JP4781267B2 - 大腸癌を検出する方法及び組成物 - Google Patents
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Description
図1Aは、CpGジヌクレオチドの位置を、ビメンチン遺伝子(ヌクレオチド1〜6200)の5’ゲノム領域中のバルーンとして示している。この領域の4つのサブドメイン(A〜D)は、結腸癌における異所的メチル化につき試験される。
図1Bは、AL133415配列の塩基対56,123〜62,340に対応するビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列(SEQ ID NO:51)を示している。
図2は、ビメンチンが正常な結腸細胞株ではよく発現されるが、結腸癌細胞株では、発現が乏しいというRT−PCRの結果を示している。このビメンチンの発現は、脱メチル化剤5−アザシチジンによって、12の結腸癌細胞株中の9株において誘導されている。
図3は、30サイクル(上パネル)又は40サイクル(下パネル)のPCR増幅によるC領域内のビメンチンメチル化についてのHpaIIアッセイの結果を示している。これらのPCR反応は、未消化(U)、メチル化感受性制限酵素HpaIIでの消化(H)、又はメチル化に中立な酵素Msp1での消化(M)後に行なわれる。3つの癌でない正常組織(NN1、NN2及びNN3)は、すべてメチル化されていないが、10の結腸癌細胞株全部のうちの9つは、メチル化を示している。
図4は、10対の正常結腸組織試料/腫瘍結腸組織試料(N1〜10及びT1〜10)のC領域内のビメンチンのメチル化についての、HpaIIによる制限酵素消化後の40サイクルのPCR増幅による、HpaIIアッセイの結果を示している。
図5は、22対の正常結腸組織試料/腫瘍結腸組織試料(N11〜32及びT11〜32)のC領域内のビメンチンのメチル化についての、HpaIIによる制限酵素消化後の40サイクルのPCR増幅による、HpaIIアッセイの結果を示している。
図6は、ビメンチン遺伝子の更なる図式描写を示している。B及びC領域内のMS−PCRのためのプライマーの位置を、MS−PCR対1〜5として示してある。
図7は、ビメンチンのゲノム配列のB及びC領域を部分的にカバーするプライマー対1〜5を利用するMS−PCRの結果を示している。プライマー対1、4及び5は、すべて、40サイクルのMS−PCRによりアッセイした場合、正常結腸組織(Nで示してある)においてビメンチンのメチル化を検出している。対照的に、プライマー対3は、ビメンチン非発現性結腸癌細胞株においてメチル化されるが正常結腸組織又はビメンチン発現性細胞株SW480ではメチル化されない差次的メチル化領域を規定している。
図8は、プライマー対MS3を利用するMS−PCRの結果を示している。ビメンチンのメチル化は、癌以外の切除術由来の14の正常結腸組織試料(NNで示してある)の何れにおいても、MS3反応を、順次的な40サイクルの反応を2回行なうことにより、PCRの80サイクルまで行なった場合でさえ、検出されていない。
図9は、10対の正常結腸組織試料/腫瘍結腸組織試料でのC領域におけるビメンチンのメチル化を検出するための、HpaIIアッセイ(上段)の、MSP3を40サイクルで利用するMS−PCR(下段)に対する比較を示している。
図10は、20対の正常結腸組織試料/腫瘍結腸組織試料(N1〜20及びT1〜20)におけるビメンチンのメチル化を検出するための、MSP3プライマーを40サイクルで利用するMS−PCRを示している。
図11は、26対の正常結腸組織試料/腫瘍結腸組織試料(N21〜46及びT21〜46)におけるビメンチンのメチル化を検出するための、MSP3プライマーを40サイクルで利用するMS−PCRを示している。
図12は、一組の結腸癌細胞株におけるビメンチンのメチル化を検出するための、MSP3プライマーを40サイクルで利用するMS−PCRを示している。
図13は、A、C及びD領域におけるビメンチンヌクレオチド配列を増幅するための、HpaIIアッセイにおけるプライマー配列を示している。A.フォワードPCRプライマー VM−HpaII−679U(SEQ ID NO:8)及びリバースPCRプライマーVM−HpaII−1266D(SEQ ID NO:9)は、HpaIIでの消化後に、A領域内のメチル化されているビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。非メチル化DNAは、HpaIIにより切断され、それ故、PCR増幅されえない。B.フォワードPCRプライマーVM−HpaII−1826U(SEQ ID NO:10)及びリバースPCRプライマーVM−HpaII−2195D(SEQ ID NO:11)は、HpaIIでの消化後に、C領域内のメチル化されたビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。C.フォワードPCRプライマーVM−HpaII−2264U(SEQ ID NO:12)及びリバースPCRプライマーVM−HpaII−2695D(SEQ ID NO:13)は、HpaIIでの消化後に、D領域内のメチル化されたビメンチン配列を選択的に増幅するが、メチル化されていないビメンチン配列は増幅しない。
