KR100870486B1

KR100870486B1 - 게놈 디엔에이 시료의 서열 콘택스트 5'-씨피쥐-3'에서 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법

Info

Publication number: KR100870486B1
Application number: KR1020037003149A
Authority: KR
Inventors: 알렉산다 올렉; 크리스티안 피펜브로크; 쿠르트 베를린; 다위드 규티흐
Original assignee: 에피제노믹스 아게
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-09-01
Publication date: 2008-12-11
Also published as: EA007028B1; DK1423528T3; US20110136687A1; US20040234960A1; CA2420840A1; WO2002018632A2; JP2004516821A; MXPA03001834A; EP1942197A1; EP1423528B1; WO2002018632A3; AU1218802A; AU2002212188B2; US9719131B2; IL154663A0; DE50113454D1; EP1423528A2; IS6705A; KR20040015705A; NZ524229A

Abstract

발명은 게놈 DNA 시료에 있어서 염기서열 5'-CpG-3'의 메틸화 도수를 검출하는 방법에 관하여 서술하였다. 첫 단계에서는 게놈 DNA를 화학적으로 처리하여 시토신 염기가 우라실로 변하게 되며, 5-메틸시토신은 변치 않는다. 특정의 시토신이 포함된 게놈 DNA의 단편은 증폭된다. 증폭된 생성물에는 검출될 수 있는 표지가 주어지며 다음 단계에서는 증폭된 생성물의 표지 검출에 의하여 두 종류의 올리고뉴클레오티드의 증폭된 생성물의 중합된 범위가 측정되어진다. 중합된 결과로 인하여 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 표지비율이 게놈 DNA에서 상기한 특정 시토신의 메틸화 범위이다.

게놈, DNA, 시토신, 메틸화, 우라실

Description

게놈 디엔에이 시료의 서열 콘택스트 5'-씨피쥐-3'에서 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법{METHOD FOR DETERMINING THE DEGREE OF METHYLATION OF DEFINED CYTOSINES IN GENOMIC DNA IN THE SEQUENCE CONTEXT 5'-CpG-3'}

본 발명은 게놈 DNA 시료 중 염기 서열 상태 5'-CpG-3' 에서 특정 시토신의 메틸화 정도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

지난 수년간 분자생물학 분야에서 방법론의 발전으로 말미암아 유심히 연구 관찰되어진 점은 유전자 자체, 유전자에서 RNA로의 전사, 이들에서 단백질로의 번역으로 설명할 수 있다. 어떤 개체의 발달 과정에서, 특정 세포 및 조직내에서 어떤 유전자가 개시되고, 특정 유전자가 활성되고 저해되는가 하는 것은 유전자 내지 게놈의 메틸화된 범위와 특성과 유의적 상관관계가 있다. 이러한 관점에서 병적 상태는 개별적인 유전자에서 혹은 게놈에서 발생된 메틸화 형태로 나타난다.

본 발명에서는 어떤 주어진 DNA 시료에 존재하는 많은 시토신 염기들을 5번 위치의 메틸기의 존재 유무에 대해 혼성화에 의하여 동시에 연구할 수 있는 방법을 제시한다. 나아가 상기 방법을 질병 존재 또는 어떤 질병을 발생할 소인의 진단에 사용하기에 유용한 핵산, 올리고뉴클레오티드, PNA-올리고머를 개시한다.

5-메틸시토신은 진핵세포의 DNA에서 가장 빈번하게 공유결합적으로 개질되는 염기이다. 예를 들면 전사의 조절, 유전적 각인작용 및 종양 발생에 있어서 주요한 역할을 한다. 그러므로 유전정보의 구성요소로서 5-메틸시토신의 동정적 확인은 대단히 중요한 의의가 있다. 그러나 5-메틸시토신의 위치는 시퀀싱에 의하여 동정 될 수 없는데, 5-메틸시토신이 시토신과 동일한 염기쌍 형성 행동을 갖기 때문이다. 또한, PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭에서, 5-메틸시토신이 보유하던 후생유전학적 정보는 완전히 소실된다.

CpG 아일랜드의 메틸화는 자주 전사 불활성과 밀접하게 관련된다. 비록 CpG 아일랜드가 유전자 프로모터에서 발견된다는 증거가 있지만 모든 CpG 아일랜드 및 메틸화된 부위가 알려진 프로모터에 위치하고 있는 것은 아니다. 다양한 조직-특이적 유전자 및 각인 유전자에서, CpG 아일랜드는 전사 출발점에서 하부로 상당히 원거리에 떨어져 위치하고 있다. 뿐만 아니라 대부분의 유전자는 복수의 프로모터들을 갖고 있다. 수많은 질병에서 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화가 발병의 원인임을 입증되었다. DNA-메틸화는 전형적인 돌연변이와는 달리 유전자의 코딩 기능을 변경시키지 않고 염기가 치환되는 메커니즘을 갖는다. 이러한 후생유전학적 변이와 전형적인 돌연변이 사이의 상호작용은 종양발생에 있어 중요한 역할을 한다. 예를 들면 병소의 과다 메틸화와 일반적인 유전적 탈메틸화는 여러 상이한 종양 형태에서 특징적으로 나타난다. 종양의 발생과 종양의 진행은 한편으로는 과다 메틸화로 유도된 돌연변이 현상이고 다른 한편으로 세포 증식을 조절하는 유전자의 작용 중지 및/또는 정상적으로는 태아 발달 단계에서만 사용되는 유전자의 탈메틸화를 통한 재활성화 유도가 원인이 된다.

부모로부터 유전되는 비 다수배체(non-polyposis)의 직장암인 경우, 예를 들면 대부분의 돌연변이 음성 대장암인 경우에 있어서는 hMLH1 프로모터의 과다 메틸화와 이에 따른 hMLH1의 미발현 및 복구유전자가 잘못된 염기쌍을 형성하기 때문으로 그 원인을 설명할 수 있다(Bevilacgua RA, Simpson AJ. Methylation of the hMLH1 promoter but no hMLH1 mutations in sporadic gastric arcinomas with high-level microsatellite isstability. Int J Cancer. 2000 Jul 15;87(2):200-3). 폐암의 병리에 있어서, 발현의 상실과 RAS 효과 동족체의 프로모터 서열내 CpG아일랜드의 메틸화는 서로 유의적 상관관계가 있다(Dammann R,Li C, Yoon JH, Chin PL, Bates S, Pfeifer GP, Nucleotide. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus3p21.3. Nat Genet. 2000 Jul;25(3):315-9). 프로모터의 과다 메틸화를 포함하여 LKB1 종양억제 유전자들의 후생유전학적 불활성화는 Peutz-Jegher 증후군에 수반된다(Esteller M, Avizienyte E, Corn PG, Lothe RA, Baylin SB, Aaltonen LA, Herman JG, Epigenetic inactivation of LKB1 in primary tumors ssociated with the Peutz-Jeghers sydrome. oncogene. 2000 Jan 6:19 (1):164-8).

