KR101086533B1 - 중화 사람 항-ｉｇｆｒ 항체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

중화 사람 항-ｉｇｆｒ 항체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 인슐린 유사 성장 인자 수용체-I(IGFR1)에 대한 완전한 사람, 중화 모노클로날 항체를 포함한다. 당해 항체는 환자의 암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 또한 본 발명의 항체를 사용하고 생산하는 방법이 포함된다.
인슐린 유사 성장 인자 수용체-I(IGFR1), IGFR1 항체, 말단비대증, 암

Description

중화 사람 항-ＩＧＦＲ 항체, 이를 제조하는 방법 및 이를 포함하는 조성물{Neutralizing human anti-IGFR antibody, a method for producing it and a composition comprising it}
본 출원은 이의 각각의 전문이 본원에서 참조로 인용된 2002년 5월 24일 출원된 미국 가특허원 제60/383,459호; 2002년 7월 2일 출원된 미국 가특허원 제60/393,214호 및 2002년 12월 23일 출원된 미국 가특허원 제60/436,254호의 이익을 청구한다.
본 발명은 완전한 사람, 모노클로날 항-인슐린 유사 성장 인자 수용체-I(IGFR1) 항체 및 당해 항체의 사용 방법 및 당해 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
소마토메딘(somatomedin)으로 또한 알려져 있는 인슐린 유사 성장 인자는 인슐린 유사 성장 인자-I(IGF-I) 및 인슐린 유사 성장 인자-II(IGF-II)를 포함한다[참조: Klapper, et al., (1983) Endocrinol. 112:2215 및 Rinderknecht, et al., (1987) Febs. Lett. 89:283]. 이들 성장 인자는 인슐린 유사 성장 인자 수용체-I(IGFR1)이라 명명된 통상의 수용체에 결합함으로써 종양 세포[참조: Macaulay, (1992) Br. J. Cancer 65:311]를 포함한 각종 세포 유형상에서 분열촉진 활성을 나타낸다[참조: Sepp-Lorenzino, (1998) Breast Cancer Research and Treatment 47:235]. IGF와 IGFR1의 상호작용은, 타이로신 잔기상에서 수용체의 자가인산화를 유발함으로써 수용체를 활성화시킨다[참조: Butler, et al., (1998) Comparative Biochemistry and Physiology 121:19]. 일단 활성화된, IGFR1은 결국 세포내 표적물을 인산화시켜 세포 신호화 경로를 활성화시킨다. 이러한 수용체 활성은 종양 세포 성장 및 생존을 자극하는데 있어 중요하다. 따라서, IGFR1 활성의 억제는 사람 암의 성장 및 기타 증식성 질병을 치료하거나 예방하는데 효과적인 강력한 방법임을 나타낸다.
몇가지 라인의 현상은, IGF-I, IGF-II 및 이들의 수용체 IGFR1이 악성 종양 표현형의 중요한 매개체임을 나타낸다. IGF-I의 혈장 수준은 전립선 암 위험의 가장 강력한 암시자임이 밝혀졌으며[참조: Chan, et al., (1998) Science 279:563] 유사한 역학적 연구는 유방암, 결장암 및 폐암 위험이 있는 혈장 IGF-I 수준과 강력하게 연관되어 있다.
인슐린 유사 성장 인자 수용체-I의 과발현은 또한 몇몇 암 세포주 및 종양 조직에서 입증되었다. IGFR1은 모든 유방 암 세포주의 40%에서 과발현되며[참조: Pandini, et al., (1999) Cancer Res. 5: 1935] 폐암 세포주중 15%에서 과발현된다. 유방암 종양 조직에 있어서, IGFR1은 6 내지 14배 과발현되며 IGFR1은 정상 조직과 비교하여 2 내지 4배 높은 키나제 활성을 나타낸다[참조: Webster, et al., (1996) Cancer Res. 56:2781 및 Pekonen, et al., (1998) Cancer Res. 48:1343]. 직장결장 암 조직 생검의 90%는 증가된 IGFR1 수준을 나타내며, 여기서, IGFR1 발현 정도는 질병의 중증도와 관련되어 있다. 1차 자궁경부 암 세포 배양물 및 자궁경부 암 세포주의 분석은 정상의 자궁경부외막 세포와 비교하여 각각 IGFR1의 3배 및 5배의 과발현을 나타낸다[참조: Steller, et al., (1996) Cancer Res. 56: 1762]. 윤활막 육종 세포에서 IGFR1의 발현은 또한 공격성 표현형(즉, 전이 및 높은 증식율)과 또한 관련된다[참조: Xie, et al., (1999) Cancer Res. 59:3588].
서서히 증가하고 있는 질병인 말단비대증은 성장 호르몬 및 IGF-I의 과분비에 의해 유발된다[참조: Ben-Schlomo, et al., (2001) Endocrin. Metab. Clin. North. Am. 30:565-583]. IGFR1 작용의 길항작용은 당해 질병을 치료하는데 도움이 될 수 있다.
IGFR1의 활성을 억제하는, 당해 분야에 공지되어 있는 몇가지 항체가 존재한다. 그러나, 이들의 치료학적 수치는 비교적 낮다. 예를 들어, α-IR3[참조: Kull, et al., (1983) J. Biol. Chem. 258:6561], 1H7[참조: Li et al., (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 196. 92-98 및 Xiong et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:5356-5360; Santa Cruz biotechnology, Inc.; Santa Cruz, CA) 및 MAB391[참조: R&D Systems; Minneapolis, MN]은 IGFR1과 상호작용하여 이의 활성을 억제하는 마우스 모노클로날 항체이다. 이들은 마우스 항체이므로, 사람에서의 이들의 치료학적 용도는 제한되어 있다. 면역적합성 사람 환자에게 1회 투여량의 마우스 항체를 투여하는 경우, 당해 환자는 마우스 면역글로불린 서열에 대한 항체를 생산한다. 이들 사람 항-마우스 항체(HAMA)는 치료학적 항체를 중화시키며 급성 독성(예를 들면, HAMA 반응)을 유발할 수 있다.
HAMA 반응을 피하는 하나의 방법은 어떠한 외부(예를 들면, 마우스) 아미노산 서열도 없는 완전한 사람 항체를 사용하는 것이다. 비록 완전한 사람 항체의 사용이 치료학적 항체의 사람 숙주 면역 거부를 감소시키거나 방지하는 효과적인 방법이라고 해도, 완전한 사람 항체의 거부가 일어날 수 있다. 사람 항체의 사람 거부는 사람 항 사람 항체 반응(HAHA 반응)으로 언급될 수 있다. HAHA 반응은 완전한 사람 항체에서 드믄, 낮은 발생의 아미노산 서열의 존재와 같은 인자에 의해 중재될 수 있다. 이러한 이유로, 치료학적 항체는 또한 비-면역학적 또는 단지 약한 면역학적 사람 항체 구조 서열의 도입에 의해 또한 최적화될 수 있다. 바람직하게는, 이들 서열은 다른 사람 항체에서 흔히 일어난다.
발명의 요약
본 발명은 바람직하게는 사람 환자에게 투여시 HAMA 반응을 유발하지 않거나 HAHA 반응을 유발하지 않고 IGFR1에 의해 중재된 질병(예를 들면, 악성 종양)을 치료하거나 예방하는데 유용한 완전한 사람 항-사람 IGFR1 모노클로날 항체를 제공한다.
본 발명은 서열 8 또는 31의 경쇄 CDR-L1, 서열 9 또는 32의 경쇄 CDR-L2 및 서열 10 또는 33의 경쇄 CDR-L3의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한 결합 조성물(즉, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 제공한다. 또한, 서열 14 또는 37의 중쇄 CDR-H1의 아미노산 서열, 서열 15 또는 38의 중쇄 CDR-H2의 아미노산 서열 및 서열 16 또는 39의 중쇄 CDR-H3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한 결합 조성물(즉, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이다.
바람직하게는, 본 발명의 결합 조성물(즉, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 서열 2의 아미노산 20 내지 128번, 서열 25의 아미노산 21 내지 130번, 서열 41 또는 43의 아미노산 20 내지 128번 또는 서열 41, 43, 72, 74, 76 또는 78의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 성숙한 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역, 바람직하게는 서열 4의 아미노산 20 내지 137번, 서열 27의 아미노산 20 내지 140번, 서열 45의 아미노산 20 내지 137번 또는 서열 112의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 결합 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 결합 조성물은 또한 폴리에틸렌 글리콜과 같은 물질에 접합될 수 있다.
본 발명은 또한
(a) Kd가 약 86 X 10-11 이하인 IGFR1(즉, 사람 IGFR1)에 대한 결합;
(b) 약 6.50 X 10-5 이하의 IGFR1(즉, 사람 IGFR1)에 대한 오프 속도(off rate: Koff);
(c) 약 0.7 X 105 이상의 IGFR1(즉, 사람 IGFR1)에 대한 온 속도(on rate: Kon);
(d) IGFR1(즉, 사람 IGFR1)에 대한 결합에 있어 IGF1과의 경쟁;
(e) IGFR1(즉, 사람 IGFR1)의 자가인산화(즉, 0.10nM의 IC50) 억제; 및
(f) IGFR1(즉, 사람 IGFR1)을 발현하는 세포의 비부착 증식의 억제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 특성을 포함하는, 사람 IGFR1에 특이적으로 결합하는 결합 조성물(즉, 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편)을 포함한다. 바람직하게는, 결합 조성물은 상기 특성(a 내지 f) 모두를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 결합 조성물(즉, 사람 항체 또는 이의 항원-결합 단편)은
(a) 서열 8의 CDR-L1, 서열 9의 CDR-L2 및 서열 10의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 아미노산 서열;
(b) 서열 31의 CDR-L1, 서열 32의 CDR-L2 및 서열 33의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 아미노산 서열;
(c) 서열 14 또는 서열 17의 CDR-H1, 서열 15의 CDR-H2 및 서열 16의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및
(d) 서열 37 또는 서열 70의 CDR-H1, 서열 38의 CDR-H2 및 서열 39의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 아미노산 서열 중에서 선택된 구성원을 포함한다.
본 발명은 또한
(a) 서열 2의 아미노산 20 내지 128번;
(b) 서열 25의 아미노산 21 내지 130번;
(c) 서열 72의 아미노산 20 내지 128번;
(d) 서열 74의 아미노산 20 내지 128번;
(e) 서열 4의 아미노산 20 내지 137번;
(f) 서열 27의 아미노산 20 내지 140번;
(g) 서열 45의 아미노산 20 내지 137번;
(h) 서열 112의 아미노산 20 내지 137번;
(i) 서열 76의 아미노산 20 내지 128번; 및
(j) 서열 78의 아미노산 20 내지 128번 중에서 선택된 펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 포함한다.
바람직하게는, 당해 핵산은
(a) 서열 1의 뉴클레오타이드 58 내지 384번;
(b) 서열 24의 뉴클레오타이드 61 내지 390번;
(c) 서열 71의 뉴클레오타이드 58 내지 384번;
(d) 서열 73의 뉴클레오타이드 58 내지 384번;
(e) 서열 3의 뉴클레오타이드 58 내지 411번;
(f) 서열 26의 뉴클레오타이드 58 내지 420번;
(g) 서열 44의 뉴클레오타이드 58 내지 411번;
(h) 서열 111의 뉴클레오타이드 58 내지 411번;
(i) 서열 75의 뉴클레오타이드 58 내지 384번; 및
(j) 서열 77의 뉴클레오타이드 58 내지 384번 중에서 선택된다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드 중 어느 것을 포함하는 재조합 벡 터 및 당해 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 또한
(a) 서열 2의 아미노산 20 내지 128번;
(b) 서열 25의 아미노산 21 내지 130번;
(c) 서열 72의 아미노산 20 내지 128번;
(d) 서열 74의 아미노산 20 내지 128번;
(e) 서열 4의 아미노산 20 내지 137번;
(f) 서열 27의 아미노산 20 내지 140번;
(g) 서열 45의 아미노산 20 내지 137번;
(h) 서열 112의 아미노산 20 내지 137번;
(i) 서열 76의 아미노산 20 내지 128번; 및
(j) 서열 78의 아미노산 20 내지 128번 중에서 선택된 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 결합 조성물은
(a) 서열 2의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 4의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[15H12/19D12 성숙한 LC-15H12/19D12 성숙한 HC]
(b) 서열 25의 아미노산 21 내지 130번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 27의 아미노산 20 내지 140번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[1H3 성숙한 LC-1H3 성숙한 HC]
(c) 서열 72의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCC-성숙한 HCA]
(d) 서열 74의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCD-성숙한 HCA]
(e) 서열 76의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCE-성숙한 HCA]
(f) 서열 78의 아미노산 20 내지 128을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 45의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCF-성숙한 HCA]
(g) 서열 72의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 112의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCC-성숙한 HCB]
(h) 서열 74의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 112의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCD-성숙한 HCB]
(i) 서열 76의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 112의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCE-성숙한 HCB] 및
(j) 서열 78의 아미노산 20 내지 128번을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 112의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 중쇄 가변 영역;[성숙한 LCF-성숙한 HCB] 중에서 선택된 하나 이상(즉, 1 또는 2개)의 경쇄/중쇄 조합을 포함하는 사람 항체이다. 더욱 바람직하게는, 사람 항체는 상기 경쇄/중쇄 쌍 중 2개를 포함하는 사량체이다. 바람직하게는, 사람 항체는 성숙한 HCA 또는 성숙한 HCB와 쌍을 이룬 성숙한 LCF를 포함한다.
또한, 펩타이드가 생산되는 조건하에서 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 서열 2의 아미노산 20 내지 128번, 서열 4의 아미노산 20 내지 137번, 서열 25의 아미노산 21 내지 130번, 서열 27의 아미노산 20 내지 140번, 서열 41, 43, 72, 74, 76 또는 78의 아미노산 20 내지 128번, 서열 45의 아미노산 20 내지 137번 또는 서열 112의 아미노산 20 내지 137번을 포함하는 펩타이드의 제조 방법이 제공된다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 또한 숙주 세포로부터 분리된다.
본 발명은 또한 인슐린 유사 성장 인자 수용체-I의 증가된 발현 또는 활성에 의해서, 또는 하나 이상의 이의 리간드(예를 들면, IGF-I 또는 IGF-II)의 증가된 발현에 의해 중재된 의학 상태의 환자에게 본 발명의 결합 조성물(예를 들면, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편)을 투여함을 포함하는, 당해 환자의 의학 상태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 바람직하게는, 결합 조성물은
(a) 서열 8의 CDR-L1, 서열 9의 CDR-L2 및 서열 10의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;
(b) 서열 31의 CDR-L1, 서열 32의 CDR-L2 및 서열 33의 CDR-L3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열;
(c) 서열 14 또는 서열 17의 CDR-H1, 서열 15의 CDR-H2 및 서열 16의 CDR-H3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열; 및
(d) 서열 37 또는 서열 70의 CDR-H1, 서열 38의 CDR-H2 및 서열 39의 CDR-H3 을 포함하는 중쇄 아미노산 서열 중에서 선택된 구성원을 포함한다.
본 발명은
(i) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCA(γ4)-
기탁명: "15H12/19D12 HCA(γ4)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5214;
(ii) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCB(γ4)-
기탁명: "15H12/19D12 HCB (γ4)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5215;
(iii) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCA(γ1)-
기탁명: "15H12/19D12 HCA(γ1)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5216;
(iv) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCC(κ)-
기탁명: "15H12/19D12 LCC(κ)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5217;
(v) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCD(κ)-
기탁명: "15H12/19D12 LCD(κ)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5218;
(vi) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCE(κ)-
기탁명: "15H12/19D12 LCE(κ)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5219; 및
(vii) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCF(κ)-
기탁명: "15H12/19D12 LCF(κ)";
ATCC 기탁 번호: PTA-5220로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어떠한 플라스미드 및 상기 어떠한 플라스미드의 핵산 삽입물도 포함한다. 또한 면역글로불린 불변 영역(예를 들면, 시그날 서열 제외)을 임의로 포함하는 플라스미드 삽입물내에 포함된 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 삽입물의 핵산 부위를 포함한다. 또한, 상기 어떠한 플라스미드 삽입물의 핵산에 의해 암호화된 어떠한 폴리펩타이드 및 면역글로불린 불변 영역(예를 들면, 시그날 서열 제외)을 임의로 포함하는 어떠한 삽입물내에 포함된 면역 글로불린 가변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드도 포함한다.
위에서 정의한 플라스미드는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC; 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 불러바드 유니버시티 10801 소재)에 2003년 5월 21일자로 부다페스트 조약하에 기탁되었다. ATCC에 기탁된 플라스미드에 대한 접근에 있어서의 모든 제한은 특허 승인시 제거될 것이다.
바람직하게는, 결합 조성물은 약제학적 조성물 중 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된다. 본 발명에 의해 고려되는 것으로서, 이러한 의학 상태는 말단비대증, 난소암, 췌장암, 양성 전립선 과형성, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 직장결장암, 자궁경부암, 윤활막 육종, 전이 유암종과 연관된 설사, 혈관활성 장 펩타이드 분비 종양, 거대증, 건선, 죽상경화증, 혈관의 평활근 재협착 및 부적절한 미세혈관 증식을 포함한다.
당해 결합 조성물은 예를 들면, 비경구적 경로로 환자에게 투여될 수 있다. 항암 치료제와 함께 또는 항암 치료 과정과 함께 본 발명의 결합 조성물을 투여함을 포함하는 조합 치료요법이 또한 제공된다.
사람 중쇄 전이유전자(transgene) 및 사람 경쇄 전이유전자를 포함하는 게놈을 갖는 비사람 형질전환 동물을 IGFR1 항원성 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 19의 아미노산 30 내지 902번 및/또는 표면에 IGFR1을 발현하는 세포(예를 들면, HEK293)로 면역화시켜 당해 동물의 B 세포가 항체를 생산하도록 하는 단계; 당해 동물의 B 세포를 분리하는 단계; 당해 B 세포와 골수종 세포를 융합시켜 IGFR1에 대해 특이적인 사람 모노클로날 항체를 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 형성시키는 단계; 및 IGFR1에 대해 특이적인 사람 모노클로날 항체를 분리하는 단계를 포함하는 완전한 사람 항-IGFR1 항체를 생산하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 바람직한 양태는 인슐린 유사 성장 인자 수용체-I, 바람직하게는 서열 19의 아미노산 30 내지 902번을 특이적으로 인지하여 이에 결합하는 완전한 사람 모노클로날 항체 또는 이의 항원 단편을 포함한다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 1H3, 15H12, 19D12, 15H12/19D12 LCA, 15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 LCC, 15H12/19D12 LCD, 15H12/19D12 LCE, 15H12/19D12 LCF, 15H12/19D12 HCA 또는 15H12/19D12 HCB이다.
결합 조성물 또는 제제는 IGFR1에 대해 특이성을 갖고, 예를 들면, 리간드- 수용체유형 양식으로 또는 항체-항원 상호작용으로 결합하는 분자, 예를 들면, 천연의 생리학적으로 관련된 단백질-단백질 상호작용으로, 공유 또는 비공유결합으로 IGFR1과 특이적으로 연합하는 단백질을 말한다. 용어 "결합 조성물"은 바람직하게는 본 발명의 완전한 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들면, 15H12/19D12 LCA, 15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 LCC, 15H12/19D12 LCD, 15H12/19D12 LCE, 15H12/19D12 LCF, 15H12/19D12 HCA 또는 15H12/19D12 HCB, 또는 하기 표 1a 내지 표 1f에 설정된 어떠한 펩타이드)과 같은 폴리펩타이드이다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 실험관내 및 생체내 둘다에서 세포, 바람직하게는 악성 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 하나의 이론에 얽매이지 않고도, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 IGFR1 및 인슐린 유사 성장 인자-I(IGF-I) 또는 인슐린 유사 성장 인자-II(IGF-II)와 같은 수용체에 대한 리간드간의 상호 작용을 억제함으로써 세포 성장을 억제할 수 있다. 당해 항체 및 항원-결합 단편은 또한 IGFR1 자가인산화를 억제하고, IGFR1을 발현하는 세포(예를 들면, 암 세포)의 비부착 증식을 억제하며, IGFR1의 분해를 유발함으로써 AKT 키나제의 활성을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 당해 항체 및 항원-결합 단편은 IGFR1의 활성을 중화시키고/시키거나 IGFR1을 하향 조절한다. 항체 및 항원-결합 단편은 IGFR1에 의해 중재된 질병을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
용어 "항체 분자"는 전체 항체(예를 들면, IgG, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4) 및 이의 단편, 바람직하게는 이의 항원-결합 단편을 말한다. 항체 단편은 Fab 항체 단편, F(ab)2 항체 단편, Fv 항체 단편, 일본 쇄 Fv 항체 단편 및 dsFv 항체 단편을 포함한다.