図14は、ビメンチンのメチル化を検出するためのMSP−PCRプライマーのセット1〜5の配列を示している。MSP1、MSP1−2、及びMSP3は、二本鎖メチル化ビメンチンDNAの重亜硫酸塩変換されたセンス鎖を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーVIM1374MF(SEQ ID NO:14)及びリバースプライマーVIM1504MR(SEQ ID NO:15);フォワードプライマーVIM1374MF(SEQ ID NO:14)及びリバースプライマーVIM1506MR(SEQ ID NO:18);フォワードプライマーVIM1776MF(SEQ ID NO:23)及びリバースプライマーVIM1982MR(SEQ ID NO:24)を含んでいる。MSP2及びMSP5は、二本鎖メチル化ビメンチンDNAの重亜硫酸塩変換されたアンチセンス鎖を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーVIM1655MF(ASS)(SEQ ID NO:19)及びリバースプライマーVIM1797MR(ASS)(SEQ ID NO:20);フォワードプライマーVIM1935MF(ASS)(SEQ ID NO:27)及びリバースプライマーVIM2094MR(ASS)(SEQ ID NO:28)を含んでいる。下線を付けた配列は、二本鎖非メチル化ビメンチンDNA(UF又はURとして示してある)の重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)を増幅するために用いるコントロールプライマーセットであり、フォワードプライマーVIM1368UF(SEQ ID NO:16)及びリバースプライマーVIM1506UR(SEQ ID NO:17);フォワードプライマーVIM1651UF(ASS)(SEQ ID NO:21)及びリバースプライマーVIM1799UR(ASS)(SEQ ID NO:22);フォワードプライマーVIM1771UF(SEQ ID NO:25)及びリバースプライマーVIM1986UR(SEQ ID NO:26);フォワードプライマーVIM1934UF(ASS)(SEQ ID NO:29)及びリバースプライマーVIM2089UR(ASS)(SEQ ID NO:30)を含んでいる。
図15は、ビメンチンのメチル化を検出するためのMSP−PCRプライマーセット6〜10の配列を示している。MSP6、MSP7、MSP8及びMSP9は、二本鎖メチル化ビメンチンDNAの重亜硫酸塩変換されたセンス配列を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーVIM1655MF(SEQ ID NO:31)及びリバースプライマーVIM1792MR(SEQ ID NO:32);フォワードプライマーVIM1655MF(SEQ ID NO:31)及びリバースプライマーVIM1796MR(SEQ ID NO:35);フォワードプライマーVIM1655MF(SEQ ID NO:31)及びリバースプライマーVIM1804MR(SEQ ID NO:36);フォワードプライマーVIM1843MF(SEQ ID NO:37)及びリバースプライマーVIM1982MR(SEQ ID NO:24)を含んでいる。MSP10は、二本鎖メチル化ビメンチンDNAの重亜硫酸塩変換されたアンチセンス配列を増幅するためのプライマーセットであり、フォワードプライマーVIM1929MF(ASS)(SEQ ID NO:39)及びリバースプライマーVIM2094MR(ASS)(SEQ ID NO:28)を含んでいる。下線を引いた配列は、二本鎖非メチル化ビメンチンDNA(UF又はURと示してある)の重亜硫酸塩変換された配列(センス又はアンチセンス)を増幅するのに利用されるコントロールプライマーであり、フォワードプライマーVIM1651UF(SEQ ID NO:33)及びリバースプライマーVIM1800UR(SEQ ID NO:34);フォワードプライマーVIM1843UR(SEQ ID NO:38)及びリバースプライマーVIM1986UR(SEQ ID NO:26);フォワードプライマーVIM1934UF(ASS)(SEQ ID NO:29)及びリバースプライマーVIM2089UR(ASS)(SEQ ID NO:30)を含んでいる。
図16は、ビメンチン遺伝子の図式描写を示している。10対のMS−PCRプライマーセットをデザインした(それは、bp1347と2094の間のビメンチンB及びC領域の部分を調べた)。これらのプライマー対により調べられた領域を、図式表示してある。