메틸화가 수반되는 대부분의 질병은 그 병인 중에 암 억제 유전자 p16 혹은 p15과 밀접한 연관이 있다. 균상식육종과 p16(INK4a)유전자의 과다 메틸화와의 관련이 추측된다(Navas IC, Ortis-Romero PL, Villuendas R, Martinez P, Garcia C, Gomez E, Rodriquez JL, Garcia D, Vanaclocha F, Iglesias L, Piris MA, Algara P, p16(INK4a) gene alterations are frequent in lesions of mycosis fugoides. Am J Pathol. 2000 May;156(5):1565-72). 또한 위암에서 p16 유전자의 전사 중지와 소수의 특정 CpG 위치의 새로운 메틸화는 강한 상관관계를 가지고 있다(Song SH, Jong HS, Choi HH, Kang SH, Ryu MH, Kim NK, Kim WH, Bang YJ, Methylation of specific CpG sitees in the promoter region could significantly down-regulate p16(INK4a) expression in gastric adenocarcinoma. Int. J. Cancer 2000 Jul 15;87(2):236-40). 원발성 경화성 담관염을 수반하는 담관 종양의 병리는 p16 암 억제 유전자의 불활성과 관련되며, 이는 다시 p16 프로모터의 메틸화에 의한 것으로 파악되었다(Ahrendt SA, Eisenberger CF, Yip L, Rashid A, Chow Jt, Pitt RA, Sidransky D, Chro- mosome 9p21 loss and p16 inactivation in primary sclerosing cholangitis associated cholangiocarcinoma. J. Surg Res. 1999 Jun 1;84(1):88-93). 과다 메틸화에 의한 유전자 p16의 불활성은 백혈병 및 급성 림프모구백혈병의 발생에 역할한다(Nakamura M, Sugita K, Inukai T, Goi K, Iijima K, Tezuka T, Kojika S, Shiraishi K, Miyamoto N, Karakida N,Kagami K, O-Koyama T Mori T, Nakazawa S, p16/MTS1/INK4A gene is frequently inactivated by hypermethylation in childhood acute lymphoblastic leukemia with 11q23 translocation. Leukemia. 1999 Jun;13(6):884-90). 한걸음 더 나아가서 유전자 p16과 유전자 p15 부위의 과다 메틸화는 복합 골수암 발생에 결정적인 역할을 한다(Ng MH, Wong IH, Lo KW, DNA methylation changes and multiple myeloma. Leuk Lymphoma. 1999 Aug;34(5-6):463-72). 메틸화로 인하여 불활성화된 VHL유전자는 신장암의 소인으로 보인다(Glavac D, Ravnik Glavac M, Ovcak Z, Masera A, Genetic changes in the origin and development of renal cell carcinoma(RCC). pflugers Arch. 1966;431(6 Suppl 2):R193-4). 5'-CpG 아일랜드의 비정상적 메틸화가 유전자 p16 전사를 불활성화함으로써 비강인두암에 관련되어 있다(Lo KW, Cheung ST, Leung SF, van Hasselt A, Tsang YS, Mak KF, Chung YF, Woo JK, Lee JC, Lee JC, Huang DP, Hypermethylation of the p16 gene in nasopharyngeal carcinoma cancer Res. 1996 Jun 15;56(12):2721-5). 간세포 종양에서는 p16 단백질의 불활성이 입증되었다. 프로모터의 과다 메틸화와 동종체 이탈이 가장 주요한 메카니즘이라 할 수 있다(Jin M, Piao Z, Kim NG, Park JH, Jung HJ, Kim CG, Kim H, p16 is a major inactivation target in hepatocellular carcinoma. cancer. 2000 jul 1;89(1):60-8). 유전자 발현을 조절하는 DNA-메틸화는 유방암의 BRCA1 유전자에서 검출되었다(Magdinier F, Billard LM, Wittmann G, Frappart L, Benchai M, Lenoir GM, Guerin JK, Dante Regional methylation of the 5` end CpG island of BRCA1 is associated with reduced gene expression in human somatic cells FASEB J. 200 Aug;14(11):1585-94). 메틸화와 비호즈킨 림프종과 역시 상관관계가 추정된다 (Martinez-Delgado B, Richart A, Garcia MJ, Robledo M, Osorio A, Cebrian A, Rivas C, Benitez J, Hypermethylation of p16ink4b genes as a marker of disease in the follow-up of non-Hodgkin's lymphomas. Br J Haematol. 2000 Apr; 109(1): 97-103). CpG-메틸화는 cdkn2A 유전자 발현 감소와 관계되는 T세포 백혈병을 유발한다(Nosaka K, Maeda M, Taiya S, Sakai T, Mitsuoka M, Increasing methylation of the CDKN2A gene is associated with the progress of adult T-cell leukemia. cancer Res. 2000 Feb 15;60(4):1043-8). 방광암인 경우 CpG 아일랜드에서 메틸화가 증가됨을 확인할 수 있다(Salem C, Liang G, Tsai YC, Coulter J, Knowles MA, Feng AC, Groshen S, Nichols PW, Jones PA, Progressive increases in de novo methylation of CpG islands in bladder cancer. Cancer Res. 2000 May 1;60(9):2473-6). 식도 평판 상피 종양에 의한 전사불활성화는 질병의 진행에 수반되는 FHIT 유전자의 메틸화와 관련된다(Shimada Y et al. cancer 2000 Jul 1;89(1):5-11). 중성 엔도펩티다제 24.11(NEP)는 안드로겐-비의존성 전립선암의 성장에 관련된 뉴로 펩티드의 증가를 불활성화한다. NEP-프로모터의 과다 메틸화에 의한 NEP 발현 소실은 뉴로펩티드-자극된, 안드로겐-비의존성 전립선암을 진전시킬 수 있다(Usmani BA, Shen R, Janeczko M, Papandreouu CN, Lee WH, Nelson WG, Nelson JB, Nanus DM, Methylation of the neutral endopeptidase gene promoter in human prostate cancers. Clin Cancer Res. 2000 May;6(5): 1664-70). 성인의 부신피질 종양은 종양 DNA에서 구조적 이상을 나타낸다. 상기 구조적 이상은 이 부위에서의 DNA의 탈메틸화와 함께 IGF2 유전자의 과잉 발현을 포함한다(Wilkin F, Gagne N, Paquette J, Oligny LL, Deal C, Pediatric adrenocortyical tumord: molecular events leading to insulin-like growth factor II gene overexpression. J Clin Endocrinol Metab. 2000 May;85(5):2048-56. review). 망막모세포종에서 다수 엑손에서의 DNA-메틸화가 상기 질병을 일으키는 것으로 추정된다(Mancini D, Sin호 S, Ainsworth P, Rodenhiser D, Constitutively methylated CpG dinucleotides as mutation hot spots in the retinoblastomagene(RB1). Am J Hum Genet. 1997 Jul;61(1):80-7). 만성 골수종 백혈병에서 질병의 진전에 따른 메틸화 패턴의 변화와 p53 유전자의 조절불능과의 관련성이 추정되고 있다(Guinn BA, Mills KI, p53 mutation, methylation and genomic instability in the progression of chronic myeloid leukaemia. Leuk Lymphoma. 1997 Jul;26(3-4):211-26). 이와 동일하게 급성 골수종 백혈병은 메틸화와 관계가 있음을 입증하였다(Melki JR, Vincent PC, Clark SJ. Concurrent DNA hypermethylation of multiple genes inacute myeloid leukemia. Cancer Res. 1999 Aug 1;59(15):3730-40). 빌름스 종양 억제유전자내 종양 특이적 메틸화 부위가 동정되었다(Kleymenova EV, Yuan X, LaBate ME, Walker CL, Identification of a tumor-specific methylation site in the Wilm tumor suppressor gene. oncogene. 1998 Feb 12;16(6):713-20). 버키드 림프종에서 일부 프로모터들은 CpG가 완전히 메틸화되었다(Tao. Q, Robertson KD, Manna A, Hildeheim A, Ambinder RF, Epstein-Barr virus(EBV) in endemic Burkitt's lymphoma: molecular analysis of primary tumor tissue. Blood. 1998 Feb 15;91(4):1373-81). DNA-메틸화는 갑상선 종양에서도 일정 역할을 하는 것으로 추정된다(Venkataramann GM, Yatin M, Marcinek R, Ain KB, Restoration of iodide uptake in the differentiated thyroid carcinoma: relationship to human Na+/I-symporter gene methylation status. J Clin Endocrinol Metab. 1999 Jul;84(7):2449-57).

메틸화는 수많은 암에 수반될 뿐 아니라, 다른 질병과도 관련된다. 염증성 관절염에 관한 연구에서 상기 질병이 게놈 DNA의 과소 메틸화와 관련됨이 밝혀졌다(Kim YI, Logan JW, Mason JB, Roubenoff R, DNA hypomethylation in inflammatory arthritis: reversal with methotre-xate. J. Lab Clin Med. 1966 Aug;128(2): 165-72). 메틸화-조절 발현은 ICF-증후군에서 검출되었다(Kondo T, Bob MP, Kuick R, Lamb B, Zhu X, Narayan A, Bourc'his D, Viegas-Pequignot E, Ehrlich M, Hanash SM, Whole-genome methylation scan in ICF syndrome:hypomethylation of non-satellite DNA repeats D4z4 and NBL2). 전신 홍반성 루프스에서도 메틸화가 관련되어 있는 것으로 추측 된다(Vallin H, Perers A, Alm GV, Ronnblom L, Antidouble-stranded DNA antibodies and immunostimulatory plasmid DNA in combination mimic the endogenous IFN-alpha inducer in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 1999 Decl; 163(11):6306-13). 또한 두커너 근육 위축 유전자와 CpG-과다 아일랜드가 서로 관련성이 있다(Banerjee S, Singh PB, Rasberry C, Cattanach BM, Embryonic inheritance of the chromatin organisation of the imprinted H19 domain in mouse spermatozoa. Mech Dev. 2000 Feb;90(2):217-26; Burmeister M, Lehrach H, Longrang restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene. nature. 1986 Dec 11-17; 324(6097):582-5). 알츠하이머의 발병과 관련 있는 아밀로이드 전구체 단백질(유전자)의 과소 메틸화와 관여되는 후생유전학적 효과가 알츠하이머에 의심된다(J Mol Neurocsi 1995). 메틸화 상태는 염색체의 수준에서도 주요한 역할을 한다. 예를 들면 정신 지체 증후군은 x-염색체의 취약성과 연계되어 있으며, 메틸화 현상으로 염색체의 취약성을 측정한다(de Muniain AL, Cobo AM, Poza JJ, Saenz A,〔diseases due to instability of DNA〕. Neurologia 1995 Dec;10 Suppl 1:12-9).

비교적 최근에 새로이 개발되어 자주 사용되는 DNA 5-메틸시토신에 대한 DNA 연구방법은 중아황산염과 시토신과의 특이적 반응에 기초한 것으로, 시토신은 상기 반응 및 후속하는 알칼리 가수분해에 의해, 염기쌍 형성 행동에서 티미딘과 동일한 우라실로 전환된다. 5-메틸 시토신은 이에 반하여 이러한 조건에서 변경되지 않는다. 따라서, 원래의 DNA는 전환되어, 시토신과 그 혼성화 행동에서 구별될 수 없었던 메틸시토신이 유일하게 잔여 하는 시토신으로서, 예컨대 증폭 및 혼성화 또는 시퀀싱 등의 "표준" 분자생물학 기술로 검출될 수 있다. 이러한 모든 기술들은 염기쌍 형성에 기초한 것으로, 현재 널리 사용되고 있다. 민감성에 관련된 선행 기술은 연구 대상 DNA를 아가로즈 매트릭스에 포함함으로써, DNA의 확산과 재복원을 방지 시키고(중아황산염은 단일 가닥 DNA에만 반응한다), 침전 및 정제 단계가 신속한 투석 방법에 의해 대체되는(Olek A et al. 핵산 연구 1996,24, 5064-5066)방법으로 제한되어 있다. 개별적 세포는 상기 방법에 의해 연구될 수 있으며, 이는 상기 방법의 잠재성을 설명한다. 지금까지 약 3000개의 염기쌍 길이의 개별적 영역만이 연구되었고, 수천 개의 가능한 메틸화 분석을 위한 광범위한 세포 연구는 불가능하였다. 물론 상기 방법 또한 매우 작은 단편의 소량의 시료도 신뢰성 있게 분석할 수 없다. 이들은 매트릭스를 통한 확산 방지에도 불구하고 소실된다.

