KR20090029184A - 항체 조성물 및 신생물성 질병의 치료 방법 - Google Patents

항체 조성물 및 신생물성 질병의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

포유동물 대상에서 신생물성 질병의 치료를 위한 항체 조성물 및 방법을 제공한다. 포유동물 대상에서 암을 진단하는 방법을 또한 제공한다.
신생물성 질병, 암, 항체 조성물, 진단 방법, 인슐린 유사 성장 인자

Description

항체 조성물 및 신생물성 질병의 치료 방법 {ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF NEOPLASTIC DISEASE}
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본원은 그 개시내용을 본원에 참고로 포함시킨, 2006년 4월 7일 출원된 미국 특허 가출원 60/790,512를 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 항체 조성물 및 포유동물 대상에서 신생물성 질병을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 단리된 인간 모노클로날 항체는 인슐린 유사 성장 인자 I에 또는 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인슐린 유사 성장 인자 II 모두에 결합한다. 본 발명은 추가로 포유동물 대상에서 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
암 치료는 분할 및 증식 속도가 가속화된 세포가 암 발병에 소인이 있다는 이론에 기반한다. 최근에, 많은 역학 연구에서는 강력한 유사분열 물질인 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)-I의 높은 순환 수준이 유방, 전립선, 폐, 및 직장결장의 암을 포함하는 몇몇 일반적인 암에 대한 증가된 위험과 연관된다는 것을 일관되게 보여주었다. 대부분의 상황에서 IGF-I의 유사분열 촉진 작용을 억제하는 혈청 내의 IGF-결합 단백질 (IGFBP)-3, 주요 IGF-I-결합 단백질의 수준은 암 위험과 역으로 연관된다.
기능적으로, IGF-I은 세포 증식을 자극할 뿐만 아니라 세포자멸 (apoptosis)을 억제한다. 이들 유사분열 촉진 및 항세포자멸 효과의 조합은 종양 성장에 영향을 미칠 수 있다. 암-관련 세포 활성에 대한 직접적인 효과 외에도, IGF 패밀리의 멤버들은 또한 성 스테로이드 호르몬, 종양 서프레서 (suppressor) 유전자의 산물 및 다른 성장 인자를 포함한 암 발병 및 진행에 관여하는 다양한 분자와 상호작용한다. 또한, 인간 성장 및 발달을 조절하는데 관여하는 펩티드 호르몬인 IGF-I의 발현 및 생산은 영양 및 신체 활동에 영향을 받는다. IGF 패밀리의 멤버의 분자 구조와 생리학적 기능을 이해하기 위한 실험은 발암에 있어서 유사분열 촉진 성장 인자의 역할에 대한 통찰을 제공한다 (Yu and Rohan, J. Natl. Cancer Inst. 92: 1472-1489, 2000).
IGF는 배양된 인간 유방암 세포의 증식을 자극한다. 상기 자극은 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체 1 (IGFR-1) (수용체 티로신 키나제 패밀리의 멤버임)를 통해 매개된다. 그의 리간드 (IGF-I 또는 IGF-II)에 의해 활성화될 때, IGFR1은 2가지 주요 기질, 즉, IRS-1 및 She 상의 티로신 잔기를 인산화하고, 이는 후속적으로 Ras/Raf 및 포스파티딜이노시톨 3'-키나제/AKT 경로를 통해 신호를 전달한다. IGFR1은 형질전환에서 중대한 역할을 한다. IGFR1 낙아웃 (knockout) 마우스로부터 유래된 세포는 SV40 큰 T 항원 및 활성화된 ras를 포함한 다양한 바이러스 및 세포 종양유전자에 의한 형질전환에 대해 내성인 반면, 야생형 마우스로부터의 섬유모세포는 상기 종양유전자에 의해 쉽게 형질전환될 수 있다.
상승된 혈장 IGF-I 수준을 전립선, 유방 및 결장 암 위험과 연관시키는 역학적 증거가 증가하고 있다. 환자로부터의 유방암 조직은 인접한 정상 조직보다 더 높은 IGFR1 발현을 나타내고, 이는 IGFR1과 유방 상피세포 형질전환 사이의 연관성을 제안한다. 종양 세포의 형질전환 능력은 안티센스 전략, 중화 항체 (항-IR3 또는 항-IGF-I) 또는 수용체의 우성 음성 말단절단 (truncation)을 이용하여 IGFR1이 억제될 때 약화되는 것으로 보고되었다 ([Hailey, J. et al., Molecular Cancer Therapeutics 1: 1349-1353, 2002]; [Maloney E.K., et al., Cancer Res. 63: 5073-5083, 2003]; [Burtrum D., et al., Cancer Res., 63: 8912-8921, 2003]; [Lu et al., J. Biol. Chem. 279: 2856-2865, 2004]; [Miyamoto et al., Clin. Cancer Res. 11: 3494-3502, 2005]; [Goya et al., Cancer Research 64: 6252-6258, 2004]). 당업계에서는 신생물성 질병 및 전이 암을 치료하기 위한 개선된 다중-표적 요법이 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명은 일반적으로 포유동물 대상에서 신생물성 질병의 치료를 위한 항체 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 대상에서 신생물성 질병의 진단 방법에 관한 것이다. 항체 조성물은 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 모노클로날 항체이다. 항체 조성물의 다른 세트는 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하고 인슐린 유사 성장 인자 II와 교차반응성이고 이에 결합하는 모노클로날 항체이다. 단리된 모노클로날 항체는 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 래트 또는 마우스 항체이다. 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 예를 들어 m705 및 m706이다. 인슐린 유사 성장 인자 I과 인슐린 유사 성장 인자 II 모두에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 m708 및 m708.2이다. 모노클로날 항체 m705, m706, m708, 및 m708.2는 인간 인슐린에 결합하지 않는다. m705는 서열 1을 포함하는 VH 사슬 아미노산 서열 및 서열 2를 포함하는 VL 사슬 아미노산 서열을 갖는다. m706은 서열 3을 포함하는 VH 사슬 아미노산 서열 및 서열 4를 포함하는 VL 사슬 아미노산 서열을 갖는다. m708은 서열 5을 포함하는 VH 사슬 아미노산 서열 및 서열 6를 포함하는 VL 사슬 아미노산 서열을 갖는다. m708.2는 서열 7을 포함하는 VH 사슬 아미노산 서열 및 서열 8을 포함하는 VL 사슬 아미노산 서열을 갖는다.
그의 중쇄 가변 구역에 서열 7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 7에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체가 제공된다.
그의 경쇄 가변 구역에 서열 8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 8에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체가 제공된다.
그의 중쇄 가변 구역 또는 경쇄 가변 구역에 각각 서열 7 또는 서열 8에 제시된 아미노산 서열 또는 각각 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체가 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가의 측면에서, 항체는 VL: Q S I S S (서열 9), VL: A A S (서열 10), VL: Q Q S Y S T P S T F (서열 11), VH: G G T F S S Y A (서열 12), VH: G I I P I L G I A (서열 13), 또는 VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (서열 14)를 포함하고 이로 제한되지 않는 적어도 하나의 CDR 서열을 제공한다. 추가의 측면에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD, 또는 IgE 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 항체는 IgG1κ 또는 IgG1λ 이소형일 수 있다. 항체는 IgG4κ 또는 IgG4λ 이소형이다. 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD, 또는 IgE 항체일 수 있다. 항체는 IgG1κ 또는 IgG1λ 이소형일 수 있다. 항체는 IgG4κ 또는 IgG4λ 이소형일 수 있다. 상세한 측면에서, 항체는 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 설치류, 래트, 또는 마우스 항체, 또는 이들의 조합이다.
다른 측면에서, 본 발명의 단리된 모노클로날 항체는 하나 이상의 다음 특징을 갖는다: (i) 약 4 nM 이상의 항체 농도에서 시험관내 MCF-7 유방암 세포 분석에서 IGF-1 수용체 인산화의 억제; (ii) IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 결합 또는 IGF-II 결합의 억제; 또는 (iii) 세포 이동 분석에서 세포 이동의 억제.
다른 측면에서, 본 발명의 단리된 모노클로날 항체의 해리 평형 상수 (KD)는 분석물로서 재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 또는 인간 인슐린 유사 성장 인자 II를, 리간드로서 항체를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 측정시에 약 10-8 M 이하이다.
추가의 측면에서, 약 108 M-1 이상의 결합 친화도로 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합할 수 있는 단리된 모노클로날 항체가 제공된다. 추가의 측면에서, 약 109 M-1 이상의 결합 친화도로 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합할 수 있는 단리된 모노클로날 항체가 제공된다. 상세한 측면에서, 단리된 모노클로날 항체는 무손상 항체, 무손상 IgG1 항체, 무손상 IgG2 항체, 무손상 IgG3 항체, 무손상 IgG4 항체, 무손상 IgM 항체, 무손상 IgA1 항체, 무손상 IgA2 항체, 무손상 분비성 IgA 항체, 무손상 IgD 항체, 또는 무손상 IgE 항체이고, 여기서 항체는 진핵 세포에서 글리코실화된다. 추가의 측면에서, 단리된 모노클로날 항체는 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다. 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 F(ab')2, Fab, Fv, 또는 Fd 단편일 수 있다. 항체는 항원-특이적일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명의 단리된 모노클로날 항체는 (i) 면역글로불린 힌지 구역 폴리펩티드에 융합된 링커 펩티드를 통해 서열 8에 제시된 가변 경쇄 아미노산 서열 또는 서열 8에 적어도 90% 상동성인 가변 경쇄 서열에 융합된, 서열 7에 제시된 가변 중쇄 아미노산 서열 또는 서열 7에 적어도 90% 상동성인 가변 중쇄 서열, (ii) 힌지 구역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 구역, 및 (iii) CH2 불변 구역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 구역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 항체는 평형 회합 상수 (Ka)가 예를 들어 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 또는 적어도 1010 M-1인 소정의 항원에 결합할 수 있다.
인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체가 제공된다. 한 측면에서, 항체는 적어도 하나의 다음 CDR 서열을 포함한다:
VL: Q S I S S (서열 9), VL: A A S (서열 10), VL: Q Q S Y S T P S T F (서열 11), VH: G G T F S S Y A (서열 12), VH: G I I P I L G I A (서열 13), 또는 VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (서열 14).
그의 인간 중쇄 가변 구역에 서열 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 1에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 그의 인간 경쇄 가변 구역에 서열 2에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 2에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 그의 인간 중쇄 가변 구역에 서열 3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 3에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성 장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 그의 인간 경쇄 가변 구역에 서열 4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 4에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 그의 인간 중쇄 가변 구역에 서열 5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 5에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 그의 인간 경쇄 가변 구역에 서열 6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 6에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체가 제공된다. 본 발명의 하나 이상의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
본 발명의 단백질/항체의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열 또는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 본 발명의 항체의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 세포가 제공된다. 항체의 HC 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 항체의 LC 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포가 제공되고, 여기서 항체는 본 발명의 단백질이다. 본 발명의 핵산을 핵산의 발현을 제공하는 조건 하에서 숙주 세포 내에서 발현시킨 후, 항체를 회수하는 것을 포함하는, 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 결합할 수 있는 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
인간 불변 구역을 포함하는 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는 적어도 1 X 1O8 리터/몰, 또는 적어도 1 X 1O9 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합한다. 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 불변 구역 및 인간 가변 구역을 포함할 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편은 적어도 하나의 인간 경쇄 및 적어도 하나의 인간 중쇄를 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, 경쇄는 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 경쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함한다. 중쇄는 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 중쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함할 수 있다. 경쇄는 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 경쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함할 수 있고, 중쇄는 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 중쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함한다.
인간 불변 구역을 포함하는 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 항원 결합 구역을 포함하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는 적어도 1 X 1O8 리터/몰, 또는 적어도 1 X 1O9 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합한다. 인간 IgG1 불변 구역을 포함하는 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는 적어도 1 X 1O8 리터/몰, 또는 적어도 1 X 1O9 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합한다. 인간 IgG1 불변 구역을 포함하는 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공되고, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 항원 결합 구역을 포함하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는 적어도 1 X 1O8 리터/몰, 또는 적어도 1 X 1O9 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합한다.
(a) 샘플을 제공하고; (b) (a)의 샘플을 폴리펩티드 리간드의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 대한 결합을 허용하는 조건 하에, 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 m708 또는 m708.2와 접촉시키고; (c) 항체 m708 또는 m708.2의 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II와의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합의 검출은 샘플에 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II가 존재함을 나타내고, 이에 의해 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는, 샘플 내에서 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는 방법이 제공된다.
(a) 샘플을 제공하고; (b) (a)의 샘플을 폴리펩티드 리간드의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 대한 결합을 허용하는 조건 하에, 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 m708 또는 m708.2와 접촉시키고; (c) 항체 m708 또는 m708.2의 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II와의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합의 검출은 샘플에 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II가 존재함을 나타내고, 이에 의해 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는, 샘플 내에서 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는 방법이 제공된다.
(a) 샘플을 제공하고; (b) (a)의 샘플을 폴리펩티드 리간드의 인간 인슐린 성장 인자 I에 대한 결합을 허용하는 조건 하에, 인간 인슐린 성장 인자 I을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 m705 또는 m706과 접촉시키고; (c) 항체 m705 또는 m706의 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I과의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합의 검출은 샘플에 인간 인슐린 성장 인자 I이 존재함을 나타내고, 이에 의해 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I을 검출하는, 샘플 내에서 인간 인슐린 성장 인자 I을 검출하는 방법이 제공된다.
본 발명의 핵산을 핵산의 발현을 제공하는 조건 하에서 숙주 세포 내에서 발현시킨 후, 항체를 회수하는 것을 포함하는, 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 결합할 수 있는 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
(a) 후보 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 I 결합 폴리펩티드를 발현하는 파지를 포함하는 파지 라이브러리를 제공하고; (b) 파지 라이브러리를 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II 단백질과 접촉시키고; (c) 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II 단백질의 파지에 대한 결합을 검출하여 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 특이적인 폴리펩티드 리간드를 확인하는 것을 포함하는, 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 특이적인 폴리펩티드 리간드를 확인하는 방법이 제공된다.
포유동물 대상에게 인슐린 유사 성장 인자 I에 특이적으로 결합하는, 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하는 제약 조성물을 신생물성 질병을 완화 또는 제거하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 대상에서 신생물성 질병을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 한 측면에서, 항체는 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인슐린 유사 성장 인자 II에 특이적으로 결합한다. 추가의 측면에서, 항체는 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다. 항체는 세포독성제에 연결될 수 있다. 세포독성제는 세포독성 약물 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상세한 측면에서, 신생물성 질병은 고형 종양, 혈액 종양, 백혈병, 결장직장암, 양성 또는 악성 유방암, 자궁암, 자궁근종, 난소암, 자궁내막암, 다낭성 난소증후군, 자궁내막 폴립, 전립선암, 전립선 비대, 뇌하수체암, 선근증, 선암종, 수막종, 흑색종, 골암, 다발 골수종, CNS 암, 신경아교종 또는 별아세포종이다. 추 가의 상세한 측면에서, 신생물성 질병은 포유동물 대상에서 종양 세포 전이이다. 신생물성 질병은 포유동물 대상에서 유방암 전이일 수 있다.
세포 집단을 포함하는 시험 샘플을 대상의 혈액 또는 조직으로부터 얻고, 세포 집단 내의 세포 상의 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고, 세포를 확인하고 특성화하기 위해 IGF-I 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하는 것을 포함하고, 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커의 존재가 포유동물 대상에서 신생물성 질병 또는 신생물성 질병의 위험을 나타내는 것인, 신생물성 질병이 발병한 것으로 의심되거나 신생물성 질병의 위험이 있는 것으로 의심되는 포유동물 대상에서 암을 진단하는 방법이 제공된다.
암을 진단하는 방법은 세포 집단 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-II 마커 및 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고, 세포를 확인하고 특성화하기 위해 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커의 존재는 포유동물 대상에서 신생물성 질병 또는 신생물성 질병의 위험을 나타낸다.
진단 방법에서, 검사물 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 또는 IGF-II 마커의 존재는 포유동물 대상에서 전이 암의 존재를 나타낸다. 진단 방법에서, 검사물 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 또는 IGF-II 마커의 존재는 포유동물 대상에서 초기 단계 암의 존재를 나타낸다. 진단 방법에서, 검사물 내의 세 포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커의 부재는 포유동물 대상에서 무병 상태를 또는 측정할 수 있는 질병 상태의 부재를 나타낸다. 진단 방법의 추가의 측면에서, 검사물 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 또는 IGF-II 마커의 존재 또는 부재에 의해 암 치료 또는 암 회복 동안의 치료 관리가 모니터링된다. 추가의 측면에서, 방법은 항체와 회합된 영상화 모이어티 (imaging moiety)를 포함한다. 영상화 모이어티는 자기공명 분광법, X선 분광법, 또는 양전자 방출 단층촬영술 (PET)을 통해 영상화될 수 있다. 회합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 신생물성 질병은 고형 종양, 혈액 종양, 백혈병, 결장직장암, 유방암, 자궁암, 자궁근종, 난소암, 자궁내막암, 다낭성 난소증후군, 자궁내막 폴립, 전립선암, 전립선 비대, 뇌하수체암, 선근증, 선암종, 수막종, 흑색종, 골암, 다발 골수종, CNS 암, 신경아교종 또는 별아세포종을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
포유동물 대상에서 암 치료를 위한 약물 후보 화합물을 스크리닝하는 방법은 치료 유효량의 약물 후보 화합물을 암이 발병한 것으로 의심되는 대상에게 투여하고, 종양 세포를 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단을 포함하는 시험 샘플을 약물 후보 화합물의 처리 전과 후에 대상의 혈액 또는 조직으로부터 얻고, 시험 샘플 내의 세포 상의 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고, 약물 후보 화합물 처리 후와 비교하여 약물 후보 화합물 처리 전의 시험 샘플에서 종양 세포를 확인하기 위해 IGF-I 마커에 의해 검출되는 세포 집단을 분석하는 것을 포함하고, 여기서 처리 전의 검사물 내의 종양 세포의 수에 비 해 처리 후에 검사물 내의 종양 세포의 감소된 수의 존재는 포유동물 대상에서 암 치료시에 약물 후보 화합물의 유효성을 나타낸다.
다른 측면에서, 포유동물 대상에서 암 치료를 위한 약물 후보 화합물을 스크리닝하는 방법은 시험 샘플 내의 세포 상의 IGF-II 마커 및 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고, 약물 후보 화합물 처리 후와 비교하여 약물 후보 화합물 처리 전의 시험 샘플에서 종양 세포를 확인하기 위해 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커에 의해 검출되는 세포 집단을 분석하는 것을 포함하고, 여기서 처리 전의 검사물 내의 종양 세포의 수에 비해 처리 후에 검사물 내의 종양 세포의 감소된 수의 존재는 포유동물 대상에서 암 치료시에 약물 후보 화합물의 유효성을 나타낸다. 암은 전이 암 또는 초기 단계 암일 수 있다.
도 1은 IGF-I 또는 IGF-I 및 IGF-II에 결합하는 IGF-I에 대해 선택된 인간 모노클로날 항체를 도시한 것이다.
도 2는 IGF-I 및 IGF-II에 대한 IgG 708.2 결합의 ELISA 결합 분석을 도시한 것이다.
도 3은 IgG 708.2가 MCF-7 세포에서 IGF-1R의 인산화를 억제하는 것을 보여준다.
도 4는 IGF-I에 대해 선택된 인간 모노클로날 항체에 의한 가용성 IGF-1R에 대한 IGF-I 결합의 억제를 도시한 것이다.
도 5는 항-IGF-II 인간 항체 IgG1 m708.2에 의한, MCF7 세포에서 IGF-II 및 IGF-I-유도된 IGF-1R 인산화의 용량-의존 억제를 도시한 것이다.
도 6은 IgG1 708.2에 의한 세포 이동성의 억제를 도시한 것이다.
도 7은 ELISA 분석에 의한 IGF-I 및 IGF-II에 대한 모노클로날 항체 m705, m706 및 m708의 결합 특이성을 도시한 것이다.
도 8은 IGF-I과 IGF-1 수용체 사이의 결합에 대한 모노클로날 항체 m705, m706 및 m708의 결합 경쟁을 도시한 것이다.
도 9는 IGF-II에 대한 모노클로날 항체 m708.2 IgG의 결합을 도시한 것이다.
본 발명은 일반적으로 포유동물 대상에서 신생물성 질병의 치료를 위한 항체 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 포유동물 대상에서 신생물성 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 항체 조성물은 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 모노클로날 항체이다. 다른 세트의 항체 조성물은 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하고 인슐린 유사 성장 인자 II에 교차반응성이면서 이에 결합하는 모노클로날 항체이다. 단리된 모노클로날 항체는 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 래트 또는 마우스 항체이다. 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 예를 들어 m705 및 m706이다. 인슐린 유사 성장 인자 I과 인슐린 유사 성장 인자 II에 모두 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 m708 및 m708.2이다. 모노클로날 항체 m705, m706, m708, 및 m708.2는 인간 인슐린에 결합하지 않는다.
인슐린 유사 성장 인자 (IGF)는 세포 증식, 분화, 및 세포자멸을 조절할 때 기능하는 유사분열 물질이다. IGF의 효과는 인슐린 유사 성장 인자 수용체인 IGF-1R을 통해 매개된다. 인슐린 유사 성장 인자 I (IGF-I) 및 인슐린 유사 성장 인자 II (IGF-II)는 타입 I 인슐린 유사 성장 인자 수용체 (IGF-1R)에 대한 결합을 통해 효과를 매개한다. IGF-1R은 많은 종양에 의해 과다발현되고, 증식, 운동성 및 세포자멸로부터의 보호를 매개한다. 종양에 의해 과다발현되는 그의 주요 리간드는 IGF-I이다. IGF-1R-매개된 신호전달의 억제가 세포외 또는 세포내 표적에서 일어날 수 있다. 세포외 IGF는 IGF-1R에 결합하고, 활성화된 티로신 키나제는 PB 키나제/Akt 및 MAPK 경로를 포함하는 신호 전달 경로에 의해 매개되는 향상된 증식 및 세포 생존을 유발한다. IGF-1R의 억제는 다수의 세포외 및 세포내 수준 모두에서 일어날 수 있다 (LeRoith D, Helman L, Cancer Cell 5: 201-202, 2004).