図17は、12の癌でない正常試料と12の結腸癌細胞株における、ビメンチンのメチル化の検出のための、3対のプライマーセットMSP1、MSP1−2、及びMSP3を利用するMS−PCRの結果を示している。
図18は、12の癌でない正常組織と12の結腸癌細胞株における、ビメンチンのメチル化の検出のための、3対のプライマーセットMSP5、MSP6、MSP7、MSP8、MSP9、及びMSP10を利用する、MS−PCRの結果を示している。
図19は、顕微解剖した異常な凹窩病巣(ACF、「A」で示してある)における、ビメンチンのメチル化の検出のための、2対のプライマーセットMSP3及びMSP1−2を利用する、MS−PCRの結果を示している。
図20は、ヒトのビメンチンタンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)を示している。
図21〜26は、ビメンチンの5’ゲノム領域の決定的配列を与えるものである。各図は、領域A〜Dを包含するビメンチン遺伝子の5’領域に及ぶNCBIヒトゲノムクローンAL133415の塩基対56,822〜58,822に対応する配列を与える。各図は、結腸癌において差次的にメチル化される塩基対57,427〜58,326の領域を太字で示している。その上、各図において、MS−PCRプライマーにより調べられる特殊な配列に下線を引いてある。
図21は、AL133415配列(SEQ ID NO:2)の塩基対56,822〜58,822に対応するビメンチンのセンス鎖配列を5’〜3’方向で示している。塩基対57,427〜58,326(SEQ ID NO:45)の、差次的にメチル化された領域は、太字にしてある(図45も参照されたい)。
図22は、図21に示したビメンチン遺伝子のセンス鎖(SEQ ID NO:3)に由来する、メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてある塩基対57,427〜58,326(SEQ ID NO:46)である。
図23は、図21に示したビメンチン遺伝子のセンス鎖に由来する未メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:4)を示している。この差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてある塩基対57,427〜58,326(SEQ ID NO:47)である。
図24は、AL133415配列(SEQ ID NO:5)の塩基対56,822〜58,822に対応する、ビメンチンのアンチセンス鎖の配列(3’〜5’)を示している。この差次的にメチル化された領域は、太字にしてある塩基対57,427〜58,326(SEQ ID NO:48)である。
図25は、図24に示したビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖(3’〜5’)に由来するメチル化されたテンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:6)を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてあり、塩基対57,427〜58,326(SEQ ID NO:49)である。
図26は、図24に示したビメンチン遺伝子のアンチセンス鎖(3’〜5’)に由来する未メチル化テンプレートの重亜硫酸塩変換された配列(SEQ ID NO:7)を示している。差次的にメチル化された領域に由来する配列は、太字にしてあり、塩基対57,427〜58,326(SEQ ID NO:50)である。
図27は、HpaIIアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「A領域」の配列(AL133415の塩基対56799〜57385、SEQ ID NO:40)を示している。この配列は又、図1A及び1Bに示したSEQ ID NO:51のヌクレオチド679〜1266とも呼ばれた。
図28は、HpaIIアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「B領域」の配列(AL133415の塩基対57436〜57781、SEQ ID NO:41)を示している。この配列は又、図1A及び1Bに示したSEQ ID NO:51のヌクレオチド1317〜1661とも呼ばれた。
図29は、HpaIIアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「C領域」の配列(AL133415の塩基対57946〜58315、SEQ ID NO:42)を示している。この配列は又、図1A及び1Bに示したSEQ ID NO:51のヌクレオチド1826〜2195とも呼ばれた。
