KR20110059755A - 소닉 헤지혹 호모로그에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 소닉 헤지혹 호모로그 (Shh)에 대한 표적화된 결합제와 이의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 Shh에 대한 완전한 인간 단클론 항체에 관한 것이다. 기술된 표적화된 결합제는 Shh의 활성 및/또는 과다 생산과 관련된 질환의 치료 및 진단에 유용하다.

Description

소닉 헤지혹 호모로그에 대한 항체 및 이의 용도{ANTIBODIES AGAINST SONIC HEDGEHOG HOMOLOG AND USES THEREOF}

본 발명은 소닉 헤지혹 호모로그(sonic hedgehog homolog)(Shh)에 대한 표적화된 결합제(targeted binding agents) 및 이들의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 Shh에 대한 완전한 인간 단클론 항체들에 관한 것이다. 설명된 표적화된 결합제는 헤지혹 단백질들의 활성 및/또는 과다 생산과 관련된 질병의 치료 및 진단에 유용하다.

헤지혹은 초파리(Drosophila)에서 배 발달 패턴의 중개물질로 확인되었다. 포유류에서 세 가지 군의 헤지혹 패밀리 즉, Sonic 헤지혹 (Shh), Indian 헤지혹 (Ihh), 및 Desert 헤지혹 (Dhh)가 있는데, 이들은 세포 성장 및 분화에 영향을 줌으로써 조직 패턴을 지정하고, 기관 항상성(homeostasis)을 조절한다. 헤지혹 단백질들은 GCPR-유사 막통과 단백질 Smoothened (SMO)의 기능을 정상적으로 억제하는 12개 패스 막 스패닝 수용체 Patched (인간의 경우 Ptch, 마우스의 경우 Ptc)에 대한 리간드다. Shh의 결합시에, Patched에 의한 SMO 억제로 전사 인자의 Gli 패밀리 구성요소들을 통하여 SMO가 신호를 발생시키는 것이 허용된다. 전사의 활성화는 Gli1 및 Ptch와 같은 경로 성분들의 합성을 유도한다.

헤지혹/SMO 신호 경로(signaling pathway)의 조절 이상은 종양 형성에 연루된다. Ptch의 비활성화 또는 Smo를 구성적으로 활성화시키는 돌연변이는 기저세포암, 수질아세포종 및 횡문근육종에서 설명되었다. 이들 돌연변이는 아마도 경로의 구성적 활성화를 초래하고, 종양 형성을 유도한다. 더욱이, Shh의 과다발현은 전립선암, 췌장암, 소세포 폐암, 결장암, 식도암, 위암, 흑색종 및 다발성 골수종과 같은 다양한 종양 형태에서 설명되었다. 많은 경우에서 Gli1 및 Ptch의 상향 조절은 Shh의 과다발현과 함께 관찰되었는데, 이는 종양 세포에서 구성적 경로 활성화는 일부 경우에 리간드-의존적 방식으로 종양 형성을 촉진시킬 수 있다는 결론을 뒷받침한다. 이 모델은 LNCaP 전립선 암 세포에서 비정상적인 장소(ectopic)에서의 Shh의 과다발현이 생체내 종양 성장을 촉진시킨다는 관찰에 의해 뒷받침된다(Fan 2004. Endocrinology 145:3961).

Shh의 과다 발현이 어떻게 암 발생을 유도하는지를 설명하기 위하여 몇 가지 모델들이 제안되어 왔었다. 제 1 모델에서, 종양 세포들에 의해 Shh가 비정상적인 장소에서 과다발현되어, 종양 세포의 표면에 Ptch의 결합시 오토크린 신호를 생성하고, 및 세포 증식을 유도한다. 두 번째 모델에서, 종양세포들에 의해 분비되는 Shh는 기질 세포에서 SMO 신호생성을 활성화시키고, 결국 종양 세포 성장을 강화시키는 인자들이 만들어지게 된다. 이 모델을 뒷받침하는 것으로, Shh를 발현시키는 종양 세포는 기질 세포에서 Gli1 발현을 유도하는 것으로 나타났다(Fan et al. 2004. Endocrinology 145:3961; Yauch et al . 2008. Nature : 455, 406-410). 더욱이, 마우스 배 섬유아세포(MEFs)의 공동이식은 종양 형성 및 Shh를 발현시키는 준-적정 수의 HT-29 종양 세포의 성장을 촉진시켰다(Yauch et al . 2008. Nature: 455, 406-410). MEFs에서 SMO의 표적화된 결손은 실질적으로 더 작은 종양을 초래하였기 때문에, MEFs가 종양 성장을 강화시키기 위해서는 고유의 Shh/SMO 신호를 요구하였다. 끝으로, Shh는 다양한 조직에서 줄기 세포의 증식 및 분화에 연루되어 있다(Taipale and Beachy . 2001. Nature 411:349-354). 이와 같이, 암 줄기 세포의 자가-재생을 유도함으로써 화학요법 및/또는 방사능요법으로 치료한 후 Shh가 종양 형성 또는 재발을 촉진할 수 있을 것이라고 제안되었다.

성장 및 생존에 대한 Shh/Smo 신호발생에서 종양 의존성은 익시아(corn lilly)로부터 유도된, SMO에 바로 결합함으로써 작용하는 경로의 자연적으로 발생된 길항제인 사이클로파민(cyclopamine)으로 전-임상 모델에서 설명되었다. 사이클로파민은 시험관 및 생체내에서 흑색종, 전립선암, 췌장암 및 소세포 폐종양을 포함하는 다수의 종양 세포주의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다. 사이클로파민의 저해 효과는 특이적인 것으로 보이는데, 그 이유는 22RV-1 전립선 암 이종이식편(xenograft)의 성장을 억제시키지만, 하류 전사 인자 Gli1를 안정적으로 과다발현시키는 22RV-1 종양의 성장은 억제시키지 못하기 때문이다 (Karhadkar et al . 2004. Nature 431:707). 좀더 최근에는, 관련없는 소분자 SMO 길항제, HhAntag는 동종이식편(allograft) 수질아세포종 종양의 성장을 억제시키는 것으로 나타났는데, 이때 SMO 경로는 Shh를 과다발현시키는 Pct1 및 인간 이종이식편 종양의 돌연변이를 통하여 구성적으로 활성화된다(Romer et al . 2004. Cancer Cell 6:229; Yauch et al . 2008. Nature: 455, 406-410).

인간 Shh과 교차-반응을 하는 쥐 Shh의 N-말단 신호생성 도메인에 대해 생성된 항체가 설명되었다(Ericson et al . 1996. Cell 87: 661-673). 5E1으로 명명된 이 항체는 Shh 경로의 특이적 차단(Gli1 리포터 유전자에 의해 측정됨)은 식도, 위 및 췌장의 확립된 종양 세포에서 증식 억제와 관련되었다는 것을 설명하는데 이용되었다. 5E1은 또한 확립된 소세포 폐암(SCLC) 세포주 및 단일 계대 췌장 이종이식편으로부터 유도된 종양 세포의 시험관 내 성장 및 생존을 감소시켰다. (Watkins et al . Nature , 422:313-317 (2003); Berman et al . 2003. Nature 426:846). 끝으로, 5E1은 생체내에서 HT55 및 HT-29 직장 종양 이종이식편의 성장을 억제시키는 것으로 나타났다(Yauch et . 2008. Nature).

단일 물질로서, 종양 세포의 성장 및 생존을 억제시키는 것에 추가적으로, Shh/SMO 길항제는 화학요법 및 방사능요법의 항-종양 활성을 증강시킬 수 있다. (Chen et al . Cell Cycle , 6:1826-1830 (2007)). 심스-무타다 등(Sims - Mourtada et al. Clin Cancer Res ., 12:6565-6572, (2006))은 Gli1-양성 세포의 수가 급격히 증가되었는데, 이는 방사능치료후 SEG-1 식도 선암 이종이식편이 재성장하였기 때문이라는 것을 보고하였다. Gli1-착색(staining) 세포들의 출현은 Ki67-양성 세포의 증가보다 앞서 나타나며, 이는 Shh 시그날링이 추정 암 줄기 세포와 같은 불응성(refractory) 세포의 소집단 팽창을 촉진시켜, 궁극적으로 종양의 재성장을 초래할 수 있다는 것이다. SEG-1 이종이식편을 파클리탁셀 및 사이클로파민과 복합 치료하는 것은 이 물질 단독 사용의 경우와 비교하였을 때 우위의 효과를 초래하였다.

상기에서 언급된 증거들은 Shh에 대한 중화 항체로 Shh/SMO 신호 경로를 길항시키는 것이 여러 인간 암의 효과적인 치료법이 될 수 있다는 이론을 뒷받침한다. 따라서, Shh 신호발생의 새로운 억제제를 확인할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명은 Shh에 특이적으로 결합하고, Shh의 생물학적 활성을 억제시키는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 구체예들은 Shh에 특이적으로 결합하고, Shh가 이의 수용체인 Patched, 가령, Patched-1 및/또는 Patched 2에 결합하는 것을 억제하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 항체는 Shh에 특이적이다.

본 발명의 구체예들은 Shh에 특이적으로 결합하고, Patched-1 및/또는 Patched 2에 Shh가 결합하는 것을 억제시키는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 표적화된 결합제가 존재하지 않을 경우의 결합과 비교하였을 때, Patched-1에 Shh의 결합을 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75% , 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95% 억제시킨다.

본 발명의 일부 구체예에서, 표적화된 결합제는 5 nanomol (nM) 미만의 결합 친화력(K_D)으로 Shh에 결합한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 1 nM 미만의 K_D로 결합한다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 950 picomol (pM) 미만의 K_D로 Shh에 결합한다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 900 pM 미만의 K_D로 Shh에 결합한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 800 pM, 700 pM 또는 600 pM 미만의 K_D로 결합한다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 500 pM 미만의 K_D로 Shh에 결합한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 400 pM 미만의 K_D로 결합한다. 여전히 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 300 pM 미만의 K_D로 결합한다. 일부 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 200 pM 미만의 K_D로 결합한다. 일부 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 100 pM 미만의 K_D로 결합한다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 50pM, 40pM, 30pM, 20pM 또는 10 pM 미만의 친화력 K_D으로 인간 Shh에 결합할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 1 pM 미만의 친화력 K_D으로 인간 Shh에 결합할 수 있다. K_D는 본 발명의 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법 또는 본원에 기술된 방법을 이용하여 평가될 수 있다(가령, BIAcore 분석, ELISA, FACS) (Biacore International AB , Uppsala , Sweden).

본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 결합 성질들은 해리 또는 연합 속도(차례로 k_off 및 k_on)에 근거하여 측정될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 최소한 10⁴ M^-1S^-1, 최소한 5×10⁴ M^-1S^-1, 최소한 10⁵ M^-1S^-1, 최소한 2 ×10⁵ M^-1S^-1, 최소한 5 ×10⁵ M^-1S^-1, 최소한 10⁶ M^-1S^-1 최소한 5 × 10⁶ M^-1S^-1, 최소한 10⁷ M^-1S^-1, 최소한 5 × 10⁷ M^-1S^-1, 또는 최소한 10⁸ M^-1S^-1의 k_on 속도(항체(Ab)+항원(Ag)^kon→Ab-Ag)를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 5×lO^-1s^-1 미만, lO^-1s^-1 미만, 5×lO^-2s^-1 미만, lO^-2s^-1 미만, 5×lO^-3s^-1 미만, lO^-3s^-1 미만, 5×lO^-4s^-1 미만, lO^-4s^-1 미만, 5×lO^-5s^-1 미만, lO^-5s^-1 미만, 5×lO^-6s^-1 미만, lO^-6s^-1 미만, 5×lO^-7s^-1 미만, lO^-7s^-1 미만, 5×lO^-8s^-1 미만, lO^-8s^-1 미만, 5×lO^-9s^-1 미만, lO^-9s^-1 미만, 또는 lO^-10s^-1 미만의 k_off 속도((Ab-Ag)^koff→항체(Ab)+항원(Ag))를 가질 수 있다.

본 발명의 표적화된 결합제는 인간 Shh에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 다른 종에서 기인된 다른 Shh 단백질과 교차-반응성이 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 마우스 Shh와 교차-반응성이 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey) Shh와 교차 반응성이 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 필리핀 원숭이 Shh 및 마우스 Shh와 교차 반응성이 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 다른 종에서 기인된 Shh 단백질들에 거의 동등한 친화력을 가진다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 인간 Shh 표적화된 결합제는 마우스 Shh에 대하여 거의 동등한 친화력을 가진다. 동등한 수준의 친화력이란, 인간 Shh4에 대한 친화력을 1로 하였을 때, 필리핀 원숭이 Shh에 대한 항체의 친화력이 0.2-5 또는 0.2-2 사이가 된다는 것을 의미한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제의 일부는 관련된 헤지혹 멤버들에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 인간 Indian 헤지혹 homolog (IHH)에 결합할 수 있다. 예를 들면, 6D7은 인간 Indian 헤지혹 및 마우스 Indian 헤지혹 모두에 결합할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 일부 표적화된 결합제는 관련된 헤지혹 멤버들에 결합하지 못한다. 예를 들면, 3H8 및 1G1은 IHH에 결합을 나타내지 않는다. 더욱이, 본 발명의 표적화된 결합제중 어느 것도 DHH에 결합하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 Shh으로 유도된 세포의 골아세포(osteoblast) 분화를 억제한다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제가 보유하는 활성은 10 μM 미만의 IC₅₀ 농도 (50% 억제를 얻기 위한 농도)에서 설명될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 또는 2 nM 미만의 IC₅₀ 농도를 가질 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 Gli1 및 Patched-1 mRNA 유도를 억제한다. 한 실시예에서, 표적화된 결합제가 보유하는 활성은 10 μM 이하의 IC₅₀ 농도 (50% 억제를 얻기 위한 농도)로 설명될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 4 nM, 또는 2 nM 미만의 IC₅₀ 농도를 가질 수 있다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 Gli1 및 2, 및 Patched-1 및 2를 억제할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체들은 대조군과 비교하였을 때(표적화된 결합제 없음), Gli1 및 Patched-1 RNA를 50% 이상, 가령, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제들은 Patched-1에의 결합에 대해 본원에서 기술한 완전한 인간 단클론 항체들 중 임의의 하나와 경쟁한다.

본 발명의 표적화된 결합제는 유익한 효능, 약동학, 및/또는 약력학 성질을 보유한다. 한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 우수한 안전성을 나타내는데, 가령, 심혈관 독성 효과를 나타내지 않는다.

일부 구체예에서, 표적화된 결합제는 비정상적인 Shh 활성과 연관된 상태(condition)을 치료하거나 예방할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 종양 세포 증식을 억제한다. 표적화된 결합제는 화학요법제 섭생과 같은 기타 항암 요법과 병용될 수 있거나, 또는 종양 성장 및/또는 전이를 단독으로 억제하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 항체들은 다음에서 유도된 신경성 질환의 치료(예방 및/또는 증상의 감소)에 이용될 수 있다: (i) 감염성/염증성 및 종양-유도된 손상과 함께, 외상적 손상, 화학적 손상, 도관 손상 및 결핍(가령, 뇌졸중으로 인한 허혈)을 포함하는 신경계의 급성, 준급성 또는 만성적 손상; (ii) 알츠하이머 질환을 포함하는 신경계의 노화; (iii) 파킨슨 질환, 헌팅턴 무도병, 근위축성 측색 경화 및 이와 유사한 것들 뿐만 아니라 척수소뇌변성증을 포함하는 신경계의 만성 신경퇴행성 질환; 및 (iv) 다발성 경색을 포함하는 신경계 또는 신경계에 영향을 주는 만성적 면역 질환.

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 항체다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 단클론 항체다. 본 발명의 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 완전한(fully) 인간 단클론 항체다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 IgG2 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체다. 상기 이소타입은 다른 이소타입들과 비교하여 효과물질(effector) 기능을 유도하는 능력이 감소되어, 감소된 독성을 유도할 수 있을 것이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 IgG1 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체다. IgG1 이소타입은 다른 이소타입들과 비교하여 ADCC를 유도하는 능력이 증가되어, 개선된 효과를 유도할 수 있을 것이다. IgG1 이소타입은 다른 이소타입들, 가령 IgG4와 비교하여 개선된 안정성을 가지며, 이는 개선된 생체이용성 또는 제조의 개선된 용이성 또는 더 긴 반감기를 유도할 수 있을 것이다. 한 구체예에서, IgG1 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체는 z, za 또는 f 알로타입(allotype)이다.

추가 구체예는 Shh에 특이적으로 결합하는, 및 표 9에 나타낸 것과 같이 상보성 결정 부위 (CDR) 서열들중 하나를 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 본 발명의 구체예들은 서열을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체를 포함하며, 이때 서열은 표 9에 나타낸 것과 같은 중쇄 가변 도메인으로부터 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열중 하나를 포함한다. 추가 구체예는 Shh에 특이적으로 결합하는, 및 표 9에 나타낸 것과 같이 중쇄 가변 도메인의 CDR 서열들중 두 개의 서열을 포함하는 서열을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같은 중쇄 가변 도메인으로부터 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같은 경쇄 가변 도메인으로부터 CDR 서열들중 하나의 서열을 포함한다. 본 발명의 구체예들은 서열을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체를 포함하며, 이때 서열은 표 9에 나타낸 것과 같은 경쇄 가변 도메인으로부터 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열중 하나를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표 9에 나타낸 것과 같이, 표적화된 결합제 또는 항체는 경쇄 가변 도메인의 CDR 서열들 중 두 개의 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같은 경쇄 가변 도메인으로부터 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같은 중쇄 가변 도메인으로부터 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과, 표 9에 나타낸 것과 같은 경쇄 가변 도메인으로부터 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적화된 결합제는 항체다. 특정 구체예에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체다. 특정 기타 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체의 결합 단편이다.

한 구체예에서, 본 발명은 Shh에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함하며,

(a) 서열 번호 : 50과 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1 또는 서열 번호: 50의 VH CDR1에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 50의 VH CDR1;

(b) 서열 번호 : 50과 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2 또는 서열 번호: 50의 VH CDR2에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 50의 VH CDR2;

(c) 서열 번호 : 50과 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3 또는 서열 번호: 50의 VH CDR3에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 50의 VH CDR3;

(d) 서열 번호 : 54와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1 또는 서열 번호: 54의 VL CDR1에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 54의 VL CDR1;

(e) 서열 번호 : 54와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2 또는 서열 번호: 54의 VL CDR2에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 54의 VL CDR2; 및

(f) 서열 번호 : 54와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3 또는 서열 번호: 54의 VL CDR3에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 54의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Shh에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함하며,

(a) 서열 번호 : 14와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1 또는 서열 번호: 14의 VH CDR1에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 14의 VH CDR1;

(b) 서열 번호 : 14와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2 또는 서열 번호: 14의 VH CDR2에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 14의 VH CDR2;

(c) 서열 번호 : 14와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3 또는 서열 번호: 14의 VH CDR3에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 14의 VH CDR3;

(d) 서열 번호 : 16과 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1 또는 서열 번호: 16의 VL CDR1에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 16의 VL CDR1;

(e) 서열 번호 : 16과 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2 또는 서열 번호: 16의 VL CDR2에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 16의 VL CDR2; 및

(f) 서열 번호 : 16과 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3 또는 서열 번호: 16의 VL CDR3에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 16의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Shh에 면역특이적으로 결합하는 항체를 포함하며,

(a) 서열 번호 : 22와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR1 또는 서열 번호: 22의 VH CDR1에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 22의 VH CDR1;

(b) 서열 번호 : 22와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR2 또는 서열 번호: 22의 VH CDR2에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 22의 VH CDR2;

(c) 서열 번호 : 22와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VH CDR3 또는 서열 번호: 22의 VH CDR3에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 22의 VH CDR3;

(d) 서열 번호 : 24와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR1 또는 서열 번호: 24의 VL CDR1에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 24의 VL CDR1;

(e) 서열 번호 : 24와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR2 또는 서열 번호: 24의 VL CDR2에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 24의 VL CDR2; 및

(f) 서열 번호 : 24와 동일한 아미노산 서열을 가지는 VL CDR3 또는 서열 번호: 24의 VL CDR3에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 치환체를 포함하는 서열 번호: 24의 VL CDR3을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9504, PTA-9506, PTA-9518, 또는 PTA-9506로 기탁된 Mab6D7VHOP, Mab1G1VH, Mab3H8VH, 및 Mab6D7VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 가변 중쇄 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9503, PTA-9509, PTA-9515, 또는 PTA-9505로 기탁된 Mab6D7VLOP, Mab1G1VL, Mab3H8VL, 및 Mab6D7VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 가변 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9504로 기탁된 Mab6D7VHOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9504로 기탁된 Mab6D7VHOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9503로 기탁된 Mab6D7VLOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9504로 기탁된 Mab6D7VHOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9503으로 기탁된 Mab6D7VLOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9504로 기탁된 Mab6D7VHOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9503으로 기탁된 Mab6D7VLOP로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9507로 기탁된 Mab1G1VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9507로 기탁된 Mab1G1VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9509로 기탁된 Mab1G1VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9507로 기탁된 Mab1G1VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9509로 기탁된 Mab1G1VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9507로 기탁된 Mab1G1VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9509로 기탁된 Mab1G1VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9518로 기탁된 Mab3H8VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9518로 기탁된 Mab3H8VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9515로 기탁된 Mab3H8VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 CDR3를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9518로 기탁된 Mab3H8VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9515로 기탁된 Mab3H8VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9518로 기탁된 Mab3H8VH로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁번호 PTA-9515로 기탁된 Mab3H8VL로 명명된 플라스미드 내 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 항체의 최소한 하나, 최소한 둘 또는 최소한 세 개의 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명 분야의 당업자는 CDR 결정을 바로 완성할 수 있을 것이다. 예를 들면, Kabat et al , Sequences of Protein of Immunological Interest , Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols . 1-3 참고. Kabat는 다수의 종 항체 이소타입으로부터 면역글로불린 쇄의 다중 서열 배열들을 제공한다. Kabat 넘버링 시스템에 따라 배열된 서열들에 번호가 부여된다. Kabat 서열들은 1991 공개된 이후 업데이트되어, 전자 서열 데이터베이스(최근 다운로드가능한 버젼 1997)로 이용가능하다. Kabat 기준 서열과 함께 배열함으로써, Kabat에 따라 임의의 면역글로불린 서열에 번호를 부여할 수 있다. 따라서, Kabat 넘버링 시스템은 면역글로불린 쇄의 넘버링을 위한 균일한(uniform) 시스템을 제공한다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 중쇄 서열들중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체 6D7, 3H8, 1G1, 6D7OP2, 6D7OP, 또는 3H8OP의 중쇄 서열들중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함한다.

경쇄 혼합(promiscuity)은 본 기술 분야에 잘 확립된 것이며, 따라서, 항체 6D7, 3H8, 1G1, 6D7OP, 6D7OP2, 또는 3H8OP 또는 본원에 기술된 또 다른 항체들의 중쇄 서열들중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함한 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 경쇄 서열들중 임의의 하나 또는 항체 6D7, 3H8 또는 1G1, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP 또는 1G1OP 또는 본원에 기술된 또 다른 항체들의 경쇄 서열중 임의의 하나를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 경쇄 서열들중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체들 6D7, 3H8 또는 1G1, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP 또는 1G1OP의 경쇄 서열들중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

일부 구체예에서, 표적화된 결합제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 단클론 항체다: 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP 또는 1G1OP. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 하나 이상의 완전한 인간 단클론 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP 또는 1G1OP를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 6D7이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 3H8이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 1G1이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 6D7OP이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 3H8OP이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 1G1OP이다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 서열중 임의의 하나로부터 선택된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 서열중 임의의 하나로부터 선택된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 또는 6D7OP2의 CDR중 임의의 하나로부터 선택된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 또는 6D7OP2의 CDR중 임의의 하나로부터 선택된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 완전한 인간 단클론 항체들 6D7, 3H8, 1G1, 6D7, 또는 6D7중 임의의 하나의 CDR1, CDR2 또는 CDR3중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 완전한 인간 단클론 항체들 6D7, 3H8, 1G1 또는 6D7 중 임의의 하나의 CDR1, CDR2 또는 CDR3중 임의의 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 완전한 인간 단클론 항체 6D7, 3H8, 1G1 또는 6D7OP의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 완전한 인간 단클론 항체 6D7, 3H8, 1G1 또는 6D7OP의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 완전한 인간 단클론 항체 6D7, 3H8, 1G1 또는 6D7의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열과, 표 9에 나타낸 완전한 인간 단클론 항체 6D7, 3H8, 1G1 또는 6D7의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체 6D7의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체 3H8의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체 1G1의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체 6D7OP2 또는 6D7OP의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다.

일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

본 발명의 추가 구체예는 표 9에 나타낸 것과 같이, 서열들중 임의의 프레임워크 부위 및 CDR, 특히 하나의 FR1 내지 FR4 또는 CDR1 내지 CDR3까지 걸쳐져 있는 인접 서열을 포함하는 서열로 구성된 표적화된 결합제 또는 항체다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 9에 나타낸 것과 같이, 단클론 항체들 6D7, 3H8, 1G1의 서열들중 임의의 하나의 프레임워크 및 CDR, 특히 하나의 FR1 내지 FR4 또는 CDR1 내지 CDR3까지 걸쳐져 있는 인접 서열을 포함하는 서열로 구성된다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 14의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 16의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서는 표적화된 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 제공하는데, 여기서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 22의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 24의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호:46의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호:48의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 50의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 52의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 50의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 56의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 22의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 56의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호: 58의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 서열 번호:60의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 공개된 CDRs 또는 중쇄 또는 경쇄 서열들내에 20개, 16개, 10개, 9개 만큼 또는 이보다 적은 가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 아미노산 추가, 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함한다. 이와 같은 변형은 CDRs 내 임의의 잔기에서 잠재적으로 제조될 수 있을 것이다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 본원에 기술된 CDRs의 변이체또는 유도체, 프레임워크 부분들 및 CDRs (특히 FR1 부터 FR4 또는 CDR1 부터 CDR3)을 연결하는 인접 서열들, 본원에 기술된 것과 같은 경쇄 또는 중쇄 서열들, 또는 본원에 기술된 것과 같은 항체들을 포함한다. 변이체들은 표 9에 나타낸 것과 같이, CDR1, CDR2 또는 CDR3중 임의의 하나, 표 9에 나타낸 것과 같이 프레임워크 부분들 및 CDRs (특히 FR1 부터 FR4 또는 CDR1 부터 CDR3)을 연결하는 인접 서열들, 본원에 기술된 경쇄 또는 중쇄 서열들, 또는 본원에 기술된 단클론 항체들중 임의의 하나에 20개, 16개, 10개, 9개 만큼 또는 이보다 적은 가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 추가, 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함하는 서열들을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체들을 포함한다. 변이체들은 표 9에 나타낸 것과 같이, CDR1, CDR2 또는 CDR3중 임의의 것, 프레임워크 부분들 및 CDRs (특히 FR1 부터 FR4 또는 CDR1 부터 CDR3)을 연결하는 인접 서열들, 본원에 기술된 경쇄 또는 중쇄 서열들, 또는 본원에 기술된 단클론 항체들과 최소한 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가지는 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다. 두 개 아미노산 서열의 동일성은 본 기술 분야의 당업자에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있는데, 단백질 쌍정열법(pairwise protein alignment)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 변이체들은 본원에 기술된 CDR 서열들 또는 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드내 변이를 포함하며, 이는 자연적으로 발생되거나 또는 재조합 DNA 기술 또는 돌연변이 생성 기술을 이용하여 시험관에서 고유 서열들을 조작하여 도입된 것이다. 자연 발생적 변이체들은 생체내에서 외부 항원에 대한 항체 발생 동안 대응하는 생식계열 뉴클레오티드 서열들에서 발생되는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 유도체는 두 개 이상의 항체들이 서로 링크된 이형(hetero) 항체가 될 수도 있다. 유도체들은 화학적으로 변형된 항체들을 포함한다. 예로는 하나 이상의 폴리머, 예를 들면 수용성 폴리머, N-링크된 또는 O-링크된 탄수화물, 슈가, 포스페이트 및/또는 기타 이와 같은 분자들의 공유적 부착을 포함한다. 유도체들은 부착된 분자의 유형 또는 위치에서 자연 발생적 또는 개시 항체와는 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 항체에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 화학기 결손을 더 포함한다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제는 이중특이적(bispecific) 항체다. 이중특이적 항체는 최소한 두 가지 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체다. 이중특이적 항체들을 만드는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들면, Millstein et al , Nature , 20 305: 537-539 (1983); Traunecker et al , EMBO J, 10:3655-3659 (1991); Suresh et al , Methods in Enzymology , 121:210 (1986); Kostelny et al , J. Immunol , 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al , Proc . Natl Acad. ScL USA , 90:6444-6448 (1993); Gruber et al , J. Immunol , 152: 5368 (1994); 미국 특허 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; 및 4,676,980, WO 94/04690; WO 91/00360; WO 92/200373; WO 93/17715; WO 92/08802; 및 EP 03089를 참고)

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 14의 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 14는 표 12의 각 일부 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합중 하나를 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 14는 표 12에 표시된 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 또는 셋 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 14는 표 12의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다. 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기들은 돌연변이되어 그 위치에 대응하는 생식계열 잔기를 만든다.

본 발명의 추가 구체예는 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체들과 Shh에 결합하기 위해 경쟁하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체들과 Shh에 결합하기 위해 경쟁하는 항체가 있다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 완전한 인간 단클론 항체들중 임의의 하나와 Shh에 결합을 위해 경쟁한다. "경쟁하다(Competes)"는 표적화된 결합제 또는 항체가 완전한 인간 단클론 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP중 임의의 하나와 Shh에 결합에 대해 경쟁하는 것을 나타내며, 가령, 경쟁은 일방향성(unidirectional)이다.

본 발명의 구체예들은 Shh에 결합에 대해 완전한 인간 단클론 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP중 임의의 하나와 교차 경쟁하는 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다. "교차 경쟁하다(Cross competes)"는 표적화된 결합제 또는 항체가 완전한 인간 단클론 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP 중 임의의 하나와 Shh에 결합하기 위해 경쟁하고 또한 역으로 경쟁하는 것을 나타내는데, 가령, 경쟁은 양방향성(bidirectional)이다.

본 발명의 추가 구체예는 Shh에 결합하기 위해 경쟁하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, Shh에 결합하기 위해 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체와 교차-경쟁하는 표적화된 결합제 또는 항체들이 있다.

본 발명의 추가 구체예는 Shh에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체들이 결합하는 동일한 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 본 발명의 구체예들은 완전한 인간 단클론 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP 중 임의의 하나가 결합하는 동일한 Shh 상 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제 또는 항체 또한 포함한다.