IGF-I의 그의 수용체에 대한 결합을 방지하면 세포 증식에 필요한 신호 전달의 억제를 야기할 수 있다. 항체 인간 나이브 (naive) 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써, IGF-I에 특이적이고 IGF-II 및 인슐린과 교차반응하지 않는 2개의 항체, 즉 m705 및 m706이 확인되었다. 2개의 항체, 즉 m708 및 m708.2는 IGF-I 및 IGF-II와 교차반응성이다. M708은 IGF-I에 대한 가장 높은 친화도 결합을 보이고, IgG1로 전환되었다. 모든 항체는 IGF-I 및 IGF-II의 수용체 (IGF-1R) 결합과 경쟁하였다. IgG1 m708은 MCF-7 유방암 세포주에서 IGF-1R에 의해 매개되는 신호 전달을 1 nM의 IC50으로 강력하게 억제하였다. 억제 메카니즘은 IGF-II에 대한 결합을 위해 IGF-1R을 과도하게 경쟁시킴으로써 발생한다. 이것은 IGF-I에 대한 그의 높은 nM 범위 친화도와 일치한다. 상기 항체는 암에 대한 치료적 처치와 암 치료에 관련된 진단적 분석 모두에 유용하다.
본 발명이 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 물론 변경될 수 있음이 이해된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시태양을 설명하기 위한 것일 뿐, 이로 제한하고자 하는 것이 아님이 이해된다. 본원 명세서 및 첨부하는 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 (하나 ("a", "an") 및 그 ("the"))는 분명하게 다른 의미를 나타내지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"라는 언급은 임의로 2 이상의 세포의 조합을 포함한다.
측정가능한 값, 예를 들어 양, 일시적인 기간 등을 나타낼 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 특정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 바람직하게는 ±1%, 보다 더 바람직하게는 ±0.1%의 변동을 포함하는 의미이고, 상기 변동은 개시된 방법을 수행하기 위해 적절하다.
달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본언에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에서 설명된다. 본 발명을 설명하고 특허청구할 때, 다음 용어를 사용할 것이다.
"환자", "대상" 또는 "포유동물"은 상호 교환가능하게 사용되고, 포유동물, 예를 들어 인간 환자 및 비-인간 영장류, 및 실험 동물, 예를 들어 토끼, 래트, 및 마우스, 및 다른 동물을 의미한다. 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다.
"치료하는" 또는 "치료"는 질병의 증상, 합병증, 또는 생화학적 징후의 개시를 억제하거나 지연시키고 질병, 병태 또는 질환 (예를 들어, 암, 전이 암, 또는 전이성 유방암)의 증상을 완화시키거나 추가 발생을 정지시키기 위한 본 발명의 항체 조성물, 화합물 또는 물질 (agent)의 투여를 포함한다. 치료는 증상의 예방적 (질병의 개시를 예방 또는 지연시키거나, 또는 그의 임상 또는 불현 증상의 표시를 예방하기 위한) 또는 질병 표시 후의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
"암" 또는 "악성 종양"은 동의어로 사용되고, 조절되지 않은 비정상적인 세포의 증식, 이환된 세포가 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 퍼지는 (즉, 전이하는) 능력 및 임의의 많은 특징적인 구조적 및(또는) 분자적 특징에 의해 특성화되는 임의의 많은 질병을 의미한다. "암성" 또는 "악성 세포"는 특이적인 구조적 특성을 갖고, 분화가 결여되고, 침습 및 전이가 가능한 세포로서 이해된다. 암의 예는 유방, 폐, 뇌, 뼈, 간, 신장, 결장, 및 전립선암이다 (모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [DeVita et al., Eds., Cancer Principles and Practice of Oncology, 6th. Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2001] 참고).
"암-연관된"은 대상 세포에서 악성 종양의 발병에 대한 핵산 및 그의 발현, 또는 그의 결여, 또는 단백질 및 그의 수준 또는 활성, 또는 그의 결여의 관계를 의미한다. 예를 들어, 암은 정상적인 건강한 세포에서 발현되지 않거나 보다 낮은 수준으로 발현되는 특정 유전자의 발현과 연관될 수 있다. 반대로, 암-연관된 유전자는 악성 세포에서 (또는 변형된 세포에서) 발현되지 않거나 정상적인 건강한 세포에서보다 낮은 수준으로 발현되는 것일 수 있다.
암과 관련하여, 용어 "변형"은 악성으로 변하면서 정상 세포가 경험하는 변화를 의미한다. 진핵세포에서, 용어 "변형"은 세포 배양에서 정상 세포의 악성 세포로의 전환을 설명하기 위해 사용될 수 있다.
"증식 세포"는 세포 분열이 활발하게 발생하고 지수 성장 중인 세포이다. "세포 증식 조절의 상실"은 정상적으로는 세포 분열을 적절히 제한하는 세포 주기 조절을 상실한 세포의 특성을 의미한다. 상기 조절을 상실한 세포는 자극 신호 없이도 정상 속도보다 빠른 속도로 증식하고, 억제 신호에 반응하지 않는다.
"진행암"은 원발성 종양 부위에 더이상 편재하지 않는 암, 또는 American Joint Committee on Cancer (AJCC)에 따른 III기 또는 IV기의 암을 의미한다.
"잘 관용되는"은 치료 결과로서 발생하여 치료 결정에 영향을 주는, 건강한 상태에서의 유해한 변경이 존재하지 않음을 의미한다.
"전이성"은 면역 결핍 마우스의 유방 지방체 및(또는) 순환계 내에 주사시에 면역 결핍 마우스의 폐, 간, 뼈 또는 뇌에 2차 종양 병변을 확립할 수 있는 종양 세포, 예를 들어, 인간 유방암 세포를 의미한다.
"비전이성"은 유방 지방체 및(또는) 순환계 내에 주사시에 면역 결핍 마우스의 폐, 간, 뼈 또는 뇌 또는 유방암 전이의 다른 표적 장기에 2차 종양 병변을 확립할 수 없는 종양 세포, 예를 들어, 인간 유방암 세포를 의미한다. 본원에서 사용되고 본원에서 비-전이성으로 언급되는 인간 종양 세포는 면역 결핍 마우스의 유방 지방체 내에 주사시에 원발성 종양을 확립할 수 있지만, 원발성 종양으로부터 전파될 수 없는 것이다.
본원에서 사용되는 "림프구"는 당업계에서 정상적인 의미를 갖고, 혈액, 림프, 및 림프성 조직에서 발견되는 임의의 단핵, 비포식성 백혈구, 예를 들어, B 및 T 림프구를 의미한다.
본원에서 사용되는 "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및(또는) 카르복시-말단이 결실되었지만, 나머지 아미노산 서열은 예를 들어 전장 cDNA 서열로부터 추정되는 자연 발생 서열의 대응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 단편의 길이는 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 14개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산, 대체로 적어도 50개의 아미노산, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 70개의 아미노산이다. 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 추정된 아미노산 서열의 일부와 실질적인 동일성을 갖는 적어도 25개의 아미노산의 세그먼트로 이루어지고 적어도 하나의 다음 특성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다: (1) 적합한 결합 조건 하에서 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 특이적인 결합, (2) IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 또는 IGF-II의 결합을 차단하는 능력, 또는 (3) 시험관 내에서 또는 생체 내에서 IGF-I 발현 세포 또는 IGF-II 발현 세포의 성장을 억제하는 능력. 전형적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연 발생 서열에 대해 보존적 아미노산 치환 (또는 부가 또는 결실)을 포함한다. 유사체의 길이는 전형적으로 적어도 20개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 50개의 아미노산이거나 이보다 길 수 있고, 종종 전장 자연 발생 폴리펩티드만큼의 길이일 수 있다.
펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 제약업계에서 통상 사용된다. 상기 종류의 비-펩티드 화합물을 "펩티드 모방체 (peptide mimetic)" 또는 "펩티드모방체 (peptidomimetic)"로 칭한다 (본원에 참고로 포함된 문헌 [Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29, 1986; Veber and Freidinger TINS p. 392 (1985)]; 및 [Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229, 1987]). 상기 화합물은 종종 컴퓨터에 의한 분자 모델링을 사용하여 개발된다. 치료상 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 동등한 치료 또는 예방 효과를 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 예시적인 폴리펩티드 (즉, 생화학적 특성 또는 약물 활성을 갖는 폴리펩티드), 예를 들어 인간 항체와 구조적으로 유사하지만, 임의로 하나 이상의 펩티드 연결이 당업계에 공지된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-로 이루어지는 군 중에서 선택되는 연결로 치환된다. 컨센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 종류의 D-아미노산으로 치환 (예를 들어, L-라이신 대신에 D-라이신)을 사용하여 보다 안정한 펩티드를 생성시킬 수 있다. 또한, 컨센서스 서열 또는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변형을 포함하는 속박된 (constrained) 펩티드가 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 펩티드를 고리화하는 분자내 디술파이드 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써 생성될 수 있다 (본원에 참고로 포함된 문헌 [Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387, 1992]).
폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "실질적인 동일성"은 디폴트 갭 가중치 (default gap weight)를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때 두 펩티드 서열이 적어도 80%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 가짐을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환가능성을 의미한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산, 및 아스파라긴-글루타민이다.
본원에서 논의되는 바와 같이, 아미노산 서열의 변이가 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%의 상동성을 유지한다면 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 작은 변이는 본 발명에 포함되는 것으로 고려된다. 특히, 보존적 아미노산 치환이 고려된다. 보존적 아미노산 치환은 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%의 상동성을 유지할 수 있는 총 상동성을 감소시키지 않는다. 보존적 치환은 그 측쇄에 관련된 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 치환이다. 유전자에 의해 코딩되는 아미노산은 일반적으로 다음 패밀리로 구분된다: (1) 산성=아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성=라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성=알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비대전 극성=글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 보다 바람직한 패밀리는 다음과 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족-히드록시 패밀리이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아미드-함유 패밀리이고; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 패밀리이고; 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 방향족 패밀리이다. 예를 들어, 류신을 이소류신 또는 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 치환하거나, 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 치환하는 것은 특히 치환이 프레임워크 부위 내의 아미노산을 수반하지 않을 경우에 생성되는 분자의 결합 또는 특성에 대해 큰 효과를 갖지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변경이 기능적 펩티드를 생성시키는지의 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이적인 활성을 분석함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 분석은 본원에서 상세하게 설명된다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에 존재한다. 구조적 및 기능적 도메인은 공개된 또는 독점적인 서열 데이타베이스에 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 데이타를 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터에 의한 비교 방법은 공지된 구조 및(또는) 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 입체형태 도메인을 확인하기 위해 사용된다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열의 확인 방법은 공지되어 있다 (Bowie et al. Science 253: 164, 1991). 따라서, 상기 예는 당업자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 규정하기 위해 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 입체형태를 인식할 수 있음을 입증한다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고, (4) 상기 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형하는 것이다. 유사체는 자연 발생 펩티드 서열 이외의 다른 서열의 상이한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)이 자연 발생 서열에 (바람직하게는 분자간 접촉부를 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분에) 생성될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경시키지 않아야 한다 (예를 들어, 치환 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파단시키거나, 또는 모 서열을 특성화하는 다른 종류의 2차 구조를 붕괴시키지 않아야 한다). 당업계에 알려진 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 각각 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)]; 및 [Thornton et al. Nature 354: 105, 1991])에 기재되어 있다.
"항체" 또는 "항체 펩티드(들)"은 무손상 항체, 또는 특이적인 결합을 위해 무손상 항체와 경쟁하는 그의 결합 단편을 의미한다. 결합 단편은 재조합 DNA 기술, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 단일쇄 항체를 포함한다. 무손상 "항체"는 디술파이드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 구역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 구역으로 이루어진다. 중쇄 불변 구역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 구역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 구역으로 이루어진다. 경쇄 불변 구역은 하나의 도메인, 즉 CL로 이루어진다. VH 및 VL 구역은 프레임워크 구역 (FR)으로 불리는, 보다 보존된 구역 내에 산재하는 상보성 결정 구역 (CDR)으로 불리는 초가변 구역으로 다시 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복실-말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 구역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 구역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함하여 면역글로불린의 숙주 조직 또는 인자에 대한 결합을 매개할 수 있다. 용어 항체는 IGF-I 또는 IGF-II에 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 항원 결합 부분을 포함한다. 결합의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 구역에서 디술파이드 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 구역 (CDR)을 포함한다.
"이중특이적" 또는 "이중기능적" 항체 이외의 다른 항체는 각각의 그의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. 항체는 과량의 항체가 대응수용체 (counterreceptor)에 결합되는 수용체의 양을 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%, 보다 일반적으로는 약 85%를 초과하여 감소시킬 때 (시험관 내 경쟁적 결합 분석으로 측정시에) 수용체의 대응수용체에 대한 부착을 실질적으로 억제한다.
"Fab 항체" 또는 "Fab 단편"은 모든 또는 일부의 면역글로불린 불변 구역이 결여되고 항체의 Fab 구역을 포함하는 항체 단편을 의미한다. Fab 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조한다.
"단일쇄 항체" 또는 "단일쇄 Fv (scFv)"는 Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH의 항체 융합 분자를 의미한다. Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, 이들을 VL 및 VH 구역이 페어링하여 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌 [Bird et al., Science 242: 423-426, 1988]; 및 [Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로서 제조하도록 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 상기 단일쇄 항체는 재조합 DNA 기술, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있는 용어 "항체" 단편에 포함된다.
"인간 서열 항체"는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 구역 (존재할 경우)을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 서열 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서의 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 PCT 공개 WO 01/14424 및 WO 00/37504에 기재된 바와 같이 비-인간 트랜스제닉 (transgenic) 동물에서 생성될 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 "인간 서열 항체"는 또다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식세포로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 그래프팅된 항체 (예를 들어, 인간화 항체)를 포함하고자 의도하지 않는다.
또한, 재조합 면역글로불린을 생산할 수 있다. 모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,816,567 (Cabilly) 및 문헌 [Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033, 1989]을 참고한다.
"모노클로날 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 구역 (존재할 경우)을 갖는 단일 결합 특이성을 보이는 항체를 의미한다. 한 실시태양에서, 인간 모노클로날 항체는 무한증식 (immortalized) 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스젠 (transgene) 및 경쇄 트랜스젠을 포함하는 게놈을 갖는, 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"폴리클로날 항체"는 세포 표면 수용체 또는 리간드, 예를 들어, IGF-1 수용체에 결합하는 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 1 초과 (2 이상)의 상이한 항체의 제제를 의미한다. 상기 제제는 일정 범위의 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 또는 IGF-II 결합을 억제하기 위해 IGF-I 또는 IGF-II 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 이와 유사하게, IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 IGF-1 수용체에 결합하여 IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 또는 IGF-II 결합을 억제하는 펩티드모방체로서 기능할 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 상기 및 다른 항체는 당업계에 공지되고(되거나) 본원에 인용된 참고문헌에 설명되어 있는 방법에 따라 제조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명에서 사용되는 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체는 "인간 항체", 예를 들어, 인간으로부터 단리된 항체이거나, 또는 "인간 서열 항체" (상기 정의됨)일 수 있다.
"면역 세포 반응"은 면역 세포 이동, 표적 세포의 사멸, 포식작용, 항체, 면역 반응의 다른 가용성 효과기 등의 생성을 유발하는, 면역 세포의 생화학적 변화를 생성시키는 외부 또는 내부 자극 (예를 들어, 항원, 세포 표면 수용체, IGF-I, IGF-II, IGF-1 수용체, 시토킨, 케모킨, 및 다른 세포)에 대한 면역계 세포의 반응을 의미한다.
"면역 반응"은 인체로부터 암성 세포, 전이성 종양 세포, 전이성 유방암 세포, 침습성 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우, 정상적인 인간 세포 또는 조직에 대한 선택적인 손상, 파괴 또는 제거를 유발하는, 림프구, 항원 제시 세포, 포식성 세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에서 생산되는 가용성 거대분자 (항체, 시토킨, 및 보체 포함)의 협동 작용을 의미한다.
"T 림프구 반응" 및 "T 림프구 활성"은 T 림프구에 의존적인 면역 반응의 성분을 의미하기 위해 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다 (예를 들어, T 림프구의 헬퍼, 세포독성 킬러, 또는 서프레서 T 림프구로의 증식 및(또는) 분화, 항체 생산을 유발하거나 억제하는 헬퍼 T 림프구에 의한 B 림프구로의 신호 공급, 세포독성 T 림프구에 의한 특이적 표적 세포의 사멸, 및 다른 면역 세포의 기능을 조정하는 시토킨과 같은 가용성 인자의 방출).
암 치료
항체 조성물에 의한 IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 또는 IGF-II 결합의 차단은 환자에서 암성 세포에 대한 기억 또는 2차 면역 반응을 향상시킬 수 있다. IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 면역을 자극하기 위해 면역원성 물질, 예를 들어 암성 세포, 정제된 종양 항원 (재조합 단백질, 펩티드 및 탄수화물 분자 포함), 세포, 및 면역 자극성 시토킨 및 세포 표면 항원을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포와 조합될 수 있거나, 또는 단독으로 사용될 수 있다.
IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 예방접종 프로토콜에 따를 때 효과적이다. 종양에 대한 예방접종을 위한 많은 실험 전략이 고안되었다 (문헌 ([Rosenberg, ASCO Educational Book Spring: 60-62, 2000]; [Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302, 2000; Khayat, ASCO Educational Book Spring: 414-428, 2000; Foon, ASCO Educational Book Spring: 730-738, 2000]) 참조; 또한 문헌 [Restifo et al., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 61: 3023-3043, 1997] 참조). 상기 전략 중의 하나에서, 백신은 자가 또는 동종이형 (allogeneic) 종양 세포를 사용하여 제조한다. 상기 세포 백신은 GM-CSF를 발현하도록 종양 세포가 형질도입될 때 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. GM-CSF는 종양 예방접종을 위한 항원 제시의 강력한 활성인자인 것으로 밝혀졌다 (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 90: 3539-43, 1993).
IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 GMCSF-변형된 종양 세포 백신을 부스팅하고, 많은 실험 종양 모델, 예를 들어 유 암종 (Hurwitz et al., 1998, 상기 문헌), 원발성 전립선암 (Hurwitz et al., Cancer Research, 60: 2444-8, 2000) 및 흑색종 (van Elsas et al., J. Exp. Med., 190: 355-66, 1999)에서 백신의 효능을 향상시킨다. 이 예에서, 비-면역원성 종양, 예를 들어 B16 흑색종은 면역계에 의한 파괴에 감수성으로 되었다. 또한, 종양 세포 백신은 다른 면역 활성인자, 예를 들어 IL2, 및 동시자극 분자를 발현하도록 변형될 수 있다.
"항신생물제"는 인간에서 신생물, 특히 악성 (암성) 병변, 예를 들어 암종, 육종, 림프종, 또는 백혈병의 발생 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 물질을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 전이의 억제는 종종 항신생물제의 특성이다.
"고형 종양"은 육종, 흑색종, 암종, 또는 다른 고형 종양암을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"육종"은 일반적으로 배아 결합 조직과 같은 물질로 이루어지는 종양을 의미하고, 일반적으로 섬유질 또는 균질한 물질을 조밀하게 채우고 있는 세포로 이루어진다. 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 멜라닌육종, 점액육종, 골육종, 아베메시 (Abemethy) 육종, 지방 육종, 지질육종, 폐포 연부 육종, 에나멜모세포 육종, 포도 육종, 녹색 육종, 융모막 암종, 배아세포성 육종, 윌름 (Wilms) 종양 육종, 자궁내막 육종, 기질 육종, 유잉 (Ewing) 육종, 근막 육종, 섬유모세포 육종, 거대 세포 육종, 과립구성 육종, 호지킨 (Hodgkin) 육종, 특발성 다색소 출혈 육종, B 세포의 면역모세포 육종, 림프종, T-세포의 면역모세포 육종, 옌센 (Jensen) 육종, 카포시 (Kaposi) 육종, 쿠퍼 (Kupffer) 세포 육종, 혈관육종, 백색육종, 악성 간엽세포 육종, 방골성 육종, 그물적혈구성 육종, 라우스 (Rous) 육종, 혈청세포 육종 (serocystic sarcoma), 윤활막 육종 및 모세혈관확장 육종을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"흑색종"은 피부 및 기타 장기의 멜라닌세포계로부터 유발되는 종양을 의미한다. 흑색종은 예를 들어 말단 흑자성 흑색종, 멜라닌 결핍 흑색종, 양성 연소성 흑색종, 클라우드맨 (Cloudman) 흑색종, S91 흑색종, 하딩-파세이 (Harding-Passey) 흑색종, 연소성 흑색종, 악성 흑점 흑색종, 악성 흑색종, 결절 흑색종, 손발톱밑 흑색종 및 표층 확산성 흑색종을 포함한다.
