparación con una cantidad en una muestra de control con un diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, MS.

Los ejemplos de ensayos que pueden usarse en dichos métodos para la detección de proteína Rep en muestras de suero o plasma incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, transferencia en mancha y transferencia Western.

Por ejemplo, una muestra de suero puede incubarse con anticuerpos antiproteína Rep para capturar la proteína Rep en la muestra, seguido por la etapa de inmunoprecipitación de la proteína Rep y, posteriormente, una etapa de detección por electroforesis SDS-PAGE y Transferencia Western.

En un ejemplo adicional, puede incubarse una membrana de transferencia en mancha con suero, seguido por una etapa de una electroforesis SDS-PAGE y una Transferencia Western.

En otro ejemplo, las diluciones de suero de la muestra se cargan en una electroforesis SDS-Page seguida de una transferencia Western.

En modalidades adicionales, la proteína Rep se detecta en muestras de tejido mediante métodos inmunohistoquímicos o microscopía de inmunofluorescencia.

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-Rep se usan para la detección o captura de la proteína Rep en la muestra. El término "anticuerpo", preferentemente, se refiere a anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpos policlonales combinados con diferentes especificidades epitópicas, así como también distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) debe incluir moléculas de inmunoglobulina intactas, así como también fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse específicamente a la proteína Rep. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión inespecífica a los tejidos que un anticuerpo intacto. Por tanto, se prefieren estos fragmentos, así como también los productos de una fAb u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos útiles para los propósitos de la presente invención incluyen anticuerpos o anticuerpos humanos quiméricos, monocatenarios, multifuncionales (por ejemplo, biespecíficos) y humanizados.

En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de esta unión a antígeno se acopla a un compuesto generador de señal, por ejemplo, un portador de marcador detectable. El anticuerpo/fragmento puede marcarse de forma detectable directa o indirectamente, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para unirse al anticuerpo, o serán capaces de descubrirlas, mediante el uso de experimentación rutinaria.

Como se muestra en la parte del Ejemplo, el doble mutante Rep recientemente diseñado muestra un rendimiento de recubrimiento ELISA comparable al de la proteína Rep natural. Adicionalmente, la reactividad de los anticuerpos reactivos con Rep en sueros de MS humana aumentó en aproximadamente un 40 % en promedio cuando se usa el doble mutante 27/154E Rep como antígeno en comparación con Rep natural en ensayos ELISA (Figura 6).

Los inventores también han planteado (generado) anticuerpos anti-Rep contra una proteína Rep que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:8 o un fragmento de esta mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos anticuerpos anti-Rep se usan para unirse a varios o todos los tipos de proteínas Rep del grupo del Genoma de Esfinge Pequeña (anticuerpo anti-Rep tipo Esfinge Pequeña o anticuerpo anti-SSLRep). Dicho anticuerpo anti-SSLRep se une a un epítopo dentro de la región N terminal conservada de la proteína Rep de los aminoácidos 1 a 229 de SEQ ID NO:1. Se usan anticuerpos anti-Rep del tipo anti-SSLRep que se unen a un epítopo dentro de la SEQ ID NO:2 (aminoácidos 32-49 de SEQ ID NO:1) o SEQ ID NO:3 (aminoácidos 197-216 de SEQ ID NO:1). Los fragmentos de péptidos de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 están muy conservados entre las proteínas Rep del grupo del genoma de la Pequeña Esfinge y parecen estar expuestos debido a su carácter hidrófilo. Los anticuerpos anti-Rep del tipo anti-SSLRep pueden producirse mediante inmunización, por ejemplo, de ratones o cobayas, por péptidos que consisten esencialmente en las secuencias de aminoácidos que se representan en las SEQ ID NO:2 o 3; o por otros fragmentos inmunogénicos, que preferentemente comprenden al menos 8-15 aminoácidos, que se obtienen de la región de la proteína Rep N terminal conservada de los aminoácidos 1 a 229 de SEQ ID NO:1.

Dichos anticuerpos se han producido, por ejemplo, mediante la inmunización de un mamífero tal como ratones o cobayas con una proteína Rep de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

Dichos anticuerpos anti-Rep son capaces de detectar la proteína Rep hasta intervalos de picogramos a femtogramos en diferentes tipos de líquidos corporales tales como, por ejemplo, sangre, suero, líquido cefalorraquídeo o líquido cerebral.

