CN101654474A - 克隆氏病抗体表位肽和检测克隆氏病的试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表位肽，其能特异性地结合在克隆氏病患者中特别地观察到的特征抗体；以及使用上述肽方便且快速地确定对象是否患有克隆氏病的检测方法。克隆氏病抗体的表位肽包含，具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽，或其盐。提供了克隆氏病的检测试剂和检测方法，其包含该肽作为活性成分。

Description

克隆氏病抗体表位肽和检测克隆氏病的试剂
本申请为申请号200580029568.5、申请日2005年4月26日、发明名称“克隆氏病抗体表位肽和检测克隆氏病的试剂”的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于诊断克隆氏病的肽，和含有它作为活性成分的检测试剂。检测试剂可以用于克隆氏病检测方法中，后者可以使用生物样品(例如血液)通过免疫学方法方便且快速地进行。
技术背景
其原因尚不清楚的克隆氏病(Crohn’s disease)的被称作炎性肠病，炎症性肠病也包括溃疡性结肠炎。当在年轻人(十岁以上至二十岁以下)中连续观察到腹痛、腹泻、体重减轻、发烧等时，应当怀疑该疾病。诊断是基于临床症状、放射照相术和内窥镜检查或病理学检查等的组合。但是，这些技术需要经验和专家，因而在有些情况下，诊断可能较困难。特别是，在疾病的早期，在许多情况下难以区分克隆氏病和溃疡性结肠炎。另一方面，胃肠放射照相术和内窥镜检查(它们是基本的诊断技术)存在它们会在生理上或心理上给患者造成疼痛的缺点。因此，需要以方便且准确的方式体外诊断克隆氏病的试剂和方法。
关于炎症性肠疾病的病因学，长期以来报道外源性因子(例如细菌，病毒和营养抗原)与肠炎有关。特别是关于克隆氏病，已经报道了副结核分枝杆菌的感染和检测的实例(非专利文件1至4，等)；检测面包酵母和嗜中性粒细胞的抗体的实例(非专利文件5和6，等)；和检测猪淀粉酶的抗体或检测克隆氏病抗体结合肽的抗体的实例(见专利文件1和2)。它们中的一些也报道了对该疾病特异性的抗体，但是它们自身都没有表现出对克隆氏病患者的足够的阳性百分比，存在溃疡性结肠炎的假阳性率高必须从中辨别的问题。在这种情况下，非常重要的是开发临床检测方法，通过它，可以使用对克隆氏病特异性的抗原肽，以方便且快速的方式，高准确度地特异性地诊断克隆氏病。
专利文件1：日本专利公开号H11-190734(权利要求书)
专利文件2：国际公开WO02/088175(发明内容)
非专利文件1：Elsaghier A.等，Clin Exp Immunol.，1992，90，503-508
非专利文件2：El-Zaatari F.A.等，Curr Microbiol.，1999，39，115-119
非专利文件3：Naser S，等，Vet Microbiol.，2000，77，497-504
非专利文件4：Suenaga K，等，Dig Dis Sci.，1999，44，1202-1207
非专利文件5：Quinton J F，等，Gut，1998，42，788-791
非专利文件6：Peeters M，等，Am J Gastroenterol.，2001，96，730-734
发明内容
本发明要解决的问题
在上述环境下，本发明的目的是提供一种表位肽，其特异性地结合在克隆氏病患者中特定地被观察到的、且是克隆氏病的特征的抗体；含有该肽作为活性成分的检测试剂和检测试剂盒；和使用它们方便且快速地检查患者是否患有克隆氏病的检测方法。
解决问题的手段
为了解决上述问题，发明人已经进行了免疫学和分子生物学研究，且已经发现，某些肽会特异性地识别和结合存在于克隆氏病患者血清中的特定抗体。已经证实，使用这些肽可以方便且准确地确定患者是否患有克隆氏病。因此，本发明涉及下面的(1)至(4)：
(1)克隆氏病抗体的表位的特征肽，其表示为下面的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽，或其盐；和
(b)包含修饰的SEQ ID NO：1至3中的任一个的氨基酸序列的肽或其盐，其中取代、缺失或添加了一个或多个氨基酸，且其具有结合克隆氏病患者血清中的抗体的特性。
(2)克隆氏病的检测试剂，其包含克隆氏病抗体的表位的上述特征肽(a)或(b)作为活性成分。
(3)克隆氏病的检测试剂盒，其包含上述克隆氏病的检测试剂作为克隆氏病抗体的抗原物质。
(4)克隆氏病的检测方法，其包含确定生物样本中是否存在结合上述肽(a)或(b)的抗体的步骤。
在下文中，根据IUPAC和IUB的规则“the Guideline forpreparing specifications，etc.，containing base sequence oramino acid sequences”(日本专利局编)，在本说明书中表示氨基酸、肽、碱基序列等的缩写，并使用本领域的常规标识。
另外，克隆氏病抗体在本文中指在患有克隆氏病的活体中产生、因而是如上所述的克隆氏病的特征的抗体，因此指无论致病抗原的类型都可以在克隆氏病患者中被特异地观察到、因而是克隆氏病的特征的抗体。
发明的效果
根据本发明，提供了克隆氏病抗体表位肽，其特异性地结合在克隆氏病患者中特定地被观察到的克隆氏病抗体，并包含在用于诊断克隆氏病的检测试剂或检测试剂盒中。因而，还提供了有用的克隆氏病检测方法，其可以以方便、快速且准确的方式，检查和确定患者是否患有克隆氏病。
附图说明
图1的散点图显示了在实施例1中得到的克隆氏病抗体表位肽(TCP-47，TCP-336和TCP-353)与克隆氏病患者血清(缩写为CD)(32份样品)、溃疡性结肠炎患者血清(缩写为UC)(32份样品)和健康人血清(32份样品)的反应性的ELISA测量结果。在图中，*，**，***，和****表示，当比较每种肽与克隆氏病患者血清的反应性和它与溃疡性结肠炎患者血清或健康人血清的反应性时的统计显著性水平(*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，且****：p＜0.0001；通过Mann-WhitneyU检验)。另外，点划线表示截止值。
图2显示了通过ELISA用TCP-47或TCP-336得到的ROC曲线，其中基于克隆氏病患者血清的32份样品和健康人血清的32份样品的ELISA测量值，得到了灵敏度和1-特异性，并分别沿垂直和水平轴绘图。在图中，点划线表示截止值。