용어 "IGFR1", "인슐린 유사 성장 인자 수용체-I" 및 "인슐린 유사 성장 인자, 제I형"은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비록 IGFR1이 어떠한 유기체로부터도 기원할 수 있다고 해도, 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 양 또는 개) 및 가장 바람직하게는 사람으로부터 기원한다. 통상의 사람 IGFR1 전구체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 진뱅크 기탁 번호 제 X04434호 또는 제 NM_000875호(서열 19)를 갖는다. 전구체의 절단(예를 들어, 아미노산 710번 및 711번 사이)은 연합하여 성숙한 수용체를 형성하는 α-소단위 및 β-소단위를 생산한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 전체 길이의 IGFR1 폴리펩타이드로부터의 아미노산 30번 내지 902번은 항-IGFR1 항체를 생성하기 위한 항원으로서 사용된다.
용어 "IGF-I", "인슐린 유사 성장 인자-I" 및 "인슐린 유사 성장 인자, 제I형"은 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 용어 "IGF-II", "인슐린 유사 성장 인자-II" 및 "인슐린 유사 성장 인자 제II형"도 또한 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 비록 IGF-I 또는 IGF-II가 어떠한 유기체로부터도 기원할 수 있다고 해도, 이들은 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 양 또는 개) 및 가장 바람직하게는 사람으로부터 기원한다. 통상의 사람 IGF-I 및 IGF-II의 핵산 및 아미노산 서열은 각각 진뱅크 기탁 번호 제XM_052648호(서열 20) 및 제NM_000612호(서열 21)를 갖는다. 용어 "sIGFR1" 또는 "가용성 IGFR1"은 IGFR1(예를 들면, 사람 IGFR1)의 어떠한 가용성 단편, 바람직하게는 수용체 트랜스-막 영역이 결실된 단편, 더욱 바람직하게는 서열 19의 아미노산 30 내지 902번을 포함한다.
본 발명의 바람직한, 완전한 사람의 모노클로날 항-IGFR1 항체 분자의 가변 영역(예를 들면, 1H3, 15H12 및 19D12)의 아미노산 서열과 당해 영역을 암호화하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열은 표 1a 내지 표 1f에 요약되어 있다. 본 발명은 하기 표 1에 설정된 어떠한 핵산 또는 폴리펩타이드(이의 성숙한 단편 포함)중 하나 이상(예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개)을 포함하는 어떠한 핵산 또는 폴리펩타이드(예를 들면, 항체)도 포함한다. 표 1은 또한 항체의 CDR 영역에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 요약을 포함한다. 15H12 및 19D12의 가변 영역에 상응하는 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은, 각각의 가변 영역 또는 CDR에 대해 단지 하나의 서열이 나타난다는 이유로 인해, 동일하다.
본 발명의 아미노산 및 뉴클레오타이드의 요약
서열 서열 확인 번호
시그날 펩타이드를 포함하는 15H12 및 19D12 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(15H12/19D12 LC) 서열 1
시그날 펩타이드를 포함하는 15H12 및 19D12 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열 2
시그날 펩타이드를 포함하는 15H12 및 19D12 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 (15H12/19D12 HC) 서열 3
서열 서열 확인 번호
시그날 펩타이드를 포함하는 15H12 및 19D12 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열 4
15H12 및 19D12 CDR-L1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 5
15H12 및 19D12 CDR-L2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 6
15H12 및 19D12 CDR-L3를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 7
15H12 및 19D12 CDR-L1의 아미노산 서열 서열 8
15H12 및 19D12 CDR-L2의 아미노산 서열 서열 9
15H12 및 19D12 CDR-L3의 아미노산 서열 서열 10
15H12 및 19D12 CDR-H1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 11
15H12 및 19D12 CDR-H2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 12
15H12 및 19D12 CDR-H3를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 13
15H12 및 19D12 CDR-H1의 아미노산 서열 서열 14
15H12 및 19D12 CDR-H2의 아미노산 서열 서열 15
15H12 및 19D12 CDR-H3의 아미노산 서열 서열 16
다른 15H12 및 19D12 CDR-H1의 아미노산 서열 서열 17
다른 15H12 및 19D12 CDR-H1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 18
인슐린 유사 성장 인자 수용체-I (IGFR1)의 아미노산 서열 서열 19
인슐린 유사 성장 인자-I (IGF1)의 아미노산 서열 서열 20
인슐린 유사 성장 인자-II(IGF2)의 아미노산 서열 서열 21
PCR 프라이머의 뉴클레오타이드 서열 서열 22
PCR 프라이머의 뉴클레오타이드 서열 서열 23
시그날 펩타이드를 포함하는 1H3 경쇄 가변 영역(1H3 LC)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 24
시그날 펩타이드를 포함하는 1H3 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열 25
시그날 펩타이드를 포함하는 1H3 중쇄 가변 영역 (1H3 HC)의 뉴클레오타이드 서열 서열 26
시그날 펩타이드를 포함하는 1H3 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 서열 27
1H3 CDR-L1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 28
1H3 CDR-L2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 29
1H3 CDR-L3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 30

서열 서열 확인 번호
1H3 CDR-L1의 아미노산 서열 서열 31
1H3 CDR-L2의 아미노산 서열 서열 32
1H3 CDR-L3의 아미노산 서열 서열 33
1H3 CDR-H1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 34
1H3 CDR-H2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 35
1H3 CDR-H3를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 36
1H3 CDR-H1의 아미노산 서열 서열 37
1H3 CDR-H2의 아미노산 서열 서열 38
1H3 CDR-H3의 아미노산 서열 서열 39
15H12/19D12 경쇄 A(LCA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 40
15H12/19D12 경쇄 A의 아미노산 서열 서열 41
15H12/19D12 경쇄 B(LCB)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 42
15H12/19D12 경쇄 B의 아미노산 서열 서열 43
15H12/19D12 중쇄 A(HCA)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 44
15H12/19D12 중쇄 A의 아미노산 서열 서열 45
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 46
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 47
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 48
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 49
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 50
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 51
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 52
15H12/19D12 경쇄 A 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 53
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 54
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 55
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 56
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 57
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 58
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 59
서열 서열 확인 번호
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 60
15H12/19D12 경쇄 B 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 61
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 62
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 63
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 64
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 65
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 66
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 67
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 68
15H12/19D12 중쇄 A 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 69
다른 1H3 CDR-H1의 아미노산 서열 서열 70
15H12/19D12 경쇄 C(LCC)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 71
15H12/19D12 경쇄 C의 아미노산 서열 서열 72
15H12/19D12 경쇄 D(LCD)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 73
15H12/19D12 경쇄 D의 아미노산 서열 서열 74
15H12/19D12 경쇄 E(LCE)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 75
15H12/19D12 경쇄 E의 아미노산 서열 서열 76
15H12/19D12 경쇄 F(LCF)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 77
15H12/19D12 경쇄 F의 아미노산 서열 서열 78
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 79
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 80
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 81
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 82
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 83
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 84
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 85
15H12/19D12 경쇄 C 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 86
서열 서열 확인 번호
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 87
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 88
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 89
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 90
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 91
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 92
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 93
15H12/19D12 경쇄 D 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 94
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 95
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 96
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 97
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 98
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 99
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 100
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 101
15H12/19D12 경쇄 E 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 102
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 103
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 104
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 105
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 106
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 107
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 108
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 109
15H12/19D12 경쇄 F 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 110
서열 서열 확인 번호
15H12/19D12 중쇄 B(HCB)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 111
15H12/19D12 중쇄 B의 아미노산 서열 서열 112
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 1을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 113
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 1의 아미노산 서열 서열 114
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 115
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 2의 아미노산 서열 서열 116
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 3을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 117
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 3의 아미노산 서열 서열 118
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 4를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 서열 119
15H12/19D12 중쇄 B 구조 영역 4의 아미노산 서열 서열 120

CDR-L1은 경쇄내에 존재하는 제1의 상보성 결정 영역(CDR)이고, CDR-L2는 경쇄상에 존재하는 제2의 CDR이며 CDR-L3은 경쇄상에 존재하는 제3의 CDR이다.
유사하게, CDR-H1은 중쇄에 존재하는 제1의 CDR이고, CDR-H2는 중쇄상에 존재하는 제2의 CDR이며 CDR-H3는 중쇄상에 존재하는 제3의 CDR이다.
FR-L1은 경쇄의 제1의 구조 영역이고, FR-L2는 경쇄의 제2의 구조 영역이며, FR-L3은 경쇄의 제3의 구조 영역이고, FR-L4는 경쇄상의 제4의 구조 영역이며, FR-H1은 중쇄의 제1의 구조 영역이고, FR-H2는 중쇄의 제2의 구조 영역이며, FR-H3은 중쇄의 제3의 구조 영역이고, FR-H4는 중쇄의 제4의 구조 영역이다. 이들 용어 및 면역글로불린 쇄상의 CDR 및 FR의 배열은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
시그날 펩타이드(예를 들면, 첫번째 19 또는 20개 잔기)가 없는 본 발명의 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열 1, 40, 42, 71, 73, 75 또는 77의 뉴클레오타이드 58번 내지 384번에 의해 암호화된 서열 2, 41, 43, 72, 74, 76 또는 78의 아미노산 20 내지 128번 또는 서열 24의 뉴클레오타이드 61 내지 390번에 의해 암호화된 서열 25의 아미노산 21 내지 130번이다.
시그날 펩타이드(예를 들면, 첫번째 19개 잔기)가 없는 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열 3, 44 및 111의 뉴클레오타이드 58번 내지 411번에 의해 암호화된 서열 4, 45 또는 112의 아미노산 20 내지 137번 또는 서열 26의 뉴클레오타이드 58 내지 420번에 의해 암호화된 서열 27의 아미노산 20 내지 140번이다.
일부 양태에서, 15H12 및 19D12 CDR-H1은 서열 18의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 GFTFSSFAMH(서열 17)이다. 일부 양태에서, 1H3 CDR-H1은 NYAMH(서열 70)이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 구조 영역 및 항원-결합 단편을 포함하는 항체 및 항원-결합 영역을 포함한다. 바람직하게는, FR-L1은 서열 2의 아미노산 20 내지 42번 또는 서열 25의 아미노산 21 내지 43번이고; FR-L2는 서열 2의 아미노산 54 내지 68번 또는 서열 25의 아미노산 55 내지 69번이며; FR-L3은 서열 2의 아미노산 76 내지 107번 또는 서열 25의 아미노산 77 내지 108번이고; FR-L4는 서열 2의 아미노산 117 내지 128번 또는 서열 25의 아미노산 128 내지 130번이며; FR-H1은 서열 4의 아미노산 20 내지 44번 또는 20 내지 49번 또는 서열 27의 아미노산 20 내지 44번 또는 20 내지 49번이고; FR-H2는 서열 4의 아미노산 55 내지 68번 또는 서열 27의 아미노산 55 내지 68번이며; FR-H3는 서열 4의 아미노산 85 내 지 116번 또는 서열 27의 아미노산 85 내지 116번이고; FR-H4는 서열 4의 아미노산 127 내지 137번 또는 서열 27의 아미노산 130 내지 140번이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 서열 41 또는 43의 아미노산 20 내지 42번으로 정의된 FR-L1; 서열 41 또는 43의 아미노산 54 내지 68번으로 정의된 FR-L2; 서열 41 또는 43의 아미노산 76 내지 107번으로 정의된 FR-L3; 및 서열 41 또는 43의 아미노산 117 내지 128번으로 정의된 FR-L4를 포함한다. 또한, 바람직한 양태는 서열 45의 아미노산 20 내지 44번으로 정의된 FR-H1; 서열 45의 아미노산 55 내지 68번으로 정의된 FR-H2; 서열 45의 아미노산 85 내지 116번으로 정의된 FR-H3; 및 서열 45의 아미노산 127 내지 137번으로 정의된 FR-H4를 포함하는 항체 분자를 포함한다.
분자 생물학
본 발명에 따라서, 당해 분야의 기술내의 통상의 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(본원에서 "Sambrook, et al., 1989"로 언급); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)].
"폴리뉴클레오타이드", "핵산" 또는 "핵산 분자"는 일 본쇄 형, 이 본쇄 형 또는 기타 형의 리보뉴클레오사이드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 사이티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오사이드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시사이티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체형, 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 이의 어떠한 포스포에스테르 유사체를 언급할 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드 서열", "핵산 서열" 또는 "뉴클레오타이드 서열"은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산내 일련의 뉴클레오타이드 염기(또한 "뉴클레오타이드"로 칭함)이며, 2개 이상의 뉴클레오타이드의 특정 쇄를 의미한다.
RNA, 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소와 같은 "암호화 서열" 또는 발현 산물을 "암호화"하는 서열은 발현시에 생성물을 생산하는 뉴클레오타이드 서열이다.
용어 "유전자"는 하나 이상의 RNA 분자, 단백질 또는 효소 모두 또는 이의 일부를 포함하고, 예를 들면 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절 DNA 서열을 포함하거나 포함하지 않는 리보뉴클레오타이드 또는 아미노산의 부분 서열을 암호화하거나 이에 상응하는 DNA 서열을 의미한다. 유전자는 아미노산 서열로 해독되거나 해독되지 않는 DNA 또는 RNA로 부터 전사될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 DNA의 "증폭"은 DNA 서열의 혼합물내에 특정 DNA 서열의 농도를 증가시키는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)의 사용을 말한다. PCR에 대한 기술은 문헌[참조: Saiki, et al. Science (1988) 239:487]을 참조한다. 특정 양태에서, 본 발명은 PCR에 의해 증폭될 수 있는, 항-IGFR1 항체, 항-IGFR1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-IGFR1 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 항-IGFR1 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 또는 항-IGFR1 항체 CDR(예를 들면, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3)을 암호화하는 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 게놈성 DNA 분자, cDNA 분자, 또는 유전자를 암호화하는 mRNA 분자, mRNA, cDNA, 또는 목적한 다른 핵산에 하이브리드화할 수 있는, 일반적으로 10개 이상(예를 들면, 10개, 11개, 12개, 13개 또는 14개), 바람직하게는 15개 이상(예를 들면, 15개, 16개, 17개, 18개 또는 19개), 및 더욱 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오타이드(예를 들면, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 30개), 바람직하게는 100개 이하의 뉴클레오타이드(예를 들면, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개 또는 90개)의 핵산을 말한다. 올리고뉴클레오타이드는 32P-뉴클레오타이드, 3H-뉴클레오타이드, 14C-뉴클레오타이드, 35S-뉴클레오타이드 또는 바이오틴과 같은 표지가 공유적으로 접합되어 있는 뉴클레오타이드를 혼입시킴에 의해 표지시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 표지된 올리고뉴클레오타이드는 핵산의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드 하나 또는 둘다가 표지될 수 있다)는 유전자의 전체 길이 또는 이의 단편을 클로닝하거나, 핵산의 존재를 검출하기 위한 PCR 프라이머로 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 합성적으로, 바람직하게는 핵산 합성기상에서 제조된다.
어떠한 핵산(예를 들면, IGFR1 유전자를 암호화하는 핵산 또는 항-IGFR1 항체를 암호화하는 핵산 또는 이의 단편 또는 이의 부위)의 서열은 당해 분야에 어떠한 공지된 방법(예를 들면, 화학적 서열분석 또는 효소적 서열분석)에 의해서도 서열분석할 수 있다. DNA의 "화학적 서열분석"은 막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert)의 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74:560]의 방법과 같은 방법을 말할 수 있으며, 여기서, DNA는 개개의 염기 특이적 반응을 사용하여 무작위적으로 절단한다. DNA의 "효소적 서열분석"은 상거(Sanger)의 방법[참조: Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463]과 같은 방법을 나타낼 수 있다.
본원에서 핵산은 천연의 조절(발현 조절) 서열에 의해 플랭킹될 수 있거나, 프로모터, 내부 리보솜 도입 부위(IRES) 및 기타 리보솜 결합 부위 서열, 인핸서, 반응 요소, 서프레서, 시그날 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 5'- 및 3'-비 암호화 영역 등을 포함하는 이종 서열과 연합될 수 있다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포내에서 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고(예를 들면, 직접 또는 다른 프로모터-결합된 단백질 또는 물질을 통해) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 일반적으로, 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 3' 말단에 결합되어 상부(5' 방향)로 연장됨으로써 어 떠한 수준으로든 전사를 개시하는데 필요한 소수의 염기 또는 성분을 포함한다. 프로모터 서열내에서는 전사 개시 부위(예를 들면, 뉴클레아제 S1으로 맵핑함으로써 편리하게 정의됨), 및 RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 단백질 결합 도메인(컨센수스 서열)을 찾을 수 있다. 당해 프로모터는 인핸서 및 리프레서 서열을 포함하는 다른 발현 조절 서열 또는 본 발명의 핵산(예를 들면, 서열 1, 3, 5-7, 11-13, 18, 22-24, 26, 28-30 또는 34-36)과 작동적으로 연합될 수 있다. 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(참조: 미국 특허 제5,385,839호 및 제5,168,062호), SV40 얼리 프로모터 영역[참조: Benoist, et al., (1981) Nature 290:304-310], 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)의 3' 긴 말단 반복부내에 함유된 프로모터[참조: Yamamoto, et al., (1980) Cell 22:787-797], 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터[참조: Wagner, et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445], 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열[참조: Brinster, et al., (1982) Nature 296:39-42]; β-락타마제 프로모터와 같은 원핵 세포 발현 벡터[참조: Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731], 또는 tac 프로모터[참조: DeBoer, et al., (1983) proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25; 또한 참조: "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American (1980) 242:74-94] 및 Gal 4 프로모터, ADC(알코올 데하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터 또는 알칼린 포스파타제 프로모터와 같은 효모 또는 기타 진균으로부터의 프로모터 성분을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
암호화 서열은, 서열이 암호화 서열의 RNA, 바람직하게는 mRNA내로의 직접적인 RNA 폴리머라제 중재된 전사를 지시한 후, RNA가 트랜스-RNA 스플라이싱(RNA가 인트론을 함유하는 경우)되고, 임의로 암호화 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독되는 경우에 세포내 전사 및 해독 조절 서열의 "조절하에" 있거나, 이와 "작용적으로 연합"되거나 "작동적으로 연합"되어 있다.
용어 "발현하다" 및 "발현"은 유전자, RNA 또는 DNA 서열내 정보가 실현되도록, 예를 들면, 상응하는 유전자의 전사 및 해독에 포함된 세포내 작용을 활성화시킴에 의해 단백질을 생성하는 것을 허용하거나 유발함을 의미한다. DNA 서열은 세포내에서 또는 세포에 의해 발현되어 RNA(예를 들면, mRNA) 또는 단백질(예를 들면, 항체 1H3, 15H12 또는 19D12 또는 이의 단편)과 같은 "발현 산물"을 형성한다. 발현 산물 자체는 또한 세포에 의해 "발현되는" 것으로 일컬어질 수 있다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 DNA 또는 RNA 서열이 숙주 세포내로 도입됨으로써 숙주를 형질전환시키고, 임의로 도입된 서열의 발현 및/또는 복제를 촉진하는 비히클(예를 들면, 플라스미드)을 의미한다.
용어 "형질감염" 또는 "형질 전환"은 핵산의 세포내로의 도입을 의미한다. 이들 용어는 항-IGFR1 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 세포내로 도입되는 것을 말한다. 도입된 유전자 또는 서열은 '클론"으로 일컬어질 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받은 숙주 세포는 "형질전환"되며 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포내로 도입된 DNA 또는 RNA는 숙주세포와 동일한 속 또는 종의 세포, 또는 상이한 속 또는 종의 세포를 포함하는 어떠한 기원으로부터도 유래할 수 있 다.
용어 "숙주 세포"는 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들면, 세포에 의한 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소의 발현 또는 복제를 위해 어떠한 방식으로든 선택되거나, 변형되거나, 형질감염되거나, 형질전환되거나, 성장하거나 사용되거나, 또는 증식된 모든 유기체의 모든 세포를 의미한다.
용어 "발현 시스템"은 벡터에 의해 운반되어 숙주 세포내로 도입된 단백질 또는 핵산을 적합한 조건하에 발현할 수 있는 숙주 세포 및 상용성 벡터를 의미한다. 통상의 발현 시스템은 이. 콜라이(E. coli) 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포 및 바큘로바이러스 벡터, 및 포유동물 숙주 세포 및 벡터를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 IGFR1 또는 항체 및 항원-결합 단편은 사람 배아 신장 세포(HEK293)내에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 세포는 CHO(중국 햄스터 난소) 세포, HeLa 세포 및 NIH 3T3 세포 및 NSO 세포(비-Ig-생성 쥐 흑색종 세포주)를 포함한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산인, sIGFR1 또는 IGFR1은 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,952,496호, 제5,693,489호 및 제5,869,320호, 및 문헌[참조: Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2035-2039; Studier, F. W., et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130; Rosenberg, A. H., et al., (1987) Gene 56: 125-135; 및 Dunn, J. J., et al., (1988) Gene 68: 259]에 기술되어 있는 이. 콜라이/T7 발현 시스템내에서 고 수준으로 발현될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에 대한 어떠한 표면적인 또는 약간의 변형도 고려한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산의 서열 보전적 변이체를 고려한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 "서열-보전적 변이체"는, 제공된 코돈내 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변화가 당해 위치에서 암호화하고 있는 아미노산에 있어서의 변형을 가져오지 않는 변이체이다. 본 발명의 항체의 작용-보전적 변이체가 또한 본 발명에 의해 고려된다. "작용-보전적 변이체"는, 단백질 또는 효소내 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산의 유사한 특성을 가지는 아미노산으로 치환됨을 포함하나, 이에 한정되거나 이러한 의미를 갖지 않는, 폴리펩타이드의 전체적인 구조 및 작용을 변화시킴이 없이 변화된 변이체이다. 유사한 특성을 갖는 아미노산은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 상호교환적일 수 있는 극성/친수성 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 시스테인, 트레오닌, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 상호교환적일 수 있는 극성/소수성 아미노산은 글라이신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하며; 상호교환적일 수 있는 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 상호교환적일 수 있는 염기성 아미노산은 히스티딘, 라이신 및 아르기닌을 포함한다.