5-메틸시토신을 검출하기 위한 공지된 다른 가능한 방법에 대한 개요는 하기 평론 기사에서 얻을 수 있다(Rein, T. DePamphilis, M. L., Zorbas, H., 핵산 연구. 1998, 26, 2255).

상기 중아황산염 기술은 오늘날까지 소수의 예외(z. B. Zechnigk, M. et al. Eur. 인체 유전 1997, 5, 94-98)가 있을 뿐, 대부분 연구에만 한정되어 응용되어 왔다. 그렇지만 알려진 유전자의 짧고 특이적인 조각들만이 중아황산염으로 처리된 후 증폭되어, 완전히 시퀀싱 되거나( Olek, A. und Walter, J., Nature Genetics. 1997, 17, 275-276), 개별적 시토신의 위치를 프라이머-확장-반응(Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., 핵산 연구. 1997, 25, 2529-2531, 국제 특허 제 9500669호) 혹은 효소단계(Xiong, Z. und Laird, P. W., 핵산 연구.1997, 25, 2532-2534)를 통해검출되었다. 혼성화에 의한 검출 또한 개시되었다(국제 특허 출원 제 99/28498호 Olek 등).

개별적인 유전자에서 메틸화 검출에 상기 중아황산염 기술을 응용하는 것과 관련된 다른 간행물은 Xiong, Z. und Laird, P. W.(1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1995), Gene 157, 261;국제 출원 제 97/46705호, 국제 출원 제95/15373호, 국제 출원 제 95/45560호) 등이다.

올리고머 어레이 제조에 대한 선행 기술의 평론은 1999년 1월 출간된 Nature Genetics 특별판 및 상기 간행물에서 인용된 문헌에 개시되어있다(Nature Genetics Supplement, 제 21권 1999 1월).

고정화한 DNA 어레이를 스캐닝하기 위해 복수의 형광 표지된 프로브(탐사체)가 사용되어왔다. 특히 형광 표지로 적합한 것은 색소물질 Cy3와 Cy5를 각 프로브에 있는 5'-OH에 단순히 도입한 것이다. 이 혼성화된 프로브의 형광은 예를 들면 공 초점 현미경으로 검출된다. 색소물질 Cy3와 Cy5는 다른 물품처럼 시중에서 구입할 수 있다.

매트릭스가 장착된 레이저 탈착 이온 질량분석기(MALDI-TOF)는 생물 분자의 분석을 발전시킨 강력한 도구이다(Karas, M. und Hillenkamp, F. 1988, 10000 달톤을 초과하는 분자량을 갖는 단백질을 레이저 탈착 이온화할 수 있다, Anal. Chem. 60:2299-2301). 분석 시료는 광 흡수 매트릭스 속에 매립된다. 매트릭스는 단파 레이저에 의하여 기화되며, 분석되는 분자는 단편화되지 않은 채 기체 상태로 운반된다. 상기 분석물은 매트릭스 분자와의 충돌에 의해 이온화된다. 인가된 전압은 장이 걸리지 않는 비행관내의 이온을 가속화시킨다. 크기가 서로 다른 질량으로 말미암아 서로 다른 속도로 이온들은 이동된다. 크기가 작은 이온은 큰 이온보다 먼저 검출되어 진다.

MALDI-TOP 질량분석기는 단백질 및 펩티드의 분석에 매우 적합하다. 핵산의 분석은 다소 어렵다(Gut, I. G. und Beck, S. 1995. DNA and Matrix Assisted Lager Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1:147-157 ).

핵산은 펩티드 보다 감수성이 100배 더 낮고, 시료 조각이 클수록 과도한 비율로 나빠진다. 핵산은 다수의 음전하를 띤 백본을 갖고 있기 때문에, 매트릭스를 통한 이온화 과정은 근본적으로 큰 효율을 기대하기 어렵다. MAlDI-TOP 질량분석기에서는 매트릭스의 선정이 주요한 역할을 한다. 펩티드를 탈착하기 위하여 매우 미세한 결정을 생성하는 효과적인 매트릭스가 발견되었다. 이러한 와중에 DNA 분석에 효율적인 매트릭스들이 개발되었으나, 결과적으로 감도의 차이를 낮추지 못하였다. 감도의 차이를 낮추려면 DNA를 펩티드와 화학적으로 유사해지도록 전환시켜야 한다. 포스포치오에이트 핵산은 백본의 일반 인산을 치오포스페이트로 치환시킨 것이며, 단순히 알킬화시켜 전하가 중성인 DNA로 전환된 것이다(Gut, I. G. und Beck, S. (1995). A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). 이 개질된 DNA에 전하 태그(charge tags)를 결합시킴으로써 거의 펩티드 정도로 감도가 증가하였다. 전하 태그의 또 다른 장점은 불순물의 존재하에서 분석의 안정성을 증가시키는 것이며, 상기 불순물은 개질 되지 않은 기질의 검출을 매우 어렵게 하였었다.

게놈 DNA는 표준방법에 의해 세포, 조직 또는 기타 시료의 DNA로부터 채취한다. 상기 표준 방법은 프리취와 마니아티스의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989 등과 같은 참조문헌에 기재되어 있다.

본 발명은 주어진 DNA 시료의 수많은 시토신 염기들에 대해 혼성화에 의해 동시에 5 위치의 메틸기의 존재를 조사할 수 있는 매우 효율적이며 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이 목적을 위하여, 올리고뉴클레오티드 및 PAN 올리고머를 제공하며, 이들은 특히 유전적 및/또는 후생유전학적 파라미터를 분석함으로써 질병의 존재 및 그 질병의 소인의 진단에 상기 방법을 사용하는데 특히 적합하다.

유전적인 파라미터들은 본 발명에서 청구된 핵산(서열번호: 1 내지 40712)의 돌연변이, 다형 및 이들의 조절에 필요한 부가적 서열을 말한다. 특히 돌연변이는 유전자 삽입, 유전자 결실, 점 돌연변이, 유전자 반전 및 다형이라 할 수 있고, 특히 바람직하게는 SNP(단일염기다형)이다. 다형은 또한 유전자 삽입, 유전자 결실, 유전자 반전일 수 있다.

본 발명에서 후생유전학적 파라미터들은 특히 시토신 메틸화 및 청구된 핵산(서열번호: 1 내지 40712)의 DNA 염기의 기타 다른 화학적 변형 및 이들의 조절에 필요한 부가적 서열들이 여기에 속한다 할 수 있다. 다른 후생유전학적 파라미터들은 예를 들면 히스톤의 아세틸화이며, 이는 본 발명의 방법으로는 직접 분석이 불가능하지만 DNA-메틸화와 직접 상관관계가 있다.

본 발명의 방법은 게놈 DNA 시료의 염기 서열 5'-CpG-3'에서 하나 이상의 특정 시토신의 메틸화 정도를 검출하는데 목적이 있다. 본 방법은 특히 바람직하게 많은 상이한 메틸화된 위치를 동시에 검출하는데 사용된다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 게놈 DNA 시료의 염기 서열 5'-CpG-3'에서 하나 이상의 특정 시토신의 메틸화 정도를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

게놈 DNA 시료의 염기서열 5′-CpG- 3′에서 특정 시토신의 메틸화 정도를 검출함에 있어서,

a) 게놈 DNA를 화학적으로 처리하여, 시토신 염기들은 우라실로 전환되지만, 5-메칠시토신 염기들은 전환되지 않는 단계;

b) 상기 특정 시토신을 포함하는 게놈 DNA 일부를 증폭하고, 이로써 증폭된 산물에는 검출가능한 표지가 주어지는 단계;

c) 상기 증폭된 산물을 각각 최소한 하나의 구성원을 갖는 두 종류의 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머와 혼성화하는 단계;

d) 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머에 대한 증폭된 산물의 혼성화 범위를 증폭된 산물의 표지를 검출하여 산출하는 단계;

e) 혼성화 결과 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머에 대해 검출된 표지의 비율로부터 게놈 DNA 시료의 상기 특정 시토신의 메틸화 정도를 결정하는 단계를 갖는 것을 특징으로 한다.

특히 바람직한 실시양태로서 c)단계에서 증폭된 산물이 상기 두 종류의 올리고머들(올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA올리고머) 각각의 최소한 하나의 구성원과 혼성화함에 있어서, 상기 첫 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화된 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화하고, 상기 두 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화한다. 이들 두 종류의 올리고머 중 하나는 예를 들면, 중앙에 CG를 함유한 올리고뉴클레오티드에 의하여 형성되며, 다른 종은 TG(또는 반대편 가닥에 CA)가 중앙에 함유된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 상기 올리고머들 서열들의 나머지 부분은 두 종류에서 서로 일치한다. 이러한 경우 첫 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 중아황산염으로 전환되기 전에 메틸화 상태로 존재하고 있었던 서열(조사될 특정 시토신 주위)에 혼성화한다. 역으로 두 번째 종류의 올리고머는 중아황산염으로 전환되기 전에 메틸화되지 않은 상태로 존재하고 있었던 서열에 혼성화하게 된다.

다른 바람직한 실시양태로서, 상기 c)단계에서 증폭된 산물이 상기 두 종류의 올리고머들(올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA올리고머) 각각의 최소한 하나의 구성원과 혼성화함에 있어서, 상기 첫번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화하며, 상기 특정 시토신이 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리후 발생되는 서열에는 우선적으로 혼성화하지 않으며, 두번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신의 게놈 DNA내에서의 메틸화 정도와 무관하게 연구 조사되는 증폭 산물에 혼성화한다.

또 다른 실시양태에서 본 발명은 상기 c)단계에서 증폭된 산물의 혼성화는 상기 두 종류의 올리고머들(올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA올리고머) 각각의 최소한 하나의 구성원과 혼성화함에 있어서, 상기 첫번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리후 발생되는 서열에 우선적으로 혼성화하며, 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에 메틸화된 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리후 발생되는 서열에는 우선적으로 혼성화하지 않으며, 상기 두번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신의 게놈 DNA내에서의 메틸화정도와 무관하게 연구 조사되는 증폭 산물에 혼성화한다.