图3的散点图显示了TCP-353与克隆氏病患者血清(CD，60份样品)、溃疡性结肠炎患者血清(UC，109份样品)、急性肠炎患者血清(11份样品)、结肠癌患者血清(35份样品)、慢性肝病患者血清(49份样品)和健康人血清(71份样品)的反应性的ELISA测量结果。在图中，**和****表示，当比较TCP-353与克隆氏病患者血清的反应性和它与各种患者血清和健康人血清的反应性时的统计显著性水平(**：p＜0.01，且****：p＜0.0001；通过Mann-WhitneyU检验)。另外，点划线表示截止值。
图4显示了ASCA-IgG ELISA和TCP-353ELISA之间的对比结果，该散点图显示了与克隆氏病患者血清(CD，60份样品)、溃疡性结肠炎患者血清(UC，109份样品)、急性肠炎患者血清(11份样品)、结肠癌患者血清(35份样品)、慢性肝病患者血清(49份样品)和健康人血清(71份样品)的反应性的ELISA测量结果。另外，点划线表示截止值。
图5显示了TCP-353 ELISA和ASCA-IgG ELISA之间的关联。将通过ASCA-IgG ELISA和TCP-353 ELISA测得的克隆氏病患者血清值分别沿垂直和水平轴绘图。字母r是相关系数。
图6显示了TCP-353 ELISA和cocktail-MAP ELISA之间的对比结果。该散点图显示了与克隆氏病患者血清(CD，60份样品)、溃疡性结肠炎患者血清(UC，109份样品)、急性肠炎患者血清(11份样品)、结肠癌患者血清(35份样品)、慢性肝病患者血清(49份样品)和健康人血清(71份样品)的反应性的ELISA测量结果。另外，点划线表示截止值。
图7显示了cocktail-MAP ELISA和TCP-353 ELISA之间的关联。将通过cocktail-MAP ELISA和TCP-353 ELISA测得的克隆氏病患者血清值分别沿垂直和水平轴绘图。字母r是相关系数。
图8显示了氨基酸序列与TCP-47同源的蛋白，通过BLAST搜索，从蛋白数据库中找到了它们。在图中，丨表示氨基酸匹配，且：表示氨基酸相似。
图9显示了氨基酸序列与TCP-336同源的蛋白，通过BLAST搜索，从蛋白数据库中找到了它们。在图中，丨表示氨基酸匹配，且：表示氨基酸相似。
图10显示了氨基酸序列与TCP-353同源的蛋白，通过BLAST搜索，从蛋白数据库中找到了它们。在图中，丨表示氨基酸匹配，且：表示氨基酸相似。
具体实施方式
1.克隆氏病抗体的表位肽
具有SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽，可以明确地例证根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽。
除了具有SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽以外，根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽可以是具有SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽，其中一个或一些(2个或多个)氨基酸被另一种氨基酸取代，或被添加或缺失。因而，根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽包括下述肽：其具有经在每种这样的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而修饰的氨基酸序列，或具有这样的氨基酸序列的一部分，只要该肽具有特异性地结合克隆氏病抗体的特性。
所有上述肽的特征在于，特异性地结合克隆氏病抗体。
对氨基酸的取代、缺失或添加的程度、位点等没有特别的限制，只要修饰的肽的特征在于，其与具有SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽相同，能特异性地结合克隆氏病抗体。
尽管氨基酸序列的修饰(诱变)因突变、翻译后修饰等而发生，它可以人工地诱导。修饰(诱变)氨基酸序列的方法是本领域众所周知的技术，包括基因工程技术，例如位点特异性的诱变(Methods inEnzymology，154，350，367-382(1987)；Ditto，100，468(1983)；Nucleic Acids Res.，12，9441(1984)；日语音译Zoku seikagakuJikken Koza 1”、“Ideshi Kenkyuho II”，它指后续的生物化学实验讲座1“基因研究方法学II”，以及化学合成技术，例如磷酸三酯方法和亚磷酰胺方法(J.Am.Chem.Soc.，89，4801(1967)；Ditto，91，3350(1969)；Science，150，178(1968)；Tetrahedoron Lett.，22，1859(1981)；Ditto，24，245(1983))。
另外，在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的肽所例证的根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽中，C末端可以是任意的羧基(-COOH)、酰胺基(-CONH2)和酯基(-COOR)。在这里，酯基中的R包括，例如，C1-6烷基，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基和正丁基；C3-8环烷基，例如环戊基和环己基；和C6-12芳基，例如苯基和α-萘基。
当在本发明中使用的肽在C末端以外的位置具有羧基时，这样的羧基可以酰胺化或酯化，且这样的肽也包括在本发明的肽中。在该情况下，这样的酯包括，例如，上面关于C末端酯所述的那些。
另外，本发明的肽也包括这样的肽：其中在N末端的氨基酸残基的氨基酸基团被保护基团(例如，C1-6酰基，例如甲酰基和乙酰基)保护；其中通过活体中的裂解产生的在N末端的谷氨酰胺残基被改变成焦谷氨酸；其中分子中的氨基酸侧链上的取代基(例如，羟基，巯基，氨基，咪唑基，吲哚基和胍基)被合适的保护基团保护；和复杂的肽，例如具有结合的糖链的所谓的糖基肽。
因为从免疫学的观点看，认为抗体识别所需的最少氨基酸数是4，根据上述的本发明的克隆氏病抗体的上述表位肽的氨基酸数是4或更大，但是没有具体的上限，只要它具有特异性地结合和识别在克隆氏病患者中观察到的克隆氏病抗体的特性。从化学合成的观点，例如肽合成，氨基酸的数目通常例如由4至约500个。
本发明的肽的盐包括生理上可接受的与酸或碱的盐。这样的盐的实例包括与无机酸的盐，例如盐酸，磷酸，氢溴酸和硫酸；和与有机酸的盐，例如醋酸，甲酸，丙酸，富马酸，马来酸，琥珀酸，酒石酸，柠檬酸，苹果酸，草酸，苯甲酸，甲磺酸和苯磺酸。另外，包括例如，与碱金属(例如钠和钾)的盐；与碱土金属(例如镁和钙)的盐；与胺(例如单甲基胺和三乙基胺)的盐；与季铵(例如三甲基乙基铵和四甲基铵)的盐。