본 발명의 기타 구체예들은 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들중 임의의 것을 인코드하는 분리된 핵산 분자들, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들을 인코드하는 분리된 핵산 분자를 가지는 벡터 또는 이와 같은 핵산 분자들중 임의의 것으로 형질변환된 숙주 세포를 포함한다. 본 발명의 구체예들은 Shh에 특이적으로 결합하고, Shh가 Patched-1에 결합하는 것을 저해하는 완전한 인간의 분리된 표적화된 결합제를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 본원에서 정의된 엄격성(stringent) 또는 낮은 엄격성 하이브리드반응 조건하에, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들중 임의의 것을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 하이브리드되는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다. 본 발명의 구체예들은 또한 결합제를 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터도 포함한다. 추가 구체예들은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포도 포함한다.

본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 항체들은 예를 들면, 다클론 항체, 올리고클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및/또는 완전한 인간 항체들이 유익할 것이다.

본 발명의 구체예들은 임의의 특정 형태의 항체 또는 생산 또는 생성 방법에 제한을 두는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체의 결합 단편이다. 예를 들면, 표적화된 결합제는 전장(full-length) 항체 (가령, 인간의 고유한 Fc 부분을 가지는) 또는 항체-결합 단편 (가령, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, FV 또는 dAb)이 될 수 있다. 추가로, 항체들은 dAb 단편과 같은, Shh에 결합하는 Camelid 또는 인간의 단일 VH 또는 VL 도메인과 같은 단일-도메인 항체들이 될 수 있다.

본원에 기술된 본 발명의 구체예들은 이와 같은 항체들을 생산하는 세포들을 또한 제공한다. 세포의 예로는 하이브리도마 또는 재조합에 의해 생성된 세포 가령, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, CHO의 변이체들(예를 들면, DG44) 및 Shh에 대한 항체를 생산하는 NSO 세포들을 포함한다. CHO 세포들의 변이체들에 대한 추가 정보는 Andersen and Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462에서 볼 수 있으며, 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다. 항체는 항체를 분비하는 하이브리도마로부터 제조되거나 또는 항체를 인코드하는 유전자로 형질변환 또는 형질감염된 유전공학적으로 조작된 세포로부터 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 한 구체예는 핵산 분자가 발현되어, 항체가 만들어지고, 이어서 항체를 회수하는 조건들하에서 숙주 세포를 배양함으로써, 본 발명의 항체를 생산하는 방법이다. 본 발명의 구체예들은 항체 생산을 위하여 숙주 세포로 형질감염될 때 항체 또는 이의 단편들의 생산율을 증가시키기 위해 최적화된 핵산 서열을 포함한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 인코드하는 임의의 핵산 분자 또한 포함한다는 것을 인지해야만 한다.

본원에서 추가 구체예는 Shh에 특이적으로 결합하고, Shh의 생물학적 활성을 억제시키는 항체를 생산하는 방법을 포함하며, 이 방법은 인간 Shh를 발현시키는 세포를 포유류에 면역주사하고, 인간 Shh, 정제된 인간 Shh 또는 이의 단편, 및/또는 하나 이상의 진화론적으로 유사한(orthologous) 서열들 또는 이의 단편들을 포함하는 세포막을 분리하는 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체 또는 이의 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가 구체예는 Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써 증식성 혈관신생 질환을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 질환의 치료를 요하는 동물을 선택하고, Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써, 종양성 질환을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 종양성 질환의 치료를 요하는 동물을 선택하고, Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써, 악성 종양을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 악성 종양의 치료를 요하는 동물을 선택하고, Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예에서는 Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써, Shh 발현과 연관된 질환 또는 상태를 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 Shh 발현과 연관된 질환 또는 상태의 치료를 요하는 동물을 선택하고, Shh에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

악성 종양은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성 및 표피암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

치료가능한 증식성 또는 혈관신생 질환은 종양성 질환 가령, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 진행된 비-소세포 폐암, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 담낭암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 신장 세포암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성 및 표피암, 및 Gleevec-저항성 CML을 포함하는 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함하는 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 임파종을 포함하는 임파종; 및 다발성 골수종을 포함하는 골수종을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 Shh에 단독으로 좌우되는 또는 부분적으로 좌우되는 종양을 가진 환자에서 Shh를 억제시키는데 사용하기에 적합하다.

본 발명의 추가 구체예들은 증식성, 또는 혈관신생 관련 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 증식성, 또는 혈관신생 - 관련 질환 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 종양성 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 종양성 질환 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 비-종양성 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 비-종양성 질환 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 악성 종양을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 악성 종양 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 Shh 발현과 연관된 질환 또는 상태를 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 Shh 발현 연관된 질환 또는 상태의 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 증식성 또는 혈관신생-관련 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 종양성 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 악성 종양을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 Shh 발현 연관된 질환 또는 상태를 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 Shh 유도된 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

한 구체예에서, 종양성 질환; 악성 종양; 신경성 질환; 안과 질환; 만성 염증성 질환; Shh 발현 연관된 질환 또는 상태의 치료는 상기 언급된 질환 또는 상태중 임의의 것을 관리, 개선, 예방하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 종양성 질환의 치료는 종양 성장의 억제, 종양 성장의 지연, 종양의 퇴보, 종양의 축소, 치료 중단시 종양의 재성장까지 소요되는 시간의 연장, 종양 재발까지 소요되는 시간의 연장, 질환 진행의 지연을 포함한다.

본 발명의 일부 구체예들에서, 치료될 동물은 인간이다.

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체다.

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 구체예들은 본원에 기술된 표적화된 결합제와 치료제로 구성된 콘쥬게이트를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 치료제는 톡신이다. 다른 구체예에서, 치료제는 방사성 동위 원소다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 약제학적 조성물이다.

또 다른 측면에서, 환자에서 암 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 환자에게 완전한 인간 항체 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 완전한 인간 항체 콘쥬게이트는 Shh 및 물질에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 결합제는 톡신, 방사성 동위 원소, 또는 암 세포를 죽일 수 있는 기타 물질이다. 따라서, 항체 콘쥬게이트는 암세포를 선택적으로 죽인다.

한 측면에서, Shh에 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트된 완전한 인간 항체가 제공된다. 물질이 항체에 부착되고, 항체가 세포에 결합되어, 결합제가 세포로 운반되게 된다. 한 구체예에서, 상기 콘쥬게이트된 완전한 인간 항체는 Shh의 세포외 도메인에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체 및 콘쥬게이트된 톡신은 Shh를 발현시키는 세포에 의해 내재화된다. 또 다른 구체예에서, 물질은 세포독성 물질이다. 또 다른 구체예에서, 물질은 예를 들면 사포린 또는 아우리스타틴, 슈도모나스 엑소톡신, 겔로닌, 리친, 칼리케미신 또는 메이탄신-계 면역콘쥬게이트 및 이와 유사한 것이 된다. 또 다른 구체예에서, 물질은 방사성 동위 원소다.

본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 단독으로 투여될 수 있거나 또는 추가 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 세포 증식을 차단하는 Shh의 단클론 항체, 올리고클론 항체 또는 다클론 항체 혼합물은 종양 세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 약물과 복합하여 투여될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 Shh 표적 물질은 다른 화학요법적 치료, 예를 들면, 항-VEGF 물질들을 포함하는 치료에 실패한 환자들에게 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 질환 또는 상태를 진단하는 방법을 포함하며, 본원에 기술된 항체들은 환자 또는 환자의 시료에서 Shh 수준을 탐지하는데 이용된다. 한 구체예에서, 환자 시료는 혈액 또는 혈청 또는 뇨가 된다. 추가 구체예에서, 위험 인자들의 확인 방법, 질병 진단 방법, 질병의 단계 진단 방법은 항-Shh 항체들을 이용하여 Shh의 발현 및/또는 과다발현을 확인하는 것과 관련된 것이다. 일부 구체예들에서, 이들 방법들은 세포에서 Shh에 선택적으로 결합하는 완전한 인간 항체 콘쥬게이트를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 항체 콘쥬게이트는 Shh에 특이적으로 결합하는 항체와 라벨을 포함한다. 이 방법들은 환자에서 라벨의 존부를 관찰하는 것을 더 포함한다. 상대적으로 많은 양의 라벨이 존재한다는 것은 질병의 위험이 상대적으로 높다는 것을 나타낼 것이며, 라벨의 양이 상대적으로 적다는 것은 질병의 위험이 상대적으로 낮다는 것을 나타낼 것이다. 한 구체예에서, 라벨은 그린 형광 단백질이다.

본 발명은 또한 환자 시료에서 Shh의 수준을 분석하는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 본원에 기술된 항체를 환자의 생물학적 시료에 접촉시키고, 항체와 시료 내 Shh 사이에 결합 수준을 탐지하는 것을 포함한다. 더욱 특이적 구체예에서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본원에 기술된 항체를 혈청 또는 세포에 접촉시키고, Shh의 존재를 탐지함으로써, 세포에서 Shh의 발현과 관련된 상태를 진단하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 이상은 종양성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 증식성 - 관련 질환이 될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Shh -관련 질환을 스크리닝하기 위하여 포유류 조직, 세포 또는 유체내에 Shh를 탐지하기 위한 분석 키트를 포함한다. 키트는 본원에 기술된 항체, 및 Shh(존재한다면)와 항체의 반응을 표지하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 단클론 항체다. 한 구체예에서, Shh에 결합하는 항체는 라벨되어 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 라벨링되지 않은 1차 항체이며, 및 키트는 1차 항체를 탐지하는 수단을 더 포함한다. 한 구체예에서, 탐지 수단은 항-면역글로불린인 라벨링된 제2항체를 포함한다. 항체는 형광색소, 효소, 방사성핵종 및 방사선불투과성 물질로 구성된 군으로부터 선택된 마커로 라벨될 수 있다.

일부 구체예들에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여하는 능력을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용기(effector) 세포를 활성화시키고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용기 세포를 활성화시키고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 강화시키고, 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여하는 능력을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다.

일부 구체예들에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여하는 능력을 감소시키기 위하여 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용기 세포를 활성화시키고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 감소시키기 위하여 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용기 세포를 활성화시키는 능력, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 모두 감소시키고, 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여하는 능력을 감소시키기 위하여 변형될 수 있다.

특정 구체예에서, 본원에 기술된, 표적화된 결합체 또는 항체의 반감기 및 본 발명의 조성물의 반감기는 최소한 약 4일 내지 7일이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체의 평균 반감기 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 최소한 약 2일 내지 5일, 3일 내지 6 일, 4 일 내지 7 일, 5 일 내지 8 일, 6 일 내지 9 일, 7 일 내지 10 일, 8 일 내지 11 일, 8 일 내지 12, 9 일 내지 13, 10 일 내지 14일, 11 일 내지 15일, 12 일 내지 16일, 13 일 내지 17일, 14 일 내지 18일, 15 일 내지 19일, 또는 16 일 내지 20 일이다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체의 평균 반감기 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 최소한 약 17 일 내지 21 일, 18 일 내지 22 일, 19 일 내지 23 일, 20 일 내지 24 일, 21 일 내지 25 일, 22 일 내지 26 일, 23 일 내지 27 일, 24 일 내지 28 일, 25 일 내지 29 일, 또는 26 일 내지 30 일이다. 추가 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체의 평균 반감기 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 최대 약 50 일이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체들 및 조성물의 반감기는 본 기술 분야에 공지된 방법들에 의해 연장될 수 있다. 이와 같은 연장으로 항체 조성물의 양 및/또는 투약 빈도를 감소시킬 수 있다. 생체내 반감기가 개선된 항체들 및 이를 만드는 방법들은 미국 특허 6,277,375; 및 국제 공개 WO 98/23289 및 WO 97/4661에 설명되어 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 용기를 포함하는 제품을 제공한다. 용기는 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체를 포함하는 조성물, 및 당해 조성물이 Shh의 발현 또는 과다발현을 특징으로 하는 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 증식-관련 질병의 치료에 이용될 수 있다는 것을 표시한 포장 삽입물 또는 라벨을 포함한다.

다른 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체를 포함하는 조성물, 및 치료를 요하는 개체에게 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 변이체 Fc 부분을 포함하는 단백질 제제를 제공한다. 이것은 자연적으로 발생되지 않는 Fc 부분, 예를 들면, 하나 이상의 자연적으로 발생되지 않는 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 부분이다. 본 발명의 변이체 Fc 부분에는 아미노산 결손, 추가 및/또는 변형을 포함하는 Fc 부분들도 포함된다.

Fc 부분을 포함하는 단백질들의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 부분의 결합 친화력을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 한 구체예에서, Fc 변이체 단백질은 필적되는 분자와 비교하여 증가된 혈청 반감기를 가진다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239, 330 및 332으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 추가적인 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산, 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 추가 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 및 331S 비-자연적으로 발생되는 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235Y, 및 331S 비-자연적으로 발생되는 아미노산 잔기를 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 추가적인 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산; 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239, 330 및 332로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 추가적인 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산, 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 추가적인 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산; 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

비-자연적으로 발생되는 Fc 부분을 만드는 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 아미노산 치환 및/또는 결손은 부위-지시된 돌연변이형성 (Kunkel, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985)), PCR 돌연변이형성 (Higuchi , in " PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications", Academic Press , San Diego , pp . 177-183 (1990)), 및 카세트 돌연변이형성 (Wells et al , Gene 46:315-323 (1985))을 포함하나 이에 한정되지 않는 돌연변이형성 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 부위-지시된 돌연변이형성은 오버랩-연장 PCR 방법(Higuchi , in " PCR Technology : Principles and Applications for DNA Amplification ", Stockton Press , New York, pp . 61-70 (1989))에 의해 실행된다. 오버랩-연장 PCR (Higuchi , ibid .) 기술은 표적 서열(출발 DNA)에 임의의 원하는 돌연변이를 도입시킬 때 이용될 수도 있다. 예를 들면, 오버랩-연장법에서 제1라운드 PCR은 표적 서열을 아웃사이드 프라이머 (프라이머 1)와 내부 돌연변이형성 프라이머 (프라이머 3)로, 및 별도로 제2 아웃사이드 프라이머 (프라이머 4) 및 내부 프라이머 (프라이머 2)로 증폭시키고, 2개의 PCR 단편 (단편 A 및 B)을 만드는 것을 포함한다. 내부 돌연변이형성 프라이머 (프라이머 3)는 원하는 돌연변이를 특정하는 표적 서열에 미스매취(mismatch)를 포함하도록 고안된다. PCR 제2라운드에서, PCR의 제1라운드 산물(단편 A 및 B)은 두 개의 아웃사이드 프라이머(프라이머 1 및 4)를 이용한 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 전장 PCR 단편 (단편 C)은 제한효소로 절단되고, 생성된 제한효소 절단 단편은 적절한 벡터내에 클론된다. 돌연변이 형성의 제1 단계로, 출발 DNA (가령, Fc 융합 단백질, 항체 또는 단순하게 Fc 부분을 인코드하는)는 돌연변이형성 벡터내로 작용가능하게 클론된다. 프라이머들은 원하는 아미노산 치환을 반영하도록 고안된다. 변이체 Fc 부분을 만드는데 유용한 기타 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있다(가령, 미국 특허 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; U.S. 특허 공개 2004/0002587 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351 참고).

본 발명의 일부 구체예들에서, 본원에서 제공된 항체들의 글리코실화 패턴을 변형시켜 ADCC 및 CDC 작용기 기능을 강화시킨다. Shields RL et al , (2002) JBC . 277:26733; Shinkawa T et al , (2003) JBC . 278:4666 and Okazaki A et al , (2004) J. MoI . Biol ., 336: 1239 참고. 일부 구체예들에서, Fc 변이체 단백질은 하나 이상의 조작된 당형(glycoforms), 즉, Fc 부분을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 탄수화물 조성물을 포함한다. 조작된(Engineered) 당형은 작용기 기능의 보강 또는 감소를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 당형은 본 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있는데, 예를 들면, 조작된 또는 변이체 발현 스트레인(strain)를 이용하여, 하나 이상의 효소, 예를 들면 DI N-아세틸글루코사아미닐트란스퍼라제 III (GnTI11)의 공동 발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체의 세포계에서 Fc 부분을 포함하는 분자의 발현에 의해, 또는 Fc 부분을 포함하는 분자가 발현된 후에 탄수화물의 변형에 의해 생성될 수 있다. 조작된 당형을 생성하는 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 문헌[Umana et al , 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies et al, 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al , 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al , 2003, J Biol Chem 278:4666-4673) U.S. Pat. No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ 기술(Biowa, Inc. Princeton, NJ.); GlycoMAb™ 글리코실화 조작 기술(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)]을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들에서 설명되어 있다. 가령, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al , 2004, JMB , 336: 1239-49 참고.

Fc 부분의 글리코실화는 작용기 기능의 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다는 것 또한 본 기술 분야에 공지된 것이다 (예를 들면, Umana et al , 1999, Nat . Biotechnol 17:176-180; Davies et al , 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al , 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al , 2003, J Biol Chem 278:4666-4673) U.S. Pat. No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140Al; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ 기술(Biowa , Inc . Princeton , NJ .); GlycoMAb™ 글리코실화 조작 기술(GLYCART biotechnology AG , Zurich , Switzerland) 참고. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체들의 Fc 부분은 아미노산 잔기의 변형된 글리코실화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 잔기의 변형된(altered) 글리코실화는 낮은 작용기 기능을 야기한다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 잔기의 변형된 글리코실화는 작용기 기능을 증가시킨다. 특정 구체예에서, Fc 부분은 감소된 퓨코실화(fucosylation)를 가진다. 또 다른 구체예에서, Fc 부분은 퓨코실이 제거된다(예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 No.2005/0226867).

도 1은 Colo205 이종이식편 종양 기질에서 특정 항체에 의해 마우스 Gli1 및 Ptc1의 약력학적 조정으로 인한 결과를 나타내는 막대 그래프다.
도 2는 세 가지 패널로 구성되는데, 이들은 막대 그래프로 나타낸 Colo205 이종이식편 종양에서 기질 헤지혹 표적 마우스 Gli1 및 Ptc1의 수준에 대해 단일 0.5 mg/kg 투여후 특정 항체들의 약물동태학을 선 그래프로 나타낸다.
도 3a는 항체 3H8에 의한 HT-29 이종이식편 종양 성장 억제를 보여주는 선 그래프다.
도 3b는 항체 치료에 의해 종양의 성장이 억제된 HT-29 이종이식편 종양의 기질에서 발현되는 헤지혹 표적 유전자에 대한 항체 3H8의 약력학적 효과를 보여주는 막대 그래프다.
도 4a는 누드 마우스에서 특정 항체에 의해 1차 결장암종 종양 모델 HCXF-001의 성장 억제를 보여주는 선 그래프다.
도 4b는 특정 항체를 사용한 치료에 의해 종양의 성장이 억제된 HXCF-001 이종이식편 종양 기질에서 헤지혹 표적 유전자의 약력학 조절로 인한 결과를 보여주는 막대 그래프다.
도 5는 항체 6D7에 의한 HT-55 이종이식편 종양 성장 억제를 보여주는 선 그래프다.

본 발명의 구체예들은 신규한 Shh 차단 분자 세트, 예를 들면, Shh가 Patched 1/2에 결합하는 것을 방해하는 항체들에 관한 것이다. 이와 같은 분자들은 단일 물질로 이용되거나 또는 대안으로 다른 결합 항체들/물질들과 복합하여 이용될 수 있다. 이들은 또한 임의의 표준 또는 신규한 항암제와 복합하여 이용될 수 있다.

본 발명의 구체예들은 Shh에 결합하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 Shh에 결합하여, Shh가 이의 수용체 Patched-1/2에 결합하는 것을 방해한다. 일부 구체예들에서, 이와 같은 결합은 하나 이상의 Shh-연합된 효과를 중화, 차단, 억제, 폐기 또는 간섭할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 단클론 항체들, 또는 이의 결합 단편이다. 이와 같은 단클론 항체들은 본원에서 항-Shh 항체들이라고 지칭될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예들은 완전한 인간 항-Shh 항체들, 및 치료요법적으로 유용한 항체 제제(preparations)를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항-Shh 항체 제제는 Shh에 대한 강력한 결합 친화력, 내피 세포 자가-사멸을 촉진시키는 능력 또는 내피 세포 증식을 억제하는 능력, 및 ADCC 및/또는 CDC 활성을 통하여 내피 세포 세포독성을 유도하는 능력을 포함한, 바람직한 치료요법적 성질을 가진다.

또한, 본 발명의 구체예들은 질환을 치료하기 위하여 이들 항체들을 이용하는 방법들을 포함한다. 본 발명의 항-Shh 항체들은 Shh-매개된 종양 세포 증식을 방지하는데 유용하다. 전이성 암, 임파성 종양 및 혈액 암을 포함하는 임의의 유형의 악성 종양을 특징으로 하는 임의의 질환이 이와 같은 억제 기전에 의해 치료될 수 있다. 인간에서 예시적인 암은 방광 종양, 신장 세포암, 유방 종양, 전립선 종양, 기저세포암, 담관암, 방광암, 뼈암, 뇌 및 CNS 암 (가령, 신경교종 종양), 경부암, 융모막암종, 결장 및 직장암, 결합조직암, 소화계 암; 자궁내막암, 식도암; 안구암; 머리 및 목 암; 위암; 상피내 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암 (가령, 소세포 및 비-소세포); 호지킨 및 비-호지킨 임파종을 포함하는 임파종; 흑색종; 다발성 골수종을 포함하는 골수종, 신경아세포종, 구강 암 (가령, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암, 망막아종; 횡문근육종; 직장암, 신장암, 호흡기암; 육종, 피부암; 위암, 고환암, 갑상선암; 자궁암, 뇨도계암 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종을 포함한다. 개, 고양이 및 기타 애완동물에서 흔히 진단되는 악성 질환은 림프육종, 골육종, 유방 종양, 비만세포종, 뇌 종양, 흑색종, 선편평세포암종, 암양종 폐종양, 기관지 선 종양, 세기관지 선종, 섬유종, 점액연골종, 폐육종, 신경육종, 골종, 유두종, 망막아종, Ewing 육종, Wilm 종양, Burkitt 임파종, 소교종, 신경아세포종, 파골세포종, 경구 종양, 섬유육종, 골육종 및 횡문근육종, 생식기 편평상피세포 암종, 전염가능한 성교 종양, 고환 종양, 선형고환종, Sertoli 세포 종양, 혈관주위세포종, 조직구종, 녹색종(가령, 과립구 육종), 각막 유두종, 각막 편평상피세포 암종, 혈관육종, 흉막 중피종, 기저 세포 종양, 흉선종, 위 종양, 부신 암종, 경구 유두종증, 혈관내피종 및 낭성선종, 소포성 림프종, 내장 림프종, 섬유육종 및 폐 편평상피세포 암종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 흰 족제비와 같은 설치류에서, 예시적인 암은 인슐린종, 림프종, 육종, 신경종, 췌장 섬 세포종, 위 MALT 림프종 및 위 선종을 포함한다. 농가 가축에 영향을 주는 종양은 백혈병, 혈관외피종 및 소과 동물 안구 종양(소에서); 음경 섬유육종, 궤양성 편평상피 세포 암종, 음경 암종, 결합 조직 종양성 및 비만세포종(말에서); 간세포 암종(돼지에서); 림프종 및 폐 선종증(양에서); 폐 육종, 림프종, Rous 육종, 세망-내피증, 섬유육종, 신아세포종, B-세포 림프종 및 암파구성 백혈병(조류 종에서); 망막아종, 간 종양, 림프육종(림프아구성림프종), 형질구모양 백혈병 및 부레 육종(물고기에서), 건락성 임파선염 (CLA): 세균 코리네박테리움 슈도투베르클로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis)에 의한 양 및 염소의 만성, 감염성, 접촉성 질환, 및 jaagsiekte에 의한 양의 전염성 폐 종양을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예들은 생물학적 시료내 Shh의 양을 특이적으로 측정하는 진단 분석을 포함한다. 분석 키트는 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체와 함께, 이와 같은 항체들을 탐지하기 위한 필수적인 라벨을 포함할 수 있다. 이와 같은 진단 분석은 종양성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포 증식 관련 질환을 스크리닝하는데 유용하다.

본 발명의 또 다른 측면은 Shh의 생물학적 활성의 길항제인데, 여기서, 길항제는 Shh에 결합한다. 한 구체예에서, 길항제는 항체와 같은 표적화된 결합제다. 길항제는 본원에 기술된 항체, 예를 들면, 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP로부터 선택될 수 있다.

한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 Shh에 결합하고, 이에 의해 헤지혹 수용체, Patched-1에 리간드 결합을 억제 또는 저해시켜 세포 증식을 억제할 수 있다.

한 구체예는 완전한 인간 단클론 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP와 동일한 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제다.

한 구체예는 완전한 인간 단클론 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP와 동일한 에피토프에 결합하는 항체다.

한 구체예는 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 생산하는 하이브리도마다. 한 구체예는 상기에서 설명된 항체들의 중쇄 및/또는 경쇄를 생산하는 하이브리도마다. 한 구체예에서, 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 또 다른 구체예에서, 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 대안으로, 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 생산할 수 있다.

또 다른 구체예는 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 인코드하는 핵산 분자다. 한 구체예는 상기에서 설명된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코드한다. 또 다른 구체예는 항체들 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2, 3H8OP, 또는 1G1OP으로부터 선택된 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기에서 설명된 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터이며, 여기서, 상기 벡터는 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 인코드한다. 본 발명의 한 구체예는 상기에서 설명된 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터이며, 여기서, 상기 벡터는 상기에서 설명된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 인코드한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기에서 설명된 벡터를 포함하는 숙주 세포다. 대안으로, 숙주 세포는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.

추가로, 본 발명의 한 구체예는 핵산 분자가 표적화된 결합제를 생산하기 위해 발현되는 조건에서 숙주 세포를 배양하고, 표적화된 결합제를 회수함으로써 본 발명의 표적화된 결합제를 생산하는 방법이다. 본 발명의 한 구체예는 핵산 분자가 항체를 생산하기 위해 발현되는 조건하에서 숙주세포를 배양하고 항체를 회수하여 본 발명의 항체를 생산하는 방법이다.

한 구체예에서, 본 발명은 최소한 하나의 숙주 세포에 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 인코드하는 최소한 하나의 핵산 분자를 형질감염시키고, 상기 핵산 분자를 상기 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 표적화된 결합제를 분리함으로써 표적화된 결합제를 만드는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 최소한 하나의 숙주 세포에 상기에서 설명된 항체를 인코드하는 최소한 하나의 핵산 분자를 형질감염시키고, 상기 핵산 분자를 상기 숙주 세포에서 발현시키고, 항체를 분리함으로써 항체를 만드는 방법을 포함한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기술된 길항제를 투여함으로써 Shh의 생물학적 활성을 길항시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포 증식에 대한 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성의 길항제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 투여함으로써 Shh의 생물학적 활성을 길항시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포 증식에 대한 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 설명된 항체를 투여함으로써 Shh의 생물학적 활성을 길항시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포 증식에 대한 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성의 길항제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 세포 증식을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포 증식에 대한 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성의 길항제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 세포 증식을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포 증식에 대한 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 표적화된 결합제는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 세포 증식을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포 증식에 대한 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성의 길항제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성의 길항제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 길항제는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 표적화된 결합제는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 종양 세포 증식을 감소 또는 억제하는 방법이 제공된다. 이 방법은 증식의 감소 또는 억제를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 종양 성장 및/또는 전이를 감소시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 종양 성장 및/또는 전이의 감소증식를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, 세포 증식 치료용 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성의 길항제의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

또 다른 측면에 따르면, 세포 증식 치료용 약물로 사용하기 위한 Shh의 생물학적 활성의 길항제를 제공한다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

또 다른 측면에 따르면, 세포 증식 치료용 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에 따르면, 세포 증식 치료용 약물로 사용하기 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체를 제공한다.

또 다른 측면에 따르면, 질환 관련된 세포 증식 치료용 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에 따르면, 질환 관련된 세포 증식 치료용 약물로 사용하기 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성의 길항제의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류의 암 치료용 약물로 사용하기 위한 Shh의 생물학적 활성의 길항제를 제공한다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, Shh의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물로 이용되는 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물로 이용되는 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 동물에서 증식 감소 또는 억제를 위한 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 동물에서 증식 감소 또는 억제, 및/또는 혈관신생의 감소 또는 억제를 위한 약물의 제조를 위한 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 동물에서 종양 성장 및/또는 전이를 감소시키기 위한 약물로 이용되는 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 동물에서 종양 성장 및/또는 전이를 감소시키기 위한 약물로 이용되는 Shh의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체를 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명은 Shh 수용체 신호발생에 좌우되는 또는 부분적으로 좌우되는 종양을 가진 환자에게서 Shh를 길항시키는데 사용하기에 특히 적합하다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성의 길항제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 길항제는 항체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, Shh의 생물학적 활성의 길항제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 길항제는 항체를 포함한다.

일부 구체예들에서, Shh에 특이적으로 결합하는 항체 투여후, 청소제(clearing agent)가 투여되어 혈액으로부터 과량의 순환 항체를 제거한다.

항-Shh 항체들은 환자 시료에서 Shh를 탐지하는데 유용하며, 따라서 본원에 기술된 질병 상태의 진단제로 유용하다. 또한, Shh-매개된 신호발생 활성을 유의적으로 억제하는 이들 능력에 근거하여(하기 실시예에서 설명됨), 항-Shh 항체들은 Shh 발현으로 인한 증상 및 이상의 치료에 치료요법적 효과를 가진다. 특정 구체예들에서, 본원에 기술된 항체들 및 방법들은 Shh-유도된 증식 및/또는 세포내 신호생성으로 인한 증상의 치료에 관한 것이다. 추가 구체예들은 종양성 질환, 가령, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암을 포함하는 세포 증식-관련 질환 치료를 위하여 본원에 기술된 항체 및 방법들을 이용하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 증식 관련 질환을 스크리닝하기 위하여 포유류 조직, 세포 또는 유체에서 Shh를 탐지하기 위한 분석 키트를 포함한다. 키트는 Shh에 결합하는 표적화된 결합제, 및 Shh(존재한다면)와 표적화된 결합제 사이의 반응을 표지하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, Shh에 결합하는 표적화된 결합제는 라벨링된다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 라벨링되지 않으며, 및 키트는 표적화된 결합제를 탐지하는 수단을 더 포함한다. 바람직하게는 표적화된 결합제는 형광색소, 효소, 방사성핵종 및 방사선불투과성 물질로 구성된 군으로부터 선택된 마커로 라벨링될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 증식-관련 질환을 스크리닝하기 위하여 포유류 조직, 세포 또는 유체내에 Shh를 탐지하기 위한 분석 키트를 포함한다. 키트는 Shh에 결합하는 항체, 및 Shh(존재한다면)와 항체의 반응을 표지하는 수단을 포함한다. 항체는 단클론 항체가 될 수 있다. 한 구체예에서, Shh에 결합하는 항체는 라벨링되어 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 라벨링안된 1차 항체이며, 키트는 1차 항체를 탐지하는 수단을 더 포함한다. 한 구체예에서, 수단은 항-면역글로불린이 라벨링된 제2항체를 포함한다. 항체는 형광색소, 효소, 방사성핵종 및 방사선불투과성 물질로 구성된 군으로부터 선택된 마커로 라벨링될 수 있다.