図30は、HpaIIアッセイに便利な部位を有していることにより最初に定義された「D領域」の配列(AL133415の塩基対58384〜58815、SEQ ID NO:43)を示している。この配列は又、図1A及び1Bに示したSEQ ID NO:51のヌクレオチド2264〜2695とも呼ばれた。
図31は、B領域並びにB領域とC領域の間のギャップをカバーする「B’領域」の配列(AL133415の塩基対57436〜57945、SEQ ID NO:44)を示している。この配列は又、図1A及び1Bに示したSEQ ID NO:51のヌクレオチド1317〜1825とも呼ばれた。このB’領域は又、差次的メチル化領域をも包含する。
図32〜34は、NCBIヒトゲノム配列エントリーAL133415の、塩基対56700〜58800の、ビメンチンの5’ゲノム領域の図式表示を示している。ボックスは、ビメンチンの領域A、B、C及びDを示している。バルーンは、潜在的メチル化の標的であるCpGジヌクレオチドを示している。黒いバルーンは、個体群多型であるCpGを示している。図32は、領域A〜Bを示し、図33〜34は、領域C〜Dを示している。図の下のバーは、種々のメチル化特異的PCR領域により調べられる領域を示している(MSP1〜MSP50と番号付けられている)。これらの図において、MS−PCR反応の第一の結果は、MS−PCRプライマーに次いで示してある。これらの反応物の最も左側のセットは、12の癌でない正常試料におけるMS−PCRの結果であり;陰性の結果は、好適な結果である。これらの反応物の最も右側のセットは、11の結腸癌細胞株のアッセイの結果であり;好適な結果は、陽性反応である。
図35は、図32〜34にまとめたMS−PCR反応のためのプライマー配列(MSP1〜MSP50)を与える。MFは、フォワードプライマーを示し、MRは、リバースプライマーを示している。プライマーは、センスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅すると仮定されている。アンチセンスゲノム鎖の重亜硫酸塩変換された配列を増幅するプライマーは、(ASS)により示してある。この表は又、増幅生成物に対応するゲノム位置(クローンAL133415の塩基対ナンバリングシステムに対するもの)をも与える。この表は又、増幅された断片の長さをも与える。影を付けたプライマーは、最良の及び好適な反応を与える。SEQ ID NO:14、15、18、19、20、23、24、27、28、31、32、36、37、39及び52〜72を、この図中に見出すことができる。
図36は、種々のMS−PCRアッセイの技術的な感度及び特異性を示している。左奥には、癌でない正常結腸組織について行なった45又は90サイクルのMS−PCR反応の結果を示してある。90サイクルの反応は、45サイクルPCR反応物からアリコートを採って、それを新鮮なPCR反応物中に希釈して、更なる45サイクルを反復することにより行なった。これらの示した反応物につき、MS−PCR反応は、正常組織についての90サイクル以下のPCRにおいて偽陽性を検出しなかった。陽性対照の結腸癌細胞株を、すぐ右に並べて示してある。右奥には、種々のMS−PCR反応の技術的な感度のアッセイを示してある。中央の及び最も右側の反応物のセットは、Vaco5(ビメンチンのメチル化を有する細胞株)由来のDNAについて行なったMS−PCRの希釈シリーズを示している。投入メチル化Vaco5DNAの100ピコグラムのレベルまで陽性反応が得られている。
図37は、更なるプライマーセットについての種々のMS−PCRアッセイの技術的な感度及び特異性を示している。左欄は、45サイクルのMS−PCRでの、11の結腸癌細胞株のパネルのアッセイの結果を示している。右側の結果は、一群の癌でない正常組織の45及び90サイクルのMS−PCR反応を評価する欄を示している。次は、候補の反応物を増大するVaco5DNA希釈物に対してアッセイする希釈シリーズのアッセイを示す2つの欄を示している。最良の希釈物(例えば、VIM−MSP50M)は、殆どの結腸癌細胞株の検出に関する高度の技術的感度を示し、正常結腸についての低い陽性率、及び投入DNAの50ピコグラムまでのVaco5DNAの希釈物の検出に関する高度の感度を示している。右側に示したこれら2つの希釈シリーズは、それらが、予め重亜硫酸塩処理した正常及びVaco5DNAを混合することにより為された(中央欄)か、先ずVaco5及び正常DNAを混合し;該混合物を希釈してから;該希釈混合物を重亜硫酸塩処理することにより行なった(最右欄)かどうかで異なっている。
図38は、正常及び腫瘍の対の、種々のビメンチンMS−PCR反応によるアッセイからの一次データを示している。
図39は、正常な結腸及び癌の対、結腸腺腫、及び結腸癌細胞株の、種々のMS−PCR反応によるアッセイからの一次データを示している。