在下文中，详细描述的制备或生产方法，以及根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽或其盐(在下文中，也统一称作克隆氏病抗体的表位肽)，包括具有SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽或其盐，以及包含修饰的SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽，其中一个或一些(2个或多个)氨基酸被取代、添加或缺失，且具有特异性地结合克隆氏病抗体的性能，或其盐。
2.克隆氏病抗体的表位肽的制备
通过使用噬菌体展示文库(基因组文库，cDNA文库，或随机的肽文库)筛选技术，可以得到根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽。这样的筛选技术称作噬菌体展示技术，且被本领域的许多技术人员用作已知的技术，用于融合噬菌体外壳蛋白和外源抗原性表位，在噬菌体表面上表达该表位，随后用探针(例如抗体)进行选择(Scott J.K.和Smith G.P.，Science，249，386-390(1990)；Dybwad A.，等，ClinExp Immunol，102，438-442(1995)；Bluthner M.，等，J ImmunolMethods，198，187-198(1996))。
用于文库的噬菌体包括丝状噬菌体(M13，f1，fd，lf1等：SmithG.P.等，Science，228，1315-1317(1985)；Devlin J.J.等，Science，249，404-406(1990)；Cwirla S.E.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6378-6382(1990))；λ噬菌体(Maruyama I.N.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，8273-8277(1994)；SantiE.，等，J.Mol Biol，296，497-508(2000))；和T7噬菌体(美国专利号5766905；Novagen T7 Select System Manual TB178(2000))。如下诱导作为文库的蛋白在噬菌体表面表达：使用众所周知的基因操作技术，克隆基因组、cDNA或位于编码噬菌体外壳蛋白的基因的上游或下游的随机寡核苷酸，将它们表达为衣壳融合蛋白，其然后可以分别用作基因组文库、cDNA文库或随机肽文库。
在使用筛选技术得到克隆氏病抗体的表位肽的具体方法中，下面的使用cDNA文库的方法适用于本发明。
首先，从培养的细胞(例如结肠癌细胞)提取总RNA，用寡(dT)柱纯化聚(A)+RNA。由此，使用随机的寡核苷酸(优选地用约8个碱基)和逆转录酶合成单链cDNA。然后，使用RNA酶H和大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA，并结合连接序列，用限制酶进一步消化，得到具有粘性末端的双链cDNA。最后，用相同的限制酶剪切噬菌体DNA，并用DNA连接酶与上述的cDNA连接，从而根据体外包装方法构建cDNA文库。
将得到的cDNA文库加入预先用蛋白G等固定了克隆氏病患者血清抗体的微量平板、微珠等，以捕获特异性地结合克隆氏病患者血清抗体的噬菌体。对要固定化到微量平板等上的克隆氏病患者血清抗体没有特别的限制，只要它能至少结合抗原。例如，可以使用从克隆氏病患者收集的血清本身。在使用前，可以用硫酸铵溶液沉淀这样的血清，或用蛋白A纯化。
通过洗涤去除不结合或仅仅微弱地结合的不感兴趣的噬菌体，重复这样的操作数次，然后用十二烷基硫酸钠(在下文中，缩写为SDS)等解离固定化的克隆氏病患者血清抗体和噬菌体，以便洗脱能结合克隆氏病患者血清中的克隆氏病抗体的噬菌体。
为了进一步选择具有对克隆氏病患者血清抗体的特异性的噬菌体，用上面的洗脱的噬菌体悬浮液感染大肠杆菌宿主，并允许在含有蛋白表达诱导物(异丙基-β-D(-)-硫代吡喃型半乳糖苷)的LB琼脂培养基上形成单个的噬菌斑。将这些噬菌斑转移到硝酸纤维素膜等，使用克隆氏病患者血清进行免疫染色，以便区分和分离结合克隆氏病患者血清抗体的噬菌体。
通过抗噬菌体抗体，将得到的噬菌体固定化到微量平板等上，并与来自克隆氏病患者、溃疡性结肠炎患者和健康人群的血清反应。以便基于反应性(在下文中，也称作噬菌体ELISA)，选择与克隆氏病患者血清抗体特异性地反应的噬菌体。更具体地，通过使它们与固定化到支持物(例如微量平板)上的抗噬菌体抗体反应，固定化上面得到的噬菌体。使固定化的噬菌体与来自克隆氏病患者的血清以及对照血清反应，所述对照血清例如来自健康人群的血清，来自患有溃疡性结肠炎或其它疾病(例如自身免疫病，结肠癌，急性肠炎，胃溃疡和十二指肠溃疡)的患者的血清，以便基于反应性选择与克隆氏病患者血清特异性地反应的噬菌体。
从通过上述的噬菌体ELISA筛选选择的噬菌体，提取和纯化DNA，并通过双脱氧方法等，确定***的cDNA的碱基序列。基于得到的碱基序列，可以确定氨基酸序列，从而可以通过一般的化学合成等，包括通过液相方法或固相方法的肽合成，得到根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽。
更具体地，基于确定的氨基酸序列，通过逐步的延伸或片段凝缩方法，可以实现化学合成。常规已知的方法可以用于肽合成中使用的氨基酸的保护基团的去除、缩合等，以便制备目的肽。实例包括下述出版物所述的那些方法：M.Bodanszky和M.A.Ondetti，“PeptideSynthesis”，Interscience Publishers，New York，1966；Schroeder和Luebke，“The Peptide”，Academic Press，New York，1965；等，“Pepuchido Gosei No Kiso To Jikken”，它指肽合成的基础和实验，Maruzen，1975；Huruaki yajima and Shunper Sakakibara，日语音译“Seikagaku Jikkenn Koza 1，Tanpakushitsu No Kagaku IV”，它指生物化学实验讲座1，蛋白化学IV，205，1977；Haruaki Yajima，编，日语音译“Zoku Iyakuh in NO Kaihatsu Vol.14，PepuchidoGosei”，它指后续的药物开发，卷14，肽合成，Hirokawa Publishing.