본원에 기술된 항체에 대한 추가 구체예, 특징 및 이와 유사한 것들은 하기에서 더 상세하게 제공된다.

서열 리스트

본 발명의 구체예들은 표 1에서 열거된 특정 항체들을 포함한다. 이 표는 각 항-Shh 항체의 식별 번호와 함께, 대응하는 중쇄 및 경쇄 유전자 및 폴리펩티드의 가변 도메인의 서열 번호를 차례로 함께 나타낸다. 각 항체는 식별번호로 제공된다.

[표 1a]

[표 1b]

정의

다른 정의가 없는 한, 본원에서 사용된 과학적 및 기술적 용어는 본 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 또한, 내용에서 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 세포, 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리드 반응과 관련된 명칭 및 이들 기재에 이용된 명명법은 본 기술 분야에 일반적으로 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질변환(가령, 전기천공, 리포펙션)에 대해서 표준 기술이 이용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 설명 또는 본 기술 분야에 통상적으로 확립된 또는 본원에 기술된 것과 같이 실행된다. 전술한 기술 및 과정들은 본 기술 분야에 통상적으로 공지된, 그리고 본 명세서를 통하여 언급되고 논의된 다양한 일반적이고 좀더 특별한 참고자료에서 설명된 것과 같은 방법에 따라 일반적으로 실행된다. 가령, Sambrook et al . Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3 rd ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor , N. Y. (2001)) 참고 - 참조에 의해 본원에 통합됨. 본원에 기술된 실험 과정, 및 분석 화학, 합성 유기화학 및 의학 및 약리 화학의 기술과 연관되어 이용된 명명법은 본 기술 분야에 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약리학적 제제, 제제 및 운반 및 환자의 치료에는 표준 기술들이 이용된다.

본 기술에 따라 이용될 때, 다음의 용어들은 다른 언급이 없는 한 다음의 의미를 가지는 것으로 이해해야 한다:

길항제 또는 억제제는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 소분자량 화합물, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, RNA 간섭 (RNAi), 안티센스, 재조합 단백질, 항체, 또는 이의 단편들 또는 콘쥬게이트 또는 이의 융합 단백질들이 될 수 있다. RNAi에 대해서는 Milhavet O, Gary DS , Mattson MP . (Pharmacol Rev . 2003 Dec ;55(4):629-48. Review)를 참고하며, 안티센스에 대해서는 (Opalinska JB, Gewirtz AM . ( Sci STKE . 2003 Oct 28;2003 (206): pe47 .)를 참고한다.

화합물은 약 2000 Daltons 미만의 분자량을 가지는 임의의 소분자량 화합물을 지칭한다.

"소닉 헤지혹 호모로그" 또는 "Shh"는 HHG1, HHG-1, HLP3, HPE3, SMMCI, TPT, TPTPS, MCOPCB5으로 공지되기도 한 소닉 헤지혹 호모로그 단백질, 및 소닉 헤지혹 단백질 전구물질이 되는 분자를 말한다.

항체와 같은 표적화된 결합제를 언급할 때 “중화하는("neutralizing")” 또는 “억제하는("inhibits")”는 표적 항원의 활성을 제거하거나, 감소시키거나 또는 상당히 감소시키는 능력을 말한다. 따라서, 본 발명의 “중화” 항-Shh 항체는 Shh의 활성을 제거 또는 상당히 감소시키는 능력이다. Shh 중화 항체는 Shh가 이의 수용체 Patched, 가령, Patched-1 또는 Patched-2에 결합하는 것을 차단시킴으로써 작용할 수도 있다. 이와 같은 결합의 차단에 의해, Shh 신호-매개된 활성은 유의하게 또는 완전하게 제거된다. Shh에 대항하는 이상적인 중화 항체는 종양 세포 증식을 억제하거나 또는 종양 세포 증식을 촉진시키는 기질 세포 인자에 의한 생산을 억제하거나 또는 암 줄기 세포들의 자가-재생을 억제한다.

“Shh의 생물학적 활성의 길항제”는 Shh의 활성을 제거, 감소 또는 상당히 감소시킬 수 있다. “Shh의 생물학적 활성의 길항제”는 Shh 신호생성을 제거, 감소 또는 상당히 감소시킬 수 있다. “Shh의 생물학적 활성의 길항제”는 종양 세포 증식을 제거, 또는 상당히 감소시킬 수 있다.

"Shh 신호생성의 감소"는 본 발명의 표적화된 결합제, 항체 또는 길항제가 없는 경우의 신호 생성과 비교하였을 때, 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%의 Shh 신호생성이 감소되는 것을 포함한다.

본원에 기술된 “폴리펩티드”는 고유 단백질, 단편 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 지칭하는 속명(generic term)으로 이용된다. 따라서, 고유 단백질, 단편들 및 유사체는 폴리펩티드류의 종들이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간의 중쇄 면역글로불린 분자, 및 인간 카파(kappa) 경쇄 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 중쇄 면역글로불린 분자와 카파 또는 람다(lambda) 경쇄 면역글로불린 분자와 같은 경쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합에 의해 형성된 항체 분자들, 그리고 이의 역, 뿐만 아니라 이의 단편들 및 유사체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로불린 분자 또는 이의 단편들 만으로 구성될 수도 있다.

최적화된("optimized") 서열은 가변 중쇄 또는 경쇄 서열의 CDR 및/또는 프레임워크 서열이 돌연변이되어 하나 이상의 비-생식계열 서열 서열들이 제거된 항체 서열이며, 글리코실화 부위 또는 쌍을 이루고 있지 않은 시스테인과 같은 서열에서 구조적인 책임(liability)이 제거된 것을 더 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 "고유한(native)" 또는 "자연적으로 발생되는(naturally-occurring)"은 물질이 적용되는 경우, 해당 물질이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 나타낸다. 예를 들면, 자연에 있는 소스로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체(바이러스를 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연적으로 발생되는 것이다.

본원에서 사용된 “작용가능하게 링크된("operably linked")”은 설명된 성분들이 의도된 방식으로 기능을 할 수 있도록 서로 유관하게 위치된 것을 지칭한다. 예를 들면, 코딩 서열에 기준 서열이 “작용가능하게 링크”되어 있다는 것은 기준 서열과 필적되는 조건하에 코딩 서열의 발현이 실행되는 방식으로 연결되어 있다는 것을 말한다.

본원에서 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 임의의 변형된 유형, 또는 RNA-DNA 이형-이형체의 길이가 최소한 10개 염기의 뉴클레오티드로 된 폴리머 형태를 말한다. 이 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥형도 포함한다.

본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생되는, 및 비-자연적으로 발생되는 링키지에 의해 서로 연결된 자연적으로 발생되는, 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 200개 또는 이보다 적은 수의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브셋이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10개 내지 60개 염기, 및 가장 바람직하게는 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 내지 40개 염기의 길이를 가진다. 올리고뉴클레오티드는 가령 프로브용으로 통상 단일 가닥이며, 올리고뉴클레오티드가 유전자 돌연변이체의 작제에 이용될 수 있도록 이중 가닥일 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스(sense) 또는 안티센스(antisence) 올리고뉴클레오티드가 될 수도 있다.

본원에서 언급된 "자연적으로 발생되는 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기술된 "변형된 뉴클레오티드"는 변형된 또는 치환된 당(sugar)기 및 이와 유사한 것을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기술된 "올리고뉴클레오티드 링키지"는 올리고뉴클레오티드 링키지 가령, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트, 포스포로아미데이트 및 이와 유사한 것들을 포함한다. LaPlanche et al . Nucl . Acids Res . 14:9081 (1986); Stec et al . J. Am . Chem . Soc . 106:6077 (1984); Stein et al . Nucl . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon et al . Anti - Cancer Drug Design 6: 539 (1991); Zon et al . Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach , pp . 87-108 (F. Eckstein , Ed , Oxford University Press , Oxford England (1991)); Stec et al . U.S. 특허 No . 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990) 참고.-이들 내용은 참조로 본원에 통합됨. 올리고뉴클레오티드는 필요하다면 탐지용 라벨을 포함할 수 있다.

본원에서 언급된 “선택적으로 하이브리드되는”은 탐지가능하게 및 특이적으로 결합한다는 의미다. 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 단편들은 비-특이적 핵산에 탐지가능한 결합의 가능한 양을 최소화시키는 하이브리드반응 및 세척 조건하에 핵산 가닥에 선택적으로 하이브리드된다. 본 기술 분야에 공지되어 있고 본원에서 논의된 것과 같이, 선택적인 하이브리드 조건을 얻기 위해서 높은 엄격성 조건들(High stringency conditions)이 이용될 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 항체 단편들과 관심대상의 핵산 서열간에 핵산 서열 상동성(homology)은 최소한 80%가 될 것이며, 좀더 일반적으로 바람직하게는 최소한 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100%의 증가된 상동성을 가질 것이다.

엄격한 하이브리드 조건은 약 45℃, 6×염화나트륨/구연산나트륨(SSC) (0.9 M NaCl, 90 mM 구연산나트륨염, pH 7.0)에서 필터에 결합된 DNA에 하이브리드되고, 이어서 약 50-65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS에서 1회 이상의 세척, 매우 엄격한 하이브리드 조건은 약 45℃, 6×SSC에서 필터에 결합된 DNA에 하이브리드되고, 이어서 약 60℃에서 0.1×SSC/0.2% SDS에서 1회 이상의 세척, 또는 본 기술 분야의 당업자에 공지된 임의의 기타 엄격한 하이브리드 조건들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.(예를 들면, Ausubel , F.M. et al , eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology , vol . 1, Green Publishing Associates , Inc . and John Wiley and Sons , Inc , NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3 참고). 두 개의 아미노산 서열들은 이들 서열들 사이에 부분적 또는 완전한 동일성이 있다면 이들 두 아미노산 서열은 "상동성(homologous)"이 있다. 예를 들면, 85% 상동성은 두 서열의 최대 매치(maximum matching)를 위해 배열시켰을 때, 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 매칭을 최대화로 하기 위하여 갭(gaps) (매치되는 두 서열중 임의의 것에)이 허용된다; 갭 길이는 5개 또는 그 미만이 바람직하며, 2개 또는 그 미만이 더욱 바람직하다. 대안으로, 및 바람직하게는, 프로그램 ALIGN과, 돌연변이 데이터 매트릭스, 6개 또는 그 이상의 갭 페널티(gap penalty)를 이용하여 이들 두 서열의 배열 스코어가 5 초과(표준 편차 단위)인 경우, 본원에서 사용된 용어와 같이, 두 개의 단백질 서열들 (또는 길이가 최소한 약 30개 아미노산으로부터 유도된 폴리펩티드 서열들)은 상동하다. Dayhoff , M. O, in Atlas of Protein Sequences and Structure , pp . 101-110 ( Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume , pp . 1-10 참고. ALIGN 프로그램을 이용하여 두 개의 서열들 또는 이의 일부분이 최적으로 배열되었을 때, 이들 아미노산이 50% 또는 그 이상으로 동일한 경우, 두 개의 서열들 또는 이의 일부분은 더욱 바람직한 상동성을 가진다. 두 개의 진화적 유사성 관계인 서열내에 상동성 부분이 상이할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 예를 들면, 마우스 및 인간의 진화론적 유사한 기능 부위는 비-기능 부분보다 더 높은 수준의 상동성을 가질 수 있다.

본원에 기술된, “대응하는("corresponds to")”은 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부분에 상동성(가령, 동일하거나 또는 엄격하게 진화론적으로 관련되지 않은)이거나 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열과 동일하다는 것을 의미한다.

대비를 위해, 본원에 기술된 용어 “~에 상보적인("complementary to")”이란 의미는 상보적 서열은 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 모두에 또는 일부분에 상동성이라는 것을 의미한다. 설명하자면, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 대응하며, 기준 서열 "GTATA"에 상보적이다.

"서열 동일성(identity)"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들이 비교 윈도우에서 동일하다(가령, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 잔기-대-잔기 근거하여)는 의미다. “서열 동일성 비율”은 비교 윈도우에서 최적으로 배열된 두 개의 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기(가령, A, T, C, G, U, 또는 I) 또는 아미노산 잔기의 위치 수를 측정하고, 비교 윈도우에서 전체 위치수(가령, 윈도우 크기)를 일치된 위치수로 나누고, 결과 값에 100을 곱하여 서열 동일성 비율을 산출함으로써, 계산된다. 본원에 기술된, “실질적 동일성”은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 표시한 것으로, 여기서, 최소한 18개 뉴클레오티드(6개 아미노산)의 비교 윈도우, 종종 최소한 24-48개 뉴클레오티드(8-16개 아미노산)의 윈도우에서 기준 서열과 비교하였을 때, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 최소한 85% 서열 동일성, 바람직하게는 최소한 90% 내지 95%, 더욱 바람직하게는 최소한 99% 서열 동일성을 가진 서열을 포함하며, 여기서 서열 동일성의 비율은 비교 윈도우에서 총 20% 또는 그 미만의 결손 또는 추가를 포함하는 서열을 기준 서열에 비교하여 계산된다. 기준 서열은 더 큰 서열의 부분(subset)이 될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 20개 통상적인 아미노산 및 이의 약어는 통상적인 용도에 따른다. Immunology - A Synthesis (2 nd Edition , E. S. Golub and D.R. Gren, Eds ., Sinauer Associates , Sunderland , Mass . (1991))-참조로 본원에 통함됨. 20개 통상적인 아미노산의 입체이성질체(가령, D-아미노산), 비-자연적 아미노산 가령, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산 및 기타 비-통상적인 아미노산 또한 본 발명의 폴리펩티드의 성분으로 적합할 수 있다. 비-통상적인 아미노산의 예로는 다음을 포함한다: 4-하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(가령, 4-하이드록시프롤린). 본원에서 사용된 폴리펩티드 표기에서, 표준 용도 및 관례에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이며, 오른쪽 방향은 카르복시 말단 방향이다.

유사하게, 다른 언급이 없는 한, 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드 서열들의 왼쪽 단부는 5' 말단이며; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열들의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사에서 5'에서 3' 방향으로의 추가는 전사 방향으로 지칭된다; RNA와 동일한 서열을 가진 DNA 가닥 상에서, 5'에서 RNA 전사체의 5'까지의 서열 부분들은 “상류(upstream) 서열들”이라고 하며; RNA와 동일한 서열을 가진 DNA 가닥상에서, 3' 에서 RNA 전사체의 3'까지의 서열 부분들은 “하류(downstream) 서열들”이라고 한다.

폴리펩티드에 사용할 경우, "실질적인 동일성"은 두 개의 펩티드 서열이 최적으로 배열되었을 때(가령, 디폴트 갭 웨이트를 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해), 두 서열은 최소한 80 % 서열 동일성, 바람직하게는 최소한 90 % 서열 동일성, 좀더 바람직하게는 최소한 95 % 서열 동일성, 가장 바람직하게는 최소한 99 % 서열 동일성을 가진다는 의미다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환과는 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 가진 잔기들의 상호교환을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 가진 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이며; 지방족-하이드록실 측쇄를 가진 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 가진 아미노산 군은 아스파라진 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 가진 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가진 아미노산 군은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이며; 황-함유 측쇄를 가진 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군들은 다음과 같다: 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타민산-아스파르트산, 및 아스파라진-글루타민.

본원에 기술된 것과 같이, 아미노산 서열에서의 변이로 항체 또는 면역글로불린 분자에 최소한 75%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99% 서열 동일성을 유지한다면, 항체들 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열에서의 약간의 변이들도 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 특히, 보존적 아미노산 치환(replacements)도 고려된다. 보존적 치환은 관련된 측쇄를 가진 아미노산 패밀리내에서 일어난다. 유전학적으로 인코드된 아미노산은 다음과 같은 패밀리로 나뉜다: (1) 산성=아스파르트산, 글루타민산; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성=알라닌, 발린, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비-하전 극성=글리신, 아스파라진, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 좀더 바람직한 패밀리는 다음과 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족-하이드록시 패밀리이며; 아스파라진 및 글루타민은 아미드-함유 패밀리이며; 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신은 지방족 패밀리이며; 및 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 방향족 패밀리다. 예를 들면, 루이신을 이소루이신 또는 발린으로 대체, 아스파르트산을 글루타민산으로 대체, 트레오닌을 세린으로 대체 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 대체시키면, 특히 이와 같은 치환이 프레임워크 부위내에 있는 아미노산에서 일어나는 것이 아닌 경우, 생성 분자의 결합 기능 또는 성질에 큰 영향이 없을 것이라고 기대해도 될 것이다. 아미노산 교환으로 기능적 펩티드가 야기되는지는 폴리펩티드 유도체의 특이 활성을 분석함으로써 바로 결정될 수 있다. 본원에서 분석법은 상세하게 설명된다. 항체들 또는 면역글로불린 분자의 단편들 또는 유사체는 본 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 준비될 수 있을 것이다. 단편들 또는 유사체들의 바람직한 아미노 및 카르복시-말단은 기능 도메인의 경계에 있다. 공개 또는 독점 서열 데이터베이스의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 비교함으로써 구조적 및 기능적 도메인을 확인할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 서열 모티프 또는 공지의 구조 및/또는 기능을 가진 기타 단백질들에서 일어나는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하기 위하여 컴퓨터를 이용한 비교 방법들이 이용된다. 공지의 3차원적 구조로 폴드되는 단백질 서열들을 확인하는 방법들은 공지되어 있다. Bowie et al . Science 253:164 (1991). 따라서, 본 기술 분야의 업자들이 본원에 기술된 항체에 따라 서열 모티프 및 구조적 및 기능적 도메인을 한정하는데 이용될 수 있는 구조적 형태를 인지할 수 있다는 것을 다음의 실시예들에서 설명한다.

글루타미닐 및 아스파라지닐 잔기는 종종 아미드가 제거되어(deamidate), 각각 상응하는 글루타민 및 아스파르틸 잔기가 된다. 이들 잔기들은 중성 또는 염기성 조건하에서 아미드가 제거된다. 이들 잔기의 아미드제거된 형태는 본 발명의 범위에 속한다.

일반적으로, 단백질에서 시스테인 잔기들은 시스테인-시스테인 이황화결합에 관여하거나 또는 폴드된 단백질 부분의 일부가 되는 경우 이황화 결합 형성으로부터 공간적으로 보호된다. 단백질에서 이황화 결합 형성은 복합 프로세스이며, 이는 환경의 산화환원 전위 및 특화된 티올-이황화 교환 효소들에 의해 결정된다(Creighton , Methods Enzymol . 107, 305-329, 1984; Houee - Levin , Methods Enzymol. 353, 35- 44,2002). 시스테인 잔기가 단백질 구조에서 쌍을 가지지 않고, 폴딩에 의해 공간적으로 보호되지 않는 경우, 시스테인 잔기는 이황화 셔플링(shuffling)으로 공지된 프로세스에서 용액에 유리(free) 시스테인과 함께 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이황화 스크램블링(scrambling)으로 알려진 또 다른 프로세스에서, 유리 시스테인은 자연적으로 발생되는 이황화 결합 (항체 구조내에 존재하는 것과 같은)을 방해하여, 낮은 결합, 낮은 생물학적 활성 및/또는 낮은 안정성을 유도할 수 있다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화력을 변경시키고, (4) 결합 친화력을 변경시키고, (5) 이와 같은 유사체의 기타 물리화학적 또는 기능적 성질을 부여하거나 변형시키는 치환이다. 유사체는 자연적으로 발생되는 펩티드 서열 외에 서열의 다양한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 또는 다중 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 자연적으로-발생되는 서열 (바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인 외부에 있는 폴리펩티드 부분)에서 있을 수도 있다. 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경해서는 안된다 (가령, 치환 아미노산은 부모 서열에 있는 헬릭스를 파괴해서는 안되며, 또는 부모 서열의 특징이 되는 다른 유형의 2차 구조를 붕괴시켜서는 안된다). 기술 분야에서 확인된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예시들은 Proteins , Structures and Molecular Principles ( Creighton , Ed , W. H. Freeman and Company , New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze , eds , Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et al. Nature 354:105 (1991)에 설명되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 통합된다.

추가적으로, 하나 이상의 주쇄(intrachain) 이황화 결합이 결손된 항체 분자를 생성시키기 위하여, 이와 같은 방법들을 이용하여 주쇄(intrachain) 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 부분 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결손을 만들 수 있다.

용어 "CDR 부분" 또는 "CDR"은 항체에 항원-결합 특이성을 부여하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 초가변(hypervariation) 부분을 나타낸다. CDRs은 Kabat 시스템에 따라 정의될 수 있다(Kabat , E. A. et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5 th Edition . US Department of Health and Human Services , Public Service , NIH , Washington ), and later editions). 항체는 일반적으로 3개의 중쇄 CDR과 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. CDR 또는 CDRs은 경우에 따라 항체가 인지하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 친화력을 담당하는 아미노산 잔기의 대부분을 포함하는 부분들중 하나 또는 몇 개 또는 전체를 지칭하는데 이용된다.

중쇄의 세 번째 CDR (HCDR3)은 더 큰 변이성(발생되는 유전자의 배열 기전으로 인해 필수적으로 특히 더 큰 변이성)을 가진다. 알려진 가장 긴 것은 26개 아미노산이나, 2개 아미노산과 같이 짧을 수도 있다. CDR 길이는 특정 근원적 프레임워크에 의해 수용될 수 있는 길이에 따라 변화될 수 있다. 기능적으로, HCDR3는 항체의 특이성을 결정하는데 일부 역할을 한다(Segal et al , PNAS , 71:4298-4302, 1974, Amit et al , Science , 233:747-753, 1986, Chothia et al , J. MoI . Biol , 196:901-917, 1987, Chothia et al , Nature , 462:877- 883, 1989, Caton et al , J. Immunol , 144:1965-1968, 1990, Sharon et al , PNAS , 87:4814-4817, 1990, Sharon et al , J. Immunol , 144:4863-4869, 1990, Kabat et al , J. Immunol , 147:1709-1719, 1991).

본원에서 사용된 "CDRs 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDRs의 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3를 말하며, LCDRs 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 말한다.

본원에서 제시된 아미노산 서열에 대한 것을 포함하며, Shh에 대한 물질 및 항체의 표적화에 이용될 수 있는, 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체들은 서열 변경 또는 돌연변이 방법 및 원하는 특징을 가진 항원 표적에 대한 스크리닝에 의해 수득될 수 있다. 원하는 특징의 예로는 항원에 특이적인 공지의 항체들과 비교하여 항원에 대한 결합 친화력이 증가; 활성이 공지된 경우, 항원에 특이적인 공지의 항체와 비교하여 항원 활성의 중화능력의 증가; 특정 몰 비에서 항원에 대하여 공지의 항체 또는 리간드와 특화된 경쟁 능력; 리간드-수용체 복합체를 면역침전시키는 능력; 지정된 에피토프에 결합하는 능력; 선형 에피토프, 예를 들어, 펩티드-결합 스캔, 가령 선형 및/또는 압박된 형태에서 스크리닝된 펩티드를 이용하여 확인된 펩티드 서열; 비-연속적 잔기들에 의해 형성된 형태학적 에피토프; Shh의 새로운 생물학적 활성을 조절하는 능력 또는, 하류 분자를 조절하는 능력; Shh에 결합하고/결합하거나 Shh를 중화시키는 능력 또는 임의의 기타 원하는 성질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

CDRs의 아미노산 서열, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 항원 결합 부위내에 치환을 만드는데 요구되는 기술은 본 기술 분야에서 이용가능하다. 본원에 기술된 항체 분자들의 변이체들은 본 발명에서 생산되고, 이용될 수 있다. 구조/특성-활성 관계에 다변수 데이터 분석 기술을 적용함에 있어서 컴퓨터에 의한 화학의 주도하에(Wold , et al . Multivariate data analysis in chemistry . Chemometrics - Mathematics and Statistics in Chemistry ( Ed .: B. Kowalski ), D. Reidel Publishing Company , Dordrecht , Holland , 1984) 항체들의 활성-특성 정량적 관계는 통계학적 회귀, 패턴 인식 및 분류와 같은 잘 알려진 수학적 기술을 이용하여 유도될 수 있다. (Norman et al . Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer- Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11, 1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (December 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (October 11, 1999);Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002); Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and applications in Drug Discovery). 일부 경우에, 항체들의 특징은 항체 서열의 실험적인 및 이론적인 모델에서 유도될 수 있으며(예를 들면, 있음직한 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 성질의 분석), 기능적 및 3차원 구조 및 이들의 성질은 단독으로 및 복합적으로 고려될 수 있다.

VH 도메인과 VL 도메인으로 구성된 항체 항원-결합 부위는 폴리펩티드의 6개 루프에 의해 일반적으로 형성된다: 경쇄 가변 도메인 (VL)으로부터 세 개, 및 중쇄 가변 도메인 (VH)으로부터 세 개. 공지의 원자 구조를 가진 항체들의 분석으로 서열과 항체 결합 부위의 3차원 구조 사이에 관련성을 밝혔다. 이들 상관관계는 VH 도메인에서 세 번째 부분(루프)을 제외하고, 결합 부위 루프는 소수의 주요-쇄 형태 중 하나: 기본적인 구조 중 하나를 가진다는 것을 의미한다. 특정 루프에서 형성된 기본 구조는 루프와 프레임워크 부분 모두에 있는 주요 부위에서 특정 잔기들의 존부 및 크기에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다.

서열-구조 상관 관계의 본 연구는 공지의 서열을 가진 항체 및 알려지지 않은 3차 구조의 항체에서 이들 잔기를 예측하는데 사용될 수 있는데, 이것은 CDR 루프의 3차원적 구조를 유지하고, 이로써 결합 특이성을 유지하는데 중요하다. 이와 같은 예측은 선두의 최적화 실험 결과의 예측과 비교됨으로써 뒷받침될 수 있다. 구조적 접근에서, WAM와 같은 임의로 자유롭게 이용가능하거나 시판되는 패키지를 이용하여 항체 분자의 모델이 생성될 수 있다. 단백질 시각화(visualisation) 및 분석 소프트웨어 패키지, 가령, Insight II (Accelrys, Inc.) 또는 Deep View는 CDR에서 각 위치에 가능한 치환을 평가하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 정보를 이용하여 활성에 최소한 또는 유익한 효과를 가지거나 기타 바람직한 성질을 부여할 수 있는 치환을 만들 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결손을 가지지만, 나머지 아미노산 서열은 전장 cDNA 서열로부터 유추된 자연적으로 발생되는 서열에서 대응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 말한다. 단편은 일반적으로 최소한 5개, 6개, 8개 또는 10개 아미노산, 바람직하게는 최소한 14개 아미노산, 더 바람직하게는 최소한 20개 아미노산, 보통 최소한 50개 아미노산, 더욱 바람직하게는 최소한 70 개의 아미노산의 길이를 가진다. 본원에서 사용된 것과 같이 “유사체(analog)”는 유추된 아미노산 서열의 일부분과 실질적으로 동일한 최소한 25개 아미노산의 단편으로 구성되며, 다음의 성질들중 최소한 하나를 가지는 폴리펩티드를 지칭한다: (1) 적절한 결합 조건하에 Shh에 특이적으로 결합, (2) Shh/Patched-1 결합을 적절하게 차단하는 능력, 또는 (3) Gli 활성을 촉진시키는 능력. 일반적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연적으로 발생되는 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 결손 또는 추가)를 포함한다. 유사체는 일반적으로 최소한 20개의 아미노산 길이, 바람직하게는 최소한 50개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 자연적으로 발생되는 전장 폴리펩티드와 동일한 길이를 가지는 경우도 종종 있을 수 있다.

약제학적 산업에서 펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 성질을 가지는 비-펩티드 약물로 흔히 이용된다. 이와 같은 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체(mimetics)" 또는 "펩티도미메틱스(peptidomimetics)"이라고 칭한다(Fauchere , J. Adv . Drug Res . 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans et al . J. Med . Chem . 30:1229 (1987), 이들은 참조로 본원에 통합됨). 이와 같은 화합물들은 흔히 컴퓨터에 의한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료요법적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체가 이용되어 등가의 치료요법적 또는 예방적 효과를 만든다. 일반적으로 펩티드-모방체는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생화학적 성질 또는 약리학적 성질을 가진 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하나, 본 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해, 하나 이상의 펩티드 링키지가 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(cis 및 trans), - COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-으로 구성된 군으로부터 선택된 링키지에 의해 임의적으로 치환되어 있다. 보전(consensus) 서열 중 하나 이상의 아미노산이 동일한 타입의 D-아미노산(가령, L-리신 위치에 D-리신)으로 치환되는 시스템을 이용하여 좀더 안정적인 펩티드를 만들 수 있다. 또한, 보전 서열 또는 실질적으로 동일한 보전 서열 변이를 포함하는 압박된(constrained) 펩티드는 본 기술 분양에 공지된 방법들에 의해 생성될 수 있다(Rizo and Gierasch Ann . Rev . Biochem . 61:387 (1992) - 참조로 본원에 통합됨); 예를 들면, 펩티드를 고리화시키는 분자내 이황화 브릿지를 만들 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.

항체는 올리고클론 항체, 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, CDR-접목된 항체, 다중-특이적 항체, 이중특이적 항체, 촉매 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 항체, 항-이디오타입 항체 및 가용성 또는 결합된 형태로 라벨링된 항체들 뿐만 아니라 이들의 단편, 변이체 또는 유도체가 될 수 있으며, 이들은 단독으로 또는 공지의 기술에 의해 제공된 기타 아미노산 서열과 복합될 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유도될 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "항체" 및 "항체들" (면역글로불린)은 단클론 항체들 (전장 단클론 항체들을 포함하는), 다클론 항체들, 카멜라이즈화된(camelised) 항체들 및 키메라 항체들을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항체들"은 내부 표면 모양 및 항원의 항원 결정 부위 특징에 상보적인 전하 분포를 가지는 3차원 결합 공간을 보유하는 폴리펩티드 쇄의 폴딩에 의해 형성된 최소한 한 개의 결합 도메인으로 구성된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 지칭한다. 고유한 항체들은 두 개의 동일한 경쇄(L)와 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 daltons의 이형사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 한 개의 공유 이황화 결합에 의해 링크되어 있으며, 이황화 링키지의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적인 공간을 두고 주쇄(spaced intrachain) 이황화 브릿지를 가진다. 각 중쇄는 한 단부에 가변 도메인 (VH)과, 몇 개의 불변(constant) 도메인을 가진다. 각 경쇄는 한 단부에 가변 도메인(VL)과 다른 단부에 한 개의 불변 도메인을 가진다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 경쇄는 경쇄 불변 부분의 아미노산 서열에 근거하여 람다 쇄 또는 카 파 쇄로 분류된다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 VK로 표시할 수도 있다. "가변 부분"은 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 설명하는데 이용될 수도 있다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 보인다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 부분이 항체 결합 부위를 형성한다. 이들 항체들은 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 포유류로부터 유도될 수 있다.