본 발명은 표 1a 내지 표 1f에 기술된 바와 같은 핵산에 의해 암호화된 항-IGFR1 항체 및 이의 단편과 이에 대해 하이브리드화되는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 낮은 스트링전시 조건(stringency condition), 더욱 바람직하게는 온화한 스트링전시 조건 및 가장 바람직하게는 높은 스트링전시 조건하에서 하이브 리드화하며, 바람직하게는 IGFR1 결합 활성을 나타낸다. 핵산 분자는, 핵산 분자의 일 본쇄 형이 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건하에서 다른 핵산 분자에 어닐링할 수 있는 경우(참조: 상기 Sambrook, et al.,) cDNA, 게놈성 DNA 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자에 "하이브리드화" 할 수 있다. 온도 및 이온 강도의 조건은 하이브리드화의 "스트링전시"를 결정한다. 통상의 낮은 스트링전시 조건은 55℃, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유 및 포름아미드가 없거나 30% 포름아미드, 5X SSC, 0.5% SDS일 수 있다. 통상적으로, 온화한 스트링전시 하이브리드화 조건은, 하이브리드화가 40% 포름아미드속에서, 5X 또는 6X SSC로 수행되는 것을 제외하고는 낮은 스트링전시 조건과 유사하다. 고 스트링전시 조건은, 하이브리드화 조건이 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC에서 및 임의로 보다 높은 온도(예를 들면, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃)에서 수행되는 것을 제외하고는, 낮은 스트링전시 조건과 유사하다. 일반적으로, SSC는 0.15M NaCl 및 0.015M Na-시트레이트이다. 하이브리드화는, 비록 하이브리드화의 스트링전시 조건에 따라 염기간의 미스매치가 가능하다고 할지라도, 2개의 핵산이 상보적인 서열을 함유하는 것을 필요로 한다. 핵산을 하이브리드화하기 위한 적합한 스트링전시 조건은 당해 분야에 잘 알려져 있는 가변성인 핵산의 길이 및 상보성 정도에 따른다. 2개의 뉴클레오타이드 서열사이의 유사성 또는 상동성 정도가 클수록, 핵산이 하이브리드화할 수 있는 스트링전시 조건이 높다. 길이에 있어서 100개 이상의 뉴클레오타이드의 하이브리드의 경우, 융점을 계산하기 위한 방정식이 유래된다(참조: Sambrook, et al., 상기 참조, 9.50-9.51). 보다 짧은 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이 드를 사용한 하이브리드화를 위해서는, 미스매치의 위치가 더욱 중요하게 되며, 올리고뉴클레오타이드의 길이는 이의 특이성을 결정한다(참조: Sambrook, et al., 상기 참조, 11.7-11.8).
또한, 알고리듬 매개변수가 각각의 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열사이의 최대 매치를 제공하도록 선택되는 BLAST 알고리듬으로 비교를 수행하는 경우, 표 1a 내지 표 1f의 참조 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대해 약 70% 이상의 동질성, 바람직하게는 약 80% 이상의 동질성, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상의 동질성 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동질성(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%)이 있는 아미노산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열 및 폴리펩타이드를 포함하는 핵산이 본 발명에 포함된다. 알고리듬의 매개변수가 각각의 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이에 최대 매치를 제공하도록 선택된 BLAST 알고리듬으로 비교를 수행하는 경우, 표 1a 내지 표 1f의 참조 아미노산 서열[예를 들면, 서열 2(예를 들면, 아미노산 20 내지 128번), 서열 4(예를 들면, 아미노산 20 내지 137번), 서열 8 내지 10, 서열 14 내지 16, 서열 17, 서열 25(예를 들면, 아미노산 21 내지 130번), 서열 27(예를 들면, 아미노산 20 내지 140번), 서열 31 내지 33 또는 서열 37 내지 39]에 대해 약 70% 이상 유사한, 바람직하게는 약 80% 이상 유사한, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상 유사한 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상 유사한(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다.
서열 동질성은 비교하는 2개 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산사이에 정확한 매치를 말한다. 서열 유사성은 비교하는 2개의 폴리펩타이드의 아미노산사이의 정확한 매치와, 동일하지 않은, 생화학적으로 관련된 아미노산사이의 매치 둘다를 말한다. 유사한 특성을 공유하며 상호교환적일 수 있는 생화학적으로 관련된 아미노산은 위에서 논의되어 있다.
BLAST 알코리듬에 관한 다음 문헌이 본원에 참조로 인용된다: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:2289-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.o., et al., "A model of evolutionary change in proteins. "in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dyhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships. "in Atlas of Proteins Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F.,(1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments. " in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York.
항체 구조
일반적으로, 염기성 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍을 포함하며, 각각의 쌍은 하나의 "경" 쇄(약 25kDa) 및 하나의 "중" 쇄(약 50 내지 70 kDa)이다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부위는 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함할 수 있다. 각각의 쇄의 카복시-말단 부위는 주로 효과인자 작용에 관여하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 통상적으로, 사람 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 정의된다. 또한, 사람 중쇄는 통상적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 항체의 동형을 정의한다. 경쇄 및 중쇄내에, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다[참조: 일반적으로, Fundamental Immunology Ch. 7(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)](모든 목적을 위해 이의 전체가 참조로 인용됨)].
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성할 수 있다. 즉, 일반적으로, 완전한 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이특이적인 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 일반적으로 동일하다.
일반적으로, 쇄는 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR이라 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 결합된 비교적 보존된 구조 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개 쇄로부터의 CDR은 일반적으로 특이적인 에피토프에 결합할 수 있는 구조 영역에 의해 정렬되어 있다. 일반적으로, N-말단으로부터 C-말단에 까지, 경쇄 및 중쇄 둘다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 일반적으로 문헌[참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342: 878-883]에 따른다. 본 발명은 카바트(Kabat) 및 코티아(Chothia)(상기 문헌 참조)에 의해 정의된 바와 같이, 1H3, 15H12 및 19D12(예를 들면, 15H12/19D12 LCA, 15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 HCA, 서열 2, 4, 25, 27, 41, 43 및 45)의 경쇄 및 중쇄로부터의 CDR 및 FR을 포함하는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 제공한다.
항체 분자
용어 "항체 분자"는 항체 및 단편, 바람직하게는 이의 항원-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당해 용어는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이특이적 항체, Fab 항체 단편, F(ab)2 항체 단편, Fv 항체 단편(예를 들면, VH 또는 VL), 일 본쇄 FV 항체 단편 및 dsFv 항체 단편을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체 분자는 완전한 사람 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체 분자는 모노클로날의, 완전한 사람 항체이며; 더욱 바람직하게는, 항체 분자는 1H3, 15H12 또는 19D12이다. 바람직하게는, 항체 분자는, 아미노산 및 핵산 서열이 표 1a 내지 표 1f에 설정되어 있는 하나 이상의 가변 영역 및 CDR을 포함한다.
본 발명은 하기 중에서 선택된 CDR을 포함하는 어떠한 항체 분자도 포함한다.
Figure 112004054354537-pct00001
본 발명의 영역은 어떠한 면역글로불린 불변 영역에 연결된 본 발명의 항체 가변 영역(예를 들면, 표 1a 내지 표 1f에 나타낸 성숙한, 또는 프로세싱되지 않은 어떠한 가변 영역)도 포함한다. 경쇄 가변 영역이 불변 영역에 연결되어 있는 경 우, 바람직하게 이는 κ 쇄이다. 중쇄 가변 영역이 불변 영역에 연결된 경우, 바람직하게 이는 γ1, γ2, γ3 또는 γ4 불변 영역, 더욱 바람직하게는, γ1, γ2 또는 γ4 및 더욱 더 바람직하게는 γ1 또는 γ4에 연결된다.
본 발명의 항-IGFR1 항체 분자는 사람 IGFR1, 바람직하게는 sIGFR1을 인지하지만, 본 발명은 상이한 종, 바람직하게는 포유동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토기, 양 또는 강아지)로부터의 IGFR1을 인지하는 항체 분자를 포함한다. 본 발명은 또한 IGFR1 또는 이의 어떠한 단편(예를 들면, 서열 19의 아미노산 30 내지 902번) 또는 세포 표면상에 IGFR1 또는 이의 어떠한 부위 또는 단편도 발현하는 어떠한 세포[예를 들면, 사람 IGFR1 또는 MCF7로 안전하게 형질전환된 HEK293 세포(예를 들면, ATCC 세포주 제HTB-22호)]과 복합체를 형성할 수 있는 항-IGFR1 항체 또는 이의 단편을 또한 포함한다. 이러한 복합체는 항체 또는 항체 단편을 IGFR1 또는 IGFR1 단편과 접촉시킴으로써 제조할 수 있다.
바람직한 양태에서, IGFR1에 대해 지시된 완전한 사람 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 사람 면역 시스템의 일부를 지닌 형질전환 마우스를 사용하여 생성시킨다. 본원에서 "HuMAb"라고 언급될 수 있는 이들 형질전환 마우스는 재배열되지 않은 사람 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 암호화하는 사람 면역글로불린 유전자 소위치와 함께, 내인성 μ 및 κ 쇄 위치를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이를 함유한다[참조: Lonberg, N., et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859]. 따라서, 당해 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내며, 면역화에 대한 반응에 있어, 도입된 사람 중쇄 및 경쇄 전이유전자는 부류 스위칭(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪으면서 고 친화성 사람 IgGκ모노클로날 항체를 생성한다[참조: Lonberg, N., et al., (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N., et al., (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93, and Harding, F., et al., (1995) Ann. N. Y Acad. Sci 764:536-546]. HuMab 마우스의 제조는 당해 분야에 일반적으로 알려져 있으며 예를 들면, 이의 기술 내용이 본원에 이의 전문에 대한 참조로 인용되어 있는 문헌[참조: Taylor, L., et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J., et al., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi, et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J., et al., (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon, et al., (1994) J Immunol. 152:2912-2920; Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:40-101; Taylor, L., et al., (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N., et al., (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F., et al., (1995) Ann. N.Y Acad. Sci 764:536-546; Fishwild, D., et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and Harding, et al., (1995) Annals NY Acad. Sci. 764:536-546]. 또한, 이의 전체 내용이 본원에 이의 전문에 대한 참조로 인용된 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 제5,700,429호 및 제5,545,807 호; 및 국제 특허공보 제WO98/24884호; 제WO94/25585호; 제WO93/12227호; 제WO92/22645호 및 제WO92/03918호를 참조한다.
IGFR1에 대한 완전한 사람, 모노클로날 항체를 생성시키기 위해, HuMab 마우스를 문헌[참조: Lonberg, N., et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D., et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 및 WO98/24884]에 기술된 바와 같이, 항원성 IGFR1 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 19의 아미노산 30 내지 902번으로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 처음 면역화시 6 내지 16주령일 것이다. 예를 들어, IGFR1 또는 sIGFR1의 정제된 제제를 사용하여 HuMab 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 당해 마우스는 또한 IGFR1 유전자로 안정하게 형질전환되거나 형질감염된 전체 HEK293 세포로 면역화시킬 수 있다. "항원성 IGFR1 폴리펩타이드"는 바람직하게는 HuMab 마우스내에서 항-IGFR1 면역 반응을 유발하는 이의 어떠한 단편의 IGFR1 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 19의 아미노산 30 내지 902번을 언급할 수 있다.
일반적으로, HuMAb 형질전환 마우스는, 완전한 플루언트 보조제(Freund's adjuvant)중 항원을 사용하여 복강내(IP)로 초기에 면역화시킨 후 불완전한 플루언트 보조제중 항원으로 격주마다 IP 면역화(일반적으로 총 6회까지)시키는 경우 잘 반응한다. 마우스는 우선 IGFR1을 발현하는 세포(예를 들면, 안정하게 형질전환된 HEK293 세포)에 이어, IGFR1의 가용성 단편(예를 들면, 서열 19의 아미노산 30 내지 902번)으로 면역화시킨 후 2개의 항원으로 교호적으로 계속 면역화시킬 수 있다. 면역 반응은 면역화 프로토콜의 과정을 통해 역궤도 출혈에 의해 수득된 혈장 샘플로 모니터할 수 있다. 혈장은 항-IGFR1 항체의 존재에 대해, 예를 들면, ELISA에 의해 스크리닝 할 수 있으며, 충분한 면역글로불린 역가를 갖는 마우스를 융합을 위해 사용할 수 있다. 마우스는 참수하여 비장을 제거하기 3일 전에 항원을 사용하여 정맥내로 부스트(boost)시킬 수 있다. 각각의 항원에 대해 2 내지 3회 주입이 수행을 위해 필요한 것으로 예상된다. 몇마리의 마우스를 각각의 항원에 대해 면역화시킬 수 있다. 예를 들어, HC07 및 HC012 균주의 총 12개의 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.
모노클로날, 완전한 사람 항-IGFR1 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 이들 방법은 코흘러(Kohler)등에 의해 개발된 하이브리도마 기술[참조: Kohler, et al., (1975), Nature 256:495-497) 및 트리오마 기술[참조: Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216 및 Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibody. Hybridomas 4:15], 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4:72 및 Cote, et al., (1983) Proc. Natl. Acas. Sci. U.S.A 80:2026-2030] 및 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985]을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 마우스 비장세포를 분리하여 표준 프로토콜을 기준으로 PEG를 사용하여 마우스 흑색종 세포주에 융합시킨다. 다음 수득되는 하이브리도마는 항원 특이적인 항체를 생산하기위해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 6마리의 수의 P3X63-Ag8.653 비배출 마우스 흑색종 세포(ATCC, CRL 1580)중 한마리에 50% PEG를 사용하여 융합시킬 수 있다. 세포는 평편바닥 미세역가 플레이트내에 약 2 x 105 세포/mL로 플레이팅한 후, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 조건화된 배지, 5% 오리진(IGEN), 4mM L-글루타민, 1mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 5mM HEPES, 0.055mM 2-머캅토에탄올, 50 단위/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 젠타마이신 및 1X HAT(Sigma 제조원, HAT는 융합후 24시간째에 가한다)를 함유하는 선택 배지내에서 2주 동안 항온처리할 수 있다. 2주 후, 세포를 배지속에서 배양하며, 여기서, HAT는 HT로 교체한다. 다음 개개의 웰을 ELISA에 의해 사람 항-IGFR1 모노클로날 IgG 항체에 대해 스크리닝할 수 있다. 일단 연장 하이브리도마 성장이 이루어지면, 일반적으로 배지를 10 내지 14일 후에 관측할 수 있다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 재플레이팅하고, 다시 스크리닝한 후, 여전히 사람 IgG에 대해 양성인 경우, 항-IGFR1 모노클로날 항체를 제한 희석에 의해 2회 이상 아클로닝할 수 있다. 다음 안정한 아클론을 시험관내에서 항온처리하여 특성화용 조직 배양 배지내에 소량의 항체를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항-IGFR 항체 분자는 또한 재조합적으로 생산할 수 있다(예를 들면, 위에서 논의한 이.콜라이/T7 발현 시스템내에서). 당해 양태에서, 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 핵산(예를 들면, VH 또는 VL)을 pET-계 플라스미드내에 삽입시키고 이. 콜라이/T7 시스템내에서 발현시킬 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 재조합 항체를 생산하는 몇가지 방법이 존재한다. 항제의 재조합 생산을 위 한 방법중 하나의 예는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,816,567호에 기재되어 있다. 형질전환은 숙주 세포내로 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 어떠한 공지된 방법에 의해서도 달성할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드를 포유 동물 세포내로 도입시키기 위한 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 덱스트란 중재된 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-중재된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 폴리펩타이드의 리포좀내 봉입, 바이오리스틱 주입 및 DNA의 핵내로의 직접적인 미세주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포내로 도입시킬 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,912,040호; 제4,740,461호 및 제4,959,455호].
발현용의 숙주로서 유용한 포유동물 세포주는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불멸 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLA 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 사람 간 세포 암종 세포(예를 들면, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, 및 다수의 기타 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 사람, 마우스, 랫트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특정의 바람직한 세포주는, 어떤 세포주가 높은 발현도를 갖는가를 측정하여 선택한다. 사용할 수 있는 다른 세포주는 Sf9 세포와 같은 곤충 세포주, 양서동물 세포, 세균 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 중쇄 또는 이의 항원-결합 부위, 경쇄 및/또는 이의 항원-결합 부위를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포 유동물 숙주 세포내로 도입되는 경우, 항체는 숙주 세포를 당해 숙주 세포내에서 항체를 발현시키기에 충분한 시간동안, 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지내로 항체가 5회 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산한다.
항체는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 또한, 생산 세포주로부터 본 발명의 항체(또는 이로부터의 기타 잔기)의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템(GS 시스템)이 특정 조건하에서 발현을 증진시키기 위한 일반적인 시도이다. GS 시스템은 유럽 특허 제0 216 846호, 제0 256 055호 및 제0 323 997호 및 유럽 특허원 제89303964.4호와 관련하여 전체 또는 일부가 논의되어 있다.
상이한 세포주 또는 형질전환 동물에 의해 발현된 항체는 각각 서로 상이한 글리코실화를 지닐 것으로 여겨진다. 그러나, 본원에서 제공된 핵산 분자에 의해 암호화된 항체, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는, 항체의 글리코실화에 상관없이, 본 발명의 일부이다.
"Koff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 오프 속도 상수이다.
"Kon"은 항체가 항원과 연합하는 속도이다.
"Kd"는 특정의 항체/항원 상호작용의 해리 상수이다. Kd = Koff / Kon.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질성인 항 체, 예를 들면, 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 존재하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개개의 항체의 집단으로부터 수득한 항체를 말한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일의 항원성 부위에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는, 이들이 다른 면역글로불린에 의해 필수적으로 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 개질인자 "모노클로날"은, 실질적으로 동질성인 항체 집단에 존재하는 항체의 특성을 나타내며, 어떠한 특정 방법에 의한 항체의 집단을 필요로 하는 것으로 구성되지는 않는다. 위에서 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용된 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler, et al., (1975) Nature 256:495]에 우선 기술된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있다.
폴리클로날 항체는 하나 이상의 다른 동일하지 않은 항체 중에서 또는 이의 존재하에 생산된 항체이다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 동일하지 않은 항체를 생산한 몇개의 다른 B-림프구의 존재하에서 B-림프구로부터 생산된다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 면역화된 동물로부터 직접 수득된다.
비특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중/경쇄 쌍과 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공의 하이브리드 항체이다. 이특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab 단편의 연결을 포함하는 각종 방법으로 생산할 수 있다[참조: Songsivilai, et al., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, et al., (1992) J Immunol. 148:1547-1553]. 또한, 이특이적 항체는 "다이아바디(diabody)"[참조: Holliger, et al., (1993) PNAS USA 90:6444-6448] 또는 "자누신 (Janusin)"[참조: Traunecker, et al., (1991) EMBO J. 10:3655-3659 및 Traunecker, et al., (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52]로서 형성될 수 있다.
용어 "완전한 사람 항체"는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말한다. 완전한 사람 항체는 마우스내에서 생산되는 경우, 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마 또는 마우스 세포내에서 쥐 탄수화물 쇄를 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체"는 마우스 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 말한다.
본 발명은 다른 비 사람 종(예를 들면, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭)으로부터 항체 영역(예를 들면, 불변 영역)과 융합되거나 이로 키메라된 본 발명의 가변 영역을 포함하는 항체인 "키메라 항체"를 포함한다. 이들 항체는 비 사람 종에서 IGFR1의 발현 또는 활성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
"일 본쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 지니며, 여기서, 이들 도메인은 폴리펩타이드 일본 쇄내에 존재한다. 일반적으로, sFv 폴리펩타이드는, 또한 sFv가 항원 결합에 대한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인사이에 폴리펩타이드 링커를 또한 포함한다. 일 본쇄 항체를 생산하기 위해 기술된 기술(참조: 미국 특허 제5,476,786호; 제5,132,405호 및 제4,946,778호)를 채택하여 항 IGFR1-특이적인 일 본쇄 항체를 생산할 수 있다. sFv에 대해 문헌[참조: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y., pp. 269-315 (1994)]를 참조한 다.
"디설파이드 안정화된 Fv 단편" 및 "dsFv"는 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 가변성 중쇄(VH) 및 가변성 경쇄(VL)을 포함하는 항체 분자를 말한다.
본 발명의 영역내 항체 단편은 또한 예를 들면, 펩신에 의해 IgG의 효소적 절단으로 생산될 수 있는 F(ab)2 단편을 포함한다. Fab 단편은 예를 들면, 디티오트레이톨 또는 머캅토에틸아민으로 F(ab)2을 환원시켜 생산할 수 있다. Fab 단편은 디설파이드 브릿지에 의해 VH-CH1 쇄에 달린 VL-CL 쇄이다. F(ab)2 단편은 결국 2개의 디설파이드 브릿지에 의해 달린 2개의 Fab 단편이다. F(ab)2 분자의 Fab 부위는 디설파이드 브릿지가 연결된 Fc 영역의 부위를 포함한다.