另外，基于确定的氨基酸序列，可以制备人工修饰的肽，其中取代、缺失或添加了一个或多个氨基酸。更具体地，它们可以通过基因工程技术(例如位点特异性的诱变)和常规地已知的化学合成技术(例如如上所述的亚磷酰胺方法)制备。这些修饰的肽可以用作根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽。
另外，基于确定的氨基酸序列，可以在数据库中搜索同源的肽序列。通过已知的分子生物学技术，可以制备含有这样的肽的高度同源的肽或蛋白，其可以用作根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽。
通过常规地已知的蛋白或肽分离和纯化方法的组合，可以分离和纯化如上所述得到的根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽。这些已知的分离和纯化方法包括：使用溶解度的方法，例如盐沉淀和溶剂沉淀；主要使用分子量差异的方法，例如透析，超滤和凝胶过滤；使用电荷差异的方法，例如离子交换色谱和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；使用特异性的亲合力的方法，例如亲合色谱；使用疏水性差异的方法，反相高效液相色谱；使用等电点的差异的方法，例如等电点聚焦。另外，使用氨基酸分析仪，可以容易地测量和分析纯化的肽的氨基酸组成。
当通过上述方法得到的肽是游离形式时，可以通过已知的方法或与其等同的方法，将它转化成合适的盐。相反地，当得到作为盐的肽时，可以通过已知的方法或与其等同的方法，将它转化成游离形式或另一种盐。
3.克隆氏病的检测试剂、检测试剂盒和检测方法
上述的克隆氏病抗体的表位肽具有特异性地结合克隆氏病患者血清中的克隆氏病抗体的性能。利用这样的结合性能，提供了克隆氏病的检测试剂、检测试剂盒和检测方法，其采用这样的肽作为活性成分。
更具体地，提供了：1)克隆氏病的检测试剂，其包含上述的克隆氏病抗体的表位肽作为活性成分；2)克隆氏病的检测试剂盒，其包含上面1)所述的检测试剂；3)克隆氏病的检测方法，其包含检测生物样本中是否存在特异性地结合克隆氏病抗体的上述表位肽中的至少一种肽的抗体的步骤；和4)克隆氏病的检测方法，其包含使用上述检测试剂或检测试剂盒的步骤。
1)克隆氏病的检测试剂
当使用上面的克隆氏病抗体的表位肽作为活性成分时，具体的活性成分是选自下述的至少一种肽或其盐：(a)包含SEQ ID NO：1至3中的任一个所示的氨基酸序列的肽，或其盐；和(b)肽或其盐，其中该肽包含修饰的SEQ ID NO：1至3所示的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代，或添加或缺失了一个或多个氨基酸，或者包含这样的氨基酸序列的一部分，且具有特异性地结合克隆氏病患者血清中的抗体的性能。
可以单独地或以2种或多种的任意组合，使用克隆氏病抗体的上述表位肽，作为克隆氏病的检测试剂的活性成分。
根据本发明的克隆氏病的检测试剂，可以用作特异性地结合克隆氏病抗体的抗原，以便进行克隆氏病抗体的检测、捕获等。为了覆盖这些目的的范围，活性成分可以不仅仅是克隆氏病抗体的上述表位肽，也可以是标记的形式(标记的肽)，其中用某种标记化合物标记该肽。
可以使用在本领域经常使用的标记化合物，作为标记上述肽的化合物，其具体实例包括，放射性同位素例如3H，14C，131I和99mTc；酶例如β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，碱性磷酸酶，过氧化物酶和苹果酸盐脱氢酶；荧光物质例如荧胺和异硫氰酸荧光素；和发光物质例如荧光素，氨基苯二酰肼衍生物和异氨基苯二酰肼衍生物。
使用酶、放射性同位素等标记的本发明的肽，可以进行克隆氏病抗体的检测、捕获等。另外，如以后将详细描述的，使用例如免疫测定，例如放射免疫测定和酶免疫测定，也可以将没有标记的本发明的肽用作检测试剂。
2)克隆氏病的试剂盒
当使用对象的生物样本例如血液(血清或血浆)测试克隆氏病时，可以容易且方便地使用含有上述试剂的检测试剂盒，其包含克隆氏病抗体的表位肽作为活性成分。
根据本发明的克隆氏病的检测试剂盒不仅仅可以使用根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽，也可以是标记的形式(标记的肽)，其中用如上所述的某种标记化合物标记该肽，只要检测试剂盒含有上面的检测试剂，以便允许该试剂结合克隆氏病抗体。另外，通过将该肽预先固定化到给定的支持物(固相)上，可以以固定化的形式使用该肽。
除了上面的试剂外，根据本发明的克隆氏病检测试剂盒可以根据克隆氏病测试采用或适用的免疫测定和检测方法(将在下面描述)的类型，任选地使用其它试剂。例如，当以放射性同位素标记的形式使用克隆氏病抗体的表位肽时，需要放射性检测装置，例如液体闪烁计数器；当以酶、荧光物质或发光物质标记的形式使用时，需要相应的检测装置。因此，在本发明的检测试剂盒中，包含每个目的所需的检测试剂、溶剂、基本物质等作为其它成分。
更具体地，本发明的检测试剂盒优选地含有用于检测人免疫球蛋白(也称作人IgG)的第二抗体(抗人IgG抗体，例如小鼠抗人IgG抗体)作为上述检测试剂以外的成分，所述检测试剂包含克隆氏病抗体的上述表位肽作为活性成分。可以用上述的标记化合物标记抗人IgG抗体，或可以固定化到预先准备的支持物(固相)上。
另外，检测试剂盒可以包括标记化合物所需的酶底物或酶；用于检测标记化合物和酶底物之间的反应的检测试剂；和方便地进行测量的其它物质，包括各种合适的样品，试剂，第二抗体等的稀释溶液标准抗体，缓冲溶液，洗涤溶液，酶底物溶液，和反应终止溶液。另外，当没有标记或固定化上述的检测试剂或抗人IgG抗体时，检测试剂盒可以包括上述的标记化合物或支持物(固相)作为另一种组分。
根据本发明的克隆氏病的检测试剂盒是上述检测试剂的组合，其包含克隆氏病抗体的表位肽作为活性成分(可以固定化和/或标记该肽)，至少一种任意地选自抗人IgG抗体(它是可以固定化和/或标记的第二抗体)；标记化合物所需的底物(当标记化合物是酶时，指酶底物；当标记化合物是荧光物质或发光物质等时，指酶)；抗体稀释溶液；标准抗体；缓冲溶液；洗涤溶液；酶底物溶液；反应终止溶液；支持物(固相)；和标记化合物。在根据本发明的克隆氏病的检测试剂盒中，从测量的可操作性、安全性、灵敏度和准确度等观点看，优选地使用酶作为标记化合物。
3)克隆氏病的检测方法