"암종"은 주변 조직에 침투되어 전이를 일으키는 경향이 있는 상피 세포로 이루어진 악성의 신생 성장을 의미한다. 예시적인 암종은 예를 들어 선포 세포 암종, 포도상 암종, 선낭성 암종, 선양낭성 암종, 선암종, 부신피질의 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종, 기저 세포 암종, 기저세포성 암종, 기저 모양 암종, 기저편평 세포 암종, 기관지폐포 암종, 세기관지성 암종, 기관지원성 암종, 대뇌모양 암종, 쓸개관세포 암종, 융모막 암종, 콜로이드 암종, 여드름세포 암종, 자궁체부 암종, 사상 암종, 갑옷 암종, 피각 암종, 원통형 암종, 원통형 세포 암종, 관 암종, 경성 암종, 배아세포성 암종, 대뇌 수질성 암종, 표피모양 암종, 선양 상피 암종, 외장성 암종, 궤양외 암종, 섬유구조 암종, 젤라틴형 암종, 젤라틴 암종, 거대 세포 암종, 거대 세포성 암종, 선암종, 과립 세포 암종, 모기질 (hair-matrix) 암종, 혈액모양 암종, 간세포 암종, 휘틀 (Hurthle) 세포 암종, 유리질 암종, 부신모양 암종, 영아 배아세포성 암종, 동소내 암종 (carcinoma in situ), 표피내 암종, 상피내 암종, 크로라페쳐 (Krorapecher) 암종, 쿨치츠키 (Kulchitzky)-세포 암종, 대세포 암종, 수정체 암종, 수정체성 암종, 지방종성 암종, 림프 상피성 암종, 수질 암종, 수질성 암종, 멜라닌 암종, 연성 암종, 뮤신 암종, 뮤시파룸 암종 (carcinoma muciparum), 점액 세포 암종, 점액 표피 모양 암종, 점막층 암종, 점액성 암종, 점액종성 암종, 비인두 암종, 귀리 세포 암종, 골화성 암종, 뼈모양 암종, 유두상 암종, 문맥주위 암종, 침투전 (preinvasive) 암종, 가시 세포 암종, 펄프형 (pultaceous) 암종, 신장 세포 암종, 예비 세포 암종, 육종성 암종, 슈나이더 (schneiderian) 암종, 경화 암종, 음낭 암종, 반지 세포 암종, 단순 암종, 작은 세포 암종, 감자 모양 암종, 구형 세포 암종, 방추 세포 암종, 해면체모양 암종, 편평 암종, 편평 세포 암종, 현 (string) 암종, 모세혈관확장성 (telangiectacticum) 암종, 모세혈관확장 암종 (carcinoma telangiectodes), 이행 세포 암종, 결절성 암종, 결절 암종, 사마귀모양 암종 및 융모 암종을 포함한다.
"백혈병"은 혈액-생성 장기의 진행성 악성 질병을 의미하고, 일반적으로 혈액 및 골수 중의 백혈구 및 이의 전구체가 기형적으로 증식 및 발달하는 특징이 있다. 일반적으로, 백혈병은 임상적으로 다음과 같이 분류된다: (1) 질환의 지속 기간 및 특징: 급성 또는 만성, (2) 관련 세포의 종류: 골수성 (골수 기원성), 림프성 (림프 기원성) 또는 단핵세포성, (3) 혈액 중의 비정상 세포수의 증가 여부: 백혈병 또는 무백혈병 (아백혈병). 백혈병은 예를 들어 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 혈구증가성 (leukocythemic) 백혈병, 호염기구성 백혈병, 모세포 백혈병, 소 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 피부 백혈병, 배아세포성 백혈병, 호산구성 백혈병, 그로스 (Gross) 백혈병, 모발상 세포성 백혈병, 혈구모세포성 백혈병 (hemoblastic leukemia), 혈구 모세포성 백혈병, 조직구성 백혈병, 줄기 세포성 백혈병, 급성 단핵세포성 백혈병, 백혈구 감소성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 림프모세포성 백혈병, 림프구성 백혈병, 림프 기원성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만세포성 백혈병, 거대핵세포 백혈병, 미세골수모세포 백혈병, 단핵세포성 백혈병, 골수모세포 백혈병, 골수구성 백혈병, 골수성 과립구성 백혈병, 골수단핵세포성 백혈병, 니젤리 (Naegeli) 백혈병, 혈장 세포 백혈병, 혈장세포성 백혈병, 형질세포성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 리더 (Rieder) 세포 백혈병, 실링 (Schilling) 백혈병, 줄기 세포 백혈병, 아백혈병성 백혈병 및 미분화 세포 백혈병을 포함한다.
추가적인 암은 예를 들어 호지킨병, 비호지킨 림프종, 다발 골수종, 신경모세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 원발 혈소판 증가증, 원발 거대글로불린혈증, 소세포 폐종양, 원발 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 카르시노이드 (carcinoid), 단일 (unary) 방광암, 전암성 피부병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경모세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신피질암 및 전립선암을 포함한다.
항체 구조
기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 각각의 쌍이 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는, 폴리펩티드 사슬의 두개의 동일한 쌍으로 이루어진다. 각각의 사슬의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 1차적으로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그보다 많은 아미노산의 가변 구역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시-말단 부분은 효과기 기능을 1차적으로 담당하는 불변 구역을 규정한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 구역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 구역에 의해 연결되고, 또한 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 구역을 포함한다 (일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)] (모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참고로 포함됨)을 참고). 각각의 경쇄/중쇄쌍의 가변 구역은 항체 결합 부위를 형성한다.
따라서, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다.
사슬은 모두 상보성 결정 구역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 구역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 구역 (FR)의 동일한 일반적인 구조를 보인다. 각각의 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 특이적인 에피토프에 대한 결합이 가능하도록 프레임워크 구역에 의해 정렬된다. 경쇄 및 중쇄는 모두 N-말단으로부터 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 지정은 문헌 ([Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)], 또는 [Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987]; [Chothia et al., Nature 342: 878-883, 1989])의 정의에 따른다.
이중특이적 또는 이중기능적 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하여 다양한 방법에 의해 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, 1990], [Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992])을 참고한다). 또한, 이중특이적 항체는 "디아바디 (diabody)" (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448, 1993) 또는 "야누신 (Janusin)" ([Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991] 및 [Traunecker et al., Int J Cancer 7:51-52, 1992])으로 형성될 수 있다. 이중특이적 항체의 생성은 통상적인 항체의 생산에 비해 비교적 노동력을 많이 필요로 하는 과정일 수 있고, 이중특이적 항체의 수율 및 순도가 일반적으로 더 낮다. 이중특이적 항체는 단일 결합 부위를 갖는 단편 (예를 들어, Fab, Fab', 및 Fv)의 형태로 존재하지 않는다.
FAB 또는 scFV 파지 라이브러리
리간드 또는 전이성 세포 상의 세포 표면 수용체, 예를 들어, IGF-I, IGF-II, 또는 IGF-1 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 조성물의 확인을 위한 파지 디스플레이 라이브러리를 위한 방법은 Fab 또는 단일쇄 Fv (scFv) 파지-라이브러리의 사용이었다 (예를 들어, 문헌 ([Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988]; [Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990]; [Zhang et al., J. Virol. 78: 9233-9242, 2004]). 박테리오파지 코트 단백질 상에 디스플레이되는 Fab 또는 scFv 라이브러리의 다양한 실시태양이 설명된 바 있다. 개선된 파지 디스플레이 방법도 예를 들어 본원에 참고로 포함된 WO96/06213 및 WO92/01047 (메디칼 리서치 카운슬 (Medical Research Council) 등) 및 WO97/08320 (모포시스 (Morphosys))에 기재된 바와 같이 알려져 있다. Fab 라이브러리의 디스플레이는 예를 들어 WO92/01047 (CAT/MRC) 및 WO91/17271 (아피맥스 (Affymax))에 기재된 바와 같이 알려져 있다.
항체 또는 항체 단편이 파지 또는 파지미드 입자의 표면 상에 존재할 것이기 때문에, 디스플레이 벡터 내로 클로닝되는 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은 우수한 결합 활성을 유지한 변이체를 확인하기 위해서 전이성 세포와 회합된 적절한 항원, 예를 들어 세포 표면 수용체 또는 전이성 종양 세포 상의 세포 표면 수용체에 대한 리간드에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]을 참고한다. 예를 들어, Fab 단편의 경우에, 경쇄 및 중쇄 Fd 생성물은 lac 프로모터의 제어 하에 놓이고, 각각의 사슬은 세균 숙주의 세포질 공간으로 유도되도록 만들기 위해 그 사슬에 융합된 리더 신호를 갖는다. 세포질 공간에서 항체 단편이 적절하게 조립될 수 있을 것이다. 중쇄 단편은 조립된 항체 단편이 새로 제조된 파지 또는 파지미드 입자의 코트 내로 혼입될 수 있도록 하는 파지 코트 단백질 도메인과의 융합체로서 발현된다. 새로운 파지미드 입자의 생성에는 모든 필요한 파지 유전자를 함유하는 헬퍼 파지의 첨가를 필요로한다. 항체 단편의 라이브러리가 일단 파지 또는 파지미드 표면 상에 제시되면, 패닝 (panning)으로 불리는 과정이 수행된다. 이는 i) 파지 또는 파지미드 입자의 표면 상에 디스플레이된 항체를 목적하는 항원에 결합시키고, ii) 비-결합물질을 세척 제거하고, iii) 결합된 입자를 항원으로부터 용출하고, iv) 추가의 선택 라운드를 위한 농축된 풀을 증폭하기 위해 용출된 입자를 새로운 세균 숙주에 노출시키는 공정이다. 전형적으로, 항체 클론을 특이적 결합에 대해 스크리닝하기 전에 3 또는 4 라운드의 패닝을 수행한다. 상기 방식으로, 파지/파지미드 입자는 결합 표현형 (항체)과 유전자형 (DNA)의 연계를 허용하고, 항체 디스플레이 기술을 성공적으로 사용할 수 있게 한다. 그러나, 예를 들어 항체 단편 라이브러리의를 선택 및(또는) 스크리닝을 위해 용해 파지 벡터 (변형된 T7 또는 Lambda Zap 시스템) 내로 클로닝하는 상기 인간화 과정을 위해 다른 벡터 포맷이 사용될 수 있다.
목적하는 하이브리드 항체 및(또는) 하이브리드 항체 단편의 선택 후, 이들은 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 원핵 또는 진핵 세포 발현 등에 의해 큰 부피로 생산될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 항체 또는 단편은, CDR 및 필요한 경우에 원래의 종 항체 결합 특이성을 보유하기 위해 필요한 가변 구역 프레임워크의 최소 부분 (본원에 기재된 기술에 따라 공학적으로 처리됨)이 기원하는 종의 항체로부터 유래하고 항체의 나머지는 본원에 기재된 바와 같이 조작되어 하이브리드 항체 중쇄의 발현을 위한 벡터를 생산할 수 있는 표적 종 면역글로불린으로부터 유래하는 항체 중쇄를 코딩하는 발현 벡터를 제작하기 위한 통상적인 기술에 의해 생산될 수 있다.
상세한 실시태양에서, Fab 또는 단일쇄 Fv (scFv) 항체 라이브러리는 상이한 암 질병이 존재하는 5, 10, 15, 또는 20명 이상의 환자의 말초혈 림프구로부터 제조할 수 있다. 이어서, 완전 인간 고친화도 Fab 또는 scFv 항체는 합성 시알릴 Lewisx 및 Lewisx BSA 컨쥬게이트를 사용하여 선택할 수 있다. 한 연구에서, 상기 인간 scFv 항체는 ELISA, BIAcore, 및 췌장 선암종 세포의 세포 표면에 대한 유동 세포 결합에 의해 입증되는 바와 같이 시알릴 Lewisx 및 Lewisx에 대해 특이적이었다. 뉴클레오티드 서열결정은 적어도 4개의 특유한 scFv 유전자가 수득되었음을 보여주었다. Kd 값은 1.1 내지 6.2 x 10-7 M이었고, 이것은 2차 면역 반응에서 유도된 mAb의 친화도와 대등하였다. 상기 항체는 탄수화물 항원의 구조 및 기능을 분석하기 위해 및 인간 종양 질병의 치료시에 가치있는 시약일 수 있다 (Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 6953-6958, 1999).
추가의 상세한 실시태양에서, 파지 디스플레이된 조합 항체 라이브러리를 사용하여 전이성 세포와 회합된 적절한 항원, 예를 들어, 세포 표면 수용체 또는 전이성 종양 세포 상의 세포 표면 수용체에 대한 리간드에 대한 매우 다양한 항체를 생성시키고 선택할 수 있다. 파지 코트 단백질 pVII 및 pIX를 사용하여 항체 Fv 구역의 이종이량체 (heterodimeric) 구조를 디스플레이할 수 있다. 상기 기술의 많은 특징은 필라멘트성 박테리오파지의 pIX 상에 디스플레이된 4.5 x 109 개의 멤버의 큰 인간 Fab 또는 단일쇄 Fv (scFv) 라이브러리를 제작하기 위해 확장되었다. 또한, 라이브러리의 다양성, 질 및 유용성은 6개의 상이한 단백질 항원에 대한 Fab 또는 scFv 클론이 선택에 의해 입증되었다. 주목할 만한 사실은, 90% 초과의 선택된 클론이 겨우 3 라운드의 패닝 후에 그들의 각각의 항원에 대한 양성 결합을 보였다는 점이다. 분석된 Fab 또는 scFv는 또한 친화도가 높은 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 운동학 분석 (BIAcore)에 의해 스타필로코커스 (staphylococcus) 장독소 B 및 콜레라 독소 B 서브유닛에 대한 Fab 또는 scFv가 각각 나노몰 및 나노몰 미만의 해리 상수를 가졌고, 면역화로부터 얻은 mAb의 친화도에 비해 동등하거나 이를 초과하는 친화도를 부여함이 밝혀졌다. 또한, 높은 특이성은 뚜렷하게 구별되는 단백질 사이뿐만 아니라, 보다 밀접하게 관련되는 단백질, 예를 들어, 리시누스 코뮤니스 (Ricinus communis) ("리신") 아글루티닌 (RCA6O 및 RCA120) (둘 사이의 서열 상동성이 80%를 초과하지만) 사이에서도 달성되었다. 이 결과는 pIX-디스플레이 라이브러리의 성능이 pIII-디스플레이 포맷의 성능을 초과하고, 매우 다양한 표적 항원의 패닝을 위해 이상적으로 적합하게 만든다는 것을 제안하였다 (Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12612-12616, 2001).
항체 또는 다른 결합제와 항원 사이의 특이적인 결합은 적어도 10-6 M의 결합 친화도를 의미한다. 바람직한 결합제는 적어도 약 10-7 M, 바람직하게는 10-8 M 내지 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 또는 10-12 M의 친화도로 결합한다. 용어 에피토프는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결정자를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성 표면기로 구성되고, 대체로 특이적인 3차원 구조적 특징, 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는 비입체형태적 에피토프가 아니라 입체형태적 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실된다는 점에서 구별된다.
"에피토프"는 하나 이상의 항체의 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 구역에서 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 인식되어 결합될 수 있는, 임의의 분자의 일부를 의미한다. 에피토프는 대체로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학 활성 표면기로 구성되고, 특이적인 3차원 구조적 특징, 및 특이적인 전하 특징을 갖는다. "억제 및(또는) 중화 에피토프"는 항체에 의해 결합될 때, 생체 내에서, 시험관 내에서 또는 계내에서 (in situ), 보다 바람직하게는 생체 내에서 에피토프를 포함하는 분자 또는 유기체의 IGF-I 또는 IGF-II의 IGF-1 수용체에 대한 결합을 포함하는 생물학적 활성을 상실시키는 에피토프를 의미한다. 항체는 해리 상수가 1 μM 미만, 바람직하게는 100 nM 미만, 가장 바람직하게는 10 nM 미만일 때 특이적으로 결합하는 항원으로 언급된다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는 비입체형태적 에피토프가 아니라 입체형태적 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실된다는 점에서 구별된다.
본 발명의 항체, 및 그의 단편 및 구역에 의해 인식되는 에피토프는 항-IGF-I 또는 IGF-II 활성을 갖는 본 발명의 항체 및 그의 단편 및 가변 구역에 의해 인식되고(되거나) 결합하는 IGF-I 또는 IGF-II의 지형적 (topographical) 또는 3차원 에피토프를 제공하는, IGF-I 또는 IGF-II의 다음 아미노산 서열의 하나 또는 둘 모두의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 5개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다: IGF-I 또는 IGF-II 중화 및(또는) 억제 활성을 결정하기 위한 스크리닝 방법도 본 발명에서 제공된다. 본 발명의 문맥에서, 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 중화 활성 또는 IGF-I 또는 IGF-II 억제 활성은 IGF-I 또는 IGF-II의 적어도 하나의 생물학적 활성을 차단하는 IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물의 능력, 예를 들어 IGF-I 또는 IGF-II의 IGF-1 수용체에 대한 결합의 억제, 세포내 프로세싱, 예를 들어 전사, 번역 또는 번역후 변형, 세포 표면 상의 발현, 생활성 IGF-I 또는 IGF-II의 분비 또는 조립에 의한 IGF-I 또는 IGF-II의 생산 차단을 의미한다. 추가로, IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물은 IGF-I 또는 IGF-II 생산의 상향조절 또는 하향조절을 수반하는 것과 같은 대사 경로의 조절의 유도에 의해 작용할 수 있다. 별법으로, IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물은 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 세포 감수성을 감소시킴으로써 상기 감수성을 조정할 수 있다. IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물은 항체, 또는 그의 단편 또는 부분, IGF-I 또는 IGF-II 활성을 시험관 내에서, 계내에서 또는 생체 내에서 중화시키고 본 발명에 따라 사용될 경우 IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물로 간주되는 펩티드, 펩티드모방체 화합물 또는 유기 모방체 화합물로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물의 IGF-I 또는 IGF-II 중화 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 스크리닝 방법은 시험관 내 또는 생체 내 분석을 포함할 수 있다. 상기 시험관 내 분석은 (i) 시험관내 MCF-7 유방암 세포 분석에서 약 4 nM 이상의 항체 농도에서 IGF-1 수용체 인산화의 억제; (ii) IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 결합 또는 IGF-II 결합의 억제; 또는 (iii) 세포 이동 분석에서 세포 이동의 억제에 대한 분석을 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, IGF-I 또는 IGF-II 중화 화합물의 IGF-I 또는 IGF-II 중화 활성의 생체 내 시험은 본원에 기재된 바와 같이 시험관내 MCF-7 유방암 세포 분석에서 약 4 nM 이상의 항체 농도에서 IGF-1 수용체 인산화의 억제에 대한 시험관 내 분석을 사용하여 시험할 수 있다.
"중화"는 결합이 발생할 경우 인간 IGF-I 또는 IGF-II의 그의 특이적 수용체인 IGF-1R에 대한 결합을 억제하거나, 또는 IGF-I 또는 IGF-II의 그의 수용체를 통한 신호 전달을 억제함으로써 IGF-I 또는 IGF-II 활성을 억제하는 항체를 의미한다. mAb는 MCF-7 유방암 세포의 인산화 분석으로 측정시에 IGF-I 또는 IGF-II 활성 억제 효과가 90%, 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 100%일 경우에 중화능이 있는 것이다.
"물질"은 본원에서 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터의 추출물을 나타내기 위해 사용된다.
"변경된 항체"는 선택된 숙주 세포에서의 발현에 의해 얻을 수 있는, 변경된 면역글로불린 코딩 구역에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 상기 변경된 항체는 공학적으로 처리된 항체 (예를 들어, 키메라 (chimera) 또는 인간화 항체) 또는 면역글로불린 불변 구역의 전체 또는 일부가 결여된 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, 또는 F(ab)2 등이다.
"변경된 면역글로불린 코딩 구역"은 본 발명의 변경된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 변경된 항체가 CDR-그라프팅된 항체 또는 인간화 항체인 경우에, 비-인간 면역글로불린으로부터의 상보성 결정 구역 (CDR)을 코딩하는 서열은 인간 가변 프레임워크 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 파트너 내로 삽입된다. 임의로, 제1 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너에 작동가능하게 연결된다.
"고 친화도"는 항체가 표면 플라스몬 공명에 의해 결정할 때 인간 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 Kd가 3.5 X 1O-11 M 이하인 것을 특징으로 하는 결합 친화도를 갖는다는 것을 의미한다.
"인간 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 결합 특이성"은 인간 IGF-I 또는 인간 IGF-II에 대한 고 친화도를 의미한다. 모노클로날 항체 m705 및 m706은 인간 IGF-I에 대한 높은 결합 특이성을 갖고, 인간 인슐린에 결합하지 않는다. 모노클로날 항체 m708 및 m708.2는 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II에 대한 높은 결합 특이성을 갖고, 인간 인슐린에 결합하지 않는다.
용어 Fv, Fc, Fd, Fab, 또는 F(ab)2는 그들의 표준 의미로 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)] 참조).
"공학적으로 처리된 항체"는 변경된 항체 종류, 즉, 선택된 수여 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인의 일부가 선택된 에피토프에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 공여 항체로부터의 유사한 부분으로 대체된 전장 합성 항체 (예를 들어, 항체 단편이 아니라 키메라 또는 인간화 항체)를 설명한다. 예를 들어, 상기 분자는 비변형된 경쇄 (또는 키메라 경쇄)와 회합된 인간화 중쇄 또는 비변형된 중쇄와 회합된 인간화 경쇄를 특징으로 하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 공학적으로 처리된 항체는 공여 항체 결합 특이성을 보유하기 위한 수여 항체 경쇄 및(또는) 중쇄 가변 도메인 프레임워크 구역을 코딩하는 핵산 서열의 변경이라는 특징을 가질 수 있다. 상기 항체는 수여 항체로부터의 하나 이상의 CDR (바람직하게는 모든)의 본원에서 설명되는 공여 항체로부터의 CDR로의 치환을 포함할 수 있다.
"키메라 항체"는 수여 항체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 구역과 함께, 공여 항체로부터 유래된 자연 발생 가변 구역 (경쇄 및 중쇄)을 포함하는 공학적으로 처리된 항체 종류를 의미한다.
"인간화 항체"는 그의 CDR이 비-인간 공여 면역글로불린으로부터 유래되고 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분은 하나의 (또는 하나 초과의) 인간 면역글로불린(들)로부터 유래되는 공학적으로 처리된 항체의 종류를 의미한다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하기 위해 변경될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032, 1989], [Hodgson et al., Bio/Technology, 2: 421, 1991] 참조).
"공여 항체"는 변경된 면역글로불린 코딩 구역, 및 공여 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특징을 갖는 생성되는 발현된 변경 항체를 제공하기 위해서 그의 가변 구역, CDR, 또는 그의 다른 기능적 단편 또는 유사체의 핵산 서열을 제1 면역글로불린 파트너에게 제시하는 항체 (모노클로날, 또는 재조합)를 의미한다.
"수여 항체"는 그의 중쇄 및(또는) 경쇄 프레임워크 구역 및(또는) 그의 중쇄 및(또는) 경쇄 불변 구역을 코딩하는 모든 (또는 임의의 부분의, 바람직하게는 모든) 핵산 서열을 제1 면역글로불린 파트너에게 제시하는, 공여 항체에 이종성인 항체 (모노클로날, 또는 재조합)를 의미한다. 바람직하게는, 인간 항체는 수여 항체이다.
"CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 구역인 항체의 상보성 결정 구역 아미노산 서열로서 규정된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)] 참조). 면역글로불린의 가변 부분에 3개의 중쇄 및 3개의 경쇄 CDR (또는 CDR 구역)이 존재한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CDR"은 3개의 모든 중쇄 CDR, 또는 3개의 모든 경쇄 CDR (또는 적절한 경우 모든 중쇄 및 모든 경쇄 CDR)을 의미한다.
CDR은 항체의 항원 또는 에피토프에 대한 결합을 위한 접촉 잔기의 대부분을 제공한다. 본 발명에서 목적하는 CDR은 공여 항체 가변 중쇄 및 경쇄 서열로부터 유래되고, 자연 발생 CDR의 유사체를 포함하며, 상기 유사체도 그들이 유래되는 공여 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화능을 공유하거나 보유한다.
"항원 결합 특이성 또는 중화능의 공유"는 예를 들어 mAb m705, m706, m708, 또는 m708.2이 특정 수준의 항원 친화도에 의해 특성화될 수 있지만, 적절한 구조적 환경에서 m705, m706, m708, 또는 m708.2의 핵산 서열에 의해 코딩되는 CDR은 보다 낮거나 보다 높은 친화도를 가질 수 있음을 의미한다. 그럼에도 불구하고, m705, m706, m708, 또는 m708.2의 CDR은 상기 환경에서 본래의 모노클로날 항체와 동일한 에피토프(들)를 인식할 것이다. 예시적인 중쇄 CDR은 서열 1; 서열 3; 서열 5; 서열 7을 포함하고, 예시적인 경쇄 CDR은 서열 2; 서열 4; 서열 6 및 서열 8을 포함한다. 예를 들어, 표 1 및 2 참조.
"기능적 단편"은 단편이 유래되는 항체와 동일한 항원 결합 특이성 및(또는) 중화능을 보유하는 부분적인 중쇄 또는 경쇄 가변 서열 (예를 들어, 면역글로불린 가변 구역의 아미노 또는 카르복시 말단에서의 작은 결실)이다.
"유사체"는 적어도 하나의 아미노산에 의해 변형된 아미노산 서열이고, 상기 변형은 몇개의 아미노산 (즉, 10개 이하)의 화학적 또는 치환 또는 재배열이고, 아미노산 서열이 비변형된 서열의 생물학적 특징, 예를 들어, 항원 특이성 및 고 친화도를 보유하도록 허용한다. 예를 들어, (침묵 (silent)) 돌연변이는 특정 엔도뉴클레아제 제한 부위가 CDR-코딩 구역 내에 또는 주위에 생성될 때 치환을 통해 제작될 수 있다.
또한, 유사체는 대립유전자 변이로서 발생할 수도 있다. "대립유전자 변이 또는 변형"은 본 발명의 아미노산 또는 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열의 변경이다. 상기 변이 또는 변형은 유전자 코드의 다의성 (degeneracy)에 의해 발생할 수 있거나 또는 목적하는 특징을 제공하도록 인위적으로 공학적으로 처리될 수 있다. 상기 변이 또는 변형은 임의의 코딩되는 아미노산 서열을 변경할 수 있거나 변경하지 않을 수 있다.
"담체 물질" 또는 "효과기 물질"은 변경된 항체, 및(또는) 공여 항체의 천연 또는 합성 경쇄 또는 중쇄 또는 공여 항체의 다른 단편이 통상적인 수단에 의해 회합될 수 있는 비-단백질 담체 분자를 의미한다. 상기 비-단백질 담체는 진단 분야에서 사용되는 통상적인 담체, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 다른 플라스틱 비드, 예를 들어 BIAcore(등록상표) [파마시아 (Pharmacia)] 시스템에 사용되는 다당체, 또는 의료 분야에 유용하고 인간 및 동물에 투여하기 안전한 다른 비-단백질 물질을 포함할 수 있다. 다른 효과기 물질은 중금속 원자를 킬레이팅하기 위한 마크로사이클 (macrocycle), 또는 방사성 동위원소를 포함한다. 또한, 상기 효과기 물질, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 변경된 항체의 반감기를 증가시키는데 유용할 수 있다.
면역 반응의 성분은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 시험관 내에서 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 세포독성 T 림프구를 방사성 표지된 표적 세포와 함께 인큐베이팅할 수 있고, 상기 표적 세포의 용해는 방사성의 방출에 의해 검출할 수 있고; (2) 헬퍼 T 림프구는 항원 및 항원 제시 세포와 함께 인큐베이팅할 수 있고, 시토킨의 합성 및 분비는 표준 방법에 의해 측정될 수 있고 (Windhagen et al., Immunity, 2: 373-80, 1995); (3) 항원 제시 세포는 전체 단백질 항원과 함께 인큐베이팅할 수 있고, MHC 상의 항원의 제시는 T 림프구 활성화 분석 또는 생물리적 방법에 의해 검출할 수 있고 (Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989); (4) 비만 세포는 그들의 Fc-엡실론 수용체와 가교결합하는 시약과 함께 인큐베이팅할 수 있고, 히스타민 방출은 효소 면역분석에 의해 측정할 수 있다 (Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983).
이와 유사하게, 모델 유기체 (예를 들어, 마우스) 또는 인간 환자에서 면역 반응의 산물도 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, (1) 예방접종에 반응한 항체의 생산은 임상 실험실에서 현재 사용되는 표준 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 쉽게 검출될 수 있고; (2) 면역 세포의 염증 부위로의 이동은 피부의 표면을 긁어내고 긁은 부위 상에서 이동하는 세포를 포획하기 위해 멸균 용기를 배치함으로써 검출할 수 있고 (Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988); (3) 유사분열 물질 또는 혼합 림프구 반응에 반응한 말초혈 단핵 세포의 증식은 3H-티미딘을 사용하여 측정할 수 있고; (4) PBMC에서 과립구, 대식세포, 및 다른 포식세포의 포식능은 PMBC를 표지된 입자와 함께 웰 내에 배치함으로써 측정할 수 있고 (Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988); (5) 면역계 세포의 분화는 PBMC를 CD 분자, 예를 들어 CD4 및 CD8에 대한 항체로 표지하고 상기 마커를 발현하는 PBMC의 비율을 측정함으로써 측정할 수 있다.
편의상, 면역 반응은 종종 본 발명에서 "1차" 또는 "2차" 면역 반응으로 설명된다. "보호" 면역 반응으로도 설명되는 1차 면역 반응은 특정 항원, 예를 들어, 세포 표면 수용체, 리간드, IGF-I, IGF-II, 또는 IGF-1 수용체에 대한 일부의 최초 노출 (예를 들어 최초 "면역화")의 결과로서 개체에서 발생하는 면역 반응을 의미한다. 상기 면역화는 예를 들어 항원에 대한 자연적인 일부 노출의 결과로서 (예를 들어, 항원을 보이거나 제시하는 일부 병원체에 의한 최초 감염으로부터) 또는 개체에서 일부 종양의 암 세포 (예를 들어, 전이성 유방암 세포)에 의해 제시되는 항원으로부터 발생할 수 있다. 별법으로, 면역화는 개체를 항원을 함유하는 백신으로 예방접종함으로써 발생할 수 있다. 예를 들어, 백신은 암 세포, 예를 들어, 전이성 유방암 세포로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 암 백신일 수 있다.
1차 면역 반응은 시간이 경과함에 따라 약화 또는 완화될 수 있고, 심지어 소멸되거나 적어도 검출될 수 없을 정도로 완화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 "면역 기억 반응"으로도 본원에서 설명되는 "2차" 면역 반응에 관련된다. 용어 2차 면역 반응은 1차 면역 반응이 이미 발생한 후에 개체에서 유도되는 면역 반응을 의미한다. 따라서, 2차 면역 반응은 예를 들어 약화 또는 완화된 기존의 면역 반응을 향상시키거나 소멸되거나 더이상 검출될 수 없는 이전의 면역 반응을 재생성시키기 위해 유도될 수 있다. 2차 면역 반응을 유도하기 위해 투여될 수 있는 물질은 1차 면역 반응을 "부스팅"하는 것으로 언급될 수 있기 때문에 "부스터 (booster)"로 언급된다.
제한하고자 하는 것이 아니라 단지 한 예로서, 2차 면역 반응은 1차 면역 반응을 유도한 개별 항원을 재도입함으로써 (예를 들어, 백신을 재투여함으로써) 유도될 수 있다. 그러나, 항원에 대한 2차 면역 반응은 또한 실제 항원을 포함할 수 없는 다른 물질의 투여에 의해서도 유도될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체를 개체에게 투여함으로써 2차 면역 반응을 강화시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 실제 항원은 반드시 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체와 함께 투여될 필요가 없고, 항체를 함유하는 조성물은 반드시 항원을 함유할 필요가 없다. 2차 또는 기억 면역 반응은 체액 (항체) 반응 또는 세포성 반응일 수 있다. 2차 또는 기억 체액 반응은 항원의 제1 제시시에 생성된 기억 B 세포의 자극시에 발생한다. 지연형 과민 (DTH) 반응은 CD4+ 세포에 의해 매개되는 세포성 2차 또는 면역 기억 반응의 종류이다. 항원에 대한 제1 노출은 면역계를 프라이밍하고, 추가의 노출(들)은 DTH를 야기한다.
"면역학적 교차반응성" 또는 "면역학적 반응성"은 항원이 동일한 ("면역학적 반응성") 또는 상이한 ("면역학적 교차반응성") 항원을 사용하여 생성시킨 항체와 특이적으로 반응성임을 의미한다. 일반적으로, 항원은 IGF-I, IGF-II, 또는 IGF-1 수용체, 또는 그의 하위서열이다.
"면역학적 반응 조건"은 항원의 특정 에피토프에 대해 생성된 항체가, 항체가 실질적으로 모든 다른 에피토프에 결합하는 것보다 검출가능하게 더 큰 수준으로, 일반적으로 배경 결합의 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배 더 큰 수준으로 특정 에피토프에 결합할 수 있는 조건을 의미한다. 면역학적 반응 조건은 항체 결합 반응의 포맷에 따라 결정되고, 전형적으로는 면역분석 포맷 및 조건의 설명에 대한 면역분석 프로토콜 ([Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988] 참조)에서 이용되는 것이다.
"세포 표면 수용체"는 신호를 수용하고 세포의 형질막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 의미한다. 본 발명의 "세포 표면 수용체"의 예는 전이성 세포 상의 IGF-1 수용체이다.
"비특이적 T 세포 활성화"는 그들의 항원 특이성에 독립적인 T 세포의 자극을 나타낸다.
"효과기 세포"는 면역 반응의 인식 및 활성화 기와 달리 면역 반응의 효과기 기에 관련되는 면역 세포를 의미한다. 예시적인 면역 세포는 골수성 또는 림프성 기원의 세포, 예를 들어, 림프구 (예를 들어, B 세포 및 T 세포, 예를 들어 세포용해 T 세포 (CTL)), 킬러 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포, 및 호염기구를 포함한다. 효과기 세포는 특이적인 Fe 수용체를 발현하고, 특이적인 면역 기능을 수행한다. 효과기 세포, 예를 들어 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 유발할 수 있는 호중구는 ADCC를 유발할 수 있다. 예를 들어, FcαR을 발현하는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 및 림프구는 표적 세포의 특이적인 치사 및 다른 면역계 성분에 대한 항원의 제시, 또는 항원을 제시하는 세포에 대한 결합에 관여한다. 효과기 세포는 또한 표적 항원, 표적 세포, 전이성 암 세포, 또는 미생물을 포식할 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 Ab 또는 Ab 조성물에 의해 표적화될 수 있는 대상 (예를 들어, 인간 또는 동물) 내의 임의의 바람직하지 않은 세포를 의미한다. 표적 세포는 인간 IGF-1 수용체를 발현하거나 과다발현하는 세포일 수 있다. 인간 IGF-1 수용체를 발현하는 세포는 종양 세포, 예를 들어 유방암 세포 또는 전이성 유방암 세포를 포함할 수 있다.
전이성 암 세포, 예를 들어, 전이성 유방암 세포에 대한 항체 조성물의 목적하는 표적은 세포 표면 수용체, 성장 인자 수용체, IGF-I, IGF-II, IGF-1 수용체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다 (예를 들어, 문헌 ([Burtrum D., et al., Cancer Res., 63: 8912-8921, 2003]; [Lu et al., J. Biol. Chem. 279: 2856-2865, 2004]; [Miyamoto et al., Clin. Cancer Res. 11: 3494-3502, 2005]; [Goya et al., Cancer Research 64: 6252-6258, 2004] 참조). 항체는 항-개별특이형 항체 및 암, 예를 들어 전이성 암 및 전이성 유방암에 존재하는 자가항체를 포함한다. 다른 표적은 부착 단백질, 예를 들어 인테그린, 셀렉틴, 및 면역글로불린 수퍼패밀리 멤버이다 ([Springer, Nature, 346: 425-433, 1990]; [Osborn, Cell, 62: 3, 1990]; [Hynes, Cell, 69: 11, 1992]). 목적하는 다른 표적은 성장 인자 수용체 (예를 들어, FGFR, PDGFR, EGF, her/neu, NGFR, 및 VEGF) 및 그들의 리간드이다. 다른 표적은 G-단백질 수용체이고, 물질 K 수용체, 안지오텐신 수용체, α- 및 β-아드레날린 수용체, 세로토닌 수용체, 및 PAF 수용체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56: 625-649, 1987] 참조). 다른 표적은 이온 채널 (예를 들어, 칼슘, 나트륨, 칼륨 채널, 다약제 내성을 매개하는 채널 단백질), 무스카린성 수용체, 아세틸콜린 수용체, GABA 수용체, 글루타메이트 수용체, 및 도파민 수용체를 포함한다 (Harpold, 미국 특허 5,401,629 및 미국 특허 5,436,128 참조). 다른 표적은 시토킨, 예를 들어 인터류킨 IL-1 내지 IL- 13, 종양 괴사인자-α 및 -β, 인터페론 -α, -β 및 -γ, 종양 성장 인자 베타 (TGF-β), 콜로니 자극 인자 (CSF) 및 과립구 단핵구 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)이다 ([Aggrawal et al., eds., Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research, Blackwell Scientific, Boston, Mass., 1991] 참조). 다른 표적은 호르몬, 효소, 및 세포내 및 세포간 메신저, 예를 들어 아데닐 시클라제, 구아닐 시클라제, 및 포스포 리파제 C이다. 또한, 약물도 목적하는 표적이다. 표적 분자는 인간, 포유동물 또는 세균일 수 있다. 다른 표적은 항원, 예를 들어 미생물 병원체, 바이러스 및 세균, 및 종양 모두로부터의 단백질, 당단백질 및 탄수화물이다. 또다른 표적은 모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,366,241에 기재되어 있다. 표적에 의해 스크리닝된 일부 물질은 표적에 결합한다. 다른 물질은 표적에 대해 작용제로 작용하거나 표적을 길항한다.
항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체의 재조합 발현
IGF-1R에 대한 IGF-I 또는 IGF-II 결합을 억제하는 재조합 인간 항체는 본원에서 제시되는 내용을 기초로 하여 공지의 기술을 사용하여 본 발명에 따라 제공된다. 예를 들어, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. (1987, 1992, 1993)]; 및 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)])을 참고한다.
본 발명의 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체를 코딩하는 DNA는 적어도 하나의 중쇄 불변 구역 (CH), 중쇄 가변 구역 (VH), 경쇄 가변 구역 (VL) 및 경쇄 불변 구역 (CL)을 코딩하는 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 뮤린 V 구역 항원 결합 세그먼트를 코딩하는 DNA의 공급원으로서 염색체 유전자 단편의 사용에 대한 편리한 대안은 예를 들어 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:3439 (1987)] 및 [J. Immunology 139: 3521 (1987)])에 보고된 바와 같이 키메라 면역글로불린 유전자의 제작을 위한 cDNA의 사용이다. cDNA의 사용은 목적하는 단백질의 합성을 달성하기 위해서 숙주 세포에 적절한 유전자 발현 성분이 유전자와 조합될 것을 필요로 한다. cDNA 서열이 적절한 RNA 스플라이싱 시스템이 결여된 세균 또는 다른 숙주에서 발현될 수 있기 때문에, cDNA 서열의 사용은 게놈 서열 (인트론을 포함하는)에 비해 유리하다.
상기 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 상기 기술은 잘 공지되어 있고, 예를 들어 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Wu, et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978)], 및 [Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (1987, 1993)])에 기재되어 있다.
유전자 코드는 다의성이기 때문에, 하나 초과의 코돈이 특정 아미노산을 코딩하도록 사용될 수 있다 (Watson, et al., 하기 문헌). 유전자 코드를 사용하여, 각각 아미노산을 코딩할 수 있는 하나 이상의 상이한 올리고뉴클레오티드를 확인할 수 있다. 특정 올리고뉴클레오티드가 실질적인 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체 코딩 서열을 구성할 가능성은 비정상적인 염기 페어링 관계 및 특정 코돈이 (특정 아미노산을 코딩하도록) 항-IGF-I 또는 IGF-II 항체 또는 단편을 발현하는 진핵 또는 원핵 세포에서 실제로 사용되는 빈도를 고려하여 추정할 수 있다. 상기 "코돈 사용 규칙"은 문헌 [Lathe, et al., J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985)]에 개시되어 있다. 상기 문헌의 "코돈 사용 규칙"을 사용하여, 단일 올리고뉴클레오티드, 또는 항-IGF-I 또는 IGF-II 가변 또는 불변 구역 서열을 코딩할 수 있는 이론적으로 "가장 가능성이 큰" 뉴클레오티드 서열을 함유하는 한 세트의 올리고뉴클레오티드가 확인된다.
때때로 아미노산 서열은 단일 올리고뉴클레오티드에 의해서만 코딩될 수 있지만, 종종 아미노산 서열은 유사한 올리고뉴클레오티드의 임의의 세트에 의해 코딩될 수 있다. 중요하게는, 상기 세트의 모든 멤버가 펩티드 단편을 코딩할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 따라서 펩티드 단편을 코딩하는 유전자와 동일한 올리고뉴클레오티드 서열을 잠재적으로 포함하는 반면에, 세트의 한 멤버만이 유전자의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 멤버는 세트 내에 존재하고 그 세트의 다른 멤버의 존재 하에서도 DNA에 혼성화할 수 있기 때문에, 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 단일 올리고뉴클레오티드를 사용하는 동일한 방식으로 올리고뉴클레오티드의 비분획화된 (unfractionated) 세트를 사용할 수 있다.
항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체 또는 가변 또는 불변 구역을 포함하는 단편을 코딩할 수 있는 이론적으로 "가장 가능성이 큰" 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드의 세트를 사용하여 "가장 가능성이 큰" 서열, 또는 서열의 세트에 혼성화할 수 있는 상보성 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 세트의 서열을 확인한다. 상기 상보성 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 가변 또는 불변 구역 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 유전자를 확인하여 단리하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다 (Sambrook et al., 하기 문헌).
가변 또는 불변 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 구역의 단편을 코딩할 수 있는 (또는 상기 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드의 세트에 상보성인) 적합한 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고뉴클레오티드의 세트를 확인하고 (상기한 절차를 이용하여), 합성하여 당업계에 공지된 수단에 의해 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체 또는 그의 가변 또는 불변 구역을 발현할 수 있는 세포로부터 유래된 DNA, 보다 바람직하게는, cDNA 제제에 혼성화시킨다. "가장 가능성이 큰" 가변 또는 불변 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 구역 펩티드 코딩 서열에 상보성인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 분자는 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 합성할 수 있다 ([Belagaje, et al., J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979)]; [Maniatis, et al., In: Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, Nierlich, et al., Eds., Acad. Press, NY (1976)]; [Wu, et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978)]; [Khorana, Science 203: 614-625 (1979)]). 추가로, DNA 합성은 자동 합성기를 사용하여 달성할 수 있다. 핵산 혼성화 기술은 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Sambrook et al. (하기 문헌)], 및 [Hayrnes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)])에 개시되어 있다. 상기 설명된 기술 또는 이와 유사한 기술을 사용하여 인간 알데히드 데히드로게나제 유전자 (Hsu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985)), 피브로넥틴 유전자 (Suzuki, et al., Bur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519-2524 (1985)), 인간 에스트로겐 수용체 유전자 (Walter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985)), 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (Pennica, et al., Nature 301: 214-221 (1983)) 및 인간 만기 태반 알카리성 포스파타제 상보성 DNA (Keun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719 (1985))의 클로닝을 성공적으로 수행할 수 있었다.