"항체" 또는 "항체들"은 본 발명의 항체들의 결합 단편들을 포함하며, 예시적인 단편은 단일-쇄 Fvs (scFv), 단일-쇄 항체들, 단일 도메인 항체들, 도메인 항체들, Fv 단편, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')₂ 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편, 이황화-안정화된 가변 부분 (dsFv), 이량체 가변 부위(디아바디)(Diabody), 항-이디오타입(항-Id) 항체들 (가령, 본 발명의 항체에 대한 항-Id ), 인트라바디(intrabodies), 선형 항체들, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체들 및 상기 언급된 것들의 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체들은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성을 가진 단편, 가령, 항원-결합 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 부류(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 부류가 될 수 있다.

효소 파파인으로 항체를 절단하면, "Fab" 단편과 "Fc" 단편으로 공지된 두 개의 동일한 항원 결합 단편이 생성되며, 이는 항원-결합 활성은 없지만 결정화되는 능력을 보유한다. 항체들을 효소 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편이 생성되는데, 항체 분자의 두 개 팔(arm)이 서로 연결된 상태로 유지되며, 두 개-항원 결합 부위를 가진다. F(ab')₂ 단편은 항원에 가교결합되는 능력을 가진다.

본원에 기술된 "Fv"는 항원-인지 및 항원-결합 부위를 모두 보유하는 항체의 최소 단편을 말한다. 이 부분은 비-공유적 또는 공유적 연합에 의한 한 개의 중쇄 및 한 개의 경쇄 가변 도메인의 단단한 이량체로 구성된다. 이와 같은 배위(configuration)에서, 각 가변 도메인의 세 개 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정시킨다. 집합적으로 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대한 특이성을 가지는 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 보유하지만, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화력을 가진다.

본원에서 사용된, "Fab"는 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.

본원에서 사용된, "dAb"은 인간 항체의 최소 기능적 결합 단위가 되는 항체 단편을 지칭한다. "dAb"는 단일 도메인 항체이며, 항체 중쇄의 가변 도메인(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 도메인(VL 도메인)으로 구성된다. 각 dAb는 6개의 자연적으로 발생되는 CDR중 세 개를 포함한다(Ward et al , Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli . Nature 461, 544-546 (1989); Holt , et al , Domain antibodies : protein for therapy , Trends Biotechnol . 21, 484-49 (2003)). 11 내지 15 kDa 범위의 분자량을 가지며, 단편 항원 결합 단편 (Fab)2보다는 4배 더 작고, 단일 쇄 Fv (scFv) 분자 크기의 절반이다.

본원에서 사용된, "Camelid"는 경쇄가 없음에도 불구하고 광역의 항원-결합 레파토리를 보유하는 중쇄-이량체로 구성된 항체 분자를 지칭한다. (Hamers - Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB , Bendahman N, Hamers R (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains . Nature 363:446-448).

용어 "디아바디(diabodies)"은 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 말하는데, 이들 단편들은 폴리펩티드 쇄(V_H-V_L)로 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 동일한 쇄에서 두 개 도메인의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용하게 되면, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 짝을 이루도록 강요받게 되어, 두 개의 항원-결합 부위가 만들어진다. “디아바디(diabodies)”은 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al , Proc . Natl . Acad . ScL USA , 90:6444-6448 (1993)에서 더욱 자세하게 설명되어 있다.

전체 항체의 단편들은 항원 결합 기능을 수행할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (Ward , E. S. et al , (1989) Nature 461, 544-546) (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (McCafferty et al (1990) Nature , 468, 552-554) ; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward , E.S. et al , Nature 461, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature , 468, 552-554, Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]; (v) 분리된 CDR 부분; (vi) F(ab')₂ 단편, 두 개의 링크된 Fab 단편을 포함하는 이가(bivalent) 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자 (scFv), 여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 두 개 도메인이 서로 연합하여 항원 결합 부위의 형성을 허용하는 펩티드 링커에 의해 링크되어 있다(Bird et al , (1988) Science , 242, 423-426, Huston et al , (1988) PNAS USA , 85, 5879-5883); (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 디아바디("diabodies"), 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편(WO94 /13804; Holliger , P. (1993) et al , Proc. Natl . Acad . Sci . USA 90 6444-6448,)이 있다. Fv, scFv 또는 디아바디(diabody) 분자들은 VH 및 VL 도메인을 링크하는 이황화 브릿지를 결합시킴으로써 안정화될 수 있다(Reiter , Y. et al , Nature Biotech , 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디(Minibodies)도 만들 수 있다(Hu , S. et al , (1996) Cancer Res , 56, 3055- 3061). 결합 단편의 기타 예는 Fab', 이는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇 개의 잔기가 추가됨으로써 Fab 단편과 달라지는데, 항체 힌지 부분에서 하나 이상의 시스테인을 포함하며, Fab'-SH, 이는 Fab' 단편으로써, 불변 도메인의 시스테인 잔기에 자유 티올기를 보유하고 있다.

"가변(variable)"이란 가변 도메인의 특정 부분들은 항체들간에 서열에서 상당히 상이하며, 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 특이성을 담당하는 것을 지칭하다. 그러나, 항체들의 가변 도메인을 통하여 가변성이 고르게 분포되어 있지는 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 부위(CDR)이라고 불리는 단편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 매우 보존된 부분은 프레임워크 부분(FR)라고 한다. 고유한 중쇄 및 경쇄의 각 가변 도메인은 4개의 FR 부분을 포함하며, 대부분 β-쉬트 형상을 취하며, 3개의 CDR에 의해 연결되어, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β-쉬트 구조의 일부분을 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR 부분에 의해 근접하게 함께 지지되며, 다른 쇄의 CDR들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. (Kabat et al , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5 th Ed . Public Health Service , National Institutes of Health , Bethesda , MD (1991)). 불변 도메인들은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항원 결합 친화력에 영향을 줄 수 있으며, 다양한 작용기 기능들 예를 들면, ADCC, CDC, 및/또는 자가-사멸에서 항체 참여와 같은 기능을 나타낸다.

초가변부위("hypervariable region")는 항원에 항체가 결합하는 것에 관여하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭하는 것이다. 초가변 부분은 "상보성 결정 부위" 또는 "CDRs"의 아미노산 잔기 (가령, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-46 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및95-102 (H3); Kabat et al , Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5 th Ed . Public Health Service , National Institutes of Health , Bethesda , MD (1991)) 및/또는 "초가변 루프"의 이들 잔기 (가령, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); Chothia and Lesk , J. MoI . Biol , 196:901- 917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDRs의 측면에 있는 가변 도메인 잔기들이다. FR 잔기는 키메라항체, 인간화 항체, 인간, 도메인 항체들, 디아바디(diabodies), 백신바디(vaccibodies), 선형(linear) 항체들, 및 이중특이적 항체들에서 존재한다.

본원에서 사용된 것과 같이, 표적화된 결합제, 표적화된 결합 단백질, 특이적 결합 단백질 및 이와 유사한 용어들은 표적 부위에 선호적으로 결합하는 항체, 또는 이의 결합 단편을 지칭한다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 오로지 한 개의 표적 부위에 특이적이다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 한 개이상의 표적 부위에 특이적이다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 단클론 항체일 수 있으며, 표적 부위는 에피토프가 될 수 있다.

항체의 "결합 단편"은 재조합 DNA 기술 또는 고유 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 만들어진다. 결합 단편들은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb 및 단일-쇄 항체들을 포함한다. "이중특이적" 또는 "이기능적" 항체를 제외한 항체는 각 동일한 결합 부위를 가지는 것으로 이해되어야 한다. 과량의 항체가 카운터-수용체에 결합된 수용체의 양을 최소한 약 20%, 40%, 60% 또는 80%, 통상적으로 약 85% 이상 감소시킬 때(시험관내 경쟁 결합 분석에 의해 측정하였을 때), 항체는 수용체가 카운터-수용체에 흡착하는 것을 실질적으로 저해한다.

에피토프("epitope")는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정부위를 포함한다. 에피토프 결정부위는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 항상 그런 것은 아니지만, 특이적인 3차원 구조적 특징 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징도 가질 수 있다. 해리 상수가 ≤1 μM인 경우, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM 인 경우, 항체는 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다.

물질("agent")은 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 재료로부터 만든 추출물을 지칭할 때 사용된다.

Shh 폴리펩티드에 대해 "활성이 있는(Active)" 또는 "활성(activity)"은 고유한 Shh 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 가지는 Shh 폴리펩티드의 부분을 지칭한다. 본원에서 사용된“생물학적”이란 고유한 Shh 폴리펩티드의 활성으로 인한 생물학적 기능을 지칭한다. 바람직한 Shh의 생물학적 활성은 예를 들면, Shh 유도된 세포 증식을 포함한다.

본원에서 사용된“포유류”는 포유류로 간주되는 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

본원에서 사용된 "동물"은 포유류로 간주되는 동물을 포함한다. 바람직하게는 동물은 인간이다.

"mAb"는 단클론 항체를 지칭한다.

본원에서 사용된 "리포좀(Liposome)"은 본 발명의 Shh 폴리펩티드 또는 Shh 폴리펩티드에 대한 항체들을 포함하는 약물을 포유류에게 운반하는데 이용될 수 있는 소포를 말한다.

본원에서 사용된 "라벨" 또는 "라벨링된"은 폴리펩티드에 탐지가능한 모이어티의 부착을 의미하는 것으로, 예를 들면, 방사능라벨, 형광 라벨, 효소적 라벨 화학발광 라벨링된 또는 바이오티닐 기의 부착을 의미한다. 방사성 동위 원소 또는 방사능핵종은 ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I을 포함하고, 형광 라벨은 로다민, 란탄 인광체, 또는 FITC를 포함할 수 있으며, 효소적 라벨링은 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제를 포함할 수 있다.

추가적인 라벨로는 설명을 위하여 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 효소, 가령, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제("G6PDH"), α-D-갈락토시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코즈 아밀라제, 카르보닌 안하이드라제, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼옥시다제; 염료; 추가적인 형광 라벨 또는 형광 물질은 플루오로레세인 및 이의 유도체들, 형광색소, GFP (GFP: "Green Fluorescent Protein"), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오로스카민을 포함하고; 란탄 크립테이트와 같은 형광체, 및 킬레이트, 가령 Europium etc. (Perkin Elmer and Cis BioInternational); 화학발광(chemoluminescent) 라벨 또는 화학형광물질( chemiluminescers), 가령, 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄; 감작제(sensitisers); 코엔자임; 효소 기질; 라텍스 또는 탄소 입자와 같은 입자; 메탈 졸(metal sol); 정자(crystallite); 리포좀; 염료, 촉매 또는 기타 탐지가능한 군으로 추가 라벨링될 수 있는 세포 등,; 바이오틴, 딕옥시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘과 같은 분자; 톡신 모이어티 예를 들면 슈도모나스 엑소톡신(PE 또는 세포독성 단편 또는 이의 돌연변이체), 디프테리아 톡신 또는 이의 세포독성 단편 또는 이의 돌연변이체, 보틀리늄 톡신 A, B, C, D, E 또는 F, 리친 또는 이의 세포독성 단편, 가령, 리친 A, 아브린 또는 이의 세포독성 단편, 사포린 또는 이의 세포독성 단편, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 톡신 또는 이의 세포독성 단편 및 브리요딘(bryodin) 1 또는 이의 세포독성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 톡신 모이어티.

본원에서 사용된, “약리학적 물질 또는 약물”은 환자에게 적절하게 투여되었을 때, 원하는 치료요법적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 본원에서 사용된 기타 화학적 용어들은 분 기술 분야, 예를 들면, The McGraw - Hill Dictionary of Chemical Terms ( Parker , S, Ed , McGraw - Hill , San FranCisco (1985)), (참조로 본원에 통합됨)에서 예시된 바와 같은 통상적인 용도에 따라 이용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “실질적으로 순수한”은 대상 종이 우세한 종이며(가령, 몰량에 근거하여, 조성물에서 임의의 기타 개별 종보다 더 많은), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분취물은 조성물이며, 여기서, 대상 종은 존재하는 모든 거대분자 종의 최소한 약 50% (몰량에 근거하여)를 포함한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 및 99%이상을 포함한다. 가장 바람직하게는, 대상 종은 필수적인 동질성을 가지도록 순수 분리되며(통상적인 탐지 방법에 의해 조성물에서 오염물질 종이 탐지되지 않는다), 여기서, 조성물은 기본적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다.

"환자"는 인간 및 수의학적 개체를 포함한다.

"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 세포-매개된 반응을 지칭하는데, 이때 Ig Fc 수용체(FcRs)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포(가령 자연 살해 세포(Natural Killer (NK)) 세포, 단핵세포, 호중구 및 대식세포)는 표적 세포에 있는 결합된 항체를 인지하고, 결과적으로 표적 세포를 용해시킨다. ADCC를 매개하는 1차 세포(primary cells), NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키지만, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈세포상에서 FcRs 발현은 Ravetch and Kinet , Annu . Rev . Immunol 9:457-92 (1991)의 464페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, U.S. 특허 No. 5,500,362, 또는 5,821,337에서 설명된 것과 같은 시험관 ADCC 분석을 실행할 수 있다. 이와 같은 분석에 유용한 작용기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해 세포(NK)를 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 Clynes et al . PNAS ( USA ) 95:652-656 (1988)에서 설명된 것과 같이 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수도 있다. "보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 항체들이 이들의 세포-사멸 기능을 실행하는 기전을 말한다. 보체의 제1 구성 성분인 C1q가 Igs, IgG 또는 IgM의 Fc 도메인에 결합하여, 항원과 복합체가 됨으로써 이 기전이 개시된다, (Hughs - Jones , N.C, and B. Gardner . 1979. MoI . Immunol. 16:697). C1q은 인간 혈청에 70 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 ~410 kDa의 구조적으로 큰 복합적인 당단백질이다(Cooper , N.R. 1985. Adv . Immunol . 37:151). 두 개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s와 함께, C1q은 보체의 제1성분인 복합체 C1을 형성한다. C1의 활성화, 이에 의해 보체 캐스캐이드를 개시하기 위해서, C1q의 N-말단 구형 머리 중 적어도 2개는 Ig의 Fc에 결합되어야만 한다(Cooper , N.R. 1985. Adv . Immunol . 37:151).

본원에서 사용된 "항체 반감기"는 투여 후, 항체 분자의 평균 생존 시간의 측량이 되는 항체의 약동학적 성질을 의미한다. 항체 반감기는 환자의 신체 또는 특정 구역, 예를 들면, 혈장 또는 혈청에서 순환 반감기로 측정된 또는 기타 조직에서 측정된 양을 알고있는 면역글로불린이 50% 제거되는데 요구되는 시간으로 표현될 수 있다. 반감기는 하나의 면역글로불린에서 또는 면역글로불린 종류 마다 가변적일 수 있다. 일반적으로, 항체 반감기의 증가는 투여된 항체에 대해 순환계에서 평균 체류 시간(MRT)의 증가를 초래한다.

"이소타입"은 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 부분의 분류를 말한다. 항체들의 불변 도메인은 항원 결합에는 관여하지 않지만, 다양한 작용기 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 부분의 아미노산 서열에 따라, 주어진 인간 항체 또는 면역글로불린은 5가지 주요 면역글로불린중 하나에 해당된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 부류중 몇 개는 하위부류(이소타입)로 추가적으로 나뉠 수 있다, 가령, IgG1 (감마 1), IgG2 (감마 2), IgG3 (감마 3), 및 IgG4 (감마 4), 및 IgA1 및 IgA2. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 부분은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 구조 및 3차원적 형태는 잘 알려져 있다. 다양한 인간 면역글로불린 부류중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM 만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 인간 IgG1 및 IgG3는 인간에서 조정되는 것으로 알려져 있다. 인간 경쇄 불변 부분은 카파 및 람다의 두 개 부류로 나뉠 수 있다.

필요하다면, Shh에 특이적으로 결합하는 항체의 이소타입은 상이한 이소타입의 생물학적 활성의 장점을 가지도록 전환(switch)될 수 있다. 예를 들면, 일부 환경에서, Shh에 대한 치료 항체로써 항체 생성과 연관하여, 항체들이 보체를 고정시킬 수 있고, 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여할 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다. 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 이와 같은 능력이 있는 다수의 항체 이소타입들이 있다: 뮤린 IgM, 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3. 다른 구체예들에서, Shh에 대한 치료 항체로써 항체 생성과 연관하여, 항체들이 작용기 세포상에서 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다. 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 이와 같은 능력이 있는 다수의 항체 이소타입들이 있다: 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3. 생성된 항체들은 처음부터 이와 같은 이소타입을 보유해야할 필요는 없지만, 다만 생성된 항체는 임의의 이소타입을 보유할 수 있고, 항체는 본 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 기술을 이용하여 전환된(switched) 이소타입이 될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 기술은 그중에서 직접적인 재조합 기술의 사용(가령, U.S. 특허 No. 4,816,397 참고), 세포-세포 융합 기술(가령, 미국 특허 5,916,771 및 6,207,418 참고)를 포함한다.

예를 들면, 본원에 기술된 항-Shh 항체들은 완전한 인간 항체들이다. 항체가 Shh에 대해 바람직한 결합을 보유한다면, 동일한 가변 부분을 보유하는(항체 특이성 및 이의 친화력의 일부를 한정시키는) 인간 IgM, 인간 IgG1, 또는 인간 IgG3 이소타입을 만들기 위해 용이하게 전환된 이소타입이 될 수 있다. 이와 같은 분자는 보체를 고정시키고, CDC에 참여할 수 있거나 및/또는 작용기 세포상의 Fc 수용체에 결합하고, ADCC에 참여할 수 있을 것이다.

"전혈 분석(Whole blood analysis)"은 천연 작용기의 소스로 분별되지 않은 혈액을 이용한다. 혈액은 혈장에 FcR-발현 세포작용기, 가령, 다형핵 세포(PMNs) 및 단핵 세포(MNCs)와 함께 보체를 포함한다. 따라서, 전혈 분석으로 시험관에서 ADCC 및 CDC 작용기 기전 모두의 공력작용의 동시 평가가 허용된다.

본원에서 사용된 "치료요법적 유효량(therapeutically effective amount)" 은 개체에게 약간의 개선 또는 이익을 주는 양이다. 또 다른 방식으로 표현하자면, “치료요법적 유효량”은 최소한 하나의 임상적 증후의 약간의 경감, 완화 및/또는 감소를 가져오는 양이다. 본 발명의 방법들에 의해 치료될 수 있는 질환과 연관된 임상적 증상은 본 기술 분야의 업자들에게 잘 알려져 있다. 더욱이, 개체에게 어느 정도의 이익이 제공되는 한, 치료요법적 효과가 완벽하거나 치유력이 있어야 한다는 것은 아니라는 것을 인지할 것이다.

본원에서 사용된 "및/또는"은 두 가지 명시된 특징 각각 또는 다른 것의 존부하에 성분들의 명시된 내용으로 받아들여야 한다. 예를 들면 "A 및/또는 B"는 마치 각각이 개별적으로 제시된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 와 B의 각각의 명시된 내용으로 받아들인다.

항체 구조

기본적인 항체 구조 단위는 사량체로 구성된다고 알려져 있다. 각 사량체는 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성되는데, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 가진다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 항원 인지를 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 부분을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 작용기 기능을 주로 담당하는 불변 부분이다. 인간 경쇄는 카파와 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤(mu), 델타, 감마, 알파, 또는 입실론으로 분류되고, 차례로 IgM, IgD, IgA, 및 IgE의 항체 이소타입으로 정의된다. 경쇄와 중쇄안에 가변 및 불변 부분은 약 12개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 “J”부분에 의해 연결되어 있으며, 중쇄는 또한 약 10개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 "D" 부분을 가진다. Generally, Fundamental Immunology Ch . 7 ( Paul , W, ed ., 2 nd ed . Raven Press , N. Y. (1989))을 참고 (모든 목적을 위해 전문이 참조로 본원에 통합됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 부분들은 항체 결합 부위를 형성한다.

따라서, 고유한 항체는 두 개의 결합 부위를 가진다. 이기능성 또는 이중특이적 항체들을 제외하고, 두 개의 결합 부위는 동일하다.

쇄는 모두 세 개의 초가변부분에 의해 연결된 상대적으로 보존된, 동일한 전체 구조의 프레임워크 부분들 (FR)을 나타내는데, 이는 CDRs이라고 한다. 각 쌍의 두 쇄에 있는 CDR은 특정 에피토프에 결합될 수 있도록 프레임워크 부분들에 의해 배열된다. N-말단으로부터 C-말단에 이르기까지 경쇄 및 중쇄 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 아미노산의 할당은 Kabat , Sequences of Proteins of Immunological Interest ( National Institutes of Health, Bethesda , Md . (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia et al . Nature 462:878-883 (1989)의 정의에 따른다.

이중특이적 또는 이기능적 항체는 두 개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 두 개의 상이한 결합 부위를 가지는 인위적인 하이브리드 항체다. 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 링크를 포함하는 다양한 방법들에 의해 이중특이적 항체들을 만들 수 있다. 가령, Songsivilai & Lachmann Clin . Exp . Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al . J. Immunol . 148:1547-1553 (1992) 참고. 이중특이적 항체들은 단일 결합 부위 (가령, Fab, Fab', 및 Fv)을 가지는 단편의 형태로는 존재하지 않는다.

일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 짝을 이루어 항체 항원-결합 부위를 제공하지만, VH 또는 VL 도메인 단독으로 항원에 결합할 수도 있다. VH 도메인 (표 12 참고)는 VL 도메인 (표 13 참고)과 짝을 이루어, VH 및 VL 도메인 모두를 포함하는 항체 항원-결합 부위가 형성된다.

인간 항체들 및 항체들의 인간화( humanization )

인간 항체들은 뮤린 또는 쥐의 가변 및/또는 불변 부분을 보유하는 항체들에 관련된 일부 문제점들을 회피한다. 이와 같은 뮤린 또는 쥐에서 유도된 단백질들이 존재함으로써 항체들이 신속하게 제거되며 또는 환자에 의해 항체에 대한 면역 반응이 유도될 수 있다. 뮤린 또는 쥐 유도된 항체들의 활용을 회피하기 위하여, 기능적 인간 항체 좌(loci)를 설치류, 기타 포유류 또는 동물에 도입시킴으로써, 설치류, 기타 포유류 또는 동물이 완전한 인간 항체들을 생산하게 만듦으로써, 완전한 인간 항체들을 만들 수 있다.

완전한 인간 항체들을 만드는 한 방법은 XenoMouse^® 마우스 균주를 이용하는 것인데, 이 균주는 인간 중쇄 좌와 카파 경쇄 좌의 최대 1000kb 미만의 크기의 생식계열로 설정된 단편을 포함하도록 조작된 것이다. Mendez et al . Nature Genetics 15:146-156 (1997) and Green and Jakobovits J. Exp . Med . 188:483-495 (1998). XenoMouse^® 균주는 Amgen , Inc . (Fremont, California , U. S. A)에서 구할 수 있다.

따라서, 이와 같은 마우스는 뮤린 면역글로불린 분자 및 항체들의 생산에서 결핍되는 인간 면역글로불린 분자 및 항체들을 생산할 수 있다. 이것을 실행하는데 이용되는 기술들은 U.S. 특허 출원 번호 08/759,620 (1996년 12월 3일자 제출됨) 및 국제 특허 출원 Nos. WO 98/24893, (1998년 6월 11일자 공개됨) 및 WO 00/76310 (2000년 12월 21일자 공개됨)-전문이 참조로 본원에 통합됨-에 설명되어 있다. Mendez et al . Nature Genetics 15:146-156 (1997)도 참고한다-전문이 참조로 본원에 통합됨.

XenoMouse^® 균주의 마우스의 생산에 대해서 U.S. 특허 출원 번호. 07/466,008 (1990년 1월 12일자 제출됨), 07/610,515 (1990년 11월 8일자 제출됨), 07/919,297 (1992년 7월 24일자 제출됨), 07/922,649 (1992년 7월 30일자 제출됨), 08/031,801 (1993년 3월 15일자 제출됨), 08/112,848 (1993년 8월 27일자 제출됨), 08/246,145 (1994년 4월 28일자 제출됨), 08/376,279 (1995년 1월 20일자 제출됨), 08/430, 938 (1995년 4월 27일자 제출됨), 08/464,584 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/464,582 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/463,191 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/462,837 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,853 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,857 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,859 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/462,513 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/724,752 (1996년 10월 2일자 제출됨), 08/759,620 (1996년 12월 3일자 제출됨), U.S. 공개 2003/0093820 (2001년 11월 30일자 제출됨) 및 미국 특허 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, 및 5,939,598; 일본 특허 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, 및 3 068 507 B2에서 더 논의되고 설명되어 있다. 또한 유럽 특허 EP 0 463 151 Bl, (1996년 6월 12일자 등록됨), 1996, 국제 특허 출원 번호, WO 94/02602 (1994년 2월 3일자 공개됨), 국제 특허 출원 No, WO 96/46096 (1996년 10월 31일자 공개됨), WO 98/24893 (1998년 6월 11일자 공개됨), WO 00/76310, (2000년 12월 21일자 공개됨)을 참고한다. 상기 언급된 특허, 출원 및 참고문헌 각각의 내용의 전문이 본원에 통합된다.

대안적 방법에서, GenPharm Internatinal, Inc을 포함하는 기타 방법은 "미니로커스(minilocus) 방법을 이용한다. 미니로커스(minilocus) 방법에서, Ig 좌의 조각(개별 유전자들)을 함유하게 하여 외인성 Ig 좌가 모방된다. 따라서, 하나 이상의 V_H 유전자들, 하나 이상의 D_H 유전자들, 하나 이상의 J_H 유전자들, mu 불변 부분, 및 보통 제 2 불변 부분 (바람직하게는 감마 불변 부분)이 동물내에 삽입되기 위한 불변부위가 형성된다. 이와 같은 방법은 U.S. 특허 No. 5,545,807 (Surani et al .) 및 미국 특허 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, 및 6,255,458 (Lonberg and Kay) U.S. 특허 No. 5,591,669 및 6,023,010 (Krimpenfort and Berns), 미국 특허 5,612,205, 5,721,367, 및 5,789,215 (Berns et al ,) 및 U.S. 특허 5,643,763 (Choi and Dunn), 및 GenPharm 국제 U.S. 특허 출원 번호. 07/574,748 (1990년 8월 29일자 제출됨), 07/575,962 (1990년 8월 31일자 제출됨), 07/810,279 (1991년 12월 17일자 제출됨), 07/853,408 (1992년 3월 18일자 제출됨), 07/904,068 (1992년 6월 23일자 제출됨), 07/990,860 (1992년 12월 16일자 제출됨), 08/053,131 (1993년 4월 26일자 제출됨), 08/096,762 (1993년 7월 22일자 제출됨), 08/155,301 (1993년 11월 18일자 제출됨), 08/161,739 (1993년 12월 3일자 제출됨), 08/165,699 (1993년 12월 10일자 제출됨), 08/209,741 (1994년 3월 9일자 제출됨)에서 설명되고 있으며, 상기 각 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다. 유럽 특허 0 546 073 Bl, 국제 특허 출원 번호. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 및 U.S. 특허 5,981,175 또한 참고하며, 이들 각 내용의 전문은 참조에 의해 본원에 통합된다. Taylor et al , 1992, Chen et al , 1993, Tuaillon et al , 1993, Choi et al , 1993, Lonberg et al , (1994), Taylor et al , (1994), 및 Tuaillon et al , (1995), Fishwild et al , (1996)의 내용도 참고하며, 이는 각 내용의 전문은 참조에 의해 본원에 통합된다.

Kirin은 마우스로부터 인간 항체들의 생성을 설명하는데, 이때 미셀 융합을 통하여, 염색체의 큰 단편들 또는 전체 염색체가 도입되었다. 유럽 특허 출원 번호. 773 288 및 843 961을 참고하며, 이들 내용의 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다. 추가적으로, KM™-마우스: Kirin의 Tc 마우스에 Medarex의 minilocus (Humab)의 교배 결과물-가 생성되었다. 이들 마우스들은 Kirin 마우스의 인간 IgH 전이염색체(transchromosome)와 Genpharm 마우스의 카파 전이유전자(transgene)를 보유한다. (Ishida et al , Cloning Stem Cells , (2002) 4:91-102).

시험관내 방법에 의해 인간 항체들이 또한 유도될 수 있다. 적합한 예로는 파아지 디스플레이(Medimmune , Morphosys , Dyax , Biosite / Medarex , Xoma , Symphogen , Alexion ( formerly Proliferon), Affimed), 리보좀 디스플레이 (Medimmune), 이스트 디스플레이 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

항체의 준비

본원에 기술된 항체들은 하기에서 설명되는 것과 같이 XenoMouse^® 기술의 이용을 통하여 준비되었다. 이와 같은 마우스는 뮤린 면역글로불린 분자 및 항체들의 생산에서 부족한 인간 면역글로불린 분자 및 항체들을 생산할 수 있다. 이를 얻는데 이용되는 기술들은 본원에서 배경 기술 부분에 언급된 특허, 출원 및 참고문헌들에서 설명되고 있다. 그러나 특히, 마우스의 전이유전자 생산 및 이로부터 항체들을 생산하는 바람직한 예들이 U.S. 특허 출원 번호. 08/759,620, (1996년 12월 3일자 제출됨) 및 국제 특허 출원 번호 WO 98/24893 (1998년 6월 11일자 공개됨) 및 WO 00/76310 (2000년 12월 21일자 공개됨)-이들 각 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다-에 설명되어 있다. Mendez et al . Nature Genetics 15:146-156 (1997) 또한 참고-이들 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다.