根据本发明的克隆氏病的检测方法使用对象的生物样本作为样品，检查每个对象是否患有克隆氏病。更具体地，使用特别地存在于克隆氏病患者的生物样本中的某些抗体作为标志物，检查每个对象是否患有克隆氏病。样品包括各种生物样本，例如血液(血清或血浆)，尿，汗，唾液，(人)对象的***和脊髓液，优选地是血清或血浆。
根据本发明的克隆氏病的检测方法的特征在于，使用克隆氏病抗体的上述表位肽作为抗原物质。更具体地，当克隆氏病抗体存在于对象的生物样本中时，由于抗原-抗体反应，它会与作为抗原的克隆氏病抗体表位肽形成复合物。通过检测和测量这样的复合物，可以诊断克隆氏病的发生或未发生等。
用于检测由作为抗原的克隆氏病抗体表位肽和克隆氏病抗体(它是克隆氏病患者的特征)之间的反应生成的复合物的方法，可以是常规地已知的方法。其实例包括放射免疫测定，酶免疫测定，免疫色谱等。当这些免疫学测定用于本发明的检测方法时，不需要特殊的条件、操作等。使用每种技术的普通条件和操作，以及本领域的技术人员给出的一般技术考虑，可以构建测量***。关于这样的一般技术的详细描述，可以参考综述和书籍。可以参考例如，Hiroshi Irie，编，“Radioimmunoassay”(Kodansha，1964)；Hiroshi Irie，编，“Sequel Radioimmunoassay”(Kodansha，1979)；Eiji Ishikawa，等，编，日语音译”Koso Meneki sokuteiho”，它指Enzyme Immunoassay(Igakushoin，1978)；Eiji Ishikawa，等，编，日语音译”KosoMeneki sokuteiho”，它指Enzyme Immunoassay(第2版)(Igakushoin，1982)；Eiji Ishikawa，等，编，日语音译”Koso Meneki sokuteiho”，它指Enzyme Immunoassay(第3版)(Igakushoin，1987)。
另外，在根据本发明的克隆氏病的检测方法中，优选地使用上面的检测试剂或检测试剂盒，其包含克隆氏病抗体的上述表位肽作为活性成分。
更具体地，根据本发明的克隆氏病的检测方法可以采用多种免疫学测定，其使用克隆氏病抗体的上述表位肽作为抗原物质。例如，对于使用人血清作为样品的固相酶联免疫吸附测定(在下文中，也称作ELISA)，可以通过下面的方法检测和测量要检查的克隆氏病抗体。
首先，将作为抗原物质的上述克隆氏病抗体表位肽固定化到支持物等上，向它添加作为样品的生物样本。如果样品中存在克隆氏病抗体，它会结合固定化的肽。然后，通过进行第二种抗原-抗体反应、检测等，使用检测试剂例如特异性地结合人IgG的抗-人IgG抗体(第二种抗体包括用标记物标记的抗体)，可以检测和测量存在于样品中的克隆氏病抗体。
或者，可以将检测试剂(例如抗人IgG抗体)预先固定化到支持物上，向它添加样品，以便捕获生物样本中的克隆氏病抗体。然后，通过添加上述的克隆氏病抗体表位肽作为抗原物质，也可以检测和测量存在于样品中的克隆氏病抗体。本领域的技术人员众所周知这些测定技术的各种方法的选择、其改进等，因而它们都可以用于本发明中(见，日语音译”Rinsho Kensaho Teiyo”，它指Laboratory TestMethods Synopsis，Kanehara，1995；等)。
对用于检测克隆氏病抗体的检测试剂(例如抗人IgG抗体)没有特别的限制，可以使用各种常用的可商业上得到的试剂。例如，优选地使用特异性地结合人IgG的抗人IgG抗体，其可以通过用作为抗原的人IgG致敏的非人物种(例如小鼠，兔子，山羊和猪)来得到。可以用上述的标记化合物标记这些抗人IgG抗体和人IgG。用于该标记目的的标记化合物包括上述的标记化合物。更具体地，优选用酶这样的标记化合物标记的那些。这些标记的抗人IgG抗体和人IgG可商业上得到，但是可以根据普通方法制备。
在根据本发明的克隆氏病的检测方法中，从可操作性、安全性、测量灵敏度和准确度等观点看，优选地采用酶免疫测定，例如使用酶作为如上所述的标记化合物的ELISA。用于酶标记的标记化合物包括上述的那些。另外，使用这些酶标记化合物的标记方法，可以是常规的已知的方法(Eiji Ishikawa，等，编，日语音译”Koso Menekisokuteiho”，它指Enzyme Immunoassay，第2版，Igakushoin，1982)。
另外，当在上述测定中采用固相方法时，对支持物没有特别的限制，只要它们是不溶的且惰性的载体，且可以广泛地使用通常采用的那些。其实例包括微量平板，珠子，膜，棒，试管等，它们由玻璃、葡聚糖、琼脂糖和塑料树脂(聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，等)等材料制成。
另外，通过物理吸附，可以使作为抗原的根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽或作为第二抗体的抗-人IgG抗体不溶。通过依赖于化学键合的方法，它通常用于使蛋白、酶等不溶或固定化，也可以使它们不溶。
在上面的ELISA中，使样品与克隆氏病抗体的固定化的表位肽反应(初次反应)，然后使标记的抗人IgG抗体与其反应(二次反应)，随后测量固定化的载体上的标记的化合物的活性。由此可以检测或定量样品中包含的克隆氏病抗体。可以在同时或以特定间隔，进行初次反应和二次反应。标记和固定化的方法类似于上述的那些。另外，在ELISA免疫测定中，固定化到载体上的抗体或标记的抗体不一定是一种，为了提高测量的灵敏度等目的，可以是两种或多种抗体的混合物。
在上述测量***中使用的溶剂可以是通常采用的那些，只要它们不会影响反应，其实例包括pH约6-9的缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液(在下文中，缩写为PBS)，硼酸盐缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，柠檬酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲溶液；和含有表面活性剂(例如吐温20和Triton-100)、稳定剂(例如牛血清白蛋白(在下文中，缩写为BSA)和乳蛋白)或防腐剂(例如NaN3)的缓冲溶液。
对免疫反应条件也没有限制，采用通常用于免疫测定的普通条件。通常，条件可以是在约4至40℃的温度约0.5至24小时。
在上述操作中，通过适合使用的标记化合物的类型的方法，可以进行由抗原-抗体反应得到的复合物(包括用标记化合物标记的形式的复合物)的测定。例如，当标记化合物是酶时，可以根据适合使用的酶的类型的已知方法测量标记形式的酶活性。