항-IGF-I 또는 항-IGF-II 가변 또는 불변 구역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝하는 대체 방법에서, 발현 벡터의 라이브러리는 DNA, 보다 바람직하게는 cDNA (항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체 또는 가변 또는 불변 구역을 발현할 수 있는 세포로부터)를 발현 벡터 내로 클로닝함으로써 제조된다. 이어서, 라이브러리를 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체, 예를 들어 m705, m706, m708, 또는 m708.2의 IGF-1R에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하고 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체 또는 그의 단편과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단백질을 발현할 수 있는 멤버에 대해 스크리닝한다. 상기 실시태양에서, 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 항체 또는 단편을 발현할 수 있는 세포로부터 DNA 또는 보다 바람직하게는 cDNA를 추출하고 정제한다. 정제된 cDNA를 단편화시켜 (전단, 엔도뉴클레아제 소화 등에 의해) DNA 또는 cDNA 단편의 풀 (pool)을 생성시킨다. 이어서, 상기 풀로부터의 DNA 또는 cDNA 단편을 발현 벡터 내로 클로닝하여, 그의 멤버가 각각 원핵 세포 (예를 들어, 세균) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물, 효모, 곤충 또는 진균)에서의 발현을 위해 람다 파지 라이브러리에서와 같이 특유한 클로닝된 DNA 또는 cDNA 단편을 포함하는 발현 벡터의 게놈 라이브러리를 생성시킨다 (예를 들어, 문헌 ([Ausubel, 하기 문헌], [Harlow, 하기 문헌], [Colligan, 하기 문헌]; [Nyyssonen et al. Bio/Technology 11: 591-595 (Can 1993)]; [Marks et al., Bio/Technology 11: 1145-1149, 1993]) 참조). 상기 가변 또는 불변 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 구역을 코딩하는 핵산을 단리한 후에, 핵산은 억제 활성을 갖는, IGF-I 또는 IGF-II에 결합하는 재조합 MAb를 제공하기 위해서 다른 불변 또는 가변 중쇄 또는 경쇄 코딩 핵산과 함께 숙주 세포에서 적절하게 발현될 수 있다. 상기 항체는 바람직하게는 항원 결합을 책임지는 상보성 결정 잔기를 갖는 프레임워크 잔기를 포함하는 뮤린 또는 인간 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 가변 구역을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 설명된 바와 같이 핵산에 의해 코딩되는 항-IGF-I 또는 항-IGF-II 가변 경쇄 또는 중쇄는 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 적어도 5개의 아미노산의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 뮤린 및 키메라 항체의 불변 (C) 구역, 단편 및 구역을 코딩하는 인간 유전자는 공지된 방법에 의해 인간 태아 간 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 인간 C 구역 유전자는 인간 면역글로불린을 발현하고 생산하는 것을 포함하여 임의의 인간 세포로부터 유래될 수 있다. 인간 CH 구역은 γ, μ, α, δ, 또는 ε, 및 그의 서브타입, 예를 들어 G1, G2, G3 및 G4를 포함하여 인간 H 사슬의 공지의 클래스 또는 이소형으로부터 유래될 수 있다. H 사슬 이소형은 항체의 다양한 효과기 기능을 담당하기 때문에, CH 구역의 선택은 목적하는 효과기 기능, 예를 들어 보체 고정, 또는 항체-의존 세포성 세포독성 (ADCC)에서의 활성에 의해 좌우된다. 바람직하게는, CH 구역은 감마 1 (IgG1), 감마 3 (IgG3), 감마 4 (IgG4), 또는 뮤 (IgM)로부터 유도된다.
인간 항체 및 항체의 인간화
인간 항체는 뮤린 또는 래트 가변 및(또는) 불변 구역을 갖는 항체와 연관된 특정 문제를 방지한다. 상기 뮤린 또는 래트 유래된 단백질의 존재는 항체의 신속한 소실을 야기할 수 있고, 환자에 의한 항체에 대한 면역 반응의 생성을 유발할 수 있다. 뮤린 또는 래트 유래된 항체의 이용을 방지하기 위해서, 설치류가 완전 인간 서열을 갖는 항체를 생산할 수 있도록 인간 항체 기능을 설치류 내에 도입함으로써 인간화 항체를 개발하거나 또는 완전 인간 항체를 생성시킬 수 있음이 제안되었다.
YAC 내의 메가 염기 크기의 인간 로커스를 클로닝하여 재구성하고 이를 마우스 생식세포 내로 도입하는 능력은 매우 큰 또는 정밀하지 않게 매핑된 로커스의 기능적 성분의 규명 및 인간 질병의 유용한 모델의 확립을 위한 효과적인 방법을 제공한다. 또한, 마우스 로커스를 그들의 인간 동등물로 치환하기 위한 상기 기술의 이용은 발달 동안 인간 유전자 산물의 발현 및 조절, 이들의 다른 시스템과의 소통, 및 질병 유도 및 진행에 대한 이들의 관련성에 대한 특유한 통찰력을 제공할 수 있다.
상기 전략의 중요한 실제 적용은 마우스 체액 면역계의 "인간화"이다. 인간 면역글로불린 (Ig) 로커스를 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 마우스 내로 도입하면 항체의 프로그래밍된 발현 및 조립 메카니즘 및 B-세포 발달에서 그의 역할을 연구할 수 있다. 또한, 상기 전략은 완전 인간 모노클로날 항체 (Mab)의 생산을 위한 이상적인 공급원을 제공하고, 인간 질병에서 항체 요법의 유망성을 실현하기 위한 중요한 이정표를 제시할 수 있다. 완전 인간 항체는 마우스 또는 마우스-유도체화된 Mab에 고유한 면역원성 및 알레르기 반응을 최소화시켜 투여된 항체의 효능 및 안전성을 증가시킬 것으로 기대된다. 완전 인간 항체의 사용은 반복된 항체 투여를 필요로 하는 만성 및 재발성 인간 질병, 예를 들어 염증, 자가면역 및 암의 치료에서 실질적인 잇점을 제공하는 것으로 예상할 수 있다.
상기 목표를 향한 하나의 방법은 마우스가 마우스 항체의 부재시에 인간 항체의 큰 레퍼토리를 생산할 것을 예상하면서 인간 Ig 로커스의 큰 단편을 갖는 마우스 항체 생산이 결여된 마우스 주를 공학적으로 처리하는 것이었다. 큰 인간 Ig 단편은 큰 가변 유전자 다양성 및 항체 생산 및 발현의 적절한 조절을 보존할 것이다. 항체 다양화 및 선택 및 인간 단백질에 대한 면역 내성의 결핍을 위한 마우스 기구 (machinery)를 이용함으로써, 상기 마우스주에서 재생된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 포함하여 목적하는 임의의 항원에 대해 높은 친화도 항체를 생성시켜야 한다. 하이브리도마 기술를 사용하여, 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 Mab를 쉽게 생산하고 선택할 수 있다.
상기 일반적인 전략은 1994년 간행된 문헌 ([Green et al., Nature Genetics 7: 13-21, 1994] 참조)에 기재된 바와 같이 본 발명자들의 제1 XenoMouse™ 주의 생성과 관련하여 입증되었다. XenoMouse™ 주는 각각 핵심적인 가변 및 불변 구역 서열을 포함하는 인간 중쇄 로커스 및 카파 경쇄 로커스의 245 kb 및 190 kb 크기의 생식세포 형상 단편을 포함하는 효모 인공 염색체 (YAC)로 공학적으로 처리되었다. YAC를 포함하는 인간 Ig은 항체의 재배열 및 발현을 위한 마우스 시스템에 적합한 것으로 입증되었고, 불활성화된 마우스 Ig 유전자를 치환할 수 있었다. 이것은 B-세포 발달을 유도하고, 완전 인간 항체의 성인-유사 인간 레퍼토리를 생성시키고, 항원-특이적 인간 Mab를 생성시키는 그의 능력에 의해 입증되었다. 상기 결과는 또한 보다 많은 수의 V 유전자, 추가의 조절 성분, 및 인간 Ig 불변 구역을 포함하는 인간 Ig 로커스의 보다 큰 부분의 도입이 감염 및 면역화에 대한 인간 체액 반응의 특징인 전체 레퍼토리를 실질적으로 재현할 수 있음을 제안하였다. 그린 (Green) 등의 연구는 최근에 각각 인간 중쇄 로커스 및 카파 경쇄 로커스의 메가 염기 크기의 생식세포 형상 YAC 단편의 도입을 통해 약 80% 초과의 인간 항체 레퍼토리를 도입하여 XenoMouse™ 마우스를 생성시키는 것으로 확장되었다. 그 개시내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156, 1997], [Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495, 1998]) 및 미국 특허 출원 08/759,620 (1996년 12월 3일 출원)을 참고한다.
상기 방법은 미국 특허 출원 07/466,008 (1990년 1월 12일 출원), 07/610,515 (1990년 11월 8일 출원), 07/919,297 (1992년 7월 24일 출원), 07/922,649 (1992년 7월 30일 출원), 08/031,801 (1993년 3월 15일 출원), 08/112,848 (1993년 8월 27일 출원), 08/234,145 (1994년 4월 28일 출원), 08/376,279 (1995년 1월 20일 출원), 08/430,938 (1995년 4월 27일 출원), 08/464,584 (1995년 6월 5일 출원), 08/464,582 (1995년 6월 5일 출원), 08/463,191 (1995년 6월 5일 출원), 08/462,837 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,853 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,857 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,859 (1995년 6월 5일 출원), 08/462,513 (1995년 6월 5일 출원), 08/724,752 (1996년 10월 2일 출원), 및 08/759,620 (1996년 12월 3일 출원)에서 추가로 논의되고 설명되어 있다. 또한, 문헌 ([Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156, 1997] 및 [Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495, 1998])을 참고한다. 또한, 유럽 특허 EP 0 463 151 B1 (1996년 6월 12일 등록 공고), 국제 특허 출원 공개 WO 94/02602 (1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 공개 WO 96/34096 (1996년 10월 31일 공개), 및 WO 98/24893 (1998년 6월 11일 공개)을 참고한다. 상기 특허, 출원 및 참고 문헌의 각각의 개시내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
대체 방법에서, 겐팜 인터내셔날, 인크. (GenPharm International, Inc.)를 포함하는 다른 연구자들은 "미니로커스 (minilocus)" 방법을 이용하였다. 미니로커스 방법에서, 외인성 Ig 로커스는 Ig 로커스로부터의 일부분 (개별 유전자)을 포함시킴으로써 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 구역, 및 제2 불변 구역 (바람직하게는 감마 불변 구역)은 동물 내로 삽입하기 위한 구성체로 형성된다. 상기 방법은 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 5,545,807 (Surani 등) 및 미국 특허 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 및 5,814,318 (각각 Lonberg 및 Kay), 미국 특허 5,591,669 (Krimpenfort 및 Berns), 미국 특허 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215 (Berns 등), 및 미국 특허 5,643,763 (Choi 및 Dunn), 및 미국 특허 출원 07/574,748 (GenPharm International) (1990년 8월 29일 출원), 07/575,962 (1990년 8월 31일 출원), 07/810,279 (1991년 12월 17일 출원), 07/853,408 (1992년 3월 18일 출원), 07/904,068 (1992년 6월 23일 출원), 07/990,860 (1992년 12월 16일 출원), 08/053,131 (1993년 4월 26일 출원), 08/096,762 (1993년 7월 22일 출원), 08/155,301 (1993년 11월 18일 출원), 08/161,739 (1993년 12월 3일 출원), 08/165,699 (1993년 10월 10일 출원), 08/209,741 (1994년 3월 9일 출원)에 기재되어 있다. 또한, 그 전부가 본원에 참고로 포함된 유럽 특허 0 546 073 B1, 국제 특허 출원 공개 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 및 WO 98/24884를 참고한다. 또한, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 ([Taylor et al., 1992], [Chen et al., 1993], [Tuaillon et al., 1993], [Choi et al., 1993], [Lonberg et al., 1994], [Taylor et al., 1994], 및 [Tuaillon et al., 1995], [Fishwild et al., 1996])을 참고한다.
Ig 로커스를 갖는 트랜스제닉 마우스는 미니로커스 방법을 이용하여 생산되었다. 미니로커스 방법의 잇점은 로커스의 부분을 포함하는 구성체가 신속하게 생성되어 동물 내에 도입될 수 있다는 점이다. 그러나, 미니로커스 방법의 유의한 단점은 적은 수의 V, D, 및 J 유전자를 포함함으로써 이론상 불충분한 다양성이 도입된다는 점이다. 실제로, 발표된 연구는 상기 우려를 지지하는 것으로 보인다. 미니로커스 방법을 이용하여 생산된 동물의 B-세포 발달 및 항체 생산은 중단된 것으로 보인다. 따라서, 본 발명과 관련한 연구는 보다 큰 다양성을 달성하고 동물의 면역 레퍼토리를 재구성하기 위해 Ig 로커스의 큰 부분을 도입하는 방향으로 일관되게 진행되었다.
인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응은 관련 업계로 하여금 키메라 또는 인간화 항체를 제조하도록 유도하였다. 키메라 항체는 인간 불변 구역 및 뮤린 가변 구역을 갖지만, 특정 인간 항-키메라 항체 (HACA) 반응이 특히 항체의 만성 또는 다수-용량 이용시에 관찰될 것으로 예상된다. 따라서, HAMA 또는 HACA 반응에 대한 우려 및(또는) 효과를 저하시키기 위해 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 완전 인간 항체를 제공하는 것이 바람직하다.
인간화 및 디스플레이 기술
인간 항체 생성과 관련하여 상기 논의한 바와 같이, 면역원성이 감소된 항체를 생성하는 방법에는 잇점이 존재한다. 이것은 어느 정도는 적절한 라이브러리를 사용하는 인간화 기술 및 디스플레이 기술에 의해 달성될 수 있다. 뮤린 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 인간화 또는 영장류화될 수 있음이 이해될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Winter and Harris, Immunol Today 14: 43-46, 1993] 및 [Wright et al., Crit. Reviews in Immunol 12:125-168, 1992] 참조). 목적하는 항체는 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인, 및(또는) 프레임워크 도메인을 대응하는 인간 서열로 치환시키기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 공학적으로 처리될 수 있다 (WO 92/02190 및 미국 특허 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, 및 5,777,085 참고). 또한, 키메라 면역글로불린 유전자의 제작을 위한 Ig cDNA의 사용은 당업계에 공지되어 있다 ([Liu et al., PNAS USA 84: 3439, 1987] 및 [J. Immunol. 139: 3521, 1987]). mRNA는 하이브리도마 또는 다른 항체 생산 세포로부터 단리되고 cDNA 생산에 사용될 수 있다. 목적하는 cDNA는 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭될 수 있다 (미국 특허 4,683,195 및 4,683,202). 별법으로, 라이브러리를 제조하고 목적하는 서열을 단리하기 위해 스크리닝할 수 있다. 이어서, 항체의 가변 구역을 코딩하는 DNA 서열은 인간 불변 구역 서열에 융합된다. 인간 불변 구역 유전자의 서열은 문헌 (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH publication no. 91-3242)에서 볼 수 있다. 인간 C 구역 유전자는 공지의 클론으로부터 쉽게 이용가능하다. 이소형의 선택은 목적하는 효과기 기능, 예를 들어 보체 고정, 또는 항체-의존 세포 세포독성에서의 활성에 의해 결정될 것이다. 바람직한 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 본 발명의 항체에 대한 특히 바람직한 이소형은 IgG2 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 구역인 카파 또는 람다를 사용할 수 있다. 이어서, 키메라, 인간화 항체가 통상적인 방법에 의해 발현된다.
항체 단편, 예를 들어 Fv, F(ab')2 및 Fab는 무손상 단백질의 절단, 예를 들어 프로테아제 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 별법으로, 말단절단된 (truncated) 유전자가 설계된다. 예를 들어, F(ab')2 단편의 일부를 코딩하는 키메라 유전자는 CH1 도메인 및 H 사슬의 힌지 구역을 코딩하는 DNA 서열, 이어서 말단절단된 분자를 생성시키기 위한 번역 중지 코돈을 포함할 것이다.
한 방법에서, 중쇄 및 경쇄 J 구역을 코딩하는 컨센서스 서열은 V 구역 세그먼트를 인간 C 구역 세그먼트에 후속적으로 연결하기 위해 유용한 제한 부위를 J 구역 내로 도입하기 위한 프라이머로서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드를 설계하기 위해 사용될 수 있다. C 구역 cDNA는 제한 부위를 인간 서열 내의 유사한 위치에 배치하기 위해 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 변형될 수 있다.
발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유래 에피좀 등을 포함한다. 편리한 벡터는 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되고 발현될 수 있도록 적절한 제한 부위가 공학적으로 처리된, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하는 것이다. 상기 벡터에서, 스플라이싱은 대체로 삽입된 J 구역 내의 스플라이스 공여 부위와 인간 C 구역 앞에 위치하는 스플라이스 수용 부위 사이에서 발생하고, 인간 CH 엑손 내에서 발생하는 스플라이스 구역에서도 발생한다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 구역의 하류에 위치하는 천연 염색체 부위에서 발생한다. 생성되는 키메라 항체는 임의의 강한 프로모터, 예를 들어 레트로바이러스 LTR, 예를 들어 SV-40 초기 프로모터 (Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3: 280, 1983), 라우스 육종 바이러스 LTR (Gorman et al., P.N.A.S. 79: 6777, 1982), 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 LTR (Grosschedl et al., Cell 41: 885, 1985); 천연 Ig 프로모터 등에 연결될 수 있다.
또한, 인간 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보좀 디스플레이, 및 다른 기술을 포함하고 이로 제한되지 않는 디스플레이형 기술을 통해 생성될 수 있고, 생성되는 분자는 당업계에 공지된 추가의 성숙, 예를 들어 친화도 성숙에 적용될 수 있다 ([Wright and Harris, 상기 문헌.], [Hanes and Plucthau, PNAS USA 94: 4937-4942, 1997] (리보솜 디스플레이), [Parmley and Smith, Gene 73: 305-318, 1988] (파지 디스플레이), [Scott, TIBS 17: 241-245, 1992], [Cwirla et al., PNAS USA 87: 6378-6382, 1990], [Russel et al., Nucl. Acids Research 21: 1081-1085, 1993], [Hoganboom et al., Immunol. Reviews 130: 43-68, 1992], [Chiswell and McCafferty, TIBTECH 10: 80-84, 1992], 및 미국 특허 5,733,743). 디스플레이 기술을 사용하여 인간 항체가 아닌 항체를 생성시킬 경우, 상기 항체는 상기 설명된 바와 같이 인간화될 수 있다.
상기 기술을 사용하여, 항체는 IGF-I 발현 또는 IGF-II 발현 세포, IGF-I 또는 IGF-II 또는 IGF-I 또는 IGF-II의 형태, 그의 에피토프 또는 펩티드, 및 그의 발현 라이브러리 (예를 들어 미국 특허 5,703,057 참조)에 대해 생성될 수 있고, 그 후 상기한 활성에 대해 상기 설명된 바와 같이 스크리닝될 수 있다.
다른 치료제의 설계 및 생성
본 발명에 따라, IGF-I 또는 IGF-II에 대해 본원에서 생산되고 특성화된 항체의 활성을 기초로 하여, 다른 항체, 다른 길항제, 또는 항체 이외의 다른 화학적 모이어티를 포함하여 다른 치료 방식의 설계가 용이해진다. 상기 방식은 유사한 결합 활성 또는 기능성을 갖는 항체, 진보된 항체 치료제, 예를 들어 이중특이적 항체, 면역독소, 및 방사성 표지된 치료제, 펩티드 치료제, 유전자 요법제, 특히 인트라바디 (intrabody), 안티센스 치료제, 및 소분자의 생성을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 항체의 효과기 기능은 다양한 치료 용도를 위해 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM으로의 이소형 전환에 의해 변경될 수 있다.
보체 고정이 바람직한 특성인 진보된 항체 치료제의 생성과 관련하여, 예를 들어 이중특이적 항체, 면역독소, 또는 방사성 표지의 사용을 통해 세포 사멸을 위한 보체 의존성을 회피할 수 있다.
이중특이적 항체와 관련하여, (i) IGF-I 또는 IGF-II에 특이성을 갖는 하나의 항체와 제2 분자에 특이성을 갖는 다른 항체가 함께 컨쥬게이팅된 2개의 항체, (ii) IGF-I 또는 IGF-II에 특이성인 하나의 사슬 및 제2 분자에 특이성인 제2 사슬을 갖는 단일 항체, 또는 (iii) IGF-I 또는 IGF-II 및 다른 분자에 특이성인 단일쇄 항체를 포함하는 이중특이적 항체가 생성될 수 있다. 상기 이중특이적 항체는 예를 들어 (i) 및 (ii)와 관련하여 (예를 들어, 문헌 ([Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81, 1994] 및 [Wright and Harris, 상기 문헌]) 참조), 및 (iii)과 관련하여 (예를 들어, [Traunecker et al., Int. J. Cancer 7: 51-52, 1992] 참조) 잘 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
또한, "카파바디 (Kappabody)" (Ill et al., Protein Eng 10: 949-57, 1997), "미니바디 (Minibody)" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9, 1994), "디아바디" (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448, 1993), 또는 "야누신" ([Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659, 1991] 및 [Traunecker et al., Int J Cancer 7:51-52, 1992])도 제조할 수 있다.
면역독소와 관련하여, 항체는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 면역독소로서 기능하도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Vitetta, Immunol Today 14: 252, 1993] 및 또한 미국 특허 5,194,594 참조). 방사성 표지된 항체의 제조와 관련하여, 상기 변형된 항체는 또한 당업계에 공지된 기술을 이용하여 쉽게 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Junghans et al., Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafier and Longo, eds., Lippincott Raven, 1996)] 참조). 또한, 미국 특허 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, 및 5,697,902를 참조한다. 각각의 면역독소 및 방사성 표지된 분자는 IGF-I 또는 IGF-II를 발현하는 세포, 특히 본 발명의 항체가 효과적인 세포를 치사시킬 수 있을 것이다.
치료 펩티드의 생성과 관련하여, IGF-I 또는 IGF-II 및 그에 대한 항체, 예를 들어 본 발명의 항체 (소분자와 관련하여 아래에서 논의되는 바와 같이)에 관련된 구조적 정보의 이용 또는 펩티드 라이브러리의 스크리닝을 통해, IGF-I 또는 IGF-II에 대한 치료 펩티드가 생성될 수 있다. 펩티드 치료제의 설계 및 스크리닝은 문헌 ([Houghten et al., Biotechniques 13: 412-421, 1992], [Houghten PNAS USA 82: 5131-5135, 1985], [Pinalla et al., Biotechniques 13: 901-905, 1992], [Blake and Litzi-Davis, BioConjugate Chem. 3: 510-513, 1992])과 관련하여 논의된다. 면역독소 및 방사성 표지된 분자도 항체와 관련하여 상기 논의된 펩티드 모이어티와 함께 유사한 방식으로 제조할 수 있다.
항체의 항원에 대한 결합에 관련된 중요한 정보는 파지 디스플레이 실험을 통해 수집할 수 있다. 상기 실험은 일반적으로 결합된 펩티드가 단리될 수 있는지를 결정하기 위해서 본 발명의 항체와의 결합을 위한 랜덤 펩티드를 발현하는 파지 라이브러리의 패닝을 통해 달성된다. 성공할 경우, 특정 에피토프 정보를 결합한 펩티드로부터 수집할 수 있다.