이와 같은 기술들을 이용하여, 다양한 항원에 대한 완전한 인간 단클론 항체들이 만들어졌다. 기본적으로, 마우스의 XenoMouse^® 계는 관심 항원(가령, Shh)으로 면역주사를 맞게 되고, 과-면역화된 생쥐로부터 임파세포 (가령, B 세포)가 회수되고, 회수된 임파세포는 골수-유형 세포와 융합되어, 불사화된(immortal) 하이브리도마 세포계를 만든다. 이와 같은 하이브리도마 세포계를 스크리닝하고, 선별하여 관심 항원에 특이적인 항체를 만드는 하이브리도마 세포계를 확인한다. Shh에 특이적인 항체들을 생산하는 다중 하이브리도마 세포계를 생산하는 방법도 제공된다. 더욱이, 이와 같은 세포계에 의해 생산되는 항체들의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 포함하는 특징이 제공된다.

대안으로, 하이브리도마를 만들기 위하여 골수종 세포에 융합하는 대신, B 세포들을 용이하게 분석할 수도 있다. 예를 들면, 과면역 XenoMouse^® 마우스로부터 CD19+ B 세포를 분리하여, 증식시키고, 항체-방출 혈장 세포로 분화시킬 수 있다. 세포 현탁액으로부터 항체들은 Shh 면역원에 대한 반응성에 대해 ELISA에 의해 스크리닝된다. Shh의 단편에 대항한 면역 반응성에 대하여 상청액을 스크리닝하여 Shh 상에 기능적 관심 도메인에 결합하는 상이한 항체들에 대해서도 측량할 수 있다. 기타 관련된 인간 엔도글리코시다제에 대해 및 쥐, 마우스, 및 종간 교차-반응성을 결정하기 위하여, 필리핀 원숭이와 같은 비-인간 영장류에 대항하여 Shh의 진화론적 유사성에 대해 항체들은 스크리닝될 수 있다. 관심 항체들을 포함하는 웰의 B 세포들은 개별 또는 모음 웰로부터 하이브리도마를 만들기 위한 융합을 포함한 다양한 방법들에 의해 불사화될 수 있거나 또는 EBV으로 감염 또는 공지의 불사화 유전자에 의한 형질감염후, 적적한 배지에 도말함으로써 불사화될 수 있다. 대안으로, 원하는 특이성을 가진 항체들을 배출하는 단일 혈장 세포는 Shh-특이적인 용혈 플락 분석을 이용하여 분리된다. (예를 들면 Babcook et al , Proc . Natl . Acad . ScL USA 93:7843-48 (1996) 참고). 용해를 위한 표적화된 세포는 Shh 항원으로 피복된 양(sheep)의 적혈구 세포(SRBCs)다.

관심 면역글로불린 및 보체를 분비하는 혈장 세포를 포함하는 B-세포 배양물 존재하에, 플락 형성은 관심 혈장 세포를 에워싸는 양(sheep)의 적혈구 세포의 특이적 Shh-매개된 용해를 나타낸다. 단일 항원-특이적인 혈장 세포가 플락의 중앙에서 분리될 수 있고, 항체 특이성을 인코드하는 유전자 정보는 단일 혈장 세포로부터 분리된다. 역-전사에 이어서 PCR (RT-PCR)를 이용하여, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부분을 인코드하는 DNA가 클론될 수 있다. 이와 같은 클론된 DNA는 적절한 발현 벡터, 바람직하게는 pcDNA와 같은 벡터 카세트, 더욱 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 포함하는 pcDNA 벡터안으로 추가 삽입될 수 있다, 생성된 벡터는 숙주 세포, 가령, HEK293 세포, CHO 세포로 형질감염되고, 전사를 유도하고, 형질변환체를 선별하거나 또는 바람직한 서열들을 인코드하는 유전자를 증폭시키는데 적절한 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다. .

이해하는 바와 같이, Shh에 특이적으로 결합하는 항체들은 하이브리도마 세포계 이외의 세포계에서 발현될 수 있다. 특정 항체들을 인코드하는 서열들을 이용하여 적절한 포유류 숙주 세포를 형질변환시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 도입시키기 위한 임의의 공지의 방법을 이용하여 형질변환될 수 있는데, 바이러스(또는 바이러스 벡터)안에 폴리뉴클레오티드를 넣고, 숙주 세포에 바이러스(또는 벡터)를 형질도입시키거나 또는 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455 (이들 특허들은 참조에 의해 본원에 통합된다)에서 예시화된 것과 같이, 본 기술 분야에 공지된 형질 감염 과정에 의해 형질도입시키는 것을 포함한다. 이용된 형질변환 과정은 형질변환되는 숙주에 따라 달라진다. 포유류 세포내로 이질성 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 방법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 이들 방법은 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질 융합, 전기천공, 리포좀에 폴리뉴클레오티드의 포집 및 핵으로 DNA의 직접적인 마이크로인젝션을 포함한다.

발현을 위하여 숙주로 이용가능한 포유류 세포계는 본 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, Chinese hamster ovary (CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(가령, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포 및 기타 다수의 세포계를 포함하나 이에 한정되지 않는, American Type Culture Collection (ATCC)로부터 이용가능한 많은 불사화된 세포계를 포함한다. 어떤 세포계가 Shh 구성적 결합 성질을 가진 항체를 높은 수준으로 발현하고, 생산하는 가를 결정하여 특히 바람직한 세포계를 선별한다.

세포-세포 융합 기술에서, 임의의 원하는 이소타입을 가진 중쇄를 보유하는 골수종, CHO 세포 또는 기타 세포계가 준비되고, 경쇄를 보유하는 또 다른 골수종, CHO 세포 또는 기타 세포계가 준비된다. 그 다음, 이와 같은 세포들이 융합되어, 고유 항체를 발현시키는 세포계가 분리될 수 있다.

따라서, 항기에서 논의된 바와 같이 원하는 “구조적”속성에 맞는 항체 후보물질이 생성되기 때문에, 이소타입 전환(switching)을 통하여 최소한 특정한 원하는 “기능적” 속성을 가지는 이들 항체들이 제공될 수 있다.

치료요법적 투여 및 제제

본 발명의 구체예들은 질환 치료에 유용한 항-Shh 항체의 멸균된 약학 제제를 포함한다. 이와 같은 제제들은 Shh가 원래 Patched-1에 결합하는 것을 방해하여, 병리학적 이상, 예를 들면 Shh 발현이 비정상적으로 상승된 혈청 또는 조직의 이상을 효과적으로 치료할 수 있다. 항-Shh 항체들은 바람직하게는 Shh의 Patched-1 결합을 강력하게 방해하는 적절한 친화력을 보유하고, 인간에게 빈번하지 않는 투약을 위하여 적절한 작용 기간을 보유한다. 연장된 작용 기간으로 덜 빈번하게, 피하 또는 근육 주사와 같은 대안적인 장관외 경로를 통하여 좀더 편리한 투약이 허용된다.

항체의 동결건조 또는 재구성 전 또는 후에 멸균 필터 막을 통하여 여과시킴으로써 멸균 제제가 제조될 수 있다. 항체는 보통 동결건조된 형태로 또는 용액내에 보관될 것이다. 치료요법적 항체 조성물은 일반적으로 멸균 입구 포트를 가지는 용기, 예를 들면, 정맥 용액 주머니 또는 제제의 벌충을 허용하는 어뎁터 가령, 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 마개를 가진 바이알내에 둔다.

항체 투여 경로는 공지의 방법에 따르는데, 가령, 정맥, 복막, 대뇌, 근육, 안구, 동맥, 척수내 주사 또는 주입, 흡입 또는 병소내 경로, 종양 부위에 직접 주사 또는 하기에서 명시된 지연된 방출계를 이용한 주사 또는 주입이 될 수 있다. 항체는 바람직하게는 주입 또는 정맥주사(bolus injection)에 의해 연속적으로 투여된다.

치료요법적으로 이용되는 항체의 유효량은 치료 대상, 투여 경로, 환자의 상태 등에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료사는 약량을 적정하고, 최적의 치료 효과를 얻는데 요구되는 투여 경로를 변형시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 임상의는 원하는 효과를 얻게되는 약량에 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 이와 같은 치료 과정은 통상적인 분석 또는 본원에 기술된 분석에 의해 용이하게 모니터된다.

본원에 기술된, 항체들은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합물로 준비될 수 있다. 이와 같은 치료 조성물은 정맥으로 또는 코 또는 폐를 통하여 바람직하게는 액체 또는 분말 에어로졸(동결건조된)로 투여될 것이다. 조성물은 원하는 경우, 장관외 또는 피하를 통하여 투여될 수도 있다. 전신으로 투여된 경우, 치료요법적 조성물은 멸균되고, 발열물이 없어야 하며, pH, 등장성 및 안정성을 가진 장관외적으로 수용가능한 용액내에 있어야 한다. 이와 같은 조건들은 본 기술 분야의 당업자들에게 공지된 것이다. 간략하게 설명하면, 본원에 기술된 바람직한 수준의 순도를 가진 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써 보관 또는 투여를 위한 화합물들의 투약량 제제가 준비된다. 이와 같은 물질들은 이용되는 투약량, 농도에서 수용체에 비-독성이며, TRIS HCl, 인산염, 구연산염, 아세테이트 및 기타 유기산 염과 같은 완충액,; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량(약 10개의 잔기) 펩티드 가령, 폴리아르기닌, 혈청 알부민과 같은 단백질들, 젤라틴 또는 면역글로불린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 셀룰로오즈 또는 이의 유도체, 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 물질; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 카운터이온 및/또는 TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

주사용 멸균 조성물은 Remington : The Science and Practice of Pharmacy (20 th ed ., Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003))에서 설명된 것과 같은 통상적인 약학적 과정에 따라 조제될 수 있다. 예를 들면, 활성 화합물을 물 또는 자연적으로 발생되는 식물성 오일 가령, 참깨, 땅콩 또는 면실유 또는 에틸 올레이트와 같은 합성 지방 비이클과 같은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 현탁시키는 것이 바람직할 수 있다. 완충액, 보존제, 항산화제 및 이와 유사한 것은 수용된 약학적 과정에 따라 결합될 수 있다.

지연-방출 제제의 적절한 예는 폴리펩티드를 포함하는 고형 소수성 폴리머의 반-투성 매트릭스를 포함하며, 이때 매트릭스는 모양을 갖춘 물품, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태다. 지연-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, Langer et al , J. Biomed Mater . Res , (1981) 15:167-277 and Langer, Chem . Tech , (1982) 12:98-105에서 설명된 것과 같은 하이드로겔(가령, 폴리(2-하이드록시에틸-메타아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(U.S. Pat. 3,773,919, EP 58,481), L-글루타민산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머(Sidman et al , Biopolymers , (1983) 22: 547-556), 분해되지 않은 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer et al , supra), 분해가능한 젖산-글리콜산 코폴리머, 예를 들면, LUPRON Depot™ (젖산-글리콜산 코폴리머와 루프로리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부틸산(EP 133,988)을 포함한다.

에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 폴리머들은 100일 이상에 걸쳐 분자를 방출할 수 있으며, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 포집된(encapsulated) 단백질들은 긴 시간 동안 체내에 머무르며, 이들은 37℃에서 수분에 노출됨으로써 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성을 상실하게 되고, 면역원성이 변화될 가능성도 있다. 관련 기전에 따라 단백질의 안정화를 위한 이성적인 전략을 연구할 수 있다. 예를 들면, 응집(aggregation) 기전이 이황화 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성으로 밝혀진다면, 설퍼하이드릴잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 이용하여 수분 함량을 조절하고, 및 특정 폴리머 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 얻을 수 있을 것이다.

지연-방출되는 조성물은 또한 현탁액에서 결정을 유지시킬 수 있는 적절한 제제내 현탁된 항체 결정물을 포함한다. 이와 같은 준비물이 피하 또는 복막으로 주사되었을 때, 지연된 방출 효과를 만들 수 있다. 기타 조성물은 또한 리포좀내에 포집된 항체를 포함한다. 이들 항체를 포함하는 리포좀은 공지된 방법에 의해 만들 수 있다: U.S. Pat . No . DE 3,218,121; Epstein et al , Proc . Natl . Acad. ScL USA , (1985) 82:3688-3692; Hwang et al , Proc . Natl . Acad . ScL USA , (1980) 77:4030-4046; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; U.S. Pat. 4,485,045 및 4,544,545; 및 EP 102,324.

주어진 환자에 제공되는 항체 제제의 투약량은 질병의 중증도, 유형, 체중, 성별, 식이, 투여 기간 및 경로, 기타 의학적 및 관련 임상적 인자들을 포함하는 약물의 작용을 변형시키는 것으로 공지된 다양한 인자들을 고려하여 담당의사에 의해 결정될 수 있을 것이다. 치료요법적 유효한 투약량은 시험관 또는 생체 방법에 의해 결정될 수 있다.

본원에 기술된, 치료요법적으로 이용되는 항체들의 유효량은 예를 들면, 치료 대상, 투여 경로, 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료사는 투약량을 적정하고, 및 최적의 치료요법적 효과를 수득하는데 요구되는 투여 경로를 수정하는 것이 바람직하다. 상기 언급된 인자들에 따라, 환자의 체중 kg당 일반적인 일일 투약량은 약 0.0001mg/kg, 0.001mg/kg, 0.01mg/kg, 0.1mg/kg, lmg/kg, 10mg/kg에서 최대 100mg/kg, 1000mg/kg, 10000mg/kg 또는 그 이상의 범위가 될 수 있다. 투약량은 상기 언급된 인자들에 따라, 환자의 체중 kg당 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg에서 0.25 mg/kg, 0.0001에서 0.15 mg/kg, 0.0001 mg/kg 에서 0.10 mg/kg, 0.001 mg/kg 에서 0.5 mg/kg, 0.01 mg/kg 에서 0.25 mg/kg 또는 0.01 mg/kg 에서 0.10 mg/kg의 범위가 될 수 있다. 일반적으로, 임상의는 원하는 효과를 얻게 되는 약량에 도달할 때까지 치료요법적 항체를 투여할 것이다. 이와 같은 치료 과정은 통상적인 분석 또는 본원에 기술된 분석에 의해 용이하게 모니터된다.

본 발명의 항체의 투약량은 반복 투여될 수 있는데, 투여는 최소한 1 일, 2 일, 3 일, 5 일, 10 일, 15 일, 30 일, 45 일, 2 개월, 75 일, 3 개월 또는 최소한 6 개월 간격을 둘 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법에 따른 치료요법적 물질은 개선된 운반, 이동, 내성 및 이와 유사한 것을 제공하기 위하여 제제내에 통합될 수 있는 적절한 담체, 부형제 및 기타 물질과 함께 투여될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이들 제제는 예를 들면, 분말, 페스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질 (양성 또는 음성)-함유 소포(가령, Lipofectin™), DNA 콘쥬게이트, 무수 흡수 페스트, 수중유 및 유중수 에멸젼, 에멸젼 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 겔, 카르보왁스를 포함하는 반고형 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물중 임의의 것들은 제제내 활성 성분이 제제에 의해 비활성화되지 않고, 제제는 생리학적으로 양립되며, 투여 경로에 내성을 가진다면, 본 발명에 따른 치료 및 치료법에 적절할 수 있다. Baldrick P. " Pharmaceutical excipient development : the need for preclinical guidance ." Regul . Toxicol . Pharmacol . 32(2):210-8 (2000), Wang W. " Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int . J. Pharm . 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN " lipids , lipophilic drugs, and oral drug delivery - some emerging concepts ." J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000), Powell et al . " Compendium of excipients for parenteral formulations " PDA J Pharm Sci Technol . 52:238-311 (1998)을 참고하며, 제제, 부형제, 및 담체 관련된 추가 정보를 위해 언급된 문헌들도 제약사들에 잘 공지된 것이다.

기타 치료제 고안 및 생성

본 발명에 따르고 본원에 기술된 Shh에 대한 특징화되고, 생산된 항체의 활성에 근거하여, 항체 모이어티에 대한 기타 치료요법적 양식의 기획이 실행된다. 이와 같은 양식은 이중특이적 항체들, 면역톡신, 및 방사능라벨링된 치료제, 단일 도메인 항체들, 항체 단편, 가령 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 dAb, 펩티드 치료제 생성, 신규한 골격(scaffold)내 Shh 결합 도메인, 유전자 요법, 특히, 인트라바디(intrabodies), 안티센스 요법 및 소(small) 분자와 같은 진보된 항체 치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

항원 결합 부위는 비-항체 단백질 골격, 가령, 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등의 골격상에 CDR을 배열하여 제공될 수 있거나 (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al . (1998) Journal of Molecular Biology , 284: 1141-1151; Nygren et al . (1997) Current Opinion in Structural Biology , 7: 463-469) 또는 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위하여 단백질내 루프 아미노산 잔기를 무작위화 시키거나 또는 돌연변이시켜 항원 결합 부위가 제공될 수도 있다. 단백질에서 신규한 결합 부위를 조작하기 위한 골격(Scaffolds)은 Nygren et al . ( Nygren et al . (1997) Current Opinion in Structural Biology , 7: 463-469)을 참고한다. 항체 모방체를 위한 단백질 골격은 WO/0046784에서 설명되고 있으며, 전문이 참조에 의해 본원에 통합되어 있으며, 이 자료의 발명자들은 최소한 하나의 무작위화된 루프를 가지는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질들 (항체 모방체)을 설명한다. 하나 이상의 CDR, 가령 HCDRs 세트에 접목될 적절한 골격은 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리의 임의의 도메인 멤버에 의해 제공될 수 있다. 골격은 인간 또는 비-인간 단백질이 될 수 있다. 비-항체 단백질 골격의 장점은 적어도 일부 항체 분자보다 더 작고, 및/또는 제조에 용이한 골격 분자내에 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 결합 멤버의 작은 크기는 세포에 유입되고, 조직내 깊이 침투하고, 또는 기타 구조내에 있는 표적에 도달하고 또는 표적 항원의 단백질 구멍내에 결합하는 것과 같은 유용한 생리학적 성질을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 골격내 항원 결합 부위의 이용에 대해서 Wess, 2004 ( Wess , L. In : BioCentury , The Bernstein Report on BioBusiness , 12(42), A1-A7, 2004)을 참고한다. 안정적인 기본 골격 및 하나 이상의 가변 루프를 가진 단백질이 일반적인데, 루프의 아미노산 서열은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 만들기 위하여 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이된다. 이와 같은 단백질들은 S. 아루레우스(S. aureus)의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트란스페린, 알부민, 테트라넥틴, 피브로넥틴(가령 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인), 리포칼린 뿐만 아니라 감마-결정 및 기타 Affilin™ 골격(Scil Proteins)를 포함한다. 기타 방법의 예로는 사이크롤티드 상에 합성 "Microbodies" -단백질들 분자내 이황화 결합을 가지는 작은 단백질, Microproteins (Versabodies™, Amunix) 및 안키린(ankyrin) 반복 단백질들 (DARPins, Molecular Partners)을 포함한다.

항체 서열들 및/또는 항원-결합 부위에 추가하여, 본 발명에 따른 표적화된 결합제는 기타 아미노산, 가령 폴드된 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는, 또는 항원에 결합하는 능력에 추가하여 또 다른 기능적 특징을 분자에 부여하기 위한 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적화된 결합제는 탐지가능한 라벨을 가지고 있을 수 있으며, 또는 톡신 또는 표적화된 모이어티 또는 효소에 콘쥬게이트(가령, 펩티드 결합 또는 링커를 통하여)될 수도 있다. 예를 들면, 표적화된 결합제는 촉매 부위(가령, 효소 도메인 안에) 뿐만 아니라 항원 결합 부위를 포함할 수 있는데, 여기서, 항원 결합 부위는 항원에 결합하고, 따라서, 항원에 촉매 부위가 표적된다. 촉매 부위는 절단에 의해 항원의 생물학적 기능을 저해시킬 수 있다.

진보된 항체 치료제 생성과 관련하여, 보체 고정(complement fixation)이 바람직한 속성이라면, 이중특이적 항체들, 면역톡신, 또는 방사능라벨과 같은 것들을 이용하여 세포 사멸에 대한 보체 의존성을 회피하는 것도 가능할 것이다.

예를 들면, (i) 두 개 항체, 즉 Shh에 특이성이 있는 한 개의 항체와 함께 콘쥬게이트되는 제 2 분자에 특이성이 있는 다른 항체, (ii) Shh에 특이적인 한 개의 쇄와 제 2 분자에 특이적인 제 2 쇄를 가지는 단일 항체, 또는 (iii) Shh 및 기타 분자에 특이성을 가지는 단일 쇄 항체를 포함하는 이중특이적 항체들이 제조될 수 있다. 이와 같은 이중특이적 항체들은 잘 공지된 기술들을 이용하여 제조될 수 있는데; 예를 들면, (i) 및 (ii)와 관련해서 Fanger et al . Immunol Methods 4:72-81 (1994) and Wright and Harris , supra을 참고하며, (iii)과 관련해서, Traunecker et al . Int. J. Cancer ( Suppl .) 7: 51-52 (1992)을 참고한다. 각 경우에, CD16 또는 CD64 (가령, Deo et al. Immunol . Today 18:127 (1997)) 또는 CD89 (가령, Valerius et al . Blood 90:4485-4492 (1997))를 포함하나 이에 한정되지 않는 중쇄 활성화 수용체에 대해 제 2 특이성이 제조될 수 있다.

항체들은 또한 본 기술 분야에 잘 공지된 기술들을 이용하여 면역톡신으로 작용할 수 있도록 변형될 수 있다. 가령, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). U.S. 특허 No. 5,194,594 참고. 방사능라벨링된 항체들을 준비하는 것과 관련하여, 이와 같은 변형된 항체들은 본 기술 분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다. 가령, Junghans et al . in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition , Chafner and Longo , eds , Lippincott Raven (1996)) 참고. 미국 특허 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 ( RE 35,500), 5,648,471, 및5 ,697,902 참고. 각 면역톡신 또는 방사능라벨링된된 분자는 원하는 다량체 효소 소단위 올리고머화 도메인을 발현하는 세포를 죽일 수 있을 것이다.

항체가 물질(가령, 방사성 동위 원소, 약제학적 조성물 또는 톡신)에 링크되어 있을 때, 물질은 세포분열억제, 알킬화, 대사길항, 항혈관신생, 자가-사멸, 알칼로이드, COX-2, 및 항생제 및 이의 복합으로 구성된 군으로부터 선택된 약학 성질을 보유하는 것으로 간주된다. 약물은 질소 머스터드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로조우레아, 트리아젠, 엽산 유사체, 안트라사이클린, 탁산, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 대사길항물질, 항생제, 효소, 에피도필로톡신, 백금 배위 복합체, 빈카 알칼로이드, 치환된 우레아, 메틸 하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 길항제, 엔도스타틴, 탁솔, 캄포테신, 옥살리플라틴, 독소루비신 및 이들의 유사체 및 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

톡신의 예로는 겔로닌, 슈도모나스 엑소톡신 (PE), PE40, PE38, 디프테리아 톡신, 리친, 아브린, 알파 톡신, 사포린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코커스 엔테로톡신-A, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌, 슈도모나스 엔도톡신, 칼리케마이신(calicheamicin) 및 에스페라마이신(esperamicin)과 같은 에네딘(enediyne) 패밀리 분자 멤버 뿐만 아니라, 이들의 유도체, 복합 및 변형을 더 포함한다. 화학적인 톡신은 듀오카르마이신(가령, U.S. 특허 5,703,080 및 U.S. 특허 No. 4,923,990), 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜파란, 클로람부칠, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스-플라티늄, 에토포시드, 블레오마이신 및 5-플로오르우라실으로 구성된 군으로부터 취할 수 있다. 화학치료요법적 물질의 예는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플로오르우라실, 시토신 아라비노시드(Ara-C), 사이클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레(독세탁셀), 부술판, 사이토신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜파란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미토산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라마이신(U.S. 특허 No. 4,675,187 참고), 멜파란 및 기타 관련 질소 머스타드를 또한 포함한다. 적절한 톡신 및 화학요법제는 Remington's Pharmaceutical Sciences , 19 th Ed . ( Mack Publishing Co . 1995), 및 Goodman And Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics , 7 th Ed . ( MacMillan Publishing Co . 1985)에서 설명된다. 기타 적절한 톡신 및/또는 화학치료제는 본 기술 분야의 당업자들에게도 알려져 있다.

방사성 동위 원소의 예로는 국소화 및/또는 치료에 이용될 수 있는 감마-방사체, 양전자-방사체, 및 x-선 방사체, 및 치료법에 이용될 수 있는 베타-방사체 및 알파-방사체를 포함한다. 진단, 예후 및 단계 확인에 유용한 것으로 이미 언급된 방사성 동위 원소 또한 치료제로 유용하다.

항암 또는 항-백혈병 치료제의 비-제한적인 예로는 안트라사이클린 가령, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 이다루비신, 데토루부신, 카르미노마이신, 에피루비신, 에소루비신 및 몰포리노 및 치환된 유도체, 이의 복합물 및 변형물을 포함한다. 예시적인 약학 물질에는 시스-플라티늄, 탁솔, 칼리케아미신, 빈크리스틴, 사이타라빈(Ara-C), 사이클로포스파미드, 프데드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부칠, 인터페론 알파, 하이드록시우레아, 테모졸로미드, 탈리도미드, 블레오마이신 및 이의 유도체, 복합물 및 변형물을 포함한다. 바람직하게는, 항암 또는 항백혈병제는 독소루비신, 몰포리노독소루비신 또는 몰포리노다우노루비신이다.

본 발명의 항체들은 포유류, 바람직하게는 인간에서 변형안된 항체의 것보다 큰 반감기(가령, 혈청 반감기)를 가지는 항체들 또한 포함한다. 상기 항체 반감기는 약 15 일 이상, 약 20 일 이상, 약 25 일 이상, 약 30 일 이상, 약 35 일 이상, 약 40 일 이상, 약 45 일 이상, 약 2 개월 이상, 약 3 개월 이상, 약 4 개월 이상, 또는 약 5 개월 이상이 될 수 있다. 포유류, 바람직하게는 인간에서 본 발명의 항체 또는 이들 단편의 반감기 증가는 포유류에서, 바람직하게는 인간에서 항체들 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서, 항체들 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고 및/또는 투여되는 항체들 또는 항체 단편의 농도를 줄일 수 있게 한다. 생체내 증가된 반감기를 가지는 항체들 또는 이의 단편들은 본 기술 분야에 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 증가된 반감기를 가지는 항체들 또는 이의 단편들은 Fc 도메인 및 FcRn 수용체 간에 상호작용에 관련된 것으로 확인된 아미노산 잔기들을 변형(가령, 치환, 결손 또는 추가)시켜 만들 수 있다(가령, 국제 공개 번호 WO 97/46631 및 WO 02/060919, 이들 내용은 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다). 생체내 반감기기 증가된 항체들 또는 이의 단편들은 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 폴리머 분자에 항체 또는 항체 단편을 부착시켜 만들 수 있다. 항체들 또는 항체 단편에 다기능 링커 유무하에, PEG의 부위-특이적인 콘쥬게이트를 통하여 항체들 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 PEG가 부착되거나 또는 리신 잔기에 있는 입실론-아미노기를 통하여 PEG가 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 상실을 최소화시키는 선형 또는 분지형 폴리머의 유도도 이용될 수 있을 것이다. PEG 분자가 항체에 적절하게 콘쥬게이트된 것을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 질량 분석을 통하여 콘쥬게이트 정도를 긴밀하게 모니터할 수 있을 것이다. 반응안된 PEG는 가령, 크기-압출 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 것이다.

본 기술 분야에 당업자들이 인지할 수 있는 것과 같이, 친화력 값이 중요하나, 항체의 특정 기능에 따라 다른 인자들도 중요할 수 있다. 예를 들면, 면역톡신 (항체에 연합된 톡신)의 경우, 표적에 항체의 결합 작용이 유용할 것이나, 일부 구체예들에서, 톡신이 세포로 내화되는 것이 원하는 최종 결과다. 이와 같은 상황에서는 높은 내화율(%)을 가진 항체들이 바람직할 것이다. 따라서, 한 구체예에서, 내화에 고효율을 가진 항체들이 고려된다. 고효율의 내화는 내화된 항체%로 측정될 수 있는데, 낮은 수치부터 100% 까지 될 수 있다. 예를 들면, 다양한 구체예에서, 0.1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99, 및 99-100%가 고효율이 될 것이다. 본 기술 분야의 당업자들이 인지할 수 있는 바와 같이, 바람직한 효과는 연합된 물질, 부위로 투여될 수 있는 항체의 양, 항체-물질 복합체의 부작용, 치료되어야 하는 문제가 되는 유형(가령, 암 유형) 및 중증도에 따라 상이한 구체예에서 달라질 수 있다.

다른 구체예들에서, 본원에 기술된 항체들은 Shh 발현에서 변화와 연루된 질병 또는 이상을 스크리닝하기 위하여, 포유류 조직 또는 세포에서 Shh 발현을 탐지하기 위한 분석 키트를 제공한다. 키트는 Shh에 결합하는 항체, 및 항원(존재한다면)과 항체의 반응을 나타내는 수단을 포함한다.

배합( Combinations )

본원에서 정의된 바와 같이, 표적화된 결합제 또는 항체는 단독 요법으로 이용되거나 또는 본 발명의 화합물에 추가하여, 통상적인 외과술 또는 방사능요법 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 이와 같은 화학요법은 다음 범주의 하나 이상의 항종양 물질을 포함할 수 있다:

(i) 종양학에서 이용되는 것과 같이, 기타 항증식성/항종양성 약물 및 이의 복합물, 가령, 알킬화제(예를 들면, 시스-플라틴, 옥살플라틴, 카르보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부칠, 부술판, 테모졸아미드 및 니트로조우레아); 대사길항물질(예를 들면 겜시타빈, 항엽산제, 가령, 5-플루오르우라실과 유사한 플로오르피리미딘 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드 및 하이드록시우레아); 항종양 항생제 (예를 들면, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노미아신 및 미트로마이신과 같은 안트라사이클린); 세포분열억제제(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신과 같은 빈카 알칼로이드 및 비노렐빈 및 탁솔 및 탁소테레과 같은 탁소이드 및 폴로키나제 억제제); 및 포토이소메라제 억제제 (예를 들면, 에토포시드 및 테니포시드와 같은 에피도펠로톡신, 암사크린, 토포테칸 및 캄포테신);

(ii) 세포증식억제제, 가령, 항에스트로겐(예를 들면, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄옥시펜, 드롤로옥시펜, 및 이도옥시펜), 항안드로겐(예를 들면, 비칼루타미드, 플루타미드, 니루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 항진제(예를 들면, 고세레린, 루프로레린 및 부세레린), 프로게스테론 (예를 들면 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제 (예를 들면, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 피나스페리드와 같은 5α-환원효소 억제제;

(iii) 항침투제(예를 들면, 4-(6-클로로-2,3-메틸렌디옥시아닐로)-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]-5-테트라하이드로피란-4-일 옥시퀴나졸린(AZD0530; 국제 특허 출원 WO 01/94461) 및 N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2- {6-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]-2-메틸피리미딘-4-일 아미노} 티아졸-5-카르복사미드(다사티니브[dasatinib], BMS -354825; J. Med . Chem , 2004, 47, 6658-6661)와 같은 c-Src 키나제 패밀리 억제제, 및 마리마스타트와 같은 금속단백질분해제 억제제, 유로키나제 플라스미노겐 작용제 수용체 기능 억제제, 카텝신 억제제, 세린 프로테아제 억제제, 예를 들면 마트리프타제, 헵신, 유로키나제, 헤파라나제 억제제);

(iv) 세포독성 물질, 가령, 플루다라빈, 2-클로로데옥시아데노신, 클로람부칠 또는 독소루비신 및 이의 복합물, 가령, 플루다라빈 + 사이클로포스파미드, CVP: 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손, ACVBP: 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈데신 + 블레오마이신 + 프레드니손, CHOP: 사이클로포스파미드 + 독소루비신 + 빈크리스틴 + 프레드니손, CNOP: 사이클로포스파미드 + 미토옥산트론 + 빈크리스틴 + 프레드니손, m-BACOD: 메토트렉세이트 + 블레오마이신 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 덱사메타손 + 루코보린, MACOP-B: 메토트렉세이트 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손 고정된 약량 + 블레오마이신 + 루코보린, 또는 ProMACE CytaBOM: 프레드니손 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 에토폭시드 + 시타라빈 + 블레오마이신 + 빈크리스틴 + 메토트렉세이트 + 루코보린.