通过广泛使用的方法，可以进行这样的酶活性的测定，其中添加适合酶的底物，例如，对于过氧化物酶是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(缩写为TMB)或邻苯二胺(缩写为OPD)，或对于碱性磷酸酶是对硝基苯基磷酸酯(缩写为pNPP)，并反应给定的时间长度，随后通过分光光度计等测量产生的颜色。
下面总结了根据本发明的克隆氏病的检测方法：
<1>将作为抗原的克隆氏病抗体的表位肽固定化在微量平板的每个孔中。通常，用蛋白(例如BSA和酪蛋白)或表面活性剂(例如吐温20)封闭孔中的非特异性的结合位点；
<2>用任选地含有蛋白(例如BSA和酪蛋白)或表面活性剂(例如吐温20)的缓冲溶液(样品稀释溶液)稀释样品(血清或血浆样本)，然后加入上述固定化的微量平板，从而实现抗原-抗体反应(初次反应)；
<3>用优选地含有表面活性剂(例如吐温20)的缓冲溶液(洗涤溶液)洗涤微量平板，然后用含有蛋白(例如BSA和酪蛋白)或表面活性剂(例如吐温20)的缓冲溶液(稀释溶液)稀释标记的抗人IgG抗体，并添加，以实现抗原-抗体反应(二次反应)；和
<4>用上述洗涤溶液洗涤微量平板后，进行适合标记的测定，也就是说，对于放射性标记，测量放射活性，对于酶标记，测量酶活性。
在下文中，列举实施例来详细地解释本发明，但是本发明不应当理解为限于这些实施例。
实施例1
<克隆氏病抗体的表位肽的选择和鉴别>
1)使用T7噬菌体制备cDNA噬菌体展示文库
使用来自Qiagen公司的RNA提取试剂盒，从约108个培养的Caco-2细胞(人结肠癌；RIKEN CELL BANK)提取和纯化总RNA，得到654ug总RNA。使用寡(dT)-纤维素柱，从600ug总RNA纯化出22.8ug聚(A)+RNA，然后使用随机寡聚物(nnnnnnCG)和逆转录酶(来自Qiagen公司的Omni-RT)，合成单链cDNA。
然后，使用RNase H和大肠杆菌DNA聚合酶I，合成双链cDNA，然后用T4DNA聚合酶将它末端平化。用甲基酶将cDNA甲基化后，用T4 DNA连接酶连接连接序列(18mer寡DNA)，并用限制酶(EcoRI和NotI)进一步剪切cDNA的末端，然后用旋转柱(来自Clontech)进凝胶过滤，去除未反应的连接物和剪切的小片段。
用相同的限制酶剪切T7噬菌体载体(来自Novagen)，用T4 DNA连接酶将上面得到的cDNA片段与其连接。使用该连接溶液和T7噬菌体体外包装试剂盒(来自Novagen)形成噬菌体颗粒，然后用它们感染宿主大肠杆菌BLT5615，以允许它扩增。制备了大小为约1.3×107的cDNA文库。
2)筛选结合克隆氏病患者血清抗体的抗原噬菌体
将宿主大肠杆菌BLT5615的单个菌落接种进含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃进行培养，直到在600nm的浊度变成0.5。向该大肠杆菌培养溶液中，加入异丙基-β-D(-)-硫代吡喃型半乳糖苷(在下文中，缩写为IPTG)至终浓度1mM，在37℃进行培养30分钟。然后，向其中加入在1)中制备的cDNA文库或可商业上得到的源自结肠癌的cDNA文库，继续在37℃培养，直到发生完全裂解。裂解后立即地，在冰上冷却混合物，然后离心去除裂解的细胞碎片，从而得到上清液。向该上清液中，加入等体积的乳缓冲液(25mM Tris-HCl缓冲液(含有137mM NaCl，和2.68mM KCl；pH 7.4)(在下文中，缩写为TBS)，其含有5％脱脂乳和0.1％吐温20)，得到在下面的操作中使用的裂解的噬菌体溶液。
向微量平板(来自Dynatec Lab.)中，加入用PBS稀释至20ug/ml的蛋白G(来自Sigma)，在4℃反应过夜。反应后，用乳缓冲液洗涤微量平板，然后用相同的缓冲液封闭，制备蛋白G-结合的平板。
从21位克隆氏病患者得到血清样品。从血清库中，得到与1至3位患者的样品等同体积的血清，并用含有0.05％NaN3的PBS稀释，然后加入蛋白G结合的平板。将平板在22℃静置2小时，使血清中的抗体结合平板，随后用乳缓冲液洗涤3次，制备克隆氏病患者血清抗体-结合的平板。
向克隆氏病患者血清抗体-结合的平板，加入上面裂解的噬菌体溶液(噬菌体滴度约1×1011pfu)，然后在室温轻轻摇动3小时，使表达抗体的噬菌体与其结合。用乳缓冲液和TBS洗涤平板，以去除未结合的噬菌体悬浮液，然后加入含有0.5％SDS的PBS，在室温摇动20小时，以洗脱结合的噬菌体，从而得到噬菌体洗脱物。
3)噬菌斑的免疫染色和结合克隆氏病患者血清抗体的抗原噬菌体 的分离
利用这样得到的噬菌体洗脱物，感染宿主大肠杆菌BLT5615，然后将其接种到含有50ug/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的LB琼脂培养基上，在37℃培养3小时，从而形成噬菌斑。将得到的噬菌斑在4℃静置1小时，然后用硝酸纤维素膜(来自Osmonics)覆盖。将膜在室温静置5分钟，将噬菌体颗粒转移于其上。
用乳缓冲液封闭膜，然后浸泡在用相同缓冲液稀释的克隆氏病患者血清中，然后将其在4℃摇动过夜。用乳缓冲液洗涤该膜3次，然后浸泡在用相同缓冲液将碱性磷酸酶标记的抗人IgG单克隆抗体(来自Sigma)稀释至1/5000的溶液中，随后在室温轻轻摇动1小时。
用乳缓冲液洗涤该膜3次，然后用100mM Tris-HCl(含有100mMNaCl和5mM MgCl2)(在下文中，缩写为AP缓冲液)洗涤，然后浸泡在含有发色溶液(0.33mg/ml硝基蓝四唑(在下文中，缩写为NBT)和0.165mg/ml溴氯吲哚基磷酸盐(在下文中，缩写为BCIP))的AP缓冲液中，以便在室温产生颜色。
刮离免疫染色的分离的噬菌斑，悬浮于含有50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中。将它的一部分加入宿主大肠杆菌BLT5615培养溶液，在37℃进行培养，直到发生完全裂解。离心该裂解的溶液，去除裂解的细胞碎片，给得到的上清液添加CHCl3至0.3％的终浓度。将其保藏在4℃，作为结合克隆氏病患者血清抗体的克隆的抗原噬菌体的溶液。
4)噬菌体ELISA
向宿主大肠杆菌BLT5615培养溶液中，加入在上面3)得到的结合克隆氏病患者血清抗体的抗原噬菌体，在37℃进行培养，直到发生完全裂解。离心该溶液，去除裂解的细胞碎片，给得到的上清液添加4倍体积的乳缓冲液。将得到的溶液用于下述操作中的初次反应。