図40は、結腸癌細胞株及び癌でない正常な結腸試料の、種々のMS−PCR反応によるアッセイからの一次データを示している。
図41は、図37を補って、更に、ビメンチンDNAメチル化についての種々のMS−PCRアッセイの技術的感度を示している。2つのプライマーセット(MSP29M及びMSP50M)を試験した。
図42は、図38を補って、更に、ビメンチンDNAメチル化についての種々のMS−PCRアッセイの臨床的感度を示している。この一次データは、正常及び腫瘍の対のアッセイから得られた。3つのプライマーセット(MSP29M、MSP47M、及びMSP50M)を利用した。
図43は、図39及び40を補って、更に、ビメンチンDNAメチル化についての種々のMS−PCRアッセイの臨床的感度を示している。この一次データは、結腸癌細胞株、癌でない正常な結腸試料(N.C.N)、結腸の正常/腫瘍対、及び結腸腺腫のアッセイから得られた。3つのプライマーセット(MSP29M、MSP47M、及びMSP50M)を利用した。
図44は、MSP29、MSP47、及びMSP50を利用するMS−PCRからの生のデータを与える。このデータは、細胞株N/T対、及び結腸腺腫試料それぞれについての3つの表で示されている。メチル化試料は、赤く暗号化されてMと標識されているが、非メチル化試料は、緑色に暗号化されてUと標識されている。V−MSP29、VMSP−47、及びV−MSP50が、ビメンチンプライマーである。H−MSP5は、比較のためのコントロールプライマー(HLTF−MSP5)である。
図45は、GenBank受入れ番号AL133415の塩基対57,427〜58,326に対応するヒトビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列:センス鎖(SEQ ID NO:45)を示している。
図46は、GenBank受入れ番号AL133415の塩基対57,427〜58,326に対応するヒトビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列:センス鎖(重亜硫酸塩変換/メチル化したもの)(SEQ ID NO:46)を示している。
図47は、GenBank受入れ番号AL133415の塩基対57,427〜58,326に対応するヒトビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列:センス鎖(重亜硫酸塩変換し/メチル化してないもの)(SEQ ID NO:47)を示している。
図48は、GenBank受入れ番号AL133415の塩基対57,427〜58,326に対応するヒトビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列:アンチセンス鎖(SEQ ID NO:48)を示している。
図49は、GenBank受入れ番号AL133415の塩基対57,427〜58,326に対応するヒトビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列:アンチセンス鎖(重亜硫酸塩変換/メチル化したもの)(SEQ ID NO:46)を示している。
図50は、GenBank受入れ番号AL133415の塩基対57,427〜58,326に対応するヒトビメンチン遺伝子の5’ゲノム配列:アンチセンス鎖(重亜硫酸塩変換し/メチル化してないもの)(SEQ ID NO:47)を示している。
便宜のために、明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いた幾らかの用語を、ここに集めた。別途規定しない限り、ここで用いるすべての技術及び科学用語は、この発明が属する分野の当業者に普通に理解されているものと同じ意味を有する。
ある面において、この発明は、患者が、結腸新生物を有することがありそうであるか、ありそうもないかどうかを決定する方法に関係する。結腸新生物は、結腸内に位置し、又は結腸に由来する、任意の癌性又は前癌性の増殖物である。結腸は、腸管の一部であり、約3フィート長であって、小腸の最後から直腸に至る。横断面で見ると、結腸は、消化された物質が通過する内腔と呼ばれる内部空間を囲む同心環状に配置された4つの識別可能な層からなっている。内腔から外側に向かって順に、これらの層は、粘膜、粘膜下組織、筋層及び漿膜下層と呼ばれている。この粘膜は、上皮層(内腔に隣接する細胞)、基底膜、固有層及び粘膜筋板を含んでいる。一般に、結腸の「壁」は、粘膜下組織及び該組織の外側の層を指すことが意図されている。「裏打ち」は、この粘膜である。