(v) 성장 인자 기능 억제제, 예를 들면, 이와 같은 억제제는 성장 인자 항체들 및 성장 인자 수용체 항체들 (예를 들면, 항-erbB2 항체 트라투주마브[Herceptin™], 항-EGFR 항체 파니투무마브, 항-erbB1 항체 세투시마브[Erbitux, C225] 및 Stern et al . Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol . 54, ppll -29)에서 설명하는 임의의 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 항체들을 포함한다; 이와 같은 억제제는 또한 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 상피 성장 인자 패밀리의 억제제(예를 들면, EGFR 패밀리 티로신 키나제억제제, 가령 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-몰포리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민 (게피티니브[gefitinib], ZD1839), N- (3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 (에르로티니브[erlotinib], OSI-774) 및 6- 아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플로오르페닐)-7-(3-몰포리노프로폭시)-퀴나졸린-4-아민 (CI 1033), erbB2 티로신 키나제억제제, 가령, 라파티니브, 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제, 혈소판-유도된 성장 인자 패밀리의 억제제, 가령 이마티니브, 세린/트레오틴 키나제의 억제제(예를 들면, Ras/Raf 신호발생 억제제, 가령 파르네실 트란스퍼라제 억제제, 예를 들면 소라페니브(BAY 43-9006)), MEK 및/또는 AKT 키나제를 통한 세포 신호발생 억제제, 간세포 성장 인자 패밀리 억제제, c-키트 억제제, ab1 키나제 억제제, IGF 수용체 (인슐린 유사 성장 인자) 키나제 억제제, 아우로라 키나제 억제제 (예를 들면 AZDl 152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 및 AX39459), 사이클린 의존적 키나제 억제제, 가령 CDK2 및/또는 CDK4 억제제, 및 생존 신호발생 단백질들 가령 Bcl-2, BcI-XL의 억제제, 예를 들면 ABT-737;

(vi) 맥관 내피 성장 인자를 저해시키는 항혈관신생제, [예를 들면 항-맥관 내피 세포 성장 인자 항체 베바치주마브 (Avastin™) 및 VEGF 수용체 티로신 키나제억제제, 가령, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일 메톡시)퀴나졸린(ZD6474; WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일 옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일 프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바타라니브(PTK787; WO 98/35985) 및 SU11248 (수니티니브; WO 01/60814), 국제 특허 출원 WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO00/47212 및 WO01/32651에서 설명된 화합물, 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예를 들면, 리노미드, 인테그린 αvβ3 기능 억제제 및 앙지오스타틴)] 또는 콜로니 자극 1 (CSF1) 또는 CSF1 수용체.;

(vii) 맥관 파괴 물질, 가령, 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04446 및 WO 02/08213에서 설명된 화합물;

(viii) 안티센스 치료제, 예를 들면 상기에서 열거된 표적을 향하는 것들, 가령, G-3139 (Genasense), 항-bcl2 안티센스;

(ix) 유전자 치료 방법, 가령, 예를 들면 변종 p53 또는 변종 BRCA1 또는 BRCA2, GDEPT (효소 프로 드럭 치료에 대한 유전자)와 같은 변종 유전자를 대체하는 방법, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 세균성 니트로환원효소를 이용하는 것과 같은 방법, 및 다중 약물 저항성 유전자 치료와 같은 화학요법 또는 방사능요법에 대한 환자의 내성을 증가시키는 방법을 포함하는 방법; 및

(x) 면역치료 방법, 예를 들면, 알레투주마브(campath-1H™)로 치료, CD52에 대한 단클론 항체, 또는 CD22에 대한 항체로 치료, 생체외(ex vivo) 및 생체내(in vivo) 환자의 종양 세포의 면역성을 증가시키는 방법, 인터루킨 2, 인터루킨 4와 같은 사이토킨 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자를 이용한 형질감염, CTLA-4 기능을 억제시키는 단클론 항체들를 이용한 치료와 같은 T-세포 아네르기를 감소시키는 방법, 사이토킨 형질감염된 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 이용하는 방법, 사이토킨 형질감염된 종양 세포계를 이용하는 방법, 및 항-이디오타입 항체들을 이용하는 방법을 포함하는, 면역치료 방법;

(xi) 단백질 분해 억제제, 가령, Velcade (보르테조미브)와 같은 프로테아좀 억제제;

(xii) 생체요법적 치료요법적 방법, 예를 들면, 수용체 리간드를 격리시키고, 수용체에 리간드 결합을 차단하거나 또는 수용체 신호발생을 감소시키는 (가령, 수용체 분해의 강화 또는 발현 수준이 낮아지기 때문) 펩티드 또는 단백질들 (가령, 항체 또는 가용성 외부 수용체 도메인 구조)을 이용하는 것을 포함하는 방법.

한 구체예에서, 본원에서 정의된 항종양 치료는 본 발명의 화합물에 추가하여, 종양학에서 이용되는 것과 같이, 항-증식성/항종양성 약물 및 이의 복합물을 이용하는 것을 포함할 수 있는데, 가령, 알킬화제(예를 들면, 시스-플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부칠, 부설판, 테모졸아미드, 및 니트로조우레아); 대사길항물질(예를 들면, 겜시타빈, 및 항엽산제, 가령 5-플루로오우라신과 유사한 플로오르피리미딘 및 테가푸르, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노사이드, 및 하이드록시우레아); 항종양 항생제(예를 들면, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티모마이신 및 미트라마이신과 같은 안트라사이클린); 세포분열억제제(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드, 및 탁솔 및 탁소테레와 같은 탁소이드 및 폴로키나제 억제제); 및 토포이소메라제 억제제 (예를 들면, 에토폭시드 및 테니포시드와 같은 에피포도필로톡신, 및 테니포시드, 암스크린, 토포테칸 및 캄포테신).

한 구체예에서, 본원에서 정의된 항-종양 치료는 본 발명의 화합물에 추가하여 겜시타빈을 이용한 치료를 포함할 수 있다.

이와 같은 결합 치료는 치료를 위한 개별 성분의 동시, 연속 또는 별도 투여를 통하여 이루어질 수 있다. 이와 같은 복합 산물은 기존에 설명된 투약량 범위의 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과, 승인된 투약 범위내에 기타 약리학적으로 활성 물질을 이용한다.

실시예

실행된 실험들과 수득된 결과들을 포함한 다음의 실시예들은 단지 설명을 목적으로 제공된 것이며, 본원에서 교수되는 것에 한정하는 의도로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

면역화(Immunization) 및 역가적정(TlTERING)

면역화

인간 소닉 헤지혹 (Shh)에 대한 단클론 항체들은 XenoMouse^® 마우스의 연속적인 면역화에 의해 개발되었다. 작전(campaign) 1에 대한 면역화는 가용성 재조합 인간 Shh (Cat# 1314-SH/CF, R&D Systems) 및 KLH-콘쥬게이트된 Shh (Shh-KLH)을 이용하여 실행되었다. 작전 1에서, 초기 부스트(boost)에서 재조합 인간 Shh (10㎍/마우스)는 TiterMax™ Gold (Sigma Cat # T2684)와 함께 복막(IP) 주사를 통하여 투여되었다. 이어지는 6회 부스트는 마우스당 5 ㎍의 Shh를 이용하여, 꼬리에 CpG DNA (ImmunEasy Mouse Adjuvant, cat # 303101, Qiagen)와 Adju-Phos (인산 알루미늄염 겔, cat # 1452-250, HCI Biosector)의 혼합물, 및 TiterMax Gold에 복합된 Shh를 IP 주사를 통하여 번갈아 주사하였다. 6회 부스트는 일주일에 2회 투여되었다. 또 다른 9회 부스트는 꼬리에 CpG DNA와 Adju-Phos를 처리하는 것과TiterMax Gold를와 IP 주사를 통하여 처리하는 것을 번갈아 수행하는 방식으로 마우스당 5 ㎍의 Shh로 실시하였다. 이들 9회 부스트 중 첫 6회는 일주일에 2회 투여되었고, 마지막 3차례는 일주일에 1회 투여되었다. 5 ㎍ Shh-KLH/PBS의 최종 부스트는 꼬리 IP에 제공되었다.

전장(full length)의 인간 Shh로 일시적으로 형질감염된 CHO 세포를 작전 2의 면역원으로 이용하였다. Adju-Phos에 혼합된 2×10⁶ 개의 세포는 IP로 첫 번째 투여되었다. 그 다음 16회 부스트는 1×10⁶ 개의 세포를 꼬리 또는 IP를 통하여 Adju-Phos와 함께 주사되었으며, 끝으로 최종 2회 부스트는 꼬리 IP를 통하여 주사되었다. 첫 14회 부스트는 일주일에 2회 제공되었으며, 나머지 5회 부스트는 매주 1회 제공되었다.

역가적정(Titer)에 의해 포획할 동물의 선별

인간 Shh에 대한 항체의 역가는 Shh 결합 분석을 통하여 결정되었다. 두 가지 방법이 이용되었다: 293T 세포에서 일시적으로 발현되는 Shh에 결합되는 항체는 유동 혈구계산을 이용하여 측정되었고, 고정된 바이오티닐화된 Shh에 결합되는 항체는 ELISA 포맷에서 평가되었다. 면역화 프로그램 종료시, 실시예 2에서 설명된 것과 같이, 마우스 골수종 세포와 면역주사를 맞은 마우스의 비장 및 림프절로부터 전기천공에 의해 분리된 림프구를 이용하여 융합을 실시하였다.

실시예 2

림프구 회수, B-세포 분리, 하이브리도마의 융합 및 생성

경추탈골을 통하여 면역화된 마우스를 죽이고, 각 무리로부터 배출되는 림프절을 수거하여, 모아두었다. 이 프로그램을 위하여 두차례 수거가 있었다. 수거(Harvest) 1은 ID 번호 159507, 159508, 159821, 159823, 163273, 및 163325의 마우스를 이용하였다. 수거(Harvest) 2는 ID 번호 159184, 159533, 159534, 159885, 163335, 및 163337의 마우스를 이용하였다.

조직으로부터 세포를 방출시키기 위하여 림프 세포는 DMEM에서 글라인딩하여 해리시켰고, DMEM에 세포들을 현탁시켰다. 세포를 카운트하였고, 1억개의 림프구당 0.9㎖ DMEM을 세포 펠렛에 첨가하여, 서서히 그러나 완전하게 세포를 현탁시켰다. 1억개 세포당 100 ㎕의 CD90+ 자성 비드를 이용하여, 15분간 4℃에서 세포를 항온처리하여 세포에 라벨시켰다. 최대 10⁸ 개의 양성 세포(또는 최대 2×10⁹ 개의 총세포)를 포함하는 자성으로 라벨링된 세포 현탁액을 LS+ 컬럼에 얹고, 컬럼을 DMEM으로 세척시켰다. 전체 용리액은 CD90- 음성 분획으로 수거되었다(이들 세포들의 대부분은 B 세포일 것으로 예상되었다).

6일 시점에 세척되고, 농축된(enriched)의 B 세포와 ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550)에서 구입한 비-분비성 골수종 P3X63Ag8.653을 1:4의 비율로 혼합하여 융합을 실시하였다. 세포 혼합물은 400 × g에서 4분간 원심분리에 의해 서서히 펠렛화되었다. 상청액을 따라낸 후, 1㎖ 피펫을 이용하여 세포를 서서히 혼합하였다. 미리 가열된 PEG (10⁶ 개의 B 세포당 1㎖)을 1분에 걸쳐 서서히 교반하면서 서서히 첨가하고, 1분간 혼합하였다. 미리가열된 IDMEM (10⁶ 개의 B 세포당 2㎖)을 서서히 교반시키면서 2분간에 걸쳐 첨가하였다. 최종적으로, 미리 가열된 IDMEM (10⁶ 개의 B 세포당 8 ㎖)는 3분에 걸쳐 첨가되었다.

융합된 세포들은 6분간 400 × g에서 스핀다운되었고, 10⁶ 개의 B 세포 당 20㎖의 선별 배지[DMEM (Invitrogen), 15 % 태아 송아지 혈청 (FBS) (Hyclone), L-글루타민, pen/strep, MEM 비-필수 아미노산, 피루베이트 나트륨, 2-멀캅토에탄올(모두 Invitrogen의 제품), HA-아자세린 하이포산틴 및 OPI (옥살로아세테이트, 피루베이트, 소의 인슐린) (둘다 Sigma의 제품) 및 IL-6 (Boehringer Mannheim)]로 현탁시켰다. 세포는 37℃에서 20-30분간 항온처리되었고, 그 다음 200㎖의 선별배지로 재현탁되었고, T175 플라스크에서 3-4일간 배양되었다.

융합후 3 일 시점에, 세포를 수거하였고, 400 × g에서 8분간 회전시켰고, 10⁶ 개의 융합된 B 세포 당 10㎖의 선별 배지에 재현탁시켰다. 하이브리도마 집단의 FACS 분석이 실행되었으며, 그 다음 세포는 냉동되었다.

선별 배지에서 통상적으로 하이브리도마를 배양시켰다. 항-인간 Shh 항체들을 잠재적으로 생산하는 하이브리도마로부터 수거된 모든 상청액은 그 다음 스크리닝 분석을 받았다.

실시예 3 : 항체 역가 측정: Shh 로 일시적으로 형질감염된 293T 세포의 고유한 항원 결합

실시예 1과 2에서 설명된 것과 같이 생산된 인간 Shh에 대한 항체의 역가를 측정하기 위하여 부모 293T 세포와 비교하여, 인간 Shh로 일시적으로 형질감염된 293T 세포에서 FACS 분석이 실행되었다. 형질감염된 세포 또는 부모 세포는 웰당 50,000 개 세포로 접종되었고, 4℃에서 1시간 동안 2 ㎕의 시료 (1: 50 희석)로 항온처리되었다. 그 다음 웰을 세척하고, Cy5-콘쥬게이트된 염소 항-인간 항체, 2 ㎍/㎖와 7-아미노-악티노마이신(7AAD), 5 ㎍/㎖과 함께 4℃에서 30분간 항온처리하였다. FACS 분석을 이용하여 결합된 Shh가 탐지되었다. 양성 대조군은 쥐 항-Shh 항체 (cat# MAB4641, R&D Systems, Inc.)이며, 음성 대조군은 naive XMG2 혈청 및 naive XMG4 (XM3C-1) 혈청을 포함한다. 표 2는 후속적인 하이브리도마 생성을 위하여 선별된 동물들의 혈청 분석에서 얻은 유동 혈구계산을 열거한 것이다.

[표 2]

일시적으로 형질감염된 293T 세포의 유동 혈구계산에 의해 측정된 인간 Shh에 대한 항체의 역가

실시예 4

항체 역가 측정: 고정된( IMMOBILIZED ) 바이오틴 - Shh 에 결합

고정된 바이오티닐화된 인간 Shh에의 결합에 대한 ELISA 분석을 이용하여, 실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같이 만들어진 항체의 역가를 측정하였다.

항체의 역가를 측정하기 위하여, 플레이트 (Costar 3368 96웰 배지 결합 플레이트)는 8 ㎍/㎖ 뉴트라바딘, 1× PBS, 0.05% 아지드로 1시간 동안 37℃에서 항온처리하여 뉴트라바딘으로 피복되었다. 플레이트는 실온에서 30분간 웰당 250 ㎕의 1% 우유/PBS 으로 차단되었다. 후속적으로, 웰당 50 ㎕의 500 ng/㎖ 바이오티닐화된 Shh/1× PBS, 1% 우유(wt/vol)를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 차단 완충액(1× PBS, 1% 우유)에서 1: 100의 희석으로 시작하여 항체들은 1:3으로 중복 적정되었고, 각 웰에 첨가되었다. 플레이트는 실온에서 1시간 동안 항온처리되었고, 후속적으로 1:1000 (염소 항-인간 IgG Fc POD; Jackson Laboratories)으로 희석된 제2 항체로 실온에서 1시간 동안 항온처리되었다. 플레이트는 세척후, One-step TMB 용액이 첨가되었고(웰당 50㎕), 실온에서 30분간 발달(develop)되도록 하였다. 발달 반응물은 동량의 1 N HCl으로 진정되었다. 흡수도는 450 nm로 측정하였다. 양성 대조군은 1 ㎍/㎖ (2차 항체들: 차례로 1:1250로 희석된 토끼-항-쥐(rat) IgG Fc POD 및 1:1000으로 희석된 토끼-항-염소 IgG Fc POD)로부터 1:3으로 적정된 염소-항-Shh (cat# AF464, R&D Systems) 및 쥐-항-Shh (cat # MAB4641, R&D Systems)이다. 음성 대조군은 naive XMG2 혈청 및 naive XMG4 (XM3C-1) 혈청을 포함하였다. 표 3은 결합된 항체들의 분석에서 얻은 ELISA 판독을 요약한 것이다. 상기 값들은 OD₄₅₀에서 측정값이 2가 되도록 하는 희석(dilution)을 계산한 것이다. 1:100 희석에서 OD<2를 나타내는 혈청의 경우, 1:100에서 수득된 OD가 제공된다.

[표 3]

ELISA 분석에 의해 측정된, 고정된 바이오티닐화된 Shh에 대한 항체의 역가

실시예 5

결합 분석을 이용한 하이브리도마 상청액 스크리닝

실시예 1 및 2에서 설명된 것과 같이, 항체를 포함하는 하이브리도마 상청액은 고정된 바이오티닐화된 Shh에의 결합을 측정하는 분석을 통하여 스크리닝되었다.

Shh 결합 활성에 대해 하이브리도마 상청액을 스크리닝하기 위하여, ELISA 포맷에서 고정된 바이오틴-Shh에 결합하는 항체는 실시예 4에서 설명된 것과 같이 실행되었다. 4℃에 하룻밤동안 뉴크라바딘 4 ㎍/㎖/1×PBS, 0.05% 아지드로 플레이트 (Costar 3702 배지 결합 384개 웰 플레이트)를 피복시켰다. 1% 우유/PBS로 차단후, 40 ㎕의 500 ng/㎖ 바이오티닐화된 Shh/1× PBS, 1% 우유 (wt/vol)를 각 웰에 첨가하였고, 1시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 웰당 40 ㎕의 1% 우유, 0.05% Tween-20/PBS에 하이브리도마 상청액 (10 ㎕/웰)을 첨가하였고, 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후 2차 항체 (100 ng/㎖ 염소-항-인간 IgG Fc HRP)로 항온처리하고, TMB 기질로 웰을 발달시킨 후, 그 다음 1 N HCl을 이용하여 진정시켰다. 표 4는 결합된 항체들의 분석에서 얻은 ELISA 판독을 요약한 것이다

[표 4]

ELISA 포멧에서 고정된 바이오티닐화된 Shh에 대한 하이브리도마 상청액내의 항체의 결합

FMAT (Fluorometric Microvolume Assay Technology)을 이용하여, 일시적으로 형질감염된 293T 세포의 표면에서 발현된 고유한 인간 Shh에 대한 결합 활성에 대해 하이브리도마 상청액을 스크리닝하였다. 293T세포의 일시적 형질감염은 1×10⁶ 개의 세포당 1 ㎍ 의 DNA, 1 ㎕의 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 실시되었다. 세포를 37℃, 5% CO₂에서 ㎖당 1×10⁶ 개의 세포로 밤새 유지시켰다. 웰당 17,500개의 형질감염되지 않은 부모 세포와 함께, 형질감염된 세포는 웰당 2500개 세포로 384개 웰 플레이트에 접종되었다. 각 웰(웰당 10 ㎕)에 상청액을 첨가하였고, 실온에서 1.5시간 동안 항온처리하였다. Cy5-라벨링된 2차 염소-항-인간 IgG Fc 항체를 각 웰 (웰당 10 ㎕)에 첨가하였고, 실온에서 3시간 동안 항온처리하였다. Applied Biosystems의 FMAT 8100 HTS 시스템상에서 플레이트를 판독하였다. 그 결과는 표 5에 나타낸다. 전체 신호 (FL1 × 카운트)는 웰에서 양성 세포의 수(카운트)에 양성 세포의 평균 형광 강도(FL1)를 곱한 것으로 정의된다.

[표 5]

인간 Shh-발현 293T 세포에 하이브리도마 상청액의 결합에 대한 FMAT 결과

끝으로, 배출 하이브리도마 상청액에서 고유한 Shh에 대한 항체의 결합은 유동 혈구계산을 이용하여 평가되었다. 실시예 5에서 설명된 것과 같이, 일시적으로 형질감염된 HEK 293T 세포의 표면에서 인간 Shh가 발현되었다. 형질감염된 세포 또는 부모 세포는 V-자 바닥 웰을 가진 플레이트(웰당 50,000개의 세포)에 접종되었다. 배출(Exhaust) 상청액 (1: 10 희석물 50 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 쥐-항-Shh MAB4641는 양성 대조군으로 이용되었다. 50 ㎕의 용적에 2 ㎍/㎖의 농도로 첨가되었다. 세포는 세척되었고, 2 ㎍/㎖의 2차 항체 50 ㎕의 용액 (Cy5-라벨링된 염소-항- 인간 IgG 또는 Cy5-라벨링된 염소-항-토끼 IgG)이 각 웰에 첨가되었다. 7AAD는 5 ㎍/㎖의 농도로 첨가되었고, 혼합물은 실온에서 30분간 항온처리되었다. 각 시료에 대한 평균 형광은 유동 혈구계산을 이용하여 측정되었다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.

[표 6]

배출 하이브리도마 상청액에서 세포 표면상에 발현된 Shh에 항-Shh 항체의 결합

실시예 6

항체-함유하는 상청액의 상대적 활성 측정

다양한 항체-함유 상청액의 상대적인 능력은 공-배양 검사 시스템에서 NIH 3T3 세포에서 발현된 Gli1 루시퍼라제의 유도를 얼마나 억제하는지를 측정함으로써 비교되었다. NIH 3T3 세포는 프로모터안에 루시퍼라제 전사 개시 부위의 상류 Gli1 결합 부위 앞부분의 다수 복사체를 포함하는 반딧불이 루시퍼라제 리포터 구조를 안정적으로 발현한다.

또한 비-특이적인 효과들을 표준화시키는데 이용되는 NIH 3T3-GH1 세포를 96 웰 플레이트에서 10% FBS와 페놀 레드 없이 웰당 6000개 세포로 도말하였고, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤동안 배양하였다. HEK 293T 세포를 pJP110 - 전장 인간 Shh를 위하여 pCR3.1-(cat # 12347019, Invitrogen) 포유류 발현 구조에 기초한-에 의해 일시적으로 형질감염시켰다. 세포들을 293 펙틴 지질 시약을 이용하여 10⁶ 개의 세포당 1 ㎍의 DNA로 형질감염시켰고, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤동안 흔들면서(rocking) 배양하였다. Shh-형질감염된 293T 세포들 (웰당 24,000개의 세포)은 37℃에서 2시간 동안 총 용적 100 ㎕의 배지에서 20% (vol/vol) 하이브리도마 상청액으로 사전 항온처리되었다. NIH 3T3-Gli1 세포로부터 배지를 제거하였고, 하이브리도마 상청액을 포함하는 배지에서 75 ㎕의 형질감염된 293T로 교환되었다. 37℃, 5% CO₂에서 세포들은 하룻밤동안 공동 배양되었다. 다음 날, 75 ㎕의 Dual-Glo 루시퍼라제 시약(cat # E2940, Promega)이 각 웰에 첨가되었고, 실온에서 10분간 항온처리되었다. Tecan 발광분석기상에서 500 msec 판독 시간을 이용하여 반딧불이 루시퍼라제 신호는 즉각 측정되었다. Dual-Glo Stop 용액(40 ㎕/웰)이 각 웰에 첨가되었고, 10분간 항온처리되었다. Tecan 발광분석기를 이용하여 500 msec 판독 시간으로부터 Renilla 루시퍼라제 신호가 수득되었다. 40가지 항-Shh 하이브리도마 상청액을 이용한 이중 실험 결과는 표 7에 나타낸다.

Gli1 리포터 활성을 자극시키기 위하여, Shh의 N-말단 신호생성 도메인인, 가용성 Shh-N을 포함하는 조건화 배지(CM)를 이용하여 유사한 리포터 분석에서 항-Shh 하이브리도마 상청액의 중화 활성도 역시 검사하였다.

CM 리포터 분석은 몇 가지 변형된 공-배양 리포터 분석으로써 동일한 프로토콜을 이용하여 실시되었다. Shh-함유된 조건화 배지(12.5% vol/vol)를 10% FBS를 포함하면서 레놀-레드가 없는 조건의 DMEM에서 하이브리도마 상청액 (20% vol/vol)과 함께 2시간 동안 37℃에서 선배양하였다. NIH 3T3-Gli1 세포(웰당 6000개 세포로 접종됨)는 75 ㎕의 Shh CM-상청액 믹스로 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤동안 처리되었다. 다음 날, 반딧불이 및 Renilla 루시퍼라제 활성은 상기에서 설명된 것과 같이 측정되었다. 이중 실험 결과는 표 7에 나타낸다.

[표 7]

하이브리도마 상청액은 NIH 3T3 세포에서 Gli1 리포터의 Shh-의존성 자극을 억제한다.

실시예 7

Gli1 리포터 분석에서 정제된 항체의 상대적 활성 측정

Gli1 리포터 분석에서 후보 항체들의 하이브리도마 서브클론으로부터 유도된 정제된 항체 물질 활성이 평가되었다. 이들 분석은 실시예 6에서 설명된 것과 같이 실행되었다. 정제된 항체들은 20 ㎍/㎖의 농도에서 출발하여 1: 5로 연속적으로 희석되었다. 공-배양된 형질감염된 293T 세포 또는 조건화 배지에 의해 공급된 Shh의 소스의 두 가지 분석 포맷에서 이중 실험 결과는 표 8에 제공된다. 20 ㎍/㎖에서만 유의적인 억제가 관찰되었고, 이 결과로써 이들 데이터만 제공한다.

[표 8]

정제된 서브클론-유도된 항체는 NIH 3T3 세포에서 Gli1 리포터의 Shh-의존적 자극을 억제한다.

실시예 8

Shh 항체들의 구조적 분석.

항체들의 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 이들의 DNA 서열을 결정하기 위해 서열화되었다. 항-Shh 항체의 완전한 서열 정보는 각각의 감마 및 카파 쇄 조합에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과 함께 서열 리스트로 제공된다. VH 패밀리, D-부분 서열 및 J-부분 서열을 결정하기 위하여 가변 중쇄 서열을 분석하였다. 그 다음, 체세포 과돌연변이를 분석하기 위하여, 1차 아미노산 서열이 결정되도록 서열들이 해독되었으며, 생식계열 VH, D 및 J-부분 서열들과 비교되었다.

아래 표 9는 항체 중쇄 부분을 이들의 동족 생식계 중쇄 부분과 비교하고, 항체 경쇄 부분을 이들의 동족 생식계 경쇄 부분과 비교한 표이다.

[표 9a]

[표 9b]

[표 9c]

면역글로불린 유전자들은 면역 반응이 성숙되는 동안 V, D 및 J 유전자 단편들의 재조합, 이소타입 전환(switching), 및 가변 부분에서 과돌연변이(hypermutation)를 포함하는 다양한 변형을 겪는다. 재조합 및 체세포 과돌연변이는 항체 다양성 및 친화력 성숙을 위한 기초가 되기도 하지만, 또한 이와 같은 면역글로불린을 치료제로 상업적으로 생산하는 것을 어렵게 만들거나 항체의 면역원성 위험을 증가시키게 만드는 서열 책임(liabilities)을 만들 수도 있다. 일반적으로, CDR 부분에서 돌연변이는 개선된 친화력 및 기능에 기여하는 것으로 보이며, 프레임워크 부분의 돌연변이는 면역원성 위험을 증가시킬 수 있을 것이다. 이와 같은 위험은 프레임워크 돌연변이를 생식계열로 되돌림으로써 감소될 수 있는데, 항체의 활성은 불리하게 영향을 받지 않는다. 일부 구조적 책임은 다양화(diversification) 프로세스에 의해 발생될 수도 있거나, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 기여하는 생식계열 서열내에 존재할 수도 있다. 소스에 무관하게, 산물의 불안정성, 응집, 이질성 또는 증가된 면역원성을 초래할 수도 있는 잠재적인 구조적 책임은 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게 못한 책임의 예를 들면, 쌍을 이루지 않는 시스테인(이황화 결합 스크램블링 또는 가변 설퍼하이드릴 부가 생성물의 형성을 유도할 수 있음), N-링크된 글리코실화 부위(구조 및 활성의 이형성을 초래), 뿐만 아니라 아미드기능기 제거(가령 NG, NS), 이성체화(DG), 산화(노출된 메티오닌), 및 가수분해 (DP) 부위를 포함한다.

면역원성 위험을 줄이고, 리드 항체들의 약리학적 성질을 개선시키기 위하여, 생식계열로부터 돌연변이 수를 감소시키거나 및/또는 구조적 책임을 제거시키는 것이 바람직할 수 있다.