일반적으로, 랜덤 펩티드를 발현하는 파지 라이브러리는 박테리오파지 M13 시스템을 기초로 하여 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)로부터 구입할 수 있다 (각각 7-mer 및 12-mer 라이브러리, Ph.D.-7 펩티드 7-mer 라이브러리 키트 및 Ph.D.-12 펩티드 12-mer 라이브러리 키트). 7-mer 라이브러리는 약 2.0 x 109개의 독립 클론의 다양성을 나타내고, 모두는 아니지만 대부분의 2O7=1.28 x 109개의 가능한 7-mer 서열을 나타낸다. 12-mer 라이브러리는 약 1.9 x 109개의 독립 클론을 포함하고, 단지 2O12=4.1 x 1015개의 12-mer 서열의 잠재적인 서열 공간의 매우 작은 샘플링만을 나타낸다. 각각의 7-mer 및 12-mer 라이브러리를 제조사의 권장사항에 따라 패닝하거나 스크리닝하고, 여기서 플레이트를 항체로 코팅하여 적절한 항체 (예를 들어, IgG 항체에 대한 염소 항-인간 IgG Fc)를 포획한 후 세척하였다. 결합된 파지를 0.2 M 글라이신-HCl (pH 2.2)로 용출시켰다. 일정한 엄격도 (0.5% Tween)에서 3 라운드의 선택/증폭 후에, DNA 서열결정을 사용하여 하나 이상의 항체와 반응성인 라이브러리로부터 클론을 특성화할 수 있다. 펩티드의 반응성은 ELISA에 의해 결정할 수 있다. 펩티드의 에피토프 분석의 추가의 논의에 대해서는, 또한 문헌 ([Scott and Smith, Science 249: 386-390, 1990]; [Cwirla et al., PNAS USA 87: 6378-6382, 1990]; [Felici et al., J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991], 및 [Kuwabara et al., Nature Biotechnology 15: 74-78, 1997])을 참고한다.
통상적인 기술을 통한 유전자 및(또는) 안티센스 치료제의 설계도 본 발명을 통해 용이해질 수 있다. 상기 방식은 IGF-I 또는 IGF-II의 기능 조정을 위해 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 항체는 그와 관련된 기능적 분석의 설계 및 사용을 용이하게 한다. 안티센스 치료제에 대한 설계 및 전략은 국제 특허 출원 공개 WO 94/29444에 상세하게 논의되어 있다. 유전자 요법에 대한 설계 및 전략은 공지되어 있다. 그러나, 특히, 인트라바디를 수반하는 유전자 치료 기술의 사용은 특히 유익한 것으로 증명될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Chen et al., Human Gene Therapy 5: 595-601, 1994] 및 [Marasco, Gene Therapy 4: 11-15, 1997]) 참조). 유전자 치료제에 대한 일반적인 설명 및 이와 관련된 고려사항도 국제 특허 출원 공개 WO 97/38137에 논의되어 있다. 본 발명의 항체를 코딩하는 유전자 물질 (예를 들어 mAb m705, m706, m708 및 m708.2 등)은 적합한 발현계 (바이러스, 약독화 바이러스, 비-바이러스, 네이키드 (naked), 또는 다른 바이러스 여부에 상관없이)에 포함되어, 숙주 내에서 항체의 생체 내 생성을 위해 숙주에 투여될 수 있다.
소분자 치료제는 또한 본 발명에 따라 설계될 수 있다. 약물은 본 발명에 기초로 하여 IGF-I 또는 IGF-II의 활성을 조정하기 위해 설계될 수 있다. IGF-I 또는 IGF-II 분자의 구조 및 본 발명에 따른 다른 분자, 예를 들어 본 발명의 항체, IGF-1R, 및 다른 물질과 그의 상호작용으로부터 수집한 지식을 이용하여 추가의 치료 방식을 합리적으로 설계할 수 있다. 이와 관련하여, 합리적인 약물 설계 기술, 예를 들어 X선 결정학, 컴퓨터 보조 (또는 지원) 분자 모델링 (CAMM), 정량적 또는 정성적 구조-활성 관계 (QSAR), 및 유사한 기술을 사용하여 약물 발견에 집중할 수 있다. 합리적인 설계를 통해 IGF-I 또는 IGF-II의 활성을 변형 또는 조정하기 위해 사용될 수 있는 분자 또는 그의 특이적인 형태와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 합성 구조체를 예측할 수 있다. 상기 구조는 화학적으로 합성되거나 생물학적 시스템에서 발현될 수 있다. 상기 방법은 문헌 [Capsey et al., Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY, 1988)]에서 검토된 바 있다. 실제로, 다른 분자 (예를 들어 본 발명에 따른 항체)와의 공지의 또는 설명된 구조-활성 관계를 기초로 한 분자 (펩티드, 펩티드모방체, 소 분자 등)의 합리적인 설계는 일반적으로 통상적인 것이 되었다 (예를 들어, 문헌 ([Fry et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 12022-7, 1998]; [Hoffman et al., J Mol Biol 282: 195-208, 1998]; [Ginalski et al., Acta Biochim Pol 44: 557-64, 1997]; [Jouko et al., Biochem J 322: 927-35, 1997]; [Singh et al., J Med Chem 40: 1130-5, 1997;] [Mandel et al., Nat Biotechnol 14: 323-8, 1996]; [Monfardini et al., Proc Assoc Am Physicians 108: 420-31, 1996]; [Furet et al., J Comput Aided Mol Des 9: 465-72, 1995]) 참조).
또한, 조합 라이브러리가 설계되어 합성되고, 스크리닝 프로그램, 예를 들어 고효율 스크리닝 방식에서 사용될 수 있다.
트랜스제닉 마우스에서 항체의 제조
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 항체 생산 게놈의 실질적인 부분이 삽입되었지만 내인성 뮤린 항체의 생산이 결핍되도록 만든 트랜스제닉 마우스를 이용하여 제조된다. 이때, 상기 마우스는 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있고, 뮤린 면역글로불린 분자 및 항체의 생산이 결핍되어 있다. 그러나, 특히, 트랜스제닉 마우스 및 그로부터 항체의 생산에 대한 바람직한 실시태양은 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 08/759,620 (1996년 12월 3일자 출원)에 개시되어 있다 (또한, 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156, 1997] 참조).
상기 기술의 이용을 통해, 본 발명자들은 다양한 항원에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생산하였다. 본질적으로, 본 발명자들은 마우스의 XenoMouse™ 주를 목적하는 항원으로 면역화시키고, 항체를 발현하는 마우스로부터 림프 세포 (예를 들어 B-세포)를 회수하고, 상기 회수된 세포를 골수성-유형 세포주와 융합시켜 무한증식 하이브리도마 세포주를 제조하고, 목적하는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 상기 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택한다. 본 발명자들은 IGF-I 또는 IGF-II에 특이적인 항체의 제조를 위해 본 발명에 따른 상기 기술을 사용하였다. 본원에서, 본 발명자들은 IGF-I 또는 IGF-II에 특이적인 항체를 생산하는 다수의 하이브리도마 세포주의 생산을 설명한다. 또한, 본 발명자들은 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 포함하여 상기 세포주에 의해 생산되는 항체의 특성화를 제공한다.
mAb m705, m706, m708 및 m708.2에 대한 293 프리 스타일 (free style) 세포주로부터 유래된 항체가 본원에서 논의되는 바와 같이 발현되었다. 상기 언급된 세포주에 의해 생산된 각각의 항체는 완전 인간 IgG1 중쇄 및 인간 IgG1 경쇄이다. 일반적으로, 본 발명에 따른 항체는 매우 높은 친화도를 갖고, 고체 상 또는 용액 상에서 측정할 때 전형적으로 약 10-9 내지 약 10-11 M의 Kd를 갖는다.
이해할 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 다른 세포주에서 발현될 수 있다. 특정 항체에 대한 cDNA 또는 게놈 클론을 코딩하는 서열은 적합한 포유동물 또는 비포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455 (본원에 참고로 포함됨)에 예시되어 있는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 바이러스 (또는 바이러스 벡터) 내에 패키징하고 숙주 세포를 바이러스 (또는 벡터)로 형질도입시키는 것을 포함하여 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내에 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 또는 당업계에 공지된 형질감염 절차에 의해 수행될 수 있다. 사용되는 형질전환 절차는 형질전환시킬 숙주에 따라 결정된다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 입자 폭격 (bombardment), 폴리뉴클레오티드(들)의 리포좀, 펩티드 컨쥬게이트, 덴드리머 내로의 봉입, 및 DNA의 핵 내로의 직접 미세주사를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당업계에 공지되어 있고, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSOo, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), 및 많은 다른 세포주를 포함하고 이로 제한되지 않는, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수가능한 많은 무한증식 세포주를 포함한다. 세균, 효모, 곤충, 및 식물을 포함하고 이로 제한되지 않는 비-포유동물 세포도 재조합 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 글리코실화를 제거하기 위한 항체 CH2 도메인의 부위 지정 돌연변이 유발이 비-인간 글리코실화로부터 발생하는 면역원성, 약동학, 및(또는) 효과기 기능의 변화를 방지하기 위해 바람직할 수 있다. 발현 방법은 어떠한 시스템이 최고 발현 수준을 생성시키고 구성적 IGF-I 또는 IGF-II 결합 특성을 갖는 항체를 생산하는 지를 결정함으로써 선택된다.
또한, 생산 세포주로부터 본 발명의 항체 (또는 그로부터의 다른 모이어티)의 발현은 많은 공지의 기술을 사용하여 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 글루타민 합성효소 및 DHFR 유전자 발현 시스템은 특정 조건 하에서의 발현을 향상시키기 위한 통상적인 방법이다. 고발현 세포 클론은 통상적인 기술, 예를 들어 제한 희석 클로닝 및 Microdrop 기술을 사용하여 확인할 수 있다. GS 시스템은 유럽 특허 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997과 유럽 특허 출원 89303964.4에서 전체적으로 또는 부분적으로 논의되어 있다.
또한, 본 발명의 항체는 목적하는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 트랜스제닉인 포유동물 또는 식물의 생성 및 그로부터 회수가능한 형태의 항체의 생산을 통해 트랜스제닉 방식으로 생산될 수도 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 생산과 관련하여, 항체는 염소, 소 또는 다른 포유동물에서 생산되고 이로부터 회수될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 및 5,741,957 참조).
본 발명에 따른 항체의 기능 분석과 관련하여, 상기 항체는 IGF-I 또는 IGF-II 및 그의 IGF-1R에 대한 그의 결합의 강력한 억제제임이 입증되었다. 예를 들어, 본 발명에 따른 항체, 예를 들어, mAb m705, m706, m708 및 m708.2는 IGF-I에 또는 IGF-I과 IGF-II에 결합하는 것으로 입증되었다 (도 2 참조). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체, 예를 들어, mAb m708.2는 MCF-7 유방암 세포에서 IGF-1R의 인산화를 억제하는 것으로 나타났다.
본 발명에 따라 입증된 결과는 신생물성 질병의 치료를 위해 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 현재 사용되는 치료 항체보다 더 큰 효능을 본 발명의 항체에 제시할 수 있는 특정 품질을 본 발명의 항체가 갖는다는 것을 나타낸다.
특히, 본 발명의 항체 mAb m705, m706, m708 및 m708.2는 매우 바람직한 특성을 갖는다. 이들의 구조적 특징, 기능, 또는 활성은 상기 논의한 바와 같이 추가의 항체 또는 다른 분자의 설계 또는 선택을 용이하게 하는 기준을 제시한다.
치료 요법
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 항체, 예를 들어, IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체 (모노클로날, 폴리클로날 또는 단일쇄 Fv; 그의 무손상 또는 결합 단편)의 하나 또는 조합을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 조성물은 본 발명의 다수의 (예를 들어, 2 이상의) 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 조합을 포함한다. 일부 조성물에서, 조성물의 각각의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 모노클로날 항체 또는 항원의 구분되는, 예비-선택된 에피토프에 결합하는 인간 서열 항체이다.
예방 용도에서, 제약 조성물 또는 의약은 질병 또는 병태 (즉, 신생물성 질병)에 걸리기 쉽거나 그의 위험이 있는 환자에게 위험을 제거 또는 감소시키거나, 심도를 낮추거나, 질병의 발병 동안 제시하는 질병의 생화학적, 조직학적 및(또는) 행동적 증상, 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하는 질병의 발병을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료 용도에서, 조성물 또는 의약은 상기 질병이 의심되거나 상기 질병으로 이미 고통받는 환자에게 질병의 발병에서 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함한 질병의 증상 (생화학적, 조직학적 및(또는) 행동적)을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료 또는 예방 처치를 달성하기에 적합한 양은 치료상 또는 예방적 유효 용량으로 정의된다. 예방 및 치료 요법에서, 물질은 대체로 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 수회 투여량으로 투여된다. 대개, 면역 반응을 모니터링하고, 면역 반응이 감퇴하기 시작하면 반복 투여량을 제공한다.
유효 투여량
본원에 기재된 암-관련 병태 및 질병, 예를 들어, 전이 암의 치료를 위한 본 발명의 항체 조성물, 예를 들어, IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지, 투여되는 다른 의약, 및 처치가 예방적인지 치료적인지를 포함한 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 대체로 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유동물을 포함한 비인간 포유동물도 또한 치료받을 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다.
항체를 사용한 투여를 위해, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg (숙주 체중), 및 보다 대체로 0.01 내지 5 mg/kg 범위이다. 예를 들어 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1-10 mg/kg의 범위일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 매달 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2개 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되고, 이 경우에 투여된 각각의 항체의 투여량은 표시된 범위 내에 있다. 항체는 대체로 다수 경우로 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매달 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수 있다. 일부 방법에서, 투여량은 1-1000 ㎍/ml 및 일부 방법에서 25-300 ㎍/ml의 혈장 항체 농도를 달성하도록 조정된다. 별법으로, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체가 최장 반감기를 보이고, 이어서 인간화 항체, 키메라 항체 및 비인간 항체 순이다. 투여량 및 투여 빈도는 처치가 예방적인지 치료적인지에 따라 변할 수 있다. 예방 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 나머지 생애 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 비교적 짧은 간격에서 비교적 높은 투여량이 때때로 요구되고, 바람직하게는 환자가 질병의 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 보일 때까지. 그후, 환자는 예방 요법으로 투여될 수 있다.
면역원을 코딩하는 핵산에 대한 용량은 환자당 약 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 또는 30-300 ㎍ DNA의 범위이다. 감염성 바이러스 벡터에 대한 용량은 용량 당 10-100 이상의 비리온으로 변한다.
투여 경로
면역 반응을 유도하기 위한 항체 조성물, 예를 들어, 암-관련 병태 및 질병, 예를 들어, 전이 암의 치료를 위한 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 뇌 병변을 표적으로 하는 항체 제제에 대한 흡입제로서 예방을 위해 및(또는) 치료적 처치를 위해 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 근육내 수단에 의해 투여될 수 있다. 면역원성 물질의 가장 대표적인 투여 경로는 피하이지만, 다른 경로도 동등하게 효과적일 수 있다. 다음으로 가장 일반적인 경로는 근육내 주사이다. 상기 종류의 주사는 팔 또는 다른 근육에 가장 일반적으로 수행된다. 일부 방법에서, 물질은 침착물이 축적된 특정 조직 내로 직접, 예를 들어 두개내 주사로 주사된다. 근육내 주사 또는 정맥내 주입이 항체의 투여를 위해 바람직하다. 일부 방법에서, 특정 치료 항체는 두개 내로 직접 주사된다. 일부 방법에서, 항체는 지속 방출 조성물 또는 장치, 예를 들어 Medipad™ 장치로서 투여된다.
본 발명의 물질은 임의로 다양한 암-관련 질병을 포함하는 다양한 질병을 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 물질과 조합으로 투여될 수 있다. 뇌로의 종양 전이의 경우에, 본 발명의 물질은 또한 혈액-뇌 관문 (BBB)을 통해 본 발명의 물질의 통과를 증가시키는 다른 물질과 함께 투여될 수 있다.
제제
면역 반응을 유도하기 위한 항체 조성물, 예를 들어, 암-관련 병태 및 질병, 예를 들어, 전이 암의 치료를 위한 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 종종 활성 치료제, 및 다양한 다른 제약상 허용되는 성분을 포함하는 제약 조성물로서 투여된다 ([Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980] 참조). 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료 용도에 따른다. 조성물은 또한 목적하는 제제에 따라, 동물 또는 인간 투여를 위한 제약 조성물을 제제화하기 위해 일반적으로 사용되는 비히클로서 정의되는 제약상 허용되는 비-독성 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 상기 희석제의 예는 증류수, 생리학적 인산염 완충 염수, 링거 (Ringer) 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 (Hank) 용액이다. 또한, 제약 조성물 또는 제제는 또한 다른 담체, 면역보강제 (adjuvant), 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다.
제약 조성물은 또한 큰, 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당체, 예를 들어 키토산, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체 (예를 들어 라텍스 관능화 세파로즈 (Sepharose)™, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집물 (예를 들어 유적 또는 리포좀)을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 담체는 면역자극제 (즉, 면역보강제)로서 기능할 수 있다.
비경구 투여를 위해, 본 발명의 조성물은 멸균 액체, 예를 들어 물, 오일, 염수, 글리세롤 또는 에탄올일 수 있는 제약상 담체와 함께 생리학상 허용되는 희석제 중의 물질의 용액 또는 현탁액의 주사가능한 용량으로서 투여될 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, 계면활성제, pH 완충 물질 등이 조성물 내에 존재할 수 있다. 제약 조성물의 다른 성분은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들어, 낙화생유, 대두유 및 광물유이다. 일반적으로, 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 특히 주사가능한 용액에 대한 바람직한 액체 담체이다. 항체는 활성 성분의 지속 방출을 허용하는 방식으로 제제화될 수 있는 데포 (depot) 주사 또는 이식 (implant) 제제 형태로 투여될 수 있다. 예시적인 조성물은 HCl로 pH 6.0으로 조정한 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 이루어지는 수성 버퍼 중에 제제화된 모노클로날 항체 5 mg/mL을 포함한다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능물로서 제조되고; 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체형이 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 향상된 면역보강제 효과를 위해 상기 논의된 바와 같이 유화되거나 리포좀 또는 미세 입자, 예를 들어 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 또는 공중합체 내에 봉입될 수 있다 ([Langer, Science 249: 1527, 1990] 및 [Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997]). 본 발명의 물질은 활성 성분의 지속적 또는 박동적인 방출을 허용하는 방식으로 제제화될 수 있는 데포 주사 또는 이식 제제 형태로 투여될 수 있다.
다른 투여 방식에 적합한 추가의 제제는 경구, 비강내, 및 폐 제제, 좌제 및 경피 적용을 포함한다.
좌제에 대해, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함하고; 상기 좌제는 활성 성분을 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1%-2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제제는 부형제, 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사크린, 셀룰로스 및 탄산마그네슘을 포함한다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지속 방출 제제 또는 분말의 형태를 취하고, 활성 성분의 10%-95%, 바람직하게는 25%-70%를 차지한다.
국소 투여는 경피 또는 피부내 전달을 이룰 수 있다. 국소 투여는 콜레라 독소 또는 그의 무독화 유도체 또는 하부단위 또는 다른 유사한 세균 독소를 갖는 물질의 동시-투여에 의해 용이하게 될 수 있다 (Glenn et al., Nature 391: 851, 1998). 동시-투여는 성분들을 혼합물로서 또는 화학적 가교결합 또는 융합 단백질로서의 발현에 의해 얻은 연결된 분자로서 사용함으로써 달성할 수 있다.
별법으로, 경피 전달은 피부 패치 (patch)를 사용하여 또는 트랜스퍼로좀 (transferosome)을 사용하여 달성할 수 있다 ([Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995]; [Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998]).
제약 조성물은 일반적으로 무균의 실질적인 등장성으로, 미국 식품의약국 (U.S. Food and Drug Administration)의 모든 우수 제조 실무 (GMP) 규정에 완전히 부합하게 제제화된다.
진단 용도
진단 시약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체 및 항체 조성물의 특징. 전이성 종양 세포, 예를 들어, 전이성 유방암 세포를 확인하기 위해 진단 방법에서 사용하기 위한 인간 항체는 바람직하게는 상기 설명된 방법을 이용하여 생산된다. 방법은 임의의 에피토프 결합 특이성 및 임의의 목적하는 항원에 대해 매우 높은 결합 친화도를 갖는 실질적으로 무제한적인 수의 본 발명의 항체 및 항체 조성물을 생성한다. 일반적으로, 그의 표적에 대한 항체의 결합 친화도가 보다 높을 수록, 표적 항원을 제거하지 않으면서 비특이적으로 결합된 물질을 제거하기 위해 면역분석에서 보다 엄격한 세척 조건을 수행할 수 있다. 따라서, 상기 분석에 사용되는 본 발명의 항체 및 항체 조성물은 대체로 결합 친화도가 적어도 108, 109, 1010, 1011 또는 1012 M-1이다. 또한, 진단 시약으로서 사용되는 항체가 표준 조건 하에 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 5시간, 보다 바람직하게는 적어도 1시간 내에 평형에 도달하기 위해 충분한 온률 (on-rate)을 갖는 것이 바람직하다.
특허청구된 방법에서 사용되는 본 발명의 항체 및 항체 조성물은 바람직하게는 높은 면역반응성, 즉, 그들의 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있도록 정확하게 접힌 항체 분자의 비율을 갖는다. 이는 상기 설명된 바와 같이 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 항체를 코딩하는 서열의 발현에 의해 달성할 수 있다. 상기 발현은 대체로 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99%의 면역반응성을 일으킨다.
본 발명의 일부 방법에서는 진단 시약으로서 본 발명의 항체 및 항체 조성물의 폴리클로날 제제를 사용하고, 다른 방법은 모노클로날 단리물을 사용한다. 폴리클로날 혼합물의 사용은 하나의 모노클로날 항체로 제조된 조성물에 관하여 많은 잇점을 갖는다. 표적 상의 다수의 부위에 결합함으로써, 폴리클로날 항체 또는 다른 폴리펩티드는 단일 부위에 결합하는 모노클로날보다 더 강한 신호 (진단을 위해)를 생성할 수 있다. 또한, 폴리클로날 제제는 원형 (prototypical) 표적 서열의 수많은 변이체 (예를 들어, 대립유전자 변이체, 종 변이체, 균주 변이체, 약물-유도된 이탈 (escape) 변이체)에 결합할 수 있는 반면, 모노클로날 항체는 원형 서열 또는 보다 좁은 범위의 그에 대한 변이체에만 결합할 수 있다. 그러나, 모노클로날 항체는 밀접하게 관련된 항원의 존재 또는 잠재적인 존재 하에 단일 항원을 검출하기 위해 유리하다.