本発明は、少なくとも部分的に、ビメンチンのヌクレオチド配列は、ある種のビメンチン関連新生物例えば結腸新生物において、差次的にメチル化されるという観察に基づいている。一面において、この出願は、ビメンチン関連新生物において差次的にメチル化されるある領域を有するビメンチンのヌクレオチド配列例えばSEQ ID NO:2及び45並びにそれらの断片を開示する。従って、一具体例において、この出願は、差次的にメチル化された核酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%同一である単離された又は組換えにより生成されたヌクレオチド配列を提供する(ここに、差次的メチル化核酸配列の何れか一つにおけるメチル化の検出は、ビメンチン関連新生物例えば結腸新生物を示す)。当業者は、SEQ ID NO:2及び45並びにそれらの変異体と相補的なビメンチン核酸配列も又、この発明の範囲内にあることを認めるであろう。かかる変異体ヌクレオチド配列は、少なくとも1ヌクレオチドの置換、付加又は欠失により異なる配列例えばアレル変異体を包含する。
ある面において、この出願は、ビメンチンヌクレオチド配列を、健康な細胞とビメンチン関連疾患の細胞を識別する分子マーカーとして利用するアッセイ及び方法を提供する。例えば、一具体例において、この出願は、ビメンチンヌクレオチド配列を、健康な細胞と結腸新生物細胞を識別するマーカーとして利用する方法及びアッセイを提供する。一面において、この発明の分子マーカーは、差次的にメチル化されたビメンチンヌクレオチド配列である。他の面において、ここに与える他のマーカーは、ビメンチン遺伝子の発現産物である。
ある面において、この発明は、ビメンチン関連疾患例えば結腸新生物を有することが疑われ又は有する被験者に関係する。或は、被験者は、日常的スクリーニングを受けていてよいし、必ずしもかかるビメンチン関連疾患を有することが疑われていなくてもよい。好適具体例において、この被験者は、ヒトの被験者であり、ビメンチン関連疾患は、結腸新生物である。
この出願の更に別の面は、細胞におけるビメンチン遺伝子の減少した発現又は過剰発現から生じるビメンチン関連疾患の治療方法に関係する。かかるビメンチン関連増殖性疾患(例えば、結腸新生物)は、様々な病的細胞増殖状態から生じうる。ある具体例において、ビメンチン関連増殖性疾患の治療には、ビメンチン遺伝子発現又はビメンチン活性の調節が含まれる。用語「調節する」は、ビメンチンが過剰発現される場合にはその発現の抑制を、又はビメンチンが過少発現される場合にはその発現の増大を構想している。
この発明は、今や、一般的に記載されており、それは、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう(該実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明の目的のために含まれるものであり、この発明を制限することを意図するものではない)。
1.細胞培養及び5−アザシチジン処理
これらの培養物を生育させて、以前に記載されたように処理した(Veigl等、1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:8698-8702)。最適許容投与量を、各処理される株について測定し、幾つかの株については、1〜3μg/mlに及ぶ2種類の投与量を用いた。
我々は、潜在的にメチル化されうるCpG濃密領域を含むビメンチン遺伝子の上流及び該遺伝子内のゲノム配列(ここでは、5’−ビメンチンゲノム配列と呼ぶ)を試験した(図1及び6参照)。このCpGリッチな領域のメチル化を試験するために、我々は、先ず、HpaIIアッセイを利用した。試料のDNAを、メチル化感受性酵素のHpaIIで消化してから、PCRプライマー対によって増幅した。DNAがメチル化されている場合には、それは、HpaII消化に耐性であり、従って、PCR産物が生成される。他方、DNAがメチル化されていない場合には、それは、HpaII消化を受けやすく、従って、PCR産物は生成されない。CpGジヌクレオチドの位置は、ビメンチン遺伝子の5’ゲノム領域内にバルーンとして示されており、このゲノム領域の4つのサブドメインA〜Dを、結腸癌における異所的メチル化について試験した(図1)。これらのHpaIIアッセイに用いたPCRプライマーの位置も又、図1に示してある。HpaIIアッセイにおいてA、C及びD領域を増幅するために利用したPCRプライマーの配列は、図13に与えてある。
RT−PCRは、ビメンチンが、正常な結腸では十分に発現されるが、結腸癌細胞株では僅かしか発現されないことを示した(図2)。メチル化がビメンチン遺伝子発現のサイレンシングの原因であるということを確立するために、ビメンチンDNAのメチル化を有する細胞株を、5−アザシチジン(5−アザC)(脱メチル化剤)で処理した。図2に示したように、5−アザC処理は、12の結腸癌細胞株の内の9つ(V400、V429、V503、RCA、V5、RKO、V432、V703及びV457)でビメンチン発現を再活性化した。