따라서 이러한 경우에 있어서 두 번째 종류의 올리고머는 메틸화 특이성을 생성하지 않는 증폭된 산물에 혼성화되며, 따라서 메틸화 가능한 시토신 위치에 해당되지 않는 증폭된 산물의 위치에 우선적으로 혼성화된다. 결과적으로 오직 증폭된 산물의 농도는 혼성화의 강도에 의하여 측정되어진다. 여기에서 상기 첫번째 종류의 올리고뉴클레오티드에의 혼성화는 조사되는 특정 시토신의 메틸화 정도의 함수로서 결과된다.

바람직하게 상기 방법은 게놈 DNA 시료뿐만 아니라 상기 특정 위치의 시토신이 메틸화 상태로 존재하는지 또는 메틸화되지 않은 상태로 존재하는지 여부가 알려져 있는 표준 DNA에 대해서도 실행되며, 메틸화되지 않은 표준 DNA로 측정한 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 검출된 표지 비율을 메틸화 정도 0 에 대한 검정값으로 하고, 이것과 상응하여 메틸화된 표준 DNA로 측정한 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 검출된 표지 비율을 메틸화 정도 1에 대한 검정값으로 하여, 이 검정값을 게놈 DNA 시료의 메틸화 정도를 결정하는 데 사용한다.

특정 시토신의 메틸화 정도가 이미 알려져 있는 부가적인 공지 표준 DNA 시료를 검정에 사용한다.

사용된 표준 DNA 시료와 샘플(게놈 DNA에서 제조된 증폭 산물)은 각각 바람직하게 상이한 표지가 부착된다. 사용된 표준 DNA 시료들은 바람직하게 차례로 다른 표지로 라벨링될 수 있다.

본 방법에 있어서 바람직하게 상이한 게놈 DNA 시료에서 유래된 증폭 산물은 상이한 표지가 사용된다. 이러한 경우 한세트의 두 종류의 올리고뉴클레오티드에 의해 상이한 시료들을 동시에 예를 들면, 두 종류의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나의 올리고머 어레이상에서 측정할 수 있다.

또한 본 발명은 바람직하게 동일한 게놈 DNA 시료에서 유래된 증폭 산물들이 상이한 표지를 구비하여, 상이한 검출 방법에서 얻어진 값의 평균을 산출함으로써 측정 정확성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면 이는 다양한 형광 색소물질로 라벨링함으로써 수행할 수 있다. 이 경우 측정은 개별적인 형광 색소물질의 개별적 방출 파장을 측정하기 위한 여러 개의 채널을 구비한 형광 스캐너로 수행된다.

본 발명에 있어서 특히 표지로서 형광 표지를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라, 상기 표지는 형광 표지인 것이 바람직하며, 상기 표지는 바람직하게 화학발광(chemiluminescence), 자외선 흡수 혹은 형광 편광에 의하여 검출될 수 있다.

특히 바람직하게 본 발명에 있어 상기 a)단계에서의 DNA 처리는 중아황산염(=수소아황산염(hydrogen sulfite), 이아황산염(disulfite))용액으로 수행한다. 특히 바람직하게는 올리고뉴클레오티드가 상기 증폭을 위하여 사용되고, 상기 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 전처리된 서열번호: 1 내지 40712중 어느 한 서열에 따른 18 염기 이상의 DNA 서열부분을 포함한다. 상기 중아황산염 처리된 DNA에 상보적인 프라이머가 사용되어, 조절 영역(CpG 아일랜드)을 증폭시킬 수 있고, 이후 이는 메틸화에 대해 조사된다.

특히 바람직하게 본 방법은 상기 혼성화 단계에 있어서, 화학적으로 전처리된 서열번호: 1 내지 40712중 어느 한 서열에 따른 9 염기 이상의 DNA 단편과 혼성화하거나 또는 상기 부분에 해당되는 올리고뉴클레오티드 및/또는 펩티드핵산(PNA)올리고머가 사용되고, 상기 염기 서열은 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드를 포함하며, CpG 디뉴클레오티드는 대략 올리고머 전체를 삼등분하였을 때, 중간에 위치한다. 이 올리고뉴클레오티드들은 본 발명의 방법에 따라 특정 CpG 위치들의 그 메틸화 정도를 연구하기에 적합하다. 올리고뉴클레오티드는 각 시토신의 위치에 메틸화된 게놈DNA 시료로부터 유래 된 처리된 DNA의 증폭 산물에 우선적으로 결합한다.

또한 바람직하게 상기 표지들은 방사성 핵 물질이다.

더욱 바람직하게 상기 표지는 질량 분석기로 측정되는 제거가능한 질량 표지(mass label)이다. 특히 바람직하게 상기 PCR(중합효소 연쇄반응)-생성물은 전체 혹은 이들의 특징적인 단편이 질량분석기로 검출되며, 그 질량에 의해 명백히 특성화된다.

본 발명에 있어서 바람직하게 상기 한 종류의 올리고머(올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA-올리고머)는 염기서열 5'-CG-3'을 포함한다.

본 발명에 있어서 바람직하게 상기 한 종류의 올리고머(올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA-올리고머)는 서열 5'-TG-3' 및/또는 서열 5'-CA-3' 을 포함하고 있다.

또한 바람직하게, 상기 첫 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 염기서열 5'-CG-3'을 포함하고, 상기 두 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 염기서열 5'-TG-3' 및/또는 염기서열 5'-CA-3'을 포함한다.

가급적, 첫 번째와 두 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 공통되는 고체상에 고정되어 있다. 또한 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 직사각 또는 육각의 그리드내 평면 고체상에 배치되어 있고, 상기 고체상위의 특정 올리고뉴클레오티드들은 그들 각각의 서열과 상관관계를 가진다.

특히 바람직하게는 상기 첫 번째 종류와 두 번째 종류의 올리고머는 비드(구슬)에 고정되어져 있으며, 상기 비드는 분리되어 검출되는 표지 세트에 의해 코드화되어 있다. 상기 표지는 비드 즉, 비드에 결합되어 있는 문제의 서열을 확인하기 위함이다. 이후 비드에 결합한 증폭 산물들은 상기 증폭 산물에 결합된 다른 표지들에 의해 확인된다. 이러한 비드측정방법에 적용되는 기구들은 예를 들면, 루미넥스 회사에 의해 제공된다.

본 발명에 따른 방법에서 가장 바람직하게는, 상기 b)단계가 하기 두 단계로 수행된다:

a) 제 1 항에서 전처리된 DNA-시료에 비특이적으로 혼성화되는 한쌍 이상의 서로 다른 서열의 프라이머로 PCR 예비증폭을 수행하여, PCR 단계에 하나 이상의 증폭된 산물을 발생시키는 단계;

b) 서열이 제 1 항에 따라 전처리된 DNA 시료〔(＋)가닥 또는 (－)가닥〕의 단편과 동일하거나 또는 반대로 상보적이며, 증폭될 DNA에 특이적으로 중합을 일으키는 서로 다른 서열로 구성된 프라이머들로 상기 예비 증폭에서 발생된 산물을 PCR 증폭하는 단계.

본 발명에 있어, 혼성화는 잘못된 염기쌍 형성의 발생 없이 서로에 대하여 왓슨-크리크 법칙에 따라 완전히 역으로 상보적인 두 개의 단일 DNA 가닥의 혼성화를 말한다. 우라실은 이 점에 있어서 티민으로 간주 된다.

본 발명에 있어서 바람직하게 수개의 DNA 부분이 한 개의 반응조에서 증폭된다.

또한 바람직하게 본 발명은 증폭할 때 열에 안정한 DNA-폴리머라제가 사용된다. 특히 바람직하게는 증폭에 사용되는 프라이머 올리고뉴클레오티드는 오로지 염기 T, A 및 C를 갖거나 또는 염기 T, A, 및 G를 함유하고 있다는 점이다.

바람직한 실시양태로서, 최소한 10 CpG들의 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석된다. 더욱 바람직하게는 최소한 50개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석된다. 보다 바람직한 점은 적어도 100개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석되어 질 수 있다는 점이다. 더 바람직한 점은 적어도 500개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석되어질 수 있다는 점이다. 더 바람직한 점은 적어도 1000개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석되어질 수 있다는 점이다.

바람직하게 본 발명의 유전자 DNA-시료는 계통 세포(cell line), 혈액, 타액, 대변,소변, 뇌척수액, 파라핀에 포장된 조직 예를 들면 안구, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 유방 혹은 간, 조직검사에 필요한 슬라이드 혹은 이들의 조합으로부터 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 바람직하게 환자들 또는 개체에 있어 부작용의 진단 및/또는 예측에 사용될 수 있으며, 상기 부작용은 하기 범주 중 어느 하나에 속한다; 바람직하지 못한 약물 상호작용; 암; CNS-기능장애, 손상 혹은 질병; 공격성 또는 행동 장애; 병리적, 심리적, 사회적 요인으로 인한 뇌 기능장애; 정신적 장애와 성격 장애; 치매 및/또는 그에 부수된 증후군들; 심혈관질병, 기능장애 및 손상; 소화기관의 기능 장애, 손상 또는 질병; 호흡기관의 기능장애, 손상 또는 질병; 상처, 염증, 감염, 면역 및 회복; 발달 단계에서의 이상인 신체의 기능장애, 손상 혹은 질병; 피부, 근육, 결합 조직 또는 뼈의 기능장애, 손상 혹은 질병; 내분비 혹은 대사장애, 손상 혹은 질병; 두통 혹은 성 기능장애를 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 바람직하게 세포 혹은 조직들의 형태를 구별하거나 세포 분화를 조사하는데 사용된다.