상기 설명된 방법에 따라 제조된 폴리클로날 인간 항체를 사용하는 방법에서, 제제는 대개 의도된 표적 항원에 상이한 에피토프 특이성을 갖는 항체의 조합을 함유한다. 모노클로날 항체를 사용하는 일부 방법에서는 상이한 에피토프 결합 특이성의 2개의 항체를 갖는 것이 바람직하다. 에피토프 결합 특이성의 차이는 경쟁 분석에 의해 결정할 수 있다.
샘플 및 표적. 인간 항체는 임의의 종류의 샘플에 대한 진단 시약으로서 사용될 수 있지만, 인간 샘플에 대한 진단 시약으로서 가장 유용하다. 샘플은 환자의 임의의 조직 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 바람직한 샘플원은 전혈, 혈장, 혈청, 침, 눈물, 소변, 분변 물질, 땀, 볼 (buccal), 피부 및 모발을 포함한다. 샘플은 또한 내부 장기의 생검 또는 암으로부터 얻을 수 있다. 샘플은 진단 또는 연구를 위해 임상 환자로부터 얻을 수 있거나, 대조군으로 또는 기초 연구를 위해 질병에 걸리지 않은 개인으로부터 얻을 수 있다.
방법은 임의의 종류의 표적 항원을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 표적 항원은 인간 질병을 유발하는 세균, 진균 및 바이러스 병원체, 예를 들어. HIV, 간염 (A, B & C), 인플루엔자, 헤르페스, 람블편모충 (Giardia), 말라리아, 리슈만편모충 (Leishmania), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)을 포함한다. 다른 표적 항원은 그의 발현 수준 또는 조성이 인간 질병 또는 다른 표현형과 상관되는 인간 단백질이다. 상기 항원의 예는 부착 단백질, 호르몬, 성장 인자, 세포성 수용체, 자가항원, 자가항체, 및 아밀로이드 침착물을 포함한다. 관심있는 다른 표적은 종양 세포 항원, 예를 들어 암종배아 항원을 포함한다. 관심있는 다른 항원은 클래스 I 및 클래스 II MHC 항원이다.
진단 분석을 위한 포맷. 인간 항체는 다양한 표준 분석 포맷에서 주어진 표적을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 포맷은 면역침전, 웨스턴 (Western) 블로팅, ELISA, 방사성면역분석 및 면역계량 분석을 포함한다 (모든 목적을 위해 그 전부가 각각 본원에 참고로 포함된 문헌 [Harlow & Lane, 상기 문헌]; 미국 특허 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,879,262; 4,034,074; 3,791,932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 및 4,098,876 참조).
면역계량 또는 샌드위치 분석이 바람직한 포맷이다 (모든 목적을 위해 그 전부가 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,376,110; 4,486,530; 5,914,241; 및 5,965,375 참고). 상기 분석에서는 고체상에 고정된 하나의 항체 또는 항체의 집단, 및 용액 내의 다른 항체 또는 항체의 집단을 사용한다. 전형적으로, 용액 항체 또는 항체의 집단이 표지된다. 항체 집단이 사용되는 경우에, 집단은 대개 표적 항원 내의 상이한 특이성의 에피토프에 결합하는 항체를 함유한다. 따라서, 고체상 및 용액 항체 모두에 대해 동일한 집단이 사용될 수 있다. 모노클로날 항체가 사용되면, 상이한 결합 특이성을 갖는 제1 및 제2 모노클로날 항체가 고체상 및 용액상에 대해 사용된다. 고체상 및 용액 항체는 순서대로 또는 동시에 표적 항원과 접촉될 수 있다. 고체상 항체가 먼저 접촉되면, 분석은 전방향 (forward) 분석인 것으로 칭한다. 이와 반대로, 용액 항체가 먼저 접촉되면, 분석은 역방향 (reverse) 분석인 것으로 칭한다. 표적이 두 항체와 동시에 접촉하면, 분석은 동시 분석으로 칭한다. 표적을 항체와 접촉시킨 후, 샘플을 약 10분 내지 약 24 hr으로 변하고 대체로 약 1 hr인 기간 동안 인큐베이팅한다. 이어서, 진단 시약으로 사용된 항체에 특이적으로 결합하지 않은 샘플의 성분을 제거하기 위해 세척 단계를 수행한다. 고체상 및 용액 항체가 별개의 단계로 결합될 때, 세척은 각각의 또는 두 결합 단계 후 수행될 수 있다. 세척 후, 대개 표지된 용액 항체의 결합을 통해 고체상에 연결된 표지를 검출함으로써 결합을 정량한다. 대체로, 주어진 쌍의 항체 또는 항체의 집단 및 주어진 반응 조건에 대해, 검정 곡선은 공지의 농도의 표적 항원을 함유하는 샘플로부터 작성한다. 이어서, 시험되는 샘플 내의 항원의 농도를 검정 곡선으로부터 내삽법에 의해 판독한다. 분석물을 평형에서 결합된 표지된 용액 항체의 양으로부터 또는 평형에 도달하기 전 일련의 시점에서 결합된 표지된 용액 항체의 운동학 측정에 의해 측정하였다. 상기 곡선의 기울기는 샘플 내 표적의 농도의 척도이다.
상기 방법에서 사용하기 위해 적합한 지지체는 예를 들어 니트로셀룰로스 멤브레인, 나일론 멤브레인 및 유도화 나일론 멤브레인, 및 또한 입자, 예를 들어 아가로스, 덱스트란-기반 겔, 딥스틱 (dipstick), 미립자, 미세구, 자성 입자, 시험관, 미세적정 웰, SEPHADEX™ (아머샴 파마시아 바이오테크 (Amersham Pharmacia Biotech, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))을 포함한다. 고정화는 흡수 또는 공유 부착에 의해 이루어질 수 있다. 임의로, 항체는 표면 결합된 링커, 예를 들어 아비딘에 대한 부착을 위해 링커 분자, 예를 들어 비오틴에 연결될 수 있다.
표지
분석에 사용되는 특정 표지 또는 검출가능한 기는 분석에 사용된 항체의 특이적 결합을 유의하게 저해하지 않는 한 본 발명의 중대한 측면이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 면역분석 분야에서 잘 개발되었고, 일반적으로, 상기 방법에 유용한 대부분의 임의의 표지가 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에서 유용한 표지는 자성 비드 (예를 들어, Dynabeads™, 형광 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 (Texas red), 로다민 등), 방사성 표지 (예를 들어, 3H, 14C, 35S, 125I, 121I, 112In, 99mTc), 다른 영상화제, 예를 들어 미세기포 (microbubble) (초음파 영상을 위해), 18F, 11C, 15O (전자 방출 단층촬영술을 위해), 99mTC, 111In (단일 광자 방출 단층촬영술을 위해), 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알카리성 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것), 및 열량측정 표지, 예를 들어 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 (예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 상기 표지의 사용을 설명한 특허는 모든 목적을 위해 그 전부가 각각 본원에 참고로 포함된 미국 특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241을 포함한다. 또한, 문헌 [Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.]을 참고한다.
표지는 당업계에 공지된 방법에 따라 분석의 목적하는 성분에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 매우 다양한 표지가 사용될 수 있고, 표지의 선택은 요구되는 감도, 화합물과의 컨쥬게이션의 용이함, 안정성 요건, 이용가능한 설비, 및 폐기 규정에 따른다.
비-방사성 표지는 종종 간접 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자 (예를 들어, 비오틴)는 분자에 공유 결합된다. 이어서, 리간드는 본래 검출가능하거나 신호 시스템, 예를 들어 검출가능한 효소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 공유 결합된 항-리간드 (예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합한다. 많은 리간드 및 항-리간드를 사용할 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드, 예를 들어, 비오틴, 타이록신 및 코르티솔을 갖는 경우에 표지된 자연 발생 항-리간드와 함께 사용될 수 있다. 별법으로, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물이 항체와 조합으로 사용될 수 있다.
분자는 또한 예를 들어 효소 또는 형광단과의 컨쥬게이션에 의해 신호 생성 화합물에 직접 컨쥬게이팅될 수 있다. 표지로서 관심있는 효소는 주로 히드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도리덕타제, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어, 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호 발생 시스템에 대해서는, 모든 목적을 위해 그 전부가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 4,391,904를 참조한다.
표지를 검출하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 표지가 방사성 표지인 경우, 검출을 위한 수단은 섬광 계수기 또는 자가방사선술에서와 같이 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광 표지인 경우에는 형광색소 (fluorochrome)를 적절한 파장의 빛으로 여기시키고, 생성되는 형광을 검출함으로써 검출할 수 있다. 형광은 사진 필름에 의해, 전자 검출기, 예를 들어 전하 결합 소자 (CCD) 또는 광증폭기 등의 사용에 의해 시각적으로 검출할 수 있다. 이와 유사하게, 효소적 표지는 효소에 대한 적절한 기질을 제공하고 생성되는 반응 산물을 검출함으로써 검출할 수 있다. 마지막으로, 단순 열량측정 표지는 단순히 표지와 연관된 색상을 관찰함으로써 검출할 수 있다. 따라서, 다양한 딥스틱 분석에서, 컨쥬게이팅된 금은 종종 분홍색으로 나타나는 한편, 다양한 컨쥬게이팅된 비드는 비드의 색상을 나타낸다.
일부 분석 포맷에서는 표지된 성분의 사용을 요구하지 않는다. 예를 들어, 응집 분석을 이용하여 표적 항체의 존재를 검출할 수 있다. 이 경우에, 항원-코팅된 입자는 표적 항체를 포함하는 샘플에 의해 응집된다. 상기 포맷에서, 성분은 표지될 필요가 없고, 표적 항체의 존재는 단순한 시각 검사로 검출된다.
종종, IGF-I 또는 IGF-II 단백질과 IGF-I 또는 IGF-II에 대한 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질을 공유 또는 비공유로 연결함으로써 표지될 것이다.
독성
바람직하게는, 본원에 기재된 항체 조성물의 치료 유효 용량은 실질적인 독성을 유발하지 않으면서 치료 이익을 제공할 것이다.
본원에 기재된 단백질의 독성은 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치사 용량) 또는 LD100 (집단의 100%에 치사 용량)을 결정함으로써 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량비가 치료 지수이다. 상기 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이타는 인간에서 사용하기 위해 독성이 없는 용량 범위를 정하는데 사용할 수 있다. 본원에 기재된 단백질의 용량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없는 유효 용량을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 놓인다. 용량은 사용되는 투여형 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제제, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태에 비추어 개별 담당의사가 선택할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1] 참조).
키트
본 발명의 조성물 (예를 들어, 모노클로날 항체, 인간 서열 항체, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)과 사용 지시서를 포함하는 키트도 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 키트는 적어도 하나의 추가의 시약, 또는 하나 이상의 추가의 본 발명의 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와 구분되는 항원 내의 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 대개 키트 내용물의 의도된 용도를 지시하는 라벨 (label)을 포함한다. 용어 라벨은 키트 상에 또는 키트와 함께 공급되거나 키트에 동봉되는 임의의 필기 또는 기록된 물질을 포함한다.
본 명세서에 기재되고 하기 실시예에서 추가로 설명되는 하기 cDNA 클론은 부다페스트 조약 (Budapest Treaty) 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 버지니아주 20110-2209 매나사스 유니버시티 불리바드 10801)에 2007년 4월 18일자로 기탁되었다. m705 VH에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8342로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m705 VL에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8342로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m706 VH에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8344로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m706 VL에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8344로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m708 VH에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8343으로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m708 VL에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8343으로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m708.2 VH에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8341로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다. m708.2 VL에 대한 cDNA 클론은 2007년 4월 18일에 기탁된 PTA-8341로 표시되는 ATCC 기탁 번호를 갖는다.
다른 실시태양 및 용도는 본원에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
인간 IGF I에 대한 파지-디스플레이된 인간 Fab의 선택
모두는 아니지만 대부분의 IGF-II에 대한 현재 이용가능한 항체는 인간이 아니라 대개 마우스 기원의 것이다. IGF-II에 대한 인간 mAb를 개발하기 위해, 최근 에 개발된 1010개의 상이한 파지-디스플레이된 Fab를 함유하는 큰 나이브 인간 Fab 라이브러리를 사용하였다. 재조합 인간 IGFI를 dynal 비드에 컨쥬게이팅하고, 항체 라이브러리 패닝을 위한 표적 항원으로서 사용하였다. 3 라운드의 패닝 후, 200개의 랜덤한 개별 파지 클론의 스크리닝을 표적으로서 IGF I을 사용하는 파지 ELISA에 의해 수행하였다. IGF I에 대한 유의한 결합을 나타내고 서열결정된 클론 중에서, 3개의 Fab가 독특한 서열을 가졌다; 이들을 세균에서 가용성 Fab로서 발현하고 정제하고 결합 활성에 대해 시험하였다. m705 및 m706으로 지정된 2개의 Fab는 IGF I에만 특이적인 결합을 보인 반면, 하나의 Fab m708는 ELISA에서 IGF I 및 IGF II 모두에 대해 유의한 수준의 결합을 나타냈고, 친화도 성숙 및 특성화를 위해 선택하였다.
물질 및 방법에 설명된 바와 같이 경쇄 셔플링된 (shuffled) m708 돌연변이체 라이브러리 제작 후 2x1O8개의 독립 클론을 얻었다. IGF I 컨쥬게이팅된 비드에 대한 2 라운드의 패닝을 수행하고, 제2 라운드의 패닝으로부터 200개의 클론을 파지 ELISA에 의해 스크리닝하고, DNA 서열결정 및 ELISA 결합 시험 후 5개의 독특한 클론을 확인하였고, 클론 m708.2는 IGF I 및 IGF II 모두에 대해 최고 결합 활성을 보였고, 추가의 특성화를 위해 선택하였다.
Figure 112008077005584-PCT00001
Figure 112008077005584-PCT00002
표 1은 IGF-I 특이적 모노클로날 항체 m705와 m706의 VH 및 VL 구역을 보여준다. 각각의 항체의 CDR 구역을 밑줄친다. 표 2는 IGF-I 특이적 및 IGF-II 특이적 모노클로날 항체 m708과 m708.2의 VH 및 VL 구역을 보여준다. 각각의 항체의 CDR 구역을 밑줄친다. m708 및 m708.2의 CDR 구역 서열은 VL: Q S I S S (서열 9), VL: A A S (서열 10), VL: Q Q S Y S T P S T F (서열 11), VH: G G T F S S Y A (서열 12), VH: G I I P I L G I A (서열 13) 및 VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (서열 14)이다.
도 1은 IGF-I 또는 IGF-I 및 IGF-II에 결합하는 IGF-I에 대해 선택된 인간 모노클로날 항체를 도시한 것이다. m705 (No. 5)와 m706 (No. 6)은 IGF-I과 반응하지만 IGF-II와 반응하지 않는다. m708 (No. 8)은 IGF-I 및 IGF-II와 교차 반응한다.
도 2는 IGF-I 및 IGF-II에 대한 IgG 708.2 결합의 ELISA 결합 분석을 도시한 것이다. 인간 IGF-I 및 IGF-II에 대한 m708.2 Fab의 ELISA 결합 분석은 대조군으로서 m708 Fab 및 m606 Fab 결합을 이용하여 나타낸다. IgG 708.2 Fab는 IGF-I 및 IGF-II 모두에 대한 결합 친화도를 나타낸다. IgG 606 Fab는 IGF-II에 대한 결합 친화도를 나타낸다. IgG 708 Fab는 IGF-II에 대한 그의 결합 친화도보다 더 큰 IGF-I에 대한 결합 친화도를 나타낸다.
실시예 2
IGF-1R의 억제 및 인슐린 수용체 인산화
도 3은 IgG 708.2가 MCF-7 세포에서 IGF-1R의 인산화를 억제하는 것을 보여준다. MCF-7 세포를 무혈청 배지 내에서 6시간 동안 굶긴 후, 1.5 nM IGF-I 또는 10 nM IGF-II가 존재하는 처리 배지를 표시된 농도의 IgG 708.2와 함께 첨가한다. 20분 후, 세포를 냉각시키고 용해시켰다. IGF-1R이 면역침전되었고, 인산화된 수용체는 포스포티로신 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. IGF-1R의 총량은 면역침전에 사용된 동일한 폴리클로날 항체에 의해 검출하였다.
도 4는 IGF-I에 대해 선택된 인간 모노클로날 항체에 의한 가용성 IGF-1R에 대한 IGF-I 결합의 억제를 도시한 것이다. m705 및 m708의 농도는 400 nM이었다. m706의 농도는 100 nM이었다. IGF-I의 농도는 50 nM이고, IGF-II의 농도는 500 nM이었다.
도 5는 항-IGF-II 인간 항체 IgG1 m708에 의한 MCF7 세포에서 IGF-II 및 IGF-I-유도된 IGF-1R 인산화의 용량-의존 억제를 도시한 것이다. m708의 농도는 0 내지 125 nM이었다. IGF-I의 농도는 1.5 nM이고, IGF-II의 농도는 10 nM이었다.
도 6은 IgG1 708.2에 의한 암 세포 이동성의 억제를 도시한 것이다. 암 세포의 이동성은 종양 전이에 필수적이다. IgG m708.2가 8 ㎛ 막 공극을 통한 MCF-7 세포의 이동을 억제할 수 있는지 시험하기 위해 세포 이동 분석을 수행하였다. IgG m708.2는 40 nmol/L 농도에서 5% 태아 소 혈청을 함유하는 배지 내에서 세포 이동의 40%를 억제하였다.
도 7은 ELISA 분석에 의한 IGF-I 및 IGF-II에 대한 모노클로날 항체 m705, m706 및 m708의 결합 특이성을 도시한 것이다. 데이타는 m705 및 m706은 IGF-I에 특이적으로 결합하고, m708은 IGF-I 및 IGF-II 모두에 결합하는 것을 보여준다.
도 8은 IGF-I과 IGF-1 수용체 사이의 결합에 대한 모노클로날 항체 m705, m706 및 m708의 결합 경쟁을 도시한 것이다. m705, m706 및 m708은 각각 IGF-I과 IGF-1 수용체 사이의 결합의 경쟁적 억제를 보였다.
도 9는 IGF-II에 대한 모노클로날 항체 m708.2 IgG의 결합을 도시한 것이다. IGF II에 대한 m708.2 IgG의 결합 친화도 Kd는 약 0.8 x 10-10 M이다.
모노클로날 항체 m705 및 m706은 인간 IGF-I에 대해 높은 결합 특이성을 갖고, 인간 인슐린에 결합하지 않는다. 모노클로날 항체 m708 및 m708.2는 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II에 대해 높은 결합 특이성을 갖고, 인간 인슐린에 결합하지 않는다.
실시예 3
물질 및 방법
파지 디스플레이 Fab 라이브러리 패닝. 재조합 인간 IGF I을 사용하여 1010개의 독특한 클론을 함유하는 인간 나이브 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝하였다 (Zhang et al., J. Virol. 78: 9233-9242, 2004). 재조합 인간 IGF I을 라이브러리 패닝을 위한 표적으로서 자성 비드 상에 컨쥬게이팅하였다. 10 ㎍의 항원을 제1 라운드의 패닝에서 사용하였다. 1012개의 증폭된 파지를 패닝을 위해 사용하였고, 세척 후, 비드 상의 결합된 파지를 직접 사용하여 지수적으로 성장하는 TG1 세포를 감염시키고 M13KO7 헬퍼 파지로 구조하였다. 패닝을 2 ㎍ 항원을 사용하여 2회 반복하고, 각 라운드 후 10회 세척하였다. 파지 ELISA 스크리닝을 위해, 제3 라운드 후 200개의 개별 콜로니를 집어 96-웰 플레이트에서 2YT 배지 내로 접종하였다.
경쇄-셔플링된 파지 디스플레이 라이브러리의 생성 및 선택. 원래의 인간 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 셔플링된 라이브러리에서 VL 레퍼토리의 공급원으로서 사용하였다. 본래의 라이브러리로부터의 파지미드 제제를 먼저 NcoI 및 SpeI로 소화시킨 후, 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 전체 VH 레퍼토리를 삭제하였다. 클론 m708의 VH 도메인을 코딩하는 유전자를 오류-유발 (error-prone) PCR 키트 (스트라타젠 (Stratagene))에 의해 증폭하여 랜덤 돌연변이를 유발한 후, 중첩 연장 (overlap extension)에 의한 스플라이싱 (SOE) PCR에 의해 CH1 유전자 단편과 융합하였다. 융합된 단편을 NcoI 및 SpeI로 소화시키고, 겔로부터 정제한 후, 정제된 백본 벡터 내로 라이게이팅하여 VL-셔플링된 Fab 레퍼토리를 생성하였다. 이. 콜라이 TG1 세포를 전기천공을 통해 라이게이션 혼합물로 형질전환하였다. 형질전환된 TG1 세포를 100 ㎍/ml 암피실린 및 2% 글루코스를 함유하는 2YT 아가 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 철야 인큐베이션 후, 플레이트 상에 성장된 모든 콜로니를 5 ml의 2YT AG 배지 내로 스크래핑하고, 1.2 ml의 50% 글리세롤 (최종 농도 10%)과 혼합하고, 분취하고, -70℃에서 돌연변이체 라이브러리 원액으로서 저장하였다.
IGF-I에 대한 VL-셔플링된 라이브러리의 선택. 라이브러리 원액 (100 ㎕)을 20 ml의 2YT 배지 내에서 지수 증식기로 성장시키고, M13K07 헬퍼 파지로 구조하고, 2YT 배지 (100 ㎍/ml의 암피실린 및 50 ㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 2YT) 내에서 30℃에서 철야 증폭시켰다. 파지 제제를 4% PEG, 0.5 M NaCl 내에서 침전시키고, 1 ml의 PBS 내에 파지 라이브러리 원액으로서 재현탁시켰다. 2 라운드의 바이오패닝 (biopanning)을 인간 IGF I 컨쥬게이팅된 자성 비드 상에서 본래의 라이브러리 패닝에서 설명된 바와 같이 수행하였다.