C領域内のビメンチンゲノム配列のメチル化を、結腸癌細胞株(図3)又は結腸腫瘍(図4〜5)におけるHpaIIアッセイにより検出した。PCR増幅を、未消化(U)、メチル化感受性制限酵素HpaIIでの消化(H)、又はメチル化に関係ない酵素Msp1での消化(M)後に、30又は40サイクルで行なった。3つの癌でない正常組織(NN)は、すべてメチル化されていないが、10の結腸癌細胞株の9つは、すべてメチル化を示している(図3)。C領域のビメンチンゲノム配列のメチル化は又、対にした正常試料/腫瘍試料においてもHpaIIアッセイにより検出された。図4及び5に示したように、C領域におけるビメンチンの差次的メチル化は、40サイクルのPCR増幅後に、31の結腸腫瘍中16で検出された。
各試料からの500ngのDNA(50μlの容積)を、NaOH(新しく生成した、終濃度0.2Mのもの)により、37℃で、15分間変性させた。次に、30μlの10mMハイドロキノン(新鮮)及び520μlの3.0M NaHSO4(新たに調製した重亜硫酸ナトリウム、pH5.0)を加えて、55℃で16時間インキュベートした。改変DNAを、ウィザードDNAクリーンアップシステム(Promega)を利用して精製した。この反応を、終濃度0.3MのNaOHによって、室温で、15分間、脱スルホン化して、10M NH4OAc(pH7.0)を終濃度3Mまで加えることにより中和した。DNAを、3容の無水エタノールにより、30分間、−80℃で沈殿させた。このDNAペレットを、次いで、蒸留水に溶解させて、約10ng/μlとした。重亜硫酸ナトリウム処理したDNAを、その後のメチル化特異的PCRのためのテンプレートとして利用した。
我々は、更に、メチル化又は非メチル化DNAテンプレートの増幅に特異的なPCRプライマーを利用して、メチル化特異的PCR技術を、ビメンチンのCpGリッチ領域のメチル化の試験に利用した(図7〜12)。図7に示したように、MS−PCRプライマー対1、4及び5は、すべて、40サイクルのPCRによりアッセイした際に正常結腸組織でメチル化を検出した。対照的に、MS−PCRプライマー対3は、差次的にメチル化した領域を限定し、それは、ビメンチンを発現しない結腸癌細胞株でメチル化されるが、正常結腸組織又はビメンチンを発現する細胞株SW480ではメチル化されない。独立したMS−PCRアッセイは、MS-PCRプライマー対MS3が、ビメンチンのメチル化を、癌でない切除物からの正常結腸切除物において、たとえPCR反応を、2つの順次的40サイクル反応によって80サイクル行なった場合でも、検出しないことを確認した(図8)。
ビメンチンゲノム配列における差次的メチル化の程度を更に研究するために、更なる6対のMS−PCRプライマーのセットを、B及びC領域内でデザインした。すべてのMS−PCRプライマーの配列を、図14及び15に示し、それらの位置を図16に示してある。
下記の実験及びデータは、更に、メチル化が結腸癌の高頻度マーカーであるビメンチンの特異的領域及びそれらの配列を特定する。加えて、これらのデータは、これらの配列についてのアッセイを特定する。
本書で言及したすべての刊行物及び特許を、個々の刊行物又は特許が特に、個別に、参考として援用されると示されているかのように、参考として、そっくりそのまま本明細書中に援用する。矛盾が生じた場合には、本願(定義を含む)が、調整する。
主題の発明の特定の具体例を論じてきたが、上記の明細書は、説明のためのものであって、制限するためのものではない。この明細書及び請求の範囲を概観すれば、この発明の多くの変形物が、当業者には明らかとなろう。この発明の全範囲は、同等物の全範囲と共に請求の範囲を及びかかる変形物と共に明細書を参照することによって決められるべきものである。
Claims (27)
- 結腸新生物を検出する方法であって、該方法は、下記:
患者から得た試料を、SEQ ID NO:2に示したヌクレオチド配列又はその断片内のメチル化の存在についてアッセイする
ことを含み、該ヌクレオチド配列のメチル化が、結腸新生物を示す、当該方法。 - 試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項1に記載の方法。
- 前記の結腸新生物が、結腸癌である、請求項1に記載の方法。
- SEQ ID NO:45のビメンチン配列のメチル化の存在につきアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。
- SEQ ID NO:40〜44から選択するビメンチン配列のメチル化の存在につきアッセイすることを含む、請求項1に記載の方法。
- アッセイが、メチル化特異的なPCRである、請求項1〜5の何れかに記載の方法。
- 下記を含む、請求項6に記載の方法:
a)試料由来のDNAを、該DNA中のメチル化されていないシトシン塩基を異なる塩基に変換する化合物で処理し;
b)該化合物変換されたビメンチンヌクレオチド配列の一領域を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを利用して増幅し;そして