Puede usarse un tipo específico de anticuerpo anti-Rep o un grupo de dos o más tipos diferentes de anticuerpos anti-Rep. Si se usa un grupo de diferentes tipos de anticuerpos anti-Rep, el grupo de anticuerpos anti-Rep puede comprender diferentes anticuerpos anti-Rep que se unen a diferentes epítopos dentro de diferentes dominios de la proteína Rep, por ejemplo, primer dominio de unión al ADN (por ejemplo, aa 1-136 de SEQ ID NO:1), segundo dominio de unión a Ad N (por ejemplo, aa 137-229 de SEQ ID NO:2) y/o dominio variable (por ejemplo aa 230-324 de SEQ ID NO:1), en particular, de MSBI1 Rep proteína (SEQ ID NO:1).

En vista de las únicas dos mutaciones puntuales en los dos dominios de unión al ADN y el mantenimiento de la misma secuencia en los dominios variables, estos anticuerpos también reconocen las proteínas mutantes de las SEQ ID Nos.

11 y 12.

Para la detección de una proteína Rep mediante anticuerpos anti-Rep pueden aplicarse métodos tales como, por ejemplo, transferencia Western, microscopía de inmunofluorescencia o métodos inmunohistoquímicos.

Los anticuerpos anti-Rep son capaces de detectar una proteína Rep en determinadas localizaciones celulares. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Rep puede detectar la proteína Rep en el citoplasma, la membrana nuclear y el núcleo o detectar motas en el citoplasma. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de dicho grupo de anticuerpos anti-Rep:

Los anticuerpos anti-Rep del grupo A tienen un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:3 (aa 198-217 de SEQ ID NO:1) y son capaces de detectar las proteínas Rep y Rep de MSBI1 que comprenden este epítopo conservado del grupo del genoma de Esfinge Pequeña (por ejemplo, MSBI2, CMI1, CMI4). En los ensayos de inmunofluorescencia, dichos anticuerpos anti-Rep detectan un patrón de localización de Rep específico, en donde la localización principal se distribuye homogéneamente sobre el citoplasma y la membrana nuclear; y se observa una localización adicional débil y distribuida homogéneamente en el núcleo. Un ejemplo de dicho anticuerpo del grupo A es el anticuerpo AB01 523-1-1 (DSM ACC3327) que se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo A.

Los anticuerpos anti-Rep del grupo B tienen un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:2 (aa 33-50 de SEQ ID NO:1) y son capaces de detectar las proteínas Rep y Rep de MSBI1 que comprenden este epítopo conservado del grupo del genomade Esfinge pequeña (por ejemplo, MSBI2, CMI1, CMI4). En los ensayos de inmunofluorescencia, dichos anticuerpos anti-Rep detectan específicamente motas (agregaciones citoplasmáticas) de la proteína Rep (a menudo en la periferia de la membrana nuclear). Un ejemplo de dicho anticuerpo del grupo B es el anticuerpo designado como AB02 304-4-1 (DSM ACC3328) que se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo B.

Los anticuerpos anti-Rep del grupo C detectan específicamente un epítopo estructural de MSBI1 (SEQ ID NO:1). En los ensayos de inmunofluorescencia, dichos anticuerpos anti-Rep detectan un patrón de localización de Rep específico, en donde la localización principal se distribuye homogéneamente sobre el citoplasma y la membrana nuclear; y se observa una localización adicional débil y distribuida homogéneamente en el núcleo. Un ejemplo de dicho anticuerpo del grupo C es el anticuerpo MSBI1 381-6-2 (DSM ACC3329) que se empleó en los ejemplos como anticuerpo del grupo C.

Los anticuerpos anti-Rep del grupo D detectan específicamente un epítopo estructural de MSBI1 (SEQ ID NO:1), donde el anticuerpo MSBI1 961-2-2 designado como "D1" detecta un epítopo representado en SEQ ID NO:9 (aa 281 287) en el dominio C terminal de MSBI1. El anticuerpo MSBI1 761-5-1 (Ds M ACC3328) designado como "D2" detecta un epítopo estructural 3D de MSBI1 que es exclusivamente accesible en condiciones in vivo y no es accesible en Transferencias Western. En los ensayos de inmunofluorescencia, dichos anticuerpos anti-Rep detectan específicamente motas (agregaciones citoplasmáticas) de la proteína Rep (a menudo en la periferia de la membrana nuclear.