向微量平板中，加入用PBS稀释至1μg/ml的抗T7噬菌体抗体(兔多克隆抗体)，在4℃反应过夜。反应后，用乳缓冲液洗涤微量平板，然后用相同的缓冲液封闭，制备抗T7噬菌体抗体结合的平板。
将上面的初次反应用溶液加入抗T7噬菌体抗体结合的平板，在22℃轻轻摇动2小时，使噬菌体结合平板，随后用乳缓冲液洗涤3次。向其中加入用相同缓冲液稀释至1/250的各种血清(源自克隆氏病患者，溃疡性结肠炎患者，或健康人)，在22℃静置1小时，然后用相同缓冲液洗涤6次。向其中加入用相同缓冲液将碱性磷酸酶标记的抗人IgG单克隆抗体稀释至1/5000的溶液，在22℃静置1小时，然后用相同缓冲液洗涤6次。另外，用AP缓冲液洗涤平板，然后添加对硝基苯基磷酸酯溶液(来自Sigma)，在22℃反应40分钟。加入终止溶液(2N NaOH)来终止反应，然后通过平板读数仪测量吸光度(在405nm)，以对比血清中的抗体滴度。从反应性的结果，选择3个表现出对克隆氏病患者血清的高特异性的克隆(为了方便，缩写为CD#47，CD#336和CD#353)。
5)编码抗原肽的DNA碱基序列和氨基酸序列的测定
利用通过噬菌体ELISA选出的上面3个结合克隆氏病患者血清抗体的抗原噬菌体，感染宿主大肠杆菌BLT5615，然后裂解。从得到的裂解溶液中，使用Qiagenλ试剂盒(来自Qiagen)提取噬菌体DNA。通过双脱氧方法，确定噬菌体DNA的***的cDNA碱基序列。使用单字母代码，在表1中显示了基于各***的cDNA碱基序列确定的每个克隆的氨基酸序列。
表1
Figure G2009101598810D00201
合成并纯化具有每个克隆的氨基酸序列的每种线性肽(为了方便，缩写为TCP-47，TCP-336和TCP-353)(根据需要，通过SigmaGenosis)。在下面的实验中，将这些肽用作克隆氏病抗体的表位肽。表2显示了制备的每种肽的性质。
表2
在表2中，分子量的单位是kDa；通过基于液相色谱分析的面积比(在225nm的吸光度)，表达纯度；且疏水性是疏水氨基酸含量的百分比。
实施例2
<TCP-47，TCP-336和TCP-353与各种血清样品的反应性>
使用在实施例1中得到的克隆氏病抗体的表位肽作为抗原，进行ELISA，以研究与各种血清(来自克隆氏病患者，溃疡性结肠炎患者，或健康人)的反应性。
向微量平板中，加入用PBS稀释至2μg/ml的每种肽，在4℃反应过夜。反应后，用封闭缓冲液(含有2％BSA、5％蔗糖和0.1％NaN3的PBS)洗涤微量平板，随后用相同的缓冲液封闭，以制备肽-固定化的平板。
向肽固定化的平板中，加入用样品稀释溶液(含有1％BSA和0.1％吐温20的PBS)稀释至1/100的各种血清(克隆氏病患者血清：32份样品，溃疡性结肠炎患者血清：32份样品，健康人血清：32份样品)，在22℃静置1小时，然后用洗涤缓冲液(含有0.1％吐温20的PBS)洗涤6次。然后，向其中加入用相同缓冲液稀释至1/4000的HRP标记的抗人IgG抗体(来自Dako)，在22℃静置1小时，然后用相同的洗涤缓冲液洗涤8次。再向其中加入作为发色底物的TMB溶液(来自Dako)，在22℃反应30分钟，然后加入终止溶液(2N H2SO4)来终止反应，随后通过平板读数仪测量吸光度(在450至600nm)。在图1中，将测量结果显示为散点图。
基于这些结果，进行显著性检验。与溃疡性结肠炎患者血清或健康人血清相比，所有三种肽都表现出与克隆氏病患者血清明显更高的反应性。如下所述确定截止值，且使用它们来评价阳性反应，以计算各种血清的阳性百分比。表3显示了结果。
截止值：
TCP-47，OD＝0.40：在接收器工作特性(Receiver operationgcharacteristic，ROC)曲线上，该OD值在1-0.1特异性范围内产生最高的灵敏度。
TCP-336，OD＝1.10：与上面相同。
TCP-353，OD＝0.11：来自健康人的血清的测量值的平均值+2SD。
表3
  TCP-47   TCP-336   TCP-353
  阳性百分比   克隆氏病患者(32)   40.6％(13)   28.1％(9)   53.1％(17)
  假阳性百分比   溃疡性结肠炎患者(32)   0％(0)   3.1％(1)   3.1％(1)
  健康人(32)   9.4％(3)   9.4％(3)   6.3％(2)
在表中，括号中的数字表示样品数。
如表3所示，TCP-47，TCP-336和TCP-353指示的克隆氏病患者血清的阳性百分比分别是40.6％，28.1％和53.1％，而溃疡性结肠炎患者血清和健康人血清的假阳性百分比是3.1至9.4％。这些结果证实，这些肽会特异性地结合克隆氏病患者血清中的抗体。
实施例3
<通过ELISA，用TCP-353测量许多不同的血清样品>
使用TCP-353，它在实施例2中对克隆氏病患者血清的阳性百分比最高(53.1％)，且对溃疡性结肠炎患者血清或健康人血清的假阳性百分比较低(分别是6.3％和3.1％)，来测量许多不同的血清样品(克隆氏病患者血清：60份样品，溃疡性结肠炎患者血清：109份样品，健康人血清：71份样品，急性肠炎患者血清：11份样品，结肠癌患者血清：35份样品，和慢性肝病患者血清：49份样品)。
除了将血清稀释至1/400外，以与实施例2相同的方式进行测量。另外，使用通过合并阳性患者血清制备的标准溶液，绘制标准曲线，将得到的吸光度值转化成单位值。在图3中，将测量结果显示为散点图。
基于这些结果，进行显著性检验。与溃疡性结肠炎患者血清、健康人血清、急性肠炎患者血清、结肠癌患者血清和慢性肝病患者血清相比，TCP-353表现出与克隆氏病患者血清明显更高的反应性。
另外，在表4中显示了阳性患者血清数和其阳性百分比，条件是，将截止值设定下述值：71位健康人血清样品的测量值的平均值+3SD。
表4
Figure G2009101598810D00231
在表中，括号中的数字表示样品数。
如表4所示，克隆氏病患者血清的阳性百分比是61.7％(37/60)，而疡性结肠炎患者血清、健康人血清、急性肠炎患者血清、结肠癌患者血清和慢性肝病患者血清的假阳性百分比分别是7.3％(8/109)、2.8％(2/71)、0％(0/11)、11.4％(4/35)和8.2％(4/49)。这些结果证实，本发明的检测方法可以用于检测克隆氏病的发生与否，并区分克隆氏病和其它相关疾病，尤其是溃疡性结肠炎。
实施例4
<对比使用TCP-353的ELISA和ASCA-IgG ELISA>