본 발명은 또한 중아황산염을 함유한 시약, 증폭 산물의 제조를 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드 및/또는 바람직하게 고체상에 고정화된 올리고뉴클레오티드 및 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 프라이머 올리고뉴클레오티드 그리고 고정된 올리고뉴클레오티드는 전술한 바와 같이 서열번호: 1 내지 40712로부터 유래한다.

게놈 DNA 시료는 바람직하게 계통 세포, 안구 조직, 혈액, 타액, 대변, 소변, 뇌척수액, 파라핀 포장에 보관된 조직 예를 들면 안구 조직, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 유방 혹은 간, 조직검사를 하기 위한 슬라이드 혹은 이들의 조합에서 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 첫 단계에서 게놈 DNA-시료는 5-메틸시토신 염기를 제외하고 모든 시토신 염기들은 우라실로 전환되게 화학 처리된다. 이러한 화학적 처리는 바람직하게 중아황산염(= 수소아황산염, 이아황산염)용액을 선택하여 적용하였다. 이 단계는 게놈 DNA-시료 뿐 아니라 상기 특정 위치의 시토신이 메틸화 또는 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 것이 알려져 있는 표준 DNA에서도 수행될 수 있다.

본 방법의 두 번째 단계에서는 상기 특정의 시토신을 함유한 게놈 DNA의 일부분이 증폭된다. 이 증폭단계에서는 특히 바람직하게 하기 두 단계로 수행된다:

1. 첫째, 화학적으로 전처리된 DNA에 혼성화하는 한 쌍 이상의 서로 다른 서열의 프라이머로 PCR-예비 증폭을 수행한다. 상기 전처리에서는 시토신 염기들이 우라실로 전환되며, 5-메틸시토신은 전환되지 않는다.

2. 상기 예비 증폭에서 생성된 산물을 서로 다른 서열의 프라이머로 PCR을 수행한다. 이 프라이머들은 상기 화학적으로 전 처리된 DNA[(+) 가닥 혹은 (-)가닥의]단편과 동일하거나 혹은 역으로 상보적이며, 그리고 증폭될 DNA에 특이적으로 혼성화한다. 증폭된 산물은 바람직하게 검출가능한 표지를 함유하고 있다.

다음 세 번째 단계에서는 상기 증폭 산물의 혼성화는 바람직하게 각각 최소한 하나의 구성원을 갖는 두 종류의 올리고뉴클레오티드상에서 일어난다. 특히 바람직하게, 상기 첫 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-CG-3'를 함유하며 두 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 서열 5'-TG-3 및/또는 5'-CA-3'를 함유한다. 상기 첫 번째와 두 번째 종류의 올리고뉴클레오티드들은 바람직하게 공통된 고체상에 고정된다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 직사각 또는 육각 그리드내 평면 고체상에 배열되고, 고체상의 특이적 올리고뉴클레오티드의 위치는 그들 각각의 서열과 관련되어져 있다.

상기 첫 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화 상태로 존재하고 있었다면 게놈 DNA의 화학적 처리후 이로부터 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화한다. 두 번째 종류의 올리고뉴클레오티드는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화되지 않은 상태로 존재했었다면 게놈 DNA의 화학적 처리 후 이로부터 발생되는 서열에 우선적으로 혼성화된다.

상기 여러 DNA 단편들의 증폭은 바람직하게 하나의 반응조에서 시행된다. 증폭은 바람직하게 열 안정성 DNA-폴리머라제가 사용되는 PCR에 의해 수행된다.

증폭에 사용되는 프라이머 올리고뉴클레오티드는 오직 T, A, C 염기 혹은 T, A, G 염기를 함유하고 있다.

다음 네 번째 단계에서, 증폭 산물의 표지를 검출하여, 두 종류의 올리고뉴클레오티드상의 증폭 산물의 혼성화 범위를 산출한다. 이 표지는 바람직하게 형광표지, 방사선 핵종, 또는 질량분석기로 검출되는 제거가능한 질량표지이다. 표지들은 바람직하게 화학발광, 자외선 흡수 혹은 형광 편광에 의해 검출된다. PCR 산물들은 전체 혹은 이들의 특징적 단편으로서 질량 분석기에서 검출될 수 있다. 따라서 PCR-산물은 이들의 질량으로 명확하게 특성화된다.

마지막 단계에서, 혼성화 결과 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드상에서 검출된 표지 비율로부터 게놈 DNA 시료내 상기 특정 시토신의 메틸화 정도를 결정한다.

메틸화되지 않은 표준 DNA로 매번 측정한 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 검출된 표지의 비율을 메틸화 정도 0에 대한 검정값으로 한다.

상응하게, 메틸화된 표준 DNA로 매번 측정한 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 검출된 표지의 비율을 메틸화 정도 1에 대한 검정값으로 한다. 상기 검정값은 특히 게놈 DNA 시료의 메틸화 정도를 결정하는데 사용된다.

바람직하게, 상기 특정 시토신의 메틸화 정도가 알려진 부가적 공지 표준 DNA를 검정에 사용하였다.

본 발명의 방법은 바람직하게 최소한 10개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석된다. 또한, 최소한 50개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석된다. 더욱 바람직하게는 최소한 100개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석된다. 더욱 바람직하게는 최소한 500개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석되며, 가장 바람직하게는 최소한 1000개의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 분석되어 진다는 점이다.

상기 방법은 바람직하게 환자들 또는 개체에 있어 부작용의 진단 및/또는 예측에 사용될 수 있으며, 상기 부작용은 하기 범주 중 어느 하나에 속한다; 바람직하지 못한 약물 상호작용; 암; CNS-기능장애, 손상 혹은 질병; 공격성 또는 행동 장애; 병리적, 심리적, 사회적 요인으로 인한 뇌 기능장애; 정신적 장애와 성격 장애; 치매 및/또는 그에 부수된 증후군들; 심혈관질병, 기능장애 및 손상; 소화기관의 기능 장애, 손상 또는 질병; 호흡기관의 기능장애, 손상 또는 질병; 상처, 염증, 감염, 면역 및 회복; 발달 단계에서의 이상인 신체의 기능장애, 손상 혹은 질병; 피부, 근육, 결합 조직 또는 뼈의 기능장애, 손상 혹은 질병; 내분비 혹은 대사장애, 손상 혹은 질병; 두통 혹은 성 기능장애를 포함한다.

사용된 두 종류의 올리고뉴클레오티드(예: CG/TG 함유)간의 중합비율을 산출하므로 본 방법은 미지의 조직 시료의 전체 혼성화 강도에 의존되지 않는다.

메틸화되지 않은 또는 메틸화된 비교 시료가 미지의 조직세포를 검정하기 위해 표준으로 사용되었다.

본 방법의 일 구성요소는 중아황산염을 함유한 시약, 증폭 산물의 제조를 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드 및/또는 바람직하게 고체상에 고정화된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트이다. 올리고뉴클레오티드(첫 번째 종류)는 서열 5'-CG-3'을 포함한다. 올리고뉴클레오티드(두 번째 종류)는 서열 5'-TG-3' 및/또는 서열 5'-CA-3'을 포함한다. 키트에는 방법을 수행하기 위한 지침서가 포함된다.

본 발명은 또한 상기 방법을 수행하기에 특히 적합한 핵산들을 제공한다.

또한 본 발명은 화학처리된 DNA(서열번호: 1 내지 40712)에서 시토신의 메틸화 상태를 검출하기 위하여 도움이 되는 최소한 10개의 올리고머 프로브(올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA-올리고머) 세트를 제공한다. 이들 프로브를 사용하여 질병의 존재 진단 또는 특정 질병에의 소인 진단을 위한 유전적 또는 후생유전학적 파라미터의 분석이 가능하다.

본 발명은 또한 서열번호: 1 내지 40712중 어느 하나에 따른 최소한 18 염기길이를 갖는 처리된 DNA 서열 단편을 제공한다. 이러한 18개의 쌍 염기로 구성된 길이의 단편은 서열번호: 1 내지 40712로 구성되었으며 처리된 게놈 DNA의 증폭에 이용된다. 최소한 9개 뉴클레오티드 길이의 올리고머가 상기 단편들의 검출자로 사용된다.

상기 올리고머는 바람직하게 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드를 함유한다. CpG 디뉴클레오티드에 상응되는 시토신은 대략 올리고머 중앙에서 세 번째 지점에 위치한다. 결정적인 점은 적어도 염기서열 ID.1에서 ID. 40712로 부터 구성된 하나의 올리고뉴클레오티드가 CpG 디뉴클레오티드를 위한 각각의 올리고머 세트에 존재한다는 것이다.

올리고머는 바람직하게 고정된 배열의 지지 물질상에서 제조되며, 최소한 하나의 올리고머가 고체상에 결합된다. 고체상에 올리고머 프로브를 결합하는 방법은 본 기술분야의 당업자에게 잘 공지되어 있다.

여기에서 중요한 것은 유전적 및/또는 청구된 핵산들(서열 번호: 1 내지 40712)의 후생유전학적 파라미터의 진단을 위해 분석되어야 하는 것은 개별적인 CpG 디뉴클레오티드가 아니라, 염기서열내 존재하는 다수의 CpG 디뉴클레오티드라는 것이다. 특히 바람직하게는 본 발명은 서열내 존재하는 모든 CpG 디뉴클레오티드가 조사된다.

더욱 바람직하게 모든 올리고머 프로브는 동일한 길이를 소유한다. 또한 보다 바람직하게 모든 18-머[단편]는 CG 디뉴클레오티드가 중앙에 위치하며, 잘못된 염기쌍 형성없이 서열 번호:1 내지 40712 중 어느 하나와 혼성화한다.