En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-Rep de los grupos A, B, C o D; o una combinación de anticuerpos anti-Rep de al menos dos grupos A, B, C o D diferentes se usan para determinar el tipo de localización de la proteína Rep en una sonda y si dicha localización de la proteína Rep se correlaciona con una función patógena. Por ejemplo, si hay motas. En ciertas modalidades, es decir, métodos o kits de la invención, al menos un anticuerpo anti-Rep seleccionado de los grupos A y B se combina con al menos un anticuerpo anti-Rep seleccionado de los grupos C y D. En modalidades particulares, es decir, métodos o kits de la invención, un anticuerpo anti-Rep del grupo A se combina con al menos otro anticuerpo anti-Rep seleccionado de los grupos B, C y D. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Rep del grupo A puede combinarse con más anticuerpos anti-Rep de los grupos C y D. Dichas combinaciones de anticuerpos anti-Rep de diferentes grupos aumentan la distinción de la evaluación diagnóstica, en particular para el diagnóstico de MS.

Los siguientes anticuerpos se depositaron en Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] el 28 de septiembre de 2017:

anticuerpo AB01 523-1-1 bajo DSM ACC3327;

anticuerpo AB02 304-4-1 bajo DSM ACC3328;

anticuerpo MSBI1 381-6-2 bajo DSM ACC3329; y

anticuerpo MSBI1 761-5-1 bajo DSM ACC3330.

El anticuerpo MSBI1 961-2-2 se depositó en DSMZ el 6 de octubre de 2017.

En una modalidad preferida, los anticuerpos anti-Rep de los grupos A, B, C o D; o una combinación de anticuerpos anti-Rep de al menos dos grupos A, B, C o D diferentes se usan para determinar la proteína Rep codificada en el genoma de MSBI1 Rep sintetizada (MSBI1 Rep 27/154E o MSBI2 Rep 27/154E)).

En modalidades adicionales se proporciona un kit para su uso en el diagnóstico de MS. El kit puede incluir material para detectar anticuerpos anti-Rep y/o proteína Rep junto con instrucciones para el uso de los materiales en ensayos para el diagnóstico de MS. El kit puede comprender uno o más de los siguientes componentes: un biomarcador de acuerdo con la invención, es decir, proteína Rep y anticuerpos anti-Rep, respectivamente; un compuesto generador de señales, una matriz sólida para unir un agente de captura, un diluyente para las muestras, un tampón de lavado. El compuesto generador de señales se refiere a un marcador detectable que se acopla a un agente de unión adicional capaz de unirse al biomarcador de la invención o directamente acoplado al biomarcador de la invención.

La invención se ilustra además con los siguientes ejemplos, pero sin limitarse a ellos:

Ejemplo 1:

Purificación de proteínas Rep MSBI1

Una molécula de ácido nucleótido que codifica el marco de lectura abierto (ORF) de longitud completa de Rep identificado dentro del genoma de MSBI1 se clona en un plásmido de expresión (pEXP5-CT, Invitrogen) que permite la expresión de la proteína basada en un sistema de traducción in vitro sin células de E. coli de alto rendimiento (ExpresswayTM Cell-Free E. coli Expression System, Invitrogen). La proteína Rep sintetizada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 dentro de la reacción de traducción in vitro se desnaturaliza mediante la adición de 20 volúmenes de reacción de tampón de muestra de urea 8 M pH 8,0 que contiene NaH2PO4 100 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,0, imidazol 5 mM. La proteína Rep se purifica posteriormente en condiciones desnaturalizantes (imidazol 20 mM para el lavado e imidazol 300 mM para elución de proteínas) sobre la base de una etiqueta His6 C terminal que se fusiona a la proteína Rep. La calidad de la purificación se determina mediante tinción de proteína Coomassie y Transferencia Western con anticuerpos antiproteína Rep. La pureza de la proteína Rep se calcula densitométricamente y es superior al 95 %. La proteína purificada se usa directamente para el cribado de sueros basado en ELISA o se somete a una electroforesis SDS-Page seguida de transferencia a membranas de nitrocelulosa para la incubación de los sueros con las tiras de membrana de proteína Rep de tamaño 1D.

Ejemplo 2:

A. Caracterización de la proteína Rep natural o mutante en condiciones de desnaturalización mediante el uso de electroforesis SDS-PAGE y Transferencia Western

Las propiedades de los antígenos Rep purificados (Rep natural y mutante) se caracterizaron mediante diferentes conjuntos de experimentos. La proteína Rep, que se purificó en condiciones no desnaturalizantes (nativas) de la línea celular HEK293TT humana, mostró niveles significativamente menores de oligómeros Rep (banda de 100 kDa) y agregados de peso molecular menos pesado para los mutantes C154E simple y doble 27/154E en comparación con el natural tanto en condiciones de carga de muestra reductoras como oxidantes cuando se somete a electroforesis SDS-PAGE y Transferencia Western anti-Rep (Figura 1).