Fv 단편은 VL 또는 VH 영역이다.
중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류에 속할 수 있다. 5개 이상의 주요 부류의 면역글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 일부는 또한 아부류(아형), 예를 들면, IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2로 분리될 수 있다.
본 발명의 항-IGFR1 항체 분자는 또한 화학 잔기에 접합될 수 있다. 화학 잔기는 특히 중합체, 방사성핵종 또는 세포독성 인자일 수 있다. 바람직하게는 화학 잔기는 환자내에서 항체 분자의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들면, 분자량이 2kDa, 5kDa, 10kDa, 12kDa, 20kDa, 30kDa 또는 40kDa), 덱스트란 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리(Lee) 등은 문헌[참조: Lee, et al., (1999) Bioconj. Chem. 10:973-981]에서 PEG 접합된 일 본쇄 항체를 기술하고 있다. 웬(Wen) 등은 문헌[참조: Wen, et al., (2001) Bioconj. Chem. 12:545-553)에서 방사선금속 킬레이터(디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA))에 부착된 PEG와 항체를 접합시키는 것을 기술하고 있다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 또한 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51 Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152 Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 및 40 K, 157Gd, 55Mn, 52Tr 및 56Fe와 같은 표지물과 접합시킬 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 또한 희토 킬레이트, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 이소티오시아네이트, 파이코에리트린, 파이코시아닌, 알로파이코시아닌, o-프탈알데하이드, 플루오레스카민, 152Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 애큐오린 표지, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 바이오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 유리 라디칼과 같는 형광단을 포함하는 형광 표지 또는 화학발광 표지와 접합시킬 수 있다.
항체 분자는 또한 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질 및 화합물(예를 들면, 지방산), 디안틴 단백질, 파이토이아카 아메리카나 단백질 PAPI, PAPII, 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신과 같은 세포독성 인자에 접합시킬 수 있다.
문헌[참조: Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; and Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407]에 기술된 방법을 포함한, 본 발명의 항원 분자를 각종 잔기에 접합시키기 위한 당해 분야에 공지된 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 항체를 접합시키기 위한 방법은 통상적이며 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
변형된 항체 분자
본 발명은 서열 41, 43, 72, 74, 76 또는 78의 경쇄(15H12/19D12 LCA, LCB, LCC, LCD, LCE 또는 LCF); 바람직하게는 서열 41, 43, 72, 74, 76 또는 78의 아미노산 20 내지 128번(성숙한 15H12/19D12 LCA, LCB, LCC, LCD, LCE 또는 LCF)를 포함하는 항체 및 항원-결합 단편(예를 들면, 완전한 사람 항체, SFv, dsFv, Fv, 키메라 항체)를 포함한다. 본 발명은 또한 서열 45 또는 112의 중쇄(15H12/19D12 HCA, HCB); 바람직하게는 서열 45 또는 112의 아미노산 20 내지 137번(성숙한 15H12/19D12 HCA, HCB)를 포함하는 항체 분자를 포함한다.
15H12/19D12 LCA, LCB, LCC, LCD, LCE 및 LCF는 본 발명의 다른 면역글로불린 중쇄, 바람직하게는 면역글로불린 중쇄로 이량체화될 수 있다. 유사하게, 15H12/19D12 HCA 또는 HCB는 어떠한 경쇄, 바람직하게는 본 발명의 경쇄로 이량체화될 수 있다. 예를 들어, 15H12/19D12 HCA 또는 HCB는 15H12/19D12 LCC, LCD, LCE 또는 LCF로 이량체화될 수 있다.
15H12/19D12 LCA, 15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 LCC, 15H12/19D12 LCD, 15H12/19D12 LCE, 15H12/19D12 LCF, 15H12/19D12 HCA 또는 15H12/19D12 HCB를 포함하는 항체 및 이의 항원-결합 단편, 또는 이의 단편은 사람 환자에서 최소의 면역원성을 나타내므로, 사람 환자에게 투여시 HAHA 반응의 유발이 낮다.
바람직한 항체 쇄는 하기에 나타낸다. 점선으로 밑줄친 형태는 시그날 펩타이드를 암호화한다. 짙게 밑줄친 형태는 CDR을 암호화한다. 선명한 형태의 밑줄은 구조 영역을 암호화한다. 가장 바람직하게는, 항체 쇄는 시그날 펩타이드가 없는 성숙한 단편이다.
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유전자 치료요법
본 발명의 항-IGFR1 항체는 또한 유전자 치료요법 시도에서 환자에게 또한 투여될 수 있다. 유전자 치료요법 시도에서, 환자의 세포는 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산으로 형질전환시킨다. 다음 핵산을 포함하는 환자는 내인성으로 항체 분자를 생성할 것이다. 앞서의 알바레즈(Alvarez) 등의 문헌[참조: Alvarez, et al., (2000) Clinical Cancer Research 6:3081-3087]은 유전자 치료요법 시도를 사용하여 환자에게 일 본쇄 항-ErbB2 항체를 도입시켰다. 알바레즈 등에 의해 기술된 방법은 본 발명의 항-IGFR1 항체 분자를 암호화하는 핵산을 환자에게 도입시키기 위해 용이하게 채택할 수 있다.
비록, 본 발명의 어떠한 폴리펩타이드 또는 항체 분자를 암호화하는 핵산을 환자에게 도입시킬 수 있다고 해도, 바람직한 양태에서, 항체 분자는 완전한 사람, 일 본쇄 항체이다.
핵산은 당해 분야에 공지된 어떠한 수단으로도 환자의 세포내로 도입시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 핵산은 바이러스 벡터의 일부로서 도입된다. 벡터가 기원할 수 있는 바람직한 바이러스의 예는 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스, 박시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 알파바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 바람직한 세포 향성(tropism)을 지닌 다른 재조합 바이러스를 포함한다.
아비겐 인코포레이티드(Avigen, Inc.: 캘리포니아 알라메다 소재; AAV 벡터), 셀 게네시스(Cell Genesys: 캘리포니아 포스터 시티 소재; 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 벡터 및 렌티바이러스 벡터), 클론테크(Clontech; 레트로바이러스 및 바큘로바이러스 벡터), 제노보, 인코포레이티드(Genovo. Inc.: 펜실바이나주 샤론 힐 소재; 아데노바이러스 및 AAV 벡터), 젠벡(Genvec; 아데노바이러스 벡터), 인트로젠(IntroGene: 네덜란드 라이덴 소재; 아데노바이러스 벡터), 몰레큘러 메디신(Molecular Medicine; 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 및 헤르페스 바이러스 벡터), 노르겐(Norgen; 아데노바이러스 벡터), 옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica: 영국 옥스포드 소재; 렌티바이러스 벡터), 및 트랜스겐(Transgene: 프랑스 스트라스보르그 소재; 아데노바이러스, 박시니아, 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 회사에서 시판되는 바이러스 벡터를 생산한다.
바이러스 벡터를 작제하여 사용하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Miller, et al., (1992) Bio Techniques 7:980-990]. 바람직하게, 바이러스 벡터는 복제 결손되어 있는데, 즉, 이들은 자가적으로 복제할 수 없으므로, 표적 세포내에서 감염성이 아니다. 바람직하게는 복제 결손 바이러스는 최소 바이러스 이며, 예를 들어, 이들은 바이러스 입자를 생산하기 위해 게놈을 캡시드화(encapsidating)하는데 필요한 자체 게놈의 서열만을 지닌다. 바이러스 유전자 전체 또는 거의 전체를 결실한 결손 바이러스가 바람직하다. 결손 바이러스 벡터의 사용은, 벡터가 다른 세포를 감염시킬 수 있는 위험성없이, 특정의 국재 부위내 세포에 투여하도록 한다. 즉, 특정 조직이 특이적으로 표적화된다.
약화된 또는 결손 DNA 바이러스 서열을 포함하는 벡터의 예는 결손 헤르페스 바이러스 벡터[참조: Kanno, et al., (1999) Cancer Gen. Ther. 6:147-154; Kaplitt, et al., (1997) J. Neurosci. Meth. 71:125-132 및 Kaplitt, et al., (1994) J. Neuro Onc. 19:137-147]을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
아데노바이러스는 변형되어 효과적으로 본 발명의 핵산을 각종의 세포 유형으로 전달할 수 있는 진핵 세포성 DNA 바이러스이다. 스트라트포드-페리카우데트(Stratford-Perricaudet) 등의 문헌[참조: Stratford-Perricaudet, et al., (1992) J. Clin. Invest. 90:626-630]에 기술된 벡터와 같은, 약화된 아데노바이러스 벡터가 일부 예에서 바람직할 수 있다. 각종의 복제 결손 아데노바이러스 및 최소 아데노바이러스 벡터는 PCT 공보 제WO94/26914호, 제WO94/28938호, 제WO94/28152호, 제WO94/12649호, 제WO95/02697호 및 제WO96/22378호에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 기술로도 제조할 수 있다[참조: Levrero, et al., (1991) Gene 101:195; 유럽 제185573호; Graham, (1984) EMBO J. 3:2917; Graham, et al., (1977) J. Gen. Virol. 36:59].
아데노-연합된 바이러스(AAV)는 안정하고 부위 특이적인 방식으로 이들이 감염시킨 세포의 게놈내로 통합할 수 있는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 성장, 형태 또는 분화에 어떠한 영향을 유발하지 않고 광범위한 세포를 감염시키고, 이들은 사람 형태학에 관여되지 않는 것으로 여겨진다. 시험관 및 생체내에서 유전자를 전달하기 위한 AAV로부터 기원한 벡터의 사용은 문헌[참조: Daly, et al., (2001) Gene Ther. 8:1343-1346, 1245-1315; Larson, et al., (2001) Adv. Exp. Med. Bio. 489:45-47; PCT 공보 제WO91/18088호 및 제WO93/09239호; 미국 특허 제4,797,368호 및 제5,139,941호 및 유럽 특허 제488528 B1호]에 기술되어 있다.
다른 양태에서, 유전자는 예를 들면, 문헌[참조: 미국 특허 제5,399,346호, 제4,650,764호, 제4,980,289호 및 제5,124,263호; Mann, et al., (1983) Cell 33:153; Markowitz, et al., (1988) J. Virol., 62:1120; 유럽 특허 제453242호 및 유럽 특허 제178220호]에 기술된 바와 같은 레트로바이러스 벡터내로 도입될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 분열하는 세포를 감염시키는 통합 바이러스이다.
렌티바이러스 벡터도 뇌, 망막, 근육, 간 및 혈액을 포함하는 몇몇 조직 유형내에서 본 발명의 항체 분자를 암호화하는 핵산의 직접적인 전달 및 지속된 발현을 위한 제제로 사용될 수 있다. 당해 벡터는 이러한 조직내에서 분열하는 세포 및 분열하지 않는 세포를 효율적으로 형질도입시키고 항체 분자의 장기간의 발현을 유지시킬 수 있다[참조: Zufferey, et al., (1988) J. Virol. 72:9873-80 및 Kafri, et al., (2001) Curr. Opin. Mol. Ther. 3:316-326]. 렌티바이러스 패키징 세포주는 당해 분야에서 시판되며 일반적으로 공지되어 있다. 이들은 유전자 치료요법을 위한 고 역가 렌티바이러스 벡터의 생산을 용이하게 한다. 예로는 3 내지 4일이상 동안에 106IU/ml이상의 역가로 바이러스 입자를 생성할 수 있는 테트라사이클린-유도성 VSV-G 슈도형 렌티바이러스 패키징 세포주가 있다[참조: Kafri, et al., (1999) (J. Virol. 73: 576-584)]. 유도성 세포주에 의해 생산된 벡터는 시험관내 및 생체내에서 분열하지 않는 세포를 효율적으로 형질도입시키는데 필요한 정도로 농축시킬 수 있다.
신드비스 바이러스는 알파바이러스 속의 구성원이며 1953년에서 시작하여 세계의 다양한 지역에서 발견되었기 때문에 집중적으로 연구되었다. 알파바이러스, 특히 신드비스 바이러스를 기초로 한 유전자 형질도입은 시험관내에서 잘 연구되어 있다[참조: Straus, et al., (1994) Microbiol. Rev., 58:491-562; Bredenbeek, et al., (1993) J. Virol., 67; 6439-6446 Lijima, et al., (1999) Int. J. Cancer 80:110-118 및 Sawai, et al., (1998) Biochim. Biophyr. Res. Comm. 248:315-323]. 알파바이러스 벡터의 많은 특성들은, 이들이 발현 구조물의 신속한 가공, 감염성 입자의 고 역가 스톡의 생산, 분열하지 않는 세포의 감염 및 고 수준의 발현을 포함하는, 다른 바이러스 유도된 벡터 시스템에 대해 바람직한 대안이 되도록 한다[참조: Strauss, et al., (1994) Microbiol. Rev. 58:491-562]. 유전자 치료요법용의 신드비스 바이러스의 사용도 기술되어 있다[참조: Wahlfors, et al., (2000) Gene. Ther. 7:472-480 및 Lundstrom (1999) J. Recep. Sig. Transduct. Res. 19(1-4):673-686].
다른 양태에서, 벡터는 지질감염에 의해 또는 다른 형질감염 촉진제(펩타이드, 중합체 등)를 사용하여 세포내로 도입시킬 수 있다. 합성 양이온성 지질을 사용하여 마커를 암호화하는 유전자의 생체내 및 시험관내 형질감염용 리포좀을 제조할 수 있다[참조: Felgner, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 및 Wang, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855]. 핵산을 전달하기 위한 유용한 지질 화합물 및 조성물은 PCT 공보 제WO95/18863호 및 제WO96/17823호, 및 미국 특허 제5,459,127호에 기술되어 있다.
벡터를 노출된(naked) DNA 플라스미드로서 생체내에 도입시킬 수 있다. 유전자 치료요법용의 노출된 DNA 벡터는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 유전자 총(gene gun)의 사용, 또는 DNA 벡터 운반인자(transporter)의 사용에 의해 목적한 숙주 세포내로 도입시킬 수 있다[참조: Wilson, et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; Williams, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730]. 수용체 중재된 DNA 전달 시도를 또한 사용할 수 있다[참조: Wu, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263:14621-14624]. 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호는 포유동물에서 감염 촉진 인자의 부재하에 외인성 DNA 서열의 전달을 기술하고 있다. 최근에, 전기전달(electrotransfer)이라 불리는 상대적으로 낮은 전압, 고 효율의 생체내 DNA 전달 기술이 기술되어 있다[참조: Vilquin, et al., (2001) Gene Ther. 8:1097; Payen, et al., (2001) Exp. Hematol. 29:295-300; Mir (2001) Bioelectrochemistry 53:1-10; PCT 공보 제WO99/01157호, 제WO99/01158호 및 제 WO99/01175호].
약제학적 조성물
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 환자 생체내에 투여하기에 적합한, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 조성물내로 도입시킬 수 있다. 비록 본 발명의 영역이 어떠한 경로[예를 들면, 경구, 안구, 국소 또는 폐(흡입)]로든 환자에게 투여할 수 있는 약제학적 조성물을 포함한다고 해도, 종양내 주사, 정맥내 주사, 경피 주사 또는 근육내 주사와 같은 비경구 경로에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 1H3, 15H12, 19D12, 15H12/19D12 LCA, 15H12/19D12 LCB, 15H12/19D12 LCC, 15H12/19D12 LCD, 15H12/19D12 LCE, 15H12/19D12 LCF, 15H12/19D12 HCA 또는 15H12/19D12 HCB 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
제형에 대한 일반적인 정보를 위해서는, 문헌[참조: Gilman, et al., (eds. )(1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed. ), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania.; Avis, et al., (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman, et al., (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; and Lieberman, et al., (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker]을 참조한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 통상적이며 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예에는 수성 및 비수성 담체, 안정화제, 항산화제, 용매, 분산 매질, 피복제, 항미생물제, 완충제, 혈청 단백질, 등장성 및 흡수 지연제 및 생리학적으로 혼화성인 제제가 포함된다. 바람직하게는, 담체는 환자 신체내로 주사하기에 적합하다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은), 및 이의 적합한 혼합물, 올리브 오일과 같은 야채 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르를 포함한다. 적합한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 피복 재료를 사용하거나, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기를 유지시키거나, 및 표면활성제를 사용함에 의해 유지시킬 수 있다.
α,α-트레할로즈 디하이드레이트와 같은 안정화제가 해리 또는 동결 건조의 붕해 효과로부터 본 발명의 항체 분자를 안정화시키기 위해 포함될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 항산화제의 예는 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 비설페이트, 나트륨 메타비설파이트, 나트륨 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; 및 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.
미생물 존재의 방지는 안정화 과정, 및 EDTA, EGTA, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등과 같은 다양한 항미생물제를 도입시킴에 의해 둘다 보증될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 적합한 완충제는 L-히스티딘계 완충제, 인산염계 완충제(예를 들면, 인산염 완충된 염수, pH 약 7), 소르베이트계 완충제 또는 글리신계 완충제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물속에 포함될 수 있는 혈청 단백질은 사람 혈청 알부민을 포함할 수 있다.
당, 에탄올, 다가알코올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨 또는 소르비톨), 나트륨 시트레이트 또는 나트륨 클로라이드(예를 들면, 완충된 염수)와 같은 등장성 제제를 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 포함시킬 수 있다.
주사가능한 약제학적 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및/또는 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함시킴에 의해 달성시킬 수 있다.
분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 속에서 및 오일속에서 제조할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사용액 또는 분산액을 즉석 제조하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질을 제조하기 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
멸균 주사 용액은 필요량의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 적절한 용매속에, 임의로 필요할 경우, 위에서 열거한 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물속에 도입시킨 후 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 항체 분자를 염기성 분산 매질과 위에서 열거한 성분들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클내로 도입시킴에 의해 제조한다. 멸균 주사가능한 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말과 임의의 추가로 바람직한 성분을 앞서의 멸균 여과된 이의 용액으로부터 수득하는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 경구 투여될 수 있다. 경구 투여용의 약제학적 조성물은 결합 조성물외에, 전분(예를 들면, 감자, 옥수수 또는 밀 전분 또는 셀룰로즈), 전분 유도체(예를 들면, 미세결정성 셀룰로즈 또는 실리카), 당(예를 들면, 락토즈), 활석, 스테아레이트, 탄산마그네슘 또는 인산칼슘과 같은 첨가제를 함유할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 경구 조성물이 환자의 소화계에 의해 잘 견디도록 하기 위해서, 점성 형성제 또는 수지를 포함시킬 수 있다. 위액속에서 불용성인 캅셀속에 항체 또는 항원-결합 단편을 제형화시킴으로써 내성을 개선시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 캅셀 형태의 본 발명의 예시적인 약제학적 조성물은 표준 2조각 경 젤라틴 캅셀에 분말 형태의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 락토즈, 활석 및 마그네슘 스테아레이트를 충진시켜 제조한다. 면역글로불린의 경구 투여는 문헌[참조: Foster, et al., (2001) Cochrane Database System rev. 3:CD001816]에 기술되어 있다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 국소 투여용 약제학적 조성물속에 포함될 수 있다. 국소 투여에 적합한 제형은 피부 내지 치료가 요구되는 부위를 통해 침투하기에 적합한 액체 또는 반-액체 제제, 예를 들면, 도포제, 로숀, 크림, 연고 또는 페이스트제와 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다.
본 발명에 따른 점적제는 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있으며 항체 또는 항원-결합 단편을 세균 및/또는 진균제의 적합한 수용액 및/또는 다른 모든 적합한 방부제속에 용해시키고 바람직하게는 표면 활성제를 포함시킴에 의해 제조할 수 있다. 다음 수득되는 용액을 여과에 의해 청정하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 로숀제는 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것들을 포함한다. 눈 로숀은 임의로 살균제를 함유하는 멸균, 수용액을 포함할 수 있으며 점적제를 제조하기 위한 것들과 유사한 방법으로 제조할 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로숀 또는 도포제는 또한 건조를 촉진시키고 피부를 냉각시키는 제제, 예를 들면, 알코올 또는 아세톤, 및/또는 글리세롤과 같은 습윤제 또는 카스터 오일 또는 아라키스 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트제는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반-고체 제형이다. 이들은 미분되거나 분말화된 형태의 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을, 단독으로 또는 수성 또는 비수성 유액중 용액중 용액 또는 현탁액속에, 지방 또는 비지방 기재를 사용하는 적합한 기계로 혼합하여 제조할 수 있 다. 이들 기재는 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속 비누과 같은 탄화수소; 점질물; 알몬드, 옥수수, 아라키스, 카스터 또는 올리브 오일과 같은 천연 기원의 오일; 양모 지방 또는 이의 유도체, 또는 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산과 프로필렌 글리콜 또는 마크로겔과 같은 알코올을 포함할 수 있다. 당해 제형에 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리에틸렌 유도체와 같은 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 표면 활성제와 같은 어떠한 적합한 표면활성제도 혼입시킬 수 있다. 천연 검, 셀룰로즈 유도체 또는 실리카성 실리카와 같은 무기 물질과 같은 현탁제, 및 라놀린과 같은 기타 성분이 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 또한 흡입에 의해 투여될 수 있다. 흡입용으로 적합한 약제학적 조성물은 에어로졸일 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 흡입용의 예시적인 약제학적 조성물은, 바람직하게는 1,2-디클로로테트라플루오로에탄 및 디플루오로클로로메탄과 배합된 프레온과 같은 추진제속에 분산된 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제와 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 용량이 15 내지 20ml인 에어로졸 용기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 당해 조성물은 비강 또는 경구 흡입 투여용으로 채택된 적절한 에어로졸 용기내에 존재한다.