다른 바람직한 방법으로서, 화학적으로 처리된 게놈 DNA시료에서 최소한 10 개 올리고머가 시토신의 메틸화 상태 및/또는 단일 염기 다형(SNP)을 검출하기 위하여 사용되었다.

상기 올리고머는 바람직하게 환자들 또는 개체에 있어 부작용의 진단 및/또는 예측에 사용될 수 있으며, 상기 부작용은 하기 범주 중 어느 하나에 속한다; 바람직하지 못한 약물 상호작용; 암; CNS-기능장애, 손상 혹은 질병; 공격성 또는 행동 장애; 병리적, 심리적, 사회적 요인으로 인한 뇌 기능장애; 정신적 장애와 성격 장애; 치매 및/또는 그에 부수된 증후군들; 심혈관질병, 기능장애 및 손상; 소화기관의 기능 장애, 손상 또는 질병; 호흡기관의 기능장애, 손상 또는 질병; 상처, 염증, 감염, 면역 및 회복; 발달 단계에서의 이상인 신체의 기능장애, 손상 혹은 질병; 피부, 근육, 결합 조직 또는 뼈의 기능장애, 손상 혹은 질병; 내분비 혹은 대사장애, 손상 혹은 질병; 두통 혹은 성 기능장애를 포함한다.

또한 본 염기서열에 서술된 핵산들 혹은 상당한 그 일부(서열 번호: 1 내지 40712) 중 최소한 하나는 질병의 진단 또는 특정 질병의 소인을 진단하기 위한 유전적 혹은 후생유전학적 파라미터의 분석에 사용될 수 있다.

본 분야의 당업자는 올리고머의 서열에서 티민이 우라실과 변경될 때 동일한 목적을 성취할 수 있다는 점을 용이하게 이해할 수 있다.

분석되어지는 게놈 DNA는 바람직하게 DNA에 대한 일반적인 공급원 예를 들면 세포주, 혈액, 타액, 대변, 소변, 뇌척수액, 예를 들면 안구, 창자, 신장, 뇌, 심장, 전립선, 폐, 유방 혹은 간과 같은 파라핀에 매립된 조직, 조직검사 슬라이드 혹은 기타 가능한 이들 모두의 조합으로부터 얻는다.

본 발명은 또한 서열번호: 1 내지 40712 중 어느 하나에 따른, 화학적으로 전처리된 DNA의 최소한 18개의 염기 길이의 서열 단편을 함유하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 화학적으로 전처리된 DNA내의 시토신의 메틸화상태를 검출하기 위한 올리고머(올리고뉴클레오티드 혹은 펩티드핵산(PNA)-올리고머)를 제공하며, 이들은 각각 최소한 9개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 최소한 하나의 염기서열을 포함하며, 화학적으로 전처리된 DNA(서열번호: 1 내지 40712)에 혼성화한다. 바람직하게 상기 염기 서열은 최소한 하나의 디뉴클레오티드를 포함한다. 더욱 바람직하게는 상기 CpG 디뉴클레오티드의 시토신은 대략 올리고머 중앙에서 세 번째 위치에 존재한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 올리고머 세트를 제공하며, 상기 올리고머 세트는 서열번호: 1 내지 40712 중 하나의 서열의 최소한 하나의 CpG 디뉴클레오티드에 대한 최소한 하나의 올리고머를 포함한다. 바람직하게 상기 올리고머 세트는 서열번호: 1 내지 40712 중 하나의 서열의 CpG 디뉴클레오티드들 각각에 대한 최소한 하나의 올리고머를 포함한다.

본 발명은 또한 적어도 두개의 핵산 세트를 제공하며, 이들은 서열번호 제1 내지 40712 중 최소한 하나의 서열 또는 이들의 부분의 본 발명에 따른 증폭을 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. 바람직하게 상기 최소한 하나의 올리고뉴클레오티드는 고체상에 결합된다.

본 발명은 서열번호: 1 내지 40712 중 하나에 따른 화학적으로 전처리된 게놈 DNA에서 시토신 메틸화 상태 및/또는 단일 염기 다형(SNP)의 검출을 위한 올리고머 프로브 세트를 제공하며, 이들은 최소한 10개의 본 발명에 따른 전술한 올리고머를 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호: 1 내지 40712 중 하나의 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화 상태와 관련된 질병의 분석을 위한 지지 물질상에 고정된 상이한 올리고머 배열(어레이)를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 어레이에서 본 발명에 따른 최소한 하나의 올리고머가 고체상에 결합되어 있다.

본 발명은 또한 고체상에 결합된 상이한 올리고머 배열(어레이)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상이한 올리고뉴클레오티드 및/또는 PNA 올리고머 배열에 관한 것이며, 이들은 직사각형 또는 육각형의 그리드의 형태로 평면 고체상에 배열된다. 바람직하게 상기 고체상 표면은 실리콘, 유리, 폴리스티렌, 알루미늄, 강철, 철, 구리, 니켈, 은 또는 금으로 구성된다.

본 발명에 의하면, DNA 어레이 및/또는 PNA 어레이는 유전자의 메틸화 상태에 관련된 질병의 분석을 위한 것이며, 이들은 본 발명에 따라 전술된 최소한 하나의 핵산을 함유한다.

도 1 은 ELK-1 파편과 중합후의 DNA칩의 사진.
도 2A 는 도1의 일부를 표현하는 것으로서, 중합반응의 도식을 명확히 나타내는 것은 두 개의 올리고누클레오티드 점들 흰색 테두리이며 ctactcaacaaaaacaaa(왼쪽) 및 ctactcaacgaaaacaaa(오른쪽)에 해당된 것을 알려주는 사진.
도 2B 는 조직시료의 알려지지 않은 수 없는 메틸화 상태의 사진.
도 2C 는 서로 상대 비교하는 시료의 메틸화된 상태의 사진.

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실시예 1
메틸화된 DNA와 메틸화되지 않은 DNA의 제조및 중아황산염의 처리
메틸화된 DNA를 제조하기 위하여 제조자 지시에 따라 인간 게놈 DNA를 s-아데노실메치온과 CpG 메틸라제(new england Biolabs제조)로 처리하여 제조하였다. 메틸화되지 않은 DNA를 제조하기 위하여, 인간 게놈 DNA을 출발 물질로 하여, 프라이머 GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA 및 AGGTGGTGGTGGCGGTGG를 사용하여 유전자 단편 ELK-1(취득번호 ep59011)를 PCR 증폭하였다. 메틸화된 DNA와 메틸화되지 않은 DNA는 상기와 같이 제조하고, 인간 게놈 DNA는 중아황산염을 처리하여 5번 염기 위치가 메칠화되지 않은 모든 시토신은 변경되어 염기짝 형성 행동이 다른 염기가 형성되고, 한편 5번 위치에 메틸화된 시토신은 변화되지 않은 채 남아 있게 하였다. 중아황산염은 0.1 내지 6 M의 농도 범위로 사용되었고, 이후 메칠화되지 않은 시토신 염기에서 부가 반응이 시작되었다. 또한 변성 시료 혹은 용액 및 라디칼 소거제가 존재하였다. 연이어서 시행된 알칼리 가수분해로 메틸화되지 않은 시토신-뉴클레오 염기는 우라실로 전환되었다. 이렇게 전환된 DNA가 메틸화된 시토신을 검출하기 위해 사용되었다.
실시예 2
Cy5-표지된 유전자 프로브의 제조
중아황산염 처리된 DNA시료를 출발물질로 하여, ELK-1 유전자(취득번호 ep59011)의 프로모터 영역에서 529 bp의 길이의 한정된 단편(defined fragment)을 증폭하였다.
증폭은 프라이머 올리고뉴클레오티드 ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT 및 TAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT를 사용하여 실시하였다. 형광색소물질 Cy5로 표지된 프라이머 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 상기 단편이 PCR에서 직접 표지되게 하였다. (1) 메틸화되지 않은 DNA, (2) 메틸화된 DNA, (3) 중아황산염 처리된 인간 게놈 DNA가 매트릭스 DNA로 사용되었다. 이후 이들 세개의 다른 DNA 단편에 대하여 특정 CpG위치에서의 메틸화 정도를 알아보기 위해 독립적으로 혼성화를 시행하였다.
실시예 3
혼성화의 실행과 혼성화된 DNA 칩의 평가
상기 실시예 2에서 생성된 유전자 프로브는 DNA 칩에 혼성화되었다. 먼저 올리고뉴클레오티드를 칩에 고정하였다. 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 실시예 2에서 언급한 ELK-1 유전자의 증폭 조각에서 유래되고, 직접적인 주위를 포함하여 CG 뉴클레오티드를 대표한다.
올리고뉴클레오티드의 길이는 14-22 뉴클레오티드에 달하며; 올리고뉴클레오티드내의 CG 디뉴클레오티드의 위치는 가변적이다. 혼성화후, 상기 DNA칩을 스캐닝하였으며(도 1 참조), 혼성화 시그널을 숫자로 평가하였다(데이타 미도시).
올리고뉴클레오티드 CTACTCAACGAAAACAAA과 CTACTCAACAAAAACAAA에 대한 혼성화 결과를 도 1 및 도 2에 도시하였다. 증폭 산물의 103 위치에 있는 ELK-1 조각의 시토신이 메틸화되어 있으면 CTACTCAACGAAAACAAA가 우선적으로 혼성화하며; 시토신이 메틸화되지 않았으면 CTACTCAACAAAAACAAA가 우선적으로 혼성화한다.
도 1 은 ELK-1 단편과 중합화한 후의 DNA칩을 도시한 것이다. 스캐닝후 생성되는 위-색상(pseudo-color) 이미지가 나타난다. 본 명세서에서는 흑백으로 도시되었지만 스캐너에 의해 색상 이미지가 생성된다. 상이한 색상의 강도가 혼성화 정도를 표시하며, 적색(도 1에서 밝은 점들로 인식된다)에서부터, 청색(도 1에서 어두운 점들로 인식된다)으로 변하면 혼성화 정도가 감소됨을 뜻한다.
도 2A 는 도 1의 일부를 나타낸 것이다. 혼성화 도해를 명확히 나타내기 위해 올리고뉴클레오티드들의 스팟 쌍(spotted pairs)을 원으로 표시하였다: ctactcaacaaaaacaaa(왼쪽)과 ctactcaacgaaaacaaa(오른쪽)에 해당됨.
도 2B는 조직 시료의 미지의 메틸화 상태에 대한 스폿팅 패턴이며, 도 2C는 메틸화된 대조 시료에 대한 메틸화 상태를 보여준다.