B. Caracterización de la proteína Rep natural o mutante en condiciones no desnaturalizantes mediante el uso de PAGE nativo

La caracterización de las mismas proteínas Rep no desnaturalizadas (nativas) por PAGE azul nativo también mostró significativamente menos agregados de proteínas de alto peso molecular (frotis de alto peso molecular) para el doble mutante en comparación con el natural, tanto para la detección por Transferencia Western (WB, anti-Rep) o por tinción de proteína total de alta sensibilidad (tinción de plata) (Figura 2). Sin embargo, en general, en condiciones de PAGE nativas, la especie oligomérica de Rep (MW de aproximadamente 150 kDa) representa la especie de proteína Rep dominante. Estos pueden ser trímeros o tetrámeros de Rep monomérico (MW teórico de 38,2 kDa).

C. Caracterización de la proteína Rep natural o mutante en condiciones de desnaturalización mediante el uso de electroforesis SDS-PAGE y Transferencia Western

Para los ensayos ELISA estándar, la proteína Rep se purificó en condiciones desnaturalizantes de E. coli para una producción de alto rendimiento y una mejor estabilidad de la proteína (ver el protocolo más abajo). Para caracterizar la agregación de Rep WT y Rep MUT desnaturalizados, las proteínas se tamponaron durante 1 h en PBS, para imitar las condiciones de bloqueo y recubrimiento de ELISA de renaturalización, y después se sometieron a electroforesis SDS-PAGE y Transferencia Western con anticuerpos anti-Rep o tinción de proteína Coomassie (Figura 3). De nuevo, el mutante Rep mostró una reducción significativa (> 50 %) de oligómeros Rep y agregados más grandes en comparación con la proteína Rep natural.

D. Caracterización de la proteína Rep natural o mutante en condiciones de desnaturalización mediante el uso de BN-PAGE y Transferencia Western

La caracterización de las mismas muestras (cada 5 pg) en electroforesis BN-PAGE y la posterior Transferencia Western anti-Rep también mostró significativamente menos oligómeros Rep, así como también menos agregados de alto peso molecular (Figura 4). Se detectó una especie adicional de la proteína Rep monomérica más obviamente en condiciones de PAGE nativas solo para el mutante Rep.

Todos los resultados muestran la existencia de oligómeros Rep altamente estables (MW ~ 110 kDa), que incluso resisten el tratamiento con SDS durante la electroforesis SDS-PAGE. Además, los agregados de Rep altamente estables que cubren intervalos de peso molecular incluso más altos (120-170 kDa y superiores) son detectables por electroforesis SDS-PAGE y Transferencia Western. Claramente, la intensidad de dichos agregados de alto peso molecular se reduce significativamente para el doble mutante 27/154E Rep. En general, la presencia de agregados de Rep es mayor para las proteínas que se purificaron en condiciones no desnaturalizantes. De todos modos, también las proteínas purificadas y almacenadas en condiciones de desnaturalización muestran una agregación muy fuerte, que se reduce significativamente para el doble mutante Rep. Esto es de especial interés, ya que las configuraciones experimentales de ELISA se basan en la renaturalización de los antígenos proteicos unidos a la superficie, porque la unión del antígeno con el anticuerpo requiere condiciones nativas.

Ejemplo 3:

A. Rendimiento de recubrimiento ELISA de la proteína Rep natural o mutante

Es importante destacar que el mutante de Rep doble recientemente diseñado muestra un rendimiento de recubrimiento de ELISA comparable en comparación con la proteína Rep natural (tampones de ensayo: tampón de caseína, tampón de superblock, BSA al 1 % en PBS) (Figura 5).

B. Rendimiento ELISA de la proteína Rep natural o mutante en sueros de MS humana

Adicionalmente, la reactividad de los anticuerpos reactivos con Rep en sueros de MS humana aumentó en aproximadamente un 40 % en promedio cuando se usa el doble mutante 27/154E Rep como antígeno en comparación con Rep natural en los ensayos ELISA (Figura 6)

Ejemplo 4:

Purificación del antígeno de la proteína Rep natural y mutante

Se clona una molécula de ácido nucleotídico que codifica el marco de lectura abierto (ORF) de Rep natural completo identificado dentro del genoma de MSBI1, o una molécula de ácido nucleotídico Rep doble mutante 27/154E en un plásmido de expresión (pEXP5-CT, Invitrogen) que permite la expresión de proteínas en E. coli. Brevemente, químicamente competente E. coli (SoluBl21, Genlantis) se transfectaron con el plásmido de expresión seguido por una selección clonal en placas de agar LB con ampicilina. Los clones de expresión de proteínas de alto nivel se seleccionaron mediante expresiones de análisis de proteínas en una preselección de bajo volumen. Por lo tanto, los cultivos clonales se expandieron hasta aproximadamente 10 ml en LB Amp (37 °C, dispositivo de agitación) hasta que se alcanzó una OD600 de 0,4 - 0,6 seguido por la inducción de la expresión de proteínas con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 0,66 mM) durante la noche a 25 °C en un dispositivo de agitación.