研究了已经报道与克隆氏病有关(Gut，1998，42，788-791；Am JGstroenterol.，2000，95，359-367；Am J Gstroenterol.，2001，96，730-734)的抗面包酵母抗体(缩写为ASCA-IgG)与各种血清的反应性，并在诊断克隆氏病的有用性方面，与使用TCP-353的ELISA(在下文中，也称作TCP-353 ELISA)相比较。
使用来自GENESIS Diagnostics的试剂盒，根据其说明手册，使用ASCA-IgG进行ELISA测量(在下文中，也称作ASCA-IgG ELISA)。在图4中，将测量结果显示为散点图。在ASCA-IgG ELISA中将截止值预先设定为90％，计算对每种血清得到的反应性百分比。表5显示了ASCA-IgG ELISA和TCP-353 ELISA之间的阳性百分比的对比结果。
另外，将通过ASCA-IgG ELISA和TCP-353ELISA测得的克隆氏病患者血清值分别沿垂直和水平轴绘图，得到相关系数，并查证2个测量***之间是否存在关联。图5显示了结果。
表5
在表中，括号中的数字表示样品数。
在表5中：
灵敏度是通过下式计算出的值：(来自克隆氏病患者的阳性血清数)/(来自测量的克隆氏病患者的血清数)×100；
特异性是通过下式计算出的值：[1-(来自非克隆氏病患者的阳性血清数)/(来自测量的非克隆氏病患者和健康人的血清数)]×100；
阳性预测值(PPV)是通过下式计算出的值：(来自克隆氏病患者的阳性血清数)/(所有阳性血清数)×100；
阴性预测值(NPV)是通过下式计算出的值：(来自非克隆氏病患者的阴性血清数)/(所有阴性血清数)×100；
图4和表5的结果证实，使用TCP-353的ELISA在灵敏度和特异性方面都胜过ASCA-IgG ELISA，且还具有更高的阳性和阴性预测值，指示着更高的诊断准确度。另外，从图5得到的相关系数是0.229，指示着2个测定***之间没有关联，这暗示着通过每个***可以测量不同的抗体。
实施例5
<与结合克隆氏病抗体的已知支链肽对比>
针对在诊断克隆氏病的有用性，与使用TCP-353的ELISA相比较，制备了4种支链肽(缩写为cocktail-MAP；WO 02/088175 A1)，它们是结合克隆氏病抗体的肽。
根据国际公开(WO 02/088175 A1)进行使用cocktail-MAP的ELISA(也称作cocktail-MAP ELISA)，例外是，使用在TCP-353 ELISA中采用的相同标准溶液，并将测量的吸光度值转化成指数值。在图6中，将测量结果显示为散点图。另外，将截止值设定下述值：71位健康人血清样品的测量值的平均值+3SD，从而计算对每种血清的反应性百分比。表6显示了通过cocktail-MAP ELISA和TCP-353 ELISA之间的阳性百分比的对比结果。另外，将通过cocktail-MAP ELISA和TCP-353ELISA测得的克隆氏病患者血清值分别沿垂直和水平轴绘图，得到相关系数，并查证2个测量***之间是否存在关联。图7显示了结果。
表6
Figure G2009101598810D00251
在表中，括号中的数字表示样品数。PPV、NPV等如表5所定义。
上面的结果证实，使用TCP-353的ELISA在诊断的灵敏度、特异性和准确度方面都胜过cocktail-MAP ELISA。而且，从图7得到的相关系数是0.281，指示着2个测量***之间没有关联，这暗示着通过每个***可以测量不同的抗体。
实施例6
<克隆氏病抗体的表位肽的同源性搜索>
针对得到的克隆氏病抗体的表位肽的氨基酸序列(TCP-47，TCP-336和TCP-353)，进行BLAST搜索，寻找具有同源氨基酸序列的肽或蛋白。图8、9和10显示了结果。TCP-47与来自人或果蝇的肌联蛋白的C-末端区域相同，还从病毒、细菌、霉菌和原生动物发现了同源蛋白。TCP-336在很大程度上与人蛋白匹配。TCP-353与来自稻的蛋白相同，暗示着克隆氏病和营养抗原之间的关联。
工业实用性
根据本发明的克隆氏病抗体的表位肽和使用这些肽的检测试剂，使方便地、快速地且准确地确定克隆氏病的发生与否成为可能，因而可以用于在克隆氏病的诊断中极其有用的诊断试剂和检测方法中。
序列表
<110>TOAGOSEI CO.，LTD
<120>克隆氏病抗体表位肽和检测克隆氏病的试剂
<160>3
<210>1
<211>27
<212>PRT
<213>噬菌体文库
<400>1
Asn Ser Val Lys Asn Glu Val Glu Glu Val Thr Phe Thr Lys His Thr
                 5                   10                  15
Gln Cys Leu Gly Cys Phe Lys Ser Gly Phe Ser
             20                  25
<210>2
<211>26
<212>PRT
<213>噬菌体文库
<400>2
Val Ile Pro Ala Leu Ser Glu Ala Glu Ala Gly Gly Ser Pro Glu Val
                 5                   10                  15
Arg Ser Ser Arg Pro Ala Trp Pro Ile Trp
             20                  25
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>噬菌体文库
<400>3
Met Ile Arg Gly Leu Phe Pro Asn
                 5

Claims (3)

1.克隆氏病抗体的表位的特征肽，其表示为下面的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽，或其盐；和
(b)包含修饰的SEQ ID NO：3的氨基酸序列的肽，或其盐，其中取代、缺失或添加了一个或多个氨基酸，或部分的修饰的或未修饰的SEQ ID NO：3的氨基酸序列，且其具有结合克隆氏病抗体的特性，其中所述抗体结合有上述肽(a)。
2.克隆氏病的检测试剂，其包含权利要求1所定义的肽作为活性成分。
3.克隆氏病的检测试剂盒，其包含权利要求2定义的检测试剂作为克隆氏病抗体的抗原物质。
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