평균치는 파장 635nm에서 측정되어진 각각의 도수이다.
표 1에서 항목 시료 A는 메틸되지 않은 대조 시료의 수치이며 시료 B는 미지의 메틸화 상태의 조직 시료이며, C는 메틸화된 대조 시료이다.
CG/CA의 비율은 각 시료의 메틸화 상태를 표시한다. 0.74는 시료가 근본적으로 메틸화된 형태로 존재함을 의미한다.
실시예 4
다음의 예는 유전성 비다수배체 직장암과 연관된 유전자 hMLH1 단편에 관련된 것이며, 상기 유전자의 특정 CG-위치의 메틸화 상태가 조사되었다.
첫 번째 단계에서 인간 게놈 DNA는 중아황산염을 처리하여 5번 염기 위치가 메칠화되지 않은 모든 시토신은 변경되어 염기짝 형성 행동이 다른 염기가 형성되고, 한편 5번 위치에 메틸화된 시토신은 변화되지 않은 채 남아 있게 하였다. 중아황산염은 0.1 내지 6 M의 농도 범위로 사용되었고, 이후 메칠화되지 않은 시토신 염기에서 부가 반응이 시작되었다. 또한 변성 시료 혹은 용액 및 라디칼 소거제가 존재하였다. 연이어서 시행된 알칼리 가수분해로 메틸화되지 않은 시토신-뉴클레오 염기는 우라실로 전환되었다. 이렇게 전환된 DNA을 메틸화된 시토신의 검출에 사용하였다. 두 번째 단계에서, 상기 처리된 DNA 시료를 물 또는 수성 용액으로 희석시켰다. DNA의 탈유황 작업을 90-100℃에서 10-30분간 pH가 알카리 범위에서 시행하였다. 세 번째 단계에서는 열 안정성 DNA-폴리메라제효소를 사용하여 상기 DNA 시료를 PCR 증폭하였다. 본 실시예에서는, hMLH1유전자, 여기에서는 1551bp-길이의 5'-flanking 영역의 시토신이 조사되었다. 이러한 목적을 위하여 719bp 조각의 한정된 단편을 특이적 프라이머 올리고뉴클레오티드ACACCTCCATGCACTG 및 TTGATTGGACAGCTTGAATGC을 사용하여 증폭하였다. 이 증폭된 산물을 시료로 하여, 미리 고체상에 결합시켜둔 예를 들면, GAAGAGCGGACAC와 같이 이중 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 혼성화시키고, 이로써 검출된 시토신은 증폭된 생성물의 588 위치에서 발견되었다. 혼성화 산물의 검출은 증폭에 사용된 형광물질인 Cy3와 Cy5가 표지된 프라이머 올리고뉴클레오티드에 근거를 두고 있다. 상기 올리고뉴클레오티드와 증폭된 DNA간의 혼성화 반응은 오직 메틸화된 시토신이 중아황산염 처리된 DNA내 이 부위에 존재하는 경우에만 일어난다. 따라서 조사될 각 시토신의 메틸화 상태가 혼성화 산물을 결정하게 된다.
실시예 5
아가로즈 비드와 중아황산염-개질된 DNA의 제조
본 실험에서는 중아황산염으로 처리된 DNA를 출발물질로 하여, 유전자 ELK-1(accession number ep59011)의 프로모터 구역에서 길이 529bp인 한정된 단편을 증폭하였다. 형광 색소 ALEXA 488로 표지한 프라이머 올리고뉴클레오티드 ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT 및 AAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT를 사용함으로써, 상기 단편은 PCR에서 직접 표지되었다. 첫 번째 종류의 올리고뉴클레오티드 여기에서는 ATTAATAGCGTTTTGGTT이며, 두 번째 종류의 올리고뉴클레오티드 여기서는 ATTAATAGTGTTTTGGTT는 개별적인 색상코드로 구분되는 비드 표면에 고정되었다.
다음 단계에서 위에서 언급된 프라임 올리고뉴클레오티드들로 생성된 증폭된 ELK-1 유전자 산물들이 두가지 종류로 된 비드 혼합물과 혼합되었고, 상기 증폭된 산물은 고정화된 올리고뉴클레오티드, ATTAATAGCGTTTTGGTT 와ATTAATAGTGTTTTGGTT와 혼성화되었으며, 이로써 검출될 C 또는 T가 증폭 산물의 476 위치에서 발견되었다. 이후 비드는 분리되고, 그 색상 코드에 기초하여 형광 측정으로 확인하고, 형광색소 ALEXA 488에 특이적인 형광 강도 측정에 의해 혼성화 정도를 측정하였다.
실시예 6
내부 검정을 위한 복수 색소의 사용.
중아황산염으로 처리한 DNA를 출발물질로 하여, 유전자 ELK-1의 프로모터 구역에서 길이 529bp의 한정된 단편을 증폭하였다. 형광물질이 표지된 프라이머 올리고뉴클레오티드 ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT 와 TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT을 사용함으로써 상기 단편은 PCR에서 직접 표지되었다. PCR 반응은 써머 사이클러(에펜도르프 회사제작)를 사용하였고, 10 ng 중아황산염을 처리한 DNA, 6 pmol의 각 프라이머, 200 μM의 각 dNTP, 1.5 mM MgCl 및 1 U HotstartTaq(퀴아겐 회사)가 사용되었다. 그 외 일반적인 제조 조건들은 제조자의 언급에 따라서 선택되어졌다. 증폭을 하기 위하여, 96℃에서 14분간 열변성이 수행되었으며, 하기 조건으로 39 사이클을 반복하였다: 96℃에서 60초간, 55℃에서 45초, 72℃에서 75초간. 최종적으로 신장이 72℃에서 10분간 수행되었다. 본 실험에서, 조사되는 시료는 건강인과 환자의 조직이었으며, 색소 Cy2가 표지되었다. 메틸화 상태의 내부 검정을 위해, 검정용 시료의 증폭을 위해 Cy3와 Cy5 형광 색소로 표지된 프라이머 올리고뉴클레오티드가 사용되었다. 한편, 검정용 시료에서 증폭된 산물들은 하나는 100% 메틸화된 알려진 메틸화 상태를 표시하고, 다른 것은 메틸화되지 않은 상태를 표시한다. 본 방법에서 파키드 바이오사이언스-바이오 칩 기술의 스캔배열 분석기 4000XL로 측정된 형광색소 물질의 강도의 비율이 두 종류의 올리고뉴클레오티드, 즉 여기에서는 ATTAATAGCGTTTTGGTT와 ATTAATAGTGTTTTGGTT에 대해 산출되고, 검출될 C 또는 T는 매번 증폭산물의 476 위치에 발견되므로, 미지 시료의 메틸화되지 않은 상태에 대한 메틸화된 상태의 비율이 산출된다.
실시예 7
시료의 처리량 및 분석의 복합성을 증가시키기 위한 복수 색소의 사용
본 실험은 상이한 시료들을 단일 혼성화 단계에서 분석하기 위한 목적으로 시료 처리량을 증가시키기 위한 것이다. 이 목적을 위하여, 4명의 개체로부터 얻은 중아황산염으로 처리된 DNA를 출발물질로 하여 유전자 ELK-1 프로모터 구역의 529bp 길이의 한정된 단편을 프라이머 올리고뉴클레오티드들 ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT 와 TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT를 사용하여 증폭하였다. 이 네명의 개체에서 유래된 단편들을 4개의 상이한 형광 색소 Cy3, Cy5, Cy2 및 Cy7로 표지하고, 고정화된 올리고뉴클레오티드, 여기에서는 ATTAATAGCGTTTTGGTT 와 ATTAATAGTGTTTTGGTT에 혼성화하였으며, 이로써 검출될 C 또는 T는 매번 증폭 산물의 476 위치에서 발견되었다. 이 네가지 서로 다른 형광 표지를 부착한 시료들은 이후 상이한 파장에서 형광 색소에 기초한 서로간의 간섭없이 분석되었다.
한편, 하나의 DNA 시료에서 유래된 단편들의 상이한 세트를 제조하는 것도 가능하며, 상기 단편들은 상이한 염료, 여기에서 Cy2, Cy3 및 Cy5로 표지되어 있다. 만약 64개의 유전자를 위한 올리고뉴클레오티드 프로브 세트(세트 1)가 칩에 고정화된 경우, 예를 들어 Cy3으로 표지된 64개를 서로에 대해 독립적으로 분석하기에 충분한 특이성이 있다. 이렇게 세트 1의 시료는 형광색소 Cy3, 세트 2의 형광색소를 Cy5, 세트 3의 색소를 Cy2 로 표지함으로써, 세트 1의 형광 광도를 측정하여 메틸화 상태를 검출하는 것은 세트 2 및 3의 형광 표지된 증폭 산물에 의해 영향을 받지 않는다(역으로도 마찬가지다). 따라서 증폭 산물의 복합성이 증가하더라도 덜 복합된 64개의 증폭 산물의 경우와 동일한 정도의 신뢰성있는 데이타를 확보할 수 있다.
실시예 8
실험 재현성 입증을 위한 복수 색소의 사용
본 실험에서는 동일한 PCR-증폭된 산물을 4개의 서로 다른 형광 색소로 표지하고 4배의 중복성으로 그 신뢰성을 검증하였다. 이를 위해 중아황산염으로 처리한 DNA에서 출발하여 유전자 ELK-1의 프로모터 구역에서 유래한 529 bp 길이의 한정된 단편을 프라이머 올리고뉴클레오티드 ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTT 및 AACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT로 증폭하고, 고정화된 올리고뉴클레오티드, 여기에서는 ATTAATAGCGTTTTGGTT와 ATTAATAGTGTTTTGGTT와 혼성화시켜 검출될 C 또는 T가 매번 증폭 산물의 476 위치에서 발견되게 하였다. 상이한 형광 표지를 갖는 시료의 비율을 Cy3, Cy5, Cy2, Cy7가 표지되어 있는 프라이머 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 비교함으로써 고도의 실험 신뢰성을 성취할 수 있었다.