본 발명의 다른 양태에서, 당해 약제학적 조성물은 조합 치료요법에 의해 투여할 수 있다. 예를 들어, 조합 치료요법은 본 발명의 약제학적 조성물과 함께 하나 이상의 항암 치료제(예를 들면, 알킬화제, 항대사제, 항 종양 항생제, 유사분열 억제제, 크로마틴 작용 억제제, 항-혈관형성제, 항-에스트로겐제, 항-안드로겐제, 항체 치료요법제 또는 면역조절제)를 포함할 수 있다. "항암 치료제"는 환자에 투여시, 환자 신체내의 암의 진행을 치료하거나 예방하는 물질이다. 본 발명의 조성물은 하나 이상의 항암 치료 과정(예를 들면, 방사선 치료요법 또는 외과 종양절제술)과 함께 투여할 수 있다. "항암 치료 과정"은 환자에서 암의 발생을 치료하거나 감소시키는, 환자에서 수행되는 과정이다. 조합 치료요법이 사용되는 경우, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이의 약제학적 조성물은 동시 전달용의 단일 조성물로 제형화되거나 2개 이상의 조성물(예를 들면, 키트)내로 별도로 제형화될 수 있다. 또한, 항체 또는 항원-결합 단편은 다른 치료제가 투여되거나 치료 과정이 적용되는 시간과는 상이한 시간에 환자에게 투여될 수 있는데, 예를 들어, 각각의 투여는 제공된 기간에 걸쳐 수회의 간격으로 제공될 수 있다.
"알킬화제"는 세포내 어떠한 분자, 바람직하게는 핵산(예를 들면, DNA)를 가교결합시키거나 알킬화시킬 수 있는 물질을 말한다. 알킬화제의 예는 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 페닐알라닌 무스타드, 멜팔렌, 클로람부콜, 우라실 무스타드, 에스트라무스틴. 티오테파, 부설판, 로무스틴, 카르무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진, 시스-플라티늄, 카르보플라틴 및 알트레타민을 포함한다.
"항대사제"는 특정의 활성, 일반적으로 DNA 합성을 방해함으로써 세포 성장 및/또는 대사를 차단하는 물질을 말한다. 항대사제의 예는 메토트렉세이트, 5-플루오르우라실, 플록수리딘, 5-플루오로데옥시우리딘, 카페시타빈, 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 겜시타빈, 클라드리빈, 데옥 시코포르마이신 및 펜토스타틴을 포함한다.
"항 종양 항생제"는 DNA, RNA 및/또는 단백질 합성을 방지하거나 억제할 수 있는 화합물을 말한다. 항 종양 항생제의 예는 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 발루비신, 미톡산트론, 닥티노마이신, 미트라마이신, 플리카마이신, 미토마이신 C, 블레오마이신 및 프로카르바진을 포함한다.
"유사분열 억제제"는 세포 주기 및 유사분열의 정상적인 진행을 방지한다. 일반적으로, 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 미소관 억제제는 유사분열을 억제할 수 있다. 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드도 또한 유사분열을 억제할 수 있다.
"크로마틴 작용 억제제"는 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II와 같은 크로마틴 모델화 단백질의 정상적인 작용을 억제하는 물질을 말한다. 크로마틴 작용 억제제의 예는 토포테칸, 이리노테칸, 에토포사이드 및 테니포사이드를 포함한다.
"항-혈관형성제"는 혈관의 성장을 억제하는 특정의 약물, 화합물, 물질 또는 제제를 말한다. 예시적인 항-혈관형성제는 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 탈리도미드, 스쿠알아민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴 및 비탁신을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
"항-에스트로겐" 또는 "항-에스트로겐제"는 에스트로겐의 작용을 감소시키거나, 길항하거나 억제하는 특정 물질을 말한다. 항-에스트로겐제의 예는 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 요독시펜, 아나스트로졸, 레트로졸 및 엑세메스탄이다.
"항-안드로겐" 또는 "항-안드로겐제"는 안드로겐의 작용을 감소시키거나, 길항하거나 또는 억제하는 특정 물질을 말한다. 항-안드로겐의 예는 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 스프리로놀락톤, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드 및 시미티딘이다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편과 함께 투여될 수 있는 항체 치료요법은 트라스투주마브(예를 들면, 헤르셉틴)[참조: Sliwkowski, et al., (1999) Semin. Oncol. 26(4 Suppl 12):60-70], 비탁신 및 리툭시마브를 포함한다.
"면역조절제"는 면역계를 자극하는 물질이다. 면역조절제의 예는 데니류킨 디프티톡스, 5-플루오로우라실과 결합된 레바미졸, 인터페론 및 인터류킨-2를 포함한다.
"방사치료요법" 또는 "방사선 치료요법"은 암과 같은 질병을, 이온화 방사선(바람직하게는 종양 부위에)을 투여함으로써 치료하는 것을 말한다. 투여할 수 있는 이온화 방사선의 예는 X-선, 감마 선(예를 들면, 로듐, 우라늄 또는 코발트 60에 의해 방사된) 및 입자 빔 방사선(예를 들면, 양성자, 중성자, 파이중간자 또는 중 이온)을 포함한다.
용량
바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 환자에게 치료되지 않 은 환자에 대해 약 20% 이상, 더욱 바람직하게는 약 40% 이상, 더욱 바람직하게는 약 60% 이상 및 더욱 더 바람직하게는 약 80 내지 100% 이상의 정도로 IGFR1에 의해 중재된 질병 또는 상태(예를 들면, 종양 성장)을 바람직하게 억제하는 "치료학적 용량"으로 투여한다. 암을 억제하기 위한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 능력은 사람 종양에서의 효능의 지표인 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 달리는 조성물의 이러한 특성은, 숙련가에게 잘 공지된 검정(하기 참조)에 의해 시험관내에서 종양 세포 성장을 억제하는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 시험함으로써 평가할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 환자의 체격, 환자 증상의 중증도 및 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 인자를 기초로 하여 이러한 양을 측정할 수 있다.
용량 섭생을 조절하여 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 단일 거환제를 투여할 수 있으며, 수회로 나누어진 투여량을 시간에 걸쳐 투여하거나 당해 투여량을 치료 상황의 필요성에 의해 제시되는 양으로 적절히 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 투여 균일성을 위해 용량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다.
당해 분야의 숙련의 또는 수의사는 필요한 약제학적 조성물의 유효량을 용이하게 측정하여 처방할 수 있다. 예를 들어, 숙련의 또는 수의사는 목적한 치료 효과를 달성하기 위하여 요구되는 양보다 더 적은 수준으로 약제학적 조성물에 사용되는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 용량으로 출발하여, 목적한 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물 의 적합한 일일 투여량은 치료학적 효과를 달성하기에 효과적인 최저 투여량인 화합물의 양일 수 있다. 이러한 유효 투여량은 일반적으로 상술한 인자에 따를 것이다. 바람직하게는 표적 부위(예를 들면 종양)에 인접한 부위에 주사함으로써 투여하는 것이 바람직하다. 경우에 따라, 약제학적 조성물의 효과적인 일일 투여량은 하루에 적절한 간격에서 별도 투여된 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상의 아투여량으로 투여될 수 있다.
치료방법 및 투여
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 및 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 IGFR1의 증가된 발현 또는 활성에 의해 또는 이의 리간드(예를 들면, IGF-I 또는 IGF-II)의 증가된 발현에 의해 중재되고 IGFR1 리간드 결합, 활성 또는 발현의 조절에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 환자에서의 특정 질병 또는 상태를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 당해 질병 또는 상태는 IGFR1, IGF-I 또는 IGF-II의 증가된 수준에 의해 중재되고 IGFR1 리간드 결합, 활성(예를 들면, 자가인산화 활성) 또는 발현을 감소시킴에 의해 치료하거나 예방한다. 바람직하게는, 당해 질병 또는 상태는 악성종양, 더욱 바람직하게는 방광암, 윌름스 암, 골암, 전립선 암, 폐암, 직장결장암, 유방암, 자궁경부암, 윤활막 육종, 난소암, 췌장암, 양성 전립선 과형성(BPH), 전이유암종과 연관된 설사 및 혈관활성 장 펩타이드 분비 종양[예를 들면, VIPoma 또는 베르너-모리슨 증후군(Werner-Morrison syndrome)]과 같은 IGFR1을 발현하는 종양에 의해 특징화되는 악성 종양이나, 이에 한정되지는 않는다. 말단비대증이 또한 본 발명의 항체 분자로 치료될 수 있다. IGF-I의 길항작용은 말단비대증의 치료에 대해 보고되어 있다[참조: Drake, et al., (2001) Trends Endocrin. Metab. 12: 408-413]. 환자에서, 본 발명의 항-IGFR1 항체를 투여함에 의해 또한 치료될 수 있는 다른 비-악성 종양의 의학 상태는 비대증, 건선, 죽상경화증, 혈관의 평활근 재협착 또는 당뇨병의 합병증으로서, 특히 눈의 합병증으로서 밝혀진 것과 같은 부적절한 미세혈관 증식을 포함한다.
용어 "환자"는 어떠한 유기체, 바람직하게는 동물, 더욱 바람직하게는 포유동물(예를 들면, 랫트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 사람을 언급할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편 및 이의 약제학적 조성물은 주사(상기 참조)와 같은 침투 경로에 의해 투여한다. 비-침투 경로(상기 참조)에 의한 투여 또한 본 발명의 영역내에 있다.
조성물은 당해 분야에 공지된 의학 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물을 피하 침으로 주사함으로써 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 침이없는 피하 주입 장치, 예를 들면, 미국 특허 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 기술된 장치를 사용하여 투여할 수 있다.
본 발명에 유용한 잘 공지되어 있는 임플란트(implant) 및 모듈(module)의 예는 조절된 속도로 의약을 분산시키기 위한 삽관가능한 미세-주입 펌프를 기술하고 있는 미국 특허 제4,487,603호; 정밀한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 기술하고 있는 미국 특허 제4,447,233호; 연속된 약물 전달용의 가변적으로 유동하는 삽관가능한 주입 장치를 기술하고 있는 미국 특허 제4,447,224호; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 기술하고 있는 미국 특허 제4,439,196호를 포함한다. 많은 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다.
검정
항-IGFR1 항체는 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 샘플내 IGFR1을 검출하는데 사용될 수 있다[참조: 예를 들면, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158(CRC Press, Inc., 1987)]. 항-IGFR1 항체는 ELISA, RIA, FACS, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 이에 한정함이 없이 포함하는 통상의 면역검정에서 사용할 수 있다. 본 발명의 항-IGFR1 항체를 사용하여 사람으로부터 IGFR1을 검출할 수 있다. 본 발명은 생물학적 샘플을 본 발명의 항-IGFR1 항체와 접촉시키고, IGFR1에 결합된 항-IGFR1 항체를 검출함으로써 생물학적 샘플내 IGFR1의 존재를 나타냄을 포함하는, 생물학적 샘플내 IGFR1을 검출하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 항-IGFR1 항체를 검출가능한 표지로 직접 표지하고 직접 검출할 수 있다. 다른 양태에서, 항-IGFR1 항체(제1 항체)를 표지시키지 않고, 항-IGFR1 항체를 결합시킬 수 있는 제2 항체 또는 다른 분자를 표지시킨다. 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 특정 종 및 제1 항체의 부류에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체를 선택한다. 예를 들어, 항-IGFR1 항체가 사람 IgG인 경우, 제2 항체는 항-사람-IgG일 수 있다. 생물학적 샘플내 항-IGFR1/IGFR1 복합체의 존재는 표지된 제2 항체의 존재를 검출함으로써 검출할 수 있다. 항체(예를 들면, 항-IGFR1 항체)에 결합할 수 있는 다른 분자는 단백질 A 및 단백질 G를 이에 제한함이 없이 포함하며, 이들 둘다는 예를 들면, 피어스 케미칼 코포레이션(Pierce Chemical Co.,: 일리노이주 록포드 소재)에서 시판된다.
항-IGFR1 또는 제2 항체에 대한 적합한 표지는 위에 기술되어 있으며 각종 효소, 인공 그룹, 형광성 물질, 발광 물질, 자기제 및 방사활성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하며; 적합한 인공 그룹 복합체의 예는 스트렙트아비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광성 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 자기제의 예는 가돌리늄을 포함하며; 적합한 방사활성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 포함한다.
다른 양태에서, IGFR1은, 검출가능한 물질로 표지된 IGFR1 표준물 및 표지되지 않은 항-IGFR1 항체를 이용함으로써 경쟁 면역검정으로 생물학적 샘플내에서 검 정할 수 있다. 당해 검정에서, 생물학적 샘플, 표지된 IGFR1 표준물 및 항-IGFR1 항체를 합하고 표지되지 않은 항체에 결합된 표지된 IGFR1 표준물의 양을 측정한다. 생물학적 샘플내 IGFR1의 양은 항-IGFR1 항체에 결합된 표지된 IGFR1 표준물의 양에 역비례한다. 당해 분야의 숙련가는 여러 목적을 위해 위에서 기술된 면역검정을 사용할 수 있다. 하나의 양태에서, 항-IGFR1 항체를 사용하여 세포 배양물내 세포내에서 IGFR1을 검출할 수 있다. 바람직한 양태에서, 항-IGFR1 항체를 사용하여 각종 화합물로 세포를 치료한 후 세포 표면상에서 타이로신 인산화, IGFR1의 타이로신 자가인산화 및/또는 IGFR1의 양을 측정할 수 있다. 당해 방법을 사용하여 IGFR1을 활성화시키거나 억제하는데 사용할 수 있는 화합물을 시험할 수 있다. 당해 방법에서, 세포의 하나의 샘플을 다른 샘플이 비처리된채로 방치되는 기간동안 시험 화합물로 처리한다. 타이로신 자가인산화를 측정하는 경우, 세포를 분해하고 IGFR1의 타이로신 자가인산화를 예를 들면, 위에서 기술한 바와 같은 면역검정을 사용하여 측정한다. IGFR1의 총 수준을 측정하여야 하는 경우, 당해 세포를 분해하여, 총 IGFR1 수준을 위에서 기술한 면역검정 중 하나를 사용하여 측정한다.
IGFR1 타이로신 인산화를 측정하거나 총 IGFR1 수준을 측정하기 위한 바람직한 면역검정은 ELISA 또는 웨스턴 블롯이다. IGFR1의 세포 표면 수준만이 측정되어야 하는 경우, 세포를 분해하지 않고, IGFR1의 세포 표면 수준을 위에서 기술한 면역검정중 하나를 사용하여 측정한다. IGFR1의 세포 표면 수준을 측정하기 위한 바람직한 면역검정은 세포 표면 단백질을 바이오틴 또는 125I와 같은 검출가능한 표지로 표지하고, IGFR1을 항-IGFR1 항체로 면역침전시킨 후 표지된 IGFR1을 검출하는 단계를 포함한다. IGFR1의 국재화, 예를 들어, 세포 표면 수준을 측정하기 위한 다른 바람직한 면역검정은 면역조직화학을 사용하는 것이다. ELISA, RIA, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 인테그랄 막(integral membrane), 단백질의 세포 표면 표지화 및 면역침전과 같은 방법들은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 또한, 당해 면역검정은 IGFR1의 활성화 또는 억제를 위해 다수의 화합물을 시험하기 위한 고 처리량 스크리닝을 위해 규모를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 항-IGFR1 항체를 또한 사용하여 조직 또는 조직으로부터 기원한 세포내 IGFR1의 수준을 측정할 수 있다. 바람직한 양태에서, 조직은 질병이 있는 조직이다. 더욱 바람직한 양태에서, 당해 조직은 종양 또는 이의 생검이다. 당해 방법의 바람직한 양태에서, 조직 또는 이의 생검은 환자로부터 절개한다. 이후 조직 또는 생검을 면역검정에 사용하여 예를 들면, IGFR1 수준, IGFR1의 세포 표면 수준, IGFR1의 타이로신 인산화 수준, 또는 IGFR1의 국재화를 위에서 기술한 방법으로 측정한다. 당해 방법을 사용하여 종양이 IGFR1을 고 수준으로 발현하는지를 측정할 수 있다.
위에서 기술한 진단 방법을 사용하여, 종양이 항-IGFR1 항체를 사용한 치료에 잘 반응할 것인지의 지표일 수 있는, 종양이 IGFR1을 고 수준으로 발현하는지를 측정할 수 있다. 진단 방법은, 또한 종양이 IGFR1을 고 수준으로 발현하는 경우, 이것이 강력한 암성인지, 이것이 IGFR1을 저 수준으로 발현하는 경우 양성인지를 측정하는데 사용할 수 있다. 또한, 진단 방법을 사용하여 항-IGFR1 항체를 사용한 치료가, 종양이 보다 낮은 수준의 IGFR1을 발현하도록 하고/하거나 저 수준의 타이로신 자가인산화를 나타내도록 하는지를 측정함으로써 치료가 성공적인지를 결정하는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 항 IGFR1 항체가 타이로신 인산화를 감소시키는지를 측정하는 방법은 목적한 세포 또는 조직내에서 타이로신 인산화의 수준을 측정하는 단계, 항-IGFR1 항체 또는 이의 항원-결합 부위와 세포 또는 조직을 항온처리하는 단계 및 이후에 세포 또는 조직에서 타이로신 인산화의 수준을 재측정하는 단계를 포함한다. IGFR1 또는 다른 단백질의 타이로신 인산화를 측정할 수도 있다. 당해 진단 방법을 또한 사용하여 난장이증, 골다공증 또는 당뇨병이 있는 개인의 경우일 수 있는, 조직 또는 세포가 충분히 높은 수준의 IGFR1을 발현하지 않는지 또는 활성화된 IGFR1를 충분히 높은 수준으로 발현하는지를 측정할 수 있다. IGFR1 또는 활성 IGFR1의 수준이 충분히 낮은 진단을 항-IGFR1 항체, IGF-1, IGF-2 또는 IGFR1 수준 또는 활성을 증가시키기 위한 다른 치료제를 사용한 치료를 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는 또한 IGFR1을 발현하는 조직 및 기관을 국재화시키기 위해 생체내에서 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 항-IGFR1 항체를 사용하여 IGFR1을 발현하는 종양을 국재화시킬 수 있다. 본 발명의 항-IGFR1 항체의 장점은, 이들이 투여시 면역 반응을 생성하지 않을 것이라는 사실이다. 당해 방법은 항-IGFR1 항체 또는 이의 약제학적 조성물을 이러한 진단 시험이 요구되는 환자에 투 여하는 단계 및 당해 환자를 영상화 분석하여 IGFR1을 발현하는 조직의 위치를 측정하는 단계를 포함한다. 영상화 분석은 의학 분야에 잘 공지되어 있으며, x-선 분석, 자기 공명 영상화(MRI) 또는 컴퓨터화된 단층촬영술(CT)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 당해 방법의 다른 양태에서는, 환자로부터 생검을 수득하여, 환자를 영상화 분석하기보다는 목적 조직이 IGFR1을 발현하는지를 측정한다. 바람직한 양태에서, 항-IGFR1 항체는 환자에서 영상화될 수 있는 검출가능한 제제로 표지할 수 있다. 예를 들어, 항체는 x-선 분석에 사용할 수 있는, 바륨과 같은 콘트라스트제, 또는 MRI 또는 CE에 사용할 수 있는 가돌리늄 킬레이트와 같은 자기 콘트라스트제를 사용하여 표지할 수 있다. 다른 표지제는 99Tc와 같은 방사선동위원소를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 양태에서는, 항-IGFR1 항체를 표지시키지 않고 항-IGFR1 항체와 결합할 수 있고 검출가능한 제2 항체 또는 다른 분자를 투여함으로써 영상화할 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 기술하기 위해 제공하는 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다.
실시예 1: 완전한 사람 항-IGFR1 항체의 작제
1.0 도입
사람 인슐린 유사 성장 인자 수용체 I(IGFR1)에 특이적인 완전한 사람 모노클로날 항체를 Hco7 유전형의 HuMab로부터 생성시키고(하기 참조), 재조합 sIGFR1 및 IGFR1으로 감염된 HEK293 세포로 면역화시켰다. HcO7 마우스의 상세한 기술은 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호; 제5,770,429호; 제5,789,650호; 제5,814,318호; 제5,874,299호 및 제5,877,397호, 및 문헌[참조: Harding, et al., (1995) Ann. NY Acad. Sci. 764:536-546]에서 제공된다. 항체 1H3, 15H12 및 19D12를 면역화 항원에 대해 역가가 25,600인 항원 특이적인 혈청 IgG의 존재를 기초로 융합을 위해 선택한 HuMab 마우스(본원에서 #23716으로 언급)로부터 분리하였다. 1H3, 15H12 및 19D12 항체는 IGFR1에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
2.0 물질 및 방법 및 결과
2.1 항원
2.1.1. 마우스를 2개 형태의 항원인 (1) 간 세포(IGFR1으로 형질감염된 HEK293 세포) 및 (2) 정제된 단백질(sIGFR1; IGFR1의 α-소단위 및 β-소단위의 세포외 도메인을 포함하는 NSO-발현된 재조합 단백질)로 면역화시켰다. 당해 단백질의 생물학적으로 활성인 형은 글리코실화된 형이다.