따라서, 하나의 구체예에서, 특정 항체가 아미노산 수준에서 이의 생식계열 서열과 상이한 경우, 당해 항체 서열을 생식계열 서열로 되돌리는 돌연변이를 겪을 수 있다. 이와 같은 교정적 돌연변이는 표준 분자생물학적 기술을 이용하여, 돌연변이된 위치중 하나, 둘, 셋 이상의 위치 또는 임의의 복합 위치에서 일어날 수 있다. 비-제한적인 예를 들자면, mAb 3H8의 중쇄 서열 (서열 번호: 14)은 위치 31에서 T는 S 로 돌연변이(돌연변이 1), 위치 80에서 N은 Y로 돌연변이 또는 위치 108에서 P는 Y로의 돌연변이를 통하여, 이의 대응 생식계열 서열 (표 9)과 상이하다는 것을 표 12에서 볼 수 있다. 따라서, mAb 3H8의 중쇄를 인코드하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 생식계열 서열을 만들기 위해 돌연변이 1의 부위에서 돌연변이 1을 바꾸기 위하여 변형될 수 있다. 더욱이, mAb 3H8의 중쇄를 인코드하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 생식계열 서열을 만들기 위해 돌연변이 2의 위치에서 돌연변이 2를 바꾸기 위하여 변형될 수 있다. 더욱이, mAb 3H8의 중쇄를 인코드하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 생식계열 서열을 만들기 위해 돌연변이 3의 위치에서 돌연변이 3을 바꾸기 위하여 변형될 수 있다. 더하여, mAb 3H8의 중쇄를 인코드하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 돌연변이 1, 돌연변이 2 및 돌연변이 3 또는 2개 이상의 돌연변이의 복합에서 이들 위치에 생식계열 서열을 만들기 위해 변형될 수 있다. 아래 표 10-15는 mAb 6D7, 3H8, 및 1G1의 생식계열로부터 이와 같은 변이 부위를 설명하고 있다. 각 열은 굵게 표시된 부위에서 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합을 나타낸다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 이질성(heterogeneity)에 영향을 줄 수 있는 서열에 임의 구조적 책임을 대체하는 것을 포함한다. 이와 같은 책임은 글리코실화 부위, 쌍을 이루지 않은 시스테인, 표면 노출된 메티오닌 등을 포함한다. 이와 같은 이질성의 위험을 감소시키기 위하여, 하나 이상의 구조적 책임을 제거하도록 변화를 만드는 것이 제안된다.

한 구체예에서, 항체 생식계열 또는 항체 서열의 하나 이상의 보전(consensus) N-링크된 글리코실화 부위를 제거하는 것이 바람직할 수도 있다. 본 기술 분야의 당업자는 이와 같은 글리코실화 부위를 바로 확인할 수 있을 것이다. 전형적으로, N-링크된 글리코실화 보전 부위 서열은 Asn-any AA-Ser 또는 Thr의 서열을 가지는데, 이때 중간 아미노산은 프롤린(Pro)이 될 수 없다. 글리코실화 부위 생성의 예로는 6D7의 중쇄(서열 번호:46 잔기 번호 101-3에서)에서 NDS다. 이 실시예에서, 글리코실화 부위 NDS의 101 위치에서 N은 Q로 돌연변이되었다. 그러나, N은 필적되는 측쇄 성질을 가진 임의의 적합한 아미노산으로 돌연변이될 수도 있다. 글리코실화 부위 NDS에서 위치 103에서 S의 돌연변이는 Shh에 결합을 감소시켰다.

또 다른 실시예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인은 단독으로 대체되거나 다른 변화와 함께 대체될 수 있다. 쌍을 이루지 않은 시스테인은 항체 6D7의 경쇄 CDR1의 위치 33에서 일어난다. 이와 같은 쌍을 이루지 않은 시스테인은 세린과 같은 필적되는 측쇄 성질을 가진 적합한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인은 항체 1G1의 경쇄 CDR1의 위치 33에서 일어난다. 이와 같은 쌍을 이루지 않은 시스테인은 세린과 같은 필적되는 측쇄 성질을 가진 적합한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.

본원에 기술된 것과 같이, 최적화된 서열이란 하나 이상의 위치에서 돌연변이되어 이의 생식계열 서열로 되돌아간 서열 또는 하나 이상의 구조적 책임이 제거되도록 변형된 서열이다. 최적화된 서열은 하나 이상의 위치에서 돌연변이되어 이의 생식계열 서열로 되돌아간 서열과 하나 이상의 구조적 책임을 제거하기 위하여 추가 변형된 서열 또한 포함할 수 있다.

[표 10a]

지정된 잔기 번호에서 mAB 6D7 중쇄 (서열 번호: 46)의 생식계열로의 돌연변이 예시

[표 10b]

[표 10c]

[표 10d]

[표 10e]

[표 10f]

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 46을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 46은 표 10의 각 열에서 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 46은 표 10에 나타낸 것과 같이, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱, 임의의 여덟 또는 8개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 46은 표 10에 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비생식계열 잔기의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다. 그러나, 숙지해야 할 것은 위치 103에서 S가 Y 아미노산 잔기로 변형되면, Shh에 항체의 결합을 감소시키는 결과를 가져왔다는 것이다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH4-31, D4-17 및 JH2 도메인을 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 특정 생식계열 서열로 돌연변이된 6D7 가변 중쇄 도메인의 예는 6D7 VHOP (비-생식계열 서열에서 위치 46의 N은 G로 돌연변이되었고, 위치 85에서 T는 S로 돌연변이되어 최적화되었다)을 포함한다. 변형된 서열은 잠재적 글리코실화 부위 NDS를 제거하기 위하여 추가적으로 변형된/최적화되는데 - 위치 101에서 N은 Q로 돌연변이된다. 6D7의 최적화된 다양한 가변 중쇄 서열들은 표 16에 나타낸다. 더욱이 N30의 생식계열 S로의 변형은 효능의 상실을 가져왔다.

[표 11a]

지정된 잔기 번호에서 mAB 6D7 경쇄 (서열 번호: 48)의 생식계열로의 돌연변이 예시

[표 11b]

[표 11c]

[표 11d]

[표 11e]

[표 11f]

[표 11g]

[표 11h]

[표 11i]

[표 11j]

[표 11k]

[표 11l]

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 48을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 48은 표 11의 각 열에서 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 48은 표 11에 나타낸 것과 같이, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱, 임의의 여덟, 임의의 아홉 또는 9개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 48은 표 11에 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다. 특정 생식 계열 서열로 돌연변이된 6D7 가변 경쇄 도메인의 특정 예는 표 11에서 볼 수 있는 것과 같이, 6D7 VLOP2 (위치 77에서 A가 T로 돌연변이되어 최적화됨) 또는 6D7 VLOP3 (위치 77에서 비-생식계열 서열 F가 Y로 돌연변이되고, 위치 77에서 A가 T로 돌연변이되어 최적화됨)를 포함한다. 더욱이, 6D7 경쇄는 쌍을 이루지 않은 시스테인을 제거하기 위하여 추가 변형될 수 있다. 쌍을 이루지 않은 시스테인의 예는 항체 6D7의 경쇄 CDR1, 위치 33에 있다. 이와 같은 쌍을 이루지 않은 시스테인은 세린과 같은 필적되는 측쇄 성질을 가진 적합한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 6D7 VLOP2 및 6D7 VLOP3는 이와 같은 구조적 책임을 제거하기 위하여 더욱 최적화되었다.

[표 12]

지정된 잔기 번호에서 mAB 3H8 중쇄 (서열 번호: 14)의 생식계열로의 예시적인 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 14를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 14는 표 12의 각 열에서 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 14는 표 12에 나타낸 것과 같이, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 또는 3개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 14는 표 12에 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH3-33, D3-10 및 JH4 도메인을 가진 생식계 서열로부터 유도되며, 여기서, 하나 이상의 잔기는 이들 위치에서 대응하는 생식계열 잔기가 생성되도록 돌연변이되었다. 특정 생식계열 서열로 돌연변이된 3H8 가변 중쇄 도메인의 특정 예는 표 16에 나타낸 것과 같이, 3H8VL OP (위치 80에서 비-생식계열 서열 N은 Y로 돌연변이되어 최적화됨)을 포함한다.

[표 13]

지정된 잔기 번호에서 mAB 3H8 경쇄 (서열 번호: 16)가 생식계열로 복귀되는 예시적인 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 16을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 16은 표 13의 각 열에서 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 16는 표 13에 나타낸 것과 같이, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯 또는 5개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 16은 표 13에 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다. 특정 생식계열 서열로 돌연변이된 3H8 가변 중쇄 도메인의 특정 예는 표 16에 나타낸 것과 같이, 3H8 VLOP (위치 49에서 비-생식계열 서열 F는 Y로 돌연변이되어 최적화됨)을 포함한다.

[표 14]

지정된 잔기 번호에서 mAB 1G1 중쇄 (서열 번호: 22)의 생식계열로의 예시적인 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 22를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 22는 표 14의 각 열에서 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 22는 표 14에 나타낸 것과 같이, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 또는 3개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 22는 표 14에 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH3-21, D4-17 및 JH6 도메인을 가진 생식계 서열로부터 유도되며, 여기서, 하나 이상의 잔기는 이들 위치에서 대응하는 생식계열 잔기가 생성되도록 돌연변이되었다. RGD의 구조적 책임에서 G가 A로 돌연변이에 의한 변화로 활성은 제거되었다.

[표 15a]

지정된 잔기 번호에서 mAB 1G1 경쇄 (서열 번호: 24)의 생식계열로의 예시적인 돌연변이

[표 15b]

[표 15c]

[표 15d]

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 24를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 24는 표 15의 각 열에서 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 24는 표 15에 나타낸 것과 같이, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱 또는 7개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 24는 표 15에 나타낸 것과 같이, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 임의의 하나를 포함한다.

[표 16]

당업자는 CDR 경계를 한정하는 대안법이 있다는 것을 인지할 것이다. 표 1에서 VH CDR1의 시작 잔기는 Scaviner D, Barbie V, Ruiz M, Lefranc M-P. Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy , Kappa and Lambda and Joining Regions . Exp Clin Immunogenet 1999, 16:246-240.에서 설명한 것과 같은 방법에 따라 한정되었다. 표 9의 나머지 CDR 경계는 Kabat 정의에 따라 정의된다.

표 9에서 모든 CDR 경계는 Kabat 정의에 따라 한정된다.

실시예 9

Shh 항체에 대한 기능적 효능 측정

Shh가 C3H10T1/2 세포의 골형성을 유도하는 골아세포 분화 분석에서 정제된 Shh 항체들의 효능이 측정되었다.

C3H10T1/2 세포는 접종 배지(MEM, 10% FBS, 1% L-글루타민)에서 웰당 5000개 세포로 384개 웰 투명한 바닥 플레이트 (cat # 4336, Matrix)에 접종된 후, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양되었다. 분석(Assay) 배지에서 로그 ½로 증가(half log increments)시키면서 항체를 연속 희석시키고, Shh를 포함하는 10% (vol/vol) 조건화 배지 (CM) 동량과 복합시켰다. 37℃, 5% CO₂에서, 폴리프로필린 희석 플레이트에서 45분간 적정된 항체들은 Shh와 사전 항온처리되었다. 항체의 최종 농도 범위는 50 ㎍/㎖ 내지 20 ng/㎖이었다. Shh-함유 CM는 5% (vol/vol)의 최종 농도로 이용되었다. 5% CM에서 Shh의 N-말단 신호생성 도메인의 농도는 대략 10 nM인 것으로 측정되었다. 사전 항온처리 단계가 종료된 후, 모든 웰로부터 접종 배지를 제거하고, Shh 및 항체의 혼합물을 포함하는 30 ㎕의 배지로 교환하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 항온처리되었다.

골아세포 분화는 알칼린 포스포타제 생산으로 평가되었다. 세포는 얼음-냉각된 PBS로 2차례 세척되며, 연속하여 15 ㎕/웰의 RIPA 용해 및 추출 완충액(Lysis and Extraction Buffer) (cat # 89900, Pierce)으로 용해되었다. 플레이트를 20분간 -80℃에서 냉동시키고, 벤치 위에서 해동시켰다. 기질 용액 (1 mg/㎖ ρ-니트로페닐 포스페이트, cat# N2765, Sigma- Aldrich), 1 M 디에탄올아민 (cat# D8885, Sigma-Aldrich), 0.5mM MgCl₂, pH 9.8, 새로 만든 것임)을 각 웰에 첨가하였다(45 ㎕/웰). 플레이트는 37℃에서 최소 90분간 항온처리된 후, 405 nm에서 흡수도가 측정되었다. GraphPad Prism으로 데이터가 분석되었다. 용량-반응 곡선으로부터 IC₅₀ 값이 계산되었고, 표 17에 나타낸다.

[표 17]

정제된 항체에 의한 골아세포 분화 억제

Shh -처리된 C3H10T1 /2 세포에서 Gli1 및 Ptc1 mRNA 유도를 억제하는 정제된 항체의 능력을 측정하는 분석.

C3H10T1/2 세포는 웰당 10,000개의 세포로 접종 배지 (MEM, 0.5% FBS, 1% L-Glut)를 이용하여 96개 웰 플레이트 (200 ㎕/웰)에 접종되며, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤 동안 배양되었다. 항체들은 실시예 9에서 설명된 것과 같이 연속적으로 희석되고, 사전 항온처리되었다. 사전 항온처리가 완료된 후, 모든 웰로부터 접종 배지를 빼내고, Shh 및 항체를 포함하는 100 ㎕의 배지로 교환하였다. 37℃, 5% CO₂에서 72 시간 동안 세포가 배양되었다.

Cells to cT 키트 (cat# AM1728, ABI)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라, 정량적 RT-PCR (qRT-PCR)을 위해 RNA가 준비되었다. 간략하게 설명하면, 냉각 PBS로 세포를 헹구었다. DNase I를 첨가하여 용해 용액을 준비하였고, 웰당 50 ㎕의 용해 용액을 웰에 첨가하였고, 실온에서 5분간 항온처리하였다. 후속적으로, 각 웰에 5 ㎕의 중단 용액을 첨가하였고, 실온에서 2분간 항온처리하였다. 플레이트는 -80℃에 보관하였다. 10 ㎕의 세포용해물, 25 ㎕ 2× 역전사효소 (RT) 완충액, 및 2.5㎕ 2OX RT 효소 혼합액(Enzyme Mix)를 이용하여 시료 당 최종 용적이 40 ㎕ 되도록 cDNA가 준비되었다. RT 반응은 37℃에서 60분간 실시되었고, 5분간 반응물을 95℃에서 항온처리함으로써 반응은 종료되었다. 시료는 -80℃에서 하룻밤동안 보관되었다.

HPRT1에 대하여 마우스 Gli1 및 Ptc1의 양을 측정하기 위하여 정량적 PCR 반응이 실시되었다. 다음의 ABI TaqMan 프라이머/프로브 세트가 이용되었다: 마우스 Gli1, Mm00494654_ml; 마우스 Ptc1, Mm00436026_ml; 및 마우스 HPRT1, Mm00446968_ml. 10 ㎕의 Universal 2×PCR Master Mix, l㎕의 2O× 프로브/프라이머 믹스, 및 5 ㎕의 cDNA 주형을 최종 용적이 20 ㎕이 되도록 복합하여 열 사이클 반응이 준비되었다. 시료를 2분간 50℃로 가열하였고, 이어서 10분간 95℃로 가열하였다. ABI 7900HT Fast Real-time PCR 시스템에서 95℃에서 15초간, 60℃에서 1분간의 사이클링(Cycling)을 40회 실시하였다. 내부 대조군으로 마우스 HPRT1를 이용하여 각 시료에서 델타 델타 Ct 값을 계산함으로써, 각 시료에서 마우스 Gli1 및 Ptc1 RNA의 양이 측정되었다(표 18).

[표 18]

정제된 항체에 의한 C3H10T1/2 세포에서 내인성 Gli1 및 Ptc1 mRNA의 억제

실시예 10

인간 Shh 에 정제된 Shh 항체들의 결합

ELISA-계 방법을 이용하여 재조합 인간 Shh에 정제된 항체의 결합이 측정되었다. Shh의 N-말달 신호생성 도메인인, Shh-N은 두 가지 형태: 지질 변형이 부족한 세균으로부터 분리된 정제된 단백질로써, N-말단 팔미토일 변형을 포함하지만, C-말단 콜레스테롤 모이어티가 없는 형태의 조건화 배지의 구성으로써 제공되었다.

플레이트 (검정색 프레임, 흰색 웰, B & W IsoPlate 단백질 결합 고친화성 폴리스트렌 ELISA 플레이트, cat#6005580, PerkinElmer)에 PBS 또는 PBS로 희석된 3% (vol/vol) Shh 조건화 배지(CM) 100 ㎕/웰을 이용하여 재조합 인간 Shh (재조합 인간 소닉 헤지혹 C24II 아미노 말단 펩티드, cat# 1845-SH-025/CF, R&D Systems) 1.5 ㎍/㎖ (100 ㎕/웰)을 피복시켰다. 플레이트는 밀봉되고, 5℃에서 쉐이크상에 하룻밤 동안 두었다. 다음 날, PBS+0.05% Tween 20 (PBS-T)으로 플레이트를 4회 세척하였다. 실온에서 1시간 동안 PBS로 희석시킨, 1% 필수적으로 글로불린이 없는 BSA (Sigma- Aldrich cat# 3156)을 이용하여 플레이트를 차단시켰다. PBS-T를 이용하여 플레이트를 4차례 세척하였다. 정제된 항체 (30 ㎍/㎖의 출발 농도로 최소한 6로그에 걸쳐 하프 로그 연속 희석)의 적정은 100 ㎕ PBS-T에서 만들었고, 각 웰에 첨가한 후, 4℃에서 쉐이킹하면서 하룻밤동안 항온처리하였다. 항체 대조군은 인간 IgG2 및 IgG4 (차례로 Sigma-Aldrich, Cat. #15404 및 #14639)를 포함한다. PBS-T를 이용하여 플레이트를 4회 세척하였다. PBS-T에서 1: 50,000로 희석된 염소-항- 인간 IgG H+L (KPL cat# 074-1006) 100 ㎕가 각 웰에 첨가되었고, 한 시간 동안 쉐이킹하면서 플레이트를 항온처리하였다. PBS-T로 세척한 후, 실온에서 화학적발광 퍼옥시다제 기질(Sigma cat# CPS-2-60)을 첨가하였고, 포일로 플레이트를 덮고 10분간 항온처리하였다. 각 웰은 Spectromax 5e에서 100msec 동안 판독되어 RLU가 측정되었다. GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 각 항체의 겉보기 결합 활성(K_D)이 계산되었고, 표 19에 나타낸다.

[표 19]

ELISA에서 고정된 Shh에 대한 정제된 항체들의 겉보기(Apparent) 결합 친화력

실시예 11

Shh 의 N-말단 신호 생성 도메인에 대한 정제된 항체들의 결합 친화력 측정

인간 IgG2 불변 도메인 배경에서 발현된 4가지 정제된 재조합 항체들의 결합 친화력은 고해상도 Biacore에 의해 측정되었다. 모든 실험은 Biacore T100 장치를 이용하여 23℃에서 실시되었다. 각 재조합 IgG2 항체 (6D7, 3H8, 1G1, 및 1H8)는 1OmM 아세테이트 나트륨 pH 4.0 (GE Healthcare, BR-1003- 49)에 20 ㎍/㎖의 농도로 희석되었다. 모든 mAbs는 통상의 아민 결합 화학을 이용하여, CM5 바이오센서 칩에 공유적으로 결합되어 있다. 각 항체에서 고정 수준은 177-838 RU이다. 탈기(degassing)후 여과된 원액에 BSA를 최종 농도가 100 ㎍/㎖ 되도록 첨가하여 HBS-P 러닝(running) 완충액(GE Healthcare, BR-1003-68, 0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 0.005% P-20)이 준비되었다. Shh-함유 조건화 배지(CM)를 이용한 실험에서, 1.5 mL 분취량을 13,200 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 모든 Shh 조건화 배지 시료 및 재조합 인간 Shh C24II (R&D Systems, Cat # 1845- SH/CF, Lot # MJC09)는 HBS-P 러닝 완충액으로 희석되었다. 이중 참고를 위하여 산재된 몇 가지 완충 주입 사이클로 3회 Shh 시료를 무작위로 주입하였다. Scrubber를 이용하여 모든 센서그램(sensorgram) 데이터를 프로세스하였고, CLAMP을 이용하여 1:1 상호작용 모델(대량 수송을 위한 용어 k_m 포함)에 피트하였다. 조건화 배지 및 러닝 완충액 사이에 유의적인 대량 굴절율로 인하여 mAb 1H8에 대한 상부 조건화 배지 농도의 센서그램에 대량 굴절율 인자(bulk refractive index factor)를 피트(fit)시킬 필요가 있다. 생성된 결합 상수는 표 20에 나타낸다.

표 20에서 *는 역동학이 완전하게 신뢰할 수 없다는 것을 나타내는데, 그 이유는 이들 mAb에 대한 반응이 거의 방산 제어된 융합율(diffusion controlled association rates)로 인하여 대량 운반이 극단적으로 제한되기 때문이다. 그러나, 결과적인 평형 해리 상수(K_D= k_d*k_m/k_a*k_m)는 신뢰성이 있는데, 그 이유는 임의의 대량 운반이 측정된 역동학에서 신뢰성있는 K_D 를 계산하기 위해 몫을 취할 때 임의의 대량 운반 효과, k_m 은 상쇠되기 때문이다. 또한, mAb 6D7에 Shh의 결합(모두 CM 및 C24II 펩티드 형태)에서 센서그램의 어느 정도의 복합성을 보여주었고, 따라서, 측정된 K_D 는 오로지 추정으로만 간주되어야 한다.

[표 20]

고해상도 Biacore으로 측정된 Shh에 정제된 항체들의 결합 친화력.

실시예 12

세포 표면에 발현된 전장의 Shh 에 대한 정제된 항체들의 결합 친화력 측정

안정적인 HEK 293 세포 집단의 표면상에서 비정상적 위치 부위에서 발현된 전장의 Shh에 대한 정제된 항체들의 결합 친화력은 유동 혈구계산을 이용하여 측정되었다. HEK 293-Shh-FL 세포는 항체의 최종 농도 범위가 20 nM 내지 80 pM이 되도록 PBS에서 하이브리도마-유도된 항체의 다양한 희석물과 혼합되었다. 폴리프로필렌 미량적정 플레이트에서 300 ㎕의 최종 용적으로 웰당 대략 74,000개의 세포 수준으로 세포와 항체가 혼합되었다. 플레이트는 4℃에서 5시간 동안 쉐이킹하면서 항온처리되었다. 얼음-냉각된 PBS로 세척된 후, 225 ㎕의 99 nM Cy5 염소 α-인간 다클론 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, cat#109- 175-008)가 3H8 및 6D7에 결합된 세포에 첨가되었다. 4℃에서 20분간 플레이트를 흔들었다. FACS Canto II HTS 유동 혈구계산 장비를 이용하여 각 시료에서 10,000회의 평균 형광이 기록되었다. K_D를 예측하기 위하여, 항체 농도의 함수로써 평균 형광 플롯은 Scientist 3.0 소프트웨어를 이용하여 비-선형적으로 피트되었다. 표 21에 결과를 나타낸다.

[표 21]

HEK293 세포의 표면에서 안정적으로 발현된 Shh에 대한 정제된 항체들의 결합 친화력/접착력(Avidity)

인간 IgG2 불변 부분으로 구성된 정제된 재조합 항체들의 결합 친화력은 상기에서 설명된 방법에 따라 유동 혈구 계산을 이용하여, CAOV3 난소암 세포의 안정적인 클론의 표면상에 발현된 전장의 Shh에 대해 측정되었다. 300 ㎕의 최종 용적의 PBS에서 다양하게 희석된 항체와 세포가 혼합되었고, 웰당 84,000개의 세포 농도에서 항온처리되었다. 플레이트는 4℃에서 5시간 동안 쉐이킹하면서 항온처리되었다. 얼음-냉각된 PBS로 세척한 후, 인간 항-Shh 항체가 결합된 세포들은 상기에서 설명된 바와 같이, Cy5 염소 α-인간 2차 항체로 착색되었다. K_D를 예측하기 위하여, 항체 농도의 함수로써 평균 형광 플롯은 Scientist 3.0 소프트웨어를 이용하여 비-선형적으로 피트되었다. 표 22에 결과를 나타낸다.

[표 22]

CAOV3 세포의 표면에서 안정적으로 발현된 Shh에 대한 정제된 항체들의 결합 친화력/접착력

실시예 13

경쟁 결합 분석을 이용하여 정제된 Shh 항체에 대한 에피토프 저장소( bin )의 규명

재조합 인간 Shh-N에 대한 바이오티닐화된, 정제된 항체들의 결합은 ELISA-근거한 방법(기본적으로 실시예 10에서 설명된 것과 같은)을 이용하여 라벨링되지 않은 과량의 경쟁 항체 존재하에서 측정되었다.

항체들 6D7 및 3H8는 제조업자의 지시에 따라 Pierce EZ-Link NHS PEG4-바이오틴 키트 (Cat# 21329)를 이용하여 바이오티닐화되었다. 간략하게 설명하면, 500 ㎍ 분취량의 각 항체는 Zeba Desalt Spin Column을 이용하여 BupH 인산염 완충된 염(Pierce cat# 28372)으로 완충액-교환되었다. 20mM 원액을 준비하기 위하여 극순수 물(170 ㎕)을 이용하여 2 mg의 NHS PEG4-바이오틴을 용해하였다. IgG 분자당 3-5개 바이오틴 분자를 가지도록 항체를 라벨시키기 위한 IgG 및 바이오틴의 적정양은 제조업자의 추천에 근거하여 계산되었다. IgG 및 바이오틴은 혼합되어, 2시간동안 얼음위에서 항온처리되었고, 반응안된 NHS PEG4-바이오틴은 Zeba Desalt Column으로 제거되었다. 바이오티닐화된 IgG의 첨가 후에 HABA/Avidin 용액에서 500nm에서 흡수도 변화를 측정하고, 제조업자의 지시에 따라 계산함으로써, 라벨링 효과가 측정되었다.

플레이트 (검정 프레임, 흰색 웰 B & W IsoPlate 고도의 단백질 결합 친화력 폴리스티렌 ELISA 플레이트, cat#6005580, PerkinElmer)는 PBS로 희석된 3% (vol/vol) Shh 조건화배지(CM)를 웰당 100 ㎕을 이용하여 5℃에서 하룻밤동안 항온처리함으로써 피복시켰다. PBS-T를 이용하여 플레이트를 4회 세척하였고, 5℃에서 5시간 동안 1% BSA/PBS-T으로 차단하였다.

각 바이오티닐화된 항체의 10배 희석물을 6 로그 농도 범위(3 ㎍/㎖ 내지 1 pg/㎖)에서 만들었고, 바이오티닐화된 항체의 각 희석물의 결합은 라벨링되지 않은 과량의 경쟁 항체 존부하에 Shh-결합 ELISA에서 측정되었다. 경쟁 항체에 대해 측정된 K_D이상의 다양한 농도에서 각 라벨 안된 경쟁 항체들이 포함되었다. 각 경쟁 항체의 K_D +1, K_D + 2, K_D + 4, K_D + 8, 및 K_D + 16의 농도를 각 바이오티닐화된 항체의 다양한 희석물과 혼합시켰다. 라벨링되지 않은 경쟁 항체 존부하에 바이오티닐화된 항체의 희석물을 100 ㎕의 PBS-T 최종 용적에 첨가하였고, 차단후, PBS-T를 이용하여 플레이트를 세척한 후, 5℃에서 쉐이킹하면서 플레이트를 항온처리하였다. 다음날, 200 ㎕의 PBS-T를 이용하여 플레이트를 4차례 세척하였다. 스트렙타아비딘-HRP (R&D Systems cat# DY998 lot 1157772)은 PBS-T에서 1:400 으로 희석하였고, 각 웰에 100 ㎕을 첨가한 후, 쉐이킹하면서 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. PBS-T로 세척한 후, 화학적발광 과산화효소 기질(Sigma CPS-2-60)을 첨가한 후, 포일로 플레이트를 덮고 10분간 실온에서 항온처리하였다. RLU를 측정하기 위하여 Spectromax 5e에서 100msec 동안 각 웰을 판독하였다.

x-축(바이오티닐화된 항체의 농도)을 따라 각 라벨링된 항체의 결합 곡선이 우측으로 전치되면, 그 라벨링된 항체의 겉보기 K_D 가 증가되는 것으로 경쟁이 설명되었다. 교차-경쟁을 보이는 항체들은 공통의 에피토프 저장소(bin)를 점유하는 것으로 밝혀졌다.

예상과 같이, 라벨링되지 않은 6D7은 바이오티닐화된 6D7의 결합에 성공적으로 경쟁하였다. 농도가 증가된 과량의 3H8은 바이오티닐화된 3H8의 결합 곡선을 점진적으로 우측으로 전치시켜, 라벨링되지 않은 3H8의 최대 농도에서 라벨링된 6D7에 대한 겉보기 K_D 가 5배 증가되었다. 1G1 또는 1H8 어느 것도 6D7의 결합에 임의의 효과를 가지지 못하였다. 라벨링된 3H8의 결합은 과량의 라벨링되지 않은 3H8과 경쟁하였다. 과량의 라벨링되지 않은 6D7는 바이오티닐화된 3H8의 결합과 효과적으로 경쟁하여, 라벨링되지 않은 6D7의 의 최대 농도에서 겉보기 K_D 가 9배 증가되었다. 1G1 또는 1H8 어느 것도 고정된 Shh에 결합하는 것에 대해 라벨링된 3H8과 경쟁하지 못하였다. 이들 결과는 6D7과 3H8이 1G1 또는 1H8가 공유하지 않는 공통의 오버랩되는 에피토프를 공유한다는 것을 나타낸다.

실시예 14

인간 Ihh 및 DHH 및 마우스 Shh / Ihh 에 대한 정제된 Shh 항체의 교차-반응성

인간 헤지혹 패밀리 멤버들 Ihh 및 Dhh 및 마우스 Shh, Ihh, 및 Dhh의 마우스의 진화론적 유사유전자(orthologs)에 대해 정제된 항체들의 교차-반응성을 테스트하였다. 인간 및 마우스 Ihh는 N-말단 신호발생 도메인에서 100% 서열 상동성을 공유하고, 따라서, 항체 결합을 평가하는데 오로지 한 개의 단백질이 이용되었다.