상기한 구성의 본 발명에 의하면, 다양한 질병의 진단, 특정 질병에 대한 소인의 예측 진단에 유용하게 적용할 수 있다. 즉, 바람직하지 못한 약물 상호작용; 암; CNS-기능장애, 손상 혹은 질병; 공격성 또는 행동 장애; 병리적, 심리적, 사회적 요인으로 인한 뇌 기능장애; 정신적 장애와 성격 장애; 치매 및/또는 그에 부수된 증후군들; 심혈관질병, 기능장애 및 손상; 소화기관의 기능 장애, 손상 또는 질병; 호흡기관의 기능장애, 손상 또는 질병; 상처, 염증, 감염, 면역 및 회복; 발달 단계에서의 이상인 신체의 기능장애, 손상 혹은 질병; 피부, 근육, 결합 조직 또는 뼈의 기능장애, 손상 혹은 질병; 내분비 혹은 대사장애, 손상 혹은 질병; 두통 혹은 성 기능장애 등 다양한 증상에 대하여 진단 및 예측을 용이하게 할 수 있다를 포함한다. 또한 세포 혹은 조직들의 형태를 구별하거나 세포 분화를 조사하는데 유용하게 적용할 수 있다.

Claims

게놈 DNA 시료의 염기서열 5′-CpG- 3′에서 특정 시토신의 메틸화 정도를 검출함에 있어서,

a) 게놈 DNA를 화학적으로 처리하여, 시토신 염기들은 우라실로 전환되지만, 5-메칠시토신 염기들은 전환되지 않는 단계;

b) 상기 특정 시토신을 포함하는 한정된 단편을 증폭하고, 이로써 증폭된 산물에는 검출가능한 표지가 주어지는 단계;

c) 상기 증폭된 산물을 각각 특정 시토신에 대한 구성원을 갖는 두 종류의 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머와 혼성화하는 단계;

d) 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머에 대한 증폭된 산물의 혼성화 범위를 증폭된 산물의 표지를 검출하여 산출하는 단계;

e) 혼성화 결과 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머에 대해 검출된 표지의 비율로부터 게놈 DNA 시료의 상기 특정 시토신의 메틸화 정도를 결정하는 단계를 갖는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 c)의 단계의 증폭된 산물이 두 종류의 올리고머들(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머) 각각의 특정 시토신에 대한 구성원과 혼성화함에 있어서, 상기 첫 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화된 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화하고, 두 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 c)단계의 증폭된 산물이 두 종류의 올리고머들(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머) 각각의 특정 시토신에 대한 구성원과 혼성화함에 있어서, 상기 첫 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화된 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화하고, 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과는 우선적으로 혼성화하지 않으며, 두 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신의 게놈 DNA에서의 메틸화 정도와 무관하게, 연구 조사되어지는 증폭된 산물과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 c)단계의 증폭된 산물이 두 종류의 올리고머들(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머) 각각의 특정 시토신에 대한 구성원과 혼성화함에 있어서, 상기 첫 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화되지 않은 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과 우선적으로 혼성화하고, 상기 특정 시토신이 게놈 DNA에서 메틸화된 상태로 존재하는 경우 게놈 DNA의 화학적 처리 후 발생되는 서열과는 우선적으로 혼성화하지 않으며, 두 번째 종류의 올리고머는 상기 특정 시토신의 게놈 DNA에서의 메틸화 정도와 무관하게, 연구 조사되어지는 증폭된 산물과 혼성화하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 방법이 게놈 DNA 시료 및 상기 특정 위치의 시토신이 메틸화된 또는 메틸화되지 않은 표준 DNA에서 실행되며, 메틸화되지 않은 표준 DNA로 측정한 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 검출된 표지 비율을 메틸화 정도 0에 대한 검정값으로 하고, 이것과 상응하여 메틸화된 표준 DNA로 측정한 상기 두 종류의 올리고뉴클레오티드에서 검출된 표지 비율을 메틸화 정도 1에 대한 검정값으로 하여, 이 검정값을 게놈 DNA 시료의 메틸화 정도를 결정하는 데 사용하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 5 항에 있어서,

상기 특정 시토신의 메틸화 정도가 알려진 공지의 부가적 표준 DNA 시료들을 검정에 사용하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메칠화 정도 측정방법.
제 5 항에 있어서,

상기 표준 시료로 사용된 DNA들은 서로 다르게 표지 되고, 상기 게놈 DNA로 부터 제조된 증폭된 산물은 상기 표지와 다른 표지가 제공되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

서로 다른 게놈 DNA 시료에서 유래된 증폭된 산물은 서로 다른 표지가 제공되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

동일한 게놈 DNA 시료에서 유래되는 증폭 산물에 서로 다른 표지가 제공되어 여러 가지 검출방법에서 확보된 수치의 평균 수치에 의해 측정의 정확성을 상승시킬 수 있도록 한 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표지는 형광표지인 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 화학적 처리는 중아황산염 용액으로 시행된 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

올리고뉴클레오티드가 증폭에 사용되고, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1 내지 40712 중 어느 하나의 18개 이상의 염기 길이의 화학적으로 전처리된 DNA 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 혼성화 단계에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머가 사용되며, 이들 올리고머들은 서열번호: 1 내지 40712 중 어느 하나에 따른 화학적 전처리된 DNA의 9개 이상의 염기 길이의 서열에 혼성화하거나 또는 상기 서열에 상응하고, 염기서열은 하나 이상의 CpG-디뉴클레오티드를 포함하고, 상기 CpG-디뉴클레오티드는 올리고머 전체 중 중간에 존재함을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표지는 화학발광, 자외선 흡수 또는 형광의 편광에 의하여 검출되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표지는 방사성 핵물질인 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 표지는 제거가능한 질량표지로서, 질량분석기를 이용하여 검출될 수 있는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 증폭 산물은 전체 또는 특정 조각이 질량분석기에서 검출이 가능하며, 그들의 질량에 의하여 특성이 파악되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 한 종류의 올리고머(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머)는 서열 5'-CG-3'을 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 한 종류의 올리고머(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머)는 서열 5'-TG-3', 또는 5'-CA-3', 또는 5'-TG-3' 및 5'-CA-3'를 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 올리고머(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머) 중 첫 번째 종류의 올리고머는 서열 5'-CG-3'을 포함하고 두 번째 종류의 올리고머는 서열 5'-TG-3', 또는 5'-CA-3', 또는 5'-TG-3' 및 5'-CA-3'를 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 첫 번째 올리고머(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머)와 두 번째 올리고머(올리고뉴클레오티드 또는 PNA-올리고머)는 공통된 고체상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 21 항에 있어서,

상기 올리고뉴클레오티드는 직사각형 또는 육각형의 그리드에 평면 고체상위에 배열되고, 상기 고체상위의 특정 올리고뉴클레오티드의 위치는 올리고뉴클레오티드 각각의 염기서열과 상관관계가 있는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 첫 번째와 두 번째 종류의 올리고머는 비드(bead)상에 고정되며, 상기 비드는 분리하여 검출가능한 표지 세트로 코드화된 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

제 1 항의 b)단계는 다음의 두 단계로 실행되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법:

a) 제 1 항에서 전처리된 DNA-시료에 비특이적으로 혼성화되는 한쌍 이상의 서로 다른 서열의 프라이머로 PCR 예비증폭을 수행하여, PCR 단계에 하나 이상의 증폭된 산물을 발생시키는 단계;

b) 서열이 제 1 항에 따라 전처리된 DNA 시료〔(＋)가닥 또는 (－)가닥〕의 단편과 동일하거나 또는 반대로 상보적이며, 증폭될 DNA에 특이적으로 중합을 일으키는 서로 다른 서열로 구성된 프라이머들로 상기 예비 증폭에서 발생된 산물을 PCR 증폭하는 단계.
제 1 항에 있어서,

수개의 DNA 단편의 증폭이 하나의 반응조에서 실행되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

열 안정성 DNA-폴리머레이즈 효소가 증폭에 사용되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

증폭에 사용된 프라이머 올리고뉴클레오티드가 오로지 T, A 및 C 염기를 포함하거나, 또는 T, A 및 G 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

10 개 이상의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

50 개 이상의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

100 개 이상의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

500 개 이상의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

1000 개 이상의 CpG 위치들이 서로 다른 염기서열에서 동시에 검출되는 것을 특징으로 하는 특정 시토신의 메틸화 정도 측정방법.
제 1 항에 있어서,

상기 게놈 DNA 시료는 계통세포, 혈액, 침, 대변, 소변, 뇌척수액, 파라핀에 포장한 안구, 창자, 신장, 심장, 전립선, 폐, 유방 또는 간의 조직, 또는 조직 검사 슬라이드로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 메틸화 정도 측정방법.
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