2.1.2. 가용성 IGFR1 항원을 사용한 3개의 면역화 및 최종 꼬리 정맥 부스트를 2.67mg/ml의 농도에서 정제된 IGFR1 제제를 사용하여 수행하였다. 가용성 IGFR1을 완전한 또는 불완전한 프루언트 보조제(CFA 및 IFA)와 합하고 마우스에게 제조한 항원 0.2cc(입방 센티미터)를 복강내로 주사하였다. 최종의 꼬리 정맥 면역화를 멸균된 PBS(포스페이트 완충제 염수)중 가용성 IGFR1을 사용하여 수행하였다.
2.1.3. 면역화를 또한 IGFR1 DNA로 형질감염시킨 HEK293 세포를 사용하여 수행하였다. 특이하게는, 각각의 마우스를 IGFR1를 발현하는 1.0 내지 2.0 x 107의 HEK293 세포를 함유하는 0.2 cc의 멸균 염수를 사용하여 복강내 주사로 면역화시켰다.
2.2 형질전환 마우스
2.2.1. 마우스를 여과기 케이지에 가두고 면역화 시기, 출혈시기 및 융합물이 생산되는 날에 우수한 물리학적 상태로 있는지를 평가하였다.
2.2.2. 선택한 하이브리도마를 생산한 마우스는 (CMD)++; (Hco7)11952+; (JKD)++; (KCo5)9272+ 유전형의 수컷(마우스 확인번호 #23716)이였다. 개개의 전이유전자 명칭을 괄호안에 나타낸 후, 무작위적으로 통합시킨 전이 유전자에 대해서는 선 수(line number)로 나타내었다. 부호 ++ 및 +는 동종접합체 또는 반접합체를 나타내나; 이는 마우스를 무작위적으로 통합된 사람 Ig 전이유전자에 대해 이종접합성 및 동종접합성사이에 구별이 되지 않는 PCR계 검정을 사용하여 통상적으로 스크리닝하기 때문이다. + 지정은 이들 성분들에 대해 실제로 동종접합성인 마우스에 대해 제공될 수 있다.
2.3. 면역화 공정 및 스케쥴
2.3.1. 면역화 스케쥴은 하기 표 2에 나타낸다.
마우스 면역화 스케쥴
경과일 면역화: 보조제, 항원 출혈 및 역가1
1일째 염수중 1.0 X 107 생 IGFR1으로 형질감염된 HEK293 세포
15일째 CFA 보조제, sIGFR1 (20㎍)
29일째 염수중 1.0 X 107 생 IGFR1으로 형질감염된 HEK293 세포
37일째 측정된 항체 역가
43일째 IFA 보조제, sIGFR1 (약 40㎍)
54일째 측정된 항체 역가
57일째 염수중 1.0 X 107 생 IGFR1으로 형질감염된 HEK293 세포
96일째 염수중 1.0 X 107 생 IGFR1으로 형질감염된 HEK293 세포
103일째 측정된 항체 역가
112일째 CFA 보조제, sIGFR1(25㎍)
126일째 측정된 항체 역가
128일 및 129일째 최종으로 꼬리 정맥을 sIGFR12으로 정맥내 부스트함
1역가 정보는 하기에 나타낸다.
2융합은 131일째에 수행하였다.

표 2(상기 참조)에서 기술한 마우스 23716의 면역화 기간동안 IGFR1 특이적인 항체의 역가
경과일 역가
37 100
54 800
103 6400
126 25600

2.4. 하이브리도마 제조 및 시험
2.4.1. SP2/0-AG14 흑색종 세포주(ATCC CRL 1581)를 융합에 사용하였다. 원래의 ATCC 바이알을 해동시키고 배양시 증식시켰다. 동결시킨 바이알의 종균 스톡을 당해 증식으로부터 제조하였다. 세포를 배양물속에 6 내지 8주동안 유지시키고 1주동안 2회 계대배양하였다.
2.4.2. 10% FBS, 항생제-항곰팡이제(100X) 및 0.1% L-글루타민을 함유하는 고 글루코즈 DMEM을 사용하여 흑색종 세포를 배양하였다. 추가의 배지 보충물을 5% 오리젠-하이브리도마 클로닝 인자(Origen-Hybridoma Cloning Factor)(조지아주 스와니 소재의 Fischer Scientific 제조원), 4.5 x 10-4 M 나트륨 피루베이트, HAT 1.0 X 10-4 M 하이포크산틴, 4.0 x 10-7 M 아미노프테린, 1.6 x 10-5 M 티미딘, 또는 HT 1.0 X 10-4M 하이포크산틴, 1.6 X 10-5M 티미딘; 및 특성화된 태아 소 혈청을 포함하는 하이브리도마 성장 배지에 가하였다.
2.4.3. 마우스 번호 제#23716호로부터의 비장은 크기가 정상이고 5.73 x 108 개의 생존 세포로 수득되었다.
2.4.4. 당해 비장을 하기 공정에 따라 융합시켰다:
1. 50mL의 튜브에 약 10ml의 DMEM + 10% FBS를 둔다.
2. 정맥내로 부스트시킨 마우스를 참수시킨다.
3. 마우스를 후드내 종이 타월위로 이전시킨다.
4. 마우스를 알코올에 침지시키고 이의 우측-좌측이 올라오도록 둔다.
5. 비장 영역위 피부를 작게 절개한다.
6. 양손으로 마우스로부터 피부를 벗긴다.
7. 알콜로 다시 침지시킨다.
8. 멸균 장비를 사용하여 복막을 개방시킨다.
9. 비장아래 지점에 가위를 삽입하고 가위를 벌려서 겸자로 비장이 파악되도록 내부를 벌린다.
10. 비장을 제거하고 DMEM + 10% FBS를 함유하는 튜브내로 둔다. 멸균 조직 배양실로 이전시킨다.
11. 멸균 후드 내부에, 혈청이 없는 약 7ml의 DMEM을 2개의 멸균된 60mm들이 배양 디쉬 각각에 가한다.
12. 비장을 첫번째 디쉬에 이전시킨다.
13. 멸균 장비를 사용하여 비장으로부터 어떠한 부착물도 제거한다.
14. 멸균 균질화기 기재를 시험 튜브 랙(지지를 위해)내로 둔다.
15. 세정한 비장을 균질화기에 가한다.
16. 약 5mL의 DMEM을 가하고 4회 균질화시킨다. 멸균된 50mL들이 원심분리 튜브에 붓는다.
17. 다른 5 내지 6mL의 DMEM을 균질화기에 가하고 다시 3 내지 4회 추가로 균질화시킨다.
18. 이를 위에서 기술한 것과 동일한 튜브에 붓는다.
19. 세포를 원심분리기내에서 1000rpm으로 10분 동안 회전시킨다.
20. 상층액을 제거한다. DMEM속에 펠렛을 붓고 재현탁시킨다.
21. 당해 비장 세포를 계수한다.
22. 적절한 용적의 SP2/0 세포(SP2/0의 1개 세포당 6개 비장 세포)를 50mL들이의 원심분리 튜브에 이전시킨다. 용적을 기록한다.
23. DMEM을 가진 비장 세포의 용적을 원심분리를 위한 더욱 편리한 균형을 맞추기 위해 조절한다.
24. 원심분리기내에서 1000rpm으로 10분 동안 비장 세포를 회전시킨다.
25. 상층액을 제거하고 30 내지 40mL의 DMEM 세척 매질(혈청 없음)내에 붓고 펠렛을 재현탁시킨다. 하나의 튜브속에 모든 세포를 합한다.
26. 위에서 기술한 바와 같이 다시 회전시킨다.
27. 상층액을 붓고 펠렛을 재현탁시킨다.
28. 37℃의 물을 함유하는 비이커내에서 튜브를 온화하게 와동시키면서 약 1분 째에 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 약 1.2mL를 가한다.
29. 튜브를 90초 동안 둔 후, 15mL의 DMEM 세척 매질을 3분째에 가한다.
30. 위에서 기술한 바와 같이 튜브를 회전시킨다.
31. 상층액을 제거하고 펠렛을 온화하게 재현탁시킨다.
32. 약 10mL의 Hat 배지를 튜브에 가한다.
33. 세포를 총 용적의 HAT 배지내로 피펫팅한다. 세포를 플레이팅하기 전에 항온기내에서 30 내지 60분 동안 둔다.
34. 세포를 96 웰 배양 플레이트, 200μL/웰(96웰 플레이트당 약 1 x 107 세포)에 플레이팅한다.
35. 세포를 7일째에 HT 배지, 250㎕/웰(HT 배지, HAT 배지와 동일, 아미노프테린은 제거됨)에 공급한다
2.4.5. 사람 IgGκ 항체에 대한 초기 ELISA 스크린을 하기 공정에 따라 융합후 7 내지 10일째에 수행하였다:
1. 플레이트를 항-hu-κ 1㎍/mL 또는 항-hu-γ, 1X PBS중 1㎍/mL, 50μL/웰로 밤새 피복시킨다. 냉장실에 저장한다.
2. 플레이트를 비우고 실온에서 1시간 동안 1X PBST(트윈을 함유한 PBS) + 5% 닭 혈청으로 차단시킨다(100μL/웰)
3. 플레이트를 비우고 세척 병(3X) 또는 플레이트 세척기(3X)로 1X PBST를 사용하여 손으로 세척한다. 세척 병을 사용하는 경우, 플레이트를 종이 타월로 배수시킨다.
4. 표준물을 클론의 생산 수준을 시험하기 위해 사용한다. 미지물(첫번째 웰중 1:10 및 플레이트를 따라 2배 희석)로 희석시킨다. Hu-IgG 표준물을 1000ng/mL에서 출발하여 플레이트를 따라 2배 희석시킨다. 소수의 웰을 블랭크를 위해 남긴다: 희석용으로 사용된 1X PBST + 5% 닭 혈청, 100μL/웰. 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 융합 스크린과 아클론을 차단 완충액속에서 1:2 희석에 대 해 일반적으로 시험한다. 융합물 및 아클론을 스크리닝하는 경우 양성 대조군을 또한 사용할 수 있다.
5. 세척 단계 #3을 반복한다.
6. 제2 항체 HRP(서양 고추냉이 퍼옥시다제)-항-hu IgG-Fc 시약 1:5000 또는 1XPBST중 HRP-항-hu-κ+5% 닭 혈청을 희석시키고 100μL/웰로 가한다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.
7. 세척 단계 #3을 반복한다.(2X)
8. 플레이트를 10ml의 시트레이트 포스페이트 완충액, pH 4.0, 80μL ABTS, 8μL H2O2/플레이트를 사용하여 플레이트를 전개시킨다.
9. 실온에서 30분 내지 1시간동안 항온처리한다. 플레이트를 OD415nm-490nm에서 판독한다.
용액:
1X PBST = 1xPBS + 0.05% 트윈-20
시트레이트 포스페이트 완충액 = 21gm/L 시트르산, 14.2gm/L 인산이수소나트륨(무수); pH4.0
ABTS = 시트레이트 완충액중 27.8mg/mL의 2,2'-아지도-비스(3-에틸벤즈-티아졸린-6-설폰산)디암모늄 염, 1mL 분취량을 동결시킴.
플레이트 = 96 웰 검정 플레이트
양성 ELISA 시그날이 하이브리도마 1H3, 15H12 및 19D12에 상응하는 웰에서 검출되었으며, 이는, 이들 하이브리도마가 사람 IgG 항체를 생산함을 입증한다.
2.4.6. 사람 IgGκ 양성 웰에 상응하는 하이브리도마 상층액을 하기 공정에 따라 가용성 IGFR1으로 피복된 ELISA 플레이트상에서 스크리닝하였다:
1. 플레이트를 밤새 1X PBS중 IGFR1(1.0㎍/mL), 50μL/웰로 피복시킨다. 냉장실에서 저장한다. 플레이트를 피복하는데 5밀리리터가 요구되었다.
2. 플레이트를 비우고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 1X PBST + 5% 닭 혈청속에서 차단시킨다(100μL/웰).
3. 플레이트를 비우고 세척 병(3X) 또는 플레이트 세척기(3X)로 1X PBST를 사용하여 손으로 세척한다. 세척 병을 사용하는 경우, 플레이트를 종이 타월로 배수시킨다.
4. 희석제로서 차단 완충액을 사용한다. 플레이트의 상부열에서 1:50의 희석으로 시작하여 혈청을 시험하고 플레이트 하단열당 2배 희석시킨다(7X). 실온에서 1시간 동안 항온처리한다. 아클론을 스크리닝하기 위해, 차단 완충액중 배양 상층액의 1:1 희석물을 출발 물질로서 사용한다.
5. 세척 단계 #3을 반복한다.
6. 제2 HRP-항-hu IgG-Fc 특이적이고/이거나 HRP-항-hu-κ 시약을 1X PBST + 5% 닭 혈청속에서 1:2500 내지 5000으로 희석시키고 100μL/웰에 가한다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.
7. 세척 단계 #3을 반복한다. (2X)
8. 10mL 시트레이트-인산염 완충액 pH 4.0, 80μL ABTS, 8μL H2O2/플레이트를 사용하여 플레이트를 전개한다.
9. 실온에서 30분 내지 1시간 동안 항온처리한다. 플레이트를 OD415nm-490nm에서 판독한다. 배경 역가 한계치 이상을 2회 고려한다.
당해 검정에서, 하이브리도마 15H12 및 19D12는 양성 ELISA 시그날을 생산하였다. 당해 데이타는, 당해 하이브리도마가 가용성 IGFR1에 결합할 수 있는 항체를 생산하였음을 입증한다.
이후에 항원 양성 하이브리도마를 24웰 플레이트에 이전시키고 궁극적으로 조직 배양 플라스크에 이전시켰다. 희석물을 제한함으로써 IGFR1 특이적인 하이브리도마를 아클로닝하여 단클론성(monoclonality)을 평가하였다. 항원 양성 하이브리도마는 오리겐 DMSO 동결 배지(조지아주 스와니 소재의 Fischer Scientific 제조원)속에 세포를 냉동시킴으로써 전개 방법의 각 단계에서 보관하였다.
2.4.7. 항원 동위형을 하기 공정에 따라 측정하였다:
1. 플레이트를 1X PBS, 50μL/웰속에서 1㎍/ml 가용성 IGFR1으로 냉장실에서 밤새 피복시킨다. 플레이트를 비운다.
2. 1X PBST + 5% 닭 혈청을 실온에서 1시간 동안 가한다(100μL/웰). 플레이트를 비운다.
3. 차단 완충액을 희석제로서 사용하고, 상층액을 가하거나 시험할 50μL/웰의 제2 항체당 1웰 중 시험할 상층액 또는 정제한 물질을 가한다. 실온에서 90분 동안 항온처리한다. 플레이트를 비운다.
4. 플레이트를 비우고 세척 병(3X) 또는 플레이트 세척기(3X)로 1X PBST를 사용하여 손으로 세척한다. 세척 병을 사용할 경우, 플레이트를 종이 타월로 배수시킨다.
5. 희석제로서 차단 완충액을 사용하여, 제2 항체를 가한다:
HRP-항-hu-감마;
HRP-항-hu-카파;
HRP-항-사람 IgG1; 또는
HRP-항-사람 IgG3.
1:1000으로 희석시킨다. 실온에서 45분동안 항온처리한다. 플레이트를 비운다.
6. 세척 단계 #4를 반복한다(3X).
7. 10ml의 시트레이트-인산염 완충액 pH 4.0, 80μL ABTS, 8μL H2O2/플레이트를 사용하여 플레이트를 전개한다.
8. 실온에서 30분 내지 1시간 동안 항온처리한다. 플레이트를 OD415nm-490nm에서 판독한다.
이들 검정으로부터의 데이타를 하기 표 4에 나타낸다.
동위형 ELISA 결과*
γ κ γ1 γ3
1 2 3 4 5 6 7
클론 1.903 1.003 0.064 0.813
15H12
*각각의 수는 각각의 제2 항체에 대해 측정한 ELISA 시그날의 크기를 나타낸다.
이들 데이타는 항체 15H12가 IgG3κ 항체임을 입증한다.
2.4.8. 하이브리도마 상층액(1H3, 15H12 및 19D12) 및 MAB391를 고정된 세포 ELISA 검정에서 IGFR1을 발현하는 세포를 직접 결합시키는 능력에 대해 시험하였다. 당해 검정에서, IGFR1 DNA로 형질감염시킨 MCF-7 세포 또는 HEK293 세포를 사용하였다. 당해 검정은 하기와 같이 수행하였다:
1. 96웰 플레이트의 각각의 웰에 1X PBS중 폴리-L-라이신의 20㎍/mL 용액중 50㎍/웰을 가하고 실온에서 30분 동안 또는 4℃에서 밤새 항온처리한다. 플레이트를 비워 폴리-L-라이신을 웰로부터 제거하고 사용시까지 실온에서 건조되도록 한다.
2. 생 세포를 1X PBS를 사용하여 원심분리(1000 RPM/5분)하여 세척한다. 최종 세포 농도를 1X PBS중 웰당 2X106 세포로 조절한다. 웰당 당해 세포 현탁액 50μL를 가한다.
3. 세포를 2000 RPM에서 5분 동안 회전시킨다. 완충액을 비운다.
4. 1X PBS중 0.5% 빙 냉 글루타르알데하이드의 50μL/웰을 가한다. 실온에서 15분 동안 정치시킨다. 플레이트를 비운다.
5. 1X PBST + 5% 닭 혈청을 가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리한다(100μ L/웰). 플레이트를 비운다.
6. 플레이트를 1X PBST를 사용하여 온화하게 세척한다(2X). 세포 손실을 피하기 위하여, 당해 단계는 특정의 플레이트 세척기를 배제한 용기내에서 손으로 수행하여야 한다.
7. 차단 완충액을 희석제로서 사용하여, 100㎍의 1:1 희석물을 가함으로써 배양 상층액을 시험한다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.
8. 단계 6을 반복한다(3X).
9. 제2 HRP 항-hu IgG-Fc 특이적이고/특이적이거나 HRP 항-hu-κ, 1X PBST + 5% 닭 혈청중 시약 1:2500 내지 5000으로 희석시키고 100μL/웰을 가한다. 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.
10. 단계 6을 반복한다(3X).
11. 플레이트를 10ml의 시트레이트-인산염 완충액 pH 4.0, 80μL, ABTS, 8μL H2O2/플레이트를 사용하여 전개시킨다.
12. 실온에서 15 내지 20분 동안 항온처리한다. OD415nm-490nm에서 플레이트를 판독한다.
이들 검정으로부터의 결과는, 하이브리도마 1H3, 15H12 및 19D12가 IGFR1을 발현하는 HEK293 세포에 결합하는 면역글로불린을 생산했으며 하이브리도마 1H3, 15H12 및 19D12가 내인성 IGFR1을 발현하는 MCF-7 세포에 결합하는 면역글로불린을 생산하였음을 입증하였다. 추가로, 당해 결과는, MAB391이 IGFR1을 발현하는 HEK293 세포 및 MCF-7 세포에 결합하였음을 입증하였다.
2.4.9. IGFR1에 대한 IGF1의 결합을 차단하는 하이브리도마 상층액(1H3, 15H12 및 19D12)의 능력을 1) IGFR1을 발현하는 HEK293 세포 및 MCF7 세포상에서 상층액의 염색 강도 및 2) IGFR1 발현 세포에 대한 IGF1-바이오틴의 결합을 차단하는 상층액의 능력을 측정함으로써 평가하였다. 초기에, 바이오티닐화된 IGF1을, IGFR1을 발현하는 HEK293 세포상에서 적정하여 본 발명의 항체에 의해 이의 수용체에 대한 IGF1 결합의 차단을 평가하기 위한 적절한 농도를 확립하였다. 이는 다음 공정으로 수행하였다:
1. IGFR1을 발현하는 HEK203 세포는, 원추형 튜브내로 피펫팅한 세포를 흩트리기위해 플라스크를 세게 놓아 당해 플라스크로부터 수거한다. 이후에 당해 세포를 300Xg에서 5분동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 이후에 배지를 흡입제거한다.
2. 세포를 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 10 내지 20mL의 PBS속에서 세척하고 동일한 완충액속에 약 2.5X106 세포/mL(±106 세포)로 재현탁시킨다. 당해 세포를 동일한 완충액중 96웰 미세역가 플레이트에 4℃에서 200μL/웰로 분취한다. 당해 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡입제거한다.
3. 동일한 완충액중 1:5 희석에서 출발하여 4배 일련 희석시킨 50μL/웰의 일련 희석된 IGRF1-바이오틴을 가함으로써 세포를 염색한다. 당해 플레이트를 두드리거나 온화하게 와동시켜 세포의 균일한 현탁액이 현탁되도록 한다. 이후에 세 포를 4℃에서 30분 동안 항온처리한다.