교차-반응성 실험은 ELISA 기반 분석(실시예 10에서 설명된 것과 같이)을 이용하여 실행되고, 측정되었다. 간단하게 설명하면, 1-2 ㎍/㎖ 재조합 인간 Ihh (재조합 인간/마우스 Indian 헤지혹 C28II, 아미노 말단 펩티드, cat# 1705-HH/CF, R&D Systems), 인간 Dhh (재조합 인간 Desert 헤지혹 C23II, 아미노 말단 펩티드, cat# 4777-HH, R&D Systems) 또는 마우스 Shh (재조합 마우스 소닉 헤지혹 C25II, N-말단, cat# 464-SH/CF, R&D Systems)를 포함하는 100 ㎕의 PBS 용액으로 플레이트를 피복하고, 4℃에서 쉐이킹하면서 하룻밤동안 항온처리하였다. PBS-T로 세척하고, 1% BSA으로 차단한 후, PBS-T에서 하프 로그 연속 희석에 의해 준비된 30 ㎍/㎖ 내지 1 pg/㎖ 농도의 항체 적정을 웰에 첨가하고, 4℃에서 쉐이킹하면서 하룻밤동안 항온처리하였다. 표 23은 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 겉보기 결합 친화력 (K_D)를 계산하여 얻은 결과를 제공한다.

[표 23]

ELISA 근거한 포맷에서 고정된 마우스 Shh 및 인간 헤지혹 패밀리 멤버들에 대한 정제된 항체들의 교차-반응성

마우스 Shh 및 Ihh에 대한 정제된, 서열-최적화된 항체 6D7OP 및 3H8OP 항체의 교차 반응성은 고해상도 Biacore을 이용하여 확증되었다. 최적화된 형태의 6D7OP 및 3H8OP의 인간 Shh에 대한 결합이 이들 실험에서 확인되었다. 표준 아민 링키지 화학을 이용하여 단백질 G를 CM5 칩 표면에 결합시켰다. 단백질 G'는 Dulbecco PBS 평형된 PD-1O 컬럼을 이용하여 트리스(Tris)가 없었다. 주요 2.75-3.94 mL 분획(fraction) (~0.78 mg/㎖)이 수거되었고, 한 방울은 10 mM 아세테이트 완충액 pH 3.65에서 20 ㎍/㎖으로 희석되었다. 단백질 G의 약 500 RU가 유동 쳄버 2 (Fc2)의 표면에 공유적으로 결합되었다. 각 사이클의 시작 시에, HBS-P 완충액을 이용하여 0.5 ㎍/㎖으로 희석된 관련 IgG (6D7OP 또는 3H8OP)는 50초간 5 ㎕/min의 속도로 , 단백질 G'위를 유동하였고, 이어서 60초의 안정화 기간이 있었다. 고정 수준은 사이클간에 재현가능하였다. 친화력 측정(6D7의 경우 100RU, 3H8의 경우 135 RU)에 있어서, 대량 운반 효과를 회피하기 위하여 IgG 고정화 수준은 낮게 유지되었다. 임의의 잠재적인 대량 운반 효과를 최소화시키기 위하여, 분석물은 30초간 50 ㎕/min의 높은 유속으로 주입되고, 해리는 1200초간 모니터되었고, 그 다음 표면은 30 ㎕/min의 유속에서 글리신 pH 1.75이 40초간 두 차례 펄스로 재생되었다. 모든 센서그람은 Langmuir 1:1 모델, RI=O, global kon, global koff 및 global Rmax settings (데이타는 이중 참조되었으며, 따라서, 대량의 RI 굴절율 변화는 없었다)을 이용하여 T-100 평가 소프트웨어에서 피트되었다.

정제된 항체들의 인간 Shh에 대한 결합 친화력 (표 24)은 서열 최적화 전 의 6D7 및 3H8을 이용한 기존의 관찰과 거의 동일하였다(표 20과 비교). 더욱이, 마우스 Shh에 대한 각 서열-최적화된 항체의 결합 친화력은 인간 Shh에서 관찰된 것과 거의 동일하였고, 이는 N-말단 신호생성 도메인에서 두 개 단백질 사이에 하나의 아미노산 차이에 근거하여 예상되었다.

[표 24]

고해상도 Biacore를 이용하여 측정된 인간 및 마우스 Shh 및 Ihh에 대한 서열 최적화된 정제된 항체들의 결합 친화력

실시예 15

정제된 Shh 항체들에 의한 Ihh 활성의 중화

이 분석은 Indian 헤지혹에 의해 유도된 C3H10T1/2 세포의 골아세포 분화를 억제하는 정제된 항체의 능력을 측정하기 위하여 실행되었다.

정제된 항체 6D7OP는 ELISA 및 Biacore 포맷 모두에서 인간 및 마우스 Indian 헤지혹 (Ihh)에 결합하는 것으로 나타났다. 골아세포 분화 분석에서 이들 항체의 중화 활성이 평가되었다.

골아세포 분화 분석은 약간의 변형이 있지만, 기본적으로 실시예 9에서 설명된 것과 같이 실행되었다. C3H10T1/2 세포는 접종 배지에서 웰당 5000개의 세포로 384개 웰의 투명 바닥 플레이트에 접종되었고, 37℃, 5% CO₂에서 하룻밤동안 배양되었다. 항체들은 분석 배지에서 하프 로그 또는 2배 증강으로 연속 희석되었고, 동량의 Ihh의 N-말단 신호생성 도메인의 변형된(위치 28의 시스테인은 두 개의 이소루이신 잔기로 대체됨) 형태(Ihh-N C28II, R&D Systems, cat# 1705-20 HH)와 복합되었다. 분석에 이용된 Ihh-N C28II의 최종 농도는 2 ㎍/㎖이었다. 적정된 항체들은 폴리프로필렌 희석 플레이트에서 37℃, 5% CO₂에서 45분간 Ihh-N C28II과 함께 사전 항온처리되었다. 항체들의 최종 농도 범위는 25 ㎍/㎖ 내지 30 ng/㎖이다. 사전 항온처리 단계가 종료된 후, 접종 배지는 모든 웰로부터 제거되었고, Ihh 및 항체의 혼합물을 포함하는 배지 30㎕로 대체되었다. 세포는 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 항온처리되었다.

골아세포 분화는 상기에서 설명된 것과 같이 알칼리 포스파타제 생산으로 평가되었다. GraphPad Prism을 이용하여 데이터 분석이 실행되었으며, IC₅₀ 값은 표 25에 제시한다. 6D7OP는 Ihh에 의해 유도된 골아세포 분화를 억제하였는데, 이는 항체가 리간드에 결합하여 생물학적 활성의 중화를 초래하였고, Ihh에 결합하지 않는 3H8OP는 이 활성에 영향을 주지 않았다는 것을 말한다.

[표 25]

C3H10T1/2 세포 골형성 분석에서 6D7OP는 Ihh 활성을 중화하지만, 3H8OP는 중화하지 못함

실시예 16

정제된 항체들의 생체내 활성 측정: COLO205 이종이식편 종양의 기질에서 마우스 Gli1 및 Ptc1 의 약력학 조정의 평가

Colo205 인간 결장 선암 세포는 ATCC으로부터 구하였고, RPMI 1640, 10% FBS 및 1% L-글루타민에 유지하였다. 마우스당 4 × 10⁶ 세포의 피하 이식편을 우측 옆구리에 이식후 암컷 누드 마우스에서 이종이식편 종양이 확립되었다. 종양은 약 200 ㎣으로 성장하였고, 이때 마우스는 비이클 또는 항체 1, 3, 또는 10 mg/kg의 단일 복막 투약량을 제공받았다. 투약후 3일 뒤 마우스를 죽이고, 종양을 잘라내었다. 수거된 종양을 잘게 부수고, 4℃의 5 ㎖ RNALater에 바로 보관하였다. 후속적으로 보존된 종양은 RNA 분리가 있을 때까지 -20℃에 보관하였다.

RNeasy 키트 (cat# 74104, Qiagen)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 종양으로부터 RNA를 추출하였다. 종양 덩어리는 Fast Prep 24 균질화 기구를 이용하여 40초간 세팅 6.0에서 균질화되었다. 실온에서 5분간 4000 RCF에서 원심분리시켜 찌꺼기를 펠렛화하였다. 동량의 70% 에탄올이 상청액에 첨가되었고, 혼합물은 RNeasy 컬럼에 첨가되었다. 컬럼은 4 ㎖의 완충액 RW1으로 평형화되었고, 2 ㎖ 완충액 RPE으로 2차례 평형화되었다. RNA는 270 ㎕ RNase-없는 물로 용리되었고, -80℃에 보관되었다. Agilent RNA 6000 Nano 키트 (Cat #5067-1511)를 이용하여 RNA 양과 질이 평가되었다.

정량적 RT-PCR을 이용하여 마우스 HPRT1에 대해 종양에서 마우스 Gli1 및 Ptc1의 수준은 측정되었다. High Capacity cDNA 역 전사 키트 (cat# 4368814, ABI)를 이용하여 2 ㎍ 의 RNA로부터 cDNA가 합성되었다. 반응은 15분간 25℃에서, 2시간 동안 37℃에서, 5분간 85℃에서 항온처리되었고, 그 다음 4℃에서 유지되었다. cDNA 시료는 RNase-없는 물로 200 ㎕의 용적으로 희석되었다. qRT-PCR을 위한 반응 혼합물은 20 ㎕의 최종 용적에 각 시료의 cDNA 5 ㎕, 1 ㎕의 각 프라이머/프로브 세트, 및 10 ㎕의 2× TaqMan 완충액(ABI cat# 4369514)을 포함한다. ABI 프라이머/프로브 세트는 뮤린 HPRT 기준 유전자 (Mm00446968_ml), 뮤린 Gli1 (Mm00494654_ml), 및 뮤린 Ptc1 (Mm00436026_ml)을 포함하였다. 시료는 2분간 50℃로 가열되었고, 그 다음 10분간 95℃로 가열되었다. ABI 7900HT Fast Real-time PCR 시스템상에서 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간의 사이클링이 40회 실시되었다. 각 시료에서 마우스 Gli1 및 Ptc1 RNA의 양은 내부 대조군으로 HPRT1을 이용하여 각 시료에 대한 델타 델타 Ct 값을 계산함으로써 측정되었다.

테스트된 최저 약량(1 mg/kg)에서도 마우스 Gli1 및 Ptc1의 수준의 유의적인 감소가 관찰되었는데(도 1) 이는 각 항체의 강력한 중화 활성을 나타낸다. 각 항체는 일관되게 mPtc1 보다는 mGli1의 수준을 더 크게 감소시켰다.

실시예 17

COLO205 이종이식편 모델을 이용하여 정제된 항체들에 대한 약동학- 약력학 상관 관계의 측정

Colo205 종양은 실시예 14에서 설명된 것과 같이 암컷 누드 마우스에서 확립되었다. 종양이 크기가 대략 200㎣에 도달하였을 때, 마우스에게 6D7, 3H8, 또는 1G1의 0.5 또는 1.0 mg/kg의 단일 IP 약량이 제공되었다. 다섯 마리 마우스 그룹은 투약후 다양한 시간대(0.5 시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 7일 및 14 일)에 희생되었다. 심장 천자를 통하여 혈청을 수거하였고, 500-800의 혈액은 혈청-분리기 Microtainer 튜브(BD catalog #365956)로 옮겨졌다. 혈액 시료는 실온에서 20-30분간 응고되도록 두었으며, 그 다음 10분간 13000 rpm에서 원심분리시켰다. 전체 혈청 양을 1.7 ㎖ Eppendorf 튜브에 수거하였고, 주사된 테스트 항체의 농도를 측정하기 위한 추가 프로세스 전까지 -80℃에서 보관하였다. 희생된 동물로부터 종양 조직을 잘라내었고, RNA 분리가 있을 때 까지 상기에서 설명된 것과 같이 RNALater에 보관하였다.

항-인간 HC + LC 캡쳐 및 항-인간 HC + LC 탐지를 이용하여 전체 인간 IgG를 측량하는 정량화된 ELISA 프로토콜을 이용하여 인간 항체의 혈청 농도가 측정되었다. ELISA 플레이트는 0.5 ㎍/㎖ 염소 항-인간 IgG (Fc 특이적)로 2-8℃에서 하룻밤동안 피복시키고, PBS, 0.05% Tween 20로 세척시킨 후, 실온에서 I-차단 완충액 (Tropix)으로 1-2시간 동안 차단시켰다. mAb 기준 표준, 품질 기준(QC) 및 테스트 시료 희석액은 10% 혈청 (분석 매트릭스)에서 준비되어, 실온에서 2시간 동안 차단된 플레이트에 첨가되었다. 상기에서 설명된 것과 같이 플레이트를 세척하였고, 실온에서 추가 1시간동안 HRP-염소 항-인간 IgG Fc의 1:20000 희석액으로 항온처리하였다. 결합안된 탐지 항체는 세척을 통하여 제거되었고, 100 ㎕의 TMB 기질을 5분간 플레이트 웰에 첨가하였다. 색깔 발생은 50 ㎕의 2M H₂SO₄를 첨가하여 중단시켰다. 플레이트는 SpectraMax Plus 384 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 이용하여 450nm에서 15분이내에 판독되었다. 각 플레이트 상의 QC, 테스트 시료 희석액에서 항체 농도는 그 플레이트에 대한 기준 표준 곡선을 이용하여 정량화되었다. 분석 범위는 100% 혈청에서 31 - 4000 ng/㎖이었다. 약동학 (PK) 분석은 WinNonLin (version 5.2, Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 이용하여 실행되었다. 각 항체에 대해 측정된 PK 매개 변수들은 표 26에 나타낸다. 각 항체는 투약후 24시간 시점에서 mGli1 및 mPtc1 수준이 80-90%로 최대 감소를 나타내었다(도 2). 72 시간을 통하여 유사한 억제 수준이 유지되었다. 그러나, 각 항체의 투약 7일 이내에 mGli1 및 Ptc 1 수준이 다시 반등하기 시작하였다.

[표 26]

누드 마우스에서 6D7, 3H8, 및 1G1 의 PK 파라미터

실시예 18

쥐에서 서열-최적화된 정제된 항체들의 약동학 측정

쥐에서 6D7OP 및 3H8OP의 약동학 분석이 또한 실시되었다. 1mg/kg, 10mg/kg, 30 mg/kg의 6D7OP 또는 1mg/kg, 10mg/kg, 28 mg/kg의 3H8OP 단일 정맥 투약량을 Hans Wistar 쥐에게 투여하였다. 다음 시간대에 임의의 항-응고제없이 꼬리 정맥을 통하여 시료 혈액을 채혈하였다: 0 시간, 및 투약후 1시간, 4시간, 8시간 및 24 시간, 2일, 4일, 7일, 10일, 15일, 21일 및 28 일. 혈액 시료를 회전시키고, 혈청 100 ㎕을 분취하여 냉동시켰다. 상기에서 설명된 총 인간 IgG를 측정한 ELISA 방법을 이용하여 mAb의 혈청 농도를 측정하였다. WinNonlin Professional (version 5.2, Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 이용하여 개별 동물의 혈청 농도 데이터에서 모델비의존형분석(Noncompartmental analysis)을 실시하였고, 약동학 데이터의 요약을 표 27에 제공한다.

[표 27]

쥐에서 3H8OP 및 6D7OP에 대한 약동학 매개변수

6D7OP의 PK는 쥐에서 약량에 대해 비선형적으로 나타난다. 1 mg/kg 약량 수준에서 38.552 mL/kg/d으로부터 10 mg/kg 약량 수준에서 10.049 mL/kg/d으로 증가시키면 CL은 감소되었다. 3H8OP의 비선형성(nonlinearity)은 6D7OP와 같이 명백하지는 않았다. 10 mg/kg 또는 그 이상의 약량 군에서, 6D7OP 및 3H8OP의CL은 쥐에서 인간 IgG에 대한 예측된 범위내에 있었다. 쥐에서 3H8OP의 말단-상 반감기는 10mg/kg 및 28 mg/kg 군에서 차례로 약 12일과 13일이다. 쥐에서 6D7OP의 말단-상 반감기는 10mg/kg 및 30 mg/kg 군에서 차례로 약 9일과 10일이다.

실시예 19

정제된 항체의 종양 성장 억제는 다양한 이종이식편 종양 모델의 마우스 기질 세포에서 헤지혹 표적 유전자들의 약력학 조정과 일치한다.

(i) HT -29 결장 암종 이종이식편 모델을 이용하여 생체내 항-종양 활성의 설명

HT-29 결장 종양 세포는 ATCC로부터 구하였고, 37℃, 5% CO₂에서 10% 태아 송아지 혈청 및 1% L-글루타민을 함유하는 McCoy 5a 배지에서 유지시켰다. 이들 세포들은 테스트되었고, 골수종 및 바이러스 감염이 없는 것으로 확인되었다. 100 ㎕의 태아 송아지 혈청-없는 McCoy's 5a 배지에 마우스당 3 × 10⁶개의 세포의 피하 이식편을 6-7 주령의 NCr 누드 암컷 마우스(Taconic, Hudson, NY) 우측 옆구리에 이식후 HT-29 이종이식편 종양이 확립되었다. 종양이 대략 100㎣으로 자라면, 투약을 시작하기 전에 종양 크기에 기초하여 무작위로 골랐다. 항체들은 복막 운반을 통하여 4주간 2주에 한번씩 10 mg/kg으로 0.9% 염으로 투약되었다. 일주일에 두차례 칼리퍼를 이용하여 다음의 식에 따라 종양 용적이 모니터되었다: 0.5× (길이) × (폭)². one-tail t-test를 이용하여 연구 종료시점에 평균 종양 용적에 대한 통계학적 분석을 실시하였다. 3H8으로 처리하면 비이클 처리와 비교하였을 때, HT-29 이종이식편 종양의 성장이 55% (P<0.05) 억제되었다(도 3).

최종 투약후 3일 시점에서 연구 종료시 절제된 종양에서 3H8의 약력학 효과가 평가되었다. 수거된 종양을 양분하여 4℃ 하룻밤동안 바로 5 ㎖ RNALater에 보관하거나 또는 액화 질소에서 빠르게 냉동하였다. RNALater에 보관된 종양은 RNA 분리가 있을 때까지 -20℃에 저장하였다. 마우스 HPRT1에 비교하여 마우스 Gli1, Gli2, Gli3, Ptc1, Ptc2, Hhip, 및 Smo의 수준은 실시예 9에서 설명된 것과 같이 정량적 RT-PCR를 이용하여 측정되었다. 다음의 ABI TaqMan 프라이머/프로브 세트가 이용되었다: 마우스 Gli1, Mm00494654_ml; 마우스 Gli2, MmO1293117_ml; 마우스 Gli3, Mm00492333_ml; 마우스 Ptc1, Mm00436026_ml; 마우스 Ptc2, Mm00436047_ml; 마우스 Hhip, Mm01241503_ml; 마우스 Smoothened, Mm01162705_ml; 및 마우스 HPRT1, Mm00446968_ml. 3H8 으로 처리하면, 마우스 GUI, Ptc1, 및 Ptc2의 수준이 대략 50% 감소되었다(도 3b).

( ii ) 원발성 결장 암종 외식편 모델 HCXF -001을 이용한 생체내 항-종양 활성의 설명.

66세의 카프카스지방의 남성에서 외과적으로 제거된 약 1g의 원발성 암종을 Asterand (Detroit, MI)로부터 구하여, SCID 마우스에 이식하여 원발성 외식편 이종이식편 모델을 만들었다. 원발성 종양을 10% FBS, 100 IU/㎖ 페니실린, 0.1 mg/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지를 이용하여 세척하고, 외과용메스로 잘게 자른다. 잘게 썬 종양 시료는 이식때까지 얼음위에 둔다. 잘게 썬 종양을 13-게이지 암 이식 투관침에 얹고, 투관침을 4마리 마우스의 우측 옆구리 피하에 삽입시켜 복부 지방 층아래 투관침의 내용물을 분할 투여하는 방식으로 이식시켰다. 종양(계대 0, P0로 정의됨)이 800-1000㎣에 도달하면, 이를 잘라내어, 대략 3×3×3 mm 단편으로 절단하였다. 단일 PO 종양 단편들을 개별 마우스에 하위-계대시켰다. 계대 2이상(P2)으로 실시된 종양으로 효과 연구가 실시되었다.

개별 SCID 생쥐에 단일 종양 단편을 피하로 이식하였고, 평균 종양 용적이 대략 100-200㎣에 도달될 때 항-Shh 항체를 이용한 치료가 시작되었다. 치료가 일단 개시된 후 4주간 2주에 한번씩 0.9% 염으로 10 mg/kg의 항체를 IP로 투여하였다. 일주일에 두차례 칼리퍼를 이용하여 다음의 식에 따라 종양 용적을 모니터하였고, one-tail t-test를 이용하여 연구 종료시 각 처리 군에서 종양의 기하학적 평균에서 통계학적 분석을 실시하였다. 각 군에서 종양을 가지지 않은 동물은 제거되었다. 기준 IgG1 mAb으로 처리된 동물에서 종양 성장과 비교하였을 때, 특히 단일 물질로 6D7OP 또는 3H8OP으로 처리된 경우에 종양 성장이 적당히 억제되었음이 관찰되었다(도 4a). IgG1 기준과 비교하여 6D7OP 또는 3H8OP으로 처리된 경우 종양 크기가 48-59% 감소되었다. (P < 0.05).

항-Shh 항체들의 약력학 효과는 상기에서 설명된 것과 같이 최종 투약후 3일 시점에 수거된 종양에서 평가되었다. mHPRT1와 비교하여, 기질 헤지혹 표적 유전자들 (mGli1, mGli2, mG1i3, mPtc1, mPtc2, 및 mHhip)의 수준은 실시예 19에서 설명된 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 이용하여, 실시예 9에서 설명된 정량적 RT-PCR을 이용하여 측정되었다. 6D7OP는 mGli1의 수준을 급격히 감소(>80%)시켰지만; 3H8OP으로 처리한 경우 mGli1 수준이 50%의 적절한 감소를 초래하였다. 이들 두 항체를 사용한 경우 mGli2, mPtc1, 및 Ptc2가 가장 적절하게 억제되었음이 관찰되었다.

( iii ) HT -55 결장 이종이식편 모델에서 생체내 항-종양 활성의 설명.

HT-55 결장 암종 세포는 European Collection of Cell Cultures (ECACC)로부터 구하였고, 37℃, 5% CO₂에서, EMEM (EBSS), 2 mM 글루타민, 1% 비-필수 아미노산 (NEAA), 및 20% 태아 송아지 혈청 (FBS)에 유지시켰다. 이들 세포들은 테스트되었고, 골수종 및 바이러스 감염(MAP)이 없는 것으로 확인되었다. 상기에서 설명된 것과 기본적으로 동일하게, 100 ㎕의 태아 송아지 혈청-없는 EMEM 배지에 마우스당 5×10⁶개의 세포의 피하 이식편을 6-7 주령의 누드 암컷 마우스의 우측 옆구리에 이식후 이종이식편 종양이 확립되었다. 종양이 대략 100㎣으로 자라면, 투약을 시작하기 전에 무작위로 골랐다. 항체들은 3.5주간 2주에 한번씩 10 mg/kg으로 0.9% 염으로 IP을 통하여 투약되었다. 일주일에 두 차례 칼리퍼를 이용하여 다음의 식에 따라 종양 용적이 모니터되었고, one-tail t-test를 이용하여 연구 종료시점에 각 처리군에서 평균 종양 용적에 대한 통계학적 분석이 실시되었다. 6D7OP로 처리하면 비이클 처리와 비교하였을 때, 32% 이종이식편 성장이 억제되었으며, IgG1 기준과 비교하였을 때 52%(P<0.05) 억제되었으며(도 5), 3H8OP는 HT-55 종양 생장에 거의 효과가 없었다.

참조에 의한 본원으로의 통합

특허, 특허 출원, 논문, 교과서 및 이와 유사한 것을 포함한 모든 참고자료 및 상기 본원에서 언급된 자료는 이의 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다.

균등성

상기 기재된 내용은 본 발명을 당업자가 충분히 실시할 정도로 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 바람직한 본 발명의 구체예들은 상세하게 설명하며, 발명자들에 의해 고려되는 최적의 방식을 설명한다. 그러나, 전술한 설명이 내용에 얼마나 상세하게 나타나는 것과는 상관없이, 본 발명은 다양한 방식으로 실행될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 이의 균등성에 따라 해석되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca <120> TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO SONIC HEDGEHOG HOMOLOG AND USES THEREOF <130> 103525 <150> 61/098697 <151> 2008-09-19 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgtacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtct attactgtgc gagagatctc 300 tattactatg gttcggggag cccctttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Tyr Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu 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Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 69 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 73 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Thr Asn Trp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 74 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 76 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 77 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 79 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Val Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 81 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Val Val Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 82 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 83 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

Claims (38)

1. BIAcore로 120pM 미만의 K_D로 인간 Shh에 결합;
   Shh에 의해 유도된 세포의 골아세포 분화의 억제;
   colo205 이종이식편 종양에서 마우스 Gli1 mRNA의 수준이 80% 초과로 감소;
   colo205 이종이식편 종양에서 마우스 Patched-1 mRNA의 수준이 70% 초과로 감소; 또는
   Desert 헤지혹에 결합을 나타내지 않음의 특성들 중 하나 이상의 특성을 나타내며,
   소닉 헤지혹 호모로그(sonic Hedgehog Homolog)(Shh)에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 포유류에서 종양 성장 및/또는 전이를 억제하는, 분리된 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 100pM 미만의 K_D로 Shh에 결합하는, 분리된 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가, 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP, 6D7OP2 또는 이의 임의의 최적화된 형태인 분리된 항체.
5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체 1G12인, 분리된 항체.
6. 제4항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체 3H8인, 분리된 항체.
7. 제4항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체 6D7인, 분리된 항체.
8. 제4항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체 6D7OP인, 분리된 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 46의 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열 번호: 46은 표 10의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합 중 임의의 하나를 포함하는, 분리된 항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 48의 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열 번호: 48은 표 11의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합 중 임의의 하나를 포함하는, 분리된 항체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 14의 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열 번호: 14는 표 12의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합 중 임의의 하나를 포함하는, 분리된 항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 16의 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열 번호: 16은 표 13의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합 중 임의의 하나를 포함하는, 분리된 항체.
13. Shh에 결합하는 것에 대해 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP 또는 이의 최적화된 형태 중 어느 하나와 경쟁하는 완전한 인간 단클론 항체.
14. 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP 또는 이의 최적화된 형태 중 어느 하나와 Shh 상 동일한 에피토프에 결합하는 완전한 인간 단클론 항체.
15. a) 표 9에 나타낸 CDR3 서열;
    b) 표 9에 나타낸 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열 중 임의의 하나;
    c) 표 9에 나타낸 가변 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 또는
    d) 표 9에 나타낸 가변 중쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 항체.
16. (a) 서열 번호: 50의 VH CHR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 50의 VH CDR1;
    (b) 서열 번호: 50의 VH CHR2과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 50의 VH CDR2;
    (c) 서열 번호: 50의 VH CHR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 50의 VH CDR3;
    (d) 서열 번호: 54의 VL CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 54의 VL CDR1;
    (e) 서열 번호: 54의 VL CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 54의 VL CDR2; 및
    (f) 서열 번호: 54의 VL CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 54의 VL CDR3을 포함하고, Shh에 면역특이적으로 결합하는 항체.
17. 제16항에 있어서, 상기 항체가,
    (a) 서열 번호: 50의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
    (b) 서열 번호: 54의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 분리된 항체.
18. (a) 서열 번호: 14의 VH CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 14의 VH CDR1;
    (b) 서열 번호: 14의 VH CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 14의 VH CDR2;
    (c) 서열 번호: 14의 VH CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 14의 VH CDR3;
    (d) 서열 번호: 16의 VL CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 16의 VL CDR1;
    (e) 서열 번호: 16의 VL CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 16의 VL CDR2; 및
    (f) 서열 번호: 16의 VL CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 16의 VL CDR3을 포함하고, Shh에 면역특이적으로 결합하는, 항체:
19. 제18항에 있어서, 상기 항체가,
    (a) 서열 번호: 14의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
    (b) 서열 번호: 16의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 분리된 항체.
20. (a) 서열 번호: 22의 VH CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 22의 VH CDR1;
    (b) 서열 번호: 22의 VH CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 22의 VH CDR2;
    (c) 서열 번호: 22의 VH CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 22의 VH CDR3;
    (d) 서열 번호: 24의 VL CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 24의 VL CDR1;
    (e) 서열 번호: 24의 VL CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 24의 VL CDR2; 및
    (f) 서열 번호: 24의 VL CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 24의 VL CDR3를 포함하고, Shh에 면역특이적으로 결합하는, 항체.
21. 제20항에 있어서, 상기 항체가,
    (a) 서열 번호: 22의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
    (b) 서열 번호: 24의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 분리된 항체.
22. Shh에 면역특이적으로 결합하며, 서열 번호: 22의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 24의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
23. Shh에 면역특이적으로 결합하며, 서열 번호: 50의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 54의 아미노산과 90% 이상의 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체의 결합 단편인, 분리된 항체.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 완전한 인간 단클론 항체인, 분리된 항체.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 dAb 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 분리된 항체.
27. ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9505로 기탁된 Mab6D7VL으로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열;
    ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9506으로 기탁된 Mab6D7VH로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열; 또는
    ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9506으로 기탁된 Mab6D7VH로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9505로 기탁된 Mab6D7VL으로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열 중에서 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
28. ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9504로 기탁된 Mab6D7VHOP로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열;
    ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9503으로 기탁된 Mab6D7VLOP로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열; 또는
    ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9504로 기탁된 Mab6D7VHOP로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9503으로 기탁된 Mab6D7VLOP로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
29. ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9507로 기탁된 Mab1G1VH로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열;
    ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9509로 기탁된 Mab1G1VL로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열; 또는
    ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9507로 기탁된 Mab1G1VH로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 중쇄 CDR을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9509로 기탁된 Mab1G1VL로 지정된 플라스미드의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
30. 표적화된 물질 또는 제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 포함하는 조성물.
31. 제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
32. 제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 인코드하는 핵산 분자.
33. 악성 종양 치료를 요하는 동물을 선별하는 단계;
    제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 따른 항체의 치료요법적 유효량을 선별된 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 악성 종양을 치료하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 동물이 인간인, 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 항체가 완전한 인간 단클론 항체 1A12, 1G12, 1H10, 3H8, 4B6, 1G1, 1F4, 1H8, 1H12, 1C8, 1A5, 6D7, 6D7OP 또는 이의 임의의 최적화된 형태로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
36. 제33항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 악성 종양이, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성 및 표피암으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
37. 악성 종양을 치료하기 위한 제30항에 따른 조성물의 용도.
38. 제37항에 있어서, 상기 악성 종양이, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성 및 표피암으로 구성된 군에서 선택되는, 용도.

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