c)該ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化パターンを分析する。 - 下記を含む、請求項6に記載の方法:
a)試料からのDNAを、該DNA中の非メチル化シトシン塩基を異なる塩基に変換する化合物で処理し;
b)化合物変換されたビメンチンヌクレオチド配列の領域を、フォワードプライマー及びリバースプライマーを利用して増幅し;
c)増幅された生成物の存在及び/又は量を検出する。 - フォワードプライマーを、SEQ ID NO:14、16、19、21、23、25、27、29、31、33、37、38、39、及び図35に列記したフォワードプライマーから選択する、請求項6に記載の方法。
- リバースプライマーを、SEQ ID NO:15、17、18、20、22、24、26、28、30、32、34、35、36、及び図35に列記したリバースプライマーから選択する、請求項6に記載の方法。
- プライマーを、MSP29、MSP47及びMSP50から選択する、請求項6に記載の方法。
- DNAを処理するために用いる化合物が、重亜硫酸化合物である、請求項6に記載の方法。
- アッセイが、メチル化特異的制限酵素を利用することを含む、請求項1〜5の何れかに記載の方法。
- 前記のメチル化特異的制限酵素を、HpaII、SmaI、SacII、EagI、MspI、BstUI及びBssHIIから選択する、請求項13に記載の方法。
- SEQ ID NO:8〜13、及び図35に列記したプライマーから選択するプライマーの対を更に含む、請求項13に記載の方法。
- 結腸新生物を含むビメンチン遺伝子のサイレンシングと関連する病気の細胞におけるビメンチンタンパク質又は核酸の発現を増進させる薬剤を同定する方法であって、該方法は、下記:
a)細胞を十分量の薬剤と適当な条件下で接触させ;
b)ビメンチンタンパク質又は核酸の量を定量的に測定し;そして
c)該ビメンチンタンパク質又は核酸の量を、該剤の非存在下でのビメンチンタンパク質又は核酸の量と比較する
ことを含み、
該剤の非存在下よりも、該剤の存在下でのビメンチンタンパク質又は核酸の一層多い量が、該剤がビメンチンタンパク質又は核酸の発現を増進させることを示す当該方法。 - 前記のビメンチン遺伝子のサイレンシングが、ビメンチンヌクレオチド配列の差次的メチル化のためである、請求項16に記載の方法。
- SEQ ID NO:2に示したビメンチンヌクレオチド配列又はその断片内で差次的メチル化が起きる、請求項17に記載の方法。
- 結腸新生物を経時的にモニターする方法であって、該方法は、下記:
a)被験者からの試料中のビメンチンヌクレオチド配列のメチル化状態を最初に検出し;そして
b)同じ被験者からの試料中のビメンチンヌクレオチド配列のメチル化状態を一層遅い時点で検出する;
ことを含み、
一層遅い時点で採ったビメンチンヌクレオチド配列中のメチル化の非存在及び最初の時点で採ったビメンチンヌクレオチド配列中のメチル化の存在は、癌の退行を示し;
一層遅い時点で採ったビメンチンヌクレオチド配列中のメチル化の存在及び最初の時点で採ったビメンチンヌクレオチド配列中のメチル化の非存在は、癌の進行を示す
当該方法。 - 試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項19に記載の方法。
- 被験者における結腸新生物を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、SEQ ID NO:8〜39及び図35に列記したプライマーより選択し、前記プライマーはビメンチンヌクレオチド配列のメチル化を検出する、当該オリゴヌクレオチドプライマー。
- 被験者における結腸新生物を検出するためのキットであって、SEQ ID NO:8〜39及び図35に列記したプライマーから選択する、ビメンチンヌクレオチド配列のメチル化を検出するための少なくとも2つのプライマーを含む当該キット。
- テンプレートDNAを変換するための化合物を更に含む、請求項22に記載のキット。
- 化合物が、重亜硫酸塩である、請求項23に記載のキット。
- 各プライマーが、少なくとも一つのCpGジヌクレオチドを含む、請求項24に記載のキット。
- 結腸癌を検出するための方法であって、該方法は、下記:
a)患者から得た試料を、ビメンチンヌクレオチド配列内のメチル化の存在につきアッセイをし;及び
b)前記試料を、SLC5A8、HLTF、p16及びhMLH1よりなる群から選択するさらに1つの遺伝子内のヌクレオチド配列のメチル化の存在につきアッセイする;
ことを含み、
これらの2つの遺伝子内のヌクレオチド配列のメチル化が、結腸癌を示す、当該方法。 - 試料が、血液、血清、血漿、血液由来の画分、大便、尿及び結腸排出物よりなる群から選択する体液である、請求項26に記載の方法。
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