4. 세포를, 제1 세척을 위해 150μL 완충액을 가함으로써 3X 세척한 후 펠렛화한다. 상층액을 흡입제거하고 200μL의 완충액을 가한다. 다시, 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡입제거하며, 이 세척 단계를 1회 이상 반복한다. 스트렙트아비딘-PE(스트렙트아비딘-R-피코에리트린)을 가하고 당해 세포를 4℃에서 30분 동안 항온처리한다.
5. 세포를 2% FBS 및 0.02% 아지드를 함유하는 PBS속에서 1회 세척하고 50㎍/mL의 프로피디움 요오다이드를 또한 함유하는 것을 제외하고는 동일한 완충액속에서 재현탁시켜 사멸한 세포를 배제시킨다.
6. 세포를 FACS로 분석한다. 차단 검정을 다음과 같이 수행한다:
1. MCF7 세포 또는 HEK293/IGFR1 세포를 조직 배양 플라스크로부터 당해 플라스크 측면을 세게 놓아 세포를 흩뜨림으로써 수거한다. 세포를 원추형 튜브내로 피펫팅한다. 튜브를 5분 동안 300Xg에서 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 배지를 흡입제거한다.
2. 세포를 2% FBS 및 0.02% 나트륨 아지드(PFA)를 함유하는 10 내지 20mL의 PBS로 세척하고 동일한 완충액속에서 약 2.5 X 106 (±1X106)로 재현탁시킨다. 200μL/웰을 동일한 완충액중 96웰 미세역가 플레이트내로 4℃에서 분취한다. 세포를 펠렛화하고 완충액을 흡입제거한다.
3. 배지(음성) 대조군, 및 양성 대조군으로서 MAB391을 포함하는 100μL/웰 을 가함으로써 세포를 각각의 IGFR1 하이브리도마 상층액으로 염색한다. 플레이트를 두드려 세포의 균일한 현탁액이 되도록 한다. 4℃에서 30 내지 60분 동안 항온처리한다.
4. 세포를, 제1 세척액에 대해 100μL 완충액을 가함으로써 PFA속에서 3회 세척하고, 펠렛화하고, 흡입제거하고, 200μL 완충액속에 재현탁시키고, 펠렛화하고, 흡입제거하고, 200μL 완충액속에서 다시 재현탁시키고, 각각의 샘플을 2개의 웰로 분리하고 펠렛화한다.
5. 웰의 한 셋트에, 상층액 염색된 샘플 및 배지 대조군에 대해 PFA(파라-포름알데하이드) 중에서 1:100으로 희석시킨 항-사람 IgG-FITC와 MAB391 염색된 샘플에 대해 1:200에서의 항-마우스 IgG-FITC를 가하고, 세포의 균일한 분산(염색 검정)이 다시 이루어지도록 한다. 4℃에서 30분 동안 항온처리한다.
6. 웰의 제2 셋트에, 0.02% 아지드(FBS 없음)를 함유하는 PBS속에 1:500으로 희석된 IGF1-바이오틴을 가하고 4℃에서 30분동안 항온처리한다. 세포를 단계 4에서 기술한 바와 같이(그러나, 샘플을 분리함이 없이) 3회 세척한다. PFA중 스트렙트아비딘-PE(스트렙트아비딘-R-피코에리트린)을 가함으로써 이들 세포를 염색한다(염색 검정). 4℃에서 30분 동안 항온처리한다.
7. PFA속에서 모든 샘플을 1회 세척하고 50㎍/mL 프로피디움 요오다이드를 함유하는 것을 제외하고는 동일한 완충액속에 재현탁시켜 사멸한 세포를 배제시킨다.
8. FACS 분석으로 분석한다.
이들 차단 검정으로부터의 결과는, 하이브리도마 1H3, 15H12 및 19D12로부터의 상층액이 IGFR1에 대한 바이오티닐화된 IGF1의 결합을 차단하고 내인성 IGFR1을 발현하는 MCF7 세포를 염색하며 IGFR1을 발현하는 HEK203 세포를 염색함을 입증하였다.
2.4.10. ELISA 검정에서 IGFR1에 대한 바이오티닐화된 IGF1의 결합을 차단하는 정제된 항체 1H3 및 15H12, 및 ELISA 검정에서 IGFR1에 대한 바이오티닐화된 MAB391에 대한 결합을 차단하는 항체 1H3, 15H12 및 19D12의 능력을 또한 하기 공정에 따라서 평가하였다:
1. 플레이트를 냉장실에서 1X PBS-50μL/웰중 1㎍/mL 가용성 IGFR1으로 밤새 피복시킨다.
2. 실온에서 1시간 동안 1X PBST + 5% 닭 혈청, 100μL/웰로 가한다. 플레이트를 비운다.
3. 플레이트를 세척 완충액(1X PBS + 0.05% 트윈 20)으로 3회 세척한다. 플레이트를 세게 놓아 건조시킨다.
4. 2㎍/mL의 1H3, 15H12 또는 19D12, 또는 양성 또는 음성 대조군 항체를 플레이트를 따라 차단 완충액속에서 희석시킨다. 당해 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리한다.
5. 플레이트를 세척 완충액속에서 3회 세척한다.
6. 바이오틴-IGF1 또는 바이오틴-MAB391을 50μL/웰에 가하고 실온에서 30분 동안 항온처리한다.
7. 플레이트를 3회 세척한다.
8. 알칼린 포스파타제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제로 표지시킨 스트렙트아비딘 100μL/웰을 가하고 실온에서 30분 동안 항온처리한다.
9. 플레이트를 3회 세척한다. 사용된 표지에 따라 적절한 시약으로 전개시킨다.
10. 10 내지 15분 후 판독한다.
MAB391을 하기 공정에 따라 바이오티닐화하였다:
1. PBS 완충액중 MAB391을 제조한다(투석시키거나 탈염 컬럼을 사용하여 트리스 또는 글리신과 같은 원치않는 완충액을 제거한다).
2. 사용직전에 설포-NHS-LC-바이오틴 용액의 신선한 스톡 용액을 제조한다. 2.0mg의 설포-NHS-LC-바이오틴을 200mL의 희석된 물에 가한다. MAB391의 10mg/mL 용액으로 작업하는 경우 당해 시약을 MAB391에 대해 12배 몰 과량으로, 또는 MAB391의 희석 제제(2mg/mL)를 사용하여 작업하는 경우 20배 몰 과량으로 가한다.
3. 계산: 밀리몰 MAB391 = mg 단백질/150,000 밀리몰 X 12 또는 20 = X556을 가하기 위한 바이오틴 밀리몰을 가하기 위한 바이오틴 시약 밀리몰 = 가하기 위한 바이오틴 시약 mg
1mg/mL의 경우:
1/150000 = 6.6 X 10-6
20 X 6.6 X 10-6 밀리몰 = 1/32 X 10-4 NHS-LC-바이오틴
1.32 X 10-4 X 556 = 0.073mg 설포 NHS-LC-바이오틴
스톡 NHS-LC-바이오틴 용액으로부터, 1 또는 2mg에 대해 IgG mg당 용액 10μL(100㎍)을 사용한다.
4. 빙상에서 2시간 동안 또는 실온에서 30분 동안 항온처리한다. PBS에 대해 투석하거나 탈염 컬럼을 사용하여 반응하지 않은 바이오틴 시약을 제거한다. PBS 0.1% 나트륨 아지드속에서 4℃로 저장한다. 일반적으로, 3-5 바이오틴을 각각의 표지된 IgG 분자에 가할 수 있다.
이들 차단 검정으로부터의 결과는, 항체 1H3 및 15H12가 sIGFR1에 대한 바이오티닐화된 IGF1의 결합을 차단하고 항체 1H3, 15H12 및 19D12가 sIGFR1에 결합하는 바이오티닐화된 MAB391을 차단함을 입증하였다.
2.4.11. IGFR1, 및 1H3, 15H12 및 19D12 항체간의 결합을 하기 공정에 따라 BIAcore/표면 플라스몬 공명속에서 평가하였다:
1. IGFR1을 아민 커플링에 의해 CM-5상에서 유동 세포상에서 350.4 반응 수준에 대해 고정시킨다. 면역화를 위해 사용된 IGFR1의 농도는 시트르산나트륨 완충액중 2.5㎍/mL이며 단백질을 pH 3.5에서 고정화시킨다.
2. 항체 1H3, 15H12 및 19D12을 단백질-A 또는 단백질-G 컬럼위에서 하이브리도마 상층액으로부터 정제하고 SDS-PAGE 분석(4% 내지 12% 트리스-글리신)에 의해 순도를 시험한다.
3. 항체를 제조하여 위에서 제조한 IGFR1 표면위에 유동시킨다.
4. 사용된 항체의 농도 범위는 4, 2, 1, 0.5 및 0.25㎍/mL이다. 블랭크를 또한 배경 치환에 대해 사용한다. 샘플을 HBS 완충액속에서 제조한다.
5. 주입 시간(연합 상)은 20μL/분의 유속에서 10분이며, 해리 시간(해리 상)은 동일한 유속에서 1시간이다.
6. 검정은 25℃ 및 37℃에서 욕에서 수행한다. 모든 시험은 2회 반복한다.
7. 데이타 분석을 비아-평가 소프트웨어(Bia-Evaluation software) v.3.0.2(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 Biocore, Inc. 제조원)를 사용하여 수행한다.
8. 모든 시험은 Biacore 3000 표면 플라스몬 공명 장치(뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 Biacore, Inc. 제조원)를 사용하여 수행한다.
이들 검정에 대한 결과는, 항체 1H3, 15H12 및 19D12가 25℃ 및 37℃에서 IGFR1과 연합하며 항체 1H3이 25℃에서 IGFR1과 연합함을 입증하였다. 이들 실험으로부터의 데이타를 또한 사용하여 IGFR1에 결합하는 1H3, 15H12 및 19D12의 친화도 및 속도 상수를 계산하였다(참조: 하기 표 5).
항체 1H3, 15H12 및 19D12과 IGFR1의 친화도 및 속도 상수
온도 항체 샘플 크기 연합 시간
(분)		 해리 시간
(분)		 KON(1/M·s) Koff(1/s) KD(M) 반감기(분)
25℃ 15H12 2 10 60 5.0X105 2.24X10-5 4.48X10-11 515.73
25℃ 19D12 2 10 60 4.0X105 2.65X10-5 5.92X10-11 435.94
25℃ 1H3 2 10 60 0.7X105 6.50 X 10-5 86X10-11 177.73
37℃ 15H12 2 10 60 7.2X105 4.01X10-5 5.57X10-11 288.09
37℃ 19D12 2 10 60 6.8X105 4.93X10-5 7.22X10-11 234.33
#반감기로 계산됨 = In(2/KOff)

실시예 2: 세포계 수용체 결합 검정
세포계 수용체 결합 검정을 사용하여 항체 1H3, 15H12 및 19D12가 IGFR1에 대한 결합에 있어 IGF1과 경쟁하는지를 측정하였다.
당해 검정에서, 96웰 여과 플레이트(1.2μm 공극)을 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)/PBS로 4℃에서 2시간 동안 예비-습윤시켰다. 이후에 완충액을 진공 다기관(vacuum manifold)으로 제거하였다. 각종 농도의 6X 대조군 또는 시험 항체(1H3, 15H12 또는 19D12)을 웰(25μL)에 가하였다. 다음 [125I]-IGF-1 리간드를 BSA/PBS중 0.375nM의 최종 농도로 웰에 가하였다. 세포를 세포 해리 용액으로 수거하고, 트립판 블루로 계수하고 0.5% BSA/PBS속에 세포수가 1 내지 3 X 105/ml가 되도록 재현탁시켰다. 100㎕의 세포(10,000 내지 30,000)를 각각의 웰에 가하였다. 당해 플레이트를 4℃에서 1시간동안 진탕시켰다. 이후에 당해 플레이트를 흡입제거하고 진공 다기관을 사용하여 빙냉 PBS로 3회 세척하였다. 여과기를 구멍을 내어 감마 계수기로 계수하였다. 데이타를 경쟁적 결합에 대해 분석하였다.
이들 실험의 결과는, 1H3, 15H12 및 19D12가 IGFR1에 대한 결합에 있어 IGF-I과 경쟁할 수 있음을 나타내었다.
실시예 3: IGFR1 자가인산화 검정
IGFR1 자가인산화를 억제하는 1H3, 15H12 및 19D12의 능력을 또한 측정하였 다.
항체(1H3, 15H12 및 19D12)을 다양한 길이의 시간동안 IGFR1을 지닌 세포에 가하였다. 이후에 세포를 37℃에서 10ng/ml IGF-I으로 자극시켰다. 세포를 0.1mM 나트륨 바나데이트를 함유하는 냉 PBS로 2회 세척하고 용해 완충액(50mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100, 1.5mM MgCl2, 프로테아제 억제제 및 2mM 나트륨 바나데이트)속에 용해시켰다. 용해물을 빙상에서 30분 동안 항온처리한 후 4℃에서 10분 동안 13,000 RPM으로 원심분리하였다. 용해물의 단백질 농도를 꼬마지에 비색 검정으로 측정하고 면역침전 및 웨스턴 블롯 검정에 적용시켰다.
이들 검정의 결과는, 항체 1H3, 15H12 및 19D12가 0.10nM의 IC50으로 IGFR1 자가인산화를 억제하였음을 나타내었다.
실시예 4: 비부착 증식(연질 아가) 검정
사람 유방암 세포주 MCF7, 사람 직장결장 암 세포 HT29 및 사람 전립선 암 세포주 DU145를 포함하는, 각종 세포의 비부착 증식을 억제하는 항-IGFR1 항체 1H3, 15H12 및 19D12의 능력을 평가하였다.
이들 실험에서, 완전한 MEM 배지내 0.6% 아가로즈 3ml를 6웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 가하고 고화되도록 하였다(바닥 층). 각종 농도의 항체 1H3, 15H12, 19D12 또는 MAB391(위에서 논의함) 100㎕를 배양 튜브에 가하였다. 세포를 수거하였다. 세포 분취량(15,000 세포)을 항체를 함유하는 배양 튜브에 가하고 실온에서 10 내지 15분 동안 항온처리하였다. 3ml의 0.35% 아가로즈/완전 최소 필수 배지(MEM) 층(상부 층)을 항체/세포 혼합물에 가한 후 고화된 바닥 층상에 플레이팅하였다. 상부 층이 고화되도록 하였다. 이후에 당해 플레이트를 3주동안 항온처리하였다. MTT(3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드)를 웰에 가하고 1 내지 2시간 동안 항온처리하였다. 당해 플레이트를 스캐닝하고 콜로니를 계수하고 통상의 콜로니 계수기 적용 프로그램을 사용하여 분석하였다.
당해 실험의 결과는, 항-IGFR1 항체가 시험한 모든 3개의 악성종양 세포주의 비부착 증식을 억제할 수 있음을 입증하였다.
실시예 5: 하이브리도마로부터의 항체의 가변 영역의 클로닝
1H3, 15H12 및 19D12 가변 영역을 암호화하는 핵산을 하기 공정에 따라 하이브리도마로부터 입수하였다.
2x106 하이브리도마 세포로부터의 전령 RNA(mRNA)를 마이크로-패스트 트랙 키트(Micro-Fast Track kit: 캘리포니아주 칼스바드 소재의 Invitrogen 제조원)를 사용하여 제조하였다. 가변 영역을 암호화하는 세포 DNA(cDNA)를 "cDNA 사이클" 키트(캘리포니아주 칼스바드 소재의 Invitrogen 제조원)에 기술된 공정에 따라 제조하였다.
항체 가변 영역을 5'RACE(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clotech 제조원) 기술을 사용하여 주형으로서 cDNA를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 하기 3'프라이머 서열을 사용하여 중쇄: 5'-TGCCAGGGGGAAGACCGATGG-3'(서열 22)를 증폭시키고 다음 3'프라이머 서열을 사용하여 경쇄: 5'-CGGGAAGATGAAGACAGATG-3'(서열 23)를 증폭시켰다. 추가로, 5'-RACE PCR 프라이머(캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clotech 제조원)를 각각의 증폭에 사용하였다.
PCR 반응 혼합물을 적절한 완충액(캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagene 제조원), 각각의 dNTP 0.2mM, 각각의 5' 및 3' 프라이머 750nM 및 cDNA 주형중 2.5 단위의 Pfu I 폴리머라제에 포함시켰다. 총 반응 용적은 50㎕였다. 하기 PCR 주기 프로그램을 열순환기(thermocycler)를 사용하여 수행하였다:
1X 94℃, 2분
10X 94℃, 45초
65℃, 45초, 주기당 -1℃
72℃, 1분
25X 94℃, 45초
55℃, 45초
72℃, 1분
1X 72℃, 15분
수득되는 PCR 증폭 생성물을 제로 블런트 토포 PCR 클로닝 벡터(Zero Blunt TOPO PCR cloning vector: 캘리포니아 칼스바드 소재의 Invitrogen 제조원)내로 삽 입시켰다. 삽입물의 확인은 제한 효소 분석으로 확인한 후 삽입물의 뉴클레오타이드 서열을 서열분석에 의해 수득하였다.
실시예 6: 항체 쇄의 재조합 발현
당해 실시예에서, 본 발명의 각종 항-IGFR1 항체 쇄를 암호화하는 핵산을 사용하여 당해 쇄를 발현한 dhfr- 포유동물 세포주(CHO-DXB11)를 형질감염시켰다. 일시적인 형질감염을 하기 나열한 플라스미드 1 내지 11로부터 선택된 하나의 중(γ1 또는 γ4) 쇄 및 하나의 경(κ) 쇄 플라스미드의 다양한 조합으로 세포주를 동시형질감염시킴으로써 수행하였다. 안정한 세포주의 작제는 다음과 같이, 하기 나열한 12 또는 13의 단일 플라스미드로 형질감염시킴으로써 수행하였다: 핵산을 하나의 플라스미드내에 위치시키고 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 작동적으로 연결시켰다. 당해 플라스미드는 플라스미드 증폭에 사용된 마우스 유방 종양 바이러스 장 말단 반복부(MMTV-LTR)에 작동적으로 연결된 DHFR cDNA를 함유하였다. 당해 플라스미드는 포유동물 세포내에서 선택하기 위한 TK 프로모터에 작동적으로 연결된 하이그로마이신 B 유전자를 또한 포함하였다.
하기는 작제된 13개 플라스미드내 프로모터-발현 카세트의 기술이다. 나타낸 플라스미드(2 내지 4 및 8 내지 11)은 나타낸 명칭 및 기탁 번호하에 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스, 유니버시티 불러바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)에 2003년 5월 21일자로 부다페스트 조약하에 기탁되었다:
(1) CMV 프로모터-15H12/19D12 HC(γ4)
삽입체 서열: 서열 3;
(2) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCA(γ4)-
기탁명: "15H12/19D12 HCA(γ4)"
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 44;
(3) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCB(γ4)-
기탁명: "15H12/19D12 HCB(γ4)"
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 111;
(4) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCA(γ1)-
기탁명: "15H12/19D12 HCA(γ1)"
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 44;
(5) CMV 프로모터-15H12/19D12 LC(κ)
삽입체 서열: 서열 1;
(6) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCA(κ)
삽입체 서열: 서열 40;
(7) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCB(κ)
삽입체 서열: 서열 42;
(8) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCC(κ)
기탁명: "15H12/19D12 LCC(κ)";
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 71;
(9) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCD(κ)-
기탁명: "15H12/19D12 LCD(κ)";
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 73;
(10) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCE(κ)
기탁명: "15H12/19D12 LCE(κ)";
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 75;
(11) CMV 프로모터-15H12/19D12 LCF(κ)
기탁명: "15H12/19D12 LCF(κ)";
ATCC 기탁 번호:
삽입체 서열: 서열 77;
(12) CMV 프로모터-15H12/19D12 HC(γ4) 및 CMV 프로모터-15H12/19D12 LC(κ);
(13) CMV 프로모터-15H12/19D12 HCA(γ1) 및 CMV 프로모터-15H12/19D12 LC( κ).
ATCC에 기탁된 플라스미드에 대한 접근에 있어서의 모든 제한은 특허 승인시 제거될 것이다.
각각의 카세트의 3' 말단은 베타-글로빈 폴리 A 시그날에 연결되었다. 발현된 가변 쇄는 괄호안에 나타낸 불변 영역(예를 들면, γ1, γ4 또는 κ)에 연결되었다. 각각의 플라스미드를 함유하는 형질감염된 세포주의 분석은, 상응하는 항체 쇄 폴리펩타이드가 발현되었음을 나타내었다(발현 생성물의 아미노산 서열은 확인하지 않았다).