Fab에서 IgG1로의 전환. pComb3H 내의 Fab를 중쇄 및 경쇄의 동시 발현을 허용하는 pDR12 내로 클로닝하였다 (예를 들어, 문헌 [Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001] 참조). 간단히 설명하면, 중쇄 가변 구역을 먼저 XbaI 및 SacI 부위를 통해 pDR12 내로 클로닝하였다. 이어서, 경쇄 서열 (VL + CL)을 HindIII 및 EcoRI 부위를 통해 pDR12 내로 클로닝하였다.
Fab 및 IgG1의 발현. HB2151 세포를 Fab 서열을 함유하는 pCombIII 플라스미드로 형질전환하였다. 단일한 신선한 콜로니를 2YT 배지 + 100 Ag/mL 암피실린 + 0.2% 글루코스 내로 접종하였다. 배양액을 A600 = 0.5까지 250 rpm에서 37℃에서 진탕하였다. 이소프로필-L-티오-h-D-갈락토피라노시드 (1 mmol/L)를 첨가하여 발현을 유도하였다. 30℃에서 철야 성장 후, 배양액을 수확하였다. 세균을 5,000 X g에서 15분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 폴리마이신 B (10,000 유닛/mL)와 함께 PBS 내에 재현탁하였다. 가용성 Fab는 실온에서 45분 동안 인큐베이팅하여 세포질로부터 방출시켰다. 추출물을 15,00Og에서 30분 동안 청정화하였다. 단백질 G 칼럼 상에서 정제를 위해 투명한 상등액을 회수하였다.
IgG1을 293 프리 스타일 세포에서 발현시켰다. 293Fectin을 사용하여 제조사 (인비트로겐 (Invitrogen))의 지시에 따라 293 프리 스타일 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 4일 후, 배양 상등액을 수확하였다. IgG를 단백질 A 칼럼 상에서 정제하였다.
ELISA 결합 분석. 항원을 좁은 웰의 96-웰 플레이트 상에 50 ng/웰로 4℃에서 철야 코팅하였다. 파지 ELISA를 위해, 각 라운드의 패닝으로부터 1010개의 파지를 항원과 함께 인큐베이팅하였다. 결합된 파지를 항-M13-HRP 폴리클로날 항체 (파마시아 (Pharmacia, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))를 사용하여 검출하였다. 가용성 Fab 결합 분석을 위해, 항-Flag HRP 컨쥬게이트를 사용하여 결합을 검출하였다.
표면 플라스몬 공명에 의한 운동학 속도 상수 및 친화도의 결정. 다양한 Fab와 인간 IGFI 및 IGF-II 사이의 상호작용은 Biacore 1000 기기 (파마시아)를 사용하는 표면 플라스몬 공명 기술에 의해 분석하였다. IGF I 및 IGF-II를 카르보디이미드 커플링 화학을 이용하여 센서 칩 (CM5) 상에 공유결합으로 고정시켰다. 대조 참조 표면을 비특이적인 결합 및 굴절률 변화를 위해 제조하였다. 상호작용의 운동학 분석을 위해, 변하는 농도의 Fab를 30 AL/min의 유속으로 150 mmol/L NaCl, 3 mmol/L EDTA 및 0.005% P-20 (pH 7.4)을 함유하는 가동 (running) 버퍼를 사용하여 주입하였다. 회합 및 해리상 데이타를 비선형 데이타 분석 프로그램 BIAevaluation 3.2를 사용함으로써 1:1 랭그미어 (Langumir) 전반 모델에 동시에 피팅하였다. 모든 실험은 25℃에서 수행하였다.
인산화 분석. MCF-7 세포를 6-웰 플레이트 내에서 완전 성장 배지 중에 1.0 X 106/웰로 접종하였다. 철야 배양 후, 세포를 무혈청 DMEM로 세정한 후, 무혈청 DMEM 내에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 재조합 Fab 또는 IgG와 함께 30분 동안 인큐베이팅한 후, IGF-II를 10 nmol/L의 최종 농도로 첨가하였다. 몇몇 경우에, 항체 및 IGF-II를 동일한 시간에 배양액에 첨가하지만 예비혼합하지는 않았다. IGF II 첨가의 20분 후, 세포를 얼음 상에서 냉각시키고, 냉 PBS 내에 세정하고, 1 mL의 용해 버퍼 [50 mmol/L HEPES (pH 7.4), 150 mmol/L NaCl, 10% 글리세롤, 1% Triton X-100, 1.5 mmol/L MgCl2, 2 mmol/L 나트륨 바나데이트 및 프로테아제 억제제] 내에서 용해시켰다. 용해물을 얼음 상에서 30분 동안 유지시킨 후, 17,000 X g에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 면역침전을 위해 사용하였다: 20 AL의 단백질 G 세파로즈 4B 및 2 Ag의 토끼 항-IGF-1R h (C-20, 산타크루즈 바이오테크놀로지스 (Santa Cruz Biotechnologies, 미국 캘리포니아주 산타크루즈)). 광범한 세척 후, 면역침전을 4% 내지 12% NUPAGE 상에서 실행하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인에 옮기고, 항포스포티로신 mAb 4G10로 블로팅하였다. 멤브레인을 떼어내고, 총 IGF-1R을 검출하기 위해 C-20 폴리클로날 항체, 또는 면역침전에서 총 인슐린 수용체를 검출하기 위해 또는 C-19로 재프로빙하였다. Akt 및 MAPK에 대해 유사한 절차를 사용하였지만, 포스포-Akt 및 포스포-MAPK를 인식하는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
세포 이동 분석. 8 ㎛ 공극 크기의 폴리카르보네이트 멤브레인이 있는 트랜스웰 (transwell) 배양판을 제조사 (코닝 라이프 사이언시즈 (Corning Life Sciences) Q5)의 지시에 따라 사용하였다. 간단히 설명하면, 저변 웰은 5% 태아 소 혈청이 있는 2.6 mL DMEM 및 다양한 농도의 항체를 함유하였다. 5% 태아 소 혈청이 있는 DMEM 및 무혈청 DMEM을 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 상부 삽입물은 무혈청 DMEM 중의 1.5 mL의 0.5 X 106 MCF-7 단일 세포 현탁액을 함유하였다. 세포를 37℃ 인큐베이터 내에서 인큐베이팅하였다. 4시간 후, 멤브레인의 상부면에 부착된 세포를 끝이 면으로 된 도포기로 세정 제거하였다. 멤브레인의 하부면 상의 세포를 Hema3 키트 (피셔 (Fischer))로 염색하였다. 멤브레인을 트랜스웰로부터 제거하고, 현미경 슬라이드 상에 탑재하고, 세포를 현미경 하에 계수하였다.
분자량과 같은 물리적 특성 또는 화학식과 같은 화학적 특성에 대해 본원에서 범위가 사용될 때, 범위의 모든 조합 및 하위조합과 그 내부의 특정 실시태양은 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 인용되거나 기재된 각각의 특허, 특허 출원 및 공개문헌의 개시내용은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
당업자는 본 발명의 실시태양에 대해 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 상기 변화 및 변형은 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 첨부된 청구의 범위는 상기 모든 동등한 변형을 본 발명의 진정한 취지와 범위 내에서 포함하는 것으로서 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Government of the United States of America as Represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Dimitrov, Dimiter S. Zhu, Zhongyu <120> ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF NEOPLASTIC DISEASE <130> NIHA-0332 / E-336-2005/0-PCT-02 <140> PCT/US2007/66180 <141> 2007-04-06 <150> US 60/790,512 <151> 2006-04-07 <160> 14 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(33) <223> CDR1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(58) <223> CDR2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(110) <223> CDR3 <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Phe Trp Ser Gly Ala Val Gly Met Asp Val Trp Gly 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Claims (85)

  1. 그의 중쇄 가변 구역에 서열 7에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 7에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
  2. 그의 경쇄 가변 구역에 서열 8에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 8에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
  3. 그들의 중쇄 가변 구역 또는 경쇄 가변 구역에 각각 서열 7 및 8에 제시된 아미노산 서열, 또는 각각 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 모노클로날 항체.
  4. 제3항에 있어서, VL: Q S I S S (서열 9), VL: A A S (서열 10), VL: Q Q S Y S T P S T F (서열 11), VH: G G T F S S Y A (서열 12), VH: G I I P I L G I A (서열 13), 또는 VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (서열 14)의 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 항체.
  5. 제2항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD, 또는 IgE 항체인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 IgG1κ 또는 IgG1λ 이소형인 항체.
  7. 제1항에 있어서, 항체가 IgG4κ 또는 IgG4λ 이소형인 항체.
  8. 제1항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD, 또는 IgE 항체인 항체.
  9. 제2항에 있어서, 항체가 IgG1κ 또는 IgG1λ 이소형인 항체.
  10. 제2항에 있어서, 항체가 IgG4κ 또는 IgG4λ 이소형인 항체.
  11. 제3항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, 분비성 IgA, IgD, 또는 IgE 항체인 항체.
  12. 제3항에 있어서, 항체가 IgG1κ 또는 IgG1λ 이소형인 항체.
  13. 제3항에 있어서, 항체가 IgG4κ 또는 IgG4λ 이소형인 항체.
  14. 제1항에 있어서, 항체가 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 래트, 또는 마우스 항체, 또는 이들의 조합인 항체.
  15. 제2항에 있어서, 항체가 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 래트, 또는 마우스 항체, 또는 이들의 조합인 항체.
  16. 제3항에 있어서, 항체가 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 래트, 또는 마우스 항체, 또는 이들의 조합인 항체.
  17. 제3항에 있어서, 항체가 (i) 약 4 nM 이상의 항체 농도에서 시험관내 MCF-7 유방암 세포 분석에서 IGF-1 수용체 인산화를 억제하거나; (ii) IGF-1 수용체에 대한 IGF-I 결합 또는 IGF-II 결합을 억제하거나; (iii) 세포 이동 분석에서 세포 이동을 억제하는 특징 중 하나 이상을 갖는 것인 항체.
  18. 제3항에 있어서, 분석물로서 재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 또는 인 간 인슐린 유사 성장 인자 II를, 리간드로서 항체를 사용하여 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 결정할 때 해리 평형 상수 (KD)가 약 10-8 M 이하인 항체.
  19. 제3항에 있어서, 항체가 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인슐린 유사 성장 인자 II에 대해 108 M-1 이상의 결합 친화도로 결합할 수 있는 것인 항체.
  20. 제3항에 있어서, 무손상 항체, 무손상 IgG1 항체, 무손상 IgG2 항체, 무손상 IgG3 항체, 무손상 IgG4 항체, 무손상 IgM 항체, 무손상 IgA1 항체, 무손상 IgA2 항체, 무손상 분비성 IgA 항체, 무손상 IgD 항체, 또는 무손상 IgE 항체이고, 여기서 항체가 진핵 세포에서 글리코실화되는 것인 항체.
  21. 제3항에 있어서, 항체 단편 또는 단일쇄 항체인 항체.
  22. 제4항에 있어서, (i) 면역글로불린 힌지 구역 폴리펩티드에 융합된, 링커 펩티드를 통해 서열 8에 제시된 가변 경쇄 아미노산 서열 또는 서열 8에 적어도 90% 상동성인 가변 경쇄 서열에 융합된 서열 7에 제시된 가변 중쇄 아미노산 서열 또는 서열 7에 적어도 90% 상동성인 가변 중쇄 서열, (ii) 힌지 구역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 구역, 및 (iii) CH2 불변 구역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 구역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질인 항체.
  23. 제3항에 있어서, 항체가 소정의 항원에 적어도 1010 M-1의 평형 회합 상수 (Ka)로 결합하는 것인 항체.
  24. 제3항에 있어서, 항체가 소정의 항원에 적어도 109 M-1의 평형 회합 상수 (Ka)로 결합하는 것인 항체.
  25. 제3항에 있어서, 항체가 소정의 항원에 적어도 108 M-1의 평형 회합 상수 (Ka)로 결합하는 항체.
  26. 제3항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체.
  27. 제3항에 있어서, 항체가 F(ab')2, Fab, Fv 또는 Fd 단편인 항체.
  28. 제3항에 있어서, 항체가 항원-특이적 항체인 항체.
  29. 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하 는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  30. 제29항에 있어서, VL: Q S I S S (서열 9), VL: A A S (서열 10), VL: Q Q S Y S T P S T F (서열 11), VH: G G T F S S Y A (서열 12), VH: G I I P I L G I A (서열 13), 또는 VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (서열 14)의 적어도 하나의 CDR 서열을 포함하는 항체.
  31. 그의 인간 중쇄 가변 구역에 서열 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 1에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  32. 그의 인간 경쇄 가변 구역에 서열 2에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 2에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  33. 그의 인간 중쇄 가변 구역에 서열 3에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 3에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  34. 그의 인간 경쇄 가변 구역에 서열 4에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 4에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  35. 그의 인간 중쇄 가변 구역에 서열 5에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 5에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  36. 그의 인간 경쇄 가변 구역에 서열 6에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 6에 적어도 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인간 인슐린 유사 성장 인자 II에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  37. 제1항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  38. 제2항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  39. 제31항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  40. 제32항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  41. 제33항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  42. 제34항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  43. 제35항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  44. 제36항의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  45. 항체가 인간 불변 구역을 포함하고, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는, 적어도 1 X 1O8 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합하는 것인, 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  46. 제45항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 인간 불변 구역 및 인간 가변 구역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  47. 제45항에 있어서, 적어도 하나의 인간 경쇄 및 적어도 하나의 인간 중쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  48. 제47항에 있어서, 경쇄가 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 경쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  49. 제47항에 있어서, 중쇄가 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 중쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  50. 제47항에 있어서, 경쇄가 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 경쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함하고 중쇄가 m708.2 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 중쇄의 모든 항원 결합 구역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  51. 항체가 인간 불변 구역을 포함하고, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 항원 결합 구역을 포함하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는, 적어도 1 X 1O8 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합하는 것인, 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  52. 항체가 인간 IgG1 불변 구역을 포함하고, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는, 적어도 1 X 1O8 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합하는 것인, 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  53. 항체가 인간 IgG1 불변 구역을 포함하고, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 (i) m708.2 항체 (ATCC 기탁 번호 PTA-8341)의 항원 결합 구역을 포함하고, (ii) 생체 내에서 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 회합 상수 (Ka)로서 측정되는, 적어도 1 X 1O8 리터/몰의 친화도로 인간 IGF-I 및 인간 IGF-II의 중화 에피토프에 결합하는 것인, 단리된 재조합 항-IGF-I 및 항-IGF-II 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  54. (a) 샘플을 제공하고; (b) (a)의 샘플을 폴리펩티드 리간드의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 대한 결합을 허용하는 조건 하에, 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 m708 또는 m708.2와 접촉시키고; (c) 항체 m708 또는 m708.2의 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II와의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합의 검출은 샘플에 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II가 존재함을 나타내고, 이에 의해 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는, 샘플 내에서 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는 방법.
  55. (a) 샘플을 제공하고; (b) (a)의 샘플을 폴리펩티드 리간드의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 대한 결합을 허용하는 조건 하에, 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 m708 또는 m708.2와 접촉시키고; (c) 항체 m708 또는 m708.2의 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II와의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합의 검출은 샘플에 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II가 존재함을 나타내고, 이에 의해 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는, 샘플 내에서 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II를 검출하는 방법.
  56. (a) 샘플을 제공하고; (b) (a)의 샘플을 폴리펩티드 리간드의 인간 인슐린 성장 인자 I에 대한 결합을 허용하는 조건 하에, 인간 인슐린 성장 인자 I을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 m705 또는 m706과 접촉시키고; (c) 항체 m705 또는 m706의 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I과의 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 결합의 검출은 샘플에 인간 인슐린 성장 인자 I이 존재함을 나타내고, 이에 의해 샘플 내의 인간 인슐린 성장 인자 I을 검 출하는, 샘플 내에서 인간 인슐린 성장 인자 I을 검출하는 방법.
  57. 제1, 2, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36항의 단백질/항체의 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열 또는 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열을 코딩하는 단리된 핵산.
  58. 제57항의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  59. 제1, 2, 31, 32, 33, 34 또는 35항의 항체의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 함유하는 재조합 세포.
  60. 항체의 HC 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 항체의 LC 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 서열을 함유하고, 여기서 항체가 제1, 2, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36항의 단백질인 숙주 세포.
  61. 숙주 세포에서 제57항의 핵산을, 상기 핵산의 발현을 제공하는 조건 하에 발현시킨 후, 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 결합할 수 있는 항체를 제조하는 방법.
  62. (a) 후보 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 I 결합 폴리펩티드 를 발현하는 파지를 포함하는 파지 라이브러리를 제공하고; (b) 상기 파지 라이브러리를 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II 단백질과 접촉시키고; (c) 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II 단백질의 파지에 대한 결합을 검출하여 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 특이적인 폴리펩티드 리간드를 확인하는 것을 포함하는, 인간 인슐린 성장 인자 I 및 인슐린 성장 인자 II에 특이적인 폴리펩티드 리간드를 확인하는 방법.
  63. 포유동물 대상에게 인슐린 유사 성장 인자 I에 특이적으로 결합하는, 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하는 제약 조성물을 포유동물 대상에서 신생물성 질병을 완화 또는 제거하기 위해 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물 대상에서 신생물성 질병을 치료하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 항체가 인슐린 유사 성장 인자 I 및 인슐린 유사 성장 인자 II에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 항체가 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  66. 제63항에 있어서, 항체가 세포독성제에 연결되는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 세포독성제가 세포독성 약물인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 세포독성제가 방사성 동위원소인 방법.
  69. 제63항에 있어서, 신생물성 질병이 고형 종양, 혈액 종양, 백혈병, 결장직장암, 양성 또는 악성 유방암, 자궁암, 자궁근종, 난소암, 자궁내막암, 다낭성 난소증후군, 자궁내막 폴립, 전립선암, 전립선 비대, 뇌하수체암, 선근증, 선암종, 수막종, 흑색종, 골암, 다발 골수종, CNS 암, 신경아교종 또는 별아세포종인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 신생물성 질병이 상기 포유동물 대상에서 종양 세포 전이인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 신생물성 질병이 상기 포유동물 대상에서 유방암 전이인 방법.
  72. 세포 집단을 포함하는 시험 샘플을 대상의 혈액 또는 조직으로부터 얻고,
    세포 집단 내의 세포 상의 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고,
    세포를 확인하고 특성화하기 위해 IGF-I 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하는 것을 포함하고, 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커의 존재가 포유동물 대상에서 신생물성 질병 또는 신생물성 질병의 위험을 나타내는 것인,
    신생물성 질병이 발병한 것으로 의심되거나 신생물성 질병의 위험이 있는 것으로 의심되는 포유동물 대상에서 암을 진단하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 세포 집단 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-II 마커 및 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고, 세포를 확인하고 특성화하기 위해 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커에 의해 검출된 세포 집단을 분석하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커의 존재는 포유동물 대상에서 신생물성 질병 또는 신생물성 질병의 위험을 나타내는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 검사물 내에서 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 또는 IGF-II 마커의 존재가 포유동물 대상에서 전이성 암의 존재를 나타내는 것인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 검사물 내에서 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 또는 IGF-II 마커의 존재가 포유동물 대상에서 초기 단계 암의 존재를 나타내는 것인 방법.
  76. 제73항에 있어서, 검사물 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커의 부재가 포유동물 대상에서 무병 상태를 또는 측정할 수 있는 질병 상태의 부재를 나타내는 것인 방법.
  77. 제72항에 있어서, 검사물 내의 세포 상 또는 세포 내의 IGF-I 마커 또는 IGF-II 마커의 존재 또는 부재에 의해 암 치료 또는 암 회복 동안의 치료 관리가 모니터링되는 것인 방법.
  78. 제72항에 있어서, 항체와 회합된 영상화 모이어티를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 영상화 모이어티가 자기공명 분광법, X선 분광법, 또는 양전자 방출 단층촬영술 (PET)을 통해 영상화될 수 있는 것인 방법.
  80. 제78항에 있어서, 회합이 공유 결합인 방법.
  81. 제78항에 있어서, 회합이 비공유 결합인 방법.
  82. 제72항에 있어서, 신생물성 질병이 고형 종양, 혈액 종양, 백혈병, 결장직장암, 유방암, 자궁암, 자궁근종, 난소암, 자궁내막암, 다낭성 난소증후군, 자궁내막 폴립, 전립선암, 전립선 비대, 뇌하수체암, 선근증, 선암종, 수막종, 흑색종, 골 암, 다발 골수종, CNS 암, 신경아교종 또는 별아세포종인 방법.
  83. 치료 유효량의 약물 후보 화합물을 암이 발병한 것으로 의심되는 대상에게 투여하고,
    종양 세포를 포함하는 것으로 의심되는 세포 집단을 포함하는 시험 샘플을 약물 후보 화합물의 처리 전과 후에 대상의 혈액 또는 조직으로부터 얻고,
    시험 샘플 내의 세포 상의 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고,
    약물 후보 화합물 처리 후와 비교하여 약물 후보 화합물 처리 전의 시험 샘플에서 종양 세포를 확인하기 위해 IGF-I 마커에 의해 검출되는 세포 집단을 분석하는 것을 포함하고, 여기서 처리 전의 검사물 내의 종양 세포의 수에 비해 처리 후에 검사물 내의 종양 세포의 감소된 수의 존재는 포유동물 대상에서 암 치료시에 약물 후보 화합물의 유효성을 나타내는 것인,
    포유동물 대상에서 암 치료를 위한 약물 후보 화합물을 스크리닝하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 시험 샘플 내의 세포 상의 IGF-II 마커 및 IGF-I 마커의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공하고, 약물 후보 화합물 처리 후와 비교하여 약물 후보 화합물 처리 전의 시험 샘플에서 종양 세포를 확인하기 위해 IGF-I 마커 및 IGF-II 마커에 의해 검출되는 세포 집단을 분석하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 처리 전의 검사물 내의 종양 세포의 수에 비해 처리 후에 검사물 내의 종양 세포의 감소된 수의 존재는 포유동물 대상에서 암 치료시에 약물 후보 화합물의 유효성을 나타내는 것인 방법.
  85. 제83항에 있어서, 암이 전이성 암 또는 초기 단계 암인 방법.
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