La expresión de la proteína objetivo se determinó mediante electroforesis SDS-PAGE y transferencia Western de los lisados de E.coli (preparados en tampón de muestra Lammli de electroforesis SDS-PAGE) con anticuerpos anti-His que reaccionan contra la etiqueta C terminal 6xHis de la proteína Rep. El cultivo inicial de E. coli que mostraba la expresión más alta de la proteína Rep se expandió después a 1000 ml de LB Amp, que se llevó a una OD600 de 0,5. La expresión de proteínas fue inducida por IPTG (0,66 mM) durante la noche a 25 °C en un dispositivo de agitación. Después, las células se centrifugaron a 6000 g a 4°C, se lavaron con PBS y se almacenaron a -80 °C en alícuotas (10 alícuotas correspondientes a cada 100 ml del cultivo de E. coli inducido por IPTG inicial de 1000 ml).

La proteína Rep sintetizada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 (natural) o SEQ ID NO:11 (mutante) dentro de la expresión de E. coli se desnaturaliza mediante la adición de 20 volúmenes de reacción de tampón de muestra de urea 8 M pH 8,0 que contiene NaH2PO4 100 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,0, imidazol 5 mM, beta-mercaptoetanol 5 mM. La proteína Rep se purificó subsecuentemente bajo condiciones de desnaturalización (55 mM de imidazol para el lavado y 300 mM de imidazol para la elución de la proteína), sobre la base de una etiqueta His6 C terminal que se fusionó con la proteína Rep. La calidad de la purificación se determinó mediante tinción de proteína Coomassie y Transferencia Western con anticuerpos antiproteína Rep. La pureza de la proteína Rep se calcula densitométricamente y es superior al 95 %. La proteína purificada se usa directamente para el cribado de sueros basado en ELISA o se somete a una electroforesis SDS-Page seguida de transferencia a membranas de nitrocelulosa para la incubación de los sueros con las tiras de membrana de proteína Rep de tamaño 1D.

Resumen de secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína asociada a la replicación de ADN (Rep) que comprende la secuencia de aminoácidos como se representa en las SEQ ID NO: 11 o 12.

2. Un método para diagnosticar la MS en un sujeto que comprende las etapas de

(a) incubar una muestra de un sujeto con una proteína Rep como se define en la reivindicación 1;

(b) detectar la cantidad de anticuerpos en la muestra del sujeto que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep; y

(c) correlacionar la cantidad de anticuerpo unido a la proteína Rep en la muestra del sujeto, en comparación con una cantidad en una muestra de control, con un diagnóstico de MS.

3. El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa (a) la proteína Rep se inmoviliza seguido por la incubación de la proteína Rep inmovilizada con la muestra del sujeto.

4. El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa (a) la proteína Rep se expresa en las células seguido por la incubación de las células con la muestra del sujeto.

5. El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa (b) la cantidad de anticuerpos que forman un complejo inmunológico con la proteína Rep se cuantifica mediante un agente de unión de detección acoplado a un compuesto generador de señales.

6. El método de la reivindicación 2, en donde en la etapa (a) los anticuerpos en la muestra del sujeto se inmovilizan seguido por la incubación con una cantidad definida de proteína Rep.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la muestra del sujeto es una muestra de suero o plasma.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en donde la MS o la predisposición a la MS se indica mediante un aumento de la cantidad de anticuerpos anti-Rep en la muestra del sujeto de al menos 2 veces en comparación con una muestra de control.

9. Un kit para su uso en el diagnóstico de la MS que comprende

(a) una proteína Rep, en donde la proteína Rep comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:11 o 12;

(b) un anticuerpo antihumano acoplado a un marcador detectable y capaz de unirse al anticuerpo anti-Rep con especificidad por una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12, y (c) una matriz sólida adecuada para inmovilizar una proteína Rep de acuerdo con (a).

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 9 para su uso en un ensayo seleccionado del grupo que consiste en ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo enzimático (EIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayo de luminiscencia (LIA) y ensayo de tira.