상기 참조한 플라스미드 각각은 본 발명의 일부를 구성한다. 또한, 각각의 발현 카세트내 위치한 핵산과 당해 핵산내 면역글로불린 가변 영역과 이의 성숙한 프로세싱된 형태(예를 들면, 시그날 서열을 상실하고 있는), 임의로 면역글로불린 불변 영역과 전술한 핵산중 어느 것에 의해 암호화된 특정의 폴리펩타이드를 포함하고, 성숙하거나 프로세싱되지 않은 쇄를 포함하며, 임의로 면역글로불린 불변 영역을 포함하는, 특히 서열 44, 성숙한 HCA(서열 44의 뉴클레오타이드 58 내지 411번), 서열 111, 성숙한 HCB(서열 111의 뉴클레오타이드 58 내지 411번), 서열 71, 성숙한 LCC(서열 71의 뉴클레오타이드 58 내지 384번), 서열 73, 성숙한 LCD(서열 73의 뉴클레오타이드 58 내지 384번), 서열 75, 성숙한 LCE(서열 75의 뉴클레오타이드 58 내지 384번), 서열 77 또는 성숙한 LCF(서열 77의 뉴클레오타이드 58 내지 384번)는 본 발명의 일부이다. 또한, 하나의 암호화된 폴리펩타이드를 포함하는 어떠한 항체 또는 이의 항원-결합 단편도 본 발명의 일부이다.
본 발명은 영역에 있어 본원에 기술된 특정의 양태로 제한되지 않는다. 또한, 본원에 기술된 것들외에 본 발명의 각종 변형도 앞서의 기술 및 첨부된 도면들로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 특허청구의 범위내에 속하는 것으로 의도된다.
특허, 특허원, 진뱅크 기탁 번호 및 공보는 본 출원 전체에서 인용되며, 이의 기술내용은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Schering Corporation <120> Neutralizing human anti-IGFR antibody <130> <140> PCT/US2003/016283 <141> 2003-05-22 <150> 60/383,459 <151> 2002-05-24 <150> 60/393,214 <151> 2002-07-02 <150> 60/436,254 <151> 2002-12-23 <160> 120 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> 1..384 <223> <220> <221> sig_peptide <222> 1..57 <223> <400> 1 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag gtt cca gac ttt cag tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Val Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 act cca aag gag aaa gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca gat cag tct cca aag 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 ctc ctc atc aag tat gct tcc cag tcc ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc aat agc 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 ctg gaa gct gaa gat gct gca gcg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cga act 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 2 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Val Pro Asp Phe Gln Ser Val 20 25 30 Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 3 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> 1..411 <223> <220> <221> sig_peptide <222> 1..57 <223> <400> 3 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct ata tta aaa ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cat 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His 20 25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agc ttt gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg 192 Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg ata tca gtt att gat act cgt ggt gcc aca tac tat gca gac 240 Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr 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Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cgggccagtc agagcattgg tagtagctta cac 33 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tatgcttccc agtccctctc a 21 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 catcagagta gtcgtttacc tcacact 27 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 His Gln Ser Ser Arg Leu Pro His Thr 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agctttgcta tgcac 15 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gttattgata ctcgtggtgc cacatactat gcagactccg tgaagggc 48 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ctggggaact tctactacgg tatggacgtc 30 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Phe Ala Met His 1 5 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala Met His 1 5 10 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ggattcacct tcagtagctt tgctatgcac 30 <210> 19 <211> 1367 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile 20 25 30 Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg 35 40 45 Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile 50 55 60 Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val 65 70 75 80 Ile Thr 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Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met 290 295 300 Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr 305 310 315 320 Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys 325 330 335 Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly 340 345 350 Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn 355 360 365 Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val 370 375 380 Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser 385 390 395 400 Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly 405 410 415 Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp 420 425 430 Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe 435 440 445 Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu 450 455 460 Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg 465 470 475 480 Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr 485 490 495 Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr 500 505 510 Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys 515 520 525 Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys 530 535 540 Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys 545 550 555 560 Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln 565 570 575 Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp 580 585 590 His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala 595 600 605 Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser 610 615 620 Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn 625 630 635 640 Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr 645 650 655 Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys 660 665 670 Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys 675 680 685 Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys 690 695 700 Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys 705 710 715 720 Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu 725 730 735 Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser 740 745 750 Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro 755 760 765 Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn 770 775 780 Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg 785 790 795 800 Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser 805 810 815 Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp 820 825 830 Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile 835 840 845 Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met 850 855 860 Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val 865 870 875 880 Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu 885 890 895 Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly 900 905 910 Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr 915 920 925 Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val 930 935 940 Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg 945 950 955 960 Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val 965 970 975 Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp 980 985 990 Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly 995 1000 1005 Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys 1010 1015 1020 Asp Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala 1025 1030 1035 Ala Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val 1040 1045 1050 Met Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val 1055 1060 1065 Val Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr 1070 1075 1080 Arg Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Met 1085 1090 1095 Glu Asn Asn Pro Val Leu Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile 1100 1105 1110 Gln Met Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala 1115 1120 1125 Asn Lys Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val 1130 1135 1140 Ala Glu Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg 1145 1150 1155 Asp Ile Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu 1160 1165 1170 Leu Pro Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val 1175 1180 1185 Phe Thr Thr Tyr Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp 1190 1195 1200 Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu Ser Asn 1205 1210 1215 Glu Gln Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys 1220 1225 1230 Pro Asp Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys 1235 1240 1245 Trp Gln Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile 1250 1255 1260 Ser Ser Ile Lys Glu Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser 1265 1270 1275 Phe Tyr Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Leu Pro Glu Pro Glu Glu Leu 1280 1285 1290 Asp Leu Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser 1295 1300 1305 Ala Ser Ser Ser Ser Leu Pro Leu Pro Asp Arg His Ser Gly His 1310 1315 1320 Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Val Leu Val Leu Arg Ala 1325 1330 1335 Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg 1340 1345 1350 Lys Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys 1355 1360 1365 <210> 20 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe 1 5 10 15 Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 20 25 30 Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 35 40 45 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 50 55 60 Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 85 90 95 Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 100 105 110 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 115 120 125 Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser Thr Asn Lys Asn Thr 130 135 140 Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Trp Pro Lys Thr His Pro Gly Gly Glu 145 150 155 160 Gln Lys Glu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Gln Ile Arg Gly Lys Lys Lys 165 170 175 Glu Gln Arg Arg Glu Ile Gly Ser Arg Asn Ala Glu Cys Arg Gly Lys 180 185 190 Lys Gly Lys 195 <210> 21 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu 20 25 30 Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg 35 40 45 Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg 50 55 60 Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu 65 70 75 80 Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu Arg Asp Val Ser Thr 85 90 95 Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys 100 105 110 Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln Ser Thr Gln Arg Leu Arg Arg 115 120 125 Gly Leu Pro Ala Leu Leu Arg Ala Arg Arg Gly His Val Leu Ala Lys 130 135 140 Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Ala Lys Arg His Arg Pro Leu Ile Ala 145 150 155 160 Leu Pro Thr Gln Asp Pro Ala His Gly Gly Ala Pro Pro Glu Met Ala 165 170 175 Ser Asn Arg Lys 180 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 tgccaggggg aagaccgatg g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 23 cgggaagatg aagacagatg 20 <210> 24 <211> 390 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(390) <223> <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(60) <223> <400> 24 atg gaa gcc cca gct cag ctt ctc ttc ctc ctg cta ctc tgg ctc cca 48 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 gat acc acc gga gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct 96 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 ttg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtt agc agt ttc tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc 192 Val Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 agg ctc ctc atc tat gat gca tcc aac agg gcc cct ggc atc cca gcc 240 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Pro Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agc cta gag cct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt agc 336 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 aac tgg cct cgg tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 384 Asn Trp Pro Arg Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 cga act 390 Arg Thr 130 <210> 25 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Pro Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser 100 105 110 Asn Trp Pro Arg Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr 130 <210> 26 <211> 420 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(420) <223> <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <223> <400> 26 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtg gct ata tta aaa ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta ctt 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu 20 25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca ggc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt aac tat gct atg cac tgg att cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg 192 Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtg tca gct att ggt gct ggt ggt gac acg tac tat gca gac 240 Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Ala Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag gac tcc 288 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser 85 90 95 ttg tat ctt caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac atg gct gtt tat 336 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt gca aga ggc cgg cat agg aac tgg tac tac tac aat aag gac 384 Tyr Cys Ala Arg Gly Arg His Arg Asn Trp Tyr Tyr Tyr Asn Lys Asp 115 120 125 tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 27 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Ala Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ala Ile Gly Ala Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Gly Arg His Arg Asn Trp Tyr Tyr Tyr Asn Lys Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 agggccagtc agagtgttag cagtttctta gcc 33 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gatgcatcca acagggcccc t 21 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cagcagcgta gcaactggcc tcggtggacg 30 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Pro 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Arg Trp Thr 1 5 10 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 ggattcacct tcagtaacta tgctatgcac 30 <210> 35 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 gctattggtg ctggtggtga cacgtactat gcagactccg tgaagggc 48 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ggccggcata ggaactggta ctactacaat aaggactac 39 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ala Ile Gly Ala Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gly Arg His Arg Asn Trp Tyr Tyr Tyr Asn Lys Asp Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 40 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30 act cca ggc gag aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 ctt ctc atc tac tat gct tcc cag tcc ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt agc 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 41 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 42 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 42 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30 tct cca ggc gag aga gcc acc ctc tcc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 ctt ctc atc tac tat gct tcc cag tcc ctc tca ggg atc ccc gat agg 240 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt aga 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 43 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 44 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <223> <400> 44 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct ata tta aaa ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta aag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agc ttt gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg 192 Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg ata tca gtt att gat act cgt ggt gcc aca tac tat gca gac 240 Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc 288 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 ttg tat ctt caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac act gct gtg tat 336 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt gca aga ctg ggg aac ttc tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 384 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 411 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 45 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 46 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> <400> 46 gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg act cca ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gtc acc atc acc tgc 69 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 47 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> <400> 48 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag ctt ctc atc tac 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 50 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 50 ggg gtc ccc tcg agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc 48 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 ctc acc atc agt agc ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt 96 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 51 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <223> <400> 52 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 54 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> <400> 54 gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg tct cca ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc ctc tcc tgc 69 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 56 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> <400> 56 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg ctt ctc atc tac 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 58 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 58 ggg atc ccc gat agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc 48 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 ctc acc atc agt aga ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt 96 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 59 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 60 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <223> <400> 60 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 62 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(90) <223> <400> 62 gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta aag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt 90 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 63 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(42) <223> <400> 64 tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg ata tca 42 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 1 5 10 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 1 5 10 <210> 66 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 66 cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc ttg tat ctt caa 48 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 atg aac agc ctg aga gcc gag gac act gct gtg tat tac tgt gca aga 96 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 67 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(33) <223> <400> 68 tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 33 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Asn Tyr Ala Met His 1 5 <210> 71 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 71 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30 act cca ggc gag aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt agc 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 ctc gag gct gaa gat gct gca gcg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 72 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 73 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 73 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30 act cca ggc gag aga gtc acc atc acc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc ctc tca ggg gtc ccc tcg agg 240 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt agc 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 74 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 75 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 75 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30 tct cca ggc gag aga gcc acc ctc tcc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc ctc tca ggg atc ccc gat agg 240 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt aga 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 ctg gag cct gaa gat gct gca gcg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 76 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 77 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> <400> 77 atg tcg cca tca caa ctc att ggg ttt ctg ctg ctc tgg gtt cca gcc 48 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 tcc agg ggt gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg 96 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30 tct cca ggc gag aga gcc acc ctc tcc tgc cgg gcc agt cag agc att 144 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 ggt agt agc tta cac tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg 192 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 ctt ctc atc aag tat gca tcc cag tcc ctc tca ggg atc ccc gat agg 240 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc ctc acc atc agt aga 288 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt cat cag agt agt cgt 336 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 tta cct cac act ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 384 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 78 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Ser Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Ser Ser Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Leu Ser Gly Ile Pro Asp Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Arg 100 105 110 Leu Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 79 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> <400> 79 gaa att gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg act cca ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gtc acc atc acc tgc 69 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 80 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 81 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> <400> 81 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag ctt ctc atc aag 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 1 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gtg ctg act cag agc cca gac tct ctg tct gtg act cca ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gtc acc atc acc tgc 69 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 88 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 89 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> <400> 89 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag tct cca aag ctt ctc atc aag 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 91 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 91 ggg gtc ccc tcg agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc 48 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 ctc acc atc agt agc ctc gag gct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt 96 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 92 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 93 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <223> <400> 93 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt acg 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 94 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> <400> 95 gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg tct cca ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc ctc tcc tgc 69 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 96 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 97 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> <400> 97 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg ctt ctc atc aag 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 98 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 99 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 99 ggg atc ccc gat agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc 48 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 ctc acc atc agt aga ctg gag cct gaa gat gct gca gcg tat tac tgt 96 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 100 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 101 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <223> <400> 101 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 103 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(69) <223> <400> 103 gaa att gtg ctg act cag agc cca ggt acc ctg tct gtg tct cca ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aga gcc acc ctc tcc tgc 69 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 104 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 105 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(45) <223> <400> 105 tgg tac cag cag aaa cca ggt cag gct cca agg ctt ctc atc aag 45 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 107 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 107 ggg atc ccc gat agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc acc 48 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 ctc acc atc agt aga ctg gag cct gaa gat ttc gca gtg tat tac tgt 96 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 108 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 109 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(36) <223> <400> 109 ttc ggc caa ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt aca 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 110 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 1 5 10 <210> 111 <211> 411 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(411) <223> <400> 111 atg gag ttt ggg ctg agc tgg gtt ttc ctt gtt gct ata tta aaa ggt 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 ccc ggg ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agc ttt gct atg cac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg 192 Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg ata tca gtt att gat act cgt ggt gcc aca tac tat gca gac 240 Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac tcc 288 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 ttg tat ctt caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac act gct gtg tat 336 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 tac tgt gca aga ctg ggg aac ttc tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc 384 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 411 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 112 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Ser Val Ile Asp Thr Arg Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 85 90 95 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Asn Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 113 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(75) <223> <400> 113 gag gtt cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct 75 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 114 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 115 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(42) <223> <400> 115 tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa ggt ctg gag tgg ata tca 42 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 1 5 10 <210> 116 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ser 1 5 10 <210> 117 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(96) <223> <400> 117 cga ttc acc atc tcc aga gac aat 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  27. 서열 45의 20 내지 137번 아미노산을 포함하는 중쇄 면역글로불린; 및 서열 78의 20 내지 128번 아미노산을 포함하는 경쇄 면역글로불린을 포함하는 분리된 항체, 또는 Fab, F(ab)2, Fv, 일본쇄 Fv(Scfv) 또는 이황화물 안정화된 Fv(dsfv) 단편인, 이의 항원 결합 단편.
  28. 제27항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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  32. 제27항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께, 하나 이상의 추가의 화학치료제를 포함하는, 말단비대증, 방광암, 윌름스 암(Wilm's cancer), 난소암, 췌장암, 양성 전립선 과형성, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 직장결장암, 자궁경부암, 윤활막 육종, 전이유암종과 연관된 설사, 혈관활성 장 펩타이드 분비 종양, 거대증, 건선, 죽상경화증, 혈관의 평활근 재협착 및 부적절한 미세혈관 증식의 치료 또는 예방용 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 추가의 화학치료제가 알킬화제, 항대사제, 항-종양 항생제, 유사분열 억제제, 크로마틴 작용 억제제, 항-혈관형성제, 항-에스트로겐제, 항-안드로겐제, 항체 치료요법제 및 면역조절제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 구성원인 조성물.
  34. 제32항에 있어서, 추가의 화학치료제가 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 페닐알라닌 무스타드, 멜팔렌, 클로람부콜, 우라실 무스타드, 에스트라무스틴, 티오테파, 부설판, 로무스틴, 카르무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진, 시스-플라티늄, 카르보플라틴, 알트레타민, 메토트렉세이트, 5-플루오르우라실, 플록수리딘, 5-플루오로데옥시우리딘, 카페시타빈, 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 겜시타빈, 클라드리빈, 데옥시코포르마이신, 펜토스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 발루비신, 미톡산트론, 닥티노마이신, 미트라마이신, 플리카마이신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 프로카르바진, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 이리노테칸, 에토포사이드, 테니포사이드, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 탈리도미드, 스쿠알아민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 요독시펜, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 스프리로놀락톤, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주마브, 리툭시마브, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 및 인터류킨-2, 및 5-플루오로우라실과 결합된 레바미졸로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 구성원인 조성물.
  35. 제32항에 있어서, 추가의 화학치료제가 이리노테칸, 도세탁셀, 파클리탁셀, 사이클로포스파미드, 타목시펜 또는 아나스트라졸인 조성물.
  36. 제27항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 직장결장암, 방광암, 윌름스암, 난소암, 췌장암 또는 자궁경부암, 또는 부적절한 미세혈관 증식 치료용 약제학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 하나 이상의 추가의 화학치료제를 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 추가의 화학치료제가 알킬화제, 항대사제, 항 종양 항생제, 유사분열 억제제, 크로마틴 작용 억제제, 항-혈관형성제, 항-에스트로겐제, 항-안드로겐제, 항체 치료요법제 및 면역조절제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 구성원인 약제학적 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 추가의 화학치료제가 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 페닐알라닌 무스타드, 멜팔렌, 클로람부콜, 우라실 무스타드, 에스트라무스틴, 티오테파, 부설판, 로무스틴, 카르무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진, 시스-플라티늄, 카르보플라틴, 알트레타민, 메토트렉세이트, 5-플루오르우라실, 플록수리딘, 5-플루오로데옥시우리딘, 카페시타빈, 플루다라빈, 사이토신 아라비노사이드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 겜시타빈, 클라드리빈, 데옥시코포르마이신, 펜토스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 발루비신, 미톡산트론, 닥티노마이신, 미트라마이신, 플리카마이신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 프로카르바진, 파클리탁셀, 도세탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 이리노테칸, 에토포사이드, 테니포사이드, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 탈리도미드, 스쿠알아민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, 인터페론-알파, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 타목시펜, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 요독시펜, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 스프리로놀락톤, 사이프로테론 아세테이트, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주마브, 리툭시마브, 데니류킨 디프티톡스, 인터페론 및 인터류킨-2, 및 5-플루오로우라실과 결합된 레바미졸로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 구성원인 약제학적 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 추가의 화학치료제가 이리노테칸, 도세탁셀, 파클리탁셀, 사이클로포스파미드, 타목시펜 또는 아나스트라졸인 약제학적 조성물.
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  61. 제27항에 있어서, 완전한 사람 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  62. 제27항에 있어서, 재조합체 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  63. 제28항에 있어서, 중쇄가 감마 1 중쇄 고정 영역에 연결되어 있고 경쇄가 카파 경쇄 고정 영역에 연결되어 있는 모노클로날 항체인 항체.
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  65. 제36항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 물, 완충제 및 당을 포함하는 약제학적 조성물.
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  69. 제40항에 있어서, 추가의 화학치료제가 이리노테칸인 약제학적 조성물.
  70. 제40항에 있어서, 추가의 화학치료제가 도세탁셀인 약제학적 조성물.
  71. 제40항에 있어서, 추가의 화학치료제가 파클리탁셀인 약제학적 조성물.
  72. 제40항에 있어서, 추가의 화학치료제가 사이클로포스파미드인 약제학적 조성물.
  73. 제40항에 있어서, 추가의 화학치료제가 타목시펜인 약제학적 조성물.
  74. 제40항에 있어서, 추가의 화학치료제가 아나스트라졸인 약제학적 조성물.
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  89. 인슐린-유사 성장 인자 수용체-I(Insuline-like Growth Factor Receptor-I: IGFR1)에 결합된 제27항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 착물.
  90. 서열 45의 20 내지 137번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열 78의 20 내지 128번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산.
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  92. 제90항에 있어서, 서열 44의 58 내지 411번 뉴클레오타이드 서열; 및 서열 77의 58 내지 384번 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  93. 제90항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  94. 제93항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  95. 제94항에 있어서, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포인 숙주 세포.
  96. 서열 45의 20 내지 137번 아미노산 및 서열 78의 20 내지 128번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 당해 폴리펩타이드가 숙주 세포내에서 생산되도록 하는 조건하에서 당해 숙주 세포내로 도입시킴을 포함하여, 서열 45의 20 내지 137번 아미노산 및 서열 78의 20 내지 128번 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 폴리펩타이드를 분리시킴을 추가로 포함하는 방법.
  98. 제96항에 있어서, 숙주 세포가 중국 햄스터 난소 세포인 방법.
  99. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 기탁 번호 제PTA-5220호하에 기탁된 플라스미드 15H12/19D12 HCA(κ)내 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 중쇄; 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁 번호 제PTA-5216호하에 기탁된 플라스미드 15H12/19D12 LCF(γ1)내 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 경쇄를 포함하는, 분리된 항체.
  100. 제27항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 양성 전립선 과형성, 윤활막 육종, 전이유암종과 연관된 설사, 혈관활성 장 펩타이드 분비 종양, 거대증, 건선, 죽상경화증, 또는 혈관의 평활근 재협착 치료용 약제학적 조성물.
  101. 제28항에 따른 모노클로날 항체인 항체, 물, 완충제 및 당을 포함하는, 말단비대증, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 양성 전립선 과형성, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암, 직장결장암, 자궁경부암, 윤활막 육종, 전이유암종과 연관된 설사, 혈관활성 장 펩타이드 분비 종양, 거대증, 건선, 죽상경화증, 혈관의 평활근 재협착 및 부적절한 미세혈관 증식의 치료 또는 예방용 